リンパ球分化または増殖調節剤、およびそのスクリーニング方法
【課題】リンパ球の分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供し、これを標的とする新たな機序のリンパ球の分化または増殖調節薬や、そのスクリーニング方法等を提供すること。
【解決手段】リンパ球の分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子としてＢＴＳ遺伝子が提供される。また、本発明は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球の分化または増殖調節剤、被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球の分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法等を提供する。
【解決手段】リンパ球の分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子としてＢＴＳ遺伝子が提供される。また、本発明は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球の分化または増殖調節剤、被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球の分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球分化または増殖調節剤、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
防御免疫反応として、免疫系は病原体や抗原の感染を認識してＴ・Ｂ両リンパ球の抗原特異的クローンを充実させる。反応の終結と過度の反応を低減させるため、該リンパ球クローンは増殖阻害や細胞死により減少する。このような免疫反応に伴う大胆な調節機構は、適切な免疫において重要である。抗原受容体、共刺激受容体、細胞死受容体は、リンパ球のクローンサイズ調節において中心的な役割を果たすことが知られている。さらに、複数の異なる分子が細胞増殖および細胞死の調節に関与している。四回膜貫通を有する分子（tetra-spanning molecule）もまた、このような調節機構に関与している。
【０００３】
多数のtetra-spanning moleculeが同定され、二つのグループに分類されている。トランスメンブレン４スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）またはテトラスパニン（tetraspanin）（Maeckerら、FASEB J.、vol.11、p428-442、（1997）、Tarrantら、TRENDS in Immunol.、vol.24、p610-617、（2003））、そして４領域membrane-spanningサブファミリーＡ（ＭＳ４Ａ）（Ishibashiら、Gene、vol.264、p87-93、（2001）、Liangら、Genomics、vol.72、p119-127、（2001））である。これら二つのグループは、構造的および配列相同性で分類されている。前者のグループは、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２を含む約２０のタンパク質のメンバーを有し、膜ミクロドメインと離れて細胞膜に集まることにより、テトラスパンミクロ領域を構成すると考えられている（Vogtら、Immunol. Rev.、vol.189、p136-151、（2002））。テトラスパンミクロ領域に、制限されたペプチドレパートリーをのせたＭＨＣクラスＩＩ分子を濃縮し、抗原呈示を促進する（Kropshoferら、Nat. Immunol.、vol.3、p61-68、（2002））。
【０００４】
ＣＤ１９と関連してＣＤ８１は、Ｂ細胞においてＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介し、細胞活性の閾値を低下させることが示唆されている。ＣＤ８１−欠損マウスはＢ１ａリンパ球サブセットの発達の低下（基礎免疫グロブリンのレベル低下）、細胞表面ＣＤ１９の発現の減少、Ｔ細胞依存的抗体応答の低下を示した（Levyら、Annu. Rev. Immunol.、vol.16、p89-109、（1998）、Maeckerら、J. Exp. Med.、vol.185、p1505-1510、（1997））。同様に、Ｔ細胞依存的抗体応答はまたＣＤ３７−欠損マウスで低下した（Knobelochら、Mol. Cell Biol.、vol.20、p5363-5369、（2000））。ＴＭ４ＳＦファミリーの分子はインテグリンやＦｃＲｓなどの広範囲にわたる細胞表面受容体に関連することが示されており、このような関連は細胞内のシグナル活性化や機能調節を誘発する（Kajiら、J. Immunol.、vol.166、p3256-3265、（2001））。
【０００５】
一方、ＭＳ４Ａファミリーは、ＣＤ２０、ＨＴｍ４、ＦｃεＲＩβや未同定の分子を含む。ＦｃεＲＩβは、ＩｇＥ受容体を構成するＩＴＡＭを構成要素として有することがよく知られており、マスト細胞やマクロファージで活性化シグナルの調節／増幅機能を示す（Maurerら、J. Exp. Med.、vol.179、p745-750、（1994）、Reth、Nature、vol.338、p383-384、（1989））。ＣＤ２０はＢ細胞の細胞死を調節しており、また、最近ではカルシウムチャネルとして機能することが示唆されている（Liら、J. Biol. Chem.、vol.278、p42427-42434、（2003）、Kanzakiら、J. Biol. Chem.、vol.272、p4964-4969、（1997））。特に、抗-ＣＤ２０モノクローナル抗体、リツキサン（rituximab）は、Ｂ細胞リンパ腫治療に適応されている（Glennieら、Immunol. Today、vol.21、p403-410、（2000）、Maloneyら、Semin. Oncol.、vol.29、p2-9、（2002））。細胞死を誘発するメカニズムはいまだ未知であるが、ＣＤＣ（compliment-dependent cytotoxicity）（Bannerjiら、Blood、vol.96、p164a、（2000）、Manchesら、Blood、vol.101、p949-954、（2003））、ＡＤＣＣ（Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity）（Clynesら、Nat. Med.、vol.6、p443-446、（2000）、Cartonら、Blood、vol.99、p754-758、（2002））、アポトーシス（Chanら、Cancer Research、vol.63、p5480-5489、（2003）、Shanら、Blood、vol.91、p1644-1652、（1998））を介して調節していると考えられている。ＨＴｍ４は、細胞周期調節に含まれることが報告されている（Donatoら、J. Clin. Invest.、vol.109、p51-58、（2002））。非リンパ組織においても多数のtetra-spanning moleculeがクローン化されているにもかかわらず、それらの機能のほとんどはいまだ未知である。
【０００６】
細胞増殖は始めの細胞サイズの増加に続くことが知られている。細胞サイズは栄養と代謝により調節されることが示されており、哺乳類のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は、細胞のエネルギー（Dennisら、Science、vol.294、p1102-1105、（2001））、栄養（Edingerら、Oncogene、vol.23、p5654-5663、（2004））、成長因子（Schemelzleら、Cell、vol.103、p253-262、（2000）、Rathmellら、J. Immunol.、vol.167、p6869-6876、（2001））に反応してこの細胞サイズ、細胞周期（Schemelzleら、Cell、vol.103、p253-262、（2000））、細胞分化（Sugataniら、J. Biol. Chem.、published online ahead of print December 7, 2004、Sarkerら、Oncogene、vol.23、p6064-6070、（2004））の調節に重要であることが示されている。Ｂ細胞では、ｍＴＯＲ経路はＢＣＲ刺激によるアルファ４／ＰＰ２Ａによって調節されることが示されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】イヌイら（Ｉｎｕｉ ｅｔ ａｌ．）、インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.）、（英国）、第１４巻、ｐ．１７７−１８７、（２００２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、リンパ球分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供し、これを標的とする新たな機序のリンパ球分化または増殖調節薬や、そのスクリーニング方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、Ｂ細胞に特異的に発現している、４回膜貫通型の分子ＢＴＳ（B cell-specific tetra-spanning molecule）を、未熟Ｂ細胞に過剰発現させると、その細胞の分化および増殖が著しく阻害されたこと等から、ＢＴＳがＢ細胞の分化または増殖を制御し得る分子であり、リンパ球分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、以下のものを提供する：
（１）ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤、
（２）該リンパ球がＢ細胞またはリンパ球系前駆細胞である、上記（１）記載の剤、
（３）該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質である、上記（１）記載の剤、
（４）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）である、上記（３）記載の剤：
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸、
（５）リンパ腫、白血病、自己免疫疾患、膠原病、自己免疫性糸球体腎炎の予防・治療剤である、上記（３）記載の剤、
（６）該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質である、上記（１）記載の剤、
（７）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質が、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸である、上記（６）記載の剤、
（８）悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群、感染症の予防・治療剤である、上記（６）記載の剤、
（９）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法、
（１０）以下の工程を含む、上記（９）記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として選択する工程、
（１１）以下の工程を含む、上記（９）記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として選択する工程、
（１２）ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法、
（１３）生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法、
（１４）ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬、
（１５）ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、またはその部分配列からなるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリンパ球分化または増殖調節剤は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し、新たなメカニズムのリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患予防・治療剤などとして有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでリンパ球分化または増殖を調節し得る物質を得ることができるので、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患予防・治療剤等の医薬品の開発や免疫学の研究などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＢＴＳ（B cell-specific tetra-spanning molecule）とは、Ｂ細胞に特異的に発現している４回膜貫通分子であり、そのアミノ酸配列、核酸配列は公知である。ＢＴＳは既知のモチーフを有さないが、後述の実施例から明らかなように、ＢＴＳを過剰発現させた未熟Ｂ細胞等において分化および増殖が著しく阻害されたこと等から、ＢＴＳがＢ細胞の分化または増殖を制御し得る分子であること等に基づき、以下に記載された発明が提供される。
