マイクロＲＮＡ生成の検出方法と癌の診断・治療およびマイクロＲＮＡ生成調整剤
【解決課題】マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生成を正確に簡単に検出できる方法、及びマイクロＲＮＡ-１４３と１４５の増減に関係する疾患の診断・治療、さらに治療に有用なマイクロＲＮＡの生成を調整するマイクロＲＮＡ生成調整剤を提供する。
【解決手段】ルシフェラーゼ遺伝子の下流にマイクロRNA結合部位を作成したベクター及びそのベクターを導入した組み換え細胞を利用してマイクロRNAの生成を検出するマイクロRNAの検出方法とした。前記マイクロRNA結合部位にマイクロＲＮＡが結合するとルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制され、生成したマイクロＲＮＡ量に依存してルシフェラーゼ発現量が増減し、蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの量を測定することができる。
【解決手段】ルシフェラーゼ遺伝子の下流にマイクロRNA結合部位を作成したベクター及びそのベクターを導入した組み換え細胞を利用してマイクロRNAの生成を検出するマイクロRNAの検出方法とした。前記マイクロRNA結合部位にマイクロＲＮＡが結合するとルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制され、生成したマイクロＲＮＡ量に依存してルシフェラーゼ発現量が増減し、蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの量を測定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の検出方法、癌の診断・治療法及びマイクロＲＮＡの生成調整作用を有するマンゴスチンを含有するマイクロＲＮＡ生成調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
短鎖ＲＮＡが植物から動物細胞まで広く存在しており、それらが単なる転写されたＲＮＡの分解された短鎖ＲＮＡではなく、生体にとって重要な役割を果たしていることが分かってきた。特許文献１では、小核酸分子例えば、短干渉核酸（ｓｉＮＡ)、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ)、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるインターロイキンファミリー遺伝子発現の調節について開示されている。
【０００３】
特許文献２において、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳の際に介在配列特異的に翻訳を抑制し、発生タイミングを調節する。また、ｓｉＲＮＡが二本鎖であるのに対し、ｍｉＲＮＡは一本鎖であることが開示されている。さらに、特許文献２では、発生プロセス及び疾患、例えば癌のモジュレーター又はターゲットとして使用することが出来る。例えば、ｍｉＲＮＡ−１５及びｍｉＲＮＡ１６は、おそらく腫瘍−サプレッサーとして機能し、したがって、これらＲＮＡ又はその類似体又は前駆体の腫瘍細胞への導入は、特に白血病、例えばＢ−細胞慢性リンパ球性白血病に対して治療効果を提供できることが開示されている。
【０００４】
特許文献３は、γーマンゴスチンに優れたラジカル消去作用を有しており、抗酸化剤として有用であることが開示されている。
【０００５】
特許文献４は、αーマンゴスチン及びγーマンゴスチンを含有する抗アレルギー剤が開示されている。
【０００６】
特許文献５は、マンゴスチン果皮を含水有機溶媒で溶出後、有機溶媒を留去した析出物を０．００１〜７０重量％含有することを特徴とする抗菌消臭剤が開示されている。
【０００７】
上記のように、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がインターロイキンファミリー遺伝子発現の調節、腫瘍−サプレッサーとして機能するなど、マイクロＲＮＡが遺伝子発現制御に関わると共に、細胞の分化、増殖に関わる重要な機能性ＲＮＡ分子であり、マイクロＲＮＡの増減は重篤な疾患を引き起こすことが考えられる。マイクロＲＮＡは細胞の維持、増殖に重要な役割を持っていることから、マイクロＲＮＡの産生を調節する因子は幅広い治療薬として有用であると期待される。
【０００８】
一方、マンゴスチン果皮抽出物、あるいはそれより精製したα−マンゴスチン、γ−マンゴスチンには、上記のように様々な薬理作用を有することが知られている。しかし、マンゴスチンがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生成調整作用を有することについては未だ知られていない。
【特許文献１】特公表２００５−５２４３９３号公報「短干渉核酸（ｓｉＲ ＮＡ）を用いるインターロイキン遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害」
【特許文献２】特公表２００５−５０３８２７号公報「マイクロＲＮＡ分子」
【特許文献３】特開平０８−２２５７８３号公報「γ−マンゴスチンを有効 成分とする天然抗酸化剤」
【特許文献４】特開平１０−７２３５７号公報「抗アレルギー剤」
【特許文献５】特開２００３−２３１６０７号公報「マンゴスチン抽出物及 びその含有抗菌剤」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生成を正確に簡単に検出できる方法を提供する。また、マイクロＲＮＡ-１４３と１４５の増減に関係する疾患の診断・治療、さらに治療に有用なマイクロＲＮＡの生成を調整するマイクロＲＮＡ生成調整剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
マイクロＲＮＡを正確に簡単に検出する方法について鋭意研究を行った結果、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成したベクター及びそのベクターを導入した組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡの生成を検出するマイクロＲＮＡの検出方法を完成した。ルシフェラーゼ遺伝子の下流に導入したマイクロＲＮＡ結合部位に生成したマイクロＲＮＡが結合するとルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制される。生成したマイクロＲＮＡの量に依存してルシフェラーゼの発現量が増減することから、ルシフェラーゼによる蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの量を正確に、簡単に測定することができる
さらに、本発明は、ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を導入したことを特徴とする発現ベクターとそれを導入した組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４３）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法である。ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を導入することによって、生成したｍｉＲ−１４３の量を特異的に測定することができる。ここで、ｍｉＲ−１４３の配列はＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣＡであり公知の配列である。
【００１１】
さらに、本発明は、ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を作成した発現ベクターとそれを導入した遺伝子組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４５）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法である。ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を導入することによって、生成したｍｉＲ−１４５の量を特異的に測定することができる。
【００１２】
ここでｍｉＲ−１４５の配列はＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵであり公知の配列である。
【００１３】
さらに、本発明は、請求項１から３のいずれかに記載の方法によって、マイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を検出して、癌細胞と正常細胞を区別する癌の診断法を提供する。マイクロＲＮＡを検出することによって、癌細胞と正常細胞を区別できる。つまり、正常組織と比較し、大腸癌、造血器腫瘍、とりわけリンパ系腫瘍に特異的にｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられた。他の多くのがん細胞でもｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられることから、これらのマイクロＲＮＡは、癌細胞と正常細胞を区別するバイオマーカーとして有用であることが判明した。また、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下が癌の増殖と関連しているため、これらを癌細胞に導入することにより癌細胞の増殖を抑制することが考えられる。
【００１４】
