メラニン合成阻害剤
【課題】安全で、安定供給の可能なメラニン合成阻害剤を提供し、飲食品、健康食品においては、固形分の析出を防止し、安定性、安全性、安定供給および嗜好性に優れた製品を提供し、化粧品、医薬部外品または医薬品においては、安定性、安全性および安定供給に優れた製品を提供する。
【解決手段】麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を有効成分とするものとしている。
【解決手段】麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を有効成分とするものとしている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン合成阻害剤、およびメラニン合成阻害作用を有する飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまで大麦若葉の青汁に抗炎症作用、抗酸化作用、抗潰瘍作用、免疫賦活作用、脂肪抑制作用などを有する各種の生理機能物質が含まれていることを報告してきた。
【０００３】
そこで、今回、麦類植物の搾汁またはその乾燥粉末の美容における機能を検討するため、メラノーマ培養細胞のメラニン合成に及ぼす影響を調べた。
【０００４】
メラニンは、メラニン細胞によって合成され、細胞のＤＮＡ損傷を防御する働きをもつが、紫外線、ストレス、化学刺激等で過剰に合成されたメラニンは、シミやソバカスの原因となるため、その合成や分解、移動を制御する薬剤の探索が行われている。
【０００５】
メラニンは、アミノ酸の一種チロシンが、チロシナーゼにより酸化されＤＯＰＡおよびＤＯＰＡキノンに変化した後、さらに重合反応を経て生成される。真性メラニン(eumelanin）と亜メラニン(pheomelanin）の２種類が存在する。
【０００６】
メラニン合成阻害作用に関する従来技術について概観する。メラニンは、植物、動物および原生動物において産生される色素であり、チロシンの誘導体である。チロシンはチロシナーゼの作用によりドーパ（ＤＯＰＡ) に変換し、さらにチロシナーゼによりＤＯＰＡはドーパキノンに変換される。ドーパキノンは化学反応性に富み、非酵素反応によりドーパクローム、インドールキノンに変化し、酸化、重合して黒褐色のユーメラニンと赤褐色のフェオメラニンに変換する。
【０００７】
脊椎動物において、メラニンは、皮膚の基底層に存在するメラノサイトの中で合成され、メラノソームに貯蔵された色素細胞を形成し、皮膚のケラチノサイトや毛髪の毛母細胞に移動して色調を与える。
【０００８】
皮膚において、メラニンは、メラノサイトに対する紫外線、ストレス等による刺激により生成し、皮膚の紫外線からの防御に寄与するが、過剰の照射によりソバカス、シミ等のメラニン色素の沈着、さらに皮膚の老化にまで及んでくる。
【０００９】
従って、メラニンの過剰産生を抑制することは、皮膚の紫外線に起因する障害の回避に必要であり、メラニン生成抑制に関与する物質に関する多くの文献が開示されている。
【００１０】
この観点から、メラニン色素の沈着を抑制し、皮膚の老化を抑制する物質の探索が行われてきた。
【００１１】
特許文献１は、香料として使用できる化合物である5-メチル-2(3H)- フラノン, 2-ブテン-4- オリド, 2-ヒドロキシメチルフラン, 2-ホルミルフラン, メチルα- フリルケトン, フルフリルアセテート, 2-ヒドロキシ-3- メチル-2- シクロペンテン-1- オン, 2-ヒドロキシ-3,5- ジメチル-2- シクロペンテン-1- オン, テトロン酸あるいは2,3-ペンタジオンの少なくとも１つを含有するメラニン生成抑制剤によるマッシュルームチロシナーゼ活性の阻害活性に基づくメラニン合成の阻害効果を開示している。
【００１２】
特許文献２は、ヒドロキシシトロネラール、ペプチンカルボン酸メチル、メチルナフチルケトン、ローズフェノン、酢酸イソボルニルによるヒト表皮メラニン細胞の産生するチロシナーゼ活性の阻害について開示している。
【００１３】
特許文献３は、好気性のグラム陰性桿菌であるRuegeria NB6450 株(FERM P-19168)の培養上清によるチロシナーゼ阻害およびヒトメラニン産生細胞によるメラニン生成の抑制効果について開示している。
【００１４】
特許文献４は、イソクエルトシトリンおよびハイペリンの混合物または個別標品によるマウスB16 メラノーマ細胞によるメラニン合成の阻害作用を開示している。
【００１５】
特許文献５は、ササユリの葉の水溶性抽出物とL-アスコルビン酸またはその誘導体を含有する美白化粧料による露光に起因する紅斑に対する有効性を開示している。
【００１６】
特許文献６は、β- イオノンを除くイオノン類、サリチル酸エステル類、ジャスモン酸誘導体によるB16 メラノーマ細胞のメラニン産生の抑制効果を開示している。
【００１７】