【００１２】
（１．リンパ球分化または増殖調節剤）
本発明はＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤を提供する。
【００１３】
ＢＴＳ遺伝子の発現とは、ＢＴＳ遺伝子からの翻訳産物（即ち、ポリペプチド）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。
【００１４】
本発明において、分化または増殖調節の対象となるリンパ球としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはリンパ球系前駆細胞等が挙げられ、例えば、Ｂ細胞、リンパ球系前駆細胞が好ましい。Ｂ細胞としては、例えば、ｐｒｏ-Ｂ細胞、ｐｒｅ-Ｂ細胞、未熟（immature）Ｂ細胞、成熟（mature）Ｂ細胞、ＧＣ（germinal center）Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質（plasma）細胞等が挙げられる。
【００１５】
一実施態様では、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質は、ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質であり得る。
【００１６】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質は、ＢＴＳ遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、ＢＴＳ遺伝子の発現の促進としては、ＢＴＳポリペプチド自体の補充をも含むものとする。
【００１７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【００１８】
本発明において、ＢＴＳポリペプチドとしては、任意の哺乳動物のＢＴＳポリペプチドを用いることが出来る。
【００１９】
哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００２０】
哺乳動物のＢＴＳポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型ＢＴＳポリペプチド（例えば、配列番号２（GenBankアクセッション番号：AAH32672）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、マウス野生型ＢＴＳポリペプチド（例えば配列番号４（GenBankアクセッション番号：AAH21548）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）等が挙げられる。また、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
【００２１】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２２】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、ＢＴＳポリペプチドの機能（活性）が性質的に野生型ＢＴＳポリペプチドと同質であることを示す。したがって、ＢＴＳポリペプチドの機能（活性）が野生型ＢＴＳポリペプチドと同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうＢＴＳポリペプチドの機能（活性）としては、後述の実施例において、ＢＴＳポリペプチド強制発現Ｂ細胞では増殖阻害が見られたことより、リンパ球の分化および増殖抑制等が挙げられる。該機能の測定は、例えば、Ｂ細胞にＢＴＳポリペプチドを強制発現させ、該細胞の分化または増殖の抑制の程度を測定することにより行うことができる。
【００２３】
また、本発明においてＢＴＳポリペプチドは、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをも含む。該ポリペプチドとしては、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型ＢＴＳと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、ポリペプチドの細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（PTD）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。より具体的には、タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。また、PTDとしては、ANTENNAPEDIA、HIV/TAT、HSV/VP-22等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。アミノ酸が付加される位置は、当該ポリペプチドの活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列の末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。
【００２４】
ＢＴＳポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２５】
ＢＴＳポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２６】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、該ＢＴＳポリペプチドを発現する哺乳動物の細胞又は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。ＢＴＳポリペプチドを発現する細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）等を挙げることが出来るが、特に限定されない。具体的には、該哺乳動物の細胞又は組織をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２７】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＢＴＳポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。
【００２８】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を培養してＢＴＳポリペプチドを生成せしめ、得られる培養物から該ポリペプチドを分離・精製することによって製造することもできる。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、ＢＴＳポリペプチドをコードするcDNA、mRNA、染色体DNAのヌクレオチド配列が含まれ、より具体的には、例えばヒト野生型ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号１（GenBankアクセッション番号：BC032672））、マウス野生型ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号３（GenBankアクセッション番号：BC021548））等を挙げることが出来る。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、該ヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーと、該ヌクレオチド配列を有する染色体DNA、mRNA、cDNA等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００２９】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００３０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）などが用いられる。
【００３１】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターを、自体公知の方法に従って宿主へ導入することにより、ＢＴＳポリペプチドを発現可能な形質転換体を製造することが出来る。
【００３２】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外にＢＴＳポリペプチドを生成させることができる。更に、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＢＴＳポリペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
【００３３】
ＢＴＳ遺伝子の発現又は機能を促進する物質としてＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を用いる場合、該核酸としては上述と同様のものを用いることが出来る。
【００３４】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、適切な発現ベクターに含まれた態様で用いられることが好ましい。即ち、該核酸は適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結され得る。
【００３５】
また、リンパ球分化または増殖を効果的に調節するため、該発現ベクターは適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内で機能可能なものが用いられる。該発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物のリンパ球への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３６】
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR、ラウス肉腫ウイルスLTR、MoMuLV由来LTR、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター；ＣＤ１９プロモーター等のＢ細胞特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３７】
該発現ベクターは、好ましくはＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００３８】
一実施態様では、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質は、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質であり得る。ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質は、ＢＴＳ遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００３９】
ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質としては、例えばＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸等を挙げることが出来る。
【００４０】
目的核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４１】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスＢＴＳ」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、ＢＴＳ遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＢＴＳは、ＢＴＳポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすることができ、mRNAの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
【００４２】
