リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ、これを含む試験キット及びこれを使用した検出方法
【課題】
本発明はリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ細胞、このようなモノクローナル抗体を含む試験キット及びこのようなモノクローナル抗体を使用してリステリアモノサイトゲネスを検出する方法に関する。
【解決手段】
本発明のモノクローナル抗体はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することによりこのような抗体を使用して人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に検定しうる。
本発明はリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ細胞、このようなモノクローナル抗体を含む試験キット及びこのようなモノクローナル抗体を使用してリステリアモノサイトゲネスを検出する方法に関する。
【解決手段】
本発明のモノクローナル抗体はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することによりこのような抗体を使用して人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に検定しうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリステリアモノサイトゲネスによる感染有無及び食品における汚染有無を迅速に確認するためのもので、リステリアモノサイトゲネスｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ細胞、このようなモノクローナル抗体を含む試験キット及びこのようなモノクローナル抗体を使ってリステリアモノサイトゲネスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア(Listeria)の菌種はグラム陽性の通性嫌気性桿菌として自然界に幅広く分布している。リステリア種(Listeria spp.)にはリステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、Listeria ivanovii、Listeria innocua、Listeria seeligeri、Listeria welshimeri及びリステリアグライイ(Listeria grayi)などの多数の種があり、このうちリステリアモノサイトゲネスだけがヒトに病原性があり、動物に病原性のある菌株はリステリアモノサイトゲネスとListeria ivanoviiである。
【０００３】
特に、リステリアモノサイトゲネスは冷蔵保存を要する食品に汚染される場合低温保存
過程で長い間生存及び増殖が可能なので、冷蔵保存食品を媒介にした食中毒発生の主な原因菌になっている。さらに、この細菌によるリステリア感染症(Listeriosis)は重症に進む場合敗血症及び脳髄膜炎を引き起こし姙産婦の流産を引き起こす。新生児、高齢者、姙産婦及び免疫欠乏患者が特に危険であり、感染症を引き起こした患者では３０％に至る高い死亡率を示す。このようなリステリア感染症の発生は食肉及び食肉加工品、野菜、乳化工品などのような食品が主要感染経路であると知られている。従って、リステリア症を予防するためにリステリアモノサイトゲネスによる食品の汚染有無を迅速に診断する必要がある。
【０００４】
現在、病院及び産業体(食品会社、食肉会社及び乳加工会社)などで使用できるリステリア同定方法としては色々の生化学的検査法を使用する伝統的な方法があるが、長時間と手間がかかる非効率的な方法である。
【０００５】
リステリアモノサイトゲネスによる感染有無及び食品における汚染有無を迅速に確認するための診断方法として重合酵素連鎖反応(ＰＣＲ)法のような分子生物学的方法が用いられているが、技術力と精度が求められるため、実際臨床及び産業的に適用し難い方法である。また、酵素免疫法(EIA:Enzyme immunoassay)のような免疫学的方法が多用されているが、非特異性が現れるので不正確な検査結果が得られたり、追加確認試験が必要な場合が発生する。
【０００６】
リステリア菌を迅速に検出するためのキットとしては、ＰＣＲ技法、核酸ハイブリッド化分析法を用いた非放射活性DNAプローブキット、免疫検定法を用いたキットなどが知られており、また免疫クロマトグラフィ法を用いたディップスティック(dip-stick)方法で開発された製品もあるが、これらキットの全てはリステリアモノサイトゲネスだけを特異的に検出できないか、全てのリステリア種が検出される短所を持っている。
【０００７】
リステリアモノサイトゲネスに対するモノクローナル抗体の生産が困難だったので、前記菌株を選択的に認知するモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡまたはディップスティック検出キットが開発できなかった。これは、リステリアモノサイトゲネス菌株全体を抗原として使用したり一部特定抗原を使用した場合もリステリアモノサイトゲネスについてだけ特異なモノクローナル抗体が生産されなかったためである。
【０００８】
リステリア種(Listeria spp.)に共通に存在するmurein hydrolases酵素であるｐ６０はリステリアが細胞分裂のために分泌するエッキソ(exo)酵素であって、本発明の前、ｐ６０の特定ペプチド、例えばｐｅｐＡ及びｐｅｐＤ（非特許文献１）を使ってポリクローナル抗体を製造したことがある。しかし、これは使用可能なポリクローナル抗体の低い力価とサンドイッチＥＬＩＳＡシステムの不適切な適用によりその効果が微弱なので商用化するには足りない点があった。本発明者は前記ｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチド部位と他の部位に特異的に結合して(実施例４、図４ａ)リステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知できる新規なモノクローナル抗体を製造した。
【０００９】
このような背景下で、本発明者はリステリア属(genus)に共通に存在するmurein hydrolases酵素ｐ６０のうちリステリアモノサイトゲネスのｐ６０の特異的抗原決定基を認知するモノクローナル抗体を製造した。
【非特許文献１】Bubert A.et al.,Appl. Environ Microbiol、６０(９)、３１２０-７、１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体及び受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリア種(Listeria spp.)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００１１】
本発明の他の目的は前記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出するための試験キットを提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タン
パク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体の存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の試験キットは、望ましくはＥＬＩＳＡ用キットまたは免疫クロマトグラフィを
用いたディップスティックである。
【００１５】
前記試験キットにおいて、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体は望ましくはリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１６】
前記検出方法において、抗原-抗体複合体は、望ましくはＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、色彩粒子結合法または化学発光物質結合法で検出する。
【００１７】
前述した検出方法において、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体は望ましくはリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することにより、抗体を使用して人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に検定しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明はリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するモノクローナル抗体に関する。
【００２０】
具体的に、一つの形態として本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００２１】
また、本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリア種(Listeria spp．)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００２２】
本願において使用された用語"モノクローナル抗体"とは、当該分野に公知の用語であって、単一抗原性部位について指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常、相異なる決定基(エピトープ)について指示される相異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは違って、モノクローナル抗体は抗原状の単一決定基について指示される。モノクローナル抗体は抗原-抗体結合を用いる診断及び分析学的分析法の選択性と特異性を改善させる長所があり、またハイブリドーマ培養により合成されるため、他の免疫グロブリンにより汚染されない他の長所を有する。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体はｐ６０を免疫原にして動物を免疫化した後、免疫化された動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質と特異的に結合するハイブリドーマを選別してこれより製造した抗体である。
【００２４】
具体的に、本発明ではモノクローナル抗体製造に組換えｐ６０タンパク質を免疫原として使用したし、これは公知の塩基配列(Andreas B．、et al．、J．Bacteriol．、１７４:８１６６-８１７１、１９９２)を用いて当分野の通常の方法におりＰＣＲ増幅産物をｐＥＴ-２１ａベクトルに挿入し、このベクトルをEscherichia coliで発現させ精製して製造した。精製された組換えｐ６０タンパク質を免疫原としてマウスを免疫化させ、これより脾臓細胞を分離した後骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３と融合させた後ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験でｐ６０タンパク質について抗体活性が高いハイブリドーマを選別した後、これを再び培養して再びＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験で陽性ハイブリドーマｐ６００７及び６０１７を選別した。前記ハイブリドーマの培養上澄液を使用したＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験結果、ハイブリドーマｐ６００７だけがリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知した。前記選別したハイブリドーマを動物腹腔内に注入し、注入後一定期間が経過した後回収した動物の腹水からモノクローナル抗体を分離した。
【００２５】
精製されたモノクローナル抗体を使ってサンドイッチ及び直接的ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット試験を通してそれぞれのモノクローナル抗体を糾明した。本願において使用された用語"モノクローナル抗体ｐ６００７"はハイブリドーマｐ６００７により分泌されるモノクローナル抗体であり、用語"モノクローナル抗体ｐ６００１７"はハイブリドーマｐ６０１７により分泌されるモノクローナル抗体である。
【００２６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験結果、モノクローナル抗体ｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知するモノクローナル抗体と判明されたし、モノクローナル抗体ｐ６０１７はリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体として判明された(図１)。
【００２７】
前述したようにリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することと確認されたモノクローナル抗体ｐ６００７及びリステリア種を選別的に認知することと確認されたモノクローナル抗体ｐ６０１７は食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株の全てを選別的に認知した(図２ｂ及び図２ｃ)。
【００２８】
また、本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７がｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチドを認知するか否かを直接的ＥＬＩＳＡで試験した。本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７はｐｅｐＡ及びｐｅｐＤと結合しなかったし、これより本発明のモノクローナル抗体はｐｅｐＡ及びｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された(図４ａ)。ｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争(competition)をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証した場合も、モノクローナル抗体ｐ６００７がｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いるとすればｐｅｐＡとｐｅｐＤの添加量変化によりＯＤ値が変わるべきであるが、ペプチド添加量の変化について差がなく飽和されたＯＤ値を示したため、モノクローナル抗体ｐ６００７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを利用しないことと確認された(図４ｂ及び図４ｃ)。
【００２９】
本発明のリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７を生産するハイブリドーマｐ６００７はＫＣＴＣ(Korean Culture for Type Cultures)に２００３年２月２１日付けにて受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰとして寄託され、リステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６０１７を分泌するハイブリドーマｐ６０１７はＫＣＴＣに２００３年２月２１日付けにて受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰとして寄託された。
【００３０】
従って、他の様態として本発明はモノクローナル抗体ｐ６００７を生産するハイブリドーマｐ６００７(ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰ)に関する。また、本発明はモノクローナル抗体ｐ６０１７を生産するハイブリドーマｐ６０１７(ＫＣＴＣ １０４３２ＢＰ)に関する。
【００３１】
本発明に係るモノクローナル抗体ｐ６００７は、標準菌株の免疫学的検定で接近可能な抗原決定因子との反応性に加えて、食品から分離されたリステリアモノサイトゲネスについても高い特異性と感度を有するのでリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するのに適している。
【００３２】
従って、さらに他の様態として本発明はリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６００７を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体存在を調べることにより、リステリアモノサイトゲネスの汚染を検出する方法に関する。
