ホスフェートを含む芳香族化合物およびラマン分光法を用いる有機体および酵素反応を検出するための方法
本開示は、サンプル中の有機体および分子の迅速且つ高感度の検出システムを提供する。ラマン活性生成物を生成する反応物を、ラマン光散乱と組み合わせて使用する。かかる化合物は、ホスファターゼの検出を可能にするホスフェートを含むことができる。本開示を使用して、酵素反応速度を測定することもできる。本開示は、従来技術よりも高い感度および特異性で生物有機体および生物学的成分を同定および定量するためのラマン分光法と生物学的標識技術との組み合わせを使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への相互参照
本願は、仮出願第６０／８３６，９３６号（２００６年８月１１日に出願）および仮出願第６０／７２７，３２８号（２００５年１０月１７日に出願）に対する優先権を主張する出願第１１／５８０，８４５号（２００６年１０月１６日に出願）の一部継続出願である、出願第１２／０８１，４９６号（２００８年４月１６日に出願）の一部継続出願である米国特許出願第１２／３７２，４９０号（２００９年２月１７日に出願）に対する優先権を主張する。これらの米国特許出願、仮出願はその全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の説明
発明の分野
本開示は、一般に、生物学的診断装置および試験方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物有機体または生物学的成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、または他の遺伝子材料）を検出するためのシステムが必要な分野が現在多数存在する。これらの領域には、以下が含まれる：食品安全性、医学的診断および獣医学的診断、病原体検出、法医学、および国土防衛。現在の検出方法には、免疫化学および分子生物学、ならびに生物学的技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など）が含まれる。これらの方法および技術は、しばしば、正確性、特異性、および感度が制限される。さらに、かかる方法は、しばしば、大規模なサンプル調製（核酸の単離および精製など）が必要である。
【０００４】
検出方法の特異性を、免疫学的技術の使用によって強化することができる。例えば、医学的診断には、サンプルの生物学的成分の検出において特異性を得るための抗体ベースの技術を使用する。特定の化合物に対して開発された抗体は、これらの成分に対して高い親和性および特異性を有することが公知である。しかし、抗体は検出が困難であり、典型的には、検出を増強する標識およびタグで化学修飾する。不運なことに、抗体検出は、サンプル中の他の材料（サンプルマトリックス、洗浄成分、および他の化学的および生物学的作用因子が含まれる）からの干渉を受ける傾向がある。さらに、現在の技術は、低濃度または少数の抗体（すなわち、低濃度または少数のターゲティングした生物学的成分）での感度を欠く。
【０００５】
ラマン光散乱技術（ラマン分光法）は、従来、特定の化学成分を検出するために使用されていた。ラマン散乱は、分子との光の相互作用の基本的性質である。光が分子に衝突する場合、光は分子の原子を振動させることができる。次いで、この振動は、分子から散乱したさらなる光のエネルギーを変化させるであろう。この散乱光は、測定可能であり、且つ振動分子の構造に固有の特徴を有する。したがって、ラマンスペクトルを使用して、分子を固有に同定することができる。
【０００６】
ラマン分光法は、既存の検出方法（定量化可能なデータの簡潔な適用および作成が含まれる）を超えるいくつかの利点を有する。しかし、ラマン分光法自体は、生物有機体および生物学的成分の検出のための特異性および感度を欠く。したがって、有機体および生物学的成分の検出のためにラマン分光法を使用可能な試薬および方法が当該分野で必要である。
【０００７】
本開示は、従来技術よりも高い感度および特異性で生物有機体および生物学的成分を同定および定量するためのラマン分光法と生物学的標識技術との組み合わせを使用する方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本開示の１つの実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび以下：
ｉ．（任意選択的に）少なくとも１つの芳香族化合物
ｉｉ．少なくとも１つのアミン含有化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【０００９】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレンおよび５−アミノサリチル酸から選択される。
【００１０】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５−ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択される。
【００１１】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１２】
【化１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００１３】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１４】
【化２】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００１５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１６】
【化３】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００１７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００１８】
【化４】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００１９】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２０】
【化５】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００２１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２２】
【化６】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００２３】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２４】
【化７】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００２５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は芳香族アミンを含む。別の実施形態では、芳香族アミンは、以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む。
【００２６】
【化８】
別の実施形態では、少なくとも１つの電子供与化合物は過酸化水素である。別の実施形態では、過酸化水素は、芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つの酵素はペルオキシダーゼである。
【００２７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は２−ヒドロキシベンジルアルコールであり、少なくとも１つのアミン含有化合物は５−アミノサリチル酸であり、少なくとも１つの電子供与化合物は過酸化水素尿素であり、少なくとも１つの酵素はペルオキシダーゼである。
【００２８】
別の実施形態では、混合物を塩基の存在下でインキュベートする。
【００２９】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【００３０】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプル、５−アミノサリチル酸、ならびに芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素Ｈ２Ｏ２から選択される過酸化水素を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程を含む、方法である。
【００３１】
１つの実施形態では、混合物はビオチンをさらに含む。
【００３２】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプル、ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、またはｍ−フェニレンジアミンを含む芳香族アミン、ならびに芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、およびＨ２Ｏ２から選択される過酸化水素を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程、を含む方法である。
【００３３】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの標的を検出する方法であって、
ａ）標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物を標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、少なくとも１つのリガンドが酵素を含む、工程、
ｃ）混合物に、
ｉ．任意選択的に少なくとも１つのアミン含有化合物；
ｉｉ．少なくとも１つの芳香族化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を与える工程、
ｄ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【００３４】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレンおよび５−アミノサリチル酸から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５ ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択される。
【００３５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００３６】
【化９】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００３７】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００３８】
【化１０】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００３９】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００４０】
【化１１】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００４１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４２】
【化１２】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００４３】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４４】
【化１３】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００４５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４６】
【化１４】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００４７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４８】
【化１５】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００４９】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、芳香族アミン（以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む）を含む。
【００５０】
【化１６】
別の実施形態では、少なくとも１つの電子供与化合物は、芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。
【００５１】
別の実施形態では、酵素はペルオキシダーゼである。
【００５２】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は２−ヒドロキシベンジルアルコールであり、アミン含有化合物は５−アミノサリチル酸であり、電子供与化合物は過酸化水素尿素であり、酵素はペルオキシダーゼである。
【００５３】
別の実施形態は、サンプル中の酵素活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび
ｉ．任意選択的に少なくとも１つの芳香族化合物、
ｉｉ．少なくとも１つのアミン含有化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物をインキュベートして少なくとも１つの電荷移動複合体を形成させる工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つの電荷移動複合体を検出する工程、
を含む、方法である。
【００５４】
別の実施形態は、少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）（任意選択的に）少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）少なくとも１つのアミン含有化合物、
ｃ）少なくとも１つの電子供与化合物、および
ｄ）（任意選択的に）少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含む、キットである。
【００５５】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレン、５−アミノサリチル酸、およびｏ−フェニレンジアミンから選択され、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択され、少なくとも１つの電子供与化合物は、有機過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。
【００５６】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００５７】
【化１７】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００５８】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００５９】
【化１８】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００６０】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００６１】
【化１９】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００６２】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６３】
【化２０】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００６４】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６５】
【化２１】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。
【００６６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６７】
【化２２】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００６８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６９】
【化２３】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００７０】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、芳香族アミン（以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む）を含む。
【００７１】
【化２４】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび少なくとも１つのリン酸基を含む少なくとも１つの芳香族化合物を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む方法である。
【００７２】
１つの実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７３】
【化２５】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７４】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７５】
【化２６】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７７】
【化２７】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７９】
【化２８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００８０】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００８１】
【化２９】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む。
【００８２】
別の実施形態では、少なくとも１つの酵素はホスファターゼを含む。
【００８３】
別の実施形態では、ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。
【００８４】
別の実施形態では、アルカリホスファターゼは抗体に抱合している。
【００８５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェートを含む。
【００８６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む。
【００８７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む。
【００８８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、ヒドロキノンジホスフェートを含む。
【００８９】
別の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムである。
【００９０】
別の実施形態では、酸化剤はメタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００９１】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【００９２】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの標的を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物を少なくとも１つの標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、少なくとも１つのリガンドがホスファターゼを含む、工程、
ｃ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物に混合物を与える工程、
ｄ）混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
インキュベートする工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【００９３】
１つの実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９４】
【化３０】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、およびＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９６】
【化３１】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９８】
【化３２】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９９】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【０１００】
【化３３】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【０１０２】
【化３４】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む。
【０１０３】
別の実施形態では、以下：
【０１０４】
【化３５】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０５】
別の実施形態では、以下：
【０１０６】
【化３６】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０７】
別の実施形態では、以下：
【０１０８】
【化３７】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、以下：
【０１１０】
【化３８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、以下：
【０１１２】
【化３９】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１１３】
別の実施形態では、混合物を塩基の存在下でインキュベートする。
【０１１４】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【０１１５】
別の実施形態では、リガンドは、受容体および抗体から選択される。別の実施形態では、リガンドは抗体である。
【０１１６】
別の実施形態では、少なくとも１つの標的は有機体である。別の実施形態では、有機体は、バクテリオファージ、細菌（大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、およびブドウ球菌が含まれる）、およびウイルス（ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）から選択される。
【０１１７】
別の実施形態では、標的は、有機体の成分である。１つの実施形態では、成分はタンパク質である。別の実施形態では、タンパク質はインターロイキンである。１つの実施形態では、インターロイキンはＩＬ−２である。別の実施形態では、タンパク質は、Ｃ反応性タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩから選択される。別の実施形態では、標的は、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、代謝産物、炭水化物、ホルモン、および代謝中間体から選択される有機体の成分である。
【０１１８】
別の実施形態は、少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）任意選択的に酸化剤、
ｃ）任意選択的に塩基、および
ｄ）任意選択的に少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含むキットである。
図面の簡単な説明
特許書類または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む特許および特許出願公開書類の副本は、請求および必要な料金の納付の上で特許庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、生物有機体または生物学的成分の検出のための典型的な先行技術の免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ）の流れ図である。
【図２】図２は、開示の装置の実施形態の線図である。
【図３】図３は、生物有機体および／または生物学的成分の検出のための開示の技術の実施形態の流れ図である。
【図４】図４は、化学成分のラマン活性化合物への変換についての酵素系のブロック線図である。
【図５】図５は、特定の標的分子を励起するためのレーザー光周波数の選択技術の流れ図である。
【図６】図６は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインされたマイクロ流体チャネルの説明図である。
【図７】図７は、カスタム集積回路などに組み込むことができる一連のマイクロ流体チャネルの説明図である。
【図８】図８は、リステリアを含むサンプル（ａ）およびリステリアを含まないサンプル（ｂ）についてのペルオキシダーゼに結合した抗体を使用した病原性細菌（リステリア）の酵素結合免疫アッセイ由来のラマンスペクトルのプロットを、横座標にプロットしたシフト数（ｃｍ−１）および縦座標にプロットしたシグナルの規模（任意の単位）と共に示す。
【図９Ａ】図９Ａは、３回の実験においてラマン試薬処方物Ａ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図９Ｂは、３回の実験においてラマン試薬Ａ−１を使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図９Ｂ】図９Ａは、３回の実験においてラマン試薬処方物Ａ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図９Ｂは、３回の実験においてラマン試薬Ａ−１を使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１０】図１０は、ラマン試薬Ａ−１（菱形）、ラマン試薬Ａ−２（三角）、およびＡ−３（四角）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１１】図１１は、ラマン試薬処方物Ａ−１（菱形）およびラマン試薬Ａ−２（四角および三角）を使用して得られた３５００−４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１２】図１２は、ラマン試薬処方物Ａ−２（四角）および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物を用いたＡ−２（菱形）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１３】図１３は、ラマン試薬Ｂ−１（菱形）、Ｂ−２（四角）、Ｂ−３（三角）、およびＢ−４（「Ｘ」）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１４】図１４は、ラマン試薬Ｂ−２（四角）および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物を用いたＢ−２（菱形）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ラマン試薬Ｃ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１５Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、ラマン試薬Ｃ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１５Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ラマン試薬Ｄ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１６Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１６Ｂ】図１６Ａは、ラマン試薬Ｄ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１６Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１７】図１７は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰおよびＡＳＡ−ＵＰを使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１８】図１８は、試験試薬の相対感度を示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、ＢＡＳＨ−ＵＰおよびＴＭＢを使用したＩＬ−２免疫アッセイにおいて３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルおよび４５０ｎｍで測定した吸収スペクトルのプロットである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応の吸収スペクトルのプロットであり、図２０Ｂは、ＯＰＤ反応の吸収スペクトルである。
【図２０Ｂ】図２０Ａは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応の吸収スペクトルのプロットであり、図２０Ｂは、ＯＰＤ反応の吸収スペクトルである。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｄ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ａ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｃ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｄ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応によってそれぞれ得られたラマンシグナルのプロットである。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応によってそれぞれ得られたラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｃ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｄ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｅ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂは、ピロガロールのラマンシグナルのプロットである。両図は、水酸化ナトリウムの添加の際のラマンシグナルの増強を示す。図２６Ａ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ａ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないベンゾキノンのラマンシグナルのプロットである。図２６Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したピロガロールのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないピロガロールのプロットである。
【図２６Ｂ】図２６Ａは、ベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂは、ピロガロールのラマンシグナルのプロットである。両図は、水酸化ナトリウムの添加の際のラマンシグナルの増強を示す。図２６Ａ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ａ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないベンゾキノンのラマンシグナルのプロットである。図２６Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したピロガロールのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないピロガロールのプロットである。
【図２７Ａ】図２７Ａは１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２７Ｂは１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。両図は、過ヨウ素酸塩および水酸化ナトリウムの依存を示す。図２７Ａ（ａ）は、過ヨウ素酸塩またはＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｂ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩を使用しないがＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｂ）は、１，４−イミノナフタキノンを含むホウ酸緩衝液のラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。
【図２７Ｂ】図２７Ａは１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２７Ｂは１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。両図は、過ヨウ素酸塩および水酸化ナトリウムの依存を示す。図２７Ａ（ａ）は、過ヨウ素酸塩またはＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｂ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩を使用しないがＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｂ）は、１，４−イミノナフタキノンを含むホウ酸緩衝液のラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。
【図２８Ａ】図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ−抗体抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ−抗体抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。図２９Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体の濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０００ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｅ）０．１ｎｇ／ｍｌ、および（ｆ）０ｎｇ／ｍｌ。図２９Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）０．１ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）０．０１ｎｇ／ｍｌ、および（ｅ）０ｎｇ／ｍｌ。
【図２９Ｂ】図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。図２９Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体の濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０００ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｅ）０．１ｎｇ／ｍｌ、および（ｆ）０ｎｇ／ｍｌ。図２９Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）０．１ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）０．０１ｎｇ／ｍｌ、および（ｅ）０ｎｇ／ｍｌ。