アンチセンスＢＴＳの標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＢＴＳポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするmRNAまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＢＴＳをコードする核酸（例えばmRNA又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、ＢＴＳをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、ＢＴＳ遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
【００４３】
さらに、アンチセンスＢＴＳは、ＢＴＳポリペプチドをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、ＢＴＳポリペプチドをコードする二本鎖DNAと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４４】
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。
【００４５】
ＢＴＳをコードするmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＢＴＳに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００４６】
ＢＴＳをコードするmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴRNA（siRNA）もまた、アンチセンスＢＴＳに包含され得る。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAの一方の鎖に相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。siRNAの大きさは、RNAiを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、15bp以上、好ましくは20bp以上であり得る。RNAｉ活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA／RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４７】
上述のＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００４８】
本発明の剤は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
【００４９】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５０】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５１】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５２】
ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン（lipfectamine）、DOGS（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、DOPE（1,2-ジオールエオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOTAP（1,2-ジオールエオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン）、DDAB（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、DHDEAB（N,N-ジ-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、HDEAB（N-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００５３】
また、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がポリペプチドである場合、該ポリペプチドの細胞内への導入効率を高めるために、本発明の剤は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（IMGENEX社製）等を用いることが出来る。
【００５４】
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００５５】
本発明の剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。例えば、本発明の剤が医薬である場合、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の予防・治療剤として使用され得る。
【００５６】
詳細には、本発明の医薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を亢進する物質を含有する場合、該物質は、リンパ球分化または増殖を低下し得るので、例えば、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患としては、例えば、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫等）、白血病（Ｂ細胞性等）、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ・多発性硬化症・多発性筋炎・重症筋無力症・ギランバレー症候群等）、膠原病（橋本病・全身性エリテマトーデス等）、自己免疫性糸球体腎炎等が挙げられる。
【００５７】
また、本発明の医薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質を含有する場合、該物質は、リンパ球分化または増殖を亢進し得るので、例えば、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患としては、例えば、悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群（エイズ等）、多くの感染症（難治性感染症等）等が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の剤が研究用試薬である場合、例えば、実験動物におけるリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の誘発剤として使用され得る。詳細には、本発明の研究用試薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質を含有する場合、例えば、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の誘発に使用され得る。本発明の研究用試薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質を含有する場合、例えば、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の誘発に使用され得る。リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患及びリンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患は、それぞれ上述と同様である。
【００５９】
（２．リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得る物質は、リンパ球分化または増殖を調節し得る。従って、本発明は、被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を含有してなるリンパ球分化または増殖調節剤を提供する。
【００６０】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００６１】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得るかを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得る物質を選択する工程；
（ｃ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として得、或いはＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として得る工程。
【００６２】
上記において、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得る物質を選択する場合、例えば工程（ａ）において、被験物質とＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較する。
ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞とは、ＢＴＳ遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＢＴＳ遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、ＢＴＳ遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、好ましくは上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００６３】
ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）等を挙げることが出来るが、特に限定されない。
【００６４】
ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＢＴＳ遺伝子転写調節領域は、ＢＴＳ遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＢＴＳ遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、GUS（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、LUC（ルシフェラーゼ）遺伝子、CAT（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００６５】
ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＢＴＳ遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＢＴＳ遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞が好ましい。また、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質を得るという目的より、リンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）を用いることがより好ましい。
【００６６】
ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００６７】
次に先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＢＴＳ遺伝子の産物、例えば、転写産物（mRNA）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。一方、ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００６８】
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００６９】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得る被験物質が選択される。
【００７０】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で選択されたＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質がリンパ球分化または増殖を低下し得る物質として、或いはＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質がリンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として獲得される。
【００７１】
更に工程（ｂ）と（ｃ）の間に、工程（ｂ´）として工程（ｂ）で選択された物質がリンパ球分化または増殖を調節し得るか確認し、該効果が確認された物質を工程（ｃ）においてリンパ球分化または増殖を調節し得る物質として得ることも出来る。これにより、より高い効率で目的とする物質を獲得することが出来る。
【００７２】