さらに、請求項１から請求項３のいずれかに記載のマイクロＲＮＡ検出方法を用いて、ルシフェラーゼ発現の蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの生成量を測定して癌細胞に対してマイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を増加させる物質を探索することができる。
【００１５】
本発明はまた、マンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マンゴスチンがマイクロＲＮＡの生成を調整することを見出した。マイクロＲＮＡが遺伝子発現制御に関わると共に、細胞の分化、増殖に関わる重要な機能性ＲＮＡ分子であり、マイクロＲＮＡの増減は重篤な疾患を引き起こすことが考えられる。生体の維持、増殖に重要な役割を持っていることから、マイクロＲＮＡの産生を調整するマンゴスチンはマイクロＲＮＡ調整剤として、異常細胞を正常化、又はアポトーシス（細胞壊死）に導く細胞改善剤、リンホカイン代謝調節剤等、細胞増殖に関わる幅広い治療薬として期待される。
【００１６】
さらに、マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４３であることを特徴とする請求項４に記載のマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１４３産生を調整するマンゴスチンはｍｉＲ−１４３の生成量に関連する幅広い治療薬として期待される。
【００１７】
さらに、マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４５であることを特徴とする請求項４に記載のマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１４５産生を調整するマンゴスチンはｍｉＲ−１４５の生成量に関連する幅広い治療薬として期待される。
【００１８】
本発明はまた、薬学的に有効量のマンゴスチンを薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む、保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は、医薬の技術分野においてよく知られており、例えば、保存剤、安定剤、着色剤、滑沢剤、および風味剤を用いることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。
【００１９】
薬学的に有効な用量とは、疾患状態の予防、発症の阻害、または治療（症状をある程度緩和し、好ましくはすべての症状を緩和する。）に必要な容量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、用いる組成物、投与の経路、治療する哺乳動物の種類、考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性、同時に投与される薬剤、および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【００２０】
本発明のマンゴスチンおよびその処方は、慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体、アジュバントおよびベヒクルを含む容量単位処方中で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入またはスプレーにより、または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合、非経口的との用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入の手法等が含まれる。さらに、本発明のマンゴスチンおよび薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方が提供される。１またはそれ以上の本発明のマンゴスチンは、１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤、および／またはアジュバント、および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明のマンゴスチンを含有する医薬組成物は、経口使用に適した形、例えば、錠剤、トローチ剤、菱形剤、水性または油性懸濁液、分散可能な粉体または顆粒、乳剤、硬カプセルまたは軟カプセル、またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
【００２１】
経口で使用することが意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために、１またはそれ以上のそのような甘味剤、芳香剤、着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムあるいはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、既知の手法により被覆してもよい。場合によっては、既知の手法によりそのような被覆を調製して、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば、遅延用材料、例えばグリセリンモノステアレートまたはグリセリンジステアレートを用いることができる。
【００２２】
経口使用のための処方は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、または活性成分が水または油状媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってよい。
【発明の効果】
【００２３】
ルシフェラーゼの下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成した発現ベクターとそれを導入した遺伝子組み換え細胞を利用することによって、ルシフェラーゼの反応生成物を蛍光法により測定して、マイクロＲＮＡの生成量を簡単に検出することができる。
【００２４】
造血器腫瘍の中でリンパ系の腫瘍（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、T細胞白血病）の診断マーカーとして使用できる。とりわけ慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は有力な診断マーカーになる。リンパ系の腫瘍ではｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の前駆体を導入することで細胞増殖を抑えることができる。つまり、遺伝子治療の可能性が示唆される。
【００２５】
マンゴスチンを含有する製剤を投与することによって、マイクロＲＮＡの生成を調整してマイクロＲＮＡが関与する疾病を治療することができる。また、その他の治療剤と併用することによって、併用した薬剤の治療効果を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を実施するための方法について例を上げて述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
遺伝子組み換え細胞の調製（ルシフェラーゼ遺伝子、及びマイクロＲＮＡ結合部位の導入）
遺伝子組み換え細胞の調製は、図１に示すように、pGL3ルシフェラーゼ発現ベクターはプロメガ社（code NO. E1741）から購入し、このルシフェラーゼ遺伝子の３‘側に合成したｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の結合部位をカイネースとアニーリングにより２本鎖にし、その後、ライゲーションにより導入した。次いで、ベクターを通常の方法にしたがって、大腸菌にトランスフェクションし、大量培養して、ベクターを調製した。
【００２８】
上記のように調製したルシフェラーゼ発現ベクターを用いることによって、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度が増加するとルシフェラーゼ遺伝子の下流に導入された３‘側のマイクロＲＮＡの結合部位にこれらのｍｉＲＮＡが結合してルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制される。このルシフェラーゼ遺伝子の翻訳の抑制は、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度に依存する。したがって、ルシフェラーゼの反応によって発生する蛍光強度を検出することによって、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度を検出することができる。
【実施例２】
【００２９】
マイクロＲＮＡの検出
細胞からフェノール／グアニヂン チオシアネイト法により、全ＲＮＡを抽出した。次いで、MirVana（商標）qRT-PCR miRNA検出キット（Ambion社製）とmirVana（商標）qRT-PCRプライマー セット（Ambion社製）を用いて、はじめにDNAを９５℃で３分間変性後、PCR法（９５℃、１５秒、６０℃、３０秒、２２サイクル）によりそれらの発現レベルを調べた。すなわち、抽出したＲＮＡ５０ｍｇを逆転写酵素によりcDNAに変換し、ｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５のプライマー（Ambion社より購入）を使用してＰＣＲ法によりそれらの発現レベルを調べた。
【００３０】
ヒト癌細胞は２mML-グルタミン、１０％の熱不活性化FBS（Sigma,St.