【００３３】
本願において使用された用語"抗原-抗体複合体"は試料中のリステリアモノサイトゲネスの存否を確認するためのｐ６０タンパク質抗原とこれを認知するモノクローナル抗体の結合物を意味する。
【００３４】
本発明の検出方法では試料サンプルとして５ないし１５分間加熱した培養上澄液を使用
する。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７とリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質との抗原-抗体複合体の検出は当業界において公知の方法、例えば分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、吸光的、化学的、その他の方法を用いられる。
【００３６】
本発明の目的上、抗原-抗体複合体の検出方法としては、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、化学発光物質結合法などが望ましく用いられる。
【００３７】
抗原-抗体複合体の検出は直接的または間接的に標識された抗体の使用を伴い、使用可能な検出標識としては、例えばバイオチン-ストレプトアビジン結合体、蛍光染料(例:フルオレセイン、テキサスレッド、ロダミン、グリーン蛍光タンパク質など)、放射性標識物(例:３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ)、酵素(例:ＨＲＰ、アルカリ性フォスファターゼ及びその他ＥＬＩＳＡで一般に使われるもの)、及び色彩標識物、例えばコロイド状金またはカラーガラスまたはプラスチック(例:ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズを含む。このような標識物の使用を記述している文献[U．S．Pat．Nos．３、８１７、８３７;３、８５０、７５２;３、９３９、３５０;３、９９６、３４５;４、２７７、４３７;４、２７５、１４９;and ４、３６６、２４１;Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed．、Molecular Probes、Inc．、Eugene Oreg．)]を参照する。
【００３８】
本発明において抗原-抗体複合体の検出に特に望ましい方法はＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ検出方法により、試料サンプルは固体支持体、例えばマイクロタイタープレート、メンブレイン、テストストリップなどにコーティングされた本発明のモノクローナル抗体と接触される。具体的な一例として、マイクロタイタープレートのウェルを本発明のモノクローナル抗体でコーティングし、占有されない(nonoccupied)結合部位を例えばＢＳＡで遮断した後、コーティングされたプレートのウェルを試料サンプルとインキュベーションし、次いで抗原-抗体複合体の存在を決定できる。抗原-抗体複合体の存在は抗原-抗体複合体の抗原について特異的な抗体、例えばリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用したり、リステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使って確認できる。前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は検出標識を有することができ、検出標識を有しない場合これらモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出できるもう一つの抗体を処理して確認できる。
【００３９】
本発明の検出方法において、リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７と結合された抗原に結合する第２抗体としては望ましくはリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体が使用でき、特にｐ６０１７が望ましい。
【００４０】
一つの例として、モノクローナル抗体ｐ６００７と試料を反応させ、次いでリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６０１７を結合させこれより検出標識信号を測定したり、これら複合体に検出可能な信号を生成できる標識を有する抗体を添加してこれより検出標識信号を測定してリステリアモノサイトゲネスを検出できる。
【００４１】
また、本発明において抗原-抗体複合体の検出に特に望ましい他の方法としてはモノクローナル抗体をコロイド状金粒子と結合させる金粒子結合法が挙げられる。
【００４２】
他の様態として、本発明は前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６００７を含む、リステリアモノサイトゲネスの汚染を検出するための試験キットに関する。
【００４３】
本発明のリステリアモノサイトゲネスの検出試験キットに使用されるモノクローナル抗体は、この抗体がリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知できる限り、モノクローナル抗体の断片も使用できる。このような抗体断片はF(ab')２、Fab、Fab'、Fv断片などを含める。
【００４４】
本発明のリステリアモノサイトゲネス検出試験キットにはリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７またはその断片及び免疫学的分析に使用される道具/試薬が含まれる。
【００４５】
免疫学的分析に使われる道具/試薬としては適した担体、検出可能な信号を生成できる標識、溶解剤、洗浄剤などが含まれる。また、標識物質が酵素の場合は酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含める。
【００４６】
適した担体としては、これに限られないが、可溶性担体、例えば当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳ、不溶性担体、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合わせでありうる。
【００４７】
本発明の検出方法及びキットに使用するための検定システムはこれに限られないが、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティックデバイス、免疫クロマトグラフィ試験ストリップ及び放射分割免疫検定デバイス、及びフロー-スロー(flow-through)デバイスなどを含む。
【００４８】
本発明のリステリアモノサイトゲネス検出のための試験キットは望ましくはＥＬＩＳＡキットまたは免疫クロマトグラフィを用いたディップスティックである。
【００４９】
本発明の試験キットで、リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７と結合された抗原に結合する第２抗体としては、望ましくはリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体が使用でき、特にモノクローナル抗体ｐ６０１７が使用できる。
【００５０】
本発明は下記の実施例に基づきさらに具体的に説明する。しかし、例示された実施例はただ本発明を説明するためのものであり、本発明はこれに限られない。
【実施例１】
【００５１】
: ＰＣＲ及びクローニング
リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質のｉａｐ(invasion-associated prote
in)遺伝子(Andreas、B．et al．、J．Bacteriol．、１７４:８１６６-８１７１、１９９２)をクローニングするために先にこの遺伝子をＰＣＴを通して増幅した。
【００５２】
プライマー、すなわちｉａｐ-Ｆ-ｐＥＴ(５'-GGG AAT TCC ATA TGA GCA CTG TAG TAG TCG AAG CT-３')(配列１)及びｉａｐ-Ｒ-ｐＥＴ(５'-GCC GCT CGA GTA CGC GAC CGA AGC CAA C-３')(配列２)をシグナル配列を除いた全ての部分が含まれるようにデザインしたし、ｐＥＴ-２１ａベクトルの特性によりストップコドンも除外した。また、クローニングのために順方向プライマーにはＮｄｅＩ、逆方向プライマーにはＸｈｏＩ制限酵素部位を添加した。ＰＣＲは全体ボリュームを５０μｌにしたし、リステリアモノサイトゲネスの染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、１０×ｆｕ緩衝液(Stratagene)５μｌ、クローニングされたＰｆｕポリマラーゼ１Ｕ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーを配合してＰＣＲした。さらに高い信頼度(fidelity)のため、Ｐｆｕポリマラ-ゼ(Stratagene)を使用した。ＰＣＲはＰＴＣ-１５０(MJ Research)を使って３０サイクル間９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分の条件にした。
【００５３】
ＰＣＲ完了後、ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。精製されたＤＮＡはクローニングのためにＮＥＢ緩衝液４(New England Biolabs))で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩ(New England Biolabs)を処理した。制限酵素処理後、１％アガロースゲルで電気泳動しGenecleanスピンキット(Q-bio gene)を用いてＤＮＡを精製した。精製された挿入ＤＮＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理したｐＥＴ-２１ａベクトルとＴ４ＤＮＡ結合緩衝液でＴ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)で結合してイー・コライ（Ｅ.Ｃｏｌｉ）ＤＨ０ｂにエレクトロポレーションした。クローニング有無はプラスミドスピンキット(Genenmed)でミニプレップして確認した。
【００５４】
ｐＥＴシステムの発現のためにクローニングされたベクトルを発現菌株イー・コライＢＬ２１で形質転換し再びミニプレップを介して確認した。クローニングされたイー・コライをプレートで一晩中大きくした後、一つのクロニーを５ｍｌ ＬＢａｍｐ肉汁培地に接種して約ＯＤ６００が１．０日まで培養した。この培養液５ｍｌを新たな５００ｍｌ ＬＢ ａｍｐ肉汁培地に加え２ないし３時間培養してＯＤ６００が０．５ないし１．０になればＩＰＴＧを１ｍＭされるよう加えてタンパク質の発現を誘導した。２０℃で一晩中誘導した後、培養液を遠心分離して上澄液を捨てて、イー・コライだけを得た。以後のタンパク質精製はHis・Bind精製キット(Novagen)を使って行なった。細胞パレットを１/２５体積の緩衝液(０．１％Triton Ｘ-１００、５０ｍＭ ｐＨ８．０Tris-HCl)に浮遊させた後、リソザイム０．１ｍｇ/ｍｌ(Sigma)を入れ超音波処理してイー・コライを壊した。再び２７０００ｘｇで３０分間遠心分離した後、充填緩衝液でＮｉイオンを充填させ予め用意されたＮＴＡ-キレート化アガロースＣＬ-６Ｂ(Peptron)カラムにこの上澄液を通過させた。タンパク質が吸着されたカラムを１０倍カラム体積の結合緩衝液(５ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭｐＨ７．９ Tris-HCl)と６倍体積の洗浄緩衝液(６０mMイミダゾル、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｐＨ７．９Tris-HCl)で非特異的に吸着されているタンパク質を除去した。最後に、溶出緩衝液(１ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭｐＨ７．９Tris-HCl)でカラムに結合されたｐ６０を分離した。得られたｐ６０をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを通して確認した。
【実施例２】
【００５５】
: ハイブリドーマ細胞製造
２-１: 抗体生成細胞
実施例１で製造したｐ６０タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥ(polyacrylamide gel electrophoresis)が含まれたゲルで電気電気泳動し(１００μｇ)、ゲルの断片を切った後同じ体積の完全フロイントアジュバントが配合されたエマルジョンを製造した。前記エマルジョンを生後７週齢雌ＢＡＬＢ/Ｃマウス５匹の腹腔内に注射した。１匹当たり２０μｇの抗原を注射し、総体積は４００μｌにした。２週後に不完全フロイントアジュバントと抗原を混合したエマルジョンを前記マウスの腹腔に注入した後、２週間後ＰＢＳに溶かした抗原を(１０μｇ/mouse)腹腔内に注射して抗体生成を誘導した。抗体生成有無を確認するためにＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット検定を施して抗体を確認した後、細胞融合に入る３日前にマウスの尻尾静脈にＰＢＳに溶かした抗原を再度注射した。汚染を防止するために全てのマウスを選択した領域で飼育した。
２-２: 抗体生成細胞の確認及び選別
前記方法により免疫化されたマウスで血液試料を目(eye ball)から取得して１．５ｍｌ遠心分離チューブに入れて血清を遠心分離して(１８００ｒｐｍ、１０分)抗体の生成有無を実験する前まで-２０℃で保管した。
【００５６】
ｐ６０タンパク質でＥＬＩＳＡ方法により抗体の生成を確認した後抗体生成細胞に対する融合に着手した。前記イー・コライで発現させたｐ６０タンパク質を０．５μｇ/ウェルで９６-ウェルプレートにコーティングした後一晩中反応させた。ＰＢＳＴ(PBS buffer、０．０５％ Tween２０)で３次洗浄した後１％ＢＳＡで反応を終了した。再びＰＢＳＴで３次洗浄した後血清を１:５００ないし２０００まで稀釈して処理した後１時間反応させた。ＰＢＳＴで３次洗浄した後、抗マウスＩｇＧ結合ＨＲＰを処理し１時間反応させた。次いで、ＰＢＳＴで３次洗浄した後、１００μｌＯＰＤ(Sigma)を処理した後２０分間発色させた。１５μｌ反応終了溶液(８Ｎ硫酸)を添加した後、４９２ｎｍ波長で吸光度を測定した。
２-３: ハイブリドーマ細胞製造
抗体生成が確認された後マウスを犠牲させ抗体生産脾臓細胞を分離し、これと骨髄腫細胞(myeloma cell)Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を融合方法(Cesar Milstein and Georges Kohler's method)から由来した変形された方法(Method in enzymology、vol．７３、 p３．Academic Press、New York)により融合した。
【００５７】
マウスのＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を培養トレイに１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて最適成長期に至るよう維持させた。細胞融合の一日前にＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を３・１０５細胞/ｍｌで稀釈して次の日５０ｍｌを取って３分間４００ｘｇで遠心分離した。無血清培地で２回洗浄した後、１・１０７細胞/ｍｌになるよう濃度を合わせた。次いで、マウスを頚椎離脱(cervical dislocation)により犠牲させ脾臓を取得し、これをメッシュ容器に入れ細胞を一つずつ分離させた。この際、全ての培地は無血清で使用した。完全に分離された抗体生産細胞を５分間４００ｘｇで遠心分離した後、無血清培地で２回洗浄し１０ｍｌの培地に懸濁させた。リンプ球を血球計数器(haemocytomer)で計数して１０８のリンプ球を１×１０７Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞(１０:１)と混ぜて３分間４００ｘｇで遠心分離した。３７℃で前処理された５０％ＰＥＧ(Sigma)１ｍｌ溶液を１分にかけてゆっくり滴下しつつ混ぜた。生成された融合混合液をＲＰＭＩ１６４０培地で４ｍｌ/３分、次いで５ｍｌ/４分、次いで２０ｍｌ/５分にかけて稀釈し３分間４００ｘｇで遠心分離した後、ＨＡＴ選択培地３５ｍｌに細胞を懸濁させた。１００μｌの懸濁液を一日前に供給細胞(feeder cell、マウスの腹腔でＰＢＳで分離した大食球)をコーティングした９６-ウェルプレートに分注して３７℃、 ５％ＣＯ２培養器で７ないし１４日間培養した。
２-４: ハイブリドーマの選別及び分離
