【課題】心臓及び骨格筋におけるマイクロＲＮＡの関与について詳述する。
【解決手段】 本発明は、速骨格筋収縮タンパク質遺伝子を抑制する２種のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの特定に関する。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現を使用して、筋骨格系障害の治療において速筋線維遺伝子を抑制し、遅筋線維遺伝子を活性化することができる。ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害は、心臓肥大、心筋梗塞、及び／又は心不全の治療として提示される。ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂ機能の拮抗薬及び作動薬を含む医薬品組成物も開示される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を有する対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の心臓細胞でｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程と
を含む、その必要がある対象の、病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞を治療する方法。
【請求項２】
阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を前記対象に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、非経口投与又は直接注射によって心臓組織に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
非経口投与が静脈内又は皮下投与である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、経口、経皮、持続放出、制御放出、遅延放出、坐薬、カテーテル、又は舌下投与によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の発現又は活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第２の心臓肥大治療薬を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の治療薬が、β遮断薬、イオノトロープ、利尿薬、ＡＣＥ−Ｉ、ＡＩＩ拮抗薬、ＢＮＰ、Ｃａ^＋＋遮断薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の治療薬が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬と同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の治療薬が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の前又は後に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
病的な心臓肥大、心不全、又は心筋梗塞の１つ又は複数の症状が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の投与の後に対象内で改善される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ又は複数の症状が、高い運動能力、高い心臓駆出容積、低い左心室拡張末期圧、低い肺毛細血管楔入圧、高い心拍出量、高い心係数、低い肺動脈圧、低い左心室収縮末期及び拡張末期径、低い左心室及び右心室壁応力、低い壁張力、高い生活の質、低い疾患関連罹患率又は死亡率、又はこれらの組合せである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬の投与が、対象での心臓肥大から心不全への移行を遅延させる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）病的な心臓肥大又は心不全を発症する危険性がある対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程と
を含む、その必要がある対象で病的な肥大又は心不全を予防する方法。
【請求項２０】
阻害する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を心臓細胞に送達する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
危険性のある対象が、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、及び病的な肥大からなる群から選択された１つ又は複数の危険因子を示す可能性がある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
危険性のある対象が、心臓肥大に対する遺伝的素因を有すると診断された、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
危険性のある対象が、心臓肥大の家族歴を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、機能性ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂを発現することができない哺乳類。
【請求項３０】
マウスである、請求項２９に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３１】
トランスジェニック非ヒト哺乳類であって、その細胞が、前記非ヒト哺乳類の細胞で活性な異種プロモーターの制御下にあるＭｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂコード領域を含む哺乳類。
【請求項３２】
マウスである、請求項３１に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項３１に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３４】
組織特異的プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項３３に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３５】
組織特異的プロモーターが心筋特異的プロモーターである、請求項３３に記載のトランスジェニック哺乳類。
【請求項３６】
天然のｍｉＲ−４９９対立遺伝子の一方又は両方、及び／又は天然のｍｉＲ−２０８ｂ対立遺伝子の一方又は両方を欠くトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞。
【請求項３７】
前記天然のｍｉＲ−４９９対立遺伝子の両方、及び／又は前記天然のｍｉＲ−２０８ｂ対立遺伝子の両方を欠く、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象の心臓肥大及び拡張型心筋症を予防する方法。
【請求項３９】
対象の心臓細胞でのｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を阻害する工程を含む、その必要がある対象での心臓肥大の進行を阻害する方法。
【請求項４０】
（ａ）筋骨格系障害の危険性を有し、あるいは危険性がある対象を特定する工程と、
（ｂ）前記対象の骨格筋細胞でのｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程と
を含む、その必要がある対象の筋骨格系障害を治療又は予防する方法。
【請求項４１】
前記筋骨格障害が、筋萎縮症、抗重力に応答した筋肉疲労、及び除神経からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程が、成熟ｍｉＲ−４９９又は成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドを前記対象に投与する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドが配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現及び／又は活性を増大させる工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂをコードする発現ベクターを前記対象に投与する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ウイルス発現ベクターがアデノウイルス発現ベクターである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
