モノカルボン酸の製造方法
【課題】ギ酸、酢酸などのモノカルボン酸含有溶液中に含まれる不純物を除去する工程を含む、モノカルボン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａ、または該工程Ａの後にさらにナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、モノカルボン酸の製造方法。
【解決手段】モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａ、または該工程Ａの後にさらにナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、モノカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノカルボン酸を精製する工程を含むモノカルボン酸の製造方法に関する。詳しくは、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じることによって、透過側から高純度のモノカルボン酸含有溶液を得る工程を含む、モノカルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、有機合成法または発酵法によりモノカルボン酸（例えば、酢酸）を製造する場合、得られるモノカルボン酸含有溶液には、目的とするモノカルボン酸の他に不純物が多種含まれている。これら不純物には例えば、有機合成法で製造された場合は金属触媒などが挙げられ、発酵法で製造された場合はグルコース、糖蜜、澱粉などの糖類および硫安などの無機塩、発酵工程において副生する、乳酸、ピルビン酸などの有機酸が挙げられる。これら不純物を除去する手段としては、イオン交換樹脂による吸着分離、抽出操作による分離方法が一般的に用いられる。イオン交換樹脂による吸着分離では、目的とするモノカルボン酸によっては他の有機酸との吸着選択性が悪く、イオン交換樹脂の機能維持のためには大量の再生液を使用することから、環境負荷が大きく、廃液処理にコストがかかるという問題がある。抽出操作による分離方法では、モノカルボン酸が低級である場合水溶性が高いことから、有機層への分配が困難であるため、特殊な有機溶媒を使用する必要があり、回収率を向上させるために繰り返し抽出操作を行う必要があるという問題があった。さらに、抽出操作後は、有機溶媒および有機溶媒を含んだ水溶液が多量の廃液として排出されることにより、廃液処理コストの増加および、環境負荷の増大という問題点もあった（特許文献１）。
【特許文献１】特開平９−１５１１５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上述したような課題、すなわち、モノカルボン酸を精製する場合において、イオン交換、抽出操作を行わずに不純物を効果的に除去するという課題を解決し、効率よくモノカルボン酸を精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜で濾過することにより、高純度のモノカルボン酸を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（７）から構成される。
（１）モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａを含む、モノカルボン酸の製造方法。
（２）前記工程Ａの後に、ナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、（１）に記載のモノカルボン酸の製造方法。
（３）前記モノカルボン酸がギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物である、（１）または（２）に記載のモノカルボン酸の製造方法。
（４）前記ナノ濾過膜の機能層がポリアミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（５）前記逆浸透膜の塩除去率が、操作圧力５．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水塩化ナトリウム濃度３．５％において、９８％以上である、（２）から（４）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（６）前記逆浸透膜の機能層がポリアミドである、（２）から（５）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（７）前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液から回収されたモノカルボン酸含有溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃに供する、（１）から（６）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係るモノカルボン酸の製造方法によって、モノカルボン酸含有溶液中に含まれるモノカルボン酸以外の不純物を簡単な操作により効果的かつ、経済的に除去することができ、従って、高純度のモノカルボン酸を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００８】
本発明は、モノカルボン酸を精製する工程を含むモノカルボン酸の製造方法であって、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過してモノカルボン酸以外の不純物を非透過液側に除去し、透過液側からモノカルボン酸含有溶液を回収する工程Ａを含むことを特徴としている。
【０００９】
本発明におけるモノカルボン酸とは、分子中にカルボキシル基（ＣＯＯＨ基）を１つ持ち、かつ、他の官能基を持たない化合物であり、具体例としてギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸などの直鎖脂肪族飽和モノカルボン酸、イソブタン酸、２−メチルブタン酸などの分枝脂肪族飽和モノカルボン酸、アクリル酸、クロトン酸などの直鎖脂肪族不飽和モノカルボン酸、メタクリル酸などの分枝脂肪族不飽和モノカルボン酸、安息香酸、フェニル酢酸などの芳香族モノカルボン酸が挙げられるが、本発明においては炭素数１以上６以下のモノカルボン酸が好ましく、中でもギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物が好ましく精製される。
【００１０】
モノカルボン酸は有機合成による製造品であっても、発酵法による製造品であってもよい。モノカルボン酸が発酵法による製造品である場合、モノカルボン酸含有溶液は発酵培養液であってもよい。
【００１１】
モノカルボン酸はモノカルボン酸塩として溶解していてもよい。モノカルボン酸塩としては、モノカルボン酸無機塩が挙げられる。ここでいう無機塩としては、モノカルボン酸リチウム塩、モノカルボン酸ナトリウム塩、モノカルボン酸カリウム塩、モノカルボン酸マグネシウム塩、モノカルボン酸カルシウム塩、モノカルボン酸アンモニウム塩であり、これらの混合物であってもよい。
【００１２】
本発明で用いるナノ濾過膜とは、ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００１３】
また、「ナノ濾過膜に通じる」とは、モノカルボン酸含有溶液を、ナノ濾過膜に通じて濾過し、モノカルボン酸以外の不純物を非透過液側に除去し、透過液側からモノカルボン酸含有溶液を回収することを意味する。
【００１４】
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノ濾過膜を構成させた複合膜を用いることができる。
【００１５】
本発明においてはこれらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。さらに操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが好ましい。ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物がより好ましい。
【００１６】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とするナノ濾過膜である。ピペラジンポリアミドを含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例としては、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系半透膜のＵＴＣ６０が挙げられる。
【００１７】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜エレメントとして使用されることが好ましく採用できる。好ましいナノ濾過膜の具体例としては、例えば、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（２）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００、ＳＵ−６１０も使用することができる。また、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−４００、あるいはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９、ＮＦ９７，ＮＦ９９ＨＦ、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａなどが挙げられる。