前記実施例で収得した培養上澄液を取って直接的ＥＬＩＳＡ方法でｐ６０に対する陽性クローンを選別した後、ウェスタンブロットで陽性クローンであることを再び確認した。多数のハイブリドーマのうちｐ６０タンパク質について抗体活性が高い(ＯＤ１．２以上)１０種のハイブリドーマ細胞を得た。
【００５８】
このように確認された陽性クローンを一連の過程で稀釈して一つの融合細胞を９６-ウェルプレートの１ウェル当たり０．５細胞ずつ分注して７日間培養した後、ＥＬＩＳＡとウェスタンブロットで検証した。これより最終陽性クローンを検証して抗体の性質と認知部位によりｐ６００７、ｐ６０１３、ｐ６０１７、ｐ６０３０及びｐ６０３３を分離した。最終的に検証された融合細胞を２４-ウェルに移して規模を少しずつ大きくしてＴ２５フラスコに最終的に移転させ分離培養した。
【００５９】
選別されたｐ６０タンパク質抗体を生産するハイブリドーマのうちハイブリドーマｐ６００７及びｐ６０１７をＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultures、韓国大田広域市儒成区魚隠洞５２番地)に２００３年２月２１日付けにてそれぞれＫＣＴＣ １０４３１BP及びＫＣＴＣ １０４３２ＢＰとして寄託した。
【実施例３】
【００６０】
: 抗体生産及び分離
前記実施例２で得られた各抗体別陽性クローンを用いてマウス腹腔培養液を製造し、これより抗体を分離した。各抗体別に生産ハイブリドーマ細胞が違うだけ、腹腔培養液製造及び分離方法は同様に行なった。
【００６１】
前記実施例２で区別された抗体の腹腔培養液を得るため、ＥＬＩＳＡ方法及びウェスタンブロット方法で確認されたモノクローナル抗体をそれぞれ生成する陽性クローン３・１０６細胞を１週間前にプレスチンを予め処理したＢＡＬＢ/Ｃマウスの腹腔内に注射した。１０ないし１５日後に３ないし１０ｍｌの腹水を抽出した。モノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７の両方同一な方法で製造したし、但し最終検証段階で五つに分かれており、それぞれの抗体を作るために独立的に腹腔培養液を収得したし、各抗体を含む腹腔培養液から抗体の分離を次のような方法で行なった。
【００６２】
前記得た腹水をタンパク質Ａ親和性カラム(Amersham Bioscience、HiTrap rProtein A FF)を通じて精製した。すなわち、タンパク質Ａカラムを１０倍体積のＤＰＢＳで１ｍｌ/分の速度で均質化させてから腹水を通過させた。この際速度はＡＫＴＡ精製器(AmershamBioscience)により１ｍｌ/分で通過させ、溶出は１００ｍＭグリシン(ｐＨ３．０)で行なった後、１/１０倍量の２Ｍ Tris(ｐＨ８．０)で中性化させた。この際、溶出速度は１ｍｌ/分にしてそれぞれの抗体を精製及び分離した。
【実施例４】
【００６３】
: モノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験
前記実施例３において分離されたモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７についてＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを行ない、これら抗体が公知のペプチドｐｅｐＡ(Ser-Thr-Pro-Val-Ala-Pro-Thr-Gln-Glu-Val-Lys-Lys)(配列３)及びｐｅｐＤ(Gln-Gln-Gln-Thr-Ala-Pro-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu)(配列４)を認知するのかを観測した。
【００６４】
捕獲抗体としてポリクローナル抗体１００ｎｇを使用した直接的ＥＬＩＳＡ分析結果、総１９個のリステリア菌のうち一つのリステリアグレイを除いたリステリア菌種の全てを検出するポリクローナル抗体がリステリアモノサイトゲネスを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡで第２抗体として使用可能であることを確認した(図１ａ)。また、ポリクローナル抗体を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にリステリア菌のうちリステリアグライイを除いたリステリア菌種の全てを検出することを確認した(図１ａ)。
【００６５】
捕獲抗体として２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７を使用し、第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ分析結果、総１９個のリステリア菌のうちリステリアモノサイトゲネスを除いた６個のリステリア菌はブランクのＯＤ値が０．３に似た水準であり、１３個のリステリアモノサイトゲネスの場合ＯＤ値が０．９以上水準であった。このような結果からモノクローナル抗体ｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するのに適していることが確認された(図１ｂ)。また、モノクローナル抗体ｐ６００７を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にステリア菌のうちリステリアモノサイトゲネス菌株だけを検出することを確認した(図１ｂ)。
【００６６】
また、捕獲抗体としてリステリア菌種の全てを検出する２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６０１７を使用し、第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ分析結果、ｐ６０１７のモノクローナル抗体はListeria grayi、Listeria welshimeri、Listeria innocua、Listeria ivanovii、リステリアモノサイトゲネス、Listeria seeligeriの全てを検出した(図１ｃ)。このような結果はｐ６０１７がｐ６００７に対する第２抗体として適していることを示す。また、モノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にモノクローナル抗体ｐ６０１７はリステリアモノサイトゲネスだけではなくListeria ivanoviiまでも検出したので、ｐ６００７に対する第２抗体として適していることを確認した(図１ｃ)。
【００６７】
また、食品から分離された総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株について捕獲抗体としてポリクローナル抗体１００ｎｇを使用した直接的ＥＬＩＳＡ分析結果、総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌を全て検出したため、図１ａのようにポリクローナル抗体がリステリアモノサイトゲネスを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡに第２抗体として使用できることを確認した(図２ａ)。また、ポリクローナル抗体を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様に全てのリステリアモノサイトゲネス菌の全部を検出することを確認した(図２ａ)。
【００６８】
そして、捕獲抗体として２００ｎｇのｐ６００７とｐ６０１７及び第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用し、食品から分離された総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株をＢＨＩ肉汁培地で３７℃で一晩中培養した後遠心分離(３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ)し、その上澄液をお湯に１０分間処理した菌液を１００μｌ/ｗｅｌｌずつ接種して行なったサンドイッチＥＬＩＳＡ分析した結果、食品菌株の全てについて陽性であり、１００％の感度と特異性を示した(図２ｂ及び図２ｃ)。このようなデータはｐ６００７とｐ６０１７の特徴的な能力をもう一度確認している。
【００６９】
また、ｐ６００７とｐ６０１７との間に存在する親和力または相違点を調べるためにウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法を行なった。図６ａに示したように、ｐ６００７はリステリアモノサイトゲネスｐ６０の少量、５ｎｇであっても容易く検出したが、Listeria innocua ｐ６０については５ｎｇの１０倍になる５０ｎｇを添加してこそやっと検出できた。５０ｎｇが添加された後リステリアモノサイトゲネスと Listeria innocua ｐ６０が結合された濃度結果を比較してみると、１００倍の差異があることが分かる。一方、図６ｂにおいてｐ６０１７はリステリアモノサイトゲネスと Listeria innocua ｐ６０との間にその効果の差異が大きくない。このようなデータは培地上澄液の典型的な濃度でｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスｐ６０と他のリステリア種ｐ６０を区別できることを示す。
【００７０】
一方、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７がｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを認知するか否かを直接的ＥＬＩＳＡ方法で調べた。コーティング抗原としては１００ｎｇのリステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０、１００ｎｇのListeria innocuaの組換えｐ６０、５００ｎｇのｐｅｐＡ、５００ｎｇのｐｅｐＤ、５００ｎｇの陰性対照群ペプチドを使用し、捕獲抗体としては５００ｎｇのポリクローナル抗体、５００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７、５００ｎｇのｐ６０１７を使用した。その結果、図４ａに示したように、ポリクローナル抗体だけがｐｅｐＡと結合したし、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７の全てがｐｅｐＡ及びｐｅｐＤと結合しないので、クローン抗体ｐ６００７とｐ６０１７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された。
【００７１】
また、捕獲抗体として２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７を使用し、サンプルとして１００ｎｇのリステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０を使用し、第２抗体として、図４ｂの場合ポリクローナル抗体を使用しつつそれぞれ１μｇないし１ｎｇのｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを陰性調節ペプチドを添加しペプチドGly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu(配列５)を対照ペプチドとして使用し、図４ｃの場合、ビオチニル化したモノクローナル抗体ｐ６０１７にそれぞれ１μｇないし１ｎｇのｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを陰性調節ペプチドとして添加しペプチドGly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu(配列５)を対照ペプチドとして使用して、ｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争(competition)をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証した。その結果、モノクローナル抗体ｐ６００７がｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いるとｐｅｐＡとｐｅｐＤの添加量変化によりＯＤ値が変るべきであるが、図４ｂ及び図４ｃに示したようにペプチド添加量の変化について差異がなくて飽和されたＯＤ値を示したので、図４ａのようにモノクローナル抗体ｐ６００７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された。従って、サンドイッチＥＬＩＳＡキットに適用時モノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７及びポリクローナル抗体はｐｅｐＡとｐｅｐＤをエピトープとして使用しないことと見られる。
【実施例５】
【００７２】
: リステリアモノサイトゲネス検出ＥＬＩＳＡキット
リステリアモノサイトゲネスを検出するためのＥＬＩＳＡ検定キットを製造するためにリステリアモノサイトゲネスに特異的なｐ６００７モノクローナル抗体とリステリア種に特異的なｐ６０１７モノクローナル抗体を用いた。
【００７３】
具体的に次のように行なった。
【００７４】
捕獲抗体として精製したｐ６００７モノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸塩緩衝溶液(ｐＨ９．６)に５μｇ/ｍｌで稀釈して１００μｌずつ９６ウェルプレート(０．５μｇ/well)に分注し一晩中４℃で反応させた。反応液を捨てて０．０５％Tween２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄した。
【００７５】
プレートの空いた空間を遮断するために０．０５％Tween２０と１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ２００μｌを各ウェルに入れ３７℃で１時間反応させた後、再び３回洗浄した。
【００７６】
サンプルはリステリア増菌培地で一晩中増菌して１ｍｌを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を１０分間沸したものを使用した。遮断したプレートに用意されたサンプルを各ウェルに１００μｌずつ加えた。この際実験の有効性を評価するために陽性対照群と陰性対照群をともに施した。プレートを３７℃で１時間反応させた。反応液を捨てて、３回洗浄した。
【００７７】
２次抗体としてモノクローナル抗体ｐ６０１７を０．１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳに１μｇ/ｍｌで稀釈して各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃で１時間反応させた。反応が終わった後、３回洗浄した。
【００７８】
吸光度を測定して、陽性対照群が１．５ないし２．０になり陰性対照群が０．１以下になれば正常的な反応と見做した。サンプルの値が１．５以上ならば陽性と見做し、リステリアモノサイトゲネスの菌を分離及び同定し、０．１以下になると陰性と見做してサンプルにリステリアモノサイトゲネスが汚染されないことと見なした。
【００７９】
捕獲モノクローナル抗体の量を相違にしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった結果が図３ａに示されている。具体的には、図３ａは捕獲抗体としてモノクローナル抗体ｐ６００７の量を２００ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、２μｇに変化させ行なったサンドイッチＥＬＩＳＡ結果を示す。この際、第２抗体としては１００ｎｇのビオチニル化したモノクローナル抗体ｐ６０１７の反応条件(検出標識物:ストレプトアビジン-ＨＲＰ)下で使用した。リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するｐ６００７を捕獲抗体として使用したのでリステリアモノサイトゲネスだけを検出したし、モノクローナル抗体ｐ６００７量が増加することによりＯＤ値が増加した。その結果によれば、サンドイッチＥＬＩＳＡキットに捕獲抗体ｐ６００７を５００ｎｇないし２μｇの量として使用した時高いＯＤ値を示した。
【００８０】
リステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知するものとして確認されたモノクローナル抗体ｐ６００７は、前記リステリア菌株以外の他の菌株、すなわちエスケリキア、エンテロコックス、エンテロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、スタヒロコッカス、ストレプトコックス、ビブリオ及びサルモネラ菌株は認知できなかった(図３ｂ)。
【実施例６】
【００８１】
: 免疫クロマトグラフィを用いたリステリアモノサイトゲネスの迅速診断