【図３０Ａ】図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは、０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。図３１Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５００ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２５０ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｅ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｆ）０ｍＵ／ｍＬ。図３１Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）０．０２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｅ）０ｍＵ／ｍＬ。
【図３１Ｂ】図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは、０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。図３１Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５００ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２５０ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｅ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｆ）０ｍＵ／ｍＬ。図３１Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）０．０２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｅ）０ｍＵ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
発明の詳細な説明
食品安全性、医学的診断、獣医学的診断、病原体検出、法医学、および国土防衛などの領域には、生物有機体（汚染細菌など）および生物学的成分（タンパク質、ＤＮＡ、または他の遺伝子材料など）の迅速且つ特異的な同定が必要である。細菌の迅速且つ感度の高い検出方法が当該分野で特に必要である。
【０１２１】
サンプル中の細菌を同定するための一般的なアッセイは免疫アッセイであり、このアッセイは細菌に結合した抗体の検出に依存する。典型的には、抗体を標識し、標識の存在をアッセイすることによって抗体の存在を検出する。あるいは、抗体を酵素に抱合し、抗体−酵素抱合体の存在を酵素活性のアッセイによって検出する。酵素−抗体抱合体を使用する一般的に使用されているアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。標準的アッセイでは、酵素活性を、酵素によって比色手段、蛍光発生手段、および化学発光手段によって検出可能な生成物に変換される反応物の存在下での酵素−抗体抱合体のインキュベーションによって測定することができる。
【０１２２】
しかし、比色手段、蛍光発生手段、および化学発光手段による検出は、制限されたダイナミックレンジ、制限された感度、およびバックグラウンドからの干渉などのいくつかの欠点に悩まされている。
【０１２３】
ラマン分光法はこれらの方法を超えるいくつかの利点を有するが、一般に、ラマン分光法を、一般的に使用されている比色試薬、蛍光発生試薬、および化学発光試薬と組み合わせて使用することができない。なぜならば、これらは、典型的には、有用なラマンスペクトルを生じないからである。例えば、比色試薬である３，３’，５，５’−テトラメチル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｅｌｅｎｅ）ベンジジン（ＴＭＢ）およびアジノビスエチル（ｅｔｈｌｙ）ベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）は、有機体の検出に有用なラマンスペクトルを生じない。したがって、有機体の検出に有用なラマン活性生成物を生じる試薬（酵素−抗体抱合体を使用した免疫アッセイ形式で使用することができる試薬が含まれる）が望まれる。
【０１２４】
ラマン分光法を使用した免疫アッセイ形式での細菌の検出に有用な試薬は、一定の好ましい特徴を有する。第１に、試薬は、細菌によって生じたバックグラウンドシグナルを事前に持たないラマンスペクトル領域中にラマンシグナルを生じるべきである。第２に、試薬によって生じたラマンシグナルは定量可能で、広範な濃度範囲にわたる検出が可能であるべきである。
【０１２５】
本開示は、その一部が、一定のアミン含有化合物を免疫アッセイ形式で使用して有機体および成分（核酸およびタンパク質など）を検出することができるという発見に基づく。これらの試薬を酵素的に変換して、細菌由来のラマンシグナルを事前に含まないスペクトル領域でラマンシグナルを有するイミノキノンまたは他の生成物を生成する。ラマンシグナルの検出は酵素の存在を示す。酵素がＥＬＩＳＡアッセイで使用した抗体抱合体の一部である場合、ラマンシグナルの検出は、ＥＬＩＳＡの標的の存在を示す。あるいは、ラマン活性試薬を酵素と共にインキュベートして、これらの試薬を試薬と異なるラマンスペクトルを有する生成物に変換することができる。ラマンシグナルの変化は酵素の存在を示す。したがって、これらの試薬の使用により、迅速、特異的、且つ定量的な酵素活性の検出が可能である。
【０１２６】
本開示はまた、一定の組み合わせおよび量の本開示の試薬が優れた感度を示すという発見に一部基づく。この感度を、多波数スペクトル分析を使用する開示の定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）法の使用によってさらに増強することができる。
【０１２７】
本開示はまた、他の比色試薬と対照的に、比色試薬ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を使用してラマン活性生成物を生成することができるという発見に一部基づく。ＯＰＤをラマン分光法と組み合わせて使用して、酵素活性のリアルタイム反応速度を測定することができる。
【０１２８】
本開示はまた、少なくとも１つのリン酸基を有する化合物をホスファターゼ基質として使用してラマン活性生成物またはラマン活性生成物の前駆体を生成することができるという発見に一部基づく。ホスファターゼ基質は、ホスファターゼの存在下で酵素的に脱リン酸化されて対応するフェノールまたはアミノフェノールを形成し、次いで、酸化剤を使用するか使用しないで酸化されて対応するラマン活性キノンまたはイミノキノンを生成することができる芳香族化合物であり得る。ホスファターゼ基質を、免疫アッセイ形式で使用することができる。ホスファターゼはアルカリホスファターゼであり得る。ラマン活性生成物の前駆体を、塩基への曝露によってラマン活性生成物に変換することができる。塩基はＮａＯＨであり得る。
【０１２９】
いかなる理論にも拘束されないが、本開示は一定の化合物がラマン分光法によって検出することができる電荷移動複合体を形成する能力に基づくと考えられる。かかる複合体の存在は、これらの化合物が電荷移動複合体の形成と一致する広いラマンピークを生じるという発見によって支持される。例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒｓ，” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１４６８−１１４８０（１９９７）を参照のこと。一定の化合物がラマン検出可能な電荷移動複合体を生成するという発見は、かかる複合体を生成する反応物を選択するための手段を提供する。
【０１３０】
定義
「抗体」は、本明細書中で使用する場合、免疫グロブリンまたはその一部を意味し、供給源、産生方法、および他の特徴と無関係に抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。本用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、およびＣＤＲグラフティング抗体が含まれる。抗体の一部には、依然として抗原に結合することができる任意のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）が含まれ得る。抗体の起源は、産生方法と無関係にゲノム配列によって定義される。
【０１３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の多量体形態をいうために交換可能に使用され、天然に存在するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生物学的に修飾されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、またはデザイナーアミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチド模倣物、デプシペプチド、および修飾、環状、二環式、デプシ環式、またはデプシ二環式のペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。本用語は、単鎖タンパク質および多量体が含まれる。
【０１３２】
用語「アミノ酸」は、アミノ酸の単量体形態をいい、天然に存在するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、またはデザイナーアミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチド模倣物、およびデプシペプチドが含まれ得る。
【０１３３】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」は、本明細書中で、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態をいうために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログまたは誘導体を含むことができる。
【０１３４】
用語「ヌクレオチド」は、単量体ヌクレオチドをいい、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログまたは誘導体が含まれる。
【０１３５】
用語「リガンド」は、別の分子（受容体が含まれる）に結合する分子をいう。
【０１３６】
免疫アッセイ形式
本開示を、種々の形式で実施することができる。１つの実施形態では、形式は免疫アッセイである。一定の免疫アッセイ実施形態では、標的生体物質を、固体表面に結合した抗体に最初に結合させる。次いで、試験サンプルの非結合成分を任意選択的に洗い流して結合した生体物質／抗体結合体（ｂｉｏｌｏｇｉｃ／ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のみを残し、これらを紫外線のラマン散乱によって検出することができる。
【０１３７】
他の免疫アッセイ実施形態では、標的生体物質を、抗体または抗体−酵素抱合体に最初に結合させる。この生体物質／抗体結合体または生体物質／抗体−酵素結合体は、生体物質／抗体結合体または生体物質／抗体−酵素結合体の抗体部分を介して、基質化合物（少なくとも１つのリン酸基を有する芳香族有機化合物など）と反応する。次いで、基質化合物を、ラマン活性生成物にさらに酸化させる。かかる実施形態では、したがって、標的生体物質を、ラマン活性生成物の検出によって定量する。
【０１３８】
１つの実施形態では、ラマン分光法と生体標識技術との組み合わせを使用して、生物学的成分（タンパク質またはペプチド（疾患に関連する特定の高次構造または条件の任意の翻訳後修飾物（例えば、プリオンタンパク質）が含まれる）など）を同定および定量する。
【０１３９】
感度を増大させるために、その後に１つまたは複数の新規の反応物を導入し、生体物質／抗体結合体に結合するようになるさらなる工程を想定する。ここで、新規の反応物の生体物質／抗体結合体との結合体を、ラマン散乱光を使用して検出することができる。かかる反応物の例には、表１に列挙した試薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
【表１】
生体物質／抗体結合体からの出発の代わりに、ラマン検出法は抗体を使用せずに生体物質と相互作用する化学物質を使用することができることも想定される。
【０１４１】
ラマンベースの方法を、多数の免疫アッセイ（ヒトＩＬ−１１、ラットＣ反応性タンパク質、可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩの検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。
【０１４２】
ラマンベースの方法を、種々の有機体および成分の検出に適用することができる。１つの実施形態では、バクテリオファージを検出する。別の実施形態では、細菌（大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、およびブドウ球菌が含まれる）を検出する。別の実施形態では、ウイルス（ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）を検出する。別の実施形態では、成分（タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、代謝産物、ホルモン、および代謝中間体が含まれる）を検出する。
【０１４３】
抗体以外の標的生体物質に特異的な結合パートナーまたはリガンド（例えば、生物学的受容体（タンパク質））を使用することができるということも想定される。
【０１４４】
本明細書中に開示の多数の技術が生物有機体および生物学的成分の検出に関連しているにもかかわらず、本開示はサンプル中の無機成分、有機成分、夾雑物、または毒素の検出に適用可能である。開示の検出技術を、共鳴ラマン光散乱を示す反応物の使用によって増強することができる。一定の反応物について、これらの反応物の構造に特異的なより高い強度の散乱光の周波数が存在する。本開示の一定の実施形態における共鳴現象は、標的分子の化学構造および相互作用にのみ関連し、表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）として公知の技術などで見出される任意の固体表面相互作用に関連しない。
【０１４５】
定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）
ラマンスペクトルを、定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）を得ることによって分析することができる。ＳＱＲ数は、サンプル中で測定されたターゲティングされた分析物に対応するラマンスペクトルと測定過程で認められた任意のバックグラウンドラマンシグナル／スペクトルとの間の相違である。ＳＱＲ過程の工程を表２に示す。
【０１４６】
【表２】
ＳＱＲ過程は、サンプル由来のラマンシグナルおよびバックグラウンドの評価が適切（すなわち、「妥当」）であり、サンプル中のターゲティングした分析物の存在を示すのに十分である（すなわち、「正値」）であるかどうかの評価を含むことができる。ＳＱＲ過程を、手作業またはデザインされたコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。バックグラウンドおよび試験スペクトルについての複数の波数のラマンシグナルを、表にしている。１つの実施形態では、バックグラウンドおよび試験スペクトルの両方について、１つおきの波数毎に表にしている。別の実施形態では、バックグラウンドおよび試験スペクトルの両方について、波数毎に表にしている。１つの実施形態では、波数範囲は２０００〜４０００ｃｍ−１である。別の実施形態では、波数範囲は３５００〜４０００ｃｍ−１である。試験シグナルとバックグラウンドシグナルとの間の差を波数範囲について決定し、この差の二乗を保存する。二乗の和を決定し、この和の平方根がＳＱＲ値である。
【０１４７】
ＳＱＲを使用する場合、ラマンスペクトルが意図する意味を有するように確実にネガティブおよび／またはサンプル運転を適切に運転する（不正確にアッセイされる系統誤差がない）ことによってその妥当性を検証することができる。バックグラウンドを測定する場合、バックグラウンドサンプルは、試験サンプル中の代表的なバックグラウンドシグナルでなければならず、装置のサンプル管を使用することなくラマン読み取りを行った場合に得られるシグナルなどの無作為なシグナルに起因しない。サンプルスペクトルは、ネガティブコントロールのスペクトルの下（未満）で一貫して運転してはならない。数学的には、より低い運転サンプルとバックグラウンドとの間の差を正値に変換し、潜在的に「正の」ＳＱＲシグナルと解釈する。
【０１４８】
以下の「妥当性」分析を行うことができる。波数（例えば、３２６０ｃｍ−１）でのバックグラウンドサンプル（「ネガティブコントロール」）のラマン値を、予想されるように運転すべきである（最小値超且つ最大値未満）。この決定は、確実に正確なサンプルをネガティブコントロールとして運転し、アッセイを正確に運転するための助けとなるであろう。ポジティブコントロールのＳＱＲ値は、予想値未満で運転すべきではない。これは、正確なサンプルをポジティブコントロールとして運転し、アッセイを正確に運転するための助けとなるであろう。各試験サンプルの「差の和」は、予想値未満で運転すべきではない。これらの分析は、確実にサンプルスペクトルがネガティブコントロールのスペクトルの下（未満）で一貫して運転されないための助けとなる。予想される最小値および最大値を、繰り返して行った実験で得られた値から最小値および最大値を確立することによって経験的に決定することができる。
【０１４９】
ＳＱＲ法を、手作業またはコンピュータを用いて行うことができる。開示の１つの実施形態は、ＳＱＲ計算用の装置操作可能な言語を有するコンピュータである。
【０１５０】
器具類
マイクロまたはナノファブリケーションテクノロジーを使用して、結合パートナーがカスタム集積回路（ラマン分光法のためのレーザーおよび検出器も含むであろう）中の１つまたは複数のマイクロ流体チャネル中に固定されたマイクロ流体チャネル（またはウェル）集積回路上で本開示の実施形態を実行することができることも想定される。かかる実行により、単一の生物学的成分（病原性細菌、タンパク質、または遺伝子材料など）を検出することができる。
【０１５１】
したがって、本開示の一定の実施形態の目的は、化学的相互作用（結合が含まれる）とラマン光散乱の最終工程との組み合わせを使用する成分の標的生物有機体の検出システムを得ることである。
【０１５２】
本開示の一定の実施形態の別の目的は、化学的相互作用（結合が含まれる）とラマン光散乱の最終工程との組み合わせを使用する無機または有機の標的成分の検出システムを得ることである。
【０１５３】
本開示の一定の実施形態の別の目的は、免疫アッセイとラマン光散乱を使用した検出とを組み合わせることである。
【０１５４】
本開示の一定の実施形態のさらに別の目的は、共鳴ラマン光散乱を生じる化学反応物の使用によって検出感度を増大させることである。
【０１５５】
本開示の一定の実施形態のさらに別の目的は、結合とラマン光散乱測定との組み合わせを実施することができるマイクロ流体チャネルまたはウェルを有する集積回路デザインを得ることである。
【０１５６】
本開示のこれらおよび他の目的および利点は、関連する図面を含む本開示を読んだ際に当業者に明らかとなるであろう。
【０１５７】
図１は、生物有機体または生物学的成分の検出のための典型的な先行技術の免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ）（１０）の流れ図である。この過程は、標的生体物質を含む液体サンプルの調製工程（１１）から開始される。例えば、サンプルを、成長培地（ハーフフレーザーブロスまたは他の適切な細菌成長培地など）中での前培養によって調製することができる。あるいは、試験用の液体サンプルを任意の液体供給源から得ることができる。固体材料を、適切な溶液に浸漬し、潜在的な標的有機体または分子を溶液に入れ、次いで、液体中でサンプリングすることができる。次の工程（１２）では、調製した液体サンプルを、固体表面に結合させた結合パートナーと組み合わせる（または混合する）。典型的な結合パートナーには、抗体、バクテリオファージ、およびバクテリオファージタンパク質が含まれる。例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレート、ラテックスビーズ、または磁性微粒子を使用することができる。他の固体支持体（ニトロセルロース、濾紙、ナイロン、および他のプラスチックなど）も使用することができる。次いで、抗体／生体物質結合体を、工程（１３）で生体物質および抗体を相互に結合可能な時間インキュベートする。一旦これが起こると、結合させた結合パートナー／生体物質をデカントし（注ぎ出し）、洗浄して非結合の生体物質および他の望ましくない材料を除去する。新規の反応物を工程（１５）で添加して、種々の方法によるシグナル分子の検出に対する混合物の感度を増強させる。かかる反応物の例には、表３に列挙した反応物が含まれる。
【０１５８】
【表３】
結合した結合パートナー／生体物質および新規の反応物を含む混合物を、工程（１３）で反応を起こす時間インキュベートする。多くの場合、この時点で、過程（１０）の反応部分は完全であり、工程（１１）〜（１５）（両端の工程を含む）中で産生されたか含まれる分子の測定工程（１６）を行うことができる。さらなる反応物が必要である場合、工程（１４）、（１５）、および（１３）を、適切なシグナル分子が存在するまで、１回または複数回連続して反復することができる。
【０１５９】
シグナル分子の測定によって定量的結果が得られ、次いで、この結果を分析し、工程（１７）で既知濃度の標的生体物質の較正反応の既知の組と比較することができる。この比較によって工程（１８）に進み、ここで、結果を定量し、工程（１１）で調製したサンプル中の標的生体物質の濃度の報告と関連づける。
【０１６０】
図１の過程（１０）の説明が生物有機体または生物学的成分の検出に関係していたにもかかわらず、過程（１０）は抗体または他の結合パートナーが反応し得る多数の分子型の検出にも適用可能である。
【０１６１】
図２は、本開示の検出サブシステム（２０）の実施形態の線図である。レーザー（２１）はレーザー・ビーム（２２）を生じ、これが焦点レンズ（２３）によって収束レーザー・ビーム（２４）に収束し、これが標的サンプル（２５）に当たる。サンプル（２５）由来の後方散乱光（２６）は、焦点レンズ（２７）によってビーム（２８）に収束する。ビーム（２８）は、検出器（３１）を有する分光計（３０）に向かう。検出器（３１）からの出力はシグナル（３２）であり、このシグナルは、分析、保存、および／またはプリンター（４２）を使用した印刷のためのパーソナルコンピュータ（４０）によって受信される。レーザー（２１）は、典型的には、可視領域で出力される連続波長（ＣＷ）レーザーである。例えば、アルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、アルゴンイオンレーザーポンプ波長可変性色素レーザー、またはダイオードレーザー（緑色、赤色、または他の周波数）。焦点レンズ（２３）および（２７）は、ミラー、レンズ、絞り、シャッター、回折格子、および／または偏光子を含む。標的サンプル（２５）は液体、気体、または固体であってよく、一定の実施形態では、標的サンプルは、液体または沈殿した固体を使用するであろう。分光計（３０）は、波長に基づいて、散乱光を空間的に分離する。本開示に有用な分光計の例は、Ｌａｍｂｄａ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓモデルＰＳ−１である。検出器（３１）は、分光計（３０）によって空間的に分離された光の振幅を測定し、電気信号（アナログまたはデジタル）に変換する。一定の実施形態では、検出器は、標準化されたコンピュータインターフェース（ＲＳ−２３２、ＵＳＢ、パラレル、ＩＥＥＥ１３９４など）を使用して電気信号を生じるであろう。本開示に有用な検出器（３０）の例は、Ｌａｍｂｄａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＰＳ−１である。パーソナルコンピュータ（４０）は、検出器（３１）への適切なインターフェースならびに分光計（３０）から受信した後方散乱光（２６）のスペクトルを分析、保存、および／または印刷するようにデザインされたソフトウェアを有する任意のデスクトップＰＣまたはラップトップＰＣであり得る。
【０１６２】
図３は、生物有機体および／または生物学的成分の検出のための本開示の実施形態の流れ図（３０）である。この過程は、標的生体物質を含む液体サンプルの調製工程（３１）から開始される。例えば、サンプルを、成長培地（ハーフフレーザーブロスまたは他の適切な細菌成長培地など）中での前培養によって調製することができる。あるいは、試験用の液体サンプルを任意の液体供給源から得ることができる。固体材料を、適切な溶液に浸漬し、潜在的な標的有機体または分子を溶液に入れ、次いで、液体中でサンプリングすることができる。次の工程（３２）では、調製した液体サンプルを、固体表面に結合させた抗体と組み合わせる（または混合する）。例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレート、ラテックスビーズ、または磁性微粒子を使用することができる。次いで、抗体／生体物質結合体を工程（３３）でインキュベートして、生体物質および抗体を相互に結合させる。一旦これが起こると、組み合わせた抗体／生体物質をデカントし（注ぎ出し）、洗浄して非結合の生体物質および他の望ましくない材料を除去する。新規の反応物を工程（３５）で添加して、ラマン光散乱による検出に対する混合物の感度を増強させる。かかる反応物の例を、表１に列挙する。
【０１６３】
結合した抗体／生体物質および新規の反応物を含む混合物を、工程（３３）で反応を起こす時間インキュベートする。多くの場合、この時点で、過程（３０）の反応部分は完全であり、工程（３１）〜（３５）（両端の工程を含む）によって産生されたラマン活性分子由来のラマン光散乱の測定工程（３６）を行うことができる。さらなる反応物が必要である場合、工程（３４）、（３５）、および（３３）を、適切なラマン活性分子が存在するまで、１回または複数回連続して反復することができる。
【０１６４】
ラマン光散乱の測定はスペクトルであり、次いで、このスペクトルを分析し、工程（３７）で既知濃度の標的生体物質の較正反応の既知の組と比較することができる。この比較によって工程（３８）に進み、ここで、結果を定量し、工程（３１）で調製したサンプル中の標的生体物質の濃度の報告と関連づける。
【０１６５】
リステリアを、（酵素結合免疫吸着アッセイ）ＥＬＩＳＡ形式で測定することができる。１００マイクロリットルの種々の濃度の細菌（１００，０００、５０，０００、２５，０００、１２，５００、６，２５０、および０コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を、抗リステリア抗体でコーティングしたマイクロウェルに添加する。３７℃で３０分間と６０分間との間のインキュベーション後、ウェルをデカントし、穏やかな洗浄液で３回洗浄する。１００μｌのペルオキシダーゼ抱合抗リステリア抗体をウェルに添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートする。ウェルをデカントし、穏やかな洗浄液で３回洗浄した。４−ヒドロキシルベンジルアルコール（８０．６ｍＭ）、４−アミノアンチピレン（２４ｍＭ）、過酸化水素尿素（１０．６ｍＭ）の混合物を含む１２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を添加し、３０〜６０分間発色させる。各ウェル由来の発色のラマンスペクトルに展開し、応答を定量する。
【０１６６】
図３の過程（３０）の説明が生物有機体または生物学的成分の検出に関連しているにもかかわらず、過程（３０）は、無機分子または有機分子、夾雑物、または毒素の検出にも適用可能である。
【０１６７】
図４は、化学成分のラマン活性化合物への変換のために酵素を使用する化学変換系（４０）のブロック線図である。例えば、（４１）、（４２）、および（４３）と命名した１つまたは複数の反応物を、生物学的触媒（４４）と混合する。生物学的触媒（４４）は、提供した反応物または１つまたは複数の反応物（４１）、（４２）、および（４３）と相互作用するようにデザインされたＲＮＡ構造の代謝に特異的な酵素であり得る。反応物の変換または組み合わせが反応（４５）で起こり、測定可能な生成物（４６）が形成される。例えば、反応物および表４中の反応物を、ペルオキシダーゼ（４４）および過酸化水素尿素（ＵＰ）（４３）の存在下で混合する。
【０１６８】
ペルオキシダーゼアッセイで有用な反応物
【０１６９】
【表４】
共に混合する場合、これらの反応物から、ラマン分光法を使用して検出可能なイミノキノン化合物が得られるであろう。ＨＢＡ、ＡＳＡ、およびＵＰを使用した反応を、ＢＡＳＨ−ＵＰという。
【０１７０】
ラマン活性生成物を生成することができるさらなる反応物を、開示の方法で使用することができる（ベンゼンまたはナフタレン中の１位および４位に少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を含む化合物など）。さらなる基（カルボキシル、アミン、塩素、臭素、ニトロ、および他の官能基など）を含めることにより、ラマンシグナルを増大させることができる。かかる化合物には、
【０１７１】
【化４０】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【０１７２】
かかる化合物には、
【０１７３】
【化４１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロ（ＮＯ２）から選択される）も含まれる。
【０１７４】
かかる化合物には、
【０１７５】
【化４２】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＮＯ２から選択される）も含まれる。
【０１７６】
開示の方法でラマン活性生成物を生成することができるさらなる化合物には、ベンゼン環またはナフタレン環中の１，２位または１，４位に少なくとも２つのヒドロキシル官能基を含む化合物が含まれる。
【０１７７】
かかる化合物には、
【０１７８】
【化４３】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【０１７９】
かかる化合物には、ポリフェノール（
【０１８０】
【化４４】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）など）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【０１８１】
開示の方法でラマン活性生成物を生成することができるさらなる化合物には、ベンゼンまたはナフタレン中のヒドロキシメチレン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｅｎｅ）（−ＣＨ２ＯＨ）基を含む化合物が含まれる。１位、４位、および６位にさらなるヒドロキシル基を含めることにより、ラマンシグナルを増大させることができる。
【０１８２】
かかる化合物には、
【０１８３】
【化４５】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【０１８４】
かかる化合物には、
【０１８５】
【化４６】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）も含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【０１８６】
かかる化合物には、芳香族アミン（オルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、およびパラ−フェニレンアミンを含む化合物が含まれる）も含まれる。
【０１８７】
かかる化合物には、２，４−ジアミノベンジルアルコール、２−アミノ−１−ナフトール、および４−アミノアンチピレンも含まれる。
【０１８８】
【化４７】
反応（４５）の生成物を、反応を定量的または定性的に報告する分子として使用することができ、そのようなものとして、例えば、特異的な抗体または生物学的もしくは化学的結合パートナーと結合した場合の特異的な生物学的標的の存在についてのプローブとして使用することができる。
【０１８９】
リン酸基を含む反応物
一定の化合物は、空気への曝露の際にラマン活性生成物を自発的に形成することができる（「自動酸化」）。かかる化合物は、一定のアッセイ形式（ＥＬＩＳＡなど）での使用に適していない。何故なら、かかる化合物は酵素によって活性化されることなくラマンシグナルを示すからである。本開示は、ラマンベースアッセイで使用可能なこれらの反応物の修飾バージョンを提供する。具体的には、自発的に酸化し得る本開示の化合物中に存在するヒドロキシル基をリン酸基で修飾して自発的酸化を防止することができる。そのようなものとして、これらの化合物により、本明細書中に開示の方法で使用することができる化合物型をさらに拡大される。さらに、本開示は、ホスファターゼ活性の検出に基づいたラマン分光法の使用方法を提供する。
【０１９０】
ラマン活性生成物を生成するさらなる反応物を、本明細書中に開示の方法で使用することができる（少なくとも１つのリン酸基を含む化合物など）。かかる化合物には、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物（例えば、置換基として少なくとも１つのリン酸基を有するベンゼン環またはナフタレン環を含む化合物）が含まれる。さらなる置換基（カルボキシル、アミン、塩素、臭素、ニトロ、および／または他の官能基など）を含めることにより、ラマン活性生成物のラマンシグナルを増大させることができる。本開示のかかる化合物は、例えば、相互にオルト（１，２）および／またはパラ（１，４）である官能基を有することができる。
【０１９１】
ヒドロキシフェニルホスフェート
４−ヒドロキシフェニルホスフェートは、触媒的に脱リン酸化されて４−ヒドロキシフェノール（ヒドロキノン）を生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されてベンゾキノンを形成する。これが電気化学的免疫アッセイで使用されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６８，２９２，１９８８）。
【０１９２】
オルト（１，２）位および／またはパラ（１，４）位でヒドロキシル化される化合物は、空気中で急速に酸化されて対応するキノン化合物を生成することができる。カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ヒドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）、およびピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）などの化合物は、空気中で急速に酸化されて対応するキノンを形成することが認められており、このキノンは、塩基（強水酸化ナトリウム溶液）での処理によってラマン分光法を使用して定量される高いラマンシグナルを生じた。ＮａＯＨ依存性シグナルは可逆性であった（反応物の酸性化の際に消滅し、ＮａＯＨの添加の際に再出現した）。
【０１９３】
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、以下の構造：
【０１９４】
【化４８】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択され、ＷはＯＨまたはＰＯ４から選択され、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣＯＯＨであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。別の実施形態では、ＸはＳＯ３Ｈであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。
【０１９５】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応によって触媒的に脱リン酸化され、次いで、酸化されてラマン活性キノン化合物を形成することができる。以下の反応によってこれを例示する：
【０１９６】
【化４９】
オルト（１，２）位またはパラ（１，４）位で酸化されたかかる化合物（例えば、カテコール（１，２−ジヒドロキシ−ベンゼン）、ヒドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）、およびピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）が含まれる）が空気中で急速に酸化されて対応するキノンを形成することができる。