特許文献７は、麦類若葉の搾汁液およびその乾燥粉末の製造方法を開示している。麦類の緑葉を洗浄し、必要により細切し、ブランチング処理を行った後、機械的に破砕し、破砕物から繊維分を主体とする粗固形分を除去し、次いで得られる搾汁液にアルカリ性水溶液を添加して搾汁液のpHを6-9 に調節した後、噴霧乾燥または凍結乾燥することにより、麦類緑葉粉末を製造する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０００−３０２６４２号公報
【特許文献２】特開２００５−８９４１６号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４８０８号公報
【特許文献４】特開２００８−２０８０７３号公報
【特許文献５】特開２００８−２１４２３６号公報
【特許文献６】特開２００８−２１４３５４号公報
【特許文献７】特公昭４６−３８５４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、安全で、安定供給の可能なメラニン産生抑制物質を提供することにある。
【００２０】
本発明において解決しようとする課題は、飲食品、健康食品においては固形分の析出を防止し、安定性、安全性、安定供給および嗜好性に優れた製品の提供、化粧品、医薬部外品または医薬品においては安定性、安全性および安定供給に優れた製品の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、安全で、しかも安定な供給の可能なメラニン産生抑制物質の探索を行い、麦類植物の葉茎の搾汁液に、メラニン産生抑制作用の存在することを見い出し、本発明を完成した。
【００２２】
さらに、本発明の具備すべき条件を検討した結果、メラニン合成阻害作用は前記搾汁液またはその乾燥粉末（噴霧乾燥物または凍結乾燥物）の水可溶性画分に局在し、その活性は１００℃、１０分間の加熱に対して減弱することなく保持されることを見い出し、本発明を完成した。
【００２３】
かくして、本発明は、麦類植物の搾汁液またはその乾燥粉末の水可溶性画分を提供するものである。
【００２４】
本発明のメラニン合成阻害剤は、水可溶性成分であることから、クロロフィルを含まず、クロロフィルに起因するフェオホルバイドの混在は極めて低いという特性を有する。しかし、製品の形態によれば、麦類植物の搾汁液を噴霧乾燥または凍結乾燥して得られる乾燥粉末をメラニン合成阻害物質として配合することもできる。
【００２５】
本発明においては、前記乾燥粉末の水抽出液はメラノーマＢ１６細胞のメラニン合成阻害作用を有することを明らかにし、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のメラニン合成阻害剤は、安全で、安定供給の可能なものとなり、飲食品、健康食品においては、固形分の析出を防止し、安定性、安全性、安定供給および嗜好性に優れた製品を提供することができ、化粧品、医薬部外品または医薬品においては、安定性、安全性および安定供給に優れた製品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示す図である。
【図２】加熱BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示す図である。
【図３】マウスメラノーマ細胞株B16 の増殖によるBLE の効果を示す図である。
【図４】チロシナーゼ活性に対するBLE の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明について、これを実施するための形態をさらに詳細に説明する。
【００２９】
本発明において原料として用いられる麦類植物は、緑色の葉または茎（以下、葉茎という) を有する麦類植物体である。
【００３０】
本発明は、麦類植物のうち、例えば、大麦、小麦、裸麦、エン麦、ハト麦、トウモロコシ、キビ、イタリアンダイグラス等のうちでも、大麦および裸麦の成熟期前の葉茎が好適である。これら麦類植物はできるだけ新鮮なうちに処理することが望ましい。麦類植物は充分洗浄し、適宜水を加えた後、搾汁する。搾汁は既知の方法に従い、ミキサー、ジューサー等の機械的な破砕工程を遠心分離や濾過等の固−液分離工程と組み合わせることにより容易に行うことができる。
【００３１】
このようにして得られる麦類植物の搾汁液またはそのｐＨを６．５〜８．５に調節した搾汁液を噴霧乾燥または凍結乾燥して乾燥粉末を得ることができる。噴霧乾燥は、通常、吹込み温度１２０〜２００℃、好ましくは１４０〜１８０℃の熱風を用いて行うことができる。凍結乾燥においては、乾燥板の温度４０〜５０℃、真空度１３５〜１. ３Ｐａ程度の条件が通常採用される。
【００３２】
また、乾燥に供する搾汁液の濃度は１．５〜３０ｗ／ｗ％程度の範囲内で、可及的高濃度側が好ましい。搾汁液の濃縮には、連続薄膜濃縮装置、真空濃縮装置を利用することができる。さらに、上記の操作に際して、所望に応じて空気を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換したり、酸素吸収剤を封入したり、低温に保ったり、遮光等の手段を単独もしくは組み合わせて、乾燥工程に供するまでの搾汁液の移送、貯蔵等における変色、変質を防止することもできる。