主要食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスを迅速にスクリーニングするための免疫クロマトグラフィを用いたディップスティックを製造するために、モノクローナル抗体ｐ６００７をコロイド状金(４０ｎｍ)と結合させ、モノクローナル抗体ｐ６０１７を捕獲抗体として使用し、抗マウスＩｇＧを対照抗体として使用した。対照線にバンドが発生すれば有効な実験として見なし、二つのバンド、すなわち捕獲線と対照線にバンドが生ずると陽性と見なし、リステリアモノサイトゲネス菌を分離及び同定し、対照線だけでバンドが発生すれば陰性と見なしてリステリアモノサイトゲネスがないことと判断した。
【００８２】
具体的に、リステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０を試料として適用させた結果が図５ａに示されている。ストリップ１ないし７はそれぞれｐ６０を１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６０ｎｇ、３０ｎｇ、１５ｎｇ使用した結果であり、ストリップ８は陰性対照群である。一方、陰性対照物としてｐ６０の代りにリステリアモノサイトゲネス(ストリップ０)及び多様な菌株(ストリップ１ないし１２)の培養上澄液を試料で適用させた結果が図５ｂに示されている。ストリップ１ないし１２はそれぞれストレプトコックスピオゲネス(Streptococus pyogenes)、Shigella flexneri、スタヒロコッカスオーリアス(Staphylococcus aureus)、Pseudomonas aeruginosa)、Klebsiella pneumoniae、Enterococcus faecalis、エシェリキアコライ(Escherichia coli)、エンテロバクターアエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio cholerae、スタヒロコッカスエピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、Salmonella typhi)を使用した。
【００８３】
組換えｐ６０及びリステリアモノサイトゲネスの培養上澄液の場合捕獲線にバンドが発生したが、陰性対照群の上澄液の場合は捕獲線にいずれのバンドが発生しなかった。従って、前記製造されたディップスティックがｐ６０だけを選別的に認知できることを確認した。
【００８４】
前述した結果から、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７の対がリステリアサイトゲネスのｐ６０を選別的に認知するディップスティックに望ましく適用できる。
【００８５】
また、図1ａにおいて使用されたポリクローナル抗体(ラビット)も２次抗体として使用できる。
本実施例に用られた試験方法は次の通りである。
【試験例１】
【００８６】
: サンドイッチＥＬＩＳＡ試験
１．リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体(ｐ６００７またはｐ６０１７)を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌに分注し３７℃で２時間３０分間インキュベーションした。
２．０．０５％ Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
３．１％ＢＳＡを１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションして遮断した。
４．０．０５％ Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
５．抗原を各ウェルに１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。具体的に、ブランクの場合０．１％ＢＳＡを分注し、陽性対照群の場合リステリアモノサイトゲネスから組換えｐ６０を１００ｎｇ/ウェルになるよう分注し、試験菌株の場合５ｍｌのＢＨＩ(brain hert infusion;DIFCO社)肉汁培地で１８時間３７℃で培養した後ＢＨＩ肉汁培地を遠心分離(３０００ｒｐｍ、１５分)してその上澄液を各ウェルに分注した。
６．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
７．ポリクローナル抗体(ラビット)またはモノクローナル抗体を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
８．ＨＲＰ(horse radish peroxidase)-結合抗ラビット抗体(ＰＢＳＴで１:１０００に稀釈)を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベーションした。
９．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを５回ずつ洗浄した。
１０．発色試薬緩衝溶液９．４５ｍｌと４％ＯＰＤ(ｏ-フェニレンジアミン)０．５ｍｌとＨ２Ｏ２ ０．０５ｍｌを混合した発色試薬を製造して各ウェルに１００μｌずつ分注し常温で２０分間インキュベーションした。
【００８７】
【表１】
【００８８】
１１．停止溶液８Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに１５μｌずつ分注した。
１２．４９２ｎｍでＯＤ値を測定した。
【試験例２】
【００８９】
:直接的ＥＬＩＳＡ試験
１．抗原を各ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間３０分間インキュベーションした。
２．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
３．１％ＢＳＡを１００μｌ分注し３７℃で１時間インキュベーションして遮断した。
４．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
５．抗体または１％ＢＳＡ(ブラック)を各ウェルに１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
６．ＨＲＰ-結合抗マウス抗体またはＨＲＰ-結合抗ラビット抗体(ＰＢＳＴで１０、０００で稀釈)を１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
７．発色試薬緩衝溶液９．４５ｍｌと４％ＯＰＤ(ｏ-フェニリンジアミン)０．５ｍｌとＨ２Ｏ２ ０．０５ｍｌを混合した発色試薬を各ウェルに１００μｌずつ分注し常温で２０分間インキュベーションした。
【００９０】
【表２】
【００９１】
８．停止溶液８Ｎ Ｎ２ＳＯ４を各ウェルに１５μｌずつ分注した。
９．４９２ｎｍでＯＤ値を測定した。
【試験例３】
【００９２】
: ウェスタンブロット試験
１．リステリア種をＢＨＩ肉汁培地で一晩中３７℃で培養して得た上澄液２５０μｌとブリリアントブルーＲ(brilliant blue R)を染料として使用したサンプル緩衝液(Ｘ６)５０μｌをよく混合してお湯に５分間浸した後そのうち２０μｌを取って１２％スルフェイト-ポリアクリレートゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルにローディングした。
２．電気電気泳動が完了された後４℃で一晩中ＮＣ(ニトロセルロース)膜に移動させた。
３．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
４．常温で１時間５％脱脂牛乳で遮断した。
５．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
６．ニトロセルロース膜を常温で１時間１０ｍｌの５％脱脂牛乳に抗体１０μｌを混合した溶液に浸漬した。
７．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
８．ニトロセルロース膜を常温で１時間HRP-結合された抗-マウス抗体またはＨＲＰ-結合された抗ラビット抗体(５%脱脂牛乳で１:１０、０００で稀釈)１０ｍｌに浸漬した。
９．SuperSignal（登録商標）WestPico Chemiluminescent Substrate(PIERCEキット)を使って発光させ化学発光計で発光を測定した。
【試験例４】
【００９３】
: ディップスティック試験
１．金粒子(gold particle; ４０ｎｍ)に結合させるｐ６００７モノクローナル抗体の最適濃度を決定してからコロイド状金に適した濃度の抗体を入れ３０分間室温で回転させながら反応させた。３０分後、ＢＳＡを入れ４℃で一晩中反応させた。４℃で１００００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、上澄液を用心深く捨てて金パレットを最初体積の１０分の１程度に浮遊させた。このようにｐ６００７モノクローナル抗体が結合された金粒子を４２０ｎｍで吸光度が１になるよう調節して接合パッドに噴射した後、接合パッドを６０℃で真空状態で１時間乾燥させた。乾燥してから使用前までは絶対湿度(ＲＨ)３０％以下で保管した
２．ニトロセルロース膜に捕獲抗体及び対照抗体処理を施した。捕獲抗体としてリステリア種に特異的なモノクローナル抗体ｐ６０１７をニトロセルロース膜１ｃｍ当り１μｇを分注し、対照抗体として濃度が１ｍｌ当り１ｍｇである抗-マウスＩｇＧをニトロセルロース膜１ｃｍ当り１μｇになるよう分注した。処理された膜を３７℃で一晩中乾燥させた後、使用前まで絶対湿度(ＲＨ)３０％以下で保管した。
３．サンプルの適用に適した条件のためサンプルパッドを適した緩衝溶液で遮断した。６０℃で１時間乾燥させてから、使用前まで絶対湿度３０％以下に保管した。
４．前記で用意されたパッドを接合パッドに連結させた後サンプルスクリーニングに使用した。
５．リステリア増菌培地で一晩中増菌し１ｍｌを取って３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上澄液を１０分間沸してサンプルとして使用した。
６．前記で用意されたサンプル１００μｌをサンプルパッドに滴下した後５分後に判読した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することによりこのような抗体を使って人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１ａ】図１ａは、ポリクローナル抗体(ラビット)を使って多様なリステリア種について直接的ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図１ｂ】図１ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を使って多様なリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図１ｃ】図１ｃは、モノクローナル抗体ｐ６０１７を使って多様なリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ａ】図２ａは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてポリクローナル抗体(ラビット)を使って直接的ＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ｂ】図２ｂは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてモノクローナル抗体ｐ６００７を使ってサンドイッチＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ｃ】図２ｃは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてモノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってサンドイッチＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図３ａ】図３ａは、モノクローナル抗体ｐ６００７の量を変化させながらリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を使ってリステリア菌株以外の他の菌株についてサンドイッチＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図４ａ】図４ａは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体ｐ６００７及びモノクローナル抗体ｐ６０１７によるｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチド認知有無を直接的ＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を捕獲抗体として使用し、第２抗体としてポリクローナル抗体を使ってｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証したグラフである。
【図４ｃ】図４ｃは、モノクローナル抗体ｐ６００７を捕獲抗体として使用し、第２抗体としてモノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証したグラフである。
【図５ａ】図５ａは、組換えｐ６０を試料として適用させたリステリアディップスティックの展開を示す写真である。
【図５ｂ】図５ｂは、陰性対照物としてｐ６０の代りにリステリアモノサイトゲネス(ストリップ０)及び多様な菌株(ストリップ１ないし１２)の培養上澄液を試料として適用させたリステリアディップスティックの展開を示す写真である。
【図６ａ】図６ａは、リステリアモノサイトゲネスｐ６０およびListeria innocua ｐ６０に対するモノクローナル抗体ｐ６００７の親和力についてのウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法の結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、リステリアモノサイトゲネスｐ６０およびListeria innocua ｐ６０に対するモノクローナル抗体ｐ６０１７の親和力についてのウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列１はプライマーである。
【００９７】
配列２はプライマーである。
【００９８】
配列５は対照ペプチドである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はリステリアモノサイトゲネスによる感染有無及び食品における汚染有無を迅速に確認するためのもので、リステリアモノサイトゲネスｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ細胞、このようなモノクローナル抗体を含む試験キット及びこのようなモノクローナル抗体を使ってリステリアモノサイトゲネスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア(Listeria)の菌種はグラム陽性の通性嫌気性桿菌として自然界に幅広く分布している。リステリア種(Listeria spp.)にはリステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、Listeria ivanovii、Listeria innocua、Listeria seeligeri、Listeria welshimeri及びリステリアグライイ(Listeria grayi)などの多数の種があり、このうちリステリアモノサイトゲネスだけがヒトに病原性があり、動物に病原性のある菌株はリステリアモノサイトゲネスとListeria ivanoviiである。
【０００３】
特に、リステリアモノサイトゲネスは冷蔵保存を要する食品に汚染される場合低温保存
過程で長い間生存及び増殖が可能なので、冷蔵保存食品を媒介にした食中毒発生の主な原因菌になっている。さらに、この細菌によるリステリア感染症(Listeriosis)は重症に進む場合敗血症及び脳髄膜炎を引き起こし姙産婦の流産を引き起こす。新生児、高齢者、姙産婦及び免疫欠乏患者が特に危険であり、感染症を引き起こした患者では３０％に至る高い死亡率を示す。このようなリステリア感染症の発生は食肉及び食肉加工品、野菜、乳化工品などのような食品が主要感染経路であると知られている。従って、リステリア症を予防するためにリステリアモノサイトゲネスによる食品の汚染有無を迅速に診断する必要がある。
【０００４】
現在、病院及び産業体(食品会社、食肉会社及び乳加工会社)などで使用できるリステリア同定方法としては色々の生化学的検査法を使用する伝統的な方法があるが、長時間と手間がかかる非効率的な方法である。
【０００５】
リステリアモノサイトゲネスによる感染有無及び食品における汚染有無を迅速に確認するための診断方法として重合酵素連鎖反応(ＰＣＲ)法のような分子生物学的方法が用いられているが、技術力と精度が求められるため、実際臨床及び産業的に適用し難い方法である。また、酵素免疫法(EIA:Enzyme immunoassay)のような免疫学的方法が多用されているが、非特異性が現れるので不正確な検査結果が得られたり、追加確認試験が必要な場合が発生する。