工程（ｂ´）においては、例えば、工程（ｂ）で選択された物質（候補物質）とリンパ球（リンパ球由来の細胞株を含む）とを接触させ、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖を測定し、該機能を候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖と比較する。
【００７３】
リンパ球に対する候補物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）中で行われ得る。培養条件は、限定されないが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。このとき、リンパ球は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【００７４】
リンパ球分化または増殖の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、リンパ球分化（例えばリンパ球前駆細胞の成熟リンパ球への分化）は、後述の実施例のような骨髄キメラ動物の解析や、細胞表面または細胞質分子の発現・消失等の測定（例えば抗ＩｇＤ抗体を用いた染色等）等により、リンパ球増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、遺伝子発現の変化はRT-PCRやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【００７５】
次いで、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖が、候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖と比較される。リンパ球分化または増殖の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖は、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、候補物質によるリンパ球分化または増殖の調節作用が確認される。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現量を調節する被験物質が選択され得る。
【００７７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質はリンパ球分化または増殖を低下し得るので、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。また、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質はリンパ球分化または増殖を亢進し得るので、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。従って、ＢＴＳ遺伝子の発現を指標として、種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【００７８】
（３．リンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法）
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖の異常をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法、当該方法により同定されるリンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型を含むポリペプチド・核酸分子を提供する。
【００７９】
ＢＴＳ遺伝子の多型とは、ある母集団において、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAにおける１以上のDNAの置換、欠失、付加（例えば、SNP、ハプロタイプ）、並びに該ゲノムDNA中の部分領域の反復、逆位、転座などであり得る。本発明の方法により同定されるＢＴＳ遺伝子の多型のタイプは、ＢＴＳ遺伝子における全てのタイプの多型のうち、リンパ球分化または増殖に異常（亢進又は低下）を有する動物と異常を有していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異であり、例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現の変化をもたらすものであり得る。なお、ＢＴＳ遺伝子多型の解析対象となる動物は上述の哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
【００８０】
解析工程は、連鎖解析等の自体公知の方法により行われ得る。リンパ球分化または増殖の異常、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の有無により特定の遺伝子多型の保有頻度に有意差が認められたとき、そのタイプの遺伝子多型を保有する対象は、保有しない対象よりもリンパ球分化または増殖に異常を有するリスク、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクが相対的に高い又は低いと判定される。
【００８１】
本発明の同定方法は、哺乳動物由来の生体試料から調製されたDNAサンプルをシークエンシング (sequencing) に供し、ＢＴＳ多型の新たなタイプを決定する工程をさらに含むこともできる。生体試料は、ＢＴＳ遺伝子の発現組織又は細胞（例えば、リンパ球）を含む試料（例えば、血液）のみならず、毛髪、爪、皮膚、粘膜等のゲノムDNAを含む任意の組織も使用できる。入手の容易性、人体への負担等を考慮すれば、生体試料は、毛髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましい。遺伝子多型の決定は、由来が異なる生体試料に含まれるゲノム又は転写産物のヌクレオチド配列を多数解析し、決定されたヌクレオチド配列中に一定頻度で見出される変異を同定することで行われ得る。
【００８２】
更に、見出された変異が実際にＢＴＳ遺伝子の発現に変化をもたらし得るか、確認してもよい。例えば、該変異を有するＢＴＳ遺伝子を、ＢＴＳ遺伝子の機能的欠損を有するリンパ球（又はその細胞株）へ導入し、該リンパ球における該ＢＴＳ遺伝子の発現を、該変異を有さないＢＴＳ遺伝子（野生型ＢＴＳ遺伝子等）の発現と比較することが出来る。或いは該変異を有するＢＴＳ遺伝子が導入されたリンパ球における分化または増殖を、該変異を有さないＢＴＳ遺伝子が導入されたリンパ球におけるものと比較してもよい。ＢＴＳ遺伝子の発現、リンパ球分化または増殖の測定は、上述と同様に行うことが出来る。
【００８３】
見出されたＢＴＳ遺伝子の変異がリンパ球分化または増殖の低下をもたらすものである場合、該変異はリンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることができる。また、見出されたＢＴＳ遺伝子の変異がリンパ球分化または増殖の亢進をもたらすものである場合、該変異はリンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることが出来る。
【００８４】
本発明の同定方法および当該方法により決定されたリンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定に有用である。
【００８５】
（４．リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法）
（４−１．発現量の測定に基づく判定方法および診断薬）
上述の様に、ＢＴＳポリペプチドはリンパ球分化または増殖を調節している。従って、本発明は、動物由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【００８６】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現量に基づきリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを評価する工程。
【００８７】
上記方法の工程（ａ）では、生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が測定される。生体試料はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを評価することが所望される動物、好ましくは哺乳動物由来である。ヒト由来の試料が最も好ましい。生体試料は、ＢＴＳ遺伝子を発現している組織又は細胞（例えば、リンパ球）を含む試料（例えば、血液）、あるいは該試料から分離された細胞であり得るが、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを判定する目的より、生体試料は、リンパ球またはそれを含む試料が好ましい。また、ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定は、上述と同様に行われ得る。
【００８８】
上記方法の工程（ｂ）では、ＢＴＳ遺伝子の発現量に基づき、生体試料が由来する動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患しているか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。
【００８９】
詳細には、先ず、測定されたＢＴＳ遺伝子の発現量が、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患していない動物（例えば、正常動物）由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００９０】
次いで、ＢＴＳ遺伝子の発現量の比較結果より、生体試料が由来する動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。従って、ＢＴＳ遺伝子の発現が低下している場合には、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。また、本明細書中に開示された知見より、ＢＴＳ遺伝子の発現が促進している場合には、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。
【００９１】
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬を提供する。本発明の診断薬を用いれば、上記判定方法により、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを容易に判定することが出来る。
【００９２】
ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬は、ＢＴＳ遺伝子の発現を定量可能である限り特に限定されないが、例えば、ＢＴＳポリペプチドを特異的に認識する抗体、ＢＴＳ遺伝子転写産物に対する核酸プローブ、またはＢＴＳ遺伝子転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断薬は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、FITC、FAM等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、3H、14C、32P、35S、125I等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００９３】
ＢＴＳ遺伝子転写産物に対する核酸プローブは、DNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、ＢＴＳ遺伝子の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【００９４】
ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＢＴＳ遺伝子転写産物を定量可能な試薬がプライマーである場合、本発明の診断薬は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【００９５】
本発明の上記判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の有無、あるいは該疾患に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、本発明は、例えば、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の容易且つ早期の発見などに有用である。
【００９６】
（４−２．多型の測定に基づく判定方法および診断薬）
本発明は、動物の生体試料を用いてＢＴＳ遺伝子の多型を測定することを含む、動物におけるリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【００９７】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物から採取した生体試料においてＢＴＳ遺伝子の多型を測定する工程；