Louis,Mo,USA）を含むRPMI-1640培地中で、９５％空気と５％炭酸ガスの雰囲気下、３７度で培養した。生存細胞数の測定は、トリパンブルー染色法により行った。
【００３１】
図２は大腸癌患者の腫瘍部及び同患者の正常組織についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。この結果、腫瘍部においてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５のいずれもが、大腸癌で特異的に発現が低下していた （６例中５例）。
【００３２】
図３はヒトのすべての正常組織とそれぞれ組織由来の癌細胞株についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。正常組織は十分発現していたが（上段）、癌細胞株ではすべての細胞株でｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現が低下していた（下段）。U6は内部標準として用いた。この結果より、大腸癌のみならず他の多くのがん細胞にもｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられ、マイクロＲＮＡの検出は、癌細胞と正常細胞を区別できるバイオマーカーとして有用であることが判明した。
【００３３】
図４は、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の前駆microRNAをｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の低下している大腸癌細胞株DLD-1, SW480に導入した。この結果、細胞増殖抑制がマイクロＲＮＡの濃度依存的にみられ、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５は癌細胞の増殖抑制に機能していることが示唆された。
【実施例３】
【００３４】
種々の白血病患者におけるｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現を検討した。
白血病は以下に分類される、骨髄系（急性骨髄性白血病、 骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患）、リンパ系の腫瘍（急性リンパ性白血病、急性T細胞性白血病、成人T細胞性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫）である。患者からインフォームドコンセントをとり、初診時および再発時（悪性細胞が大部分）について末梢血、骨髄、リンパ節からサンプリングし、qRT-PCR法にて検討した。その結果、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄに示すように、リンパ系の腫瘍に有意に低下傾向を示した。中でも図５ｃに示す慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は全症例で低下を認めた。コントロールとして健常人の末梢リンパ球、扁桃、骨髄を用いた。
【実施例４】
【００３５】
（１） α−マンゴスチンの調製
マンゴスチン果皮の乾燥物６０ｋｇに対して水６００Ｌを加えて、９０℃以上、好ましくは９５℃〜１００℃で攪拌ししながら１時間洗浄を行った。加熱洗浄工程で、マンゴスチン果皮に含まれる赤色物質、粘性物質、吸湿性物質等の不純物質が多量に溶出されて、以後の抽出工程で純度の高いマンゴスチン結晶を含有する組成物を得ることが出来る。
【００３６】
加熱洗浄したマンゴスチン果皮を濾過して、その残渣に５０％（ｖ／ｖ）エタノールを６００Ｌ加えて、８０℃〜８５℃で１時間攪拌しながら抽出して、抽出液を濾過した。
【００３７】
濾液を常温にまで徐々に温度を下げた後、常温で１夜放置して、粗マンゴスチン結晶を析出させた。粗マンゴスチン結晶の析出した液を濾過して粗マンゴスチン結晶を分離した。分離した粗マンゴスチン結晶を５０％Ｖ／Ｖエタノール１０Ｌで洗浄後、６０℃で真空乾燥して、粗マンゴスチン結晶粉末を２．４ｋｇを得た。
【００３８】
粗マンゴスチン結晶２．４ｋｇに対してエタノール２４Ｌを加えて、常温で１時間攪拌して溶解した。この溶解液を常温で攪拌しながら水３６Ｌに滴下し、その後８０℃〜８５℃で１時間攪拌した。この液を常温まで徐々に冷却し、常温で１夜攪拌してマンゴスチン結晶を析出させ濾過後、得られたマンゴスチン結晶を５０％Ｖ／Ｖエタノールで洗浄した後、真空乾燥してマンゴスチン結晶を含有するマンゴスチン含有組成物を得た。
（２）マンゴスチンの定量法
上記方法により得られたマンゴスチン含有組成物の定量は、マンゴスチン含有組成物２０ｍｇを正確に計り、エタノールを加えて正確に１００ｍｌに溶解して試料とした。別にα−マンゴスチン標準品２０ｍｇを量り取り、エタノールを加えて正確に１００ｍｌに溶解して、標準溶液ー１とした。別にγーマンゴスチン標準品１０ｍｇを正確に計り取り、エタノールを加えて正確に５０ｍｌに溶解した。この液５ｍｌを正確に計り、エタノールを加えて正確に５０ｍｌとして、これを標準溶液ー２とした。
【００３９】
上記各試料の分析は高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。使用したカラムはDevelosil ODS-5(φ４．６×２５０ｍｍ、野村化学製)を用いて、移動相にアセトニトリル／０．０５Mリン酸水溶液（７：３）を用い、流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで、４０℃で展開し、波長３６５ｎｍで測定を行った。高速液体クロマトグラフィーでマンゴスチン含有組成物を分析した結果、上記の精製方法で得られたマンゴスチン含有組成物はα−マンゴスチンが８２．１％、γーマンゴスチンが９．０％の割合で含まれていた。上記方法で分離精製したマンゴスチン（キサントン）誘導体の化学構造を図５に示す。
【００４０】
本発明で使用されるマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤のマンゴスチンは、α−マンゴスチン又はγ−マンゴスチンのいずれかの単独でもよいが、分離することに手間と時間が掛かるので、α−マンゴスチンとγ−マンゴスチンの混合物であってもよく、いずれか一方に限定されるものではない。
【実施例５】
【００４１】
マンゴスチンのマイクロＲＮＡ調整作用
マンゴスチンをヒト大腸癌細胞株DLD-1に対して処理すると細胞増殖が抑制され、マンゴスチンの用量依存的にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現量が上昇することが判明した。
【００４２】
図６は大腸癌細胞株DLD-1を20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。この結果、時間と共にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現が上昇することが認められた。
【００４３】
図７は、大腸癌細胞株DLD-1に、図１で示したルシフェラーゼ発現ベクターにpGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorを導入した後、0から20 mM のa-マンゴスチンで処理した結果を示す。この結果、 a-マンゴスチンの濃度に依存してルシフェラーゼ活性が低下（相対蛍光強度の低下）することが判明した。すなわち、マンゴスチンの濃度に依存して、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度が増加して、ルシフェラーゼ遺伝子の下流の３‘側の結合部位にｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５が結合してルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制されたことを示している。この結果から、マンゴスチンのルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する効果は、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度を上昇させることによって抑制していることが明らかとなった。