【０００６】
リステリア菌を迅速に検出するためのキットとしては、ＰＣＲ技法、核酸ハイブリッド化分析法を用いた非放射活性DNAプローブキット、免疫検定法を用いたキットなどが知られており、また免疫クロマトグラフィ法を用いたディップスティック(dip-stick)方法で開発された製品もあるが、これらキットの全てはリステリアモノサイトゲネスだけを特異的に検出できないか、全てのリステリア種が検出される短所を持っている。
【０００７】
リステリアモノサイトゲネスに対するモノクローナル抗体の生産が困難だったので、前記菌株を選択的に認知するモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡまたはディップスティック検出キットが開発できなかった。これは、リステリアモノサイトゲネス菌株全体を抗原として使用したり一部特定抗原を使用した場合もリステリアモノサイトゲネスについてだけ特異なモノクローナル抗体が生産されなかったためである。
【０００８】
リステリア種(Listeria spp.)に共通に存在するmurein hydrolases酵素であるｐ６０はリステリアが細胞分裂のために分泌するエッキソ(exo)酵素であって、本発明の前、ｐ６０の特定ペプチド、例えばｐｅｐＡ及びｐｅｐＤ（非特許文献１）を使ってポリクローナル抗体を製造したことがある。しかし、これは使用可能なポリクローナル抗体の低い力価とサンドイッチＥＬＩＳＡシステムの不適切な適用によりその効果が微弱なので商用化するには足りない点があった。本発明者は前記ｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチド部位と他の部位に特異的に結合して(実施例４、図４ａ)リステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知できる新規なモノクローナル抗体を製造した。
【０００９】
このような背景下で、本発明者はリステリア属(genus)に共通に存在するmurein hydrolases酵素ｐ６０のうちリステリアモノサイトゲネスのｐ６０の特異的抗原決定基を認知するモノクローナル抗体を製造した。
【非特許文献１】Bubert A.et al.,Appl. Environ Microbiol、６０(９)、３１２０-７、１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体及び受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリア種(Listeria spp.)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００１１】
本発明の他の目的は前記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出するための試験キットを提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タン
パク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体の存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の試験キットは、望ましくはＥＬＩＳＡ用キットまたは免疫クロマトグラフィを
用いたディップスティックである。
【００１５】
前記試験キットにおいて、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体は望ましくはリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００１６】
前記検出方法において、抗原-抗体複合体は、望ましくはＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、色彩粒子結合法または化学発光物質結合法で検出する。
【００１７】
前述した検出方法において、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体は望ましくはリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することにより、抗体を使用して人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に検定しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明はリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するモノクローナル抗体に関する。
【００２０】
具体的に、一つの形態として本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００２１】
また、本発明は受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞により生産される、リステリア種(Listeria spp．)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００２２】
本願において使用された用語"モノクローナル抗体"とは、当該分野に公知の用語であって、単一抗原性部位について指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常、相異なる決定基(エピトープ)について指示される相異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは違って、モノクローナル抗体は抗原状の単一決定基について指示される。モノクローナル抗体は抗原-抗体結合を用いる診断及び分析学的分析法の選択性と特異性を改善させる長所があり、またハイブリドーマ培養により合成されるため、他の免疫グロブリンにより汚染されない他の長所を有する。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体はｐ６０を免疫原にして動物を免疫化した後、免疫化された動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質と特異的に結合するハイブリドーマを選別してこれより製造した抗体である。
【００２４】
具体的に、本発明ではモノクローナル抗体製造に組換えｐ６０タンパク質を免疫原として使用したし、これは公知の塩基配列(Andreas B．、et al．、J．Bacteriol．、１７４:８１６６-８１７１、１９９２)を用いて当分野の通常の方法におりＰＣＲ増幅産物をｐＥＴ-２１ａベクトルに挿入し、このベクトルをEscherichia coliで発現させ精製して製造した。精製された組換えｐ６０タンパク質を免疫原としてマウスを免疫化させ、これより脾臓細胞を分離した後骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３と融合させた後ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験でｐ６０タンパク質について抗体活性が高いハイブリドーマを選別した後、これを再び培養して再びＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験で陽性ハイブリドーマｐ６００７及び６０１７を選別した。前記ハイブリドーマの培養上澄液を使用したＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験結果、ハイブリドーマｐ６００７だけがリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知した。前記選別したハイブリドーマを動物腹腔内に注入し、注入後一定期間が経過した後回収した動物の腹水からモノクローナル抗体を分離した。
【００２５】
精製されたモノクローナル抗体を使ってサンドイッチ及び直接的ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット試験を通してそれぞれのモノクローナル抗体を糾明した。本願において使用された用語"モノクローナル抗体ｐ６００７"はハイブリドーマｐ６００７により分泌されるモノクローナル抗体であり、用語"モノクローナル抗体ｐ６００１７"はハイブリドーマｐ６０１７により分泌されるモノクローナル抗体である。
【００２６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験結果、モノクローナル抗体ｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知するモノクローナル抗体と判明されたし、モノクローナル抗体ｐ６０１７はリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体として判明された(図１)。
【００２７】
前述したようにリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することと確認されたモノクローナル抗体ｐ６００７及びリステリア種を選別的に認知することと確認されたモノクローナル抗体ｐ６０１７は食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株の全てを選別的に認知した(図２ｂ及び図２ｃ)。
【００２８】
また、本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７がｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチドを認知するか否かを直接的ＥＬＩＳＡで試験した。本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７はｐｅｐＡ及びｐｅｐＤと結合しなかったし、これより本発明のモノクローナル抗体はｐｅｐＡ及びｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された(図４ａ)。ｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争(competition)をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証した場合も、モノクローナル抗体ｐ６００７がｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いるとすればｐｅｐＡとｐｅｐＤの添加量変化によりＯＤ値が変わるべきであるが、ペプチド添加量の変化について差がなく飽和されたＯＤ値を示したため、モノクローナル抗体ｐ６００７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを利用しないことと確認された(図４ｂ及び図４ｃ)。
【００２９】
本発明のリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７を生産するハイブリドーマｐ６００７はＫＣＴＣ(Korean Culture for Type Cultures)に２００３年２月２１日付けにて受託番号ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰとして寄託され、リステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６０１７を分泌するハイブリドーマｐ６０１７はＫＣＴＣに２００３年２月２１日付けにて受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰとして寄託された。
【００３０】
従って、他の様態として本発明はモノクローナル抗体ｐ６００７を生産するハイブリドーマｐ６００７(ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰ)に関する。また、本発明はモノクローナル抗体ｐ６０１７を生産するハイブリドーマｐ６０１７(ＫＣＴＣ １０４３２ＢＰ)に関する。
【００３１】
本発明に係るモノクローナル抗体ｐ６００７は、標準菌株の免疫学的検定で接近可能な抗原決定因子との反応性に加えて、食品から分離されたリステリアモノサイトゲネスについても高い特異性と感度を有するのでリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するのに適している。
【００３２】
従って、さらに他の様態として本発明はリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６００７を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体存在を調べることにより、リステリアモノサイトゲネスの汚染を検出する方法に関する。
【００３３】
本願において使用された用語"抗原-抗体複合体"は試料中のリステリアモノサイトゲネスの存否を確認するためのｐ６０タンパク質抗原とこれを認知するモノクローナル抗体の結合物を意味する。
【００３４】
本発明の検出方法では試料サンプルとして５ないし１５分間加熱した培養上澄液を使用
する。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７とリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質との抗原-抗体複合体の検出は当業界において公知の方法、例えば分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、吸光的、化学的、その他の方法を用いられる。
【００３６】
本発明の目的上、抗原-抗体複合体の検出方法としては、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、化学発光物質結合法などが望ましく用いられる。
【００３７】
抗原-抗体複合体の検出は直接的または間接的に標識された抗体の使用を伴い、使用可能な検出標識としては、例えばバイオチン-ストレプトアビジン結合体、蛍光染料(例:フルオレセイン、テキサスレッド、ロダミン、グリーン蛍光タンパク質など)、放射性標識物(例:３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ)、酵素(例:ＨＲＰ、アルカリ性フォスファターゼ及びその他ＥＬＩＳＡで一般に使われるもの)、及び色彩標識物、例えばコロイド状金またはカラーガラスまたはプラスチック(例:ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズを含む。このような標識物の使用を記述している文献[U．S．Pat．Nos．３、８１７、８３７;３、８５０、７５２;３、９３９、３５０;３、９９６、３４５;４、２７７、４３７;４、２７５、１４９;and ４、３６６、２４１;Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed．、Molecular Probes、Inc．、Eugene Oreg．)]を参照する。
【００３８】
本発明において抗原-抗体複合体の検出に特に望ましい方法はＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ検出方法により、試料サンプルは固体支持体、例えばマイクロタイタープレート、メンブレイン、テストストリップなどにコーティングされた本発明のモノクローナル抗体と接触される。具体的な一例として、マイクロタイタープレートのウェルを本発明のモノクローナル抗体でコーティングし、占有されない(nonoccupied)結合部位を例えばＢＳＡで遮断した後、コーティングされたプレートのウェルを試料サンプルとインキュベーションし、次いで抗原-抗体複合体の存在を決定できる。抗原-抗体複合体の存在は抗原-抗体複合体の抗原について特異的な抗体、例えばリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用したり、リステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使って確認できる。前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は検出標識を有することができ、検出標識を有しない場合これらモノクローナルまたはポリクローナル抗体を検出できるもう一つの抗体を処理して確認できる。
【００３９】
本発明の検出方法において、リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７と結合された抗原に結合する第２抗体としては望ましくはリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体が使用でき、特にｐ６０１７が望ましい。