【００３３】
このようにして得られる麦類植物の搾汁液の乾燥粉末は、必要に応じて水に懸濁して攪拌することにより、水抽出し、得られた抽出液から水不溶性成分を除去する。前記乾燥粉末の水抽出における乾燥粉末に対する水の使用量は、通常、乾燥粉末１Ｋｇあたり水を２〜５０リットル、特に５〜２０リットルの割合が適当である。本発明における上記水抽出は、その目的により、温度範囲としては０〜１００℃が採用される。
【００３４】
以上の水抽出により、前記乾燥粉末に含まれる水不溶性成分は除去される。得られた水可溶性成分を含む水抽出液は、必要に応じ、減圧濃縮、熱処理による除タンパクを行った後、濃縮して製品に配合することもでき、さらに、噴霧乾燥、凍結乾燥等により乾燥することもできる。
【００３５】
すなわち、本発明のメラニン合成阻害剤は、前記乾燥粉末の水可溶性成分であり、麦類の緑色部を特に必要とせず、１００℃、１０分間の熱処理に対しても安定であるためｐＨ調整を行わない処理工程が適用され、さらに水可溶性画分の加熱によるタンパク質除去工程を組み込み、精製することもできる。
【００３６】
本発明により提供される水可溶性抽出物は、飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品の分野において有利に使用することができる。
【００３７】
本発明の水可溶性抽出物は、そのまま或いは濃縮して飲食用に用いることもできるが、必要に応じて、シクロデキストリン、クラウンエーテル等による包接を行うこともできる。また、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色剤、香料、食品添加物、調味料等と混合し、使用の形態に応じて、粉末、顆粒、ペレット、錠剤、油状等の形態に成形することもできる。
【００３８】
本発明の麦類植物の搾汁液または水可溶性抽出物は、必要に応じて、イオン交換樹脂、イオン交換膜等により陰イオンおよび／または陽イオンを部分的に除去して、製品の味覚の改善、品質の安定性、安全性を図ることもできる。
【００３９】
本発明の水可溶性抽出物は、通常の飲食品または濃縮して、果糖、ブドウ糖、可食性植物または生薬抽出物、ビタミン類、アミノ酸類、有機酸、香料等を加えた濃縮飲料または野菜、果物を原料とするジュースの製造に用いることもできる。さらに、水可溶性抽出物またはその濃縮物、乾燥粉末を、麦類植物の加工品、野菜加工品、海藻加工食品、肉類加工食品、スープ類、菓子類、パン類、麺類等に配合することができる。
【実施例】
【００４０】
実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４１】
（細胞培養）
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団「ヒューマンサイエンス研究資源バンク」) を、気相のＣＯ2 を5v/v% に調節し、温度を37℃設定したインキュベーター中で、10% ウシ胎児血清(FBS)(MP Biomedicals, Inc)、PEN./ STREP. 100X 10mLを添加した MEM培地(SIGMA-ALDRICH社))培地で3 〜4 日毎に継代培養を行い維持した。
【００４２】
（麦類植物抽出物の調製方法）
草丈20〜30cmに生育した六条裸大麦（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook）の若葉を搾汁し、その搾汁液を噴霧乾燥して麦類植物抽出物の乾燥粉末を得た。
【００４３】
この乾燥粉末 5g にイオン交換水50mLを加え60分間撹拌抽出し、超遠心機（日立 himac CR21)により遠心分離(10,000rpm,15 分間,4℃) を行った後、得られた上清を濾紙濾過する。その濾液をメンブレンフィルター0.45μm (Sartorius社) さらに0.22μm フィルター(Sartorius社) に通し、麦類植物抽出物の水可溶性画分（以下、BLE という）として実験に用いた。
【００４４】
麦類植物抽出物の水可溶性画分BLE のメラニン合成阻害活性に対する熱安定性実験においては、BLE を0.45μm フィルターにより濾過した後、得られたBLE を沸騰水浴中で10分間加熱し、超遠心機（日立 himac CR21)により遠心分離(10,000rpm,15 分間,4℃) を行った後、得られた上清を濾紙濾過し、さらに0.22μm フィルターにより濾過した標品を加熱BLE として実験に用いた。
【００４５】
（メラニン合成阻害試験）