【００１８】
本発明において、モノカルボン酸含有溶液のナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけて行ってもよい。その濾過圧は、０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられるが、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、モノカルボン酸を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００１９】
本発明において、モノカルボン酸含有溶液のナノ濾過膜による濾過は、非透過液を再び原水に戻し、繰り返し濾過することでモノカルボン酸の回収率を向上させることができる。モノカルボン酸の回収率は、ナノ濾過前のモノカルボン酸総量およびナノ濾過膜透過モノカルボン酸総量を測定することで、式１によって算出することができる。
【００２０】
モノカルボン酸回収率（％）＝（ナノ濾過膜透過モノカルボン酸総量／ナノ濾過前のモノカルボン酸総量）×１００・・・（式１）。
【００２１】
本発明で用いるナノ濾過膜の膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）を０．７５ＭＰａの濾過圧で評価したとき塩除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。ここでいう塩除去率は前記塩化ナトリウム水溶液の透過液塩濃度を測定することにより、式２によって算出することができる。
【００２２】
塩除去率＝１００×｛１−（透過液中の塩濃度／供給水中の塩濃度）｝・・・（式２）。
【００２３】
また、ナノ濾過膜の透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）の膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．３以上のものが好ましく用いられる。膜透過流束は透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。
【００２４】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））＝透過液量／（膜面積×採水時間）・・・（式３）。
【００２５】
本発明においては、ナノ濾過膜に通じるモノカルボン酸含有溶液に酸性物質を添加してｐＨを１以上７未満に調整することが好ましい。ナノ濾過は、溶液中にイオン化していない（非解離）物質の方が、イオン化している（解離）物質に比べて透過しやすい特性から、モノカルボン酸を含んだ水溶液のｐＨを７未満とすることで、モノカルボン酸を含んだ水溶液中でイオン化していないモノカルボン酸の割合の方がイオン化しているモノカルボン酸より多くなり（非解離モノカルボン酸／解離モノカルボン酸＞１）、効率的にモノカルボン酸溶液を透過液側から回収することができる。モノカルボン酸を含んだ水溶液のｐＨが１を下回ると、ナノ濾過膜の耐久性に悪影響を及ぼす場合がある。より好ましいｐＨの範囲は、１以上６以下である。ｐＨ調整剤として添加する酸性物質としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが挙げられる。
【００２６】
本発明においてモノカルボン酸含有溶液からナノ濾過膜により非透過液側に分離される不純物としては、カルシウム、ナトリウム、硫酸、硝酸、リン酸などの無機物や、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ガラクトース、澱粉などの糖類や、タンパク質などが挙げられ、これらの混合物であっても好ましく分離される。
【００２７】
本発明におけるモノカルボン酸を含んだ溶液のナノ濾過膜透過性は、モノカルボン酸透過率を算出することで評価できる。モノカルボン酸透過率は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーに代表される分析により、原水（モノカルボン酸を含んだ溶液）中に含まれるモノカルボン酸濃度（原水モノカルボン酸濃度）および透過液（モノカルボン酸溶液）中に含まれるモノカルボン酸濃度（透過液モノカルボン酸濃度）を測定することで、式４によって算出することができる。
【００２８】
モノカルボン酸透過率（％）＝（透過液モノカルボン酸濃度／原水モノカルボン酸濃度）×１００・・・（式４）。
【００２９】
本発明においては、前記工程Ａによって得られる透過液をさらに逆浸透膜に通じて透過側からモノカルボン酸含有溶液を回収する工程Ｂに供することで、ナノ濾過膜を一部透過した不純物をほぼ完全に除去することができる。
【００３０】
本発明における、ナノ濾過膜透過液を「逆浸透膜に通じる」とは、ナノ濾過膜を透過したモノカルボン酸溶液を、逆浸透膜に通じて濾過し、透過液側にモノカルボン酸を含んだ溶液を濾別回収し、非透過液側にモノカルボン酸以外不純物を除去することを意味する。
【００３１】
ここで本発明で用いる逆浸透膜の膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム（原水塩化ナトリウム濃度３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧で評価したときの塩化ナトリウム除去率が９８％以上のものが好ましく用いられる。塩化ナトリウム除去率は前記海水の透過液塩化ナトリウム濃度を測定することにより、式５によって算出することができる。
【００３２】
塩化ナトリウム除去率＝１００×｛１−（透過液中の塩化ナトリウム濃度／原水中の塩化ナトリウム濃度）｝・・・（式５）。
【００３３】
また、逆浸透膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧において、膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．２以上のものであれば、透過液側のモノカルボン酸と非透過液側の不純物を分離する速度を早めることができることから、好ましく用いられる。
【００３４】
本発明で使用する逆浸透膜の膜素材としては、一般に市販されている酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、該１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。
【００３５】
本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。
【００３６】
本発明においては、モノカルボン酸の透過率が高い逆浸透膜であれば膜素材に特に制限はないが、ポリアミド系の逆浸透膜であればモノカルボン酸の回収率が高く、不純物との分離効率が高いことからより好ましい。
【００３７】
膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
【００３８】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ（株）製ポリアミド系逆浸透膜（ＵＴＣ）ＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐ、ＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工（株）製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０などが挙げられる。
【００３９】
本発明において、ナノ濾過膜透過液の逆浸透膜による濾過は、圧力をかけて行うが、その濾過圧は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、モノカルボン酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、２ＭＰａ以上６ＭＰａ以下の範囲であることがさらに好ましい。
【００４０】
本発明においてモノカルボン酸含有溶液から逆浸透膜により非透過液側に分離されるモノカルボン酸以外の不純物としては、乳酸、ピルビン酸、酪酸、コハク酸などの有機酸、塩化ナトリウム、アンモニアなどの無機塩が挙げられる。
【００４１】
逆浸透膜による分離に供されるモノカルボン酸含有溶液の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、濾過する時間を短縮することができることからコスト削減に好適であり、例えば１０ｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００４２】
本発明においては、前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液を他のモノカルボン酸精製工程に供してもよく、好ましくはモノカルボン酸含有溶液を、さらに蒸留する工程に供することで、高純度のモノカルボン酸を得ることができる。蒸留工程は、１Ｐａ以上大気圧（常圧、約１０１ｋＰａ）以下の減圧下で行うことが好ましく、１００Ｐａ以上１５ｋＰａ以下の減圧下で行うことがより好ましい。減圧下で行う場合の蒸留温度は、２０℃以上２００℃以下で行うことが好ましく、５０℃以上１５０℃以下で行うことがより好ましい。
【００４３】
本発明のナノ濾過膜または逆浸透膜の分離膜装置の形態としては、モノカルボン酸含有溶液を貯留するための原水槽と、ろ過の駆動力を与える高圧ポンプとナノ濾過膜を装着するためのセルによって主に構成される。
【００４４】
