ペプチドの固定化方法
【課題】 ペプチドチップを用いる測定系において、結合シグナルを増幅しながら生体分子の非特異的吸着を抑制することにある。特に表面プラズモン測定に用いた際に、信頼性の高いデータを得ることのできるペプチドチップを得る。
【解決手段】表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
【解決手段】表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質相互作用の解析系に用いられるペプチドチップの製造方法に関する。より詳細には、特定の低分子量化合物を架橋剤として用いることにより、物質間の結合シグナルを増大させ、非特異的な影響も低減することの可能なペプチドチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
しかしながら、相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性高分子が表面に固定化されたバイオチップが開発されている。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。しかしながら、デキストランのような大きな分子を介してペプチドなどの生体分子を固定化した場合、デキストラン等の影響が大きく、ペプチドの性質の測定に悪影響を及ぼす可能性がある。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制して、なおかつ標的物質における結合シグナルを増大下、ペプチドチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
１．表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
【０００６】
【化１】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
２．チップ表面が金であることを特徴とする項１記載の方法。
３．チップの基板が透明基板であることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
４．２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする項１〜３のいずれか記載の方法。
５．固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のＳＨ基がマレイミド基と反応することを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．下記式
【０００７】
【化２】
（式中、「Substrate」はチップの基板を示し、「Peptide」はチップに固定化されるペプチド（結合に関与するCys残基を除く）を示し、S(Cys)は該ペプチドのCys残基のSH基に由来するSであることを示す。）
で表される構造を有するペプチドを固定化したチップ。
８．S(Cys)が、ペプチドの末端のCys残基のSH基に由来するSである項７に記載のチップ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明における低分子化合物を架橋剤に用いることにより、標的シグナルを向上させ、更に非特異的吸着が抑制された精度のよいペプチドチップを用いた測定系を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、チオール基を介してペプチドをチップに固定化することを特徴とする。
チオール基（ＳＨ）は、ペプチド中のシステイン残基に由来するのが好ましい。
固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで、ペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。
システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端（Ｎ末端もしくはＣ末端）のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をシステイン残基と目的のペプチドの間にさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００１０】
また、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合され、この付加された化合物のチオール基を介してマレイミド基と結合してもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１１】
本発明においては、ペプチドの固定化に際して、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤として、ＲがＨである式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくはＲがＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍ，ｎは前記に定義されるとおりである）である式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）を架橋剤として用いることを特徴としている。なお、本発明において用いる架橋剤は、式（Ｉ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
1/nＭは、Ｈ，Ｎａ，Ｋ，Ｌｉ，Ｃｓ等のアルカリ金属(ｎ＝１)、ＮＨ4，Ｎ(Ｍｅ)4等のＣ1〜Ｃ4のアルキル基で置換されていてもよい四級アンモニウム（ｎ＝１）、1/2Ｃａ，1/2Ｍｇ，1/2Ｂａ等のアルカリ土類金属（ｎ＝２）等が挙げられ、好ましくはアルカリ金属、より好ましくはＮａである。
【００１３】
上述したような式（Ｉ）の架橋剤を適用することにより、特に高分子量の架橋剤と比べて、ペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる。
【００１４】
上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスルホン酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
本発明の方法の第一工程は、アミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）の化合物とを反応させ、式（Ｉ）の化合物のコハク酸イミド部分（スルホン酸基またはその塩を有していてもよい）を脱離させてアミド結合を形成し、マレイミド基を基板に導入する。
該反応は、基板上のアミノ基１モルに対して１モルから過剰量の式（Ｉ）の架橋剤の水溶液（Ｒがスルホン酸又はその塩の場合）または有機溶媒（Ｒが水素原子の場合）溶液を基板上に塗布するか、或いは基板を式（Ｉ）の架橋剤の水溶液又は有機溶媒溶液に浸漬することにより、行うことができる。反応は、例えば１０〜６０℃程度（好ましくは室温）の温度下に、１〜２４時間程度反応させることで有利に進行する。
次に、第二工程では、チオール基を有するペプチドと式（Ｉ）の化合物に由来する基板にアミド結合を介して導入されたマレイミド基を反応させる。反応は、マレイミド基１モルに対しチオール基を有するペプチドを１モルから過剰量使用し、溶媒中で、１０〜６０℃程度（好ましくは室温）の温度下に、１〜２４時間程度反応させることで有利に進行する。溶媒としては、水、含水有機溶媒（含水エタノール、含水メタノール、含水プロパノールなどの含水アルコール、含水ＴＨＦ、含水アセトン、含水ＴＨＦなど）、低級アルコール、ＤＭＦ，ジメチルアセトアミド、ＤＭＳＯなどの水混和性の有機溶媒が例示される。
【００１５】
得られたペプチドを固定化したチップにおいて、マレイミド基が残存している可能性がある。この残存マレイミド基はそのまま残されていてもよいが、チオール基を有する化合物とさらに反応させて、残存マレイミド基を除いておくことが望ましい。この反応条件は、溶媒としてより極性の低い有機溶媒を使用できる点を除いて第二工程のチオール基を有するペプチドとの反応と同様な条件で実施することができる。
【００１６】
本発明におけるペプチドチップの固定化方法はさまざまな用途に応用可能である。一般にアレイにおける検出手段としてよく用いられている蛍光性物質、化学発光性物質、放射性物質等による検出系においても有効であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。
【００１７】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の固定化方法は非常に効果的である。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。