マウスメラノーマ細胞株B16 をプレート(6 well, 96 well)(Nunc社) に2 ×106cells/2mL/well の濃度で播種し、10%ウシ胎児血清(FBS)(MP Biomedicals, Inc)、2mMテオフィリン、BLE 1,2.5,5,10% または加熱 BLE 5,10%を含むMEM 培地(SIGMA-ALDORICH 社) で37℃、5%CO2 の条件において CO2インキュベーター（三洋電機バイオメディカ社 CO2INCUBATOR MCO-96) で３日間培養した後、 0.25%トリプシンと 0.02%EDTAの等量混合液 1.5mL/ well添加し、37℃、5%CO2 のCO2 インキュベーター内で10分間インキュベートして 0.25%トリプシン/ 0.02%EDTA 混合液と剥がれた細胞をそれぞれ1.5mL エッペンドルフチューブへ回収し、遠心分離機（TOMY KOGYO CO.LTD CAPSULE HF-120 )により１分間遠心分離した。
【００４６】
各プレートにPBS(pH 7.2 )1.5mL / wellを注加し、PBS(pH 7.2 )と未回収の細胞混合液1.5mL をエッペンドルフチューブへ回収し、CAPSULE HF-120で１分間遠心分離した。上清を除き、回収された細胞を合併して 0.1% TritonX-100 含有1N NaOH 1.0mL を添加して溶解した。
【００４７】
これを試料溶液とし、メラニン量を415nm の吸光度を分光光度計（日立 U-3000 Spectrophotometer)で測定した。
【００４８】
図１は、BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示し、BLE は、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生を濃度依存的に阻害することを示している。
【００４９】
図２は、加熱BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示し、加熱BLE は、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生を、BLE と同程度に阻害することを示している。
【００５０】
（細胞毒性の測定）
マウスメラノーマ細胞株B16 を96穴プレートに 1×105 cells/100 μL/wellの濃度で播種し、10% ウシ胎児血清、2mM テオフィリン、 BLE 1,2.5,5,10%、加熱BLE 5,10% を含むMEM 培地で37℃、5%CO2 で３日間培養した後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社) 10μL / wellを添加し、1,2,3 および4 時間後の450nm(参照波長630nm)における吸光度をマイクロプレートリーダー(CORONA ELECTRIC社 CORONA MTP-120)で測定し、BLE の細胞毒性に起因する細胞増殖についての検討を行った。
【００５１】
図３(a) 〜(d) に示すように、麦類植物抽出物の水可溶性画分に含まれる、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制物質は、マウスメラノーマ細胞株B16 に対して細胞毒性を示さなかった。本実験においては、BLE によるメラニン合成抑制は、細胞増殖抑制を介したものではないことを示唆するものである。
【００５２】
（チロシナーゼ活性阻害試験）
試験管にpH6.8, 0.2M リン酸緩衝液 680μL 、L-DOPA 0.4mg / mL 水溶液 500μL 、BLE 水溶液（最終濃度1, 2.5, 5, 10%)720μL を注加して37℃で５分間保持後、チロシナーゼ(SIGMA-ALDRICH社, マッシュルーム由来, 5370units/mg) 水溶液 100μL(300units / mL)を添加し、37℃で５分間反応させ、475nm における吸光度を分光光度計（日立 U-3000)で測定した。
【００５３】
図４に示すように、BLE のチロシナーゼ活性に対する阻害効果は小であり、本発明のメラニン合成阻害画分は、チロシナーゼ活性の阻害以外のメラニン合成阻害を有するものと推察される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン合成阻害剤、およびメラニン合成阻害作用を有する飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまで大麦若葉の青汁に抗炎症作用、抗酸化作用、抗潰瘍作用、免疫賦活作用、脂肪抑制作用などを有する各種の生理機能物質が含まれていることを報告してきた。
【０００３】
そこで、今回、麦類植物の搾汁またはその乾燥粉末の美容における機能を検討するため、メラノーマ培養細胞のメラニン合成に及ぼす影響を調べた。
【０００４】
メラニンは、メラニン細胞によって合成され、細胞のＤＮＡ損傷を防御する働きをもつが、紫外線、ストレス、化学刺激等で過剰に合成されたメラニンは、シミやソバカスの原因となるため、その合成や分解、移動を制御する薬剤の探索が行われている。
【０００５】