【０１９７】
本開示のいくつかの実施形態では、キノン生成物のラマンシグナルを、塩基（強水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液など）での処理の際に増強させる。このシグナルの増強は、酸の添加の際にラマンシグナルが減少し、塩基添加の際に増加する（ラマンシグナル増強の回復）ように、ｐＨ依存性（すなわち、ＮａＯＨ依存性）であり得る。例えば、自動酸化およびＮａＯＨ添加の際のラマンシグナル増強は、カテコール、ピロガロール、および１，２，４−ベンゼントリオール（１，２，４−ｂｅｎｅｚｅｎｅｔｒｉｏｌ）について認められており、これらは以下の構造を有する：
【０１９８】
【化５０】
アミノフェニルホスフェート
４−アミノフェニルホスフェートが触媒的に脱リン酸化されて４−アミノフェノールを生成し、これがアルカリ条件下で空気によって急速に酸化されて１，４−イミノキノンを形成することも公知である（Ｔａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１４，１９７，１９８８）。このイミノキノン化合物は、電気化学的免疫アッセイによるアルカリホスファターゼの高感度検出で使用されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２７１，２２３，１９９３）。
【０１９９】
４−アミノフェノール、４−アミノ−２−クロロフェノール、および２，４−ジアミノフェノールなどの化合物は空気中で急速に酸化されて対応するイミノキノン化合物を形成し、塩基（強水酸化ナトリウム溶液）での処理によってラマン分光法を使用して定量することができる高ラマンシグナルを生じることが認められた。４−アミノフェノール、４−アミノ−２−クロロフェノール、および２，４−ジアミノフェノール由来の水酸化ナトリウム処理したイミノキノンのラマンスペクトルは、上記の水酸化ナトリウム処理したベンゾキノンと類似する。
【０２００】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのアミン基をさらに含み、以下の構造：
【０２０１】
【化５１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択され、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。
【０２０２】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応によって触媒的に脱リン酸化され、次いで酸化されて対応するラマン活性イミノキノン化合物を形成することができる。以下の反応によってこれを例示する：
【０２０３】
【化５２】
塩基（例えば、強ＮａＯＨ溶液）での処理の際、イミノキノンは、定量することができる増強されたラマンシグナルを生じることができる。
【０２０４】
ナフチルホスフェート
別のリン酸含有化合物（４−ヒドロキシナフチルホスフェート）は、触媒的に脱リン酸化されて１，４−ジヒドロキシナフタレンを生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されて１，４−ナフタキノンを形成する。これが検出感度の高い電流測定免疫アッセイで使用されている（Ｍａｓｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４０２，２９−３５，１９９９）。１位、２位、または両方の位置が官能基で置換されたナフチル化合物は、空気中で同様に急速に酸化されて対応するキノンを生成することができる。例えば、１，４−ジヒドロキシナフタレンは、空気中で急速に酸化されて１，４−ナフタキノンを形成することが認められたのに対して、１，３−ジヒドロキシナフタレンは自動酸化を示さなかった。さらに、１，４−ナフタキノンは、酸化剤を使用するか使用せずに高いラマンシグナルを生じることが見出された。強塩基（ＮａＯＨなど）の添加により、スペクトルパターンが変化することも見出された。
【０２０５】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのヒドロキシル基をさらに含み、以下の構造：
【０２０６】
【化５３】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、ＸおよびＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹはＨである。
【０２０７】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、触媒的に脱リン酸化されて対応するジヒドロキシナフタレンを生成することができ、これが空気中でさらに酸化されてラマン活性ナフタキノンを形成することができる。反応を以下に例示する：
【０２０８】
【化５４】
アミノナフチルホスフェート（ａｍｉｎｏｎａｐｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
別のリン酸含有化合物（４−アミノナフチルホスフェート）は、触媒的に脱リン酸化されて４−アミノ−１−ナフトールを生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されて１，４−イミノナフタキノンを形成する。これが検出感度の高い電流測定免疫アッセイで使用されている（Ｍａｓｓｏｎら，Ｔａｌａｎｔａ，６４，１７４−１８０，２００４）。
【０２０９】
１，４−イミノナフタキノンは、酸化剤を使用するか使用せずに強いラマンシグナルを生じることが認められており、これを使用してラマン分光法によって標的生体物質を定量することができる。ラマンスペクトルパターンは、強塩基（ＮａＯＨなど）を添加して変化させることができる。
【０２１０】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのアミン基をさらに含み、以下の構造：
【０２１１】
【化５５】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＰＯ４およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、ＸおよびＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹはＨである。
【０２１２】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、触媒的に脱リン酸化されて対応するアミノ−ナフトールを生成することができ、これがさらに酸化されてラマン活性イミノナフタキノンを形成することができる。反応を以下に例示する：
【０２１３】
【化５６】
さらなるフェニルホスフェート
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、以下の構造：
【０２１４】
【化５７】
（式中、ＸおよびＺは、Ｈ、ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＰＯ４からそれぞれ選択され、ＹおよびＷは、Ｈ、ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２からそれぞれ選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、Ｙ、Ｚ、およびＷはＯＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＨであり、ＺおよびＷはＯＨである。
【０２１５】
適切なレーザー光周波数の選択
図５は、共鳴ラマン検出のために特定の標的分子を励起するための１つまたは複数のレーザー光周波数の選択技術（５０）の流れ図である。ラマン活性生成物（５１）（図４の反応（４５）によって生成された生成物（４６）など）は、ラマン活性な構造を保有する化学物質である。生成物（５１）の吸収スペクトルを、工程（５２）において吸光度または透過率分光光度法などの技術を使用して測定する。工程（５３）では、生成物（５１）が工程（５２）で測定したスペクトルで認められた光を吸収する時点の１つまたは複数の波長を同定する。工程（５４）では、次いで、工程（５３）で同定した１つまたは複数の波長の１つに対応する波長で発光するレーザーを選択する。かかるレーザー波長は、可視領域、紫外線領域、または赤外領域に存在し得る。例えば、図３に記載のリステリア検出反応（３０）のために、選択したレーザー波長は５３２ｎｍである。
【０２１６】
最後に、工程（５５）では、工程（５４）で選択したレーザーを使用して、工程（５１）で作製したラマン活性生成物を照射する。これにより、検出に適切なシグナルを得るための工程（５１）で作製したラマン活性生成物の有意なラマン散乱が存在することが確認されるであろう。
【０２１７】
図６は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインしたマイクロ流体チャネル（６０）の説明図である。標的生物有機体または生物学的成分を含む供給源の液体（または気体）サンプル（６１）は、チャネル（６２）を流れる。標的生物有機体または生物学的成分は、反応して活性表面（６４）に結合した反応物に結合するであろう。レーザー（６５）からの光（６８）によりラマン散乱光（６９）を生じ、これを光検出器（６６）によって検出する。光検出器を、反応物と生物有機体または生物学的成分との結合体のラマンスペクトルに対応する１つまたは複数の特異的波長が測定されるようにデザインする。表面（６４）への生物有機体または生物学的成分の結合の代わりに、反応物を表面から放出することができ、ラマン散乱レーザー（６５）および検出器（６６）を表面から下流に配置することができることも想定される。
【０２１８】
図７は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインされた一連のマイクロ流体チャネル（７０）の説明図である。標的生物有機体または生物学的成分を含む１つまたは複数の供給源の液体（または気体）サンプル（７１Ａ）、（７１Ｂ）〜（７１Ｎ）がチャネル（７２Ａ）、（７２Ｂ）〜（７２Ｎ）を流れる。標的生物有機体または生物学的成分は、反応して活性表面（７４Ａ）、（７４Ｂ）〜（７４Ｎ）に結合した反応物に結合するであろう。レーザー（７５Ａ）〜（７５Ｎ）からの光（７８Ａ）〜（７８Ｎ）によりラマン散乱光（７９Ａ）〜（７９Ｎ）を生じ、これを光検出器（７６Ａ）〜（７６Ｎ）によって検出する。光検出器を、反応物と表面に結合した生物有機体または生物学的成分との結合体のラマンスペクトルに対応する１つまたは複数の特異的波長が測定されるようにデザインする。
【０２１９】
上限Ｎによって制限される一連のマイクロ流体チャネル中のマイクロ流体チャネル数は、２〜１００，０００の範囲である。異なる反応物およびレーザー波長の多様性を異なるチャネルで使用することができることも想定される。これにより、同一の生物有機体または生物学的成分からの散乱の複数の波長が検出可能であるか、複数の異なる生物有機体および生物学的成分の同時検出が可能であろう。最後に、一連のマイクロ流体チャネル（７０）の代わりに、一連のマイクロ流体ウェルを使用して一連の二次元ラマン散乱検出器を作製することができることが想定される。
【０２２０】
本開示を、以下の実施例でより具体的に記載する。実施例は、実施例の多数の修正形態および変更形態が当業者に明らかであるので、例示のみを目的とする。当業者は、本明細書中に記載の方法で使用した装置のパラメーターを本開示にしたがって変更することができると認識するであろう。種々の実施形態をここに詳述する。当業者は以下を意図するであろう。説明中および以下の特許請求の範囲を通して使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数が含まれる。また、説明中および以下の特許請求の範囲を通して使用する場合、「ｉｎ」の意味には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」が含まれる。本明細書中に引用され、本明細書中で考察された全ての引例は、その全体および各引例が個別に参考として援用されるのと同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：ＢＡＳＨ−ＵＰを使用したリステリアの検出
図８は、２成分ＢＡＳＨ−ＵＰ化学、酵素結合抗体、および以下の緩衝液および試薬を使用した下記のラマン検出手順を使用した酵素結合免疫アッセイから得た病原性細菌リステリアについてのラマンスペクトルを示す。
【０２２２】
作業塩類緩衝液（プロトコールで洗浄のための使用）：
１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．６７ｍＭ 塩化カリウム
０．０９ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
０．０５％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ−Ｌ
最終化学試薬（ＢＡＳＨ）：
０．５８８ｍＭ ５−アミノサリチル酸
０．１４５ｍＭ ２−ヒドロキシベンジルアルコール
０．００５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸
０．０９％ ツウィーン−２０
ＵＰ成分：
１．０６３ｍＭ 過酸化尿素
作業塩類緩衝液
さらなる試薬：
１．微粒子−抗リステリア（抗体）コーティングした磁性微粒子（添加の際、２００万微粒子／サンプル）。
２．抱合体溶液−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を抱合した抗リステリア（抗体）（添加の際、２μｇ／サンプル）
加熱死リステリアまたはネガティブブロス（１ｍｌ）のいずれかのサンプルを、以下の手順に供した。１ｍｌサンプルは、培養物、コントロール、スワブ、スポンジなどに由来し得ることに留意のこと。
【０２２３】
手順：
１．１００μｌの微粒子をサンプルに添加する。
２．室温で３０分間インキュベートする。
３．磁石を使用して微粒子を１０分間捕捉する。
４．サンプル体積を除去する。
５．５００μｌの作業塩類緩衝液を添加し、１０００ｒｐｍで２分間混合する。
６．磁石を使用して微粒子を２分間捕捉する。
７．洗浄体積を除去する。
８．工程３〜７をさらに２回繰り返す（全部で３回の洗浄）。
９．２００μｌ抱合体溶液を添加する。
１０．溶液を３０分間混合する。
１１．洗浄工程３〜７を繰り返す（全部で３回の洗浄）。
１２．２００μｌ最終化学試薬を添加する。
１３．１０００ｒｐｍで混合しながら２０分間インキュベートする。
１４．４０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
１５．１０００ｒｐｍで２分間混合する。
１６．磁石を使用して微粒子を２分間捕捉する。
１７．一定体積をラマンシグナル検出用キュベットに移す。
【０２２４】
この手順では、最終化学試薬は２成分ＢＡＳＨ−ＵＰ化学であった。ラマンシグナルは、一般に、約１時間以上安定であった。化学（ＢＡＳＨ）中の第１の成分は、２−ヒドロキシベンジルアルコール（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、５−アミノサリチル酸（０．１ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ツウィーン−２０、およびアスコルビン酸（１μｇ／ｍｌ）を作業塩類緩衝液（ｐＨ６．０）中に含んでいた。第２の成分（ＵＰ）は、過酸化尿素添加物（１ｍｇ／ｍｌ）、作業塩類緩衝液（ｐＨ６．０）（ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む）を含んでいた。これらの処方物は、直接照明を避けて１ヶ月超冷蔵した場合に活性を維持していた。ＵＰ：ＢＡＳＨ＝１：１０の比での２成分の混合により、ＢＡＳＨ−ＵＰの作業溶液を作製した。これは一般に１作業日で安定であった。
【０２２５】
ＢＡＳＨ−ＵＰのアリコートを、加熱死リステリアまたはネガティブブロスのいずれかを含むサンプルに添加し、３０分間反応させた。適切な期間は、必要とする検出感度に基づいて変化するであろう。４０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを２００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ反応体積に添加して反応を停止させ、生成物をラマン検出可能にする。ＮａＯＨの体積および濃度の変更により、特定のアッセイに必要なより高いシグナル安定性を得ることができる。
【０２２６】
高倍率設定で操作した５３２ｎｍレーザーを備えたラマンシステムＲ−３０００ラマン分光計を使用して、２４０μｌサンプル由来のラマン散乱を観察した。
【０２２７】
実施例２：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）の比色アッセイ
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）活性の比色アッセイを実施して、ラマンベースの方法と比較することができるデータを得た。ＴＭＢは、西洋ワサビペルオキシダーゼと反応した場合に濃青色の可溶性生成物を生じる。ＡＢＴＳは、西洋ワサビペルオキシダーゼと反応した場合に青緑色生成物を生じる。
【０２２８】
比色アッセイを、以下の２つの異なる方法を使用したＴＭＢ反応およびＡＢＴＳ反応を使用して行った。
【０２２９】
方法Ａ（ＴＭＢ）：０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｐＨ７．４）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中（ＰＢＳ）で１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが測定されるようにＨＲＰＯ希釈物を作製した。５０μｌのＨＲＰＯサンプル／希釈物を２００μｌのＴＭＢ試薬に添加し、１５分間または３０分間反応させ、この時点で、２００μｌ停止溶液（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。各サンプルについて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２３０】
方法Ｂ（ＡＢＴＳ）：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが可能なようにＨＲＰＯ希釈物を作製した。５０μｌのＨＲＰＯサンプル／希釈物を２００μｌのＡＢＴＳ試薬に添加し、１５分間または３０分間反応させ、この時点で、２００μｌ停止溶液（１％ＳＤＳ水溶液）を添加した。各サンプルについて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２３１】
ＴＭＢについてのＨＲＰＯの検出限度は８ｐｇ／ｍｌであり、ダイナミックレンジは５〜５０００ｐｇ／ｍｌであった。ＡＢＴＳについて、検出限度は３２ｐｇ／ｍｌであり、ダイナミックレンジは３２〜５０００ｐｇ／ｍｌであった。
【０２３２】
実施例３：ＨＲＰＯの蛍光発生アッセイおよび化学発光アッセイ
以下のいくつかの試薬を試験した：Ｓｉｇｍａの化学発光ペルオキシダーゼ基質、Ｐｉｅｒｃｅの蛍光発生（Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）基質キット、ＡｎａＳｐｅｃ ＳｅｎｓｏｌｙｔｅのＡＤＨＰ蛍光発生基質、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光発生基質、およびＫＰＬ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＬｕｍｉＧＬＯ。ＳｉｇｍａおよびＰｉｅｒｃｅの基質は、ＨＲＰＯを含むＰＢＳやＢＳＡ含有緩衝液を使用して作用しなかった。
【０２３３】
Ａ．ＡｎａＳｐｅｃの蛍光発生ＡＤＨＰアッセイ
ＡｎａＳｐｅｃの蛍光発生キットは、溶液中のペルオキシダーゼを分析するためにＡＤＨＰ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）を使用する。これにより、ＡＤＨＰがペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で酸化される。ＡＤＨＰの酸化生成物（レゾルフィン（ｒｅｓｏｚｕｆｉｎ））は、桃色蛍光を生じ、これは、励起波長５３０〜５６０ｎｍを使用して発光波長５９０ｎｍで測定することができる。アッセイにおける過剰量のペルオキシダーゼにより、蛍光レゾルフィンが非蛍光レゾルフィン（ｒｅｓｏｚｕｒｉｎ）にさらに変換されて、蛍光シグナルが減少するであろう。１，０００，０００ｐｇ〜０．０６２５ｐｇ／５０μｌサンプルが検出されるように作製されたＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。手順は、前述のＴＭＢアッセイおよびＡＢＴＳアッセイと同一であり、２つの方法を使用した。
【０２３４】
方法Ａ：ＡＤＨＰ試薬および過酸化水素を、製造者の説明書にしたがって調製した。５００μｌのペルオキシダーゼ溶液を、１．５ｍｌのプラスチック製のマイクロキュベット中の５００μｌＡＤＨＰ試薬に添加した。反応混合物を穏やかに混合し、光に曝露することなく室温で３０分間インキュベートした。蛍光シグナルを、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ蛍光分光計にて、５５０ｎｍの励起を使用して５９０ｎｍの発光について測定した。
【０２３５】
方法Ｂ：４００μｌの各ペルオキシダーゼおよびＡＤＨＰ試薬を使用したこと以外は、方法Ａに類似の方法を使用した。
【０２３６】
ＡｎａＳｐｅｃ ＡＤＨＰ蛍光アッセイの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて１２．５ｐｇ／ｍｌであることが見出された。アッセイ範囲は、ＨＲＰＯの２５０ｐｇ／ｍｌ〜０ｐｇ／ｍｌまで線形であった。
【０２３７】
Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光発生アッセイ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ蛍光発生アッセイキットは、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）を使用し、このアッセイはＡｎａＳｐｅｃ ＡＤＨＰアッセイに類似している。ペルオキシダーゼおよび過酸化水素を使用したアッセイの酸化最終生成物はレゾルフィンである。アッセイクレームは１×１０−５Ｕ／ｍｌであり、これは１０ｐｇ／ｍｌ（１×１０−５ｍｌ）と等価である。
【０２３８】
１，０００，０００ｐｇ〜０．０６２５ｐｇ／５０μｌサンプルが検出されるように作製したＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬および過酸化水素を、製造者の説明書にしたがって調製した。４００μｌのペルオキシダーゼ溶液を、１．５ｍｌのプラスチック製のマイクロキュベット中の４００μｌ ＡＤＨＰ試薬に添加した。反応混合物を穏やかに混合し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。蛍光シグナルを、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ蛍光分光計にて、５５０ｎｍの励起を使用して５９０ｎｍの発光について３０分および３５分で測定した。
【０２３９】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光アッセイの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて２５ｐｇ／ｍｌであることが見出された。アッセイ範囲は、ＨＲＰＯについて直線で２５０ｐｇ／ｍｌ〜０ｐｇ／ｍｌであった。
【０２４０】
Ｃ．ＬｕｍｉＧＬＯ（登録商標）
ＬｕｍｉＧＬＯは、ペルオキシダーゼ標識レポーター分子との使用のためにデザインされたルミノールベースの化学発光基質である。過酸化水素の存在下で、ＨＲＰＯは、ルミノールを励起中間体ジアニオンに変換する。このジアニオンは、その基底状態へ戻る際に発光する。ＨＲＰＯ抱合体との反応後、ＬｕｍｉＧＬＯからの発光は５分以内に最大強度に到達し、およそ１〜２時間持続する。
【０２４１】
各実験におけるＬｕｍｉＧＬＯの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて１１ｐｇ／ｍｌであることが見出された。
【０２４２】
ラマンベースのアッセイ
種々の異なる組み合わせおよび量のラマン活性生成物を生成する試薬を、それぞれについての最適な反応条件を見出すために試験した。これらのアッセイのために、５０μｌ ＨＲＰＯサンプル／希釈物を、１５０μｌの選択したラマン試薬（Ａ〜Ｅ）および体積比９：１の尿素ペルオキシダーゼに添加し、サンプルを３０分間反応させた。試薬Ａ〜Ｅの処方物を、以下の表に示す。次いで、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを各サンプルに添加し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈したＨＲＰＯサンプルにおいてラマンベースのアッセイも行った。ラマンスペクトルを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して記録した。スペクトル分析は、波長３２６０ｃｍ−１でのラマンシグナルの測定および３５００ｃｍ−１と４０００ｃｍ−１との間の１つおきの波数を使用したＳＱＲに基づいた。
【０２４３】
実施例４：ラマン試薬Ａ（ＢＡＳＨ−ＵＰ）
この研究のために使用した処方物を表５に列挙する。
【０２４４】
【表５】
ＨＲＰＯを、０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで希釈したラマン試薬Ａ−１と反応させた。ラマンスペクトルを、０（「ブランク」）〜１００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物について記録した。図９Ａは、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図９Ｂは、ＳＱＲ分析への適用後のその結果を示す（３５００〜４０００ｃｍ−１）。表６は異なる実験由来のＨＲＰＯの検出限界を比較し、シングルピークに基づいた測定と比較したＳＱＲ法由来の感度の増大を示す。
【０２４５】
【表６】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ａ−１、Ａ−２、およびＡ−３中で反応させ、０（「ブランク」）〜５ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物についてのラマンスペクトルを記録した。図１０は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。図１１は、ラマン試薬Ａ−１およびＡ−２（３５００〜４０００ｃｍ−１）のＳＱＲ分析を示す。
【０２４６】
ＨＲＰＯを、ラマン試薬Ａ−２および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物と反応させた。図１２は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。
【０２４７】
表７は異なるラマン試薬Ａ処方物由来の検出限界を比較し、ＳＱＲ法によって提供された感度の増大を示す。
【０２４８】
【表７】
実施例５：ラマン試薬Ｂ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表８に列挙する。
【０２４９】
【表８】
ＨＲＰＯを、ラマン試薬Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、およびＢ−４中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物についてのラマンスペクトルを記録した。図１３は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。図１４は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク依存を示し、新鮮なＨＲＰＯを含むＢＳＡ希釈物および処方物Ｂ−２を比較している。
【０２５０】
表９は、いくつかの異なるラマン試薬Ｂ処方物由来の検出限界を比較し、ＳＱＲ法によって提供された感度の増大を示す。
【０２５１】
【表９】
実施例６：ラマン試薬Ｃ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表１０に列挙する。
【０２５２】
【表１０】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｃ−１中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物のスペクトルを記録した。図１５ＡはＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図１５Ｂは対応するＳＱＲスペクトルを示す。表１１はシングルピークおよびＳＱＲ法の検出限界を比較し、ＳＱＲ由来の感度の増大を示している。
【０２５３】
【表１１】
実施例７：ラマン試薬Ｄ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表１２に列挙する。
【０２５４】
【表１２】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｄ−１中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物のスペクトルを記録した。図１６ＡはＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図１６Ｂは対応するＳＱＲスペクトルを示す。
【０２５５】
【表１３】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｄ−１中で反応させた。ラマン試薬処方物Ｄの検出限界は５０ｐｇ／ｍｌであった。
【０２５６】
実施例８：感度試験
異なるラマン試薬を使用したペルオキシダーゼの感度試験を、ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。本研究は、ＢＳＡを使用しないＰＢＳにおける感度を評価することを意図していた。以下の試薬を本研究で使用した。
ラマン試薬Ａ−１：５００μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；２０μｇ／ｍｌ ＨＢＡ；２０μｇ／ｍｌ ＡＡ
ラマン試薬Ｂ−３：２５０μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；２５μｇ／ｍｌ ＣＤＭＰ
ラマン試薬Ｃ−１：４００μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；１５０μｇ／ｍｌ ＮＡＰ
１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが許容されるように作製したＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。５０μｌ ＨＲＰＯサンプル／希釈物を１５０μｌ試薬に添加し、３０分間反応させた。次いで、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加した。３０分間のインキュベーション後、ラマンスペクトルを、Ｓｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して記録した。ＳＱＲを使用してデータを分析した。各実験由来の結果を、表１４〜１８に示す。
【０２５７】
実施例９：ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰ、ＡＳＡ−ＵＰ、および抗酸化剤の存在下でのＡＳＡ−ＵＰ
これらの研究の目的は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰおよびＡＳＡ−ＵＰを使用してペルオキシダーゼの感度を評価すること、およびＡＳＡ−ＵＰに及ぼす種々の抗酸化剤の影響を調査することであった。
【０２５８】
使用材料は、ビオチン（１２５μｇ／ｍｌ）、ＡＳＡ（１２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）、およびＡＳＡ（１２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）であった。図１７中の結果は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰ結合体によって０．００６２５ｐｇサンプルもの低濃度を検出することができる高感度アッセイが得られることを示す。ＨＢＡを使用しないＡＳＡ−ＵＰも２ｐｇもの低濃度のＨＲＰＯの検出が可能である。
【０２５９】
ラマンベースのアッセイの比較の代表的な結果を、表１４〜１８に示す。ラマン試薬Ａ（１００〜２５０または５００μｇ／ｍｌのＡＳＡの増加）、試薬Ｂ、およびビオチン−ＡＳＡにより、試薬Ａ−１および試薬Ｃ処方物と比較して超高感度のペルオキシダーゼアッセイが得られる。ラマンベースのアッセイは溶液中のペルオキシダーゼを高感度に検出し、図１８にグラフで示している。
【０２６０】
興味深いことに、ＡＳＡのみで非常に良好な感度が得られる。この感度は、ＣＤＭＰ、ビオチンの添加によって増加し、ＮＡＰの添加によってさえも増加する。アスコルビン酸塩およびＨＢＡを省略したＡ−１に基づく反応では、ペルオキシダーゼの検出限度は、５００μｇ／ｍｌのＡＳＡを使用し、ラマンシグナルを波数３，３００ｃｍ−１およびＳＱＲを使用して分析した場合、それぞれ３．９および４．４ｐｇ／ｍｌであった。７５０μｇ／ｍｌのＡＳＡを使用した場合、検出限度は、ラマンシグナルを波数３，３００ｃｍ−１およびＳＱＲを使用して分析した場合にそれぞれ２．３および１．９であった。
【０２６１】
新鮮なＨＲＰＯ（調製後約３時間以内で使用されるＨＰＲＯ）の使用によってより高い感度が得られ、より高い感度が必要である場合、２〜８℃で一晩の保存後でさえ、サンプルを使用すべきではない。以下の表（表１４〜１８）は、代表的な実験由来の先行例と比較した検出限界のまとめである。
【０２６２】
【表１４】
【０２６３】
【表１５−１】
【０２６４】
【表１５−２】
【０２６５】
【表１６】
【０２６６】
【表１７−１】
【０２６７】
【表１７−２】
Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅａｄペルオキシダーゼアッセイは２５ｐｇ／５０μｌと２５０ｐｇ／５０μｌのサンプルとの間で比例し（ベンダーの主張による）、このアッセイは、１×１０−５Ｕ／ｍｌもの低さで検出することができることに留意のこと。本研究で使用したＳｉｇｍａ ＨＲＰＯの活性は、１０８０Ｕ／ｍｇ固体であった。これに基づいて、１×１０−５Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯは１０ｐｇ／ｍｌに等価である（０．５ｐｇ／５０μｌ）。
【０２６８】
表１８は、ラマンベースの検出、ならびに吸光度、化学発光、および蛍光による検出の代表的な比較をまとめている。
【０２６９】
【表１８】
ラマンベースの検出アッセイに及ぼす種々の抗酸化剤の影響を試験した。代表的実験における７５０μｇ／ｍｌ ＡＳＡを使用したペルオキシダーゼ反応に及ぼす抗酸化剤の影響を表１９にまとめている。
【０２７０】
【表１９】
実施例１０：ラマンベースの検出を使用した免疫アッセイ
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｄ２０５０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（５５０６１１１）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（５５７８２５）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ＤＲＴ２００）、およびＢｉｏＣｈｅｃｋ Ｉｎｃ（ＢＣ−１１０５）から利用可能な免疫アッセイ形式に対してラマンベースの方法を使用した。アッセイプロトコールは、ラマン活性化合物を生成する基質をＴＭＢの代わりに使用したことを除いて、製造者の説明書に従った。ラマン活性化合物を使用した実験を以下のように行った。
試薬Ａ
１．５−アミノサリチル酸：２５０μｇ／ｍＬ
２．２−ヒドロキシベンジルアルコール：２０μｇ／ｍＬ
３．アスコルビン酸：０．２μｇ／ｍＬ
上記の３つの試薬を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に溶解し、滅菌０．４５ミクロンニトロセルロース濾紙で濾過し、琥珀色のポリエチレンボトル中にて２〜８℃で保存した。