【００４０】
一つの例として、モノクローナル抗体ｐ６００７と試料を反応させ、次いでリステリア種のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６０１７を結合させこれより検出標識信号を測定したり、これら複合体に検出可能な信号を生成できる標識を有する抗体を添加してこれより検出標識信号を測定してリステリアモノサイトゲネスを検出できる。
【００４１】
また、本発明において抗原-抗体複合体の検出に特に望ましい他の方法としてはモノクローナル抗体をコロイド状金粒子と結合させる金粒子結合法が挙げられる。
【００４２】
他の様態として、本発明は前述したようなリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体ｐ６００７を含む、リステリアモノサイトゲネスの汚染を検出するための試験キットに関する。
【００４３】
本発明のリステリアモノサイトゲネスの検出試験キットに使用されるモノクローナル抗体は、この抗体がリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知できる限り、モノクローナル抗体の断片も使用できる。このような抗体断片はF(ab')２、Fab、Fab'、Fv断片などを含める。
【００４４】
本発明のリステリアモノサイトゲネス検出試験キットにはリステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７またはその断片及び免疫学的分析に使用される道具/試薬が含まれる。
【００４５】
免疫学的分析に使われる道具/試薬としては適した担体、検出可能な信号を生成できる標識、溶解剤、洗浄剤などが含まれる。また、標識物質が酵素の場合は酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含める。
【００４６】
適した担体としては、これに限られないが、可溶性担体、例えば当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳ、不溶性担体、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合わせでありうる。
【００４７】
本発明の検出方法及びキットに使用するための検定システムはこれに限られないが、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティックデバイス、免疫クロマトグラフィ試験ストリップ及び放射分割免疫検定デバイス、及びフロー-スロー(flow-through)デバイスなどを含む。
【００４８】
本発明のリステリアモノサイトゲネス検出のための試験キットは望ましくはＥＬＩＳＡキットまたは免疫クロマトグラフィを用いたディップスティックである。
【００４９】
本発明の試験キットで、リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体ｐ６００７と結合された抗原に結合する第２抗体としては、望ましくはリステリア種を選別的に認知するモノクローナル抗体が使用でき、特にモノクローナル抗体ｐ６０１７が使用できる。
【００５０】
本発明は下記の実施例に基づきさらに具体的に説明する。しかし、例示された実施例はただ本発明を説明するためのものであり、本発明はこれに限られない。
【実施例１】
【００５１】
: ＰＣＲ及びクローニング
リステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質のｉａｐ(invasion-associated prote
in)遺伝子(Andreas、B．et al．、J．Bacteriol．、１７４:８１６６-８１７１、１９９２)をクローニングするために先にこの遺伝子をＰＣＴを通して増幅した。
【００５２】
プライマー、すなわちｉａｐ-Ｆ-ｐＥＴ(５'-GGG AAT TCC ATA TGA GCA CTG TAG TAG TCG AAG CT-３')(配列１)及びｉａｐ-Ｒ-ｐＥＴ(５'-GCC GCT CGA GTA CGC GAC CGA AGC CAA C-３')(配列２)をシグナル配列を除いた全ての部分が含まれるようにデザインしたし、ｐＥＴ-２１ａベクトルの特性によりストップコドンも除外した。また、クローニングのために順方向プライマーにはＮｄｅＩ、逆方向プライマーにはＸｈｏＩ制限酵素部位を添加した。ＰＣＲは全体ボリュームを５０μｌにしたし、リステリアモノサイトゲネスの染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、１０×ｆｕ緩衝液(Stratagene)５μｌ、クローニングされたＰｆｕポリマラーゼ１Ｕ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーを配合してＰＣＲした。さらに高い信頼度(fidelity)のため、Ｐｆｕポリマラ-ゼ(Stratagene)を使用した。ＰＣＲはＰＴＣ-１５０(MJ Research)を使って３０サイクル間９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分の条件にした。
【００５３】
ＰＣＲ完了後、ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製した。精製されたＤＮＡはクローニングのためにＮＥＢ緩衝液４(New England Biolabs))で制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩ(New England Biolabs)を処理した。制限酵素処理後、１％アガロースゲルで電気泳動しGenecleanスピンキット(Q-bio gene)を用いてＤＮＡを精製した。精製された挿入ＤＮＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理したｐＥＴ-２１ａベクトルとＴ４ＤＮＡ結合緩衝液でＴ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)で結合してイー・コライ（Ｅ.Ｃｏｌｉ）ＤＨ０ｂにエレクトロポレーションした。クローニング有無はプラスミドスピンキット(Genenmed)でミニプレップして確認した。
【００５４】
ｐＥＴシステムの発現のためにクローニングされたベクトルを発現菌株イー・コライＢＬ２１で形質転換し再びミニプレップを介して確認した。クローニングされたイー・コライをプレートで一晩中大きくした後、一つのクロニーを５ｍｌ ＬＢａｍｐ肉汁培地に接種して約ＯＤ６００が１．０日まで培養した。この培養液５ｍｌを新たな５００ｍｌ ＬＢ ａｍｐ肉汁培地に加え２ないし３時間培養してＯＤ６００が０．５ないし１．０になればＩＰＴＧを１ｍＭされるよう加えてタンパク質の発現を誘導した。２０℃で一晩中誘導した後、培養液を遠心分離して上澄液を捨てて、イー・コライだけを得た。以後のタンパク質精製はHis・Bind精製キット(Novagen)を使って行なった。細胞パレットを１/２５体積の緩衝液(０．１％Triton Ｘ-１００、５０ｍＭ ｐＨ８．０Tris-HCl)に浮遊させた後、リソザイム０．１ｍｇ/ｍｌ(Sigma)を入れ超音波処理してイー・コライを壊した。再び２７０００ｘｇで３０分間遠心分離した後、充填緩衝液でＮｉイオンを充填させ予め用意されたＮＴＡ-キレート化アガロースＣＬ-６Ｂ(Peptron)カラムにこの上澄液を通過させた。タンパク質が吸着されたカラムを１０倍カラム体積の結合緩衝液(５ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭｐＨ７．９ Tris-HCl)と６倍体積の洗浄緩衝液(６０mMイミダゾル、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｐＨ７．９Tris-HCl)で非特異的に吸着されているタンパク質を除去した。最後に、溶出緩衝液(１ｍＭイミダゾル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭｐＨ７．９Tris-HCl)でカラムに結合されたｐ６０を分離した。得られたｐ６０をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを通して確認した。
【実施例２】
【００５５】
: ハイブリドーマ細胞製造
２-１: 抗体生成細胞
実施例１で製造したｐ６０タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥ(polyacrylamide gel electrophoresis)が含まれたゲルで電気電気泳動し(１００μｇ)、ゲルの断片を切った後同じ体積の完全フロイントアジュバントが配合されたエマルジョンを製造した。前記エマルジョンを生後７週齢雌ＢＡＬＢ/Ｃマウス５匹の腹腔内に注射した。１匹当たり２０μｇの抗原を注射し、総体積は４００μｌにした。２週後に不完全フロイントアジュバントと抗原を混合したエマルジョンを前記マウスの腹腔に注入した後、２週間後ＰＢＳに溶かした抗原を(１０μｇ/mouse)腹腔内に注射して抗体生成を誘導した。抗体生成有無を確認するためにＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット検定を施して抗体を確認した後、細胞融合に入る３日前にマウスの尻尾静脈にＰＢＳに溶かした抗原を再度注射した。汚染を防止するために全てのマウスを選択した領域で飼育した。
２-２: 抗体生成細胞の確認及び選別
前記方法により免疫化されたマウスで血液試料を目(eye ball)から取得して１．５ｍｌ遠心分離チューブに入れて血清を遠心分離して(１８００ｒｐｍ、１０分)抗体の生成有無を実験する前まで-２０℃で保管した。
【００５６】
ｐ６０タンパク質でＥＬＩＳＡ方法により抗体の生成を確認した後抗体生成細胞に対する融合に着手した。前記イー・コライで発現させたｐ６０タンパク質を０．５μｇ/ウェルで９６-ウェルプレートにコーティングした後一晩中反応させた。ＰＢＳＴ(PBS buffer、０．０５％ Tween２０)で３次洗浄した後１％ＢＳＡで反応を終了した。再びＰＢＳＴで３次洗浄した後血清を１:５００ないし２０００まで稀釈して処理した後１時間反応させた。ＰＢＳＴで３次洗浄した後、抗マウスＩｇＧ結合ＨＲＰを処理し１時間反応させた。次いで、ＰＢＳＴで３次洗浄した後、１００μｌＯＰＤ(Sigma)を処理した後２０分間発色させた。１５μｌ反応終了溶液(８Ｎ硫酸)を添加した後、４９２ｎｍ波長で吸光度を測定した。
２-３: ハイブリドーマ細胞製造
抗体生成が確認された後マウスを犠牲させ抗体生産脾臓細胞を分離し、これと骨髄腫細胞(myeloma cell)Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を融合方法(Cesar Milstein and Georges Kohler's method)から由来した変形された方法(Method in enzymology、vol．７３、 p３．Academic Press、New York)により融合した。
【００５７】
マウスのＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を培養トレイに１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて最適成長期に至るよう維持させた。細胞融合の一日前にＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を３・１０５細胞/ｍｌで稀釈して次の日５０ｍｌを取って３分間４００ｘｇで遠心分離した。無血清培地で２回洗浄した後、１・１０７細胞/ｍｌになるよう濃度を合わせた。次いで、マウスを頚椎離脱(cervical dislocation)により犠牲させ脾臓を取得し、これをメッシュ容器に入れ細胞を一つずつ分離させた。この際、全ての培地は無血清で使用した。完全に分離された抗体生産細胞を５分間４００ｘｇで遠心分離した後、無血清培地で２回洗浄し１０ｍｌの培地に懸濁させた。リンプ球を血球計数器(haemocytomer)で計数して１０８のリンプ球を１×１０７Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞(１０:１)と混ぜて３分間４００ｘｇで遠心分離した。３７℃で前処理された５０％ＰＥＧ(Sigma)１ｍｌ溶液を１分にかけてゆっくり滴下しつつ混ぜた。生成された融合混合液をＲＰＭＩ１６４０培地で４ｍｌ/３分、次いで５ｍｌ/４分、次いで２０ｍｌ/５分にかけて稀釈し３分間４００ｘｇで遠心分離した後、ＨＡＴ選択培地３５ｍｌに細胞を懸濁させた。１００μｌの懸濁液を一日前に供給細胞(feeder cell、マウスの腹腔でＰＢＳで分離した大食球)をコーティングした９６-ウェルプレートに分注して３７℃、 ５％ＣＯ２培養器で７ないし１４日間培養した。
２-４: ハイブリドーマの選別及び分離
前記実施例で収得した培養上澄液を取って直接的ＥＬＩＳＡ方法でｐ６０に対する陽性クローンを選別した後、ウェスタンブロットで陽性クローンであることを再び確認した。多数のハイブリドーマのうちｐ６０タンパク質について抗体活性が高い(ＯＤ１．２以上)１０種のハイブリドーマ細胞を得た。
【００５８】
このように確認された陽性クローンを一連の過程で稀釈して一つの融合細胞を９６-ウェルプレートの１ウェル当たり０．５細胞ずつ分注して７日間培養した後、ＥＬＩＳＡとウェスタンブロットで検証した。これより最終陽性クローンを検証して抗体の性質と認知部位によりｐ６００７、ｐ６０１３、ｐ６０１７、ｐ６０３０及びｐ６０３３を分離した。最終的に検証された融合細胞を２４-ウェルに移して規模を少しずつ大きくしてＴ２５フラスコに最終的に移転させ分離培養した。
【００５９】
選別されたｐ６０タンパク質抗体を生産するハイブリドーマのうちハイブリドーマｐ６００７及びｐ６０１７をＫＣＴＣ(Korean Collection for Type Cultures、韓国大田広域市儒成区魚隠洞５２番地)に２００３年２月２１日付けにてそれぞれＫＣＴＣ １０４３１BP及びＫＣＴＣ １０４３２ＢＰとして寄託した。
【実施例３】
【００６０】
: 抗体生産及び分離
前記実施例２で得られた各抗体別陽性クローンを用いてマウス腹腔培養液を製造し、これより抗体を分離した。各抗体別に生産ハイブリドーマ細胞が違うだけ、腹腔培養液製造及び分離方法は同様に行なった。
【００６１】
前記実施例２で区別された抗体の腹腔培養液を得るため、ＥＬＩＳＡ方法及びウェスタンブロット方法で確認されたモノクローナル抗体をそれぞれ生成する陽性クローン３・１０６細胞を１週間前にプレスチンを予め処理したＢＡＬＢ/Ｃマウスの腹腔内に注射した。１０ないし１５日後に３ないし１０ｍｌの腹水を抽出した。モノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７の両方同一な方法で製造したし、但し最終検証段階で五つに分かれており、それぞれの抗体を作るために独立的に腹腔培養液を収得したし、各抗体を含む腹腔培養液から抗体の分離を次のような方法で行なった。
【００６２】
前記得た腹水をタンパク質Ａ親和性カラム(Amersham Bioscience、HiTrap rProtein A FF)を通じて精製した。すなわち、タンパク質Ａカラムを１０倍体積のＤＰＢＳで１ｍｌ/分の速度で均質化させてから腹水を通過させた。この際速度はＡＫＴＡ精製器(AmershamBioscience)により１ｍｌ/分で通過させ、溶出は１００ｍＭグリシン(ｐＨ３．０)で行なった後、１/１０倍量の２Ｍ Tris(ｐＨ８．０)で中性化させた。この際、溶出速度は１ｍｌ/分にしてそれぞれの抗体を精製及び分離した。
【実施例４】
【００６３】
: モノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験
前記実施例３において分離されたモノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７についてＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを行ない、これら抗体が公知のペプチドｐｅｐＡ(Ser-Thr-Pro-Val-Ala-Pro-Thr-Gln-Glu-Val-Lys-Lys)(配列３)及びｐｅｐＤ(Gln-Gln-Gln-Thr-Ala-Pro-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu)(配列４)を認知するのかを観測した。
【００６４】
捕獲抗体としてポリクローナル抗体１００ｎｇを使用した直接的ＥＬＩＳＡ分析結果、総１９個のリステリア菌のうち一つのリステリアグレイを除いたリステリア菌種の全てを検出するポリクローナル抗体がリステリアモノサイトゲネスを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡで第２抗体として使用可能であることを確認した(図１ａ)。また、ポリクローナル抗体を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にリステリア菌のうちリステリアグライイを除いたリステリア菌種の全てを検出することを確認した(図１ａ)。