図１は、本発明で用いることができるナノ濾過膜の分離膜装置の例を説明するための概要図である。また、図２は本発明で用いることができるナノ濾過膜の分離膜装置のナノ濾過膜が装着された例を説明するためのセル断面概要図である。次に、図１のナノ濾過膜の分離膜装置によるモノカルボン酸の精製の形態について説明する。ナノ濾過膜７をセル２に支持板８を用いて装着する。次にモノカルボン酸を含んだ水溶液を原水槽１に投入して、高圧ポンプ３によってモノカルボン酸含有溶液をセルに送液することによってモノカルボン酸の精製を行う。高圧ポンプ３によるろ過圧力は０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下で行うことができる。好ましくは、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下であり、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。モノカルボン酸を含んだ水溶液はセル２に送液されてモノカルボン酸を含んだ透過液５が得られる。セルで濃縮された濃縮液４は再び原水槽１に返送される。この時、透過液と等量のモノカルボン酸を新たに原水槽に投入することで連続的にモノカルボン酸を精製することも可能である（図示せず）。このようにして、モノカルボン酸含有溶液から所望の生産物であるモノカルボン酸と不純物を分離し、簡便にモノカルボン酸を精製することができる。なお、逆浸透膜による濾過もナノ濾過膜による分離装置と同等の分離膜装置により実施することができる。
【００４５】
本発明のモノカルボン酸の製造方法によれば、膜分離操作によるモノカルボン酸の分離精製は、加熱工程を必要としないことからエネルギーコスト削減に好適であり、有機溶媒廃液が一切排出されないことから、環境負荷低減に好適である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（乳酸生産能力を持つ酵母株の作製）
参考例１ 乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
モノカルボン酸である酢酸の分離精製実験に供する酢酸含有溶液として、副生物として酢酸を含む乳酸発酵培養液を利用した。乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。具体的には、ヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００４８】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００４９】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ＬＤＨ遺伝子（アクセッションナンバー；ＡＹ００９１０８、配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ＬＤＨ５（Ｌ−ＬＤＨ遺伝子）を得た。
【００５０】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００５１】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。また、酢酸の濃度についても、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により分析を行った。
【００５２】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸と副生物として１ｇ／Ｌの酢酸が検出された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００５４】
参考例２ 乳酸生産酵母のバッチ発酵試験
表１に示す発酵培地を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。
【００５５】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、 温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ 水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整。
【００５６】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
参考例３ ナノ濾過膜の無機塩（硫酸マグネシウム）阻止率評価
超純水１０Ｌに硫酸マグネシウム（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ硫酸マグネシウム水溶液を調製した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した硫酸マグネシウム水溶液１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＵＴＣ６０”（ナノ濾過膜１；東レ株式会社製）、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＮＦ−４００”（ナノ濾過膜２；フィルムテック製）、ポリアミド半透膜“ＮＦ９９”（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）、酢酸セルロース半透膜“ＧＥｓｅｐａ”（ナノ濾過膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を０．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸マグネシウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、硫酸マグネシウムの透過率を計算した。
【００６０】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００６１】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００６２】
結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３の結果より、ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１：東レ株式会社製）が最も無機塩の阻止率が高いことが示された。
【００６５】
参考例４ ナノ濾過膜の酢酸透過性評価
超純水１０Ｌに酢酸（和光純薬工業株式会社製）１００ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ酢酸水溶液を調製した。次いで、参考例１と同じ条件でナノ濾過膜１〜４の透過液を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、酢酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により以下の条件で分析し、酢酸の透過率を算出した。
【００６６】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）、移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００６７】
結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例１〜２１ ナノ濾過膜による酢酸分離実験
（ナノ濾過膜で濾過する培養液の準備）
参考例１、２で発酵した培養液（２Ｌ）をｐＨが１．９（実施例１）２．０（実施例２〜５）、２．２（実施例６〜９）、２．６（実施例１０〜１６）、４．０（実施例１７〜２０）になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウム、酢酸カルシウムを乳酸、酢酸、硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ2（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。また、濃硫酸を添加しなかったｐＨ５の培養液（２Ｌ）についても分離実験を行った（実施例２１）。
【００７０】
（ナノ濾過膜による分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記実施例で得られた濾液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例３と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、グルコース、乳酸、酢酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】
表５に示すように、すべてのｐＨ、濾過圧力において、硫酸カルシウム、グルコース、乳酸が高効率で除去されたことがわかった。また、上記実施例１〜２１において、ナノ濾過膜を新しい膜に取り換えることなく、上記の濾加圧において、硫酸カルシウムが高効率で除去された。
【００７３】
参考例５ 逆浸透膜の塩化ナトリウム除去性評価