試薬Ｂ
１．過酸化尿素：３６０μｇ／ｍＬ過酸化水素を含む１０００μｇ／ｍＬ
試薬を２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に溶解し、滅菌０．４５ミクロンニトロセルロース濾紙で濾過し、琥珀色のポリエチレンボトル中にて２〜８℃で保存した。
ラマン基質
ラマン基質を、使用前に試薬Ａおよび試薬Ｂを９：１の体積比で混合することによって調製した。基質を、同一の調製で使用すべきである。
代表的実験由来の結果を表２０にまとめている。
【０２７１】
【表２０】
ヒトＩＬ−２アッセイへのラマン活性生成物を生成する基質の導入により、アッセイ感度がおよそ５〜２０倍に改善された。図１９。図１９で証明したＩＬ−２用量反応曲線の左側へのシフトは、この感度の改善を例示している。
【０２７２】
実施例１１：ＨＲＰＯを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応の吸光度、蛍光、およびラマン検出
ペルオキシダーゼ基質としてｏ−フェニレンジアミンを使用した研究により、ＯＰＤがペルオキシダーゼ依存性のラマンシグナルを生じ、ＮａＯＨを添加する必要がなく、広範な波数にわたって検出することができることが明らかとなった。シグナルはＮａＯＨの非存在下でより顕著であるが、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかで反応を停止させた場合に異なる形態で存在する。
【０２７３】
ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液を使用したラマンペルオキシダーゼ反応の蛍光および吸収の特徴を評価するための研究を行った。ＯＰＤ反応およびＢＡＳＨ−ＵＰ反応を、以下の手順にしたがって調製した。
【０２７４】
ＯＰＤプロトコール：
１．ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤの説明にしたがってＯＰＤ基質溶液を調製する。
２．４，０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯペルオキシダーゼ希釈物を緩衝液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で調製する。
３．ＯＰＤ／ペルオキシド基質溶液を調製する（基質溶液を調製後１時間以内に使用すべきである）。
４．２５０μｌの希釈ペルオキシダーゼサンプルを各反応管に添加する。
５．７５０μｌのＯＰＤ／ペルオキシド基質を各管に添加する。
６．混合し、暗所にて室温で１５分間インキュベートする。
【０２７５】
ＢＡＳＨ−ＵＰプロトコール：
１．ＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液（ＢＡＳＨ：ＵＰ＝９：１、ｖ／ｖ）を調製する。
２．２００μｌの希釈ペルオキシダーゼ溶液を各反応管に添加する。
３．６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液を各管に添加する。
４．混合し、室温で３０分間インキュベートする。
５．２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ停止溶液を各反応管に添加する。
６．混合し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２７６】
ＢＡＳＨ−ＵＰまたはＯＰＤ−ペルオキシド試薬のいずれかを使用した反応を、以下のように０または２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼのいずれかを含むサンプル溶液に対して行った。
【０２７７】
ＯＰＤ反応
１．２５０μｌの２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ＋７５０μｌのＯＰＤ−ペルオキシド基質溶液を混合する。
２．２５０μｌの１Ｘ ＰＢＳ−ＢＳＡ 緩衝液＋７５０μｌのＯＰＤ−ペルオキシド基質溶液を混合する。
３．ペルオキシダーゼを添加し、暗所で反応を進行させる。
４．反応完了から３０分後にスペクトルを読み取る。
【０２７８】
ＢＡＳＨ反応
１．２００μｌのペルオキシダーゼ（濃度２，０００ｐｇ／ｍｌ）＋６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ＋２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ
２．２００μｌの１×ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液＋６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ＋２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ
３．ペルオキシダーゼおよびＢＡＳＨを添加し、３０分間反応させ、ＮａＯＨで反応停止させる。
４．反応停止から３０分後にスペクトルを読み取る。
【０２７９】
吸光度。Ｄｉｇｉｌａｂ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ−２８００分光光度計を使用してスキャンし、シングルビームモードを使用して０．７５０ｍｌの各反応サンプルを用いてスペクトルを記録した。バックグラウンドサンプル（０ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）をベースラインとして使用した。スペクトル（３４０〜６５０ｎｍ；スキャン速度１２００ｎｍ／分；２ｎｍ間隔）を、図２０Ａおよび２０Ｂに示す。ＢＡＳＨ反応の吸収スペクトルは可視波長範囲に広く及び（５００ｎｍあたりを中心とする）、固有の吸収種に関連する明確なピークを欠く（図２０Ａ）。ＯＰＤ反応の吸収スペクトルはより明確であり（図２０Ｂ）、４４０ｎｍ付近に広いピークが存在する（黄色波長範囲）。
【０２８０】
蛍光。２００ｎｍスプリットを有し、Ｓｐｅｃｔｒａｓｕｉｔｅソフトウェアを備えたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＵＳＢ２．０光ファイバーレンズを使用してスキャンした。５１４ｎｍまたは５３２ｎｍのいずれかの励起波長を使用して、スペクトルを生成した。発光スペクトルを、１２秒の積分およびボックス幅３０を使用して収集した。発光スペクトルを、図２１Ａ〜Ｄに示す。ネガティブ（０ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）および反応性（２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）ＢＡＳＨ反応の両方の蛍光発光スペクトルは類似しており（図２１ＡおよびＢ）、低レベルの固有の蛍光を伴う。ＯＰＤ反応の蛍光スペクトルは類似していた（図２２Ａ〜Ｄ）。
【０２８１】
ラマン。５３２ｎｍレーザーを備えたＳｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器でスペクトルを収集し、各反応のスペクトルを図３０および３１に示す。ＢＡＳＨ反応により、巨大なラマンシグナルが得られた（図２３Ａ）。このＢＡＳＨ反応物は、巨大なペルオキシダーゼ含有サンプルに関連する特徴的な淡桃色を有していた。ＯＰＤ反応により、巨大なラマンシグナルも得られ（図２３Ｂ）、巨大なペルオキシダーゼ含有サンプルにも関連する特徴的な黄色も有していた。ラマンシグナルの増加に対応する蛍光シグナルの増加は認められなかった。実際、ペルオキシダーゼが存在する場合に認められる蛍光シグナルのわずかな低下は認められた。これらの所見は、５１４ｎｍおよび５３２ｎｍの発光波長で一貫していた。
【０２８２】
これらの結果は、巨大なペルオキシダーゼ依存性ラマンシグナルを生じるＢＡＳＨ反応およびＯＰＤ反応はいずれも巨大なペルオキシダーゼ依存性蛍光シグナルを示さなかったことを示す。したがって、蛍光は、ＢＡＳＨ反応またはＯＰＤ反応におけるペルオキシダーゼ活性の結果として検出されたラマンシグナルを説明することができない。
【０２８３】
実施例１２：ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応のラマン感度および酵素反応速度の測定
ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応に関連するラマンシグナルを評価し、特徴づけるための研究を行った。サンプル調製のために以下の手順を使用した。
【０２８４】
ＯＰＤ反応：
１．ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤの説明書にしたがってＯＰＤ基質溶液を調製する。
２．３Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を調製する。
３．４，０００ｐｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ希釈物を緩衝液（ＰＢＳ ＢＳＡ）で調製する。
４．ＯＰＤ／ペルオキシド基質溶液を調製する（基質溶液を調製後１時間以内に使用すべきである）。
５．５０μｌの希釈ペルオキシダーゼサンプルを各反応管に添加する。
６．１５０μｌのＯＰＤ／ペルオキシド基質を各管に添加する。
７．混合し、暗所にて室温で３０分間インキュベートする。
８．５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ、または５０μｌの１×ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を各反応管に添加する。
【０２８５】
以下の反応混合物を、５×６０ｍｍキュベット中で調製した。各混合物を調製し、次の反応物の調製の３０分前に測定した。１時間毎に新鮮なＯＰＤ基質を調製した。使用した反応を表２１に示す。
【０２８６】
【表２１】
２分毎にラマンスペクトルを回収して各反応についての動力学的研究を行った。図２４Ａ〜Ｅは、およそ５〜６分間隔で収集したスペクトルを示す。
【０２８７】
ＳＱＲ分析を、以下の波長範囲について収集したスペクトルに適用した： ２，０００〜２，５００ｃｍ−１；２，５００〜３，０００ｃｍ−１；３，０００〜３，５００ｃｍ−１；および３，５００〜４，０００ｃｍ−１。ＳＱＲスペクトル対ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応時間のラマン動力学的プロットを図２５Ａ〜Ｄに示す。これらの結果は、動力学的速度情報を単一管のＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応から収集することができる（単一の反応管由来の反応の行程の間の複数のラマンスペクトルの収集）ことを示す。
【０２８８】
反応３０分後に得たＳＱＲ値を、ＳＱＲによって計算した推定反応速度と比較した。これにより、広範な波数にわたるこれらの値の間の良好な相関関係が明らかとなった。
【０２８９】
実施例１３：ホスファターゼ基質のラマン検出
リン酸置換基を有する異なる芳香族有機化合物とのアルカリホスファターゼの反応から得た生成物のラマンシグナルを研究するための実験を行った。酸化剤としてのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加および／または水酸化ナトリウムの添加の影響も研究した。以下の手順に従った。
（ａ）アルカリホスファターゼおよび酵素基質としてのリン酸含有芳香族化合物を含む混合物を調製する。
（ｂ）混合物をインキュベートしてラマン活性生成物を形成する。
【０２９０】
（ｉ）（任意選択的に）酸化剤としてのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する。
【０２９１】
（ｉｉ）（任意選択的に）水酸化ナトリウムを添加する。
（ｃ）ラマン分光法を使用してラマン活性生成物を検出する。
【０２９２】
５３２ｎｍレーザーを備えたＳｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して、０〜４０００ｃｍ−１の範囲のラマンスペクトルを収集した。試験した化合物は、ベンゾキノン、ピロガロール、１，４−ナフタキノン、および１，４−イミノナフタキノンであった。
【０２９３】
図２６Ａは、強ＮａＯＨ溶液（０．５Ｎ）の添加の関数としてのベンゾキノンのラマンスペクトルを示し、このスペクトルはＮａＯＨの添加によってラマンシグナルが増強される。この増強は、可逆的であることが見出され、酸の添加によってシグナルが減少し、ＮａＯＨの再添加によってシグナルが再度増加した。図２６Ｂは、ＮａＯＨ添加の関数としてのピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）のラマンスペクトルを示す。ピロガロールは、オルト（１，２）位でヒドロキシル化された芳香族（フェニル）構造を例示している。
【０２９４】
メタ過ヨウ素酸ナトリウム添加の影響も研究した。図２７Ａは、ＮａＯＨおよび過ヨウ素酸塩の両方の関数としての１，４−ナフタキノンのラマンスペクトルを示す。図２７Ｂは、同様に、１，４−イミノナフタキノンのラマンスペクトルを示す。これらのプロットは、かかる化合物が急速に自動酸化されてラマンシグナルを生じることを示す。１，４−ナフタキノン（図２７Ａ）は、ＮａＯＨの非存在下で過ヨウ素酸塩を使用するか使用しないで非常に高いシグナルを示す。ＮａＯＨの添加と共にスペクトルパターンが変化し、シグナルの減少が認められた。他方では、１，４−イミノナフタキノン（図２７Ｂ）は、ＮａＯＨの存在下で過ヨウ素酸塩を使用することなくラマンシグナルの増強が認められた。この化合物は、ＮａＯＨの存在下での過ヨウ素酸塩の使用によってシグナルの減少が認められ、これはおそらくこの化合物中のイミノ官能基のさらなる酸化に起因する。１，４−イミノキノンのラマンシグナルを、ＮａＯＨを使用しないで得ることができなかった（図２７Ｂ（ｄおよびｅ）。
【０２９５】
実施例１４：例示的なホスファターゼベースのラマン免疫アッセイ試薬および手順
以下に、ホスファターゼベースの免疫アッセイで使用することができる例示的な試薬および手順を記載する。
ラマン基質
・４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェート
・４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェート
・４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェート
・ヒドロキノンジホスフェート
酵素
・仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）
・ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ抱合体（ＫＰＬ）（タンパク質安定剤および防腐剤としてのアジ化ナトリウムを含む）
基質緩衝液
・０．２Ｍ ＴＲＩＳ（４−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）（５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８）を含む）
・１Ｍ ジエタノールアミン（０．５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）（ｐＨ９．８）
酵素保存緩衝液：１０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、５０％グリセロール（ｐＨ８．２）。
コーティング緩衝液：５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）
ブロッキング緩衝液：２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．０５％ツウィーン２０（ｐＨ８．０）を含む５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）
アッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）（ｐＨ９．０）
洗浄緩衝液：５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（０．０５％ツウィーン２０を含む）（ｐＨ８．０）
手順Ａ：４−アミノフェニルホスフェートの免疫アッセイを、以下のように調製する。
１．アルカリホスファターゼ（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液で希釈する。
２．５０μＬの希釈アルカリホスファターゼを取る。
３．１５０μＬの基質溶液（２００μｇ／ｍＬ）を添加する。
４．室温で１時間インキュベートする。
５．５０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
６．室温で３０分間インキュベートする。
７．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９６】
手順Ｂ：ヒドロキノンジホスフェート、４−ヒドロキシナフチルホスフェート、および４−アミノナフチルホスフェートの免疫アッセイを、以下のように調製する。
１．アルカリホスファターゼ（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液で希釈する。
２．５０μＬの希釈アルカリホスファターゼを取る。
３．１５０μＬの基質溶液（１００〜２００μｇ／ｍＬ）を添加する。
４．室温で１時間インキュベートする。
５．５０μＬの０．５ｍｇ／ｍｌの新たに調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を水に添加する。
６．室温で３０分間インキュベートする。
７．５０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
８．室温で３０分間インキュベートする。
９．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９７】
実施例１５：マイクロタイタープレート免疫アッセイ
一般的抗原「Ａ」のためのマイクロタイタープレート免疫アッセイの調製手順を、以下に記載する。
１．コーティング：一般的抗原Ａに特異的な１００μＬ／ｍＬ／ウェルの捕捉抗体を５〜１０μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２〜３時間インキュベートする。
２．ブロッキング：プレートを空にする。２００μＬのブロッキング緩衝液を添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを空にし、重ねた紙タオル上でプレートをブロットする。さらなる使用のためにプレートを４℃で保存するか、直ちに使用することができる。
３．洗浄：プレートを３００μＬの洗浄緩衝液／ウェルで５回洗浄する。最後の洗浄後に重ねた紙タオル上でプレートをブロットする。
４．サンプルの添加：ウェルあたり５０〜１００μＬの抗原Ａを含むサンプルを添加する（標準および試験すべきサンプル）。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。サンプルを、プレートへの添加前にアッセイ緩衝液で新たに希釈すべきである。
５．洗浄：工程（３）を繰り返す。
６．酵素抱合二次抗体の添加：抗原Ａに特異的なアルカリホスファターゼ抱合抗体をアッセイ緩衝液で約１μｇ／ｍＬに希釈する。各ウェルに１００μＬを添加する。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。
７．洗浄：工程（３）を繰り返し、各ウェルを７回洗浄する。
８．基質の添加：１５０μＬの基質溶液を各ウェルに添加する。プレート震盪器上にて室温で３０分間インキュベートする。
９．基質の酸化（任意選択的）：５０〜１００μＬの新たに調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）を添加する。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。
１０．ラマン活性トリガーまたはエンハンサーの添加（任意選択的）：５０μｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムを各ウェルに添加する。プレート震盪器上にて室温で３０分間インキュベートする。
１１．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９８】
実施例１６：酸化剤でのアルカリホスファターゼ抱合体の比色検出
アルカリホスファターゼを、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用した比色分析によって分析した。
【０２９９】
材料
・アルカリホスファターゼ抱合体：
−アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ ＩＮＣ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、精製抗体＝０．１０ｍｇ；酵素／抗体のモル比＝１．７：１
−１ｍＬの蒸留水に溶解する（１００μｇ／ｍＬ）。
−５０μＬアリコートにて−２０℃で凍結保存する。
・ＤＥＡ緩衝液（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１．０Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８））
・ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
試薬の調製
・ＤＥＡ緩衝液で濃度０．００１〜１００ｎｇ／ｍＬに調製したアルカリホスファターゼ抱合体希釈物。
・ＤＥＡ緩衝液で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０３００】
比色アッセイ手順
１．５０μＬのアルカリホスファターゼ抱合体をプラスチック製のマイクロキュベットに添加する。
２．２００μＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を読み取る。
【０３０１】
アルカリホスファターゼ抱合体に対する吸光度の線形従属性が低濃度で認められた（０〜１０ｎｇ／ｍＬ）。検出限度は、およそ０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０３０２】
実施例１７：酸化剤を使用したアルカリホスファターゼ抱合体のラマン検出
アルカリホスファターゼを、酸化剤（メタ過ヨウ素酸ナトリウム）と共に基質として４−アミノフェニルホスフェートを使用したラマン分光法で分析した。
【０３０３】
材料
・アルカリホスファターゼ抱合体（実施例１６を参照のこと）
・ＤＥＡ緩衝液
・メタ過ヨウ素酸ナトリウム
・４−アミノフェニルホスフェートナトリウム塩（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
試薬の調製
・実施例１５に従って調製したアルカリホスファターゼ抱合体希釈物
・水で調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ）
・ＤＥＡ緩衝液で調製した４−アミノフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
ラマンアッセイ手順
１．５０μＬアルカリホスファターゼ抱合体をガラス製キュベットに添加する。
２．２００μＬの４−アミノフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．５０μＬのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加する。
６．ボルテックスミキサーで混合する。
７．室温で３０分間インキュベートする。
８．ラマンスペクトル（０〜４０００ｃｍ−１）を記録する。
【０３０４】
ラマンデータを表２２に示す。
【０３０５】
【表２２】
「ポジティブ」は、３３００ｃｍ−１で記録されたその平均ラマンシグナルが３３００ｃｍ−１で記録されたネガティブ平均シグナルを超えた（＋２ＳＤ）サンプルをいう。ＣＶ＝変動係数：ＳＤ＝標準偏差；Ｓ／Ｎ＝シグナル対ノイズ比。
【０３０６】
図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【０３０７】
図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。検出限度はおよそ０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０３０８】
実施例１８：酸化剤を使用しないアルカリホスファターゼの比色検出
アルカリホスファターゼを、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用した比色分析によって分析した。
【０３０９】
材料
・アルカリホスファターゼ：
−仔ウシ腸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
濃度：１０，０００単位／ｍＬ
−保存緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２を含む５０％グリセロール（ｐＨ８．２））
−全２．０ｍＬ保存緩衝液中で保存した５００単位／５０μＬ
−−２０℃で凍結保存した１００μＬアリコート
−各アリコートの濃度：２５０Ｕ／ｍＬ
・ＤＥＡ緩衝液
・ｐ−ニトロフェニルホスフェート
試薬の調製
・ＤＥＡ緩衝液で濃度０．００２５〜２，５００ｍＵ／ｍＬに調製したアルカリホスファターゼ希釈物
・ＤＥＡ緩衝液で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍＬ）
比色アッセイ
１．５０μＬのアルカリホスファターゼをプラスチック製のマイクロキュベットに添加する。
２．２００μＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を読み取る。
【０３１０】
アルカリホスファターゼに対する吸光度の線形従属性が低濃度で認められた（０〜２５ｍＵ／ｍＬ）。検出限度は、およそ０．１０ｍＵ／ｍＬであった。
【０３１１】
実施例１９：酸化剤を使用しないアルカリホスファターゼのラマン検出
アルカリホスファターゼを、酸化剤を使用しないで基質として４−アミノフェニルホスフェートを使用したラマン分光法で分析した。
【０３１２】
材料
・アルカリホスファターゼ（実施例１８を参照のこと）
・ＤＥＡ緩衝液
・メタ過ヨウ素酸ナトリウム
・４−アミノフェニルホスフェートナトリウム塩（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
試薬の調製
・実施例１８に従って調製したアルカリホスファターゼ希釈物
・ＤＥＡ緩衝液で調製した４−アミノフェニルホスフェート溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）
ラマンアッセイ手順
１．５０μＬアルカリホスファターゼをガラス製キュベットに添加する。
２．１５０μＬの４−アミノフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．ラマンスペクトル（０〜４０００ｃｍ−１）を記録する。
【０３１３】
ラマンデータを表２３に示す。
【０３１４】
【表２３】
「ポジティブ」は、３３００ｃｍ−１で記録されたその平均ラマンシグナルが３３００ｃｍ−１で記録されたネガティブ平均シグナルを超えた（＋２ＳＤ）サンプルをいう。ＣＶ＝変動係数：ＳＤ＝標準偏差；Ｓ／Ｎ＝シグナル対ノイズ比。
【０３１５】
図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。検出限度はおよそ１ｍＵ／ｍＬであった。
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への相互参照
本願は、仮出願第６０／８３６，９３６号（２００６年８月１１日に出願）および仮出願第６０／７２７，３２８号（２００５年１０月１７日に出願）に対する優先権を主張する出願第１１／５８０，８４５号（２００６年１０月１６日に出願）の一部継続出願である、出願第１２／０８１，４９６号（２００８年４月１６日に出願）の一部継続出願である米国特許出願第１２／３７２，４９０号（２００９年２月１７日に出願）に対する優先権を主張する。これらの米国特許出願、仮出願はその全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の説明
発明の分野
本開示は、一般に、生物学的診断装置および試験方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物有機体または生物学的成分（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、または他の遺伝子材料）を検出するためのシステムが必要な分野が現在多数存在する。これらの領域には、以下が含まれる：食品安全性、医学的診断および獣医学的診断、病原体検出、法医学、および国土防衛。現在の検出方法には、免疫化学および分子生物学、ならびに生物学的技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など）が含まれる。これらの方法および技術は、しばしば、正確性、特異性、および感度が制限される。さらに、かかる方法は、しばしば、大規模なサンプル調製（核酸の単離および精製など）が必要である。
【０００４】
検出方法の特異性を、免疫学的技術の使用によって強化することができる。例えば、医学的診断には、サンプルの生物学的成分の検出において特異性を得るための抗体ベースの技術を使用する。特定の化合物に対して開発された抗体は、これらの成分に対して高い親和性および特異性を有することが公知である。しかし、抗体は検出が困難であり、典型的には、検出を増強する標識およびタグで化学修飾する。不運なことに、抗体検出は、サンプル中の他の材料（サンプルマトリックス、洗浄成分、および他の化学的および生物学的作用因子が含まれる）からの干渉を受ける傾向がある。さらに、現在の技術は、低濃度または少数の抗体（すなわち、低濃度または少数のターゲティングした生物学的成分）での感度を欠く。
【０００５】
ラマン光散乱技術（ラマン分光法）は、従来、特定の化学成分を検出するために使用されていた。ラマン散乱は、分子との光の相互作用の基本的性質である。光が分子に衝突する場合、光は分子の原子を振動させることができる。次いで、この振動は、分子から散乱したさらなる光のエネルギーを変化させるであろう。この散乱光は、測定可能であり、且つ振動分子の構造に固有の特徴を有する。したがって、ラマンスペクトルを使用して、分子を固有に同定することができる。
【０００６】
ラマン分光法は、既存の検出方法（定量化可能なデータの簡潔な適用および作成が含まれる）を超えるいくつかの利点を有する。しかし、ラマン分光法自体は、生物有機体および生物学的成分の検出のための特異性および感度を欠く。したがって、有機体および生物学的成分の検出のためにラマン分光法を使用可能な試薬および方法が当該分野で必要である。
【０００７】
本開示は、従来技術よりも高い感度および特異性で生物有機体および生物学的成分を同定および定量するためのラマン分光法と生物学的標識技術との組み合わせを使用する方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本開示の１つの実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび以下：
ｉ．（任意選択的に）少なくとも１つの芳香族化合物
ｉｉ．少なくとも１つのアミン含有化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【０００９】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレンおよび５−アミノサリチル酸から選択される。
【００１０】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５−ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択される。
【００１１】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１２】
【化１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００１３】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１４】
【化２】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００１５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００１６】
【化３】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００１７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００１８】
【化４】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００１９】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２０】
【化５】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００２１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２２】
【化６】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００２３】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００２４】
【化７】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００２５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は芳香族アミンを含む。別の実施形態では、芳香族アミンは、以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む。
【００２６】
【化８】
別の実施形態では、少なくとも１つの電子供与化合物は過酸化水素である。別の実施形態では、過酸化水素は、芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つの酵素はペルオキシダーゼである。
【００２７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は２−ヒドロキシベンジルアルコールであり、少なくとも１つのアミン含有化合物は５−アミノサリチル酸であり、少なくとも１つの電子供与化合物は過酸化水素尿素であり、少なくとも１つの酵素はペルオキシダーゼである。
【００２８】
別の実施形態では、混合物を塩基の存在下でインキュベートする。
【００２９】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【００３０】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプル、５−アミノサリチル酸、ならびに芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素Ｈ２Ｏ２から選択される過酸化水素を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程を含む、方法である。
【００３１】
１つの実施形態では、混合物はビオチンをさらに含む。
【００３２】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプル、ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、またはｍ−フェニレンジアミンを含む芳香族アミン、ならびに芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、およびＨ２Ｏ２から選択される過酸化水素を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程、を含む方法である。
【００３３】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの標的を検出する方法であって、
ａ）標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物を標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、少なくとも１つのリガンドが酵素を含む、工程、