【実施例６】
【００４４】
マンゴスチンを含むマイクロＲＮＡ調整剤の調製
実施例４で示したように、マンゴスチンが用量依存的にマイクロＲＮＡ含量を調整することができることが判明した。実施例４で得られたマンゴスチン含有組成物の経口投与用製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、経口用液体製剤等が例示できる。マイクロＲＮＡ調整剤としてのマンゴスチンの投与量は１日当たり全投与量２〜２０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇである。
以下に示す割合でマンゴスチン含有組成物を配合して、マンゴスチンを含む錠剤を調製した。
（製剤例１）マンゴスチン含有組成物１３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース２６０ｇを加えて、３９０ｍｇ当たり１３０ｍｇのマンゴスチンを含有する散剤を製造した。
（製剤例２）マンゴスチン含有組成物１３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース６５ｇ、D-マンニトール３０５ｇを加えて、５００ｍｇ当たり１３０ｍｇのマンゴスチンを含有する顆粒剤を製造した。
【００４５】
マンゴスチンを含むマイクロＲＮＡ調整剤に加えるマンゴスチン含有組成物の量は、対象疾患の治療にマイクロＲＮＡを望ましい量だけ増加させるために、併用する薬剤、適用する対象疾患、疾病の重傷度等、投与する患者に対応できるようにマンゴスチン含有組成物の含有量や投与量を適宜変更させて、マイクロＲＮＡの生成量を加減できるマイクロＲＮＡ調整剤を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ルシフェラーゼ発現ベクターにｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５の結合部位を導入し、pGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorをの構造の図式を示す。
【図２】図２は大腸癌患者の腫瘍部及び同患者の正常組織についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。すべての腫瘍部においていずれの発現も正常組織に比べ低下していた。
【図３】図３はヒトのすべての正常組織とそれぞれ組織由来の癌細胞株についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。正常組織は十分発現していたが（上段）ヒト癌細胞株ではすべての細胞株で共に発現の低下がみられた（下段）。U6は内部標準。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の前駆microRNAをｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の低下している大腸癌細胞株DLD-1, SW480に導入した。その結果、細胞増殖抑制が濃度依存的にみられた。
【図５ａ】図５ａは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び骨髄増殖成疾患の患者から得られた細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、患者から得られた急性リンパ性白血病細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、患者から得られた急性リンパ性白血病及びＢリンパ腫細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｄ】図５ｄは、患者から得られた成人Ｔ細胞白血病細胞及びＴ細胞急性リンパ性白血病細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。図５ａ〜図５ｄにおいて、リンパ系腫瘍に発現低下の傾向がみられた。とくに慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は全症例で低下を認めた。コントロールとして健常人の末梢リンパ球、扁桃、骨髄を用いた。
【図６】図6は、マンゴスチンから分離精製したマンゴスチン（キサントン）誘導体の化学構造を示す。
【図７】図7は大腸癌細胞株DLD-1を20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。時間と共にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現が増加している。
【図８】図8は、大腸癌細胞株DLD-1にルシフェラーゼ発現ベクターpGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorを導入した後、0から20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。マンゴスチンの濃度依存的にｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５が増加し、ルシフェラーゼの活性が減少していることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の検出方法、癌の診断・治療法及びマイクロＲＮＡの生成調整作用を有するマンゴスチンを含有するマイクロＲＮＡ生成調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
短鎖ＲＮＡが植物から動物細胞まで広く存在しており、それらが単なる転写されたＲＮＡの分解された短鎖ＲＮＡではなく、生体にとって重要な役割を果たしていることが分かってきた。特許文献１では、小核酸分子例えば、短干渉核酸（ｓｉＮＡ)、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ)、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるインターロイキンファミリー遺伝子発現の調節について開示されている。
【０００３】
特許文献２において、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳の際に介在配列特異的に翻訳を抑制し、発生タイミングを調節する。また、ｓｉＲＮＡが二本鎖であるのに対し、ｍｉＲＮＡは一本鎖であることが開示されている。さらに、特許文献２では、発生プロセス及び疾患、例えば癌のモジュレーター又はターゲットとして使用することが出来る。例えば、ｍｉＲＮＡ−１５及びｍｉＲＮＡ１６は、おそらく腫瘍−サプレッサーとして機能し、したがって、これらＲＮＡ又はその類似体又は前駆体の腫瘍細胞への導入は、特に白血病、例えばＢ−細胞慢性リンパ球性白血病に対して治療効果を提供できることが開示されている。
【０００４】
特許文献３は、γーマンゴスチンに優れたラジカル消去作用を有しており、抗酸化剤として有用であることが開示されている。
【０００５】
特許文献４は、αーマンゴスチン及びγーマンゴスチンを含有する抗アレルギー剤が開示されている。
【０００６】