超純水１０Ｌに塩化ナトリウム（和光純薬製）を添加して２５℃１時間攪拌し、３．５％塩化ナトリウムを調整した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した３．５％塩化ナトリウム１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φ逆浸透膜として、ポリアミド系逆浸透膜“ＵＴＣ７０”（逆浸透膜１；東レ株式会社製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＲＯ−９９”（逆浸透膜２；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＨＲ９８ＰＰ”（逆浸透膜３；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ ＰＡ−ＡＫ”（逆浸透膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）、酢酸セルロース系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ ＣＦ−ＣＡ”（逆浸透膜５；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を５．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、塩化ナトリウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、塩化ナトリウムの透過率を計算した。
【００７４】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００７５】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００７６】
結果を表６に示す。
【００７７】
【表６】
【００７８】
実施例２２〜４１ 逆浸透膜による酢酸分離実験
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に実施例５〜２５で得られたナノ濾過膜透過液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、前記逆浸透膜１〜５をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、乳酸、酢酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、逆浸透膜の透過側から回収した、酢酸回収率を式６の方法で算出し、逆浸透膜の透過側から回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率を式７の方法で算出した。
【００７９】
酢酸回収率（％）＝透過側から回収した総酢酸量／原水槽に注入した総酢酸量・・・（式６）。
【００８０】
回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率（％）＝回収した乳酸含有量／回収した総酢酸量・・・（式７）。
その結果を表７に示す。
【００８１】
【表７】
【００８２】
表７に示すように、１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａのすべての濾過圧力において、高純度の酢酸が透過液側に高効率で回収されたことがわかった。
【００８３】
実施例４２〜５７ ナノ濾過膜によるギ酸分離実験
超純水にギ酸（１０ｇ／Ｌ）、乳酸（１０ｇ／Ｌ）、グルコース（１ｇ／Ｌ）、硫酸カルシウム（１ｇ／Ｌ）を添加したモデル水溶液（２Ｌ）を、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例３と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、グルコース、乳酸、ギ酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表８に示す。
【００８４】
【表８】
【００８５】
実施例５８〜７７ 逆浸透膜によるギ酸分離実験
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に実施例４２〜５７で得られたナノ濾過膜透過液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、前記逆浸透膜１〜５をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、乳酸、ギ酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、逆浸透膜の透過側から回収した、ギ酸回収率を式８の方法で算出し、逆浸透膜の透過側から回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率を式９の方法で算出した。
【００８６】
ギ酸回収率（％）＝透過側から回収した総ギ酸量／原水槽に注入した総ギ酸量・・・（式８）。
【００８７】
回収したギ酸水溶液中の乳酸含有率（％）＝回収した乳酸含有量／回収した総ギ酸量・・・（式９）。
その結果を表９に示す。
【００８８】
【表９】
【００８９】
表９に示すように、１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａのすべての濾過圧力において、高純度のギ酸が透過液側に高効率で回収されたことがわかった。
【００９０】
比較例１ ナノ濾過膜を用いない酢酸の精製
実施例１と同様に、参考例１、２で培養した発酵液（２Ｌ）をｐＨが１．９になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウム、酢酸カルシウムを乳酸、酢酸、硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ2（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。次いで、濾液２Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化製）を用いて、減圧下（５０ｈＰａ）で水を蒸発させて濃縮した。この時、硫酸カルシウムの析出が見られた。得られた濾液中には、乳酸４５ｇ／Ｌ、酢酸１２ｇ／Ｌ含まれていた。
【００９１】
比較例２ 抽出操作による酢酸の精製
比較例１で得られた濾液２Ｌに２Ｌのクロロホルム（和光純薬製）を入れ、分液漏斗で抽出した。抽出した有機層、水層中に含まれる酢酸濃度をＨＰＬＣで分析したところ、有機層への酢酸回収率は１０％であった。抽出後の水層に再びクロロホルム２Ｌを入れ、分液漏斗で繰り返し抽出したが、回収率は４０％を超えることはなかった。また、抽出操作により１０Ｌ以上の有機溶媒廃液が産出した。
【００９２】
以上の実施例及び比較例の結果から、ナノ濾過膜により、酢酸含有溶液から不純物を高効率で除去でき、酢酸を高収率で回収できることが明らかとなった。すなわち、本発明によって、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜を用いて濾過することにより、有機溶媒を用いた抽出操作を行わずに、モノカルボン酸を高収率で精製できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明で用いたナノ濾過膜および逆浸透膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いたナノ濾過膜および逆浸透膜分離装置の逆浸透膜が装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【符号の説明】
【００９４】
１ 原水槽
２ ナノ濾過膜または逆浸透膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜濃縮液の流れ
５ 膜透過液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液された培養液またはナノ濾過膜透過液の流れ
７ ナノ濾過膜または逆浸透膜
８ 支持板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノカルボン酸を精製する工程を含むモノカルボン酸の製造方法に関する。詳しくは、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じることによって、透過側から高純度のモノカルボン酸含有溶液を得る工程を含む、モノカルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、有機合成法または発酵法によりモノカルボン酸（例えば、酢酸）を製造する場合、得られるモノカルボン酸含有溶液には、目的とするモノカルボン酸の他に不純物が多種含まれている。これら不純物には例えば、有機合成法で製造された場合は金属触媒などが挙げられ、発酵法で製造された場合はグルコース、糖蜜、澱粉などの糖類および硫安などの無機塩、発酵工程において副生する、乳酸、ピルビン酸などの有機酸が挙げられる。これら不純物を除去する手段としては、イオン交換樹脂による吸着分離、抽出操作による分離方法が一般的に用いられる。イオン交換樹脂による吸着分離では、目的とするモノカルボン酸によっては他の有機酸との吸着選択性が悪く、イオン交換樹脂の機能維持のためには大量の再生液を使用することから、環境負荷が大きく、廃液処理にコストがかかるという問題がある。抽出操作による分離方法では、モノカルボン酸が低級である場合水溶性が高いことから、有機層への分配が困難であるため、特殊な有機溶媒を使用する必要があり、回収率を向上させるために繰り返し抽出操作を行う必要があるという問題があった。さらに、抽出操作後は、有機溶媒および有機溶媒を含んだ水溶液が多量の廃液として排出されることにより、廃液処理コストの増加および、環境負荷の増大という問題点もあった（特許文献１）。