ｃ）混合物に、
ｉ．任意選択的に少なくとも１つのアミン含有化合物；
ｉｉ．少なくとも１つの芳香族化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を与える工程、
ｄ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【００３４】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレンおよび５−アミノサリチル酸から選択される。別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５ ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択される。
【００３５】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００３６】
【化９】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００３７】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００３８】
【化１０】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００３９】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００４０】
【化１１】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００４１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４２】
【化１２】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００４３】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４４】
【化１３】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００４５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４６】
【化１４】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００４７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００４８】
【化１５】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００４９】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、芳香族アミン（以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む）を含む。
【００５０】
【化１６】
別の実施形態では、少なくとも１つの電子供与化合物は、芳香族過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。
【００５１】
別の実施形態では、酵素はペルオキシダーゼである。
【００５２】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は２−ヒドロキシベンジルアルコールであり、アミン含有化合物は５−アミノサリチル酸であり、電子供与化合物は過酸化水素尿素であり、酵素はペルオキシダーゼである。
【００５３】
別の実施形態は、サンプル中の酵素活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび
ｉ．任意選択的に少なくとも１つの芳香族化合物、
ｉｉ．少なくとも１つのアミン含有化合物、および
ｉｉｉ．少なくとも１つの電子供与化合物
を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物をインキュベートして少なくとも１つの電荷移動複合体を形成させる工程、および
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つの電荷移動複合体を検出する工程、
を含む、方法である。
【００５４】
別の実施形態は、少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）（任意選択的に）少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）少なくとも１つのアミン含有化合物、
ｃ）少なくとも１つの電子供与化合物、および
ｄ）（任意選択的に）少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含む、キットである。
【００５５】
１つの実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、４−アミノアンチピレン、５−アミノサリチル酸、およびｏ−フェニレンジアミンから選択され、少なくとも１つの芳香族化合物は、２−ヒドロキシベンジルアルコール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、２−ナフトール、４−ヒドロキシ−４−ビフェニル−カルボン酸、５，７−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、４−クロロ−１−ナフトール、フェノール、および４，５ジヒドロキシ−ナフタレン（ｎａｐｈｔｈｅｌｅｎｅ）−２，７−ジスルホン酸から選択され、少なくとも１つの電子供与化合物は、有機過酸化水素、過酸化水素尿素、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から選択される。
【００５６】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００５７】
【化１７】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【００５８】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００５９】
【化１８】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００６０】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、
【００６１】
【化１９】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択される）を含む。
【００６２】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６３】
【化２０】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【００６４】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６５】
【化２１】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。
【００６６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６７】
【化２２】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００６８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００６９】
【化２３】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）を含む。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【００７０】
別の実施形態では、少なくとも１つのアミン含有化合物は、芳香族アミン（以下のオルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、またはパラ−フェニレンアミンを含む）を含む。
【００７１】
【化２４】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）サンプルおよび少なくとも１つのリン酸基を含む少なくとも１つの芳香族化合物を含む混合物を調製する工程、
ｂ）前記混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む方法である。
【００７２】
１つの実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７３】
【化２５】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７４】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７５】
【化２６】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７７】
【化２７】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００７８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００７９】
【化２８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００８０】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００８１】
【化２９】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む。
【００８２】
別の実施形態では、少なくとも１つの酵素はホスファターゼを含む。
【００８３】
別の実施形態では、ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。
【００８４】
別の実施形態では、アルカリホスファターゼは抗体に抱合している。
【００８５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェートを含む。
【００８６】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む。
【００８７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む。
【００８８】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、ヒドロキノンジホスフェートを含む。
【００８９】
別の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムである。
【００９０】
別の実施形態では、酸化剤はメタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００９１】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【００９２】
別の実施形態は、サンプル中の少なくとも１つの標的を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）混合物を少なくとも１つの標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、少なくとも１つのリガンドがホスファターゼを含む、工程、
ｃ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物に混合物を与える工程、
ｄ）混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
インキュベートする工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法である。
【００９３】
１つの実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９４】
【化３０】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、およびＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９５】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９６】
【化３１】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９７】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【００９８】
【化３２】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【００９９】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【０１００】
【化３３】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、少なくとも１つの芳香族化合物は、
【０１０２】
【化３４】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む。
【０１０３】
別の実施形態では、以下：
【０１０４】
【化３５】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０５】
別の実施形態では、以下：
【０１０６】
【化３６】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０７】
別の実施形態では、以下：
【０１０８】
【化３７】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、以下：
【０１１０】
【化３８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、以下：
【０１１２】
【化３９】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む芳香族化合物を提供する。
【０１１３】
別の実施形態では、混合物を塩基の存在下でインキュベートする。
【０１１４】
別の実施形態では、ラマン分光法は共鳴ラマン分光法である。
【０１１５】
別の実施形態では、リガンドは、受容体および抗体から選択される。別の実施形態では、リガンドは抗体である。
【０１１６】
別の実施形態では、少なくとも１つの標的は有機体である。別の実施形態では、有機体は、バクテリオファージ、細菌（大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、およびブドウ球菌が含まれる）、およびウイルス（ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）から選択される。
【０１１７】
別の実施形態では、標的は、有機体の成分である。１つの実施形態では、成分はタンパク質である。別の実施形態では、タンパク質はインターロイキンである。１つの実施形態では、インターロイキンはＩＬ−２である。別の実施形態では、タンパク質は、Ｃ反応性タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩから選択される。別の実施形態では、標的は、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、代謝産物、炭水化物、ホルモン、および代謝中間体から選択される有機体の成分である。
【０１１８】
別の実施形態は、少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）任意選択的に酸化剤、
ｃ）任意選択的に塩基、および
ｄ）任意選択的に少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含むキットである。
図面の簡単な説明
特許書類または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む特許および特許出願公開書類の副本は、請求および必要な料金の納付の上で特許庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、生物有機体または生物学的成分の検出のための典型的な先行技術の免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ）の流れ図である。
【図２】図２は、開示の装置の実施形態の線図である。
【図３】図３は、生物有機体および／または生物学的成分の検出のための開示の技術の実施形態の流れ図である。
【図４】図４は、化学成分のラマン活性化合物への変換についての酵素系のブロック線図である。
【図５】図５は、特定の標的分子を励起するためのレーザー光周波数の選択技術の流れ図である。
【図６】図６は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインされたマイクロ流体チャネルの説明図である。
【図７】図７は、カスタム集積回路などに組み込むことができる一連のマイクロ流体チャネルの説明図である。
【図８】図８は、リステリアを含むサンプル（ａ）およびリステリアを含まないサンプル（ｂ）についてのペルオキシダーゼに結合した抗体を使用した病原性細菌（リステリア）の酵素結合免疫アッセイ由来のラマンスペクトルのプロットを、横座標にプロットしたシフト数（ｃｍ−１）および縦座標にプロットしたシグナルの規模（任意の単位）と共に示す。
【図９Ａ】図９Ａは、３回の実験においてラマン試薬処方物Ａ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図９Ｂは、３回の実験においてラマン試薬Ａ−１を使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図９Ｂ】図９Ａは、３回の実験においてラマン試薬処方物Ａ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図９Ｂは、３回の実験においてラマン試薬Ａ−１を使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１０】図１０は、ラマン試薬Ａ−１（菱形）、ラマン試薬Ａ−２（三角）、およびＡ−３（四角）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１１】図１１は、ラマン試薬処方物Ａ−１（菱形）およびラマン試薬Ａ−２（四角および三角）を使用して得られた３５００−４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１２】図１２は、ラマン試薬処方物Ａ−２（四角）および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物を用いたＡ−２（菱形）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１３】図１３は、ラマン試薬Ｂ−１（菱形）、Ｂ−２（四角）、Ｂ−３（三角）、およびＢ−４（「Ｘ」）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１４】図１４は、ラマン試薬Ｂ−２（四角）および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物を用いたＢ−２（菱形）を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ラマン試薬Ｃ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１５Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、ラマン試薬Ｃ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１５Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ラマン試薬Ｄ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１６Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１６Ｂ】図１６Ａは、ラマン試薬Ｄ−１を使用して得られた３２６０ｃｍ−１で測定したラマンスペクトルのプロットであり、図１６Ｂは、３５００〜４０００ｃｍ−１で測定した対応するＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１７】図１７は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰおよびＡＳＡ−ＵＰを使用して得られた３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルのプロットである。
【図１８】図１８は、試験試薬の相対感度を示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、ＢＡＳＨ−ＵＰおよびＴＭＢを使用したＩＬ−２免疫アッセイにおいて３５００〜４０００ｃｍ−１で測定したＳＱＲラマンスペクトルおよび４５０ｎｍで測定した吸収スペクトルのプロットである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応の吸収スペクトルのプロットであり、図２０Ｂは、ＯＰＤ反応の吸収スペクトルである。
【図２０Ｂ】図２０Ａは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応の吸収スペクトルのプロットであり、図２０Ｂは、ＯＰＤ反応の吸収スペクトルである。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２１Ｄ】図２１Ａおよび２１Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２１Ｃおよび２１Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ａ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｃ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２２Ｄ】図２２Ａおよび２２Ｂは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットであり、図２２Ｃおよび２２Ｄは、ペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の蛍光スペクトルのプロットである。
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応によってそれぞれ得られたラマンシグナルのプロットである。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、ＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応によってそれぞれ得られたラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｃ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｄ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２４Ｅ】図２４Ａは、ペルオキシダーゼを使用しないＯＰＤ反応についての時間に対するラマンシグナルのプロットであり、図２４Ｂ〜Ｅは、漸減量のペルオキシダーゼを使用したＯＰＤ反応の時間に対するラマンシグナルのプロットである。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２５Ｄ】図２５Ａ〜Ｄは、ＯＰＤ反応についての時間に対するＳＱＲスペクトルのプロットである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂは、ピロガロールのラマンシグナルのプロットである。両図は、水酸化ナトリウムの添加の際のラマンシグナルの増強を示す。図２６Ａ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ａ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないベンゾキノンのラマンシグナルのプロットである。図２６Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したピロガロールのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないピロガロールのプロットである。
【図２６Ｂ】図２６Ａは、ベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂは、ピロガロールのラマンシグナルのプロットである。両図は、水酸化ナトリウムの添加の際のラマンシグナルの増強を示す。図２６Ａ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したベンゾキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ａ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないベンゾキノンのラマンシグナルのプロットである。図２６Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを添加したピロガロールのラマンシグナルのプロットであり、図２６Ｂ（ｂ）は、ＮａＯＨを使用しないピロガロールのプロットである。
【図２７Ａ】図２７Ａは１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２７Ｂは１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。両図は、過ヨウ素酸塩および水酸化ナトリウムの依存を示す。図２７Ａ（ａ）は、過ヨウ素酸塩またはＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｂ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩を使用しないがＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｂ）は、１，４−イミノナフタキノンを含むホウ酸緩衝液のラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。
【図２７Ｂ】図２７Ａは１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットであり、図２７Ｂは１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。両図は、過ヨウ素酸塩および水酸化ナトリウムの依存を示す。図２７Ａ（ａ）は、過ヨウ素酸塩またはＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｂ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩を使用しないがＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ａ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−ナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ａ）は、ＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｂ）は、１，４−イミノナフタキノンを含むホウ酸緩衝液のラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｃ）は、過ヨウ素酸塩およびＮａＯＨを使用した１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。図２７Ｂ（ｄ）は、過ヨウ素酸塩を使用するがＮａＯＨを使用しない１，４−イミノナフタキノンのラマンシグナルのプロットである。
【図２８Ａ】図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ−抗体抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ−抗体抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。図２９Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体の濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０００ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｅ）０．１ｎｇ／ｍｌ、および（ｆ）０ｎｇ／ｍｌ。図２９Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）０．１ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）０．０１ｎｇ／ｍｌ、および（ｅ）０ｎｇ／ｍｌ。
【図２９Ｂ】図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。図２９Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体の濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０００ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｅ）０．１ｎｇ／ｍｌ、および（ｆ）０ｎｇ／ｍｌ。図２９Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）０．１ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）０．０１ｎｇ／ｍｌ、および（ｅ）０ｎｇ／ｍｌ。
【図３０Ａ】図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは、０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。図３１Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５００ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２５０ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｅ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｆ）０ｍＵ／ｍＬ。図３１Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）０．０２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｅ）０ｍＵ／ｍＬ。
【図３１Ｂ】図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは、０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。図３１Ａ（ａ〜ｆ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５００ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２５０ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｅ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｆ）０ｍＵ／ｍＬ。図３１Ｂ（ａ〜ｅ）は、以下のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示す：（ａ）２５ｍＵ／ｍＬ、（ｂ）２．５ｍＵ／ｍＬ、（ｃ）０．２５ｍＵ／ｍＬ、（ｄ）０．０２５ｍＵ／ｍＬ、および（ｅ）０ｍＵ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
発明の詳細な説明
食品安全性、医学的診断、獣医学的診断、病原体検出、法医学、および国土防衛などの領域には、生物有機体（汚染細菌など）および生物学的成分（タンパク質、ＤＮＡ、または他の遺伝子材料など）の迅速且つ特異的な同定が必要である。細菌の迅速且つ感度の高い検出方法が当該分野で特に必要である。
【０１２１】
サンプル中の細菌を同定するための一般的なアッセイは免疫アッセイであり、このアッセイは細菌に結合した抗体の検出に依存する。典型的には、抗体を標識し、標識の存在をアッセイすることによって抗体の存在を検出する。あるいは、抗体を酵素に抱合し、抗体−酵素抱合体の存在を酵素活性のアッセイによって検出する。酵素−抗体抱合体を使用する一般的に使用されているアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。標準的アッセイでは、酵素活性を、酵素によって比色手段、蛍光発生手段、および化学発光手段によって検出可能な生成物に変換される反応物の存在下での酵素−抗体抱合体のインキュベーションによって測定することができる。
【０１２２】
しかし、比色手段、蛍光発生手段、および化学発光手段による検出は、制限されたダイナミックレンジ、制限された感度、およびバックグラウンドからの干渉などのいくつかの欠点に悩まされている。
【０１２３】
ラマン分光法はこれらの方法を超えるいくつかの利点を有するが、一般に、ラマン分光法を、一般的に使用されている比色試薬、蛍光発生試薬、および化学発光試薬と組み合わせて使用することができない。なぜならば、これらは、典型的には、有用なラマンスペクトルを生じないからである。例えば、比色試薬である３，３’，５，５’−テトラメチル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｅｌｅｎｅ）ベンジジン（ＴＭＢ）およびアジノビスエチル（ｅｔｈｌｙ）ベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）は、有機体の検出に有用なラマンスペクトルを生じない。したがって、有機体の検出に有用なラマン活性生成物を生じる試薬（酵素−抗体抱合体を使用した免疫アッセイ形式で使用することができる試薬が含まれる）が望まれる。
【０１２４】
ラマン分光法を使用した免疫アッセイ形式での細菌の検出に有用な試薬は、一定の好ましい特徴を有する。第１に、試薬は、細菌によって生じたバックグラウンドシグナルを事前に持たないラマンスペクトル領域中にラマンシグナルを生じるべきである。第２に、試薬によって生じたラマンシグナルは定量可能で、広範な濃度範囲にわたる検出が可能であるべきである。
【０１２５】
本開示は、その一部が、一定のアミン含有化合物を免疫アッセイ形式で使用して有機体および成分（核酸およびタンパク質など）を検出することができるという発見に基づく。これらの試薬を酵素的に変換して、細菌由来のラマンシグナルを事前に含まないスペクトル領域でラマンシグナルを有するイミノキノンまたは他の生成物を生成する。ラマンシグナルの検出は酵素の存在を示す。酵素がＥＬＩＳＡアッセイで使用した抗体抱合体の一部である場合、ラマンシグナルの検出は、ＥＬＩＳＡの標的の存在を示す。あるいは、ラマン活性試薬を酵素と共にインキュベートして、これらの試薬を試薬と異なるラマンスペクトルを有する生成物に変換することができる。ラマンシグナルの変化は酵素の存在を示す。したがって、これらの試薬の使用により、迅速、特異的、且つ定量的な酵素活性の検出が可能である。
【０１２６】
本開示はまた、一定の組み合わせおよび量の本開示の試薬が優れた感度を示すという発見に一部基づく。この感度を、多波数スペクトル分析を使用する開示の定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）法の使用によってさらに増強することができる。
【０１２７】
本開示はまた、他の比色試薬と対照的に、比色試薬ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を使用してラマン活性生成物を生成することができるという発見に一部基づく。ＯＰＤをラマン分光法と組み合わせて使用して、酵素活性のリアルタイム反応速度を測定することができる。
【０１２８】