（ｂ）多型のタイプに基づきリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症可能性を評価する工程。
【００９８】
上記方法の工程（ａ）では、動物から採取された生体試料においてＢＴＳ遺伝子の多型のタイプが測定される。動物としては、上述の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。生体試料は、本発明の多型の同定方法で使用し得るものと同様である。
【００９９】
多型のタイプの測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、RFLP（制限酵素切断断片長多型）法、PCR-SSCP（一本鎖DNA高次構造多型解析）法、ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ARMS（Amplification Refracting Mutation System）法、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法、RNAseA切断法、DOL（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、TaqMan PCR法、インベーダー法などが使用できる。
【０１００】
上記方法の工程（ｂ）では、多型のタイプに基づき、動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。特定の疾患を発症しやすい動物では、当該疾患に関連する遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られている。従って、ＢＴＳ遺伝子の機能を低下させるような多型を含む動物は、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。同様に、ＢＴＳ遺伝子の機能を促進するような多型を含む動物は、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。従って、ＢＴＳ遺伝子の多型の解析より、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症可能性を判断することが可能である。なお、本工程で測定対象となる多型のタイプは、例えば、本発明の同定方法により得られたものであり得る。
【０１０１】
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬を提供する。
【０１０２】
ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬は、ＢＴＳ遺伝子の多型を決定可能である限り特に限定されない。該試薬は、標識用物質で標識されていてもよい。また、該試薬が標識用物質で標識されていない場合、本キットは、該標識用物質をさらに含むこともできる。
【０１０３】
詳細には、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬は、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブ、あるいは特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマーを含むものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAまたはＢＴＳ遺伝子転写産物に対するものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、転写産物またはゲノムDNAの抽出用試薬とともに提供されてもよい。
【０１０４】
特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブは、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を選別可能である限り特に限定されない。該プローブはDNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を選別可能とするため短ければ短いほどよく、例えば、約１５〜３０ｂｐのサイズであり得る。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。該プローブにより、例えばＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法が可能となる。
【０１０５】
特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。このような複数のプライマーは、例えば、いずれか一方のプライマーの３’末端に多型部位を含むように設計される。測定可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＢＴＳ遺伝子の多型を測定し得る手段がＢＴＳ遺伝子転写産物に対するプライマー対である場合、判定キットは、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１０６】
また、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬として、特定のタイプの多型部位を認識する制限酵素を含むものを挙げることもできる。このような試薬によれば、ＲＦＬＰによる多型解析が可能となる。
【０１０７】
本発明の上記判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定を可能とする。従って、本発明の判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の予防を目的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
【０１０８】
（５．ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸）
（５−１．ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチド）
後述の実施例から明らかなように、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域を欠失させると、ＢＴＳによるリンパ球増殖抑制作用が減少することから、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はリンパ球分化または増殖の調節に大きく関与していることが理解される。したがって、本発明はまた、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドを提供する。
【０１０９】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域は、例えば、該ポリペプチドの推定アミノ酸配列の疎水性解析等により特定することができる。例えばマウスでは、Ｎ末端側から９８〜１１８アミノ酸が膜貫通領域であるため、マウスにおけるＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はＮ末端側から１〜９７アミノ酸の領域（配列番号６）であるといえる。また、ヒトでは、Ｎ末端側から１０２〜１２２アミノ酸が膜貫通領域であるため、ヒトにおけるＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はＮ末端側から１〜１０１アミノ酸の領域（配列番号８）であるといえる。なお、該ポリペプチドは、上述のＢＴＳポリペプチドと同様の方法にて得ることができる。
【０１１０】
また、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列の部分配列（少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは４３アミノ酸以上）からなるポリペプチドは特に制限されないが、後述の実施例において、Ｎ末端から５３アミノ酸を欠失させたマウスＢＴＳポリペプチドではＢＴＳによる増殖阻害作用に変化がなかったのに対し、Ｎ末端から８１アミノ酸を欠失させたマウスＢＴＳポリペプチドではＢＴＳによる増殖阻害作用に変化が見られたことより、例えばマウスでは、Ｎ末端側から５３〜９８アミノ酸の領域を含むことが好ましい。
【０１１１】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチド等は、以下に示すリンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法に使用することができるので有用である。
【０１１２】
（５−２．ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸）
本発明はまた、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸も提供する。該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、上述のように、該ヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーと、該ヌクレオチド配列を有する染色体DNA、mRNA、cDNA等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。なお、該核酸としては、例えば、配列番号５又は配列番号７で表されるヌクレオチド配列等が挙げられる。
【０１１３】
（６．リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法）
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域は、リンパ球の分化および増殖の調節に大きく関わり得ることから、当該領域に相互作用しうる物質はリンパ球分化および増殖を調節し得る。したがって、本発明はまた、被験物質がＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドと相互作用し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１１４】
スクリーニング方法に供される被験物質としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【０１１５】
本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドに接触させる工程；
（ｂ）被験物質の該ポリペプチドに対する結合能を測定する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドに結合能を有する被験物質を選択する工程。
【０１１６】
上記方法の工程（ａ）では、被験物質が該ポリペプチドと接触条件下におかれる。被験物質の該ポリペプチドに対する接触は、溶液中での被験物質と該ポリペプチドとの混合により行われ得る。
【０１１７】
該ポリペプチドは自体公知の方法により調製できる。例えば、上述のＢＴＳポリペプチドと同様の方法にて得ることができる。
【０１１８】
上記方法の工程（ｂ）では、該ポリペプチドに対する被験物質の結合能が測定される。結合能の測定は、自体公知の方法、例えば、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の使用）により行われ得る。
【０１１９】
また一つの態様として、被験物質はＢＴＳを天然で発現している細胞中で存在する分子（ポリペプチド等）であり得る。この場合、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドを当該細胞に発現させ、該ポリペプチドを免疫沈降し、該ポリペプチドと共に沈殿する分子を同定することにより、該ペプチドと相互作用し得る分子を得ることができる。
【０１２０】
上記方法の工程（ｃ）では、該ポリペプチドに結合能を有する被験物質が選択される。ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はリンパ球分化または増殖の調節に大きく関与しているので、該ポリペプチドに結合能を有する物質は、リンパ球分化および増殖を調節し得る。また、被験物質がＢＴＳを天然で発現している細胞中で存在する分子（ポリペプチド等）の場合、該ポリペプチドと相互作用する物質は、リンパ球分化および増殖に関与する分子であり得る。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
【０１２２】
〔１〕実験方法
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本ＳＬＣ（静岡、日本）より購入した。
【０１２３】
（試薬および抗体）