【特許文献１】特開平９−１５１１５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上述したような課題、すなわち、モノカルボン酸を精製する場合において、イオン交換、抽出操作を行わずに不純物を効果的に除去するという課題を解決し、効率よくモノカルボン酸を精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜で濾過することにより、高純度のモノカルボン酸を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（７）から構成される。
（１）モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａを含む、モノカルボン酸の製造方法。
（２）前記工程Ａの後に、ナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、（１）に記載のモノカルボン酸の製造方法。
（３）前記モノカルボン酸がギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物である、（１）または（２）に記載のモノカルボン酸の製造方法。
（４）前記ナノ濾過膜の機能層がポリアミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（５）前記逆浸透膜の塩除去率が、操作圧力５．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水塩化ナトリウム濃度３．５％において、９８％以上である、（２）から（４）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（６）前記逆浸透膜の機能層がポリアミドである、（２）から（５）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
（７）前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液から回収されたモノカルボン酸含有溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃに供する、（１）から（６）のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に係るモノカルボン酸の製造方法によって、モノカルボン酸含有溶液中に含まれるモノカルボン酸以外の不純物を簡単な操作により効果的かつ、経済的に除去することができ、従って、高純度のモノカルボン酸を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００８】
本発明は、モノカルボン酸を精製する工程を含むモノカルボン酸の製造方法であって、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過してモノカルボン酸以外の不純物を非透過液側に除去し、透過液側からモノカルボン酸含有溶液を回収する工程Ａを含むことを特徴としている。
【０００９】
本発明におけるモノカルボン酸とは、分子中にカルボキシル基（ＣＯＯＨ基）を１つ持ち、かつ、他の官能基を持たない化合物であり、具体例としてギ酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸などの直鎖脂肪族飽和モノカルボン酸、イソブタン酸、２−メチルブタン酸などの分枝脂肪族飽和モノカルボン酸、アクリル酸、クロトン酸などの直鎖脂肪族不飽和モノカルボン酸、メタクリル酸などの分枝脂肪族不飽和モノカルボン酸、安息香酸、フェニル酢酸などの芳香族モノカルボン酸が挙げられるが、本発明においては炭素数１以上６以下のモノカルボン酸が好ましく、中でもギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物が好ましく精製される。
【００１０】
モノカルボン酸は有機合成による製造品であっても、発酵法による製造品であってもよい。モノカルボン酸が発酵法による製造品である場合、モノカルボン酸含有溶液は発酵培養液であってもよい。
【００１１】
モノカルボン酸はモノカルボン酸塩として溶解していてもよい。モノカルボン酸塩としては、モノカルボン酸無機塩が挙げられる。ここでいう無機塩としては、モノカルボン酸リチウム塩、モノカルボン酸ナトリウム塩、モノカルボン酸カリウム塩、モノカルボン酸マグネシウム塩、モノカルボン酸カルシウム塩、モノカルボン酸アンモニウム塩であり、これらの混合物であってもよい。
【００１２】
本発明で用いるナノ濾過膜とは、ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００１３】
また、「ナノ濾過膜に通じる」とは、モノカルボン酸含有溶液を、ナノ濾過膜に通じて濾過し、モノカルボン酸以外の不純物を非透過液側に除去し、透過液側からモノカルボン酸含有溶液を回収することを意味する。
【００１４】
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノ濾過膜を構成させた複合膜を用いることができる。
【００１５】
本発明においてはこれらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。さらに操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが好ましい。ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物がより好ましい。
【００１６】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とするナノ濾過膜である。ピペラジンポリアミドを含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例としては、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系半透膜のＵＴＣ６０が挙げられる。
【００１７】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜エレメントとして使用されることが好ましく採用できる。好ましいナノ濾過膜の具体例としては、例えば、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（２）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００、ＳＵ−６１０も使用することができる。また、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−４００、あるいはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９、ＮＦ９７，ＮＦ９９ＨＦ、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａなどが挙げられる。
【００１８】
本発明において、モノカルボン酸含有溶液のナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけて行ってもよい。その濾過圧は、０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられるが、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、モノカルボン酸を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００１９】
本発明において、モノカルボン酸含有溶液のナノ濾過膜による濾過は、非透過液を再び原水に戻し、繰り返し濾過することでモノカルボン酸の回収率を向上させることができる。モノカルボン酸の回収率は、ナノ濾過前のモノカルボン酸総量およびナノ濾過膜透過モノカルボン酸総量を測定することで、式１によって算出することができる。
【００２０】
モノカルボン酸回収率（％）＝（ナノ濾過膜透過モノカルボン酸総量／ナノ濾過前のモノカルボン酸総量）×１００・・・（式１）。
【００２１】
本発明で用いるナノ濾過膜の膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）を０．７５ＭＰａの濾過圧で評価したとき塩除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。ここでいう塩除去率は前記塩化ナトリウム水溶液の透過液塩濃度を測定することにより、式２によって算出することができる。
【００２２】
塩除去率＝１００×｛１−（透過液中の塩濃度／供給水中の塩濃度）｝・・・（式２）。
【００２３】
また、ナノ濾過膜の透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、塩化ナトリウム水溶液（５００ｍｇ／Ｌ）の膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．３以上のものが好ましく用いられる。膜透過流束は透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。
【００２４】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））＝透過液量／（膜面積×採水時間）・・・（式３）。
【００２５】