【００６５】
捕獲抗体として２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７を使用し、第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ分析結果、総１９個のリステリア菌のうちリステリアモノサイトゲネスを除いた６個のリステリア菌はブランクのＯＤ値が０．３に似た水準であり、１３個のリステリアモノサイトゲネスの場合ＯＤ値が０．９以上水準であった。このような結果からモノクローナル抗体ｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスを特異的に検出するのに適していることが確認された(図１ｂ)。また、モノクローナル抗体ｐ６００７を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にステリア菌のうちリステリアモノサイトゲネス菌株だけを検出することを確認した(図１ｂ)。
【００６６】
また、捕獲抗体としてリステリア菌種の全てを検出する２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６０１７を使用し、第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ分析結果、ｐ６０１７のモノクローナル抗体はListeria grayi、Listeria welshimeri、Listeria innocua、Listeria ivanovii、リステリアモノサイトゲネス、Listeria seeligeriの全てを検出した(図１ｃ)。このような結果はｐ６０１７がｐ６００７に対する第２抗体として適していることを示す。また、モノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様にモノクローナル抗体ｐ６０１７はリステリアモノサイトゲネスだけではなくListeria ivanoviiまでも検出したので、ｐ６００７に対する第２抗体として適していることを確認した(図１ｃ)。
【００６７】
また、食品から分離された総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株について捕獲抗体としてポリクローナル抗体１００ｎｇを使用した直接的ＥＬＩＳＡ分析結果、総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌を全て検出したため、図１ａのようにポリクローナル抗体がリステリアモノサイトゲネスを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡに第２抗体として使用できることを確認した(図２ａ)。また、ポリクローナル抗体を使ってウェスタンブロット検定した結果、同様に全てのリステリアモノサイトゲネス菌の全部を検出することを確認した(図２ａ)。
【００６８】
そして、捕獲抗体として２００ｎｇのｐ６００７とｐ６０１７及び第２抗体として１００ｎｇのポリクローナル抗体を使用し、食品から分離された総３３個のリステリアモノサイトゲネス菌株をＢＨＩ肉汁培地で３７℃で一晩中培養した後遠心分離(３０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ)し、その上澄液をお湯に１０分間処理した菌液を１００μｌ/ｗｅｌｌずつ接種して行なったサンドイッチＥＬＩＳＡ分析した結果、食品菌株の全てについて陽性であり、１００％の感度と特異性を示した(図２ｂ及び図２ｃ)。このようなデータはｐ６００７とｐ６０１７の特徴的な能力をもう一度確認している。
【００６９】
また、ｐ６００７とｐ６０１７との間に存在する親和力または相違点を調べるためにウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法を行なった。図６ａに示したように、ｐ６００７はリステリアモノサイトゲネスｐ６０の少量、５ｎｇであっても容易く検出したが、Listeria innocua ｐ６０については５ｎｇの１０倍になる５０ｎｇを添加してこそやっと検出できた。５０ｎｇが添加された後リステリアモノサイトゲネスと Listeria innocua ｐ６０が結合された濃度結果を比較してみると、１００倍の差異があることが分かる。一方、図６ｂにおいてｐ６０１７はリステリアモノサイトゲネスと Listeria innocua ｐ６０との間にその効果の差異が大きくない。このようなデータは培地上澄液の典型的な濃度でｐ６００７がリステリアモノサイトゲネスｐ６０と他のリステリア種ｐ６０を区別できることを示す。
【００７０】
一方、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７がｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを認知するか否かを直接的ＥＬＩＳＡ方法で調べた。コーティング抗原としては１００ｎｇのリステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０、１００ｎｇのListeria innocuaの組換えｐ６０、５００ｎｇのｐｅｐＡ、５００ｎｇのｐｅｐＤ、５００ｎｇの陰性対照群ペプチドを使用し、捕獲抗体としては５００ｎｇのポリクローナル抗体、５００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７、５００ｎｇのｐ６０１７を使用した。その結果、図４ａに示したように、ポリクローナル抗体だけがｐｅｐＡと結合したし、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７の全てがｐｅｐＡ及びｐｅｐＤと結合しないので、クローン抗体ｐ６００７とｐ６０１７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された。
【００７１】
また、捕獲抗体として２００ｎｇのモノクローナル抗体ｐ６００７を使用し、サンプルとして１００ｎｇのリステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０を使用し、第２抗体として、図４ｂの場合ポリクローナル抗体を使用しつつそれぞれ１μｇないし１ｎｇのｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを陰性調節ペプチドを添加しペプチドGly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu(配列５)を対照ペプチドとして使用し、図４ｃの場合、ビオチニル化したモノクローナル抗体ｐ６０１７にそれぞれ１μｇないし１ｎｇのｐｅｐＡ及びｐｅｐＤを陰性調節ペプチドとして添加しペプチドGly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu(配列５)を対照ペプチドとして使用して、ｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争(competition)をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証した。その結果、モノクローナル抗体ｐ６００７がｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いるとｐｅｐＡとｐｅｐＤの添加量変化によりＯＤ値が変るべきであるが、図４ｂ及び図４ｃに示したようにペプチド添加量の変化について差異がなくて飽和されたＯＤ値を示したので、図４ａのようにモノクローナル抗体ｐ６００７はｐｅｐＡとｐｅｐＤのエピトープを用いないことと確認された。従って、サンドイッチＥＬＩＳＡキットに適用時モノクローナル抗体ｐ６００７及びｐ６０１７及びポリクローナル抗体はｐｅｐＡとｐｅｐＤをエピトープとして使用しないことと見られる。
【実施例５】
【００７２】
: リステリアモノサイトゲネス検出ＥＬＩＳＡキット
リステリアモノサイトゲネスを検出するためのＥＬＩＳＡ検定キットを製造するためにリステリアモノサイトゲネスに特異的なｐ６００７モノクローナル抗体とリステリア種に特異的なｐ６０１７モノクローナル抗体を用いた。
【００７３】
具体的に次のように行なった。
【００７４】
捕獲抗体として精製したｐ６００７モノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸塩緩衝溶液(ｐＨ９．６)に５μｇ/ｍｌで稀釈して１００μｌずつ９６ウェルプレート(０．５μｇ/well)に分注し一晩中４℃で反応させた。反応液を捨てて０．０５％Tween２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄した。
【００７５】
プレートの空いた空間を遮断するために０．０５％Tween２０と１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳ２００μｌを各ウェルに入れ３７℃で１時間反応させた後、再び３回洗浄した。
【００７６】
サンプルはリステリア増菌培地で一晩中増菌して１ｍｌを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を１０分間沸したものを使用した。遮断したプレートに用意されたサンプルを各ウェルに１００μｌずつ加えた。この際実験の有効性を評価するために陽性対照群と陰性対照群をともに施した。プレートを３７℃で１時間反応させた。反応液を捨てて、３回洗浄した。
【００７７】
２次抗体としてモノクローナル抗体ｐ６０１７を０．１％ＢＳＡが含まれたＰＢＳに１μｇ/ｍｌで稀釈して各ウェルに１００μｌずつ入れて３７℃で１時間反応させた。反応が終わった後、３回洗浄した。
【００７８】
吸光度を測定して、陽性対照群が１．５ないし２．０になり陰性対照群が０．１以下になれば正常的な反応と見做した。サンプルの値が１．５以上ならば陽性と見做し、リステリアモノサイトゲネスの菌を分離及び同定し、０．１以下になると陰性と見做してサンプルにリステリアモノサイトゲネスが汚染されないことと見なした。
【００７９】
捕獲モノクローナル抗体の量を相違にしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった結果が図３ａに示されている。具体的には、図３ａは捕獲抗体としてモノクローナル抗体ｐ６００７の量を２００ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、２μｇに変化させ行なったサンドイッチＥＬＩＳＡ結果を示す。この際、第２抗体としては１００ｎｇのビオチニル化したモノクローナル抗体ｐ６０１７の反応条件(検出標識物:ストレプトアビジン-ＨＲＰ)下で使用した。リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するｐ６００７を捕獲抗体として使用したのでリステリアモノサイトゲネスだけを検出したし、モノクローナル抗体ｐ６００７量が増加することによりＯＤ値が増加した。その結果によれば、サンドイッチＥＬＩＳＡキットに捕獲抗体ｐ６００７を５００ｎｇないし２μｇの量として使用した時高いＯＤ値を示した。
【００８０】
リステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知するものとして確認されたモノクローナル抗体ｐ６００７は、前記リステリア菌株以外の他の菌株、すなわちエスケリキア、エンテロコックス、エンテロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、スタヒロコッカス、ストレプトコックス、ビブリオ及びサルモネラ菌株は認知できなかった(図３ｂ)。
【実施例６】
【００８１】
: 免疫クロマトグラフィを用いたリステリアモノサイトゲネスの迅速診断
主要食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスを迅速にスクリーニングするための免疫クロマトグラフィを用いたディップスティックを製造するために、モノクローナル抗体ｐ６００７をコロイド状金(４０ｎｍ)と結合させ、モノクローナル抗体ｐ６０１７を捕獲抗体として使用し、抗マウスＩｇＧを対照抗体として使用した。対照線にバンドが発生すれば有効な実験として見なし、二つのバンド、すなわち捕獲線と対照線にバンドが生ずると陽性と見なし、リステリアモノサイトゲネス菌を分離及び同定し、対照線だけでバンドが発生すれば陰性と見なしてリステリアモノサイトゲネスがないことと判断した。
【００８２】
具体的に、リステリアモノサイトゲネスの組換えｐ６０を試料として適用させた結果が図５ａに示されている。ストリップ１ないし７はそれぞれｐ６０を１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６０ｎｇ、３０ｎｇ、１５ｎｇ使用した結果であり、ストリップ８は陰性対照群である。一方、陰性対照物としてｐ６０の代りにリステリアモノサイトゲネス(ストリップ０)及び多様な菌株(ストリップ１ないし１２)の培養上澄液を試料で適用させた結果が図５ｂに示されている。ストリップ１ないし１２はそれぞれストレプトコックスピオゲネス(Streptococus pyogenes)、Shigella flexneri、スタヒロコッカスオーリアス(Staphylococcus aureus)、Pseudomonas aeruginosa)、Klebsiella pneumoniae、Enterococcus faecalis、エシェリキアコライ(Escherichia coli)、エンテロバクターアエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio cholerae、スタヒロコッカスエピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、Salmonella typhi)を使用した。
【００８３】
組換えｐ６０及びリステリアモノサイトゲネスの培養上澄液の場合捕獲線にバンドが発生したが、陰性対照群の上澄液の場合は捕獲線にいずれのバンドが発生しなかった。従って、前記製造されたディップスティックがｐ６０だけを選別的に認知できることを確認した。
【００８４】
前述した結果から、モノクローナル抗体ｐ６００７とｐ６０１７の対がリステリアサイトゲネスのｐ６０を選別的に認知するディップスティックに望ましく適用できる。
【００８５】
また、図1ａにおいて使用されたポリクローナル抗体(ラビット)も２次抗体として使用できる。
本実施例に用られた試験方法は次の通りである。
【試験例１】
【００８６】
: サンドイッチＥＬＩＳＡ試験
１．リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体(ｐ６００７またはｐ６０１７)を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌに分注し３７℃で２時間３０分間インキュベーションした。
２．０．０５％ Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
３．１％ＢＳＡを１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションして遮断した。
４．０．０５％ Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
５．抗原を各ウェルに１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。具体的に、ブランクの場合０．１％ＢＳＡを分注し、陽性対照群の場合リステリアモノサイトゲネスから組換えｐ６０を１００ｎｇ/ウェルになるよう分注し、試験菌株の場合５ｍｌのＢＨＩ(brain hert infusion;DIFCO社)肉汁培地で１８時間３７℃で培養した後ＢＨＩ肉汁培地を遠心分離(３０００ｒｐｍ、１５分)してその上澄液を各ウェルに分注した。
６．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
７．ポリクローナル抗体(ラビット)またはモノクローナル抗体を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
８．ＨＲＰ(horse radish peroxidase)-結合抗ラビット抗体(ＰＢＳＴで１:１０００に稀釈)を各ウェルに１００ｎｇ/１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間インキュベーションした。
９．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを５回ずつ洗浄した。
１０．発色試薬緩衝溶液９．４５ｍｌと４％ＯＰＤ(ｏ-フェニレンジアミン)０．５ｍｌとＨ２Ｏ２ ０．０５ｍｌを混合した発色試薬を製造して各ウェルに１００μｌずつ分注し常温で２０分間インキュベーションした。