N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(O-Me)fluoromethyl ketone(Z-VAD-FMK）はＳｉｇｍａ（St Louis、MO）より購入した。ＰＥ結合抗ＩｇＭ、ＣＤ４３、ＣＤ４５．１、ＣＤ２１、ＣＤ４、ＣＤ３抗体、ＡＰＣ結合抗ＣＤ２５、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ８抗体、ビオチン結合抗ＩｇＤ、ＣＤ２３、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２抗体、ＰｅｒＣＰ結合抗Ｂ２２０抗体、ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５結合ストレプトアビジンはBD Pharmingenより購入した。抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２はＩＣＮ（Costa Mesa、CA）より購入した。
【０１２４】
（全長ＢＴＳのクローニング）
全長ＢＴＳは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに基づき、脾臓のｃＤＮＡからクローン化した。ＢＴＳのｃＤＮＡは、プライマー（５’プライマー、ＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＣ：配列番号９；３’プライマー、ＧＣＴＧＣＡＡＧＣＧＴＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣ：配列番号１０）を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１２５】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
定量的リアルタイムＰＣＲはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭＳＹＢＲＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ試薬（QIAGEN、UK）とプライマー（５’プライマー、ＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＴ：配列番号１１；３’プライマー、ＡＡＣＴＣＴＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡＡ：配列番号１２）とともに、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（Hercules、CA）を用いて行った。
【０１２６】
（生化学的解析）
細胞表面ビオチン化、免疫沈降、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは既知の方法（Okazakiら、J. Bio. Chem.、vol.275：p35751-35758、（2000））にて行った。使用した抗体は抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Sigma、St Louis、MO）であった。
【０１２７】
（遺伝子導入）
ＢＴＳのｃＤＮＡをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（東京大学T.Kitamura博士提供）にサブクローニングし、Lipofectamine Plus（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞に遺伝子導入した。レトロウィルスを介した遺伝子導入は既知の方法（Yokosukaら、J. Exp. Med.、vol.195：p991-1001、（2002））にて行った。
【０１２８】
（細胞培養）
ＷＥＨＩ２３１細胞はT.Tsubata博士（東京医科歯科大学）により、７０ｚ３、ＣＨ３１，ＷＥＨＩ２７９細胞はO-Wang J博士（ＲＩＫＥＮ）により提供された。未熟胸腺ダブルネガティブ細胞株ＳＣＩＤは、Wiest博士（Fox Chase Institute、Philadelphia）により提供された。全ての細胞は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
【０１２９】
（顕微解析）
細胞はポリ−Ｌ−リジン（Sigma、St Louis、MO）コートしたカバースリップ上で培養し、遺伝子導入した。遺伝子導入４８時間後、細胞は４％パラフォルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで二回洗い、０．３％サポニン（Saponin）で膜透過性化した。その後抗−Ｆｌａｇ Ｍ２ビオチン（Sigma、St Louis、MO）とストレプトアビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）で染色した。画像はライカ共焦点顕微鏡にて解析した。
【０１３０】
（細胞周期とアポトーシスの解析）
細胞周期解析は既知の方法（Hataら、J. Immunol.、vol.173(4)：p2453-61、(2004)）にて行った。つまり、ろ過の前に細胞を集め、ＰＢＳで洗い、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＰＢＳ液で、または氷上にて７０％エタノールで膜透過性化し、そしてＤＮＡを５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピヂウム（ＰＩ）、５０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（Roche、Germany）で染色した。細胞周期プロファイルは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒとＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ソフトウェア（BD Bioscience、San Jose、CA）を用いて解析した。アポトーシス細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで解析する前に、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死同定キット、ＴＭＲレッド（Roche、Germany）を用い、terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling（ＴＵＮＥＬ）で算定した。
【０１３１】
（細胞増殖解析）
細胞増殖解析は既知の方法（Kohnoら、Blood、vol.105(5)：p2059-65、(2005)）にて行った。つまり、１×１０５細胞を２４ウェルプレート（FALCON、Lincoln Park、NJ）で培養し、表示時間にヨウ化プロピヂウムで染色し、生細胞（ＰＩネガティブ細胞）をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Bioscience、San Jose、CA）でカウントした。
【０１３２】
（骨髄（ＢＭ）キメラの産出）
Ｌｙ５．１＋Ｃ５７ＢＬ／６マウス（三共、東京、日本）に５−フルオロウラシル（Sigma、St Louis、MO）を腹腔内投与した（１５０ｍｇ／ｋｇ）。４日後、ＢＭ細胞を抗ＳｃａＩ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec、Germany）で染色し、続けて磁気細胞分離（MACS、Miltenyi Biotec、Germany）した。細胞は、サイトカイン混合物[２０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３（Peprotech、UK）、１００ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ（Peprotech、UK）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６]を含む培地で、ＩＲＥＳ−ＧＦＰの形態でレトロウィルス構成物を含むウィルス上清と１０μｇ／ｍｌポリブレン（polybrene；Sigma、St Louis、MO）と共に３日間培養した。ＧＦＰ＋細胞はＦＡＣＳＡｒｉａ（BD Bioscience、San Jose、CA）で、９７％以上の精度で分離した。計６×１０５ＧＦＰ＋細胞を致死的な放射線を浴びたレピシエントＬｙ５．２＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャーリスリバー、横浜、日本）に注入した。マウスはＰＢＣ解析し、最終的には移植６週間後に解剖した。
【０１３３】
〔２〕結果
（Ｂ細胞特異的membrane tetra-spanning分子、ＢＴＳのクローニング）
本願発明者らは以前、ＣＤ８−キメラｃＤＮＡライブラリーを用いて、細胞活性を誘発する遺伝子をクローン化する機能的ｃＤＮＡクローニングシステムを開発した（Ohtsukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、vol.101：p8126-8131、（2004））。このシステムによりクローン化されたｃＤＮＡのひとつは、ＢＴＳと命名された（Ｂ細胞特異的Tetra-Spanning）（GenBank accession no.BC021548：配列番号１）。全長マウスおよびヒトＢＴＳのｃＤＮＡはクローン化され（GenBank accession no.BC009731）、推定アミノ酸配列を図１に示した。マウスおよびヒトＢＴＳはそれぞれ２６９、２７４アミノ酸をコード化し、既知のどのようなモチーフも有していない。疎水性解析により、ＢＴＳはＴＭ３とＴＭ４の間に明確な細胞外領域を有さない、４つの膜貫通領域を有することが示された。ＢＴＳはシグナルペプチドを有さないという事実と共に、ＢＴＳは４ＴＭ含有分子でＮ、Ｃ両末端が細胞内にある構造を有する。
【０１３４】
様々なＢ細胞サブセットと異なる発育段階でのＢＴＳ発現を解析した。様々な組織でのＢＴＳの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ（図２）とノザンブロット（データ未掲載）で解析した。ＢＴＳは主に脾臓で発現しており、他の組織では、あったとしても非常に低レベルで発現していた（図２Ａ）。脾臓では、Ｂ細胞は主にＢＴＳを発現していた（図２Ｂ）。ＢＴＳはｐｒｅ−Ｂ細胞段階以降に発現し、その発現レベルはＢＭの発達段階に従い上昇した（図２Ｃ）。脾臓のサブ集団の中で、濾胞期のＢ細胞において、新生Ｂ細胞や辺縁層Ｂ細胞と比べてＢＴＳの高い発現が見られた（図２Ｄ）。
【０１３５】
（ＢＴＳの細胞内および細胞表面局在）
ＢＴＳの局在性を検証するために、ＢＴＳ−ＧＦＰ融合タンパクと同様に、ＢＴＳのアミノ（Ｎ）またはカルボキシル（Ｃ）末端にＦｌａｇタグのついたＢＴＳを用意した。これらの改変ＢＴＳは、マウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４やヒト繊維芽細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅと同様、マウス未熟Ｂ細胞株ＷＥＨＩ２３１でも発現した。一方、これらのＮ、Ｃ末端ＦｌａｇタグＢＴＳを発現している細胞は、細胞表面が抗Ｆｌａｇで染色されず、細胞内が明らかに染色された。このことは、ＢＴＳは主に細胞内で発現していることを示している（図３Ｂ）。しかしながら、導入体が表面ビオチン化や抗Ｆｌａｇで免疫沈降したとき、ビオチン化ＢＴＳが約３０ｋＤａタンパクとして同定された（図３Ａ）。このことは、ＢＴＳは細胞表面でも低レベルで発現していることを示している。これらのデータと一致し、ＢＴＳは共焦点顕微鏡解析により主に細胞内顆粒で検出された（図３Ｃ）。Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒと抗ｌｇｐ８５抗体で、ＢＴＳ導入体は共染色されなかったことから、ＢＴＳを含む顆粒はミトコンドリアやリソソームではないということが示された（データ未掲載）。
【０１３６】
（ＢＴＳのＢ細胞株増殖阻害誘発）
Ｂ細胞におけるＢＴＳの機能を解析するために、ＢＴＳをｐＭＸ−ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウィルスベクターを用いてＷＥＨＩ２３１細胞に導入した（Kitamuraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、vol.92：p9146-9150、（1995））。ＧＦＰ発現はウィルス感染から４８時間後にフローサイトメトリーにより観察した。ＧＦＰのみを導入した集団のＧＦＰ＋細胞の比率は感染後１４４時間にいたるまで一定であった。対照的に、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した集団のＧＦＰ＋細胞の数は時間経過と共に減少し、ＢＴＳ発現がＷＥＨＩ２３１細胞の増殖阻害を誘導したことを示した（図４）。観察された増殖阻害が他の細胞でも誘導されるかどうかを検証するため、ＢＴＳを、ｐｒｅ−Ｂ細胞リンパ球７０ｚ３、未熟Ｂ細胞リンパ球ＣＨ３１、成熟Ｂ細胞株ＷＥＨＩ２７９とＩＩＡ１．６、プラズマ細胞株Ｊ５５８、Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４、未熟Ｔ細胞株ＳＣＩＤを含む様々なタイプの細胞に、同様に導入した。ＧＦＰ＋集団の減少は未熟Ｂ細胞株（７０ｚ３、ＣＨ３１，ＷＥＨＩ２３１）でのみ観察され、成熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２７９，ＩＩＡ１．６）やプラズマ細胞株（Ｊ５５８）やＴ細胞株（２Ｂ４）では観察されなかった。