本開示はまた、少なくとも１つのリン酸基を有する化合物をホスファターゼ基質として使用してラマン活性生成物またはラマン活性生成物の前駆体を生成することができるという発見に一部基づく。ホスファターゼ基質は、ホスファターゼの存在下で酵素的に脱リン酸化されて対応するフェノールまたはアミノフェノールを形成し、次いで、酸化剤を使用するか使用しないで酸化されて対応するラマン活性キノンまたはイミノキノンを生成することができる芳香族化合物であり得る。ホスファターゼ基質を、免疫アッセイ形式で使用することができる。ホスファターゼはアルカリホスファターゼであり得る。ラマン活性生成物の前駆体を、塩基への曝露によってラマン活性生成物に変換することができる。塩基はＮａＯＨであり得る。
【０１２９】
いかなる理論にも拘束されないが、本開示は一定の化合物がラマン分光法によって検出することができる電荷移動複合体を形成する能力に基づくと考えられる。かかる複合体の存在は、これらの化合物が電荷移動複合体の形成と一致する広いラマンピークを生じるという発見によって支持される。例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら，“Ｄｉｒｅｃｔ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒｓ，” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１４６８−１１４８０（１９９７）を参照のこと。一定の化合物がラマン検出可能な電荷移動複合体を生成するという発見は、かかる複合体を生成する反応物を選択するための手段を提供する。
【０１３０】
定義
「抗体」は、本明細書中で使用する場合、免疫グロブリンまたはその一部を意味し、供給源、産生方法、および他の特徴と無関係に抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。本用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、およびＣＤＲグラフティング抗体が含まれる。抗体の一部には、依然として抗原に結合することができる任意のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）が含まれ得る。抗体の起源は、産生方法と無関係にゲノム配列によって定義される。
【０１３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の多量体形態をいうために交換可能に使用され、天然に存在するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生物学的に修飾されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、またはデザイナーアミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチド模倣物、デプシペプチド、および修飾、環状、二環式、デプシ環式、またはデプシ二環式のペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。本用語は、単鎖タンパク質および多量体が含まれる。
【０１３２】
用語「アミノ酸」は、アミノ酸の単量体形態をいい、天然に存在するアミノ酸、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、またはデザイナーアミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチド模倣物、およびデプシペプチドが含まれ得る。
【０１３３】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」は、本明細書中で、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態をいうために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログまたは誘導体を含むことができる。
【０１３４】
用語「ヌクレオチド」は、単量体ヌクレオチドをいい、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログまたは誘導体が含まれる。
【０１３５】
用語「リガンド」は、別の分子（受容体が含まれる）に結合する分子をいう。
【０１３６】
免疫アッセイ形式
本開示を、種々の形式で実施することができる。１つの実施形態では、形式は免疫アッセイである。一定の免疫アッセイ実施形態では、標的生体物質を、固体表面に結合した抗体に最初に結合させる。次いで、試験サンプルの非結合成分を任意選択的に洗い流して結合した生体物質／抗体結合体（ｂｉｏｌｏｇｉｃ／ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のみを残し、これらを紫外線のラマン散乱によって検出することができる。
【０１３７】
他の免疫アッセイ実施形態では、標的生体物質を、抗体または抗体−酵素抱合体に最初に結合させる。この生体物質／抗体結合体または生体物質／抗体−酵素結合体は、生体物質／抗体結合体または生体物質／抗体−酵素結合体の抗体部分を介して、基質化合物（少なくとも１つのリン酸基を有する芳香族有機化合物など）と反応する。次いで、基質化合物を、ラマン活性生成物にさらに酸化させる。かかる実施形態では、したがって、標的生体物質を、ラマン活性生成物の検出によって定量する。
【０１３８】
１つの実施形態では、ラマン分光法と生体標識技術との組み合わせを使用して、生物学的成分（タンパク質またはペプチド（疾患に関連する特定の高次構造または条件の任意の翻訳後修飾物（例えば、プリオンタンパク質）が含まれる）など）を同定および定量する。
【０１３９】
感度を増大させるために、その後に１つまたは複数の新規の反応物を導入し、生体物質／抗体結合体に結合するようになるさらなる工程を想定する。ここで、新規の反応物の生体物質／抗体結合体との結合体を、ラマン散乱光を使用して検出することができる。かかる反応物の例には、表１に列挙した試薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
【表１】
生体物質／抗体結合体からの出発の代わりに、ラマン検出法は抗体を使用せずに生体物質と相互作用する化学物質を使用することができることも想定される。
【０１４１】
ラマンベースの方法を、多数の免疫アッセイ（ヒトＩＬ−１１、ラットＣ反応性タンパク質、可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩの検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。
【０１４２】
ラマンベースの方法を、種々の有機体および成分の検出に適用することができる。１つの実施形態では、バクテリオファージを検出する。別の実施形態では、細菌（大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、およびブドウ球菌が含まれる）を検出する。別の実施形態では、ウイルス（ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）を検出する。別の実施形態では、成分（タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、代謝産物、ホルモン、および代謝中間体が含まれる）を検出する。
【０１４３】
抗体以外の標的生体物質に特異的な結合パートナーまたはリガンド（例えば、生物学的受容体（タンパク質））を使用することができるということも想定される。
【０１４４】
本明細書中に開示の多数の技術が生物有機体および生物学的成分の検出に関連しているにもかかわらず、本開示はサンプル中の無機成分、有機成分、夾雑物、または毒素の検出に適用可能である。開示の検出技術を、共鳴ラマン光散乱を示す反応物の使用によって増強することができる。一定の反応物について、これらの反応物の構造に特異的なより高い強度の散乱光の周波数が存在する。本開示の一定の実施形態における共鳴現象は、標的分子の化学構造および相互作用にのみ関連し、表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）として公知の技術などで見出される任意の固体表面相互作用に関連しない。
【０１４５】
定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）
ラマンスペクトルを、定量可能な単一の結果（ＳＱＲ）を得ることによって分析することができる。ＳＱＲ数は、サンプル中で測定されたターゲティングされた分析物に対応するラマンスペクトルと測定過程で認められた任意のバックグラウンドラマンシグナル／スペクトルとの間の相違である。ＳＱＲ過程の工程を表２に示す。
【０１４６】
【表２】
ＳＱＲ過程は、サンプル由来のラマンシグナルおよびバックグラウンドの評価が適切（すなわち、「妥当」）であり、サンプル中のターゲティングした分析物の存在を示すのに十分である（すなわち、「正値」）であるかどうかの評価を含むことができる。ＳＱＲ過程を、手作業またはデザインされたコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。バックグラウンドおよび試験スペクトルについての複数の波数のラマンシグナルを、表にしている。１つの実施形態では、バックグラウンドおよび試験スペクトルの両方について、１つおきの波数毎に表にしている。別の実施形態では、バックグラウンドおよび試験スペクトルの両方について、波数毎に表にしている。１つの実施形態では、波数範囲は２０００〜４０００ｃｍ−１である。別の実施形態では、波数範囲は３５００〜４０００ｃｍ−１である。試験シグナルとバックグラウンドシグナルとの間の差を波数範囲について決定し、この差の二乗を保存する。二乗の和を決定し、この和の平方根がＳＱＲ値である。
【０１４７】
ＳＱＲを使用する場合、ラマンスペクトルが意図する意味を有するように確実にネガティブおよび／またはサンプル運転を適切に運転する（不正確にアッセイされる系統誤差がない）ことによってその妥当性を検証することができる。バックグラウンドを測定する場合、バックグラウンドサンプルは、試験サンプル中の代表的なバックグラウンドシグナルでなければならず、装置のサンプル管を使用することなくラマン読み取りを行った場合に得られるシグナルなどの無作為なシグナルに起因しない。サンプルスペクトルは、ネガティブコントロールのスペクトルの下（未満）で一貫して運転してはならない。数学的には、より低い運転サンプルとバックグラウンドとの間の差を正値に変換し、潜在的に「正の」ＳＱＲシグナルと解釈する。
【０１４８】
以下の「妥当性」分析を行うことができる。波数（例えば、３２６０ｃｍ−１）でのバックグラウンドサンプル（「ネガティブコントロール」）のラマン値を、予想されるように運転すべきである（最小値超且つ最大値未満）。この決定は、確実に正確なサンプルをネガティブコントロールとして運転し、アッセイを正確に運転するための助けとなるであろう。ポジティブコントロールのＳＱＲ値は、予想値未満で運転すべきではない。これは、正確なサンプルをポジティブコントロールとして運転し、アッセイを正確に運転するための助けとなるであろう。各試験サンプルの「差の和」は、予想値未満で運転すべきではない。これらの分析は、確実にサンプルスペクトルがネガティブコントロールのスペクトルの下（未満）で一貫して運転されないための助けとなる。予想される最小値および最大値を、繰り返して行った実験で得られた値から最小値および最大値を確立することによって経験的に決定することができる。
【０１４９】
ＳＱＲ法を、手作業またはコンピュータを用いて行うことができる。開示の１つの実施形態は、ＳＱＲ計算用の装置操作可能な言語を有するコンピュータである。
【０１５０】
器具類
マイクロまたはナノファブリケーションテクノロジーを使用して、結合パートナーがカスタム集積回路（ラマン分光法のためのレーザーおよび検出器も含むであろう）中の１つまたは複数のマイクロ流体チャネル中に固定されたマイクロ流体チャネル（またはウェル）集積回路上で本開示の実施形態を実行することができることも想定される。かかる実行により、単一の生物学的成分（病原性細菌、タンパク質、または遺伝子材料など）を検出することができる。
【０１５１】
したがって、本開示の一定の実施形態の目的は、化学的相互作用（結合が含まれる）とラマン光散乱の最終工程との組み合わせを使用する成分の標的生物有機体の検出システムを得ることである。
【０１５２】
本開示の一定の実施形態の別の目的は、化学的相互作用（結合が含まれる）とラマン光散乱の最終工程との組み合わせを使用する無機または有機の標的成分の検出システムを得ることである。
【０１５３】
本開示の一定の実施形態の別の目的は、免疫アッセイとラマン光散乱を使用した検出とを組み合わせることである。
【０１５４】
本開示の一定の実施形態のさらに別の目的は、共鳴ラマン光散乱を生じる化学反応物の使用によって検出感度を増大させることである。
【０１５５】
本開示の一定の実施形態のさらに別の目的は、結合とラマン光散乱測定との組み合わせを実施することができるマイクロ流体チャネルまたはウェルを有する集積回路デザインを得ることである。
【０１５６】
本開示のこれらおよび他の目的および利点は、関連する図面を含む本開示を読んだ際に当業者に明らかとなるであろう。
【０１５７】
図１は、生物有機体または生物学的成分の検出のための典型的な先行技術の免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ）（１０）の流れ図である。この過程は、標的生体物質を含む液体サンプルの調製工程（１１）から開始される。例えば、サンプルを、成長培地（ハーフフレーザーブロスまたは他の適切な細菌成長培地など）中での前培養によって調製することができる。あるいは、試験用の液体サンプルを任意の液体供給源から得ることができる。固体材料を、適切な溶液に浸漬し、潜在的な標的有機体または分子を溶液に入れ、次いで、液体中でサンプリングすることができる。次の工程（１２）では、調製した液体サンプルを、固体表面に結合させた結合パートナーと組み合わせる（または混合する）。典型的な結合パートナーには、抗体、バクテリオファージ、およびバクテリオファージタンパク質が含まれる。例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレート、ラテックスビーズ、または磁性微粒子を使用することができる。他の固体支持体（ニトロセルロース、濾紙、ナイロン、および他のプラスチックなど）も使用することができる。次いで、抗体／生体物質結合体を、工程（１３）で生体物質および抗体を相互に結合可能な時間インキュベートする。一旦これが起こると、結合させた結合パートナー／生体物質をデカントし（注ぎ出し）、洗浄して非結合の生体物質および他の望ましくない材料を除去する。新規の反応物を工程（１５）で添加して、種々の方法によるシグナル分子の検出に対する混合物の感度を増強させる。かかる反応物の例には、表３に列挙した反応物が含まれる。
【０１５８】
【表３】
結合した結合パートナー／生体物質および新規の反応物を含む混合物を、工程（１３）で反応を起こす時間インキュベートする。多くの場合、この時点で、過程（１０）の反応部分は完全であり、工程（１１）〜（１５）（両端の工程を含む）中で産生されたか含まれる分子の測定工程（１６）を行うことができる。さらなる反応物が必要である場合、工程（１４）、（１５）、および（１３）を、適切なシグナル分子が存在するまで、１回または複数回連続して反復することができる。
【０１５９】
シグナル分子の測定によって定量的結果が得られ、次いで、この結果を分析し、工程（１７）で既知濃度の標的生体物質の較正反応の既知の組と比較することができる。この比較によって工程（１８）に進み、ここで、結果を定量し、工程（１１）で調製したサンプル中の標的生体物質の濃度の報告と関連づける。
【０１６０】
図１の過程（１０）の説明が生物有機体または生物学的成分の検出に関係していたにもかかわらず、過程（１０）は抗体または他の結合パートナーが反応し得る多数の分子型の検出にも適用可能である。
【０１６１】
図２は、本開示の検出サブシステム（２０）の実施形態の線図である。レーザー（２１）はレーザー・ビーム（２２）を生じ、これが焦点レンズ（２３）によって収束レーザー・ビーム（２４）に収束し、これが標的サンプル（２５）に当たる。サンプル（２５）由来の後方散乱光（２６）は、焦点レンズ（２７）によってビーム（２８）に収束する。ビーム（２８）は、検出器（３１）を有する分光計（３０）に向かう。検出器（３１）からの出力はシグナル（３２）であり、このシグナルは、分析、保存、および／またはプリンター（４２）を使用した印刷のためのパーソナルコンピュータ（４０）によって受信される。レーザー（２１）は、典型的には、可視領域で出力される連続波長（ＣＷ）レーザーである。例えば、アルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、アルゴンイオンレーザーポンプ波長可変性色素レーザー、またはダイオードレーザー（緑色、赤色、または他の周波数）。焦点レンズ（２３）および（２７）は、ミラー、レンズ、絞り、シャッター、回折格子、および／または偏光子を含む。標的サンプル（２５）は液体、気体、または固体であってよく、一定の実施形態では、標的サンプルは、液体または沈殿した固体を使用するであろう。分光計（３０）は、波長に基づいて、散乱光を空間的に分離する。本開示に有用な分光計の例は、Ｌａｍｂｄａ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓモデルＰＳ−１である。検出器（３１）は、分光計（３０）によって空間的に分離された光の振幅を測定し、電気信号（アナログまたはデジタル）に変換する。一定の実施形態では、検出器は、標準化されたコンピュータインターフェース（ＲＳ−２３２、ＵＳＢ、パラレル、ＩＥＥＥ１３９４など）を使用して電気信号を生じるであろう。本開示に有用な検出器（３０）の例は、Ｌａｍｂｄａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＰＳ−１である。パーソナルコンピュータ（４０）は、検出器（３１）への適切なインターフェースならびに分光計（３０）から受信した後方散乱光（２６）のスペクトルを分析、保存、および／または印刷するようにデザインされたソフトウェアを有する任意のデスクトップＰＣまたはラップトップＰＣであり得る。
【０１６２】
図３は、生物有機体および／または生物学的成分の検出のための本開示の実施形態の流れ図（３０）である。この過程は、標的生体物質を含む液体サンプルの調製工程（３１）から開始される。例えば、サンプルを、成長培地（ハーフフレーザーブロスまたは他の適切な細菌成長培地など）中での前培養によって調製することができる。あるいは、試験用の液体サンプルを任意の液体供給源から得ることができる。固体材料を、適切な溶液に浸漬し、潜在的な標的有機体または分子を溶液に入れ、次いで、液体中でサンプリングすることができる。次の工程（３２）では、調製した液体サンプルを、固体表面に結合させた抗体と組み合わせる（または混合する）。例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレート、ラテックスビーズ、または磁性微粒子を使用することができる。次いで、抗体／生体物質結合体を工程（３３）でインキュベートして、生体物質および抗体を相互に結合させる。一旦これが起こると、組み合わせた抗体／生体物質をデカントし（注ぎ出し）、洗浄して非結合の生体物質および他の望ましくない材料を除去する。新規の反応物を工程（３５）で添加して、ラマン光散乱による検出に対する混合物の感度を増強させる。かかる反応物の例を、表１に列挙する。
【０１６３】
結合した抗体／生体物質および新規の反応物を含む混合物を、工程（３３）で反応を起こす時間インキュベートする。多くの場合、この時点で、過程（３０）の反応部分は完全であり、工程（３１）〜（３５）（両端の工程を含む）によって産生されたラマン活性分子由来のラマン光散乱の測定工程（３６）を行うことができる。さらなる反応物が必要である場合、工程（３４）、（３５）、および（３３）を、適切なラマン活性分子が存在するまで、１回または複数回連続して反復することができる。
【０１６４】
ラマン光散乱の測定はスペクトルであり、次いで、このスペクトルを分析し、工程（３７）で既知濃度の標的生体物質の較正反応の既知の組と比較することができる。この比較によって工程（３８）に進み、ここで、結果を定量し、工程（３１）で調製したサンプル中の標的生体物質の濃度の報告と関連づける。
【０１６５】
リステリアを、（酵素結合免疫吸着アッセイ）ＥＬＩＳＡ形式で測定することができる。１００マイクロリットルの種々の濃度の細菌（１００，０００、５０，０００、２５，０００、１２，５００、６，２５０、および０コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を、抗リステリア抗体でコーティングしたマイクロウェルに添加する。３７℃で３０分間と６０分間との間のインキュベーション後、ウェルをデカントし、穏やかな洗浄液で３回洗浄する。１００μｌのペルオキシダーゼ抱合抗リステリア抗体をウェルに添加し、３７℃で１〜４時間インキュベートする。ウェルをデカントし、穏やかな洗浄液で３回洗浄した。４−ヒドロキシルベンジルアルコール（８０．６ｍＭ）、４−アミノアンチピレン（２４ｍＭ）、過酸化水素尿素（１０．６ｍＭ）の混合物を含む１２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ６．０）を添加し、３０〜６０分間発色させる。各ウェル由来の発色のラマンスペクトルに展開し、応答を定量する。
【０１６６】
図３の過程（３０）の説明が生物有機体または生物学的成分の検出に関連しているにもかかわらず、過程（３０）は、無機分子または有機分子、夾雑物、または毒素の検出にも適用可能である。
【０１６７】
図４は、化学成分のラマン活性化合物への変換のために酵素を使用する化学変換系（４０）のブロック線図である。例えば、（４１）、（４２）、および（４３）と命名した１つまたは複数の反応物を、生物学的触媒（４４）と混合する。生物学的触媒（４４）は、提供した反応物または１つまたは複数の反応物（４１）、（４２）、および（４３）と相互作用するようにデザインされたＲＮＡ構造の代謝に特異的な酵素であり得る。反応物の変換または組み合わせが反応（４５）で起こり、測定可能な生成物（４６）が形成される。例えば、反応物および表４中の反応物を、ペルオキシダーゼ（４４）および過酸化水素尿素（ＵＰ）（４３）の存在下で混合する。
【０１６８】
ペルオキシダーゼアッセイで有用な反応物
【０１６９】
【表４】
共に混合する場合、これらの反応物から、ラマン分光法を使用して検出可能なイミノキノン化合物が得られるであろう。ＨＢＡ、ＡＳＡ、およびＵＰを使用した反応を、ＢＡＳＨ−ＵＰという。
【０１７０】
ラマン活性生成物を生成することができるさらなる反応物を、開示の方法で使用することができる（ベンゼンまたはナフタレン中の１位および４位に少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を含む化合物など）。さらなる基（カルボキシル、アミン、塩素、臭素、ニトロ、および他の官能基など）を含めることにより、ラマンシグナルを増大させることができる。かかる化合物には、
【０１７１】
【化４０】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＮＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、ニトロ、およびベンジルから選択され、Ｙは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロから選択され、Ｚは、Ｈ、ベンジル、およびＮＨ２から選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＮＨ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、Ｘはニトロであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＣｌである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、ＹはＢｒである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＨであり、Ｙはニトロである。別の実施形態では、ＸおよびＺはベンジルであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＮＨ２であり、ＹはＨである。
【０１７２】
かかる化合物には、
【０１７３】
【化４１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびニトロ（ＮＯ２）から選択される）も含まれる。
【０１７４】
かかる化合物には、
【０１７５】
【化４２】
（式中、Ｘは、Ｈ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＮＯ２から選択される）も含まれる。
【０１７６】
開示の方法でラマン活性生成物を生成することができるさらなる化合物には、ベンゼン環またはナフタレン環中の１，２位または１，４位に少なくとも２つのヒドロキシル官能基を含む化合物が含まれる。
【０１７７】
かかる化合物には、
【０１７８】
【化４３】
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＹはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷはＯＨであり、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＹはＯＨであり、ＸおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＷおよびＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【０１７９】
かかる化合物には、ポリフェノール（
【０１８０】
【化４４】
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨおよびＯＨから選択される）など）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＯＨであり、ＺはＨである。別の実施形態では、ＸおよびＺはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＺはＯＨであり、ＸおよびＹはＨである。
【０１８１】
開示の方法でラマン活性生成物を生成することができるさらなる化合物には、ベンゼンまたはナフタレン中のヒドロキシメチレン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｅｎｅ）（−ＣＨ２ＯＨ）基を含む化合物が含まれる。１位、４位、および６位にさらなるヒドロキシル基を含めることにより、ラマンシグナルを増大させることができる。
【０１８２】
かかる化合物には、
【０１８３】
【化４５】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）が含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【０１８４】
かかる化合物には、
【０１８５】
【化４６】
（式中、ＸおよびＹはＨおよびＯＨから選択される）も含まれる。１つの実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＨである。
【０１８６】
かかる化合物には、芳香族アミン（オルト−フェニレンジアミン、メタ−フェニレンジアミン、およびパラ−フェニレンアミンを含む化合物が含まれる）も含まれる。
【０１８７】
かかる化合物には、２，４−ジアミノベンジルアルコール、２−アミノ−１−ナフトール、および４−アミノアンチピレンも含まれる。
【０１８８】
【化４７】
反応（４５）の生成物を、反応を定量的または定性的に報告する分子として使用することができ、そのようなものとして、例えば、特異的な抗体または生物学的もしくは化学的結合パートナーと結合した場合の特異的な生物学的標的の存在についてのプローブとして使用することができる。
【０１８９】
リン酸基を含む反応物
一定の化合物は、空気への曝露の際にラマン活性生成物を自発的に形成することができる（「自動酸化」）。かかる化合物は、一定のアッセイ形式（ＥＬＩＳＡなど）での使用に適していない。何故なら、かかる化合物は酵素によって活性化されることなくラマンシグナルを示すからである。本開示は、ラマンベースアッセイで使用可能なこれらの反応物の修飾バージョンを提供する。具体的には、自発的に酸化し得る本開示の化合物中に存在するヒドロキシル基をリン酸基で修飾して自発的酸化を防止することができる。そのようなものとして、これらの化合物により、本明細書中に開示の方法で使用することができる化合物型をさらに拡大される。さらに、本開示は、ホスファターゼ活性の検出に基づいたラマン分光法の使用方法を提供する。
【０１９０】
ラマン活性生成物を生成するさらなる反応物を、本明細書中に開示の方法で使用することができる（少なくとも１つのリン酸基を含む化合物など）。かかる化合物には、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物（例えば、置換基として少なくとも１つのリン酸基を有するベンゼン環またはナフタレン環を含む化合物）が含まれる。さらなる置換基（カルボキシル、アミン、塩素、臭素、ニトロ、および／または他の官能基など）を含めることにより、ラマン活性生成物のラマンシグナルを増大させることができる。本開示のかかる化合物は、例えば、相互にオルト（１，２）および／またはパラ（１，４）である官能基を有することができる。
【０１９１】
ヒドロキシフェニルホスフェート
４−ヒドロキシフェニルホスフェートは、触媒的に脱リン酸化されて４−ヒドロキシフェノール（ヒドロキノン）を生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されてベンゾキノンを形成する。これが電気化学的免疫アッセイで使用されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６８，２９２，１９８８）。
【０１９２】
オルト（１，２）位および／またはパラ（１，４）位でヒドロキシル化される化合物は、空気中で急速に酸化されて対応するキノン化合物を生成することができる。カテコール（１，２−ジヒドロキシベンゼン）、ヒドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）、およびピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）などの化合物は、空気中で急速に酸化されて対応するキノンを形成することが認められており、このキノンは、塩基（強水酸化ナトリウム溶液）での処理によってラマン分光法を使用して定量される高いラマンシグナルを生じた。ＮａＯＨ依存性シグナルは可逆性であった（反応物の酸性化の際に消滅し、ＮａＯＨの添加の際に再出現した）。
【０１９３】
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、以下の構造：
【０１９４】
【化４８】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択され、ＷはＯＨまたはＰＯ４から選択され、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣＯＯＨであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。別の実施形態では、ＸはＳＯ３Ｈであり、ＹはＯＨであり、ＺはＮＨ２である。
【０１９５】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応によって触媒的に脱リン酸化され、次いで、酸化されてラマン活性キノン化合物を形成することができる。以下の反応によってこれを例示する：
【０１９６】
【化４９】
オルト（１，２）位またはパラ（１，４）位で酸化されたかかる化合物（例えば、カテコール（１，２−ジヒドロキシ−ベンゼン）、ヒドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）、およびピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）が含まれる）が空気中で急速に酸化されて対応するキノンを形成することができる。
【０１９７】
本開示のいくつかの実施形態では、キノン生成物のラマンシグナルを、塩基（強水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液など）での処理の際に増強させる。このシグナルの増強は、酸の添加の際にラマンシグナルが減少し、塩基添加の際に増加する（ラマンシグナル増強の回復）ように、ｐＨ依存性（すなわち、ＮａＯＨ依存性）であり得る。例えば、自動酸化およびＮａＯＨ添加の際のラマンシグナル増強は、カテコール、ピロガロール、および１，２，４−ベンゼントリオール（１，２，４−ｂｅｎｅｚｅｎｅｔｒｉｏｌ）について認められており、これらは以下の構造を有する：
【０１９８】
【化５０】
アミノフェニルホスフェート
４−アミノフェニルホスフェートが触媒的に脱リン酸化されて４−アミノフェノールを生成し、これがアルカリ条件下で空気によって急速に酸化されて１，４−イミノキノンを形成することも公知である（Ｔａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１４，１９７，１９８８）。このイミノキノン化合物は、電気化学的免疫アッセイによるアルカリホスファターゼの高感度検出で使用されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２７１，２２３，１９９３）。
【０１９９】
４−アミノフェノール、４−アミノ−２−クロロフェノール、および２，４−ジアミノフェノールなどの化合物は空気中で急速に酸化されて対応するイミノキノン化合物を形成し、塩基（強水酸化ナトリウム溶液）での処理によってラマン分光法を使用して定量することができる高ラマンシグナルを生じることが認められた。４−アミノフェノール、４−アミノ−２−クロロフェノール、および２，４−ジアミノフェノール由来の水酸化ナトリウム処理したイミノキノンのラマンスペクトルは、上記の水酸化ナトリウム処理したベンゾキノンと類似する。
【０２００】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのアミン基をさらに含み、以下の構造：
【０２０１】
【化５１】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択され、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、およびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹおよびＺはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹおよびＺはＨである。
【０２０２】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応によって触媒的に脱リン酸化され、次いで酸化されて対応するラマン活性イミノキノン化合物を形成することができる。以下の反応によってこれを例示する：
【０２０３】
【化５２】
塩基（例えば、強ＮａＯＨ溶液）での処理の際、イミノキノンは、定量することができる増強されたラマンシグナルを生じることができる。
【０２０４】
ナフチルホスフェート
別のリン酸含有化合物（４−ヒドロキシナフチルホスフェート）は、触媒的に脱リン酸化されて１，４−ジヒドロキシナフタレンを生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されて１，４−ナフタキノンを形成する。これが検出感度の高い電流測定免疫アッセイで使用されている（Ｍａｓｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，４０２，２９−３５，１９９９）。１位、２位、または両方の位置が官能基で置換されたナフチル化合物は、空気中で同様に急速に酸化されて対応するキノンを生成することができる。例えば、１，４−ジヒドロキシナフタレンは、空気中で急速に酸化されて１，４−ナフタキノンを形成することが認められたのに対して、１，３−ジヒドロキシナフタレンは自動酸化を示さなかった。さらに、１，４−ナフタキノンは、酸化剤を使用するか使用せずに高いラマンシグナルを生じることが見出された。強塩基（ＮａＯＨなど）の添加により、スペクトルパターンが変化することも見出された。
【０２０５】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのヒドロキシル基をさらに含み、以下の構造：
【０２０６】