メラニンは、アミノ酸の一種チロシンが、チロシナーゼにより酸化されＤＯＰＡおよびＤＯＰＡキノンに変化した後、さらに重合反応を経て生成される。真性メラニン(eumelanin）と亜メラニン(pheomelanin）の２種類が存在する。
【０００６】
メラニン合成阻害作用に関する従来技術について概観する。メラニンは、植物、動物および原生動物において産生される色素であり、チロシンの誘導体である。チロシンはチロシナーゼの作用によりドーパ（ＤＯＰＡ) に変換し、さらにチロシナーゼによりＤＯＰＡはドーパキノンに変換される。ドーパキノンは化学反応性に富み、非酵素反応によりドーパクローム、インドールキノンに変化し、酸化、重合して黒褐色のユーメラニンと赤褐色のフェオメラニンに変換する。
【０００７】
脊椎動物において、メラニンは、皮膚の基底層に存在するメラノサイトの中で合成され、メラノソームに貯蔵された色素細胞を形成し、皮膚のケラチノサイトや毛髪の毛母細胞に移動して色調を与える。
【０００８】
皮膚において、メラニンは、メラノサイトに対する紫外線、ストレス等による刺激により生成し、皮膚の紫外線からの防御に寄与するが、過剰の照射によりソバカス、シミ等のメラニン色素の沈着、さらに皮膚の老化にまで及んでくる。
【０００９】
従って、メラニンの過剰産生を抑制することは、皮膚の紫外線に起因する障害の回避に必要であり、メラニン生成抑制に関与する物質に関する多くの文献が開示されている。
【００１０】
この観点から、メラニン色素の沈着を抑制し、皮膚の老化を抑制する物質の探索が行われてきた。
【００１１】
特許文献１は、香料として使用できる化合物である5-メチル-2(3H)- フラノン, 2-ブテン-4- オリド, 2-ヒドロキシメチルフラン, 2-ホルミルフラン, メチルα- フリルケトン, フルフリルアセテート, 2-ヒドロキシ-3- メチル-2- シクロペンテン-1- オン, 2-ヒドロキシ-3,5- ジメチル-2- シクロペンテン-1- オン, テトロン酸あるいは2,3-ペンタジオンの少なくとも１つを含有するメラニン生成抑制剤によるマッシュルームチロシナーゼ活性の阻害活性に基づくメラニン合成の阻害効果を開示している。
【００１２】
特許文献２は、ヒドロキシシトロネラール、ペプチンカルボン酸メチル、メチルナフチルケトン、ローズフェノン、酢酸イソボルニルによるヒト表皮メラニン細胞の産生するチロシナーゼ活性の阻害について開示している。
【００１３】
特許文献３は、好気性のグラム陰性桿菌であるRuegeria NB6450 株(FERM P-19168)の培養上清によるチロシナーゼ阻害およびヒトメラニン産生細胞によるメラニン生成の抑制効果について開示している。
【００１４】
特許文献４は、イソクエルトシトリンおよびハイペリンの混合物または個別標品によるマウスB16 メラノーマ細胞によるメラニン合成の阻害作用を開示している。
【００１５】
特許文献５は、ササユリの葉の水溶性抽出物とL-アスコルビン酸またはその誘導体を含有する美白化粧料による露光に起因する紅斑に対する有効性を開示している。
【００１６】
特許文献６は、β- イオノンを除くイオノン類、サリチル酸エステル類、ジャスモン酸誘導体によるB16 メラノーマ細胞のメラニン産生の抑制効果を開示している。
【００１７】
特許文献７は、麦類若葉の搾汁液およびその乾燥粉末の製造方法を開示している。麦類の緑葉を洗浄し、必要により細切し、ブランチング処理を行った後、機械的に破砕し、破砕物から繊維分を主体とする粗固形分を除去し、次いで得られる搾汁液にアルカリ性水溶液を添加して搾汁液のpHを6-9 に調節した後、噴霧乾燥または凍結乾燥することにより、麦類緑葉粉末を製造する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０００−３０２６４２号公報
【特許文献２】特開２００５−８９４１６号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４８０８号公報
【特許文献４】特開２００８−２０８０７３号公報
【特許文献５】特開２００８−２１４２３６号公報
【特許文献６】特開２００８−２１４３５４号公報
【特許文献７】特公昭４６−３８５４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、安全で、安定供給の可能なメラニン産生抑制物質を提供することにある。
【００２０】
本発明において解決しようとする課題は、飲食品、健康食品においては固形分の析出を防止し、安定性、安全性、安定供給および嗜好性に優れた製品の提供、化粧品、医薬部外品または医薬品においては安定性、安全性および安定供給に優れた製品の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、安全で、しかも安定な供給の可能なメラニン産生抑制物質の探索を行い、麦類植物の葉茎の搾汁液に、メラニン産生抑制作用の存在することを見い出し、本発明を完成した。
【００２２】