特許文献５は、マンゴスチン果皮を含水有機溶媒で溶出後、有機溶媒を留去した析出物を０．００１〜７０重量％含有することを特徴とする抗菌消臭剤が開示されている。
【０００７】
上記のように、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がインターロイキンファミリー遺伝子発現の調節、腫瘍−サプレッサーとして機能するなど、マイクロＲＮＡが遺伝子発現制御に関わると共に、細胞の分化、増殖に関わる重要な機能性ＲＮＡ分子であり、マイクロＲＮＡの増減は重篤な疾患を引き起こすことが考えられる。マイクロＲＮＡは細胞の維持、増殖に重要な役割を持っていることから、マイクロＲＮＡの産生を調節する因子は幅広い治療薬として有用であると期待される。
【０００８】
一方、マンゴスチン果皮抽出物、あるいはそれより精製したα−マンゴスチン、γ−マンゴスチンには、上記のように様々な薬理作用を有することが知られている。しかし、マンゴスチンがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生成調整作用を有することについては未だ知られていない。
【特許文献１】特公表２００５−５２４３９３号公報「短干渉核酸（ｓｉＲ ＮＡ）を用いるインターロイキン遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害」
【特許文献２】特公表２００５−５０３８２７号公報「マイクロＲＮＡ分子」
【特許文献３】特開平０８−２２５７８３号公報「γ−マンゴスチンを有効 成分とする天然抗酸化剤」
【特許文献４】特開平１０−７２３５７号公報「抗アレルギー剤」
【特許文献５】特開２００３−２３１６０７号公報「マンゴスチン抽出物及 びその含有抗菌剤」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生成を正確に簡単に検出できる方法を提供する。また、マイクロＲＮＡ-１４３と１４５の増減に関係する疾患の診断・治療、さらに治療に有用なマイクロＲＮＡの生成を調整するマイクロＲＮＡ生成調整剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
マイクロＲＮＡを正確に簡単に検出する方法について鋭意研究を行った結果、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成したベクター及びそのベクターを導入した組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡの生成を検出するマイクロＲＮＡの検出方法を完成した。ルシフェラーゼ遺伝子の下流に導入したマイクロＲＮＡ結合部位に生成したマイクロＲＮＡが結合するとルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制される。生成したマイクロＲＮＡの量に依存してルシフェラーゼの発現量が増減することから、ルシフェラーゼによる蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの量を正確に、簡単に測定することができる
さらに、本発明は、ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を導入したことを特徴とする発現ベクターとそれを導入した組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４３）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法である。ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を導入することによって、生成したｍｉＲ−１４３の量を特異的に測定することができる。ここで、ｍｉＲ−１４３の配列はＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣＡであり公知の配列である。
【００１１】
さらに、本発明は、ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を作成した発現ベクターとそれを導入した遺伝子組み換え細胞を利用してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４５）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法である。ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を導入することによって、生成したｍｉＲ−１４５の量を特異的に測定することができる。
【００１２】
ここでｍｉＲ−１４５の配列はＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵであり公知の配列である。
【００１３】
さらに、本発明は、請求項１から３のいずれかに記載の方法によって、マイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を検出して、癌細胞と正常細胞を区別する癌の診断法を提供する。マイクロＲＮＡを検出することによって、癌細胞と正常細胞を区別できる。つまり、正常組織と比較し、大腸癌、造血器腫瘍、とりわけリンパ系腫瘍に特異的にｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられた。他の多くのがん細胞でもｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられることから、これらのマイクロＲＮＡは、癌細胞と正常細胞を区別するバイオマーカーとして有用であることが判明した。また、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下が癌の増殖と関連しているため、これらを癌細胞に導入することにより癌細胞の増殖を抑制することが考えられる。
【００１４】
さらに、請求項１から請求項３のいずれかに記載のマイクロＲＮＡ検出方法を用いて、ルシフェラーゼ発現の蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの生成量を測定して癌細胞に対してマイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を増加させる物質を探索することができる。
【００１５】
本発明はまた、マンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マンゴスチンがマイクロＲＮＡの生成を調整することを見出した。マイクロＲＮＡが遺伝子発現制御に関わると共に、細胞の分化、増殖に関わる重要な機能性ＲＮＡ分子であり、マイクロＲＮＡの増減は重篤な疾患を引き起こすことが考えられる。生体の維持、増殖に重要な役割を持っていることから、マイクロＲＮＡの産生を調整するマンゴスチンはマイクロＲＮＡ調整剤として、異常細胞を正常化、又はアポトーシス（細胞壊死）に導く細胞改善剤、リンホカイン代謝調節剤等、細胞増殖に関わる幅広い治療薬として期待される。
【００１６】
さらに、マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４３であることを特徴とする請求項４に記載のマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１４３産生を調整するマンゴスチンはｍｉＲ−１４３の生成量に関連する幅広い治療薬として期待される。
【００１７】
さらに、マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４５であることを特徴とする請求項４に記載のマイクロＲＮＡ生成調整剤である。マイクロＲＮＡのｍｉＲ−１４５産生を調整するマンゴスチンはｍｉＲ−１４５の生成量に関連する幅広い治療薬として期待される。