【化５３】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、ＸおよびＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹはＨである。
【０２０７】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、触媒的に脱リン酸化されて対応するジヒドロキシナフタレンを生成することができ、これが空気中でさらに酸化されてラマン活性ナフタキノンを形成することができる。反応を以下に例示する：
【０２０８】
【化５４】
アミノナフチルホスフェート（ａｍｉｎｏｎａｐｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
別のリン酸含有化合物（４−アミノナフチルホスフェート）は、触媒的に脱リン酸化されて４−アミノ−１−ナフトールを生成することが公知である。次いで、これは空気によって急速に酸化されて１，４−イミノナフタキノンを形成する。これが検出感度の高い電流測定免疫アッセイで使用されている（Ｍａｓｓｏｎら，Ｔａｌａｎｔａ，６４，１７４−１８０，２００４）。
【０２０９】
１，４−イミノナフタキノンは、酸化剤を使用するか使用せずに強いラマンシグナルを生じることが認められており、これを使用してラマン分光法によって標的生体物質を定量することができる。ラマンスペクトルパターンは、強塩基（ＮａＯＨなど）を添加して変化させることができる。
【０２１０】
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、少なくとも１つのアミン基をさらに含み、以下の構造：
【０２１１】
【化５５】
（式中、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＰＯ４およびＮＨ２から選択され、Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２から選択される）を有する。１つの実施形態では、ＸおよびＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＯＨであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＮＯ２であり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＣｌであり、ＹはＨである。別の実施形態では、ＸはＢｒであり、ＹはＨである。
【０２１２】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、かかる化合物は、触媒的に脱リン酸化されて対応するアミノ−ナフトールを生成することができ、これがさらに酸化されてラマン活性イミノナフタキノンを形成することができる。反応を以下に例示する：
【０２１３】
【化５６】
さらなるフェニルホスフェート
本開示の他の実施形態では、少なくとも１つのリン酸基を含む芳香族有機化合物は、以下の構造：
【０２１４】
【化５７】
（式中、ＸおよびＺは、Ｈ、ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＰＯ４からそれぞれ選択され、ＹおよびＷは、Ｈ、ＯＨ、ＳＯ３Ｈ、およびＮＨ２からそれぞれ選択される）を有する。１つの実施形態では、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷはＨである。別の実施形態では、ＸはＨであり、Ｙ、Ｚ、およびＷはＯＨである。別の実施形態では、ＸおよびＹはＨであり、ＺおよびＷはＯＨである。
【０２１５】
適切なレーザー光周波数の選択
図５は、共鳴ラマン検出のために特定の標的分子を励起するための１つまたは複数のレーザー光周波数の選択技術（５０）の流れ図である。ラマン活性生成物（５１）（図４の反応（４５）によって生成された生成物（４６）など）は、ラマン活性な構造を保有する化学物質である。生成物（５１）の吸収スペクトルを、工程（５２）において吸光度または透過率分光光度法などの技術を使用して測定する。工程（５３）では、生成物（５１）が工程（５２）で測定したスペクトルで認められた光を吸収する時点の１つまたは複数の波長を同定する。工程（５４）では、次いで、工程（５３）で同定した１つまたは複数の波長の１つに対応する波長で発光するレーザーを選択する。かかるレーザー波長は、可視領域、紫外線領域、または赤外領域に存在し得る。例えば、図３に記載のリステリア検出反応（３０）のために、選択したレーザー波長は５３２ｎｍである。
【０２１６】
最後に、工程（５５）では、工程（５４）で選択したレーザーを使用して、工程（５１）で作製したラマン活性生成物を照射する。これにより、検出に適切なシグナルを得るための工程（５１）で作製したラマン活性生成物の有意なラマン散乱が存在することが確認されるであろう。
【０２１７】
図６は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインしたマイクロ流体チャネル（６０）の説明図である。標的生物有機体または生物学的成分を含む供給源の液体（または気体）サンプル（６１）は、チャネル（６２）を流れる。標的生物有機体または生物学的成分は、反応して活性表面（６４）に結合した反応物に結合するであろう。レーザー（６５）からの光（６８）によりラマン散乱光（６９）を生じ、これを光検出器（６６）によって検出する。光検出器を、反応物と生物有機体または生物学的成分との結合体のラマンスペクトルに対応する１つまたは複数の特異的波長が測定されるようにデザインする。表面（６４）への生物有機体または生物学的成分の結合の代わりに、反応物を表面から放出することができ、ラマン散乱レーザー（６５）および検出器（６６）を表面から下流に配置することができることも想定される。
【０２１８】
図７は、ラマン活性化合物が検出されるようにデザインされた一連のマイクロ流体チャネル（７０）の説明図である。標的生物有機体または生物学的成分を含む１つまたは複数の供給源の液体（または気体）サンプル（７１Ａ）、（７１Ｂ）〜（７１Ｎ）がチャネル（７２Ａ）、（７２Ｂ）〜（７２Ｎ）を流れる。標的生物有機体または生物学的成分は、反応して活性表面（７４Ａ）、（７４Ｂ）〜（７４Ｎ）に結合した反応物に結合するであろう。レーザー（７５Ａ）〜（７５Ｎ）からの光（７８Ａ）〜（７８Ｎ）によりラマン散乱光（７９Ａ）〜（７９Ｎ）を生じ、これを光検出器（７６Ａ）〜（７６Ｎ）によって検出する。光検出器を、反応物と表面に結合した生物有機体または生物学的成分との結合体のラマンスペクトルに対応する１つまたは複数の特異的波長が測定されるようにデザインする。
【０２１９】
上限Ｎによって制限される一連のマイクロ流体チャネル中のマイクロ流体チャネル数は、２〜１００，０００の範囲である。異なる反応物およびレーザー波長の多様性を異なるチャネルで使用することができることも想定される。これにより、同一の生物有機体または生物学的成分からの散乱の複数の波長が検出可能であるか、複数の異なる生物有機体および生物学的成分の同時検出が可能であろう。最後に、一連のマイクロ流体チャネル（７０）の代わりに、一連のマイクロ流体ウェルを使用して一連の二次元ラマン散乱検出器を作製することができることが想定される。
【０２２０】
本開示を、以下の実施例でより具体的に記載する。実施例は、実施例の多数の修正形態および変更形態が当業者に明らかであるので、例示のみを目的とする。当業者は、本明細書中に記載の方法で使用した装置のパラメーターを本開示にしたがって変更することができると認識するであろう。種々の実施形態をここに詳述する。当業者は以下を意図するであろう。説明中および以下の特許請求の範囲を通して使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数が含まれる。また、説明中および以下の特許請求の範囲を通して使用する場合、「ｉｎ」の意味には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」が含まれる。本明細書中に引用され、本明細書中で考察された全ての引例は、その全体および各引例が個別に参考として援用されるのと同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：ＢＡＳＨ−ＵＰを使用したリステリアの検出
図８は、２成分ＢＡＳＨ−ＵＰ化学、酵素結合抗体、および以下の緩衝液および試薬を使用した下記のラマン検出手順を使用した酵素結合免疫アッセイから得た病原性細菌リステリアについてのラマンスペクトルを示す。
【０２２２】
作業塩類緩衝液（プロトコールで洗浄のための使用）：
１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．６７ｍＭ 塩化カリウム
０．０９ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
０．０５％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ−Ｌ
最終化学試薬（ＢＡＳＨ）：
０．５８８ｍＭ ５−アミノサリチル酸
０．１４５ｍＭ ２−ヒドロキシベンジルアルコール
０．００５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸
０．０９％ ツウィーン−２０
ＵＰ成分：
１．０６３ｍＭ 過酸化尿素
作業塩類緩衝液
さらなる試薬：
１．微粒子−抗リステリア（抗体）コーティングした磁性微粒子（添加の際、２００万微粒子／サンプル）。
２．抱合体溶液−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を抱合した抗リステリア（抗体）（添加の際、２μｇ／サンプル）
加熱死リステリアまたはネガティブブロス（１ｍｌ）のいずれかのサンプルを、以下の手順に供した。１ｍｌサンプルは、培養物、コントロール、スワブ、スポンジなどに由来し得ることに留意のこと。
【０２２３】
手順：
１．１００μｌの微粒子をサンプルに添加する。
２．室温で３０分間インキュベートする。
３．磁石を使用して微粒子を１０分間捕捉する。
４．サンプル体積を除去する。
５．５００μｌの作業塩類緩衝液を添加し、１０００ｒｐｍで２分間混合する。
６．磁石を使用して微粒子を２分間捕捉する。
７．洗浄体積を除去する。
８．工程３〜７をさらに２回繰り返す（全部で３回の洗浄）。
９．２００μｌ抱合体溶液を添加する。
１０．溶液を３０分間混合する。
１１．洗浄工程３〜７を繰り返す（全部で３回の洗浄）。
１２．２００μｌ最終化学試薬を添加する。
１３．１０００ｒｐｍで混合しながら２０分間インキュベートする。
１４．４０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
１５．１０００ｒｐｍで２分間混合する。
１６．磁石を使用して微粒子を２分間捕捉する。
１７．一定体積をラマンシグナル検出用キュベットに移す。
【０２２４】
この手順では、最終化学試薬は２成分ＢＡＳＨ−ＵＰ化学であった。ラマンシグナルは、一般に、約１時間以上安定であった。化学（ＢＡＳＨ）中の第１の成分は、２−ヒドロキシベンジルアルコール（０．０２ｍｇ／ｍｌ）、５−アミノサリチル酸（０．１ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ツウィーン−２０、およびアスコルビン酸（１μｇ／ｍｌ）を作業塩類緩衝液（ｐＨ６．０）中に含んでいた。第２の成分（ＵＰ）は、過酸化尿素添加物（１ｍｇ／ｍｌ）、作業塩類緩衝液（ｐＨ６．０）（ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む）を含んでいた。これらの処方物は、直接照明を避けて１ヶ月超冷蔵した場合に活性を維持していた。ＵＰ：ＢＡＳＨ＝１：１０の比での２成分の混合により、ＢＡＳＨ−ＵＰの作業溶液を作製した。これは一般に１作業日で安定であった。
【０２２５】
ＢＡＳＨ−ＵＰのアリコートを、加熱死リステリアまたはネガティブブロスのいずれかを含むサンプルに添加し、３０分間反応させた。適切な期間は、必要とする検出感度に基づいて変化するであろう。４０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを２００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ反応体積に添加して反応を停止させ、生成物をラマン検出可能にする。ＮａＯＨの体積および濃度の変更により、特定のアッセイに必要なより高いシグナル安定性を得ることができる。
【０２２６】
高倍率設定で操作した５３２ｎｍレーザーを備えたラマンシステムＲ−３０００ラマン分光計を使用して、２４０μｌサンプル由来のラマン散乱を観察した。
【０２２７】
実施例２：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）の比色アッセイ
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）活性の比色アッセイを実施して、ラマンベースの方法と比較することができるデータを得た。ＴＭＢは、西洋ワサビペルオキシダーゼと反応した場合に濃青色の可溶性生成物を生じる。ＡＢＴＳは、西洋ワサビペルオキシダーゼと反応した場合に青緑色生成物を生じる。
【０２２８】
比色アッセイを、以下の２つの異なる方法を使用したＴＭＢ反応およびＡＢＴＳ反応を使用して行った。
【０２２９】
方法Ａ（ＴＭＢ）：０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｐＨ７．４）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中（ＰＢＳ）で１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが測定されるようにＨＲＰＯ希釈物を作製した。５０μｌのＨＲＰＯサンプル／希釈物を２００μｌのＴＭＢ試薬に添加し、１５分間または３０分間反応させ、この時点で、２００μｌ停止溶液（ＫＰＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。各サンプルについて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２３０】
方法Ｂ（ＡＢＴＳ）：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが可能なようにＨＲＰＯ希釈物を作製した。５０μｌのＨＲＰＯサンプル／希釈物を２００μｌのＡＢＴＳ試薬に添加し、１５分間または３０分間反応させ、この時点で、２００μｌ停止溶液（１％ＳＤＳ水溶液）を添加した。各サンプルについて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２３１】
ＴＭＢについてのＨＲＰＯの検出限度は８ｐｇ／ｍｌであり、ダイナミックレンジは５〜５０００ｐｇ／ｍｌであった。ＡＢＴＳについて、検出限度は３２ｐｇ／ｍｌであり、ダイナミックレンジは３２〜５０００ｐｇ／ｍｌであった。
【０２３２】
実施例３：ＨＲＰＯの蛍光発生アッセイおよび化学発光アッセイ
以下のいくつかの試薬を試験した：Ｓｉｇｍａの化学発光ペルオキシダーゼ基質、Ｐｉｅｒｃｅの蛍光発生（Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）基質キット、ＡｎａＳｐｅｃ ＳｅｎｓｏｌｙｔｅのＡＤＨＰ蛍光発生基質、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光発生基質、およびＫＰＬ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＬｕｍｉＧＬＯ。ＳｉｇｍａおよびＰｉｅｒｃｅの基質は、ＨＲＰＯを含むＰＢＳやＢＳＡ含有緩衝液を使用して作用しなかった。
【０２３３】
Ａ．ＡｎａＳｐｅｃの蛍光発生ＡＤＨＰアッセイ
ＡｎａＳｐｅｃの蛍光発生キットは、溶液中のペルオキシダーゼを分析するためにＡＤＨＰ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）を使用する。これにより、ＡＤＨＰがペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で酸化される。ＡＤＨＰの酸化生成物（レゾルフィン（ｒｅｓｏｚｕｆｉｎ））は、桃色蛍光を生じ、これは、励起波長５３０〜５６０ｎｍを使用して発光波長５９０ｎｍで測定することができる。アッセイにおける過剰量のペルオキシダーゼにより、蛍光レゾルフィンが非蛍光レゾルフィン（ｒｅｓｏｚｕｒｉｎ）にさらに変換されて、蛍光シグナルが減少するであろう。１，０００，０００ｐｇ〜０．０６２５ｐｇ／５０μｌサンプルが検出されるように作製されたＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。手順は、前述のＴＭＢアッセイおよびＡＢＴＳアッセイと同一であり、２つの方法を使用した。
【０２３４】
方法Ａ：ＡＤＨＰ試薬および過酸化水素を、製造者の説明書にしたがって調製した。５００μｌのペルオキシダーゼ溶液を、１．５ｍｌのプラスチック製のマイクロキュベット中の５００μｌＡＤＨＰ試薬に添加した。反応混合物を穏やかに混合し、光に曝露することなく室温で３０分間インキュベートした。蛍光シグナルを、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ蛍光分光計にて、５５０ｎｍの励起を使用して５９０ｎｍの発光について測定した。
【０２３５】
方法Ｂ：４００μｌの各ペルオキシダーゼおよびＡＤＨＰ試薬を使用したこと以外は、方法Ａに類似の方法を使用した。
【０２３６】
ＡｎａＳｐｅｃ ＡＤＨＰ蛍光アッセイの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて１２．５ｐｇ／ｍｌであることが見出された。アッセイ範囲は、ＨＲＰＯの２５０ｐｇ／ｍｌ〜０ｐｇ／ｍｌまで線形であった。
【０２３７】
Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光発生アッセイ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ蛍光発生アッセイキットは、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）を使用し、このアッセイはＡｎａＳｐｅｃ ＡＤＨＰアッセイに類似している。ペルオキシダーゼおよび過酸化水素を使用したアッセイの酸化最終生成物はレゾルフィンである。アッセイクレームは１×１０−５Ｕ／ｍｌであり、これは１０ｐｇ／ｍｌ（１×１０−５ｍｌ）と等価である。
【０２３８】
１，０００，０００ｐｇ〜０．０６２５ｐｇ／５０μｌサンプルが検出されるように作製したＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬および過酸化水素を、製造者の説明書にしたがって調製した。４００μｌのペルオキシダーゼ溶液を、１．５ｍｌのプラスチック製のマイクロキュベット中の４００μｌ ＡＤＨＰ試薬に添加した。反応混合物を穏やかに混合し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。蛍光シグナルを、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ蛍光分光計にて、５５０ｎｍの励起を使用して５９０ｎｍの発光について３０分および３５分で測定した。
【０２３９】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ蛍光アッセイの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて２５ｐｇ／ｍｌであることが見出された。アッセイ範囲は、ＨＲＰＯについて直線で２５０ｐｇ／ｍｌ〜０ｐｇ／ｍｌであった。
【０２４０】
Ｃ．ＬｕｍｉＧＬＯ（登録商標）
ＬｕｍｉＧＬＯは、ペルオキシダーゼ標識レポーター分子との使用のためにデザインされたルミノールベースの化学発光基質である。過酸化水素の存在下で、ＨＲＰＯは、ルミノールを励起中間体ジアニオンに変換する。このジアニオンは、その基底状態へ戻る際に発光する。ＨＲＰＯ抱合体との反応後、ＬｕｍｉＧＬＯからの発光は５分以内に最大強度に到達し、およそ１〜２時間持続する。
【０２４１】
各実験におけるＬｕｍｉＧＬＯの感度（検出下限）は、ＨＲＰＯについて１１ｐｇ／ｍｌであることが見出された。
【０２４２】
ラマンベースのアッセイ
種々の異なる組み合わせおよび量のラマン活性生成物を生成する試薬を、それぞれについての最適な反応条件を見出すために試験した。これらのアッセイのために、５０μｌ ＨＲＰＯサンプル／希釈物を、１５０μｌの選択したラマン試薬（Ａ〜Ｅ）および体積比９：１の尿素ペルオキシダーゼに添加し、サンプルを３０分間反応させた。試薬Ａ〜Ｅの処方物を、以下の表に示す。次いで、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを各サンプルに添加し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈したＨＲＰＯサンプルにおいてラマンベースのアッセイも行った。ラマンスペクトルを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して記録した。スペクトル分析は、波長３２６０ｃｍ−１でのラマンシグナルの測定および３５００ｃｍ−１と４０００ｃｍ−１との間の１つおきの波数を使用したＳＱＲに基づいた。
【０２４３】
実施例４：ラマン試薬Ａ（ＢＡＳＨ−ＵＰ）
この研究のために使用した処方物を表５に列挙する。
【０２４４】
【表５】
ＨＲＰＯを、０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで希釈したラマン試薬Ａ−１と反応させた。ラマンスペクトルを、０（「ブランク」）〜１００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物について記録した。図９Ａは、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図９Ｂは、ＳＱＲ分析への適用後のその結果を示す（３５００〜４０００ｃｍ−１）。表６は異なる実験由来のＨＲＰＯの検出限界を比較し、シングルピークに基づいた測定と比較したＳＱＲ法由来の感度の増大を示す。
【０２４５】
【表６】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ａ−１、Ａ−２、およびＡ−３中で反応させ、０（「ブランク」）〜５ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物についてのラマンスペクトルを記録した。図１０は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。図１１は、ラマン試薬Ａ−１およびＡ−２（３５００〜４０００ｃｍ−１）のＳＱＲ分析を示す。
【０２４６】
ＨＲＰＯを、ラマン試薬Ａ−２および新鮮なＨＰＲＯを含むＢＳＡ希釈物と反応させた。図１２は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。
【０２４７】
表７は異なるラマン試薬Ａ処方物由来の検出限界を比較し、ＳＱＲ法によって提供された感度の増大を示す。
【０２４８】
【表７】
実施例５：ラマン試薬Ｂ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表８に列挙する。
【０２４９】
【表８】
ＨＲＰＯを、ラマン試薬Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、およびＢ−４中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物についてのラマンスペクトルを記録した。図１３は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示す。図１４は、ＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク依存を示し、新鮮なＨＲＰＯを含むＢＳＡ希釈物および処方物Ｂ−２を比較している。
【０２５０】
表９は、いくつかの異なるラマン試薬Ｂ処方物由来の検出限界を比較し、ＳＱＲ法によって提供された感度の増大を示す。
【０２５１】
【表９】
実施例６：ラマン試薬Ｃ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表１０に列挙する。
【０２５２】
【表１０】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｃ−１中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物のスペクトルを記録した。図１５ＡはＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図１５Ｂは対応するＳＱＲスペクトルを示す。表１１はシングルピークおよびＳＱＲ法の検出限界を比較し、ＳＱＲ由来の感度の増大を示している。
【０２５３】
【表１１】
実施例７：ラマン試薬Ｄ
本研究のために使用したラマン試薬処方物を、表１２に列挙する。
【０２５４】
【表１２】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｄ−１中で反応させた。０（「ブランク」）〜１０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯ希釈物のスペクトルを記録した。図１６ＡはＨＲＰＯ濃度に対するシングルピーク（３２６０ｃｍ−１）依存を示し、図１６Ｂは対応するＳＱＲスペクトルを示す。
【０２５５】
【表１３】
ＨＲＰＯをラマン試薬Ｄ−１中で反応させた。ラマン試薬処方物Ｄの検出限界は５０ｐｇ／ｍｌであった。
【０２５６】
実施例８：感度試験
異なるラマン試薬を使用したペルオキシダーゼの感度試験を、ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。本研究は、ＢＳＡを使用しないＰＢＳにおける感度を評価することを意図していた。以下の試薬を本研究で使用した。
ラマン試薬Ａ−１：５００μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；２０μｇ／ｍｌ ＨＢＡ；２０μｇ／ｍｌ ＡＡ
ラマン試薬Ｂ−３：２５０μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；２５μｇ／ｍｌ ＣＤＭＰ
ラマン試薬Ｃ−１：４００μｇ／ｍｌ ＡＳＡ；１５０μｇ／ｍｌ ＮＡＰ
１０００ｐｇ〜０．０１２５ｐｇ／５０μｌサンプルが許容されるように作製したＨＲＰＯ希釈物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した。５０μｌ ＨＲＰＯサンプル／希釈物を１５０μｌ試薬に添加し、３０分間反応させた。次いで、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加した。３０分間のインキュベーション後、ラマンスペクトルを、Ｓｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して記録した。ＳＱＲを使用してデータを分析した。各実験由来の結果を、表１４〜１８に示す。
【０２５７】
実施例９：ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰ、ＡＳＡ−ＵＰ、および抗酸化剤の存在下でのＡＳＡ−ＵＰ
これらの研究の目的は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰおよびＡＳＡ−ＵＰを使用してペルオキシダーゼの感度を評価すること、およびＡＳＡ−ＵＰに及ぼす種々の抗酸化剤の影響を調査することであった。
【０２５８】
使用材料は、ビオチン（１２５μｇ／ｍｌ）、ＡＳＡ（１２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）、およびＡＳＡ（１２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）であった。図１７中の結果は、ビオチン−ＡＳＡ−ＵＰ結合体によって０．００６２５ｐｇサンプルもの低濃度を検出することができる高感度アッセイが得られることを示す。ＨＢＡを使用しないＡＳＡ−ＵＰも２ｐｇもの低濃度のＨＲＰＯの検出が可能である。
【０２５９】
ラマンベースのアッセイの比較の代表的な結果を、表１４〜１８に示す。ラマン試薬Ａ（１００〜２５０または５００μｇ／ｍｌのＡＳＡの増加）、試薬Ｂ、およびビオチン−ＡＳＡにより、試薬Ａ−１および試薬Ｃ処方物と比較して超高感度のペルオキシダーゼアッセイが得られる。ラマンベースのアッセイは溶液中のペルオキシダーゼを高感度に検出し、図１８にグラフで示している。
【０２６０】
興味深いことに、ＡＳＡのみで非常に良好な感度が得られる。この感度は、ＣＤＭＰ、ビオチンの添加によって増加し、ＮＡＰの添加によってさえも増加する。アスコルビン酸塩およびＨＢＡを省略したＡ−１に基づく反応では、ペルオキシダーゼの検出限度は、５００μｇ／ｍｌのＡＳＡを使用し、ラマンシグナルを波数３，３００ｃｍ−１およびＳＱＲを使用して分析した場合、それぞれ３．９および４．４ｐｇ／ｍｌであった。７５０μｇ／ｍｌのＡＳＡを使用した場合、検出限度は、ラマンシグナルを波数３，３００ｃｍ−１およびＳＱＲを使用して分析した場合にそれぞれ２．３および１．９であった。
【０２６１】
新鮮なＨＲＰＯ（調製後約３時間以内で使用されるＨＰＲＯ）の使用によってより高い感度が得られ、より高い感度が必要である場合、２〜８℃で一晩の保存後でさえ、サンプルを使用すべきではない。以下の表（表１４〜１８）は、代表的な実験由来の先行例と比較した検出限界のまとめである。
【０２６２】
【表１４】
【０２６３】
【表１５−１】
【０２６４】
【表１５−２】
【０２６５】
【表１６】
【０２６６】
【表１７−１】
【０２６７】
【表１７−２】
Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅａｄペルオキシダーゼアッセイは２５ｐｇ／５０μｌと２５０ｐｇ／５０μｌのサンプルとの間で比例し（ベンダーの主張による）、このアッセイは、１×１０−５Ｕ／ｍｌもの低さで検出することができることに留意のこと。本研究で使用したＳｉｇｍａ ＨＲＰＯの活性は、１０８０Ｕ／ｍｇ固体であった。これに基づいて、１×１０−５Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯは１０ｐｇ／ｍｌに等価である（０．５ｐｇ／５０μｌ）。
【０２６８】
表１８は、ラマンベースの検出、ならびに吸光度、化学発光、および蛍光による検出の代表的な比較をまとめている。
【０２６９】
【表１８】
ラマンベースの検出アッセイに及ぼす種々の抗酸化剤の影響を試験した。代表的実験における７５０μｇ／ｍｌ ＡＳＡを使用したペルオキシダーゼ反応に及ぼす抗酸化剤の影響を表１９にまとめている。
【０２７０】
【表１９】
実施例１０：ラマンベースの検出を使用した免疫アッセイ
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｄ２０５０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（５５０６１１１）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（５５７８２５）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ＤＲＴ２００）、およびＢｉｏＣｈｅｃｋ Ｉｎｃ（ＢＣ−１１０５）から利用可能な免疫アッセイ形式に対してラマンベースの方法を使用した。アッセイプロトコールは、ラマン活性化合物を生成する基質をＴＭＢの代わりに使用したことを除いて、製造者の説明書に従った。ラマン活性化合物を使用した実験を以下のように行った。
試薬Ａ
１．５−アミノサリチル酸：２５０μｇ／ｍＬ
２．２−ヒドロキシベンジルアルコール：２０μｇ／ｍＬ
３．アスコルビン酸：０．２μｇ／ｍＬ
上記の３つの試薬を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に溶解し、滅菌０．４５ミクロンニトロセルロース濾紙で濾過し、琥珀色のポリエチレンボトル中にて２〜８℃で保存した。
試薬Ｂ
１．過酸化尿素：３６０μｇ／ｍＬ過酸化水素を含む１０００μｇ／ｍＬ
試薬を２ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に溶解し、滅菌０．４５ミクロンニトロセルロース濾紙で濾過し、琥珀色のポリエチレンボトル中にて２〜８℃で保存した。
ラマン基質
ラマン基質を、使用前に試薬Ａおよび試薬Ｂを９：１の体積比で混合することによって調製した。基質を、同一の調製で使用すべきである。
代表的実験由来の結果を表２０にまとめている。
【０２７１】
【表２０】
ヒトＩＬ−２アッセイへのラマン活性生成物を生成する基質の導入により、アッセイ感度がおよそ５〜２０倍に改善された。図１９。図１９で証明したＩＬ−２用量反応曲線の左側へのシフトは、この感度の改善を例示している。
【０２７２】
実施例１１：ＨＲＰＯを使用したＢＡＳＨ−ＵＰ反応およびＯＰＤ反応の吸光度、蛍光、およびラマン検出
ペルオキシダーゼ基質としてｏ−フェニレンジアミンを使用した研究により、ＯＰＤがペルオキシダーゼ依存性のラマンシグナルを生じ、ＮａＯＨを添加する必要がなく、広範な波数にわたって検出することができることが明らかとなった。シグナルはＮａＯＨの非存在下でより顕著であるが、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかで反応を停止させた場合に異なる形態で存在する。
【０２７３】
ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液を使用したラマンペルオキシダーゼ反応の蛍光および吸収の特徴を評価するための研究を行った。ＯＰＤ反応およびＢＡＳＨ−ＵＰ反応を、以下の手順にしたがって調製した。
【０２７４】
ＯＰＤプロトコール：
１．ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤの説明にしたがってＯＰＤ基質溶液を調製する。
２．４，０００ｐｇ／ｍｌのＨＲＰＯペルオキシダーゼ希釈物を緩衝液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で調製する。
３．ＯＰＤ／ペルオキシド基質溶液を調製する（基質溶液を調製後１時間以内に使用すべきである）。
４．２５０μｌの希釈ペルオキシダーゼサンプルを各反応管に添加する。
５．７５０μｌのＯＰＤ／ペルオキシド基質を各管に添加する。
６．混合し、暗所にて室温で１５分間インキュベートする。
【０２７５】
ＢＡＳＨ−ＵＰプロトコール：
１．ＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液（ＢＡＳＨ：ＵＰ＝９：１、ｖ／ｖ）を調製する。
２．２００μｌの希釈ペルオキシダーゼ溶液を各反応管に添加する。
３．６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ基質溶液を各管に添加する。
４．混合し、室温で３０分間インキュベートする。
５．２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ停止溶液を各反応管に添加する。
６．混合し、室温で３０分間インキュベートする。
【０２７６】
ＢＡＳＨ−ＵＰまたはＯＰＤ−ペルオキシド試薬のいずれかを使用した反応を、以下のように０または２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼのいずれかを含むサンプル溶液に対して行った。
【０２７７】
ＯＰＤ反応
１．２５０μｌの２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ＋７５０μｌのＯＰＤ−ペルオキシド基質溶液を混合する。
２．２５０μｌの１Ｘ ＰＢＳ−ＢＳＡ 緩衝液＋７５０μｌのＯＰＤ−ペルオキシド基質溶液を混合する。
３．ペルオキシダーゼを添加し、暗所で反応を進行させる。
４．反応完了から３０分後にスペクトルを読み取る。
【０２７８】
ＢＡＳＨ反応
１．２００μｌのペルオキシダーゼ（濃度２，０００ｐｇ／ｍｌ）＋６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ＋２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ
２．２００μｌの１×ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液＋６００μｌのＢＡＳＨ−ＵＰ＋２００μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ
３．ペルオキシダーゼおよびＢＡＳＨを添加し、３０分間反応させ、ＮａＯＨで反応停止させる。
４．反応停止から３０分後にスペクトルを読み取る。
【０２７９】