【００１９】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００２０】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００２１】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００２２】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２３】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２４】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２５】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面積は１０〜１０００ｍｍ2に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２６】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２７】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２８】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２９】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
【００３１】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００３２】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００３３】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とSSMCCのNHS基が反応し、未反応のMAL基を表面に導入することができた。
【００３４】
上記のようにして得られた表面に、図１下部に示したように、プロテインキナーゼＡの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＡ基質のネガティブコントロール（ｎＰＫＡ；セリン残基がアラニン残基に置換）、プロテインキナーゼＡ基質のポジティブコントロール（ｐＰＫＡ；セリン残基がリン酸化）、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（ｃＳｒｃ）を、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。アレイの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記ＴＥＧ−ＳＨ（HS-(CH2CH2O)4-CH3）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。また比較例として、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡリン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイを用いてＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、４時間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ４μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化セリン抗体ＰＳＲ−４５（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで４０００倍、２０００倍、１０００倍希釈した溶液を用いて希釈倍率の高いものから順に作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
（観察の結果と考察）
ＳＰＲシグナル変化をグラフ化したセンサグラムの結果を図１に示した。センサグラムはスポットごとにおけるシグナルの平均値をプロットしている。Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄについては、基質ペプチドのスポット部分以外の任意に選択した箇所を測定ポイントとして得たシグナルの平均値をプロットしている。ポジティブコントロールに対しては非常に強い抗体結合シグナルの上昇を確認されており、ＰＫＡ基質においてもある程度の結合シグナルの上昇を認めることができる。一方、ネガティブコントロール、ｃＳｒｃ基質、ブランク及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄに関してはほとんどシグナル変化を認めることができない。したがって、この方法により、非常に特異的にＰＫＡ基質のリン酸化を検出することができている。
［比較例１］
金表面に８−ＡＯＴを導入した後、ＳＳＭＣＣの替わりに、分子量３４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）を作用させる点を除き、全て実施例１と同様にして検討した。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬはリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。結果を図２に示す。
【００３５】
この場合は、全体的に結合シグナル自体が弱くなっている。更にＰＫＡ基質以外においても非特異的なシグナルが確認されており、特異性の点でも好ましくない結果である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法により、ペプチドチップにおける結合シグナルを増幅させることができつつ、非特異的吸着に関しては抑制することができ、より正確な測定が可能となる。また処理方法も非常に容易であり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【図２】比較例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質相互作用の解析系に用いられるペプチドチップの製造方法に関する。より詳細には、特定の低分子量化合物を架橋剤として用いることにより、物質間の結合シグナルを増大させ、非特異的な影響も低減することの可能なペプチドチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
しかしながら、相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性高分子が表面に固定化されたバイオチップが開発されている。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。しかしながら、デキストランのような大きな分子を介してペプチドなどの生体分子を固定化した場合、デキストラン等の影響が大きく、ペプチドの性質の測定に悪影響を及ぼす可能性がある。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制して、なおかつ標的物質における結合シグナルを増大下、ペプチドチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
１．表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
【０００６】
【化１】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
２．チップ表面が金であることを特徴とする項１記載の方法。
３．チップの基板が透明基板であることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
４．２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする項１〜３のいずれか記載の方法。
５．固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のＳＨ基がマレイミド基と反応することを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
６．チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載の方法。
７．下記式
【０００７】
【化２】
（式中、「Substrate」はチップの基板を示し、「Peptide」はチップに固定化されるペプチド（結合に関与するCys残基を除く）を示し、S(Cys)は該ペプチドのCys残基のSH基に由来するSであることを示す。）
で表される構造を有するペプチドを固定化したチップ。