【００８７】
【表１】
【００８８】
１１．停止溶液８Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに１５μｌずつ分注した。
１２．４９２ｎｍでＯＤ値を測定した。
【試験例２】
【００８９】
:直接的ＥＬＩＳＡ試験
１．抗原を各ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間３０分間インキュベーションした。
２．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
３．１％ＢＳＡを１００μｌ分注し３７℃で１時間インキュベーションして遮断した。
４．０．０５％Tween２０のＰＢＳ溶液で各ウェルを３回ずつ洗浄した。
５．抗体または１％ＢＳＡ(ブラック)を各ウェルに１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
６．ＨＲＰ-結合抗マウス抗体またはＨＲＰ-結合抗ラビット抗体(ＰＢＳＴで１０、０００で稀釈)を１００μｌずつ分注し３７℃で１時間インキュベーションした。
７．発色試薬緩衝溶液９．４５ｍｌと４％ＯＰＤ(ｏ-フェニリンジアミン)０．５ｍｌとＨ２Ｏ２ ０．０５ｍｌを混合した発色試薬を各ウェルに１００μｌずつ分注し常温で２０分間インキュベーションした。
【００９０】
【表２】
【００９１】
８．停止溶液８Ｎ Ｎ２ＳＯ４を各ウェルに１５μｌずつ分注した。
９．４９２ｎｍでＯＤ値を測定した。
【試験例３】
【００９２】
: ウェスタンブロット試験
１．リステリア種をＢＨＩ肉汁培地で一晩中３７℃で培養して得た上澄液２５０μｌとブリリアントブルーＲ(brilliant blue R)を染料として使用したサンプル緩衝液(Ｘ６)５０μｌをよく混合してお湯に５分間浸した後そのうち２０μｌを取って１２％スルフェイト-ポリアクリレートゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルにローディングした。
２．電気電気泳動が完了された後４℃で一晩中ＮＣ(ニトロセルロース)膜に移動させた。
３．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
４．常温で１時間５％脱脂牛乳で遮断した。
５．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
６．ニトロセルロース膜を常温で１時間１０ｍｌの５％脱脂牛乳に抗体１０μｌを混合した溶液に浸漬した。
７．ＰＢＳに０．０５％Tween２０を添加した溶液で洗浄した。
８．ニトロセルロース膜を常温で１時間HRP-結合された抗-マウス抗体またはＨＲＰ-結合された抗ラビット抗体(５%脱脂牛乳で１:１０、０００で稀釈)１０ｍｌに浸漬した。
９．SuperSignal（登録商標）WestPico Chemiluminescent Substrate(PIERCEキット)を使って発光させ化学発光計で発光を測定した。
【試験例４】
【００９３】
: ディップスティック試験
１．金粒子(gold particle; ４０ｎｍ)に結合させるｐ６００７モノクローナル抗体の最適濃度を決定してからコロイド状金に適した濃度の抗体を入れ３０分間室温で回転させながら反応させた。３０分後、ＢＳＡを入れ４℃で一晩中反応させた。４℃で１００００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、上澄液を用心深く捨てて金パレットを最初体積の１０分の１程度に浮遊させた。このようにｐ６００７モノクローナル抗体が結合された金粒子を４２０ｎｍで吸光度が１になるよう調節して接合パッドに噴射した後、接合パッドを６０℃で真空状態で１時間乾燥させた。乾燥してから使用前までは絶対湿度(ＲＨ)３０％以下で保管した
２．ニトロセルロース膜に捕獲抗体及び対照抗体処理を施した。捕獲抗体としてリステリア種に特異的なモノクローナル抗体ｐ６０１７をニトロセルロース膜１ｃｍ当り１μｇを分注し、対照抗体として濃度が１ｍｌ当り１ｍｇである抗-マウスＩｇＧをニトロセルロース膜１ｃｍ当り１μｇになるよう分注した。処理された膜を３７℃で一晩中乾燥させた後、使用前まで絶対湿度(ＲＨ)３０％以下で保管した。
３．サンプルの適用に適した条件のためサンプルパッドを適した緩衝溶液で遮断した。６０℃で１時間乾燥させてから、使用前まで絶対湿度３０％以下に保管した。
４．前記で用意されたパッドを接合パッドに連結させた後サンプルスクリーニングに使用した。
５．リステリア増菌培地で一晩中増菌し１ｍｌを取って３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上澄液を１０分間沸してサンプルとして使用した。
６．前記で用意されたサンプル１００μｌをサンプルパッドに滴下した後５分後に判読した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のモノクローナル抗体ｐ６００７はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することによりこのような抗体を使って人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１ａ】図１ａは、ポリクローナル抗体(ラビット)を使って多様なリステリア種について直接的ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図１ｂ】図１ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を使って多様なリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図１ｃ】図１ｃは、モノクローナル抗体ｐ６０１７を使って多様なリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ａ】図２ａは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてポリクローナル抗体(ラビット)を使って直接的ＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ｂ】図２ｂは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてモノクローナル抗体ｐ６００７を使ってサンドイッチＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図２ｃ】図２ｃは、食品から分離された３３個のリステリアモノサイトゲネスについてモノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってサンドイッチＥＬＩＳＡ試験及びウェスタンブロット試験したグラフである。
【図３ａ】図３ａは、モノクローナル抗体ｐ６００７の量を変化させながらリステリア種についてサンドイッチＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を使ってリステリア菌株以外の他の菌株についてサンドイッチＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図４ａ】図４ａは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体ｐ６００７及びモノクローナル抗体ｐ６０１７によるｐｅｐＡ及びｐｅｐＤペプチド認知有無を直接的ＥＬＩＳＡ試験したグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、モノクローナル抗体ｐ６００７を捕獲抗体として使用し、第２抗体としてポリクローナル抗体を使ってｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証したグラフである。
【図４ｃ】図４ｃは、モノクローナル抗体ｐ６００７を捕獲抗体として使用し、第２抗体としてモノクローナル抗体ｐ６０１７を使ってｐｅｐＡ/ｐｅｐＤの競争をサンドイッチＥＬＩＳＡで検証したグラフである。
【図５ａ】図５ａは、組換えｐ６０を試料として適用させたリステリアディップスティックの展開を示す写真である。
【図５ｂ】図５ｂは、陰性対照物としてｐ６０の代りにリステリアモノサイトゲネス(ストリップ０)及び多様な菌株(ストリップ１ないし１２)の培養上澄液を試料として適用させたリステリアディップスティックの展開を示す写真である。
【図６ａ】図６ａは、リステリアモノサイトゲネスｐ６０およびListeria innocua ｐ６０に対するモノクローナル抗体ｐ６００７の親和力についてのウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法の結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、リステリアモノサイトゲネスｐ６０およびListeria innocua ｐ６０に対するモノクローナル抗体ｐ６０１７の親和力についてのウェスタンブロットとイメージ分析による結合動力学定量法の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列１はプライマーである。
【００９７】
配列２はプライマーである。
【００９８】
配列５は対照ペプチドである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＴＣ−１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリア種(Listeria spp．)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰ。
【請求項４】
請求項２のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰ。
【請求項５】
請求項１のモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法。
【請求項６】
抗原-抗体複合体をＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、または化学発光物質結合法で検出する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体として請求項２のモノクローナル抗体を使って検出する請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のモノクローナル抗体を含むことを特徴とするリステリアモノサイトゲネス汚染を検出するためのキット。
【請求項９】
キットはＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法を用いる請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
キットは免疫クロマトグラフィ法を用いる請求項８に記載のディップスティックキット。
【請求項１１】
請求項１のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体として請求項２のモノクローナル抗体を使用する請求項８ないし１０のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項１】
受託番号ＫＣＴＣ−１０４３１ＢＰのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリア種(Listeria spp．)のｐ６０タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞ＫＣＴＣ１０４３１ＢＰ。
【請求項４】
請求項２のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞ＫＣＴＣ１０４３２ＢＰ。
【請求項５】
請求項１のモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのｐ６０タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法。
【請求項６】
抗原-抗体複合体をＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、または化学発光物質結合法で検出する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体として請求項２のモノクローナル抗体を使って検出する請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のモノクローナル抗体を含むことを特徴とするリステリアモノサイトゲネス汚染を検出するためのキット。
【請求項９】
キットはＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法を用いる請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
キットは免疫クロマトグラフィ法を用いる請求項８に記載のディップスティックキット。
【請求項１１】
請求項１のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第２抗体として請求項２のモノクローナル抗体を使用する請求項８ないし１０のうちいずれか１項に記載のキット。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【公開番号】特開２００６−１０４１５４（Ｐ２００６−１０４１５４Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９５０７２（Ｐ２００４−２９５０７２）
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年５月 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ発行の「ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．３，Ｍａｙ ２００４，ｐａｇｅｓ ４４６−４５１，“Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｐ６０ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ”」に発表
【出願人】（５０４３７６５９９）コメッド コーポレーション リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＭＥＤ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】＃４０４， Ａ−ｄｏｎｇ， Ｂｕｎｄａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｐａｒｋ， １５０， Ｙａｔａｂ−ｄｏｎｇ， Ｂｕｎｄａｎｇ−ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｃｉｔｙ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４６３−７６０， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年５月 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ発行の「ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．３，Ｍａｙ ２００４，ｐａｇｅｓ ４４６−４５１，“Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｐ６０ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ”」に発表
【出願人】（５０４３７６５９９）コメッド コーポレーション リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＭＥＤ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】＃４０４， Ａ−ｄｏｎｇ， Ｂｕｎｄａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｐａｒｋ， １５０， Ｙａｔａｂ−ｄｏｎｇ， Ｂｕｎｄａｎｇ−ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｃｉｔｙ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４６３−７６０， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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