発現ベクターが非ウイルス発現ベクターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
非ウイルス発現ベクターが脂質ビヒクル内に含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ポリヌクレオチドが脂質ビヒクル内に含まれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の発現及び／又は活性を、前記対象の骨格筋細胞で増大させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記骨格筋細胞の１つ又は複数の速骨格筋遺伝子の発現を、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの発現又は活性を増大させた後に低下させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ又は複数の速骨格筋遺伝子が、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、速骨格ミオシン軽鎖、及びα骨格アクチンからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
非ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ治療薬を対象に投与する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターを特定するための方法であって、
（ａ）細胞を候補物質に接触させる工程と、
（ｂ）ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の活性又は発現を、候補物質の不在下での活性又は発現と比較する工程と
を含み、測定した活性又は発現の間の差から、前記候補物質がｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターであることが示される方法。
【請求項５５】
細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補物質に接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで候補物質に接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターが、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの作動薬である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂのモジュレーターが、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの拮抗薬である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
候補物質が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は小分子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現を評価する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの発現を評価する工程が、ノーザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性又は発現を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程が、ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂによって調節された遺伝子の発現又は活性を評価する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ｍｉＲ−４９９によって調節された遺伝子が、β−ミオシン重鎖又は速骨格筋タンパク質遺伝子である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ｍｉＲ−２０８ｂによって調節された遺伝子が、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲβ、ＴＨＲＡＰ１、又は速骨格筋タンパク質遺伝子である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
速骨格筋タンパク質遺伝子が、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、速骨格筋ミオシン軽鎖、又はα骨格アクチンである、請求項６４又は請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの活性を評価する工程が、α−ミオシン重鎖発現レベルとβ−ミオシン重鎖発現レベルとの比を評価する工程を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
ｍｉＲ−４９９及び／又はｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む医薬品組成物。
【請求項６９】
前記阻害薬が、アンタゴｍｉｒ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は阻害性ＲＮＡ分子である、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７０】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列に相補的な配列を含む、請求項６９に記載の医薬品組成物。
【請求項７１】
アンタゴｍｉｒ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号２６又は配列番号２７に相補的な配列を含む、請求項７０に記載の医薬品組成物。
【請求項７２】
阻害性ＲＮＡ分子が二本鎖領域を含み、前記二本鎖領域が、成熟ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に同一な配列を含む、請求項６９に記載の医薬品組成物。
【請求項７３】
二本鎖領域が、配列番号２６又は配列番号２７と実質的に同一な配列を含む、請求項７２に記載の医薬品組成物。
【請求項７４】
ｍｉＲ−４９９の阻害薬及びｍｉＲ−２０８ｂの阻害薬を含む、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７５】
注射用に配合される、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７６】
非経口投与用のキットと組み合わせた、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７７】
非経口投与が静脈内又は皮下投与である、請求項７６に記載の医薬品組成物。
【請求項７８】
カテーテル投与用のキットと組み合わせた、請求項６８に記載の医薬品組成物。
【請求項７９】
ｍｉＲ−４９９又はｍｉＲ−２０８ｂの成熟配列を含有するポリヌクレオチドを含む、医薬品組成物。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクター内に含有される、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２６又は配列番号２７の配列を含む、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８２】
前記ポリヌクレオチドが脂質送達ビヒクルに含まれる、請求項７９に記載の医薬品組成物。
【請求項８３】
ｍｉＲ−４９９及びｍｉＲ−２０８ｂの両方の成熟配列を含有するポリヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の医薬品組成物。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【公表番号】特表２０１０−５３５２４６（Ｐ２０１０−５３５２４６Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０２０５（Ｐ２０１０−５２０２０５）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８４９２
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（５０１１００５８２）ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティー　オブ　テキサス　システム (19)
【Ｆターム（参考）】