さらに、本発明の具備すべき条件を検討した結果、メラニン合成阻害作用は前記搾汁液またはその乾燥粉末（噴霧乾燥物または凍結乾燥物）の水可溶性画分に局在し、その活性は１００℃、１０分間の加熱に対して減弱することなく保持されることを見い出し、本発明を完成した。
【００２３】
かくして、本発明は、麦類植物の搾汁液またはその乾燥粉末の水可溶性画分を提供するものである。
【００２４】
本発明のメラニン合成阻害剤は、水可溶性成分であることから、クロロフィルを含まず、クロロフィルに起因するフェオホルバイドの混在は極めて低いという特性を有する。しかし、製品の形態によれば、麦類植物の搾汁液を噴霧乾燥または凍結乾燥して得られる乾燥粉末をメラニン合成阻害物質として配合することもできる。
【００２５】
本発明においては、前記乾燥粉末の水抽出液はメラノーマＢ１６細胞のメラニン合成阻害作用を有することを明らかにし、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のメラニン合成阻害剤は、安全で、安定供給の可能なものとなり、飲食品、健康食品においては、固形分の析出を防止し、安定性、安全性、安定供給および嗜好性に優れた製品を提供することができ、化粧品、医薬部外品または医薬品においては、安定性、安全性および安定供給に優れた製品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示す図である。
【図２】加熱BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示す図である。
【図３】マウスメラノーマ細胞株B16 の増殖によるBLE の効果を示す図である。
【図４】チロシナーゼ活性に対するBLE の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明について、これを実施するための形態をさらに詳細に説明する。
【００２９】
本発明において原料として用いられる麦類植物は、緑色の葉または茎（以下、葉茎という) を有する麦類植物体である。
【００３０】
本発明は、麦類植物のうち、例えば、大麦、小麦、裸麦、エン麦、ハト麦、トウモロコシ、キビ、イタリアンダイグラス等のうちでも、大麦および裸麦の成熟期前の葉茎が好適である。これら麦類植物はできるだけ新鮮なうちに処理することが望ましい。麦類植物は充分洗浄し、適宜水を加えた後、搾汁する。搾汁は既知の方法に従い、ミキサー、ジューサー等の機械的な破砕工程を遠心分離や濾過等の固−液分離工程と組み合わせることにより容易に行うことができる。
【００３１】
このようにして得られる麦類植物の搾汁液またはそのｐＨを６．５〜８．５に調節した搾汁液を噴霧乾燥または凍結乾燥して乾燥粉末を得ることができる。噴霧乾燥は、通常、吹込み温度１２０〜２００℃、好ましくは１４０〜１８０℃の熱風を用いて行うことができる。凍結乾燥においては、乾燥板の温度４０〜５０℃、真空度１３５〜１. ３Ｐａ程度の条件が通常採用される。
【００３２】
また、乾燥に供する搾汁液の濃度は１．５〜３０ｗ／ｗ％程度の範囲内で、可及的高濃度側が好ましい。搾汁液の濃縮には、連続薄膜濃縮装置、真空濃縮装置を利用することができる。さらに、上記の操作に際して、所望に応じて空気を窒素、アルゴン等の不活性ガスで置換したり、酸素吸収剤を封入したり、低温に保ったり、遮光等の手段を単独もしくは組み合わせて、乾燥工程に供するまでの搾汁液の移送、貯蔵等における変色、変質を防止することもできる。
【００３３】
このようにして得られる麦類植物の搾汁液の乾燥粉末は、必要に応じて水に懸濁して攪拌することにより、水抽出し、得られた抽出液から水不溶性成分を除去する。前記乾燥粉末の水抽出における乾燥粉末に対する水の使用量は、通常、乾燥粉末１Ｋｇあたり水を２〜５０リットル、特に５〜２０リットルの割合が適当である。本発明における上記水抽出は、その目的により、温度範囲としては０〜１００℃が採用される。
【００３４】
以上の水抽出により、前記乾燥粉末に含まれる水不溶性成分は除去される。得られた水可溶性成分を含む水抽出液は、必要に応じ、減圧濃縮、熱処理による除タンパクを行った後、濃縮して製品に配合することもでき、さらに、噴霧乾燥、凍結乾燥等により乾燥することもできる。
【００３５】
すなわち、本発明のメラニン合成阻害剤は、前記乾燥粉末の水可溶性成分であり、麦類の緑色部を特に必要とせず、１００℃、１０分間の熱処理に対しても安定であるためｐＨ調整を行わない処理工程が適用され、さらに水可溶性画分の加熱によるタンパク質除去工程を組み込み、精製することもできる。
【００３６】
本発明により提供される水可溶性抽出物は、飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品の分野において有利に使用することができる。
【００３７】