８．S(Cys)が、ペプチドの末端のCys残基のSH基に由来するSである項７に記載のチップ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明における低分子化合物を架橋剤に用いることにより、標的シグナルを向上させ、更に非特異的吸着が抑制された精度のよいペプチドチップを用いた測定系を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、チオール基を介してペプチドをチップに固定化することを特徴とする。
チオール基（ＳＨ）は、ペプチド中のシステイン残基に由来するのが好ましい。
固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで、ペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。
システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端（Ｎ末端もしくはＣ末端）のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をシステイン残基と目的のペプチドの間にさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００１０】
また、固定化されるペプチドに対して、チオール基を有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合され、この付加された化合物のチオール基を介してマレイミド基と結合してもよい。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１１】
本発明においては、ペプチドの固定化に際して、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤として、ＲがＨである式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくはＲがＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍ，ｎは前記に定義されるとおりである）である式（Ｉ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）を架橋剤として用いることを特徴としている。なお、本発明において用いる架橋剤は、式（Ｉ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含する。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+)（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
1/nＭは、Ｈ，Ｎａ，Ｋ，Ｌｉ，Ｃｓ等のアルカリ金属(ｎ＝１)、ＮＨ4，Ｎ(Ｍｅ)4等のＣ1〜Ｃ4のアルキル基で置換されていてもよい四級アンモニウム（ｎ＝１）、1/2Ｃａ，1/2Ｍｇ，1/2Ｂａ等のアルカリ土類金属（ｎ＝２）等が挙げられ、好ましくはアルカリ金属、より好ましくはＮａである。
【００１３】
上述したような式（Ｉ）の架橋剤を適用することにより、特に高分子量の架橋剤と比べて、ペプチドのチップへの固定化効率が格段に高くなるため標的物質との結合効率も向上して、結合によるシグナルがより鮮明になるという効果を奏するものである。また、非特異的な影響に関してもほとんど問題とならず、いわゆるＳ／Ｎ比を大きくすることができる。
【００１４】
上記ＳＭＣＣもしくはＳＳＭＣＣをチップ上に導入させてマレイミド表面を形成させるためには、ＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスクシンイミド基あるいはＳＳＭＣＣにおけるもう一方の端に有するスルホン酸スクシンイミド基と反応性を有する官能基、具体的にはアミノ基を予めチップ上に導入させておく必要がある。チップ上にアミノ基を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いてアミノ基を導入する手段なども含まれる。
本発明の方法の第一工程は、アミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）の化合物とを反応させ、式（Ｉ）の化合物のコハク酸イミド部分（スルホン酸基またはその塩を有していてもよい）を脱離させてアミド結合を形成し、マレイミド基を基板に導入する。
該反応は、基板上のアミノ基１モルに対して１モルから過剰量の式（Ｉ）の架橋剤の水溶液（Ｒがスルホン酸又はその塩の場合）または有機溶媒（Ｒが水素原子の場合）溶液を基板上に塗布するか、或いは基板を式（Ｉ）の架橋剤の水溶液又は有機溶媒溶液に浸漬することにより、行うことができる。反応は、例えば１０〜６０℃程度（好ましくは室温）の温度下に、１〜２４時間程度反応させることで有利に進行する。
次に、第二工程では、チオール基を有するペプチドと式（Ｉ）の化合物に由来する基板にアミド結合を介して導入されたマレイミド基を反応させる。反応は、マレイミド基１モルに対しチオール基を有するペプチドを１モルから過剰量使用し、溶媒中で、１０〜６０℃程度（好ましくは室温）の温度下に、１〜２４時間程度反応させることで有利に進行する。溶媒としては、水、含水有機溶媒（含水エタノール、含水メタノール、含水プロパノールなどの含水アルコール、含水ＴＨＦ、含水アセトン、含水ＴＨＦなど）、低級アルコール、ＤＭＦ，ジメチルアセトアミド、ＤＭＳＯなどの水混和性の有機溶媒が例示される。
【００１５】
得られたペプチドを固定化したチップにおいて、マレイミド基が残存している可能性がある。この残存マレイミド基はそのまま残されていてもよいが、チオール基を有する化合物とさらに反応させて、残存マレイミド基を除いておくことが望ましい。この反応条件は、溶媒としてより極性の低い有機溶媒を使用できる点を除いて第二工程のチオール基を有するペプチドとの反応と同様な条件で実施することができる。
【００１６】
本発明におけるペプチドチップの固定化方法はさまざまな用途に応用可能である。一般にアレイにおける検出手段としてよく用いられている蛍光性物質、化学発光性物質、放射性物質等による検出系においても有効であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着してなければ、正確に測定できているものと判断することができる。
【００１７】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の固定化方法は非常に効果的である。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングを行うことが好ましい。特に未反応のマレイミド基表面をブロッキングする場合は、チオール基を有する化合物を用いるのが好ましく、特にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の誘導体が好適に用いられる。
【００１９】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００２０】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００２１】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。
【００２２】
ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２３】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２４】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００２５】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面積は１０〜１０００ｍｍ2に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００２６】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００２７】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００２８】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００２９】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎDは１．５以上であることが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１００００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