本発明においては、ナノ濾過膜に通じるモノカルボン酸含有溶液に酸性物質を添加してｐＨを１以上７未満に調整することが好ましい。ナノ濾過は、溶液中にイオン化していない（非解離）物質の方が、イオン化している（解離）物質に比べて透過しやすい特性から、モノカルボン酸を含んだ水溶液のｐＨを７未満とすることで、モノカルボン酸を含んだ水溶液中でイオン化していないモノカルボン酸の割合の方がイオン化しているモノカルボン酸より多くなり（非解離モノカルボン酸／解離モノカルボン酸＞１）、効率的にモノカルボン酸溶液を透過液側から回収することができる。モノカルボン酸を含んだ水溶液のｐＨが１を下回ると、ナノ濾過膜の耐久性に悪影響を及ぼす場合がある。より好ましいｐＨの範囲は、１以上６以下である。ｐＨ調整剤として添加する酸性物質としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが挙げられる。
【００２６】
本発明においてモノカルボン酸含有溶液からナノ濾過膜により非透過液側に分離される不純物としては、カルシウム、ナトリウム、硫酸、硝酸、リン酸などの無機物や、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、ガラクトース、澱粉などの糖類や、タンパク質などが挙げられ、これらの混合物であっても好ましく分離される。
【００２７】
本発明におけるモノカルボン酸を含んだ溶液のナノ濾過膜透過性は、モノカルボン酸透過率を算出することで評価できる。モノカルボン酸透過率は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーに代表される分析により、原水（モノカルボン酸を含んだ溶液）中に含まれるモノカルボン酸濃度（原水モノカルボン酸濃度）および透過液（モノカルボン酸溶液）中に含まれるモノカルボン酸濃度（透過液モノカルボン酸濃度）を測定することで、式４によって算出することができる。
【００２８】
モノカルボン酸透過率（％）＝（透過液モノカルボン酸濃度／原水モノカルボン酸濃度）×１００・・・（式４）。
【００２９】
本発明においては、前記工程Ａによって得られる透過液をさらに逆浸透膜に通じて透過側からモノカルボン酸含有溶液を回収する工程Ｂに供することで、ナノ濾過膜を一部透過した不純物をほぼ完全に除去することができる。
【００３０】
本発明における、ナノ濾過膜透過液を「逆浸透膜に通じる」とは、ナノ濾過膜を透過したモノカルボン酸溶液を、逆浸透膜に通じて濾過し、透過液側にモノカルボン酸を含んだ溶液を濾別回収し、非透過液側にモノカルボン酸以外不純物を除去することを意味する。
【００３１】
ここで本発明で用いる逆浸透膜の膜分離性能としては、温度２５℃、ｐＨ６．５に調整した塩化ナトリウム（原水塩化ナトリウム濃度３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧で評価したときの塩化ナトリウム除去率が９８％以上のものが好ましく用いられる。塩化ナトリウム除去率は前記海水の透過液塩化ナトリウム濃度を測定することにより、式５によって算出することができる。
【００３２】
塩化ナトリウム除去率＝１００×｛１−（透過液中の塩化ナトリウム濃度／原水中の塩化ナトリウム濃度）｝・・・（式５）。
【００３３】
また、逆浸透膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（３．５％）を５．５ＭＰａの濾過圧において、膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・日））が０．２以上のものであれば、透過液側のモノカルボン酸と非透過液側の不純物を分離する速度を早めることができることから、好ましく用いられる。
【００３４】
本発明で使用する逆浸透膜の膜素材としては、一般に市販されている酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、該１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。
【００３５】
本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。
【００３６】
本発明においては、モノカルボン酸の透過率が高い逆浸透膜であれば膜素材に特に制限はないが、ポリアミド系の逆浸透膜であればモノカルボン酸の回収率が高く、不純物との分離効率が高いことからより好ましい。
【００３７】
膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
【００３８】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ（株）製ポリアミド系逆浸透膜（ＵＴＣ）ＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐ、ＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工（株）製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０などが挙げられる。
【００３９】
本発明において、ナノ濾過膜透過液の逆浸透膜による濾過は、圧力をかけて行うが、その濾過圧は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、モノカルボン酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、２ＭＰａ以上６ＭＰａ以下の範囲であることがさらに好ましい。
【００４０】
本発明においてモノカルボン酸含有溶液から逆浸透膜により非透過液側に分離されるモノカルボン酸以外の不純物としては、乳酸、ピルビン酸、酪酸、コハク酸などの有機酸、塩化ナトリウム、アンモニアなどの無機塩が挙げられる。
【００４１】
逆浸透膜による分離に供されるモノカルボン酸含有溶液の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、濾過する時間を短縮することができることからコスト削減に好適であり、例えば１０ｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００４２】
本発明においては、前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液を他のモノカルボン酸精製工程に供してもよく、好ましくはモノカルボン酸含有溶液を、さらに蒸留する工程に供することで、高純度のモノカルボン酸を得ることができる。蒸留工程は、１Ｐａ以上大気圧（常圧、約１０１ｋＰａ）以下の減圧下で行うことが好ましく、１００Ｐａ以上１５ｋＰａ以下の減圧下で行うことがより好ましい。減圧下で行う場合の蒸留温度は、２０℃以上２００℃以下で行うことが好ましく、５０℃以上１５０℃以下で行うことがより好ましい。
【００４３】
本発明のナノ濾過膜または逆浸透膜の分離膜装置の形態としては、モノカルボン酸含有溶液を貯留するための原水槽と、ろ過の駆動力を与える高圧ポンプとナノ濾過膜を装着するためのセルによって主に構成される。
【００４４】
図１は、本発明で用いることができるナノ濾過膜の分離膜装置の例を説明するための概要図である。また、図２は本発明で用いることができるナノ濾過膜の分離膜装置のナノ濾過膜が装着された例を説明するためのセル断面概要図である。次に、図１のナノ濾過膜の分離膜装置によるモノカルボン酸の精製の形態について説明する。ナノ濾過膜７をセル２に支持板８を用いて装着する。次にモノカルボン酸を含んだ水溶液を原水槽１に投入して、高圧ポンプ３によってモノカルボン酸含有溶液をセルに送液することによってモノカルボン酸の精製を行う。高圧ポンプ３によるろ過圧力は０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下で行うことができる。好ましくは、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下であり、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。モノカルボン酸を含んだ水溶液はセル２に送液されてモノカルボン酸を含んだ透過液５が得られる。セルで濃縮された濃縮液４は再び原水槽１に返送される。この時、透過液と等量のモノカルボン酸を新たに原水槽に投入することで連続的にモノカルボン酸を精製することも可能である（図示せず）。このようにして、モノカルボン酸含有溶液から所望の生産物であるモノカルボン酸と不純物を分離し、簡便にモノカルボン酸を精製することができる。なお、逆浸透膜による濾過もナノ濾過膜による分離装置と同等の分離膜装置により実施することができる。
【００４５】
本発明のモノカルボン酸の製造方法によれば、膜分離操作によるモノカルボン酸の分離精製は、加熱工程を必要としないことからエネルギーコスト削減に好適であり、有機溶媒廃液が一切排出されないことから、環境負荷低減に好適である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（乳酸生産能力を持つ酵母株の作製）
参考例１ 乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
モノカルボン酸である酢酸の分離精製実験に供する酢酸含有溶液として、副生物として酢酸を含む乳酸発酵培養液を利用した。乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。具体的には、ヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００４８】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００４９】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ＬＤＨ遺伝子（アクセッションナンバー；ＡＹ００９１０８、配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ＬＤＨ５（Ｌ−ＬＤＨ遺伝子）を得た。