本発明の水可溶性抽出物は、そのまま或いは濃縮して飲食用に用いることもできるが、必要に応じて、シクロデキストリン、クラウンエーテル等による包接を行うこともできる。また、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色剤、香料、食品添加物、調味料等と混合し、使用の形態に応じて、粉末、顆粒、ペレット、錠剤、油状等の形態に成形することもできる。
【００３８】
本発明の麦類植物の搾汁液または水可溶性抽出物は、必要に応じて、イオン交換樹脂、イオン交換膜等により陰イオンおよび／または陽イオンを部分的に除去して、製品の味覚の改善、品質の安定性、安全性を図ることもできる。
【００３９】
本発明の水可溶性抽出物は、通常の飲食品または濃縮して、果糖、ブドウ糖、可食性植物または生薬抽出物、ビタミン類、アミノ酸類、有機酸、香料等を加えた濃縮飲料または野菜、果物を原料とするジュースの製造に用いることもできる。さらに、水可溶性抽出物またはその濃縮物、乾燥粉末を、麦類植物の加工品、野菜加工品、海藻加工食品、肉類加工食品、スープ類、菓子類、パン類、麺類等に配合することができる。
【実施例】
【００４０】
実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４１】
（細胞培養）
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団「ヒューマンサイエンス研究資源バンク」) を、気相のＣＯ2 を5v/v% に調節し、温度を37℃設定したインキュベーター中で、10% ウシ胎児血清(FBS)(MP Biomedicals, Inc)、PEN./ STREP. 100X 10mLを添加した MEM培地(SIGMA-ALDRICH社))培地で3 〜4 日毎に継代培養を行い維持した。
【００４２】
（麦類植物抽出物の調製方法）
草丈20〜30cmに生育した六条裸大麦（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook）の若葉を搾汁し、その搾汁液を噴霧乾燥して麦類植物抽出物の乾燥粉末を得た。
【００４３】
この乾燥粉末 5g にイオン交換水50mLを加え60分間撹拌抽出し、超遠心機（日立 himac CR21)により遠心分離(10,000rpm,15 分間,4℃) を行った後、得られた上清を濾紙濾過する。その濾液をメンブレンフィルター0.45μm (Sartorius社) さらに0.22μm フィルター(Sartorius社) に通し、麦類植物抽出物の水可溶性画分（以下、BLE という）として実験に用いた。
【００４４】
麦類植物抽出物の水可溶性画分BLE のメラニン合成阻害活性に対する熱安定性実験においては、BLE を0.45μm フィルターにより濾過した後、得られたBLE を沸騰水浴中で10分間加熱し、超遠心機（日立 himac CR21)により遠心分離(10,000rpm,15 分間,4℃) を行った後、得られた上清を濾紙濾過し、さらに0.22μm フィルターにより濾過した標品を加熱BLE として実験に用いた。
【００４５】
（メラニン合成阻害試験）
マウスメラノーマ細胞株B16 をプレート(6 well, 96 well)(Nunc社) に2 ×106cells/2mL/well の濃度で播種し、10%ウシ胎児血清(FBS)(MP Biomedicals, Inc)、2mMテオフィリン、BLE 1,2.5,5,10% または加熱 BLE 5,10%を含むMEM 培地(SIGMA-ALDORICH 社) で37℃、5%CO2 の条件において CO2インキュベーター（三洋電機バイオメディカ社 CO2INCUBATOR MCO-96) で３日間培養した後、 0.25%トリプシンと 0.02%EDTAの等量混合液 1.5mL/ well添加し、37℃、5%CO2 のCO2 インキュベーター内で10分間インキュベートして 0.25%トリプシン/ 0.02%EDTA 混合液と剥がれた細胞をそれぞれ1.5mL エッペンドルフチューブへ回収し、遠心分離機（TOMY KOGYO CO.LTD CAPSULE HF-120 )により１分間遠心分離した。
【００４６】
各プレートにPBS(pH 7.2 )1.5mL / wellを注加し、PBS(pH 7.2 )と未回収の細胞混合液1.5mL をエッペンドルフチューブへ回収し、CAPSULE HF-120で１分間遠心分離した。上清を除き、回収された細胞を合併して 0.1% TritonX-100 含有1N NaOH 1.0mL を添加して溶解した。
【００４７】
これを試料溶液とし、メラニン量を415nm の吸光度を分光光度計（日立 U-3000 Spectrophotometer)で測定した。
【００４８】
図１は、BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示し、BLE は、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生を濃度依存的に阻害することを示している。
【００４９】