【００１８】
本発明はまた、薬学的に有効量のマンゴスチンを薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む、保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は、医薬の技術分野においてよく知られており、例えば、保存剤、安定剤、着色剤、滑沢剤、および風味剤を用いることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。
【００１９】
薬学的に有効な用量とは、疾患状態の予防、発症の阻害、または治療（症状をある程度緩和し、好ましくはすべての症状を緩和する。）に必要な容量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、用いる組成物、投与の経路、治療する哺乳動物の種類、考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性、同時に投与される薬剤、および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【００２０】
本発明のマンゴスチンおよびその処方は、慣用的な無毒性の薬学的に許容しうる担体、アジュバントおよびベヒクルを含む容量単位処方中で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入またはスプレーにより、または直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合、非経口的との用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入の手法等が含まれる。さらに、本発明のマンゴスチンおよび薬学的に許容しうる担体を含む医薬処方が提供される。１またはそれ以上の本発明のマンゴスチンは、１またはそれ以上の無毒性の薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤、および／またはアジュバント、および所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明のマンゴスチンを含有する医薬組成物は、経口使用に適した形、例えば、錠剤、トローチ剤、菱形剤、水性または油性懸濁液、分散可能な粉体または顆粒、乳剤、硬カプセルまたは軟カプセル、またはシロップまたはエリキシル剤の形であることができる。
【００２１】
経口で使用することが意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために、１またはそれ以上のそのような甘味剤、芳香剤、着色剤または保存剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムあるいはリン酸ナトリウム；顆粒化剤および崩壊剤、例えばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、既知の手法により被覆してもよい。場合によっては、既知の手法によりそのような被覆を調製して、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば、遅延用材料、例えばグリセリンモノステアレートまたはグリセリンジステアレートを用いることができる。
【００２２】
経口使用のための処方は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、または活性成分が水または油状媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってよい。
【発明の効果】
【００２３】
ルシフェラーゼの下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成した発現ベクターとそれを導入した遺伝子組み換え細胞を利用することによって、ルシフェラーゼの反応生成物を蛍光法により測定して、マイクロＲＮＡの生成量を簡単に検出することができる。
【００２４】
造血器腫瘍の中でリンパ系の腫瘍（急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、T細胞白血病）の診断マーカーとして使用できる。とりわけ慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は有力な診断マーカーになる。リンパ系の腫瘍ではｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の前駆体を導入することで細胞増殖を抑えることができる。つまり、遺伝子治療の可能性が示唆される。
【００２５】
マンゴスチンを含有する製剤を投与することによって、マイクロＲＮＡの生成を調整してマイクロＲＮＡが関与する疾病を治療することができる。また、その他の治療剤と併用することによって、併用した薬剤の治療効果を増大させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を実施するための方法について例を上げて述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
遺伝子組み換え細胞の調製（ルシフェラーゼ遺伝子、及びマイクロＲＮＡ結合部位の導入）
遺伝子組み換え細胞の調製は、図１に示すように、pGL3ルシフェラーゼ発現ベクターはプロメガ社（code NO. E1741）から購入し、このルシフェラーゼ遺伝子の３‘側に合成したｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の結合部位をカイネースとアニーリングにより２本鎖にし、その後、ライゲーションにより導入した。次いで、ベクターを通常の方法にしたがって、大腸菌にトランスフェクションし、大量培養して、ベクターを調製した。
【００２８】
上記のように調製したルシフェラーゼ発現ベクターを用いることによって、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度が増加するとルシフェラーゼ遺伝子の下流に導入された３‘側のマイクロＲＮＡの結合部位にこれらのｍｉＲＮＡが結合してルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制される。このルシフェラーゼ遺伝子の翻訳の抑制は、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度に依存する。したがって、ルシフェラーゼの反応によって発生する蛍光強度を検出することによって、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度を検出することができる。
【実施例２】
【００２９】
マイクロＲＮＡの検出
細胞からフェノール／グアニヂン チオシアネイト法により、全ＲＮＡを抽出した。次いで、MirVana（商標）qRT-PCR miRNA検出キット（Ambion社製）とmirVana（商標）qRT-PCRプライマー セット（Ambion社製）を用いて、はじめにDNAを９５℃で３分間変性後、PCR法（９５℃、１５秒、６０℃、３０秒、２２サイクル）によりそれらの発現レベルを調べた。すなわち、抽出したＲＮＡ５０ｍｇを逆転写酵素によりcDNAに変換し、ｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５のプライマー（Ambion社より購入）を使用してＰＣＲ法によりそれらの発現レベルを調べた。
【００３０】
ヒト癌細胞は２mML-グルタミン、１０％の熱不活性化FBS（Sigma,St.