【００５０】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００５１】
得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。また、酢酸の濃度についても、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により分析を行った。
【００５２】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸と副生物として１ｇ／Ｌの酢酸が検出された。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。
【００５４】
参考例２ 乳酸生産酵母のバッチ発酵試験
表１に示す発酵培地を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。
【００５５】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、 温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ 水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整。
【００５６】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
参考例３ ナノ濾過膜の無機塩（硫酸マグネシウム）阻止率評価
超純水１０Ｌに硫酸マグネシウム（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ硫酸マグネシウム水溶液を調製した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した硫酸マグネシウム水溶液１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＵＴＣ６０”（ナノ濾過膜１；東レ株式会社製）、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＮＦ−４００”（ナノ濾過膜２；フィルムテック製）、ポリアミド半透膜“ＮＦ９９”（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）、酢酸セルロース半透膜“ＧＥｓｅｐａ”（ナノ濾過膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を０．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸マグネシウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、硫酸マグネシウムの透過率を計算した。
【００６０】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００６１】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００６２】
結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】
表３の結果より、ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１：東レ株式会社製）が最も無機塩の阻止率が高いことが示された。
【００６５】
参考例４ ナノ濾過膜の酢酸透過性評価
超純水１０Ｌに酢酸（和光純薬工業株式会社製）１００ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ酢酸水溶液を調製した。次いで、参考例１と同じ条件でナノ濾過膜１〜４の透過液を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、酢酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により以下の条件で分析し、酢酸の透過率を算出した。
【００６６】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）、移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。
【００６７】
結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
【００６９】
実施例１〜２１ ナノ濾過膜による酢酸分離実験
（ナノ濾過膜で濾過する培養液の準備）
参考例１、２で発酵した培養液（２Ｌ）をｐＨが１．９（実施例１）２．０（実施例２〜５）、２．２（実施例６〜９）、２．６（実施例１０〜１６）、４．０（実施例１７〜２０）になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウム、酢酸カルシウムを乳酸、酢酸、硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ2（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。また、濃硫酸を添加しなかったｐＨ５の培養液（２Ｌ）についても分離実験を行った（実施例２１）。
【００７０】
（ナノ濾過膜による分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記実施例で得られた濾液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例３と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、グルコース、乳酸、酢酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】
表５に示すように、すべてのｐＨ、濾過圧力において、硫酸カルシウム、グルコース、乳酸が高効率で除去されたことがわかった。また、上記実施例１〜２１において、ナノ濾過膜を新しい膜に取り換えることなく、上記の濾加圧において、硫酸カルシウムが高効率で除去された。
【００７３】
参考例５ 逆浸透膜の塩化ナトリウム除去性評価
超純水１０Ｌに塩化ナトリウム（和光純薬製）を添加して２５℃１時間攪拌し、３．５％塩化ナトリウムを調整した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記で調整した３．５％塩化ナトリウム１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φ逆浸透膜として、ポリアミド系逆浸透膜“ＵＴＣ７０”（逆浸透膜１；東レ株式会社製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＲＯ−９９”（逆浸透膜２；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＨＲ９８ＰＰ”（逆浸透膜３；アルファラバル製）、ポリアミド系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ ＰＡ−ＡＫ”（逆浸透膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）、酢酸セルロース系逆浸透膜“ＧＥｓｅｐａ ＣＦ−ＣＡ”（逆浸透膜５；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を５．５ＭＰａに調整し、透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、塩化ナトリウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、塩化ナトリウムの透過率を計算した。
【００７４】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。
【００７５】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。
【００７６】
結果を表６に示す。
【００７７】
【表６】
【００７８】
実施例２２〜４１ 逆浸透膜による酢酸分離実験
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に実施例５〜２５で得られたナノ濾過膜透過液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、前記逆浸透膜１〜５をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、乳酸、酢酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、逆浸透膜の透過側から回収した、酢酸回収率を式６の方法で算出し、逆浸透膜の透過側から回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率を式７の方法で算出した。
【００７９】
酢酸回収率（％）＝透過側から回収した総酢酸量／原水槽に注入した総酢酸量・・・（式６）。
【００８０】