図２は、加熱BLE 添加におけるマウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制率を示し、加熱BLE は、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生を、BLE と同程度に阻害することを示している。
【００５０】
（細胞毒性の測定）
マウスメラノーマ細胞株B16 を96穴プレートに 1×105 cells/100 μL/wellの濃度で播種し、10% ウシ胎児血清、2mM テオフィリン、 BLE 1,2.5,5,10%、加熱BLE 5,10% を含むMEM 培地で37℃、5%CO2 で３日間培養した後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社) 10μL / wellを添加し、1,2,3 および4 時間後の450nm(参照波長630nm)における吸光度をマイクロプレートリーダー(CORONA ELECTRIC社 CORONA MTP-120)で測定し、BLE の細胞毒性に起因する細胞増殖についての検討を行った。
【００５１】
図３(a) 〜(d) に示すように、麦類植物抽出物の水可溶性画分に含まれる、マウスメラノーマ細胞株B16 によるメラニン産生抑制物質は、マウスメラノーマ細胞株B16 に対して細胞毒性を示さなかった。本実験においては、BLE によるメラニン合成抑制は、細胞増殖抑制を介したものではないことを示唆するものである。
【００５２】
（チロシナーゼ活性阻害試験）
試験管にpH6.8, 0.2M リン酸緩衝液 680μL 、L-DOPA 0.4mg / mL 水溶液 500μL 、BLE 水溶液（最終濃度1, 2.5, 5, 10%)720μL を注加して37℃で５分間保持後、チロシナーゼ(SIGMA-ALDRICH社, マッシュルーム由来, 5370units/mg) 水溶液 100μL(300units / mL)を添加し、37℃で５分間反応させ、475nm における吸光度を分光光度計（日立 U-3000)で測定した。
【００５３】
図４に示すように、BLE のチロシナーゼ活性に対する阻害効果は小であり、本発明のメラニン合成阻害画分は、チロシナーゼ活性の阻害以外のメラニン合成阻害を有するものと推察される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を有効成分とするメラニン合成阻害剤。
【請求項２】
麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を水抽出することにより水不溶性成分を除去してなる水可溶性抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤。
【請求項３】
麦類植物が大麦または裸麦である請求項１または２記載のメラニン合成阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のメラニン合成阻害剤を配合する飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品。
【請求項１】
麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を有効成分とするメラニン合成阻害剤。
【請求項２】
麦類植物の葉茎を搾汁して得られる搾汁液またはその乾燥粉末を水抽出することにより水不溶性成分を除去してなる水可溶性抽出物を有効成分とするメラニン合成阻害剤。
【請求項３】
麦類植物が大麦または裸麦である請求項１または２記載のメラニン合成阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のメラニン合成阻害剤を配合する飲食品、健康食品、化粧品、医薬部外品または医薬品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−５１９４８（Ｐ２０１１−５１９４８Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０３８１９（Ｐ２００９−２０３８１９）
【出願日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 日本薬学会第１２９年会 主催者名 社団法人 日本薬学会 発表日 平成２１年３月２７日
【出願人】（５０１０２８５７４）日本薬品開発株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 日本薬学会第１２９年会 主催者名 社団法人 日本薬学会 発表日 平成２１年３月２７日
【出願人】（５０１０２８５７４）日本薬品開発株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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