Louis,Mo,USA）を含むRPMI-1640培地中で、９５％空気と５％炭酸ガスの雰囲気下、３７度で培養した。生存細胞数の測定は、トリパンブルー染色法により行った。
【００３１】
図２は大腸癌患者の腫瘍部及び同患者の正常組織についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。この結果、腫瘍部においてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５のいずれもが、大腸癌で特異的に発現が低下していた （６例中５例）。
【００３２】
図３はヒトのすべての正常組織とそれぞれ組織由来の癌細胞株についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。正常組織は十分発現していたが（上段）、癌細胞株ではすべての細胞株でｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現が低下していた（下段）。U6は内部標準として用いた。この結果より、大腸癌のみならず他の多くのがん細胞にもｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現の低下がみられ、マイクロＲＮＡの検出は、癌細胞と正常細胞を区別できるバイオマーカーとして有用であることが判明した。
【００３３】
図４は、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の前駆microRNAをｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の低下している大腸癌細胞株DLD-1, SW480に導入した。この結果、細胞増殖抑制がマイクロＲＮＡの濃度依存的にみられ、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５は癌細胞の増殖抑制に機能していることが示唆された。
【実施例３】
【００３４】
種々の白血病患者におけるｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５の発現を検討した。
白血病は以下に分類される、骨髄系（急性骨髄性白血病、 骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患）、リンパ系の腫瘍（急性リンパ性白血病、急性T細胞性白血病、成人T細胞性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫）である。患者からインフォームドコンセントをとり、初診時および再発時（悪性細胞が大部分）について末梢血、骨髄、リンパ節からサンプリングし、qRT-PCR法にて検討した。その結果、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄに示すように、リンパ系の腫瘍に有意に低下傾向を示した。中でも図５ｃに示す慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は全症例で低下を認めた。コントロールとして健常人の末梢リンパ球、扁桃、骨髄を用いた。
【実施例４】
【００３５】
（１） α−マンゴスチンの調製
マンゴスチン果皮の乾燥物６０ｋｇに対して水６００Ｌを加えて、９０℃以上、好ましくは９５℃〜１００℃で攪拌ししながら１時間洗浄を行った。加熱洗浄工程で、マンゴスチン果皮に含まれる赤色物質、粘性物質、吸湿性物質等の不純物質が多量に溶出されて、以後の抽出工程で純度の高いマンゴスチン結晶を含有する組成物を得ることが出来る。
【００３６】
加熱洗浄したマンゴスチン果皮を濾過して、その残渣に５０％（ｖ／ｖ）エタノールを６００Ｌ加えて、８０℃〜８５℃で１時間攪拌しながら抽出して、抽出液を濾過した。
【００３７】
濾液を常温にまで徐々に温度を下げた後、常温で１夜放置して、粗マンゴスチン結晶を析出させた。粗マンゴスチン結晶の析出した液を濾過して粗マンゴスチン結晶を分離した。分離した粗マンゴスチン結晶を５０％Ｖ／Ｖエタノール１０Ｌで洗浄後、６０℃で真空乾燥して、粗マンゴスチン結晶粉末を２．４ｋｇを得た。
【００３８】
粗マンゴスチン結晶２．４ｋｇに対してエタノール２４Ｌを加えて、常温で１時間攪拌して溶解した。この溶解液を常温で攪拌しながら水３６Ｌに滴下し、その後８０℃〜８５℃で１時間攪拌した。この液を常温まで徐々に冷却し、常温で１夜攪拌してマンゴスチン結晶を析出させ濾過後、得られたマンゴスチン結晶を５０％Ｖ／Ｖエタノールで洗浄した後、真空乾燥してマンゴスチン結晶を含有するマンゴスチン含有組成物を得た。
（２）マンゴスチンの定量法
上記方法により得られたマンゴスチン含有組成物の定量は、マンゴスチン含有組成物２０ｍｇを正確に計り、エタノールを加えて正確に１００ｍｌに溶解して試料とした。別にα−マンゴスチン標準品２０ｍｇを量り取り、エタノールを加えて正確に１００ｍｌに溶解して、標準溶液ー１とした。別にγーマンゴスチン標準品１０ｍｇを正確に計り取り、エタノールを加えて正確に５０ｍｌに溶解した。この液５ｍｌを正確に計り、エタノールを加えて正確に５０ｍｌとして、これを標準溶液ー２とした。
【００３９】
上記各試料の分析は高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。使用したカラムはDevelosil ODS-5(φ４．６×２５０ｍｍ、野村化学製)を用いて、移動相にアセトニトリル／０．０５Mリン酸水溶液（７：３）を用い、流量１．０ｍｌ／ｍｉｎで、４０℃で展開し、波長３６５ｎｍで測定を行った。高速液体クロマトグラフィーでマンゴスチン含有組成物を分析した結果、上記の精製方法で得られたマンゴスチン含有組成物はα−マンゴスチンが８２．１％、γーマンゴスチンが９．０％の割合で含まれていた。上記方法で分離精製したマンゴスチン（キサントン）誘導体の化学構造を図５に示す。
【００４０】
本発明で使用されるマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤のマンゴスチンは、α−マンゴスチン又はγ−マンゴスチンのいずれかの単独でもよいが、分離することに手間と時間が掛かるので、α−マンゴスチンとγ−マンゴスチンの混合物であってもよく、いずれか一方に限定されるものではない。
【実施例５】
【００４１】
マンゴスチンのマイクロＲＮＡ調整作用
マンゴスチンをヒト大腸癌細胞株DLD-1に対して処理すると細胞増殖が抑制され、マンゴスチンの用量依存的にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現量が上昇することが判明した。
【００４２】
図６は大腸癌細胞株DLD-1を20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。この結果、時間と共にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現が上昇することが認められた。
【００４３】
図７は、大腸癌細胞株DLD-1に、図１で示したルシフェラーゼ発現ベクターにpGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorを導入した後、0から20 mM のa-マンゴスチンで処理した結果を示す。この結果、 a-マンゴスチンの濃度に依存してルシフェラーゼ活性が低下（相対蛍光強度の低下）することが判明した。すなわち、マンゴスチンの濃度に依存して、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度が増加して、ルシフェラーゼ遺伝子の下流の３‘側の結合部位にｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５が結合してルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が抑制されたことを示している。この結果から、マンゴスチンのルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する効果は、ｍｉＲ−１４３又はｍｉＲ−１４５の細胞内濃度を上昇させることによって抑制していることが明らかとなった。
【実施例６】
【００４４】
マンゴスチンを含むマイクロＲＮＡ調整剤の調製
実施例４で示したように、マンゴスチンが用量依存的にマイクロＲＮＡ含量を調整することができることが判明した。実施例４で得られたマンゴスチン含有組成物の経口投与用製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、経口用液体製剤等が例示できる。マイクロＲＮＡ調整剤としてのマンゴスチンの投与量は１日当たり全投与量２〜２０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇである。
以下に示す割合でマンゴスチン含有組成物を配合して、マンゴスチンを含む錠剤を調製した。
（製剤例１）マンゴスチン含有組成物１３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース２６０ｇを加えて、３９０ｍｇ当たり１３０ｍｇのマンゴスチンを含有する散剤を製造した。
（製剤例２）マンゴスチン含有組成物１３０ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース６５ｇ、D-マンニトール３０５ｇを加えて、５００ｍｇ当たり１３０ｍｇのマンゴスチンを含有する顆粒剤を製造した。
【００４５】