【０１３７】
ＢＴＳ誘導増殖阻害を確認するために、感染後、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞の細胞数を観察した。図５Ａに示すように、ＧＦＰ＋細胞は時間経過と共に増殖遅延を示し、最終的に増殖阻害を示した。ＧＦＰ＋ＢＴＳ導入体の減少は、ＢＴＳの過剰発現によるアポトーシスの誘導によるものと思われた。この可能性を検証するため、ＢＴＳ導入体にパンカスパーゼ（pan-caspase）阻害剤であるｚ−ＶＡＤを添加し、フローサイトメトリーで観察した。ＧＦＰ＋集団の減少はｚ−ＶＡＤの添加により変化しなかった（図５Ｂ）。一方、同量のｚ−ＶＡＤは抗ＩｇＭによるアポトーシスを阻害した（データ未掲載）。さらに、ＷＥＨＩ２３１導入体を、ＴＵＮＥＬ解析を用いてアポトーシス細胞を検出することにより、この結果を確認した。ＢＴＳ導入によりＴＵＮＥＬ陽性細胞の明らかな誘導は観察されなかった（図５Ｃ）。これらの結果より、未熟Ｂ細胞株において、ＢＴＳの過剰発現は増殖阻害を誘導するが、それは主にアポトーシスではないということが示唆された。
【０１３８】
（ＢＴＳの細胞周期進行・細胞分裂の阻害）
次に、ＢＴＳによる増殖阻害が細胞分裂の阻害によるものかどうかについて解析した。ＷＥＨＩ２３１細胞は抗ＣＤ２染色で導入体を分離するために、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ｒａｔＣＤ２構成物またはただのＩＲＥＳ−ｒａｔＣＤ２を用いて遺伝子導入し、ＣＦＳＥでラベルした。ラットＣＤ２発現細胞は、抗ラットＣＤ２染色と磁気ビーズで分離した。感染２４時間後のＣＦＳＥ染色解析により、ＢＴＳ導入体による細胞分裂の阻害が観察された（データ未掲載）。それから、血清飢餓状態において、ヨウ化プロピヂウム（ＰＩ）染色で細胞周期の進行状況を解析した。分離したラットＣＤ２＋導入体は、血清にさらされるか、ＦＣＳ含有培地飢餓で１１時間培養した。ＰＩ染色によりＢＴＳ導入体は明らかにＧ２／Ｍ期への細胞周期の進行を阻害し、一方、血清飢餓後の細胞の状況は、同レベルのＧ０／Ｇ１アレストを誘導した（図６Ａ）。これらのデータは、ＢＴＳが細胞周期の進行を阻害することを示している。ＢＴＳの細胞周期進行阻害活性に付け加えて、ＢＴＳ導入体の細胞サイズは、同じ細胞培養物のＧＦＰ−細胞や擬似導入体のものに比べて明らかに小さかった。このことは、ＢＴＳは細胞サイズの調節に関与することを示唆している（図６Ｂ）。
【０１３９】
（ＢＴＳのＮ末端による細胞増殖阻害機能）
ＢＴＳのどの部分が、観察された細胞分裂と増殖の阻害的機能に関与するかを調べるために、図７Ａに示すようなＮまたはＣ末端のどちらかが欠損したＢＴＳ変異体を用意した。これらの変異ＢＴＳをＷＥＨＩ２３１細胞に導入し、細胞増殖における阻害活性を解析した。図７Ｂに示されるようにＣ末端欠損導入体は阻害作用に変化がなかったのに対し（右のパネル）、ＢＴＳのＮ末端を欠失させるにしたがって、ＧＦＰ＋集団減少は徐々に弱化していった（左のパネル）。このことはＢＴＳのＮ末端がＢ細胞増殖の阻害作用に関連するということを明示している。
【０１４０】
（ＢＣＲ刺激におけるＢＴＳの減少）
Ｂ細胞における内因性ＢＴＳの機能を解析するために、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２によるＢＣＲ刺激下での、ＷＥＨＩ２３１におけるＢＴＳ発現を解析した。ｍＲＮＡ発現はＢＣＲ刺激数時間以内に減少した（図７Ｃ）。この結果は、ＢＴＳは定常状態で阻害的機能を示しており、ＢＣＲ刺激によるＢＴＳの減少はＢ細胞の増殖／生存を増加させるということを示唆しているかもしれない。しかしながら、ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１は、ＢＣＲ刺激による細胞死に対し、擬似導入体と比べて抵抗性がある（データ未掲載）。
【０１４１】
（ＢＴＳ発現キメラマウスにおけるＩｎ ｖｉｖｏ機能）
ＢＴＳの生理的機能を、ＢＴＳを発現している骨髄（ＢＭ）キメラを産出することにより検証した。このようなキメラマウスを産出するため、Ｌｙ５．１＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来Ｓｃａ−Ｉ＋ ＢＭ幹細胞を細胞分離により質を高め、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはコントロールＧＦＰのみを含むレトロウィルスを感染させ、致死的な量の放射線を浴びたＬｙ５．２＋マウスに導入した。ＧＦＰ＋細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、胸腺、脾臓、ＢＭ、リンパ節（ＬＮ）で観察され、６週間後に解析した。図８Ａに示すように、擬似キメラ由来のものと比べ、ＢＴＳキメラマウス由来のＰＢＬ、脾臓、ＢＭにおけるＢ２２０＋、Ｂ２２０−両集団のＧＦＰ＋細胞は際立って減少していた。この状態で全ての集団においてドナーの起源細胞（Ｌｙ５．１＋）の割合は８０％以上であり、導入したＧＦＰ＋細胞の純度はＳｃａ−１の質を高めた集団で９７％以上であったことより、これらの結果はＢＴＳの過剰発現はＢ細胞系細胞だけでなく未熟リンパ球系前駆細胞でも増殖阻害を引き起こすということを示している。さらにＢＴＳキメラマウスで、特定のＢ細胞の発達段階が強い効果を有するかどうかを解析した。しかしながら、ＢＭの集団（ｐｒｏ−、ｐｒｅ−、未熟、循環Ｂ細胞）の多くは同様の阻害を示し、同様に脾臓の全ての集団（新生、濾胞期、辺縁層Ｂ細胞）は同様の発達の機能的障害を示した（図８Ｂ）。ＧＦＰ＋細胞の形態は、全てのＢ細胞のサブセットにかかわらず、ＢＴＳと擬似キメラマウスでほぼ同じであった。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明のリンパ球分化または増殖調節剤、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法は、リンパ球分化または増殖調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ＢＴＳの構造を示す図である。 マウスおよびヒトＢＴＳのアミノ酸配列である。下線は４回膜貫通領域を示している。
【図２】ＢＴＳの発現を示す図である。（Ａ）−（Ｄ）様々な組織（Ａ）、脾臓の様々な細胞タイプ（Ｂ）、ＢＭのＢ細胞サブ集団（Ｃ）、脾臓のＢ細胞サブ集団（Ｄ）におけるＢＴＳｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ解析である。ＢＭと脾臓のＢ細胞サブ集団は以下のように定義した：ｐｒｏ−Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋；ｐｒｅ−Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２５＋；ＢＭ未熟Ｂ細胞、Ｂ２２０ｍｉｄＩｇＭ＋ＩｇＤ−；循環Ｂ細胞、Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋ＩｇＤ＋：新生Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１−ＣＤ２３−：濾胞期Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋；辺縁層Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３−。データは３個の平均±ＳＤを示している。
【図３】ＢＴＳの局在とトポロジーを示す図である。（Ａ）ＢＴＳ導入細胞の細胞表面におけるＢＴＳの発現。ＮおよびＣ末端にＦｌａｇタグを付したＢＴＳの発現しているＴ細胞ハイブリドーマは、表面をビオチン化し、細胞溶解物を抗Ｆｌａｇと免疫沈降（ＩＰ）し（上図）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。同じメンブレンを抗ＦｌａｇＭ２ｍ抗体で再ブロットした（下図）。（Ｂ）導入体におけるＢＴＳの細胞表面および細胞内染色。擬似（影）、Ｎ末端（細線）およびＣ末端（太線）にＦｌａｇタグしたＢＴＳを導入したＰｈｏｅｎｉｘ細胞を、細胞表面染色として抗ＦｌａｇＭ２で染色した（左図）。細胞内染色として（右図）、細胞を固定し０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で膜透過性化し、その後抗ＦｌａｇＭ２で染色した。（Ｃ）導入体におけるＢＴＳの細胞内局在。擬似（左図）、Ｎ末端（中央図）およびＣ末端（右図）にＦｌａｇタグしたＢＴＳを導入したＰｈｏｅｎｉｘ細胞をカバーガラス上に培養し、固定し、０．３％サポニンで膜透過性化し、抗ＦｌａｇＭ２−ビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色した（×１００）。
【図４】ＢＴＳの過剰発現がＢ細胞株において増殖阻害を誘導する図である。成熟Ｂ細胞やＴ細胞ではなく、未熟Ｂ細胞株においてＢＴＳ導入による増殖阻害がみられた。未熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１、７０ｚ３）、成熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２７９、ＩＩＡ１．６）、プラズマ細胞株（Ｊ５５８）、Ｔ細胞株（ＳＣＩＤ、２Ｂ４）に、レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（白四角）またはＩＲＥＳ−ＧＦＰ（黒菱形）を導入し、ＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリーで解析した。感染後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と感染４８時間後におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。
【図５】ＢＴＳの過剰発現がＢ細胞株において増殖阻害を誘導する図である。（Ａ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞の増殖遅延である。レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したＷＥＨＩ２３１を、フローサイトメトリーにて解析した。ＢＴＳ導入細胞におけるＧＦＰ＋（黒四角）およびＧＦＰ−（白四角）細胞の比率を感染４８時間後のＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞数の比率に対する割合として示した。（Ｂ）ＢＴＳによる増殖阻害はカスパーゼ依存性アポトーシスによるものではない。ｚ−ＶＡＤまたはコントロールのＤＭＳＯを、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＲＰまたはＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したＷＥＨＩ２３１に、感染４８時間後に添加した。ｚ−ＶＡＤ添加後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と時間０におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。記号；白菱形：添加なしのＢＴＳ導入体、白四角：ＤＭＳＯ添加ＢＴＳ導入体、星印：ｚ−ＶＡＤ添加ＢＴＳ導入体、黒菱形：添加なし擬似導入体、黒四角：ＤＭＳＯ添加擬似導入体、バツ印：ｚ−ＶＡＤ添加擬似導入体。（Ｃ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞のＴＵＮＥＬ解析。ＷＥＨＩ２３１にＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＢＴＳ）（右図）またはＩＲＥＳ−ＧＦＰ（擬似）（中央図）を導入した。感染３６時間後に死細胞を除去した後、細胞を固定し、膜透過性化し、製造元のマニュアルに従ってＴｄＴ活性を染色した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理した擬似導入体をポジティブコントロールとした（左図）。