回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率（％）＝回収した乳酸含有量／回収した総酢酸量・・・（式７）。
その結果を表７に示す。
【００８１】
【表７】
【００８２】
表７に示すように、１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａのすべての濾過圧力において、高純度の酢酸が透過液側に高効率で回収されたことがわかった。
【００８３】
実施例４２〜５７ ナノ濾過膜によるギ酸分離実験
超純水にギ酸（１０ｇ／Ｌ）、乳酸（１０ｇ／Ｌ）、グルコース（１ｇ／Ｌ）、硫酸カルシウム（１ｇ／Ｌ）を添加したモデル水溶液（２Ｌ）を、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例３と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、グルコース、乳酸、ギ酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表８に示す。
【００８４】
【表８】
【００８５】
実施例５８〜７７ 逆浸透膜によるギ酸分離実験
図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に実施例４２〜５７で得られたナノ濾過膜透過液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、前記逆浸透膜１〜５をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液５を回収した。原水槽１、透過液５に含まれる、乳酸、ギ酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析し、逆浸透膜の透過側から回収した、ギ酸回収率を式８の方法で算出し、逆浸透膜の透過側から回収した酢酸水溶液中の乳酸含有率を式９の方法で算出した。
【００８６】
ギ酸回収率（％）＝透過側から回収した総ギ酸量／原水槽に注入した総ギ酸量・・・（式８）。
【００８７】
回収したギ酸水溶液中の乳酸含有率（％）＝回収した乳酸含有量／回収した総ギ酸量・・・（式９）。
その結果を表９に示す。
【００８８】
【表９】
【００８９】
表９に示すように、１ＭＰａ、２ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａのすべての濾過圧力において、高純度のギ酸が透過液側に高効率で回収されたことがわかった。
【００９０】
比較例１ ナノ濾過膜を用いない酢酸の精製
実施例１と同様に、参考例１、２で培養した発酵液（２Ｌ）をｐＨが１．９になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウム、酢酸カルシウムを乳酸、酢酸、硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ2（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。次いで、濾液２Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化製）を用いて、減圧下（５０ｈＰａ）で水を蒸発させて濃縮した。この時、硫酸カルシウムの析出が見られた。得られた濾液中には、乳酸４５ｇ／Ｌ、酢酸１２ｇ／Ｌ含まれていた。
【００９１】
比較例２ 抽出操作による酢酸の精製
比較例１で得られた濾液２Ｌに２Ｌのクロロホルム（和光純薬製）を入れ、分液漏斗で抽出した。抽出した有機層、水層中に含まれる酢酸濃度をＨＰＬＣで分析したところ、有機層への酢酸回収率は１０％であった。抽出後の水層に再びクロロホルム２Ｌを入れ、分液漏斗で繰り返し抽出したが、回収率は４０％を超えることはなかった。また、抽出操作により１０Ｌ以上の有機溶媒廃液が産出した。
【００９２】
以上の実施例及び比較例の結果から、ナノ濾過膜により、酢酸含有溶液から不純物を高効率で除去でき、酢酸を高収率で回収できることが明らかとなった。すなわち、本発明によって、モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜を用いて濾過することにより、有機溶媒を用いた抽出操作を行わずに、モノカルボン酸を高収率で精製できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明で用いたナノ濾過膜および逆浸透膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いたナノ濾過膜および逆浸透膜分離装置の逆浸透膜が装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【符号の説明】
【００９４】
１ 原水槽
２ ナノ濾過膜または逆浸透膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜濃縮液の流れ
５ 膜透過液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液された培養液またはナノ濾過膜透過液の流れ
７ ナノ濾過膜または逆浸透膜
８ 支持板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａを含む、モノカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ａの後に、ナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、請求項１に記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記モノカルボン酸がギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物である、請求項１または２に記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記ナノ濾過膜の機能層がポリアミドである、請求項１から３のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記逆浸透膜の塩除去率が、操作圧力５．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水塩化ナトリウム濃度３．５％において、９８％以上である、請求項２から４のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
前記逆浸透膜の機能層がポリアミドである、請求項２から５のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項７】
前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液から回収されたモノカルボン酸含有溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃに供する、請求項１から６のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項１】
モノカルボン酸含有溶液をナノ濾過膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ａを含む、モノカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ａの後に、ナノ濾過膜透過液を逆浸透膜に通じて濾過して、透過側からモノカルボン酸を回収する工程Ｂを含む、請求項１に記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記モノカルボン酸がギ酸、酢酸およびプロピオン酸から選択される１種または２種以上の混合物である、請求項１または２に記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記ナノ濾過膜の機能層がポリアミドである、請求項１から３のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記逆浸透膜の塩除去率が、操作圧力５．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水塩化ナトリウム濃度３．５％において、９８％以上である、請求項２から４のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
前記逆浸透膜の機能層がポリアミドである、請求項２から５のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【請求項７】
前記工程Ａまたは工程Ｂの透過液から回収されたモノカルボン酸含有溶液を、さらに、１Ｐａ以上大気圧以下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留する工程Ｃに供する、請求項１から６のいずれかに記載のモノカルボン酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−９５４５０（Ｐ２０１０−９５４５０Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６５０９７（Ｐ２００８−２６５０９７）
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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