【００３１】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００３２】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されてパターン化される。照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００３３】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＳＳＭＣＣ（ピアス製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に０．４ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに１５分間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とSSMCCのNHS基が反応し、未反応のMAL基を表面に導入することができた。
【００３４】
上記のようにして得られた表面に、図１下部に示したように、プロテインキナーゼＡの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＡ基質のネガティブコントロール（ｎＰＫＡ；セリン残基がアラニン残基に置換）、プロテインキナーゼＡ基質のポジティブコントロール（ｐＰＫＡ；セリン残基がリン酸化）、ｃＳｒｃキナーゼの基質となるアミノ酸配列からなるペプチド（ｃＳｒｃ）を、いずれもリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒスポッター（東洋紡績製）を用いて１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。アレイの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、上記ＴＥＧ−ＳＨ（HS-(CH2CH2O)4-CH3）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。また比較例として、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、室温で１時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。
（ＳＰＲ解析によるＰＫＡリン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイを用いてＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃、４時間反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ４μｌとした。その後、ＰＢＳ及び水で３回ずつアレイの洗浄を行い、アレイ表面を乾燥した後、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化セリン抗体ＰＳＲ−４５（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで４０００倍、２０００倍、１０００倍希釈した溶液を用いて希釈倍率の高いものから順に作用させた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
（観察の結果と考察）
ＳＰＲシグナル変化をグラフ化したセンサグラムの結果を図１に示した。センサグラムはスポットごとにおけるシグナルの平均値をプロットしている。Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄについては、基質ペプチドのスポット部分以外の任意に選択した箇所を測定ポイントとして得たシグナルの平均値をプロットしている。ポジティブコントロールに対しては非常に強い抗体結合シグナルの上昇を確認されており、ＰＫＡ基質においてもある程度の結合シグナルの上昇を認めることができる。一方、ネガティブコントロール、ｃＳｒｃ基質、ブランク及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄに関してはほとんどシグナル変化を認めることができない。したがって、この方法により、非常に特異的にＰＫＡ基質のリン酸化を検出することができている。
［比較例１］
金表面に８−ＡＯＴを導入した後、ＳＳＭＣＣの替わりに、分子量３４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）を作用させる点を除き、全て実施例１と同様にして検討した。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬはリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。結果を図２に示す。
【００３５】
この場合は、全体的に結合シグナル自体が弱くなっている。更にＰＫＡ基質以外においても非特異的なシグナルが確認されており、特異性の点でも好ましくない結果である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法により、ペプチドチップにおける結合シグナルを増幅させることができつつ、非特異的吸着に関しては抑制することができ、より正確な測定が可能となる。また処理方法も非常に容易であり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【図２】比較例１におけるＳＰＲ解析の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
【化１】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+）（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
【請求項２】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のＳＨ基がマレイミド基と反応することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
下記式
【化２】
（式中、「Substrate」はチップの基板を示し、「Peptide」はチップに固定化されるペプチド（結合に関与するCys残基を除く）を示し、S(Cys)は該ペプチドのCys残基のSH基に由来するSであることを示す。）
で表される構造を有するペプチドを固定化したチップ。
【請求項８】
S(Cys)が、ペプチドの末端のCys残基のSH基に由来するSである請求項７に記載のチップ。
【請求項１】
表面にアミノ基を有するチップの基板と式（Ｉ）で表される化合物：
【化１】
（式中、Ｒは水素原子またはＳＯ3-(1/nＭn+）（Ｍn+はｎ価のカチオンを示す。ｎは１又は２を示す。）である）
を反応させてチップの基板にマレイミド基を導入する工程、チオール基を有するペプチドと該マレイミド基を反応させてペプチドを固定化する工程、必要に応じてさらに基板上に残存するマレイミド基をブロッキングする工程を含む、ペプチドを固定化したチップの製造方法。
【請求項２】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
固定化されるペプチドの少なくとも一方の末端がシステイン残基であり、該システイン残基のＳＨ基がマレイミド基と反応することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
下記式
【化２】
（式中、「Substrate」はチップの基板を示し、「Peptide」はチップに固定化されるペプチド（結合に関与するCys残基を除く）を示し、S(Cys)は該ペプチドのCys残基のSH基に由来するSであることを示す。）
で表される構造を有するペプチドを固定化したチップ。
【請求項８】
S(Cys)が、ペプチドの末端のCys残基のSH基に由来するSである請求項７に記載のチップ。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−４７０１７（Ｐ２００６−４７０１７Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２６０００（Ｐ２００４−２２６０００）
【出願日】平成１６年８月２日（２００４．８．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２日（２００４．８．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ゲノム研究成果産業利用のための細胞内シグナル網羅的解析技術」委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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