吸光度。Ｄｉｇｉｌａｂ Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ−２８００分光光度計を使用してスキャンし、シングルビームモードを使用して０．７５０ｍｌの各反応サンプルを用いてスペクトルを記録した。バックグラウンドサンプル（０ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）をベースラインとして使用した。スペクトル（３４０〜６５０ｎｍ；スキャン速度１２００ｎｍ／分；２ｎｍ間隔）を、図２０Ａおよび２０Ｂに示す。ＢＡＳＨ反応の吸収スペクトルは可視波長範囲に広く及び（５００ｎｍあたりを中心とする）、固有の吸収種に関連する明確なピークを欠く（図２０Ａ）。ＯＰＤ反応の吸収スペクトルはより明確であり（図２０Ｂ）、４４０ｎｍ付近に広いピークが存在する（黄色波長範囲）。
【０２８０】
蛍光。２００ｎｍスプリットを有し、Ｓｐｅｃｔｒａｓｕｉｔｅソフトウェアを備えたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＵＳＢ２．０光ファイバーレンズを使用してスキャンした。５１４ｎｍまたは５３２ｎｍのいずれかの励起波長を使用して、スペクトルを生成した。発光スペクトルを、１２秒の積分およびボックス幅３０を使用して収集した。発光スペクトルを、図２１Ａ〜Ｄに示す。ネガティブ（０ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）および反応性（２，０００ｐｇ／ｍｌペルオキシダーゼ）ＢＡＳＨ反応の両方の蛍光発光スペクトルは類似しており（図２１ＡおよびＢ）、低レベルの固有の蛍光を伴う。ＯＰＤ反応の蛍光スペクトルは類似していた（図２２Ａ〜Ｄ）。
【０２８１】
ラマン。５３２ｎｍレーザーを備えたＳｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器でスペクトルを収集し、各反応のスペクトルを図３０および３１に示す。ＢＡＳＨ反応により、巨大なラマンシグナルが得られた（図２３Ａ）。このＢＡＳＨ反応物は、巨大なペルオキシダーゼ含有サンプルに関連する特徴的な淡桃色を有していた。ＯＰＤ反応により、巨大なラマンシグナルも得られ（図２３Ｂ）、巨大なペルオキシダーゼ含有サンプルにも関連する特徴的な黄色も有していた。ラマンシグナルの増加に対応する蛍光シグナルの増加は認められなかった。実際、ペルオキシダーゼが存在する場合に認められる蛍光シグナルのわずかな低下は認められた。これらの所見は、５１４ｎｍおよび５３２ｎｍの発光波長で一貫していた。
【０２８２】
これらの結果は、巨大なペルオキシダーゼ依存性ラマンシグナルを生じるＢＡＳＨ反応およびＯＰＤ反応はいずれも巨大なペルオキシダーゼ依存性蛍光シグナルを示さなかったことを示す。したがって、蛍光は、ＢＡＳＨ反応またはＯＰＤ反応におけるペルオキシダーゼ活性の結果として検出されたラマンシグナルを説明することができない。
【０２８３】
実施例１２：ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応のラマン感度および酵素反応速度の測定
ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応に関連するラマンシグナルを評価し、特徴づけるための研究を行った。サンプル調製のために以下の手順を使用した。
【０２８４】
ＯＰＤ反応：
１．ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤの説明書にしたがってＯＰＤ基質溶液を調製する。
２．３Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を調製する。
３．４，０００ｐｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ希釈物を緩衝液（ＰＢＳ ＢＳＡ）で調製する。
４．ＯＰＤ／ペルオキシド基質溶液を調製する（基質溶液を調製後１時間以内に使用すべきである）。
５．５０μｌの希釈ペルオキシダーゼサンプルを各反応管に添加する。
６．１５０μｌのＯＰＤ／ペルオキシド基質を各管に添加する。
７．混合し、暗所にて室温で３０分間インキュベートする。
８．５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止溶液、５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ、または５０μｌの１×ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液を各反応管に添加する。
【０２８５】
以下の反応混合物を、５×６０ｍｍキュベット中で調製した。各混合物を調製し、次の反応物の調製の３０分前に測定した。１時間毎に新鮮なＯＰＤ基質を調製した。使用した反応を表２１に示す。
【０２８６】
【表２１】
２分毎にラマンスペクトルを回収して各反応についての動力学的研究を行った。図２４Ａ〜Ｅは、およそ５〜６分間隔で収集したスペクトルを示す。
【０２８７】
ＳＱＲ分析を、以下の波長範囲について収集したスペクトルに適用した： ２，０００〜２，５００ｃｍ−１；２，５００〜３，０００ｃｍ−１；３，０００〜３，５００ｃｍ−１；および３，５００〜４，０００ｃｍ−１。ＳＱＲスペクトル対ＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応時間のラマン動力学的プロットを図２５Ａ〜Ｄに示す。これらの結果は、動力学的速度情報を単一管のＯＰＤ−ペルオキシダーゼ反応から収集することができる（単一の反応管由来の反応の行程の間の複数のラマンスペクトルの収集）ことを示す。
【０２８８】
反応３０分後に得たＳＱＲ値を、ＳＱＲによって計算した推定反応速度と比較した。これにより、広範な波数にわたるこれらの値の間の良好な相関関係が明らかとなった。
【０２８９】
実施例１３：ホスファターゼ基質のラマン検出
リン酸置換基を有する異なる芳香族有機化合物とのアルカリホスファターゼの反応から得た生成物のラマンシグナルを研究するための実験を行った。酸化剤としてのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加および／または水酸化ナトリウムの添加の影響も研究した。以下の手順に従った。
（ａ）アルカリホスファターゼおよび酵素基質としてのリン酸含有芳香族化合物を含む混合物を調製する。
（ｂ）混合物をインキュベートしてラマン活性生成物を形成する。
【０２９０】
（ｉ）（任意選択的に）酸化剤としてのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加する。
【０２９１】
（ｉｉ）（任意選択的に）水酸化ナトリウムを添加する。
（ｃ）ラマン分光法を使用してラマン活性生成物を検出する。
【０２９２】
５３２ｎｍレーザーを備えたＳｗｏｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｒａｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＮＣ ＱＥ ６５０００ラマン検出器を使用して、０〜４０００ｃｍ−１の範囲のラマンスペクトルを収集した。試験した化合物は、ベンゾキノン、ピロガロール、１，４−ナフタキノン、および１，４−イミノナフタキノンであった。
【０２９３】
図２６Ａは、強ＮａＯＨ溶液（０．５Ｎ）の添加の関数としてのベンゾキノンのラマンスペクトルを示し、このスペクトルはＮａＯＨの添加によってラマンシグナルが増強される。この増強は、可逆的であることが見出され、酸の添加によってシグナルが減少し、ＮａＯＨの再添加によってシグナルが再度増加した。図２６Ｂは、ＮａＯＨ添加の関数としてのピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）のラマンスペクトルを示す。ピロガロールは、オルト（１，２）位でヒドロキシル化された芳香族（フェニル）構造を例示している。
【０２９４】
メタ過ヨウ素酸ナトリウム添加の影響も研究した。図２７Ａは、ＮａＯＨおよび過ヨウ素酸塩の両方の関数としての１，４−ナフタキノンのラマンスペクトルを示す。図２７Ｂは、同様に、１，４−イミノナフタキノンのラマンスペクトルを示す。これらのプロットは、かかる化合物が急速に自動酸化されてラマンシグナルを生じることを示す。１，４−ナフタキノン（図２７Ａ）は、ＮａＯＨの非存在下で過ヨウ素酸塩を使用するか使用しないで非常に高いシグナルを示す。ＮａＯＨの添加と共にスペクトルパターンが変化し、シグナルの減少が認められた。他方では、１，４−イミノナフタキノン（図２７Ｂ）は、ＮａＯＨの存在下で過ヨウ素酸塩を使用することなくラマンシグナルの増強が認められた。この化合物は、ＮａＯＨの存在下での過ヨウ素酸塩の使用によってシグナルの減少が認められ、これはおそらくこの化合物中のイミノ官能基のさらなる酸化に起因する。１，４−イミノキノンのラマンシグナルを、ＮａＯＨを使用しないで得ることができなかった（図２７Ｂ（ｄおよびｅ）。
【０２９５】
実施例１４：例示的なホスファターゼベースのラマン免疫アッセイ試薬および手順
以下に、ホスファターゼベースの免疫アッセイで使用することができる例示的な試薬および手順を記載する。
ラマン基質
・４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェート
・４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェート
・４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェート
・ヒドロキノンジホスフェート
酵素
・仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）
・ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ抱合体（ＫＰＬ）（タンパク質安定剤および防腐剤としてのアジ化ナトリウムを含む）
基質緩衝液
・０．２Ｍ ＴＲＩＳ（４−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）（５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８）を含む）
・１Ｍ ジエタノールアミン（０．５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）（ｐＨ９．８）
酵素保存緩衝液：１０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２、５０％グリセロール（ｐＨ８．２）。
コーティング緩衝液：５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）
ブロッキング緩衝液：２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．０５％ツウィーン２０（ｐＨ８．０）を含む５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）
アッセイ緩衝液：５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）（ｐＨ９．０）
洗浄緩衝液：５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水（０．０５％ツウィーン２０を含む）（ｐＨ８．０）
手順Ａ：４−アミノフェニルホスフェートの免疫アッセイを、以下のように調製する。
１．アルカリホスファターゼ（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液で希釈する。
２．５０μＬの希釈アルカリホスファターゼを取る。
３．１５０μＬの基質溶液（２００μｇ／ｍＬ）を添加する。
４．室温で１時間インキュベートする。
５．５０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
６．室温で３０分間インキュベートする。
７．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９６】
手順Ｂ：ヒドロキノンジホスフェート、４−ヒドロキシナフチルホスフェート、および４−アミノナフチルホスフェートの免疫アッセイを、以下のように調製する。
１．アルカリホスファターゼ（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）をアッセイ緩衝液で希釈する。
２．５０μＬの希釈アルカリホスファターゼを取る。
３．１５０μＬの基質溶液（１００〜２００μｇ／ｍＬ）を添加する。
４．室温で１時間インキュベートする。
５．５０μＬの０．５ｍｇ／ｍｌの新たに調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を水に添加する。
６．室温で３０分間インキュベートする。
７．５０μＬの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加する。
８．室温で３０分間インキュベートする。
９．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９７】
実施例１５：マイクロタイタープレート免疫アッセイ
一般的抗原「Ａ」のためのマイクロタイタープレート免疫アッセイの調製手順を、以下に記載する。
１．コーティング：一般的抗原Ａに特異的な１００μＬ／ｍＬ／ウェルの捕捉抗体を５〜１０μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２〜３時間インキュベートする。
２．ブロッキング：プレートを空にする。２００μＬのブロッキング緩衝液を添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを空にし、重ねた紙タオル上でプレートをブロットする。さらなる使用のためにプレートを４℃で保存するか、直ちに使用することができる。
３．洗浄：プレートを３００μＬの洗浄緩衝液／ウェルで５回洗浄する。最後の洗浄後に重ねた紙タオル上でプレートをブロットする。
４．サンプルの添加：ウェルあたり５０〜１００μＬの抗原Ａを含むサンプルを添加する（標準および試験すべきサンプル）。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。サンプルを、プレートへの添加前にアッセイ緩衝液で新たに希釈すべきである。
５．洗浄：工程（３）を繰り返す。
６．酵素抱合二次抗体の添加：抗原Ａに特異的なアルカリホスファターゼ抱合抗体をアッセイ緩衝液で約１μｇ／ｍＬに希釈する。各ウェルに１００μＬを添加する。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。
７．洗浄：工程（３）を繰り返し、各ウェルを７回洗浄する。
８．基質の添加：１５０μＬの基質溶液を各ウェルに添加する。プレート震盪器上にて室温で３０分間インキュベートする。
９．基質の酸化（任意選択的）：５０〜１００μＬの新たに調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム（０．５ｍｇ／ｍｌ水溶液）を添加する。プレート震盪器上にて室温で１時間インキュベートする。
１０．ラマン活性トリガーまたはエンハンサーの添加（任意選択的）：５０μｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムを各ウェルに添加する。プレート震盪器上にて室温で３０分間インキュベートする。
１１．ラマンスペクトルを記録する。
【０２９８】
実施例１６：酸化剤でのアルカリホスファターゼ抱合体の比色検出
アルカリホスファターゼを、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用した比色分析によって分析した。
【０２９９】
材料
・アルカリホスファターゼ抱合体：
−アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ ＩＮＣ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、精製抗体＝０．１０ｍｇ；酵素／抗体のモル比＝１．７：１
−１ｍＬの蒸留水に溶解する（１００μｇ／ｍＬ）。
−５０μＬアリコートにて−２０℃で凍結保存する。
・ＤＥＡ緩衝液（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１．０Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８））
・ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
試薬の調製
・ＤＥＡ緩衝液で濃度０．００１〜１００ｎｇ／ｍＬに調製したアルカリホスファターゼ抱合体希釈物。
・ＤＥＡ緩衝液で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍｌ）。
【０３００】
比色アッセイ手順
１．５０μＬのアルカリホスファターゼ抱合体をプラスチック製のマイクロキュベットに添加する。
２．２００μＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を読み取る。
【０３０１】
アルカリホスファターゼ抱合体に対する吸光度の線形従属性が低濃度で認められた（０〜１０ｎｇ／ｍＬ）。検出限度は、およそ０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０３０２】
実施例１７：酸化剤を使用したアルカリホスファターゼ抱合体のラマン検出
アルカリホスファターゼを、酸化剤（メタ過ヨウ素酸ナトリウム）と共に基質として４−アミノフェニルホスフェートを使用したラマン分光法で分析した。
【０３０３】
材料
・アルカリホスファターゼ抱合体（実施例１６を参照のこと）
・ＤＥＡ緩衝液
・メタ過ヨウ素酸ナトリウム
・４−アミノフェニルホスフェートナトリウム塩（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
試薬の調製
・実施例１５に従って調製したアルカリホスファターゼ抱合体希釈物
・水で調製したメタ過ヨウ素酸ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ）
・ＤＥＡ緩衝液で調製した４−アミノフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
ラマンアッセイ手順
１．５０μＬアルカリホスファターゼ抱合体をガラス製キュベットに添加する。
２．２００μＬの４−アミノフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．５０μＬのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加する。
６．ボルテックスミキサーで混合する。
７．室温で３０分間インキュベートする。
８．ラマンスペクトル（０〜４０００ｃｍ−１）を記録する。
【０３０４】
ラマンデータを表２２に示す。
【０３０５】
【表２２】
「ポジティブ」は、３３００ｃｍ−１で記録されたその平均ラマンシグナルが３３００ｃｍ−１で記録されたネガティブ平均シグナルを超えた（＋２ＳＤ）サンプルをいう。ＣＶ＝変動係数：ＳＤ＝標準偏差；Ｓ／Ｎ＝シグナル対ノイズ比。
【０３０６】
図２８Ａは、酸化剤を添加したアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図２８Ｂは直線プロットを示す。
【０３０７】
図２９Ａは、酸化剤を添加した０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ抱合体濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図２９Ｂは０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のものを示す。検出限度はおよそ０．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０３０８】
実施例１８：酸化剤を使用しないアルカリホスファターゼの比色検出
アルカリホスファターゼを、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用した比色分析によって分析した。
【０３０９】
材料
・アルカリホスファターゼ：
−仔ウシ腸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
濃度：１０，０００単位／ｍＬ
−保存緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２を含む５０％グリセロール（ｐＨ８．２））
−全２．０ｍＬ保存緩衝液中で保存した５００単位／５０μＬ
−−２０℃で凍結保存した１００μＬアリコート
−各アリコートの濃度：２５０Ｕ／ｍＬ
・ＤＥＡ緩衝液
・ｐ−ニトロフェニルホスフェート
試薬の調製
・ＤＥＡ緩衝液で濃度０．００２５〜２，５００ｍＵ／ｍＬに調製したアルカリホスファターゼ希釈物
・ＤＥＡ緩衝液で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（１ｍｇ／ｍＬ）
比色アッセイ
１．５０μＬのアルカリホスファターゼをプラスチック製のマイクロキュベットに添加する。
２．２００μＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．分光光度計で４０５ｎｍの吸光度を読み取る。
【０３１０】
アルカリホスファターゼに対する吸光度の線形従属性が低濃度で認められた（０〜２５ｍＵ／ｍＬ）。検出限度は、およそ０．１０ｍＵ／ｍＬであった。
【０３１１】
実施例１９：酸化剤を使用しないアルカリホスファターゼのラマン検出
アルカリホスファターゼを、酸化剤を使用しないで基質として４−アミノフェニルホスフェートを使用したラマン分光法で分析した。
【０３１２】
材料
・アルカリホスファターゼ（実施例１８を参照のこと）
・ＤＥＡ緩衝液
・メタ過ヨウ素酸ナトリウム
・４−アミノフェニルホスフェートナトリウム塩（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
試薬の調製
・実施例１８に従って調製したアルカリホスファターゼ希釈物
・ＤＥＡ緩衝液で調製した４−アミノフェニルホスフェート溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）
ラマンアッセイ手順
１．５０μＬアルカリホスファターゼをガラス製キュベットに添加する。
２．１５０μＬの４−アミノフェニルホスフェート溶液を添加する。
３．ボルテックスミキサーで混合する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．ラマンスペクトル（０〜４０００ｃｍ−１）を記録する。
【０３１３】
ラマンデータを表２３に示す。
【０３１４】
【表２３】
「ポジティブ」は、３３００ｃｍ−１で記録されたその平均ラマンシグナルが３３００ｃｍ−１で記録されたネガティブ平均シグナルを超えた（＋２ＳＤ）サンプルをいう。ＣＶ＝変動係数：ＳＤ＝標準偏差；Ｓ／Ｎ＝シグナル対ノイズ比。
【０３１５】
図３０Ａは、アルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートについて記録した３３００ｃｍ−１でのラマンスペクトル値の対数プロットであり、図３０Ｂは直線プロットを示す。図３１Ａは、０〜２５００ｍＵ／ｍＬの範囲のアルカリホスファターゼ濃度の関数としての４−アミノフェニルホスフェートのラマンスペクトルを示し、図３１Ｂは０〜２５ｍＵ／ｍＬの範囲のものを示す。検出限度はおよそ１ｍＵ／ｍＬであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出するための方法であって、
ａ）該サンプル、および少なくとも１つの芳香族化合物を含む混合物を調製する工程であって、該芳香族化合物は、少なくとも１つのリン酸基を含む、工程、
ｂ）該混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化５８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化５９】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６０】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６１】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６２】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの酵素がホスファターゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリホスファターゼが抗体に抱合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、ヒドロキノンジホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化剤がメタ過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラマン分光法が共鳴ラマン分光法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の少なくとも１つの標的を検出するための方法であって、
ａ）該少なくとも１つの標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）該混合物を該少なくとも１つの標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、該少なくとも１つのリガンドがホスファターゼを含む、工程、
ｃ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物に該混合物を与える工程、
ｄ）該混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して該少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項２に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項３に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項４に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項５に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項６に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ラマン分光法が共鳴ラマン分光法である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの標的が有機体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機体が、大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、ブドウ球菌、ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、およびヒト乳頭腫ウイルスから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、炭水化物、代謝産物、ホルモン、および代謝中間体から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が、ＩＬ−２、Ｃ反応性タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのリガンドが抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）任意選択的に酸化剤、
ｃ）任意選択的に塩基、および
ｄ）任意選択的に該少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含む、キット。
【請求項３０】
芳香族化合物であって、
【化６３】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、
芳香族化合物。
【請求項３１】
芳香族化合物であって、
【化６４】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、芳香族化合物。
【請求項３２】
芳香族化合物であって、
【化６５】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む、芳香族化合物。
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つの酵素の活性を検出するための方法であって、
ａ）該サンプル、および少なくとも１つの芳香族化合物を含む混合物を調製する工程であって、該芳香族化合物は、少なくとも１つのリン酸基を含む、工程、
ｂ）該混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、
ｃ）ラマン分光法を使用して少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化５８】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化５９】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６０】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６１】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、
【化６２】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの酵素がホスファターゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ホスファターゼがアルカリホスファターゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリホスファターゼが抗体に抱合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−アミノ−１−フェニル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−ヒドロキシ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が４−アミノ−１−ナフチル−１−ホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が、ヒドロキノンジホスフェートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基が水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化剤がメタ過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラマン分光法が共鳴ラマン分光法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中の少なくとも１つの標的を検出するための方法であって、
ａ）該少なくとも１つの標的を含む混合物を調製する工程、
ｂ）該混合物を該少なくとも１つの標的に特異的な少なくとも１つのリガンドとインキュベートする工程であって、該少なくとも１つのリガンドがホスファターゼを含む、工程、
ｃ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物に該混合物を与える工程、
ｄ）該混合物をインキュベートして少なくとも１つのラマン活性生成物を形成する工程であって、
ｉ）任意選択的に酸化剤を添加し、
ｉｉ）任意選択的に塩基を添加する、
工程、および
ｅ）ラマン分光法を使用して該少なくとも１つのラマン活性生成物を検出する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項２に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項３に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項４に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項５に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの芳香族化合物が請求項６に記載の芳香族化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ラマン分光法が共鳴ラマン分光法である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの標的が有機体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機体が、大腸菌、リステリア、サルモネラ、ビブリオ、Ｃａｍｐｈｅｌｂａｃｔｅｒ、ブドウ球菌、ＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、およびヒト乳頭腫ウイルスから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、炭水化物、代謝産物、ホルモン、および代謝中間体から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が、ＩＬ−２、Ｃ反応性タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ、およびヒト心筋トロポニンＩから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのリガンドが抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの酵素活性を検出するためのキットであって、
ａ）ホスフェートを含む少なくとも１つの芳香族化合物、
ｂ）任意選択的に酸化剤、
ｃ）任意選択的に塩基、および
ｄ）任意選択的に該少なくとも１つの酵素に適切なバッファ
を含む、キット。
【請求項３０】
芳香族化合物であって、
【化６３】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＯＨから選択され、
Ｚは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、
芳香族化合物。
【請求項３１】
芳香族化合物であって、
【化６４】
（式中、
Ｘは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４、およびＣＯＯＨから選択され、
Ｙは、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＳＯ３Ｈ、およびＣＯＯＨから選択される）を含む、芳香族化合物。
【請求項３２】
芳香族化合物であって、
【化６５】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＷのぞれぞれは、ＨおよびＯＨからそれぞれ独立して選択される）を含む、芳香族化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５１７８０７（Ｐ２０１２−５１７８０７Ａ）
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０１５３（Ｐ２０１１−５５０１５３）
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２８０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６２６０
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５１１１９６８６９）ソード ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２８０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９６２６０
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５１１１９６８６９）ソード ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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