マンゴスチンを含むマイクロＲＮＡ調整剤に加えるマンゴスチン含有組成物の量は、対象疾患の治療にマイクロＲＮＡを望ましい量だけ増加させるために、併用する薬剤、適用する対象疾患、疾病の重傷度等、投与する患者に対応できるようにマンゴスチン含有組成物の含有量や投与量を適宜変更させて、マイクロＲＮＡの生成量を加減できるマイクロＲＮＡ調整剤を調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ルシフェラーゼ発現ベクターにｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５の結合部位を導入し、pGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorをの構造の図式を示す。
【図２】図２は大腸癌患者の腫瘍部及び同患者の正常組織についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。すべての腫瘍部においていずれの発現も正常組織に比べ低下していた。
【図３】図３はヒトのすべての正常組織とそれぞれ組織由来の癌細胞株についてｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。正常組織は十分発現していたが（上段）ヒト癌細胞株ではすべての細胞株で共に発現の低下がみられた（下段）。U6は内部標準。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の前駆microRNAをｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の低下している大腸癌細胞株DLD-1, SW480に導入した。その結果、細胞増殖抑制が濃度依存的にみられた。
【図５ａ】図５ａは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び骨髄増殖成疾患の患者から得られた細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、患者から得られた急性リンパ性白血病細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、患者から得られた急性リンパ性白血病及びＢリンパ腫細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。
【図５ｄ】図５ｄは、患者から得られた成人Ｔ細胞白血病細胞及びＴ細胞急性リンパ性白血病細胞におけるｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現を調べた結果を示す。図５ａ〜図５ｄにおいて、リンパ系腫瘍に発現低下の傾向がみられた。とくに慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫は全症例で低下を認めた。コントロールとして健常人の末梢リンパ球、扁桃、骨髄を用いた。
【図６】図6は、マンゴスチンから分離精製したマンゴスチン（キサントン）誘導体の化学構造を示す。
【図７】図7は大腸癌細胞株DLD-1を20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。時間と共にｍｉＲ−１４３とｍｉＲ−１４５の発現が増加している。
【図８】図8は、大腸癌細胞株DLD-1にルシフェラーゼ発現ベクターpGL3-miR-143 sensorまたはpGL3-miR-145 sensorを導入した後、0から20 mM a-マンゴスチンで処理した結果を示す。マンゴスチンの濃度依存的にｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５が増加し、ルシフェラーゼの活性が減少していることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼの下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成した発現ベクターおよびそのベクターを導入した組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡの生成を検出するマイクロＲＮＡ検出方法。
【請求項２】
ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を作成した発現ベクターを導入したことを特徴とする遺伝子組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４３）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を作成した発現ベクターを導入したことを特徴とする遺伝子組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４５）の産生を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法によって、マイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を検出して、癌細胞と正常細胞を区別する癌の診断法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のルシフェラーゼ発現の蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの生成量を測定して癌細胞に対してマイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を増加させる物質を探索方法。
【請求項６】
マンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【請求項７】
マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４３であることを特徴とする請求項６に記載のマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【請求項８】
マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４５であることを特徴とする請求項６に記載のマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【請求項１】
ルシフェラーゼの下流にマイクロＲＮＡ結合部位を作成した発現ベクターおよびそのベクターを導入した組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡの生成を検出するマイクロＲＮＡ検出方法。
【請求項２】
ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４３結合部位を作成した発現ベクターを導入したことを特徴とする遺伝子組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４３）の生成を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
ルシフェラーゼの下流にｍｉＲ−１４５結合部位を作成した発現ベクターを導入したことを特徴とする遺伝子組み換え細胞を利用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４５）の産生を検出する請求項１に記載のマイクロＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法によって、マイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を検出して、癌細胞と正常細胞を区別する癌の診断法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のルシフェラーゼ発現の蛍光強度を測定することにより、マイクロＲＮＡの生成量を測定して癌細胞に対してマイクロＲＮＡ―１４３又は１４５を増加させる物質を探索方法。
【請求項６】
マンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【請求項７】
マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４３であることを特徴とする請求項６に記載のマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【請求項８】
マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４５であることを特徴とする請求項６に記載のマンゴスチンを含有することを特徴とするマイクロＲＮＡ生成調整剤。
【図１】
【図４】
【図６】
【図８】
【図２】
【図３】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図７】
【図４】
【図６】
【図８】
【図２】
【図３】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図７】
【公開番号】特開２００８−８６２０１（Ｐ２００８−８６２０１Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６６９１８（Ｐ２００６−２６６９１８）
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月２８日 日本癌学会発行の「第６５回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２９日（２００６．９．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月２８日 日本癌学会発行の「第６５回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（５９７１１２４７２）財団法人岐阜県研究開発財団 (25)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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