【図６】細胞周期進行と細胞サイズ成長におけるＢＴＳの阻害的機能を示す図である。（Ａ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞の細胞周期解析。ＢＴＳ導入体は、血清枯渇後１１時間（左図）または継続してＦＣＳ含有培地で１１時間（右図）のどちらかで培養した。細胞は抗ラットＣＤ２と磁気ビーズで分離し、ＰＩ染色した。数字はＧ０／Ｇ１期（左）とＳ／Ｇ２／Ｍ期（右）の集団の割合を示している。擬似およびＢＴＳ導入細胞をそれぞれ上図、下図に示している。（Ｂ）ＢＴＳ発現は細胞サイズを小さく戻す。レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（下図）または擬似−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（上図）を導入したＷＥＨＩ２３１は、フローサイトメトリーにより前方散乱を用いて細胞サイズを計測した。細線はＧＦＰ−の集団を、太線はＧＦＰ＋の集団を示している。右の表はそれぞれの集団における平均蛍光強度を示している。
【図７】ＢＴＳの構造−機能相関関係を示す図である。（Ａ）４回膜貫通領域を有するＢＴＳの予想トポロジーである。それぞれの数字は膜貫通領域の両端のアミノ酸残基を示している。矢印のついた数字はＢＴＳ欠失変異の位置を示している。Ｎ：Ｎ末端からの欠失、Ｃ：Ｃ末端からの欠失。（Ｂ）ＢＴＳのＮ末端細胞内領域はＢ細胞増殖阻害に関与する。レトロウィルス感染によりＢＴＳの全長またはＮ末端欠失変異（左図）またはＣ末端欠失変異（右図）を導入したＷＥＨＩ２３１を、フローサイトメトリーにより解析した。感染後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と感染４８時間後におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。それぞれの記号は凡例に示されているそれぞれの欠失変異を示す。（Ｃ）ＢＣＲ刺激によるＢＴＳｍＲＮＡ発現の減少。ＷＥＨＩ２３１細胞を抗ＩｇＭＦａｂ（１０μｇ／ｍｌ）で表示時間刺激した。各時間におけるＢＴＳの相対的ｍＲＮＡ発現を、０時間におけるＢＴＳの相対的ｍＲＮＡ発現との比率で示している。
【図８】ＢＭキメラマウスにおけるＢＴＳのインビボ解析を示す図である。（Ａ）ＢＴＳキメラマウスのＰＢＬ，脾臓、ＢＭ由来のＢ細胞および非Ｂ細胞の発達。ＧＦＰ＋細胞とＧＦＰ−細胞の比率を測定した。データはＢ２２０＋細胞（黒棒）とＢ２２０−細胞（白棒）の平均±ＳＤを示している。（Ｂ）ＢＴＳ変換キメラマウスと擬似変換キメラマウス由来のＢＭおよび脾臓細胞を、サブ集団に分けるために染色した。それぞれのサブ集団は図１に示すように染色した。ＧＦＰ＋／−Ｂ２２０＋／−のパーセンテージを示す（上図）。それぞれのマウスのＧＦＰ＋またはＧＦＰ−集団中で、それぞれ表示したサブ集団のパーセンテージを示す。ＢＭおよび脾臓のサブ集団は表示した通り中央図および下図に示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球分化または増殖調節剤、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
防御免疫反応として、免疫系は病原体や抗原の感染を認識してＴ・Ｂ両リンパ球の抗原特異的クローンを充実させる。反応の終結と過度の反応を低減させるため、該リンパ球クローンは増殖阻害や細胞死により減少する。このような免疫反応に伴う大胆な調節機構は、適切な免疫において重要である。抗原受容体、共刺激受容体、細胞死受容体は、リンパ球のクローンサイズ調節において中心的な役割を果たすことが知られている。さらに、複数の異なる分子が細胞増殖および細胞死の調節に関与している。四回膜貫通を有する分子（tetra-spanning molecule）もまた、このような調節機構に関与している。
【０００３】
多数のtetra-spanning moleculeが同定され、二つのグループに分類されている。トランスメンブレン４スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）またはテトラスパニン（tetraspanin）（Maeckerら、FASEB J.、vol.11、p428-442、（1997）、Tarrantら、TRENDS in Immunol.、vol.24、p610-617、（2003））、そして４領域membrane-spanningサブファミリーＡ（ＭＳ４Ａ）（Ishibashiら、Gene、vol.264、p87-93、（2001）、Liangら、Genomics、vol.72、p119-127、（2001））である。これら二つのグループは、構造的および配列相同性で分類されている。前者のグループは、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２を含む約２０のタンパク質のメンバーを有し、膜ミクロドメインと離れて細胞膜に集まることにより、テトラスパンミクロ領域を構成すると考えられている（Vogtら、Immunol. Rev.、vol.189、p136-151、（2002））。テトラスパンミクロ領域に、制限されたペプチドレパートリーをのせたＭＨＣクラスＩＩ分子を濃縮し、抗原呈示を促進する（Kropshoferら、Nat. Immunol.、vol.3、p61-68、（2002））。
【０００４】
ＣＤ１９と関連してＣＤ８１は、Ｂ細胞においてＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介し、細胞活性の閾値を低下させることが示唆されている。ＣＤ８１−欠損マウスはＢ１ａリンパ球サブセットの発達の低下（基礎免疫グロブリンのレベル低下）、細胞表面ＣＤ１９の発現の減少、Ｔ細胞依存的抗体応答の低下を示した（Levyら、Annu. Rev. Immunol.、vol.16、p89-109、（1998）、Maeckerら、J. Exp. Med.、vol.185、p1505-1510、（1997））。同様に、Ｔ細胞依存的抗体応答はまたＣＤ３７−欠損マウスで低下した（Knobelochら、Mol. Cell Biol.、vol.20、p5363-5369、（2000））。ＴＭ４ＳＦファミリーの分子はインテグリンやＦｃＲｓなどの広範囲にわたる細胞表面受容体に関連することが示されており、このような関連は細胞内のシグナル活性化や機能調節を誘発する（Kajiら、J. Immunol.、vol.166、p3256-3265、（2001））。
【０００５】
一方、ＭＳ４Ａファミリーは、ＣＤ２０、ＨＴｍ４、ＦｃεＲＩβや未同定の分子を含む。ＦｃεＲＩβは、ＩｇＥ受容体を構成するＩＴＡＭを構成要素として有することがよく知られており、マスト細胞やマクロファージで活性化シグナルの調節／増幅機能を示す（Maurerら、J. Exp. Med.、vol.179、p745-750、（1994）、Reth、Nature、vol.338、p383-384、（1989））。ＣＤ２０はＢ細胞の細胞死を調節しており、また、最近ではカルシウムチャネルとして機能することが示唆されている（Liら、J. Biol. Chem.、vol.278、p42427-42434、（2003）、Kanzakiら、J. Biol. Chem.、vol.272、p4964-4969、（1997））。特に、抗-ＣＤ２０モノクローナル抗体、リツキサン（rituximab）は、Ｂ細胞リンパ腫治療に適応されている（Glennieら、Immunol. Today、vol.21、p403-410、（2000）、Maloneyら、Semin. Oncol.、vol.29、p2-9、（2002））。細胞死を誘発するメカニズムはいまだ未知であるが、ＣＤＣ（compliment-dependent cytotoxicity）（Bannerjiら、Blood、vol.96、p164a、（2000）、Manchesら、Blood、vol.101、p949-954、（2003））、ＡＤＣＣ（Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity）（Clynesら、Nat. Med.、vol.6、p443-446、（2000）、Cartonら、Blood、vol.99、p754-758、（2002））、アポトーシス（Chanら、Cancer Research、vol.63、p5480-5489、（2003）、Shanら、Blood、vol.91、p1644-1652、（1998））を介して調節していると考えられている。ＨＴｍ４は、細胞周期調節に含まれることが報告されている（Donatoら、J. Clin. Invest.、vol.109、p51-58、（2002））。非リンパ組織においても多数のtetra-spanning moleculeがクローン化されているにもかかわらず、それらの機能のほとんどはいまだ未知である。
【０００６】
細胞増殖は始めの細胞サイズの増加に続くことが知られている。細胞サイズは栄養と代謝により調節されることが示されており、哺乳類のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は、細胞のエネルギー（Dennisら、Science、vol.294、p1102-1105、（2001））、栄養（Edingerら、Oncogene、vol.23、p5654-5663、（2004））、成長因子（Schemelzleら、Cell、vol.103、p253-262、（2000）、Rathmellら、J. Immunol.、vol.167、p6869-6876、（2001））に反応してこの細胞サイズ、細胞周期（Schemelzleら、Cell、vol.103、p253-262、（2000））、細胞分化（Sugataniら、J. Biol. Chem.、published online ahead of print December 7, 2004、Sarkerら、Oncogene、vol.23、p6064-6070、（2004））の調節に重要であることが示されている。Ｂ細胞では、ｍＴＯＲ経路はＢＣＲ刺激によるアルファ４／ＰＰ２Ａによって調節されることが示されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】イヌイら（Ｉｎｕｉ ｅｔ ａｌ．）、インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.）、（英国）、第１４巻、ｐ．１７７−１８７、（２００２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、リンパ球分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供し、これを標的とする新たな機序のリンパ球分化または増殖調節薬や、そのスクリーニング方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、Ｂ細胞に特異的に発現している、４回膜貫通型の分子ＢＴＳ（B cell-specific tetra-spanning molecule）を、未熟Ｂ細胞に過剰発現させると、その細胞の分化および増殖が著しく阻害されたこと等から、ＢＴＳがＢ細胞の分化または増殖を制御し得る分子であり、リンパ球分化または増殖調節薬開発等のための新たなターゲット分子として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、以下のものを提供する：
（１）ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤、
（２）該リンパ球がＢ細胞またはリンパ球系前駆細胞である、上記（１）記載の剤、
（３）該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質である、上記（１）記載の剤、
（４）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）である、上記（３）記載の剤：
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸、
（５）リンパ腫、白血病、自己免疫疾患、膠原病、自己免疫性糸球体腎炎の予防・治療剤である、上記（３）記載の剤、
（６）該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質である、上記（１）記載の剤、
（７）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質が、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸である、上記（６）記載の剤、
（８）悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群、感染症の予防・治療剤である、上記（６）記載の剤、
（９）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法、
（１０）以下の工程を含む、上記（９）記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として選択する工程、
（１１）以下の工程を含む、上記（９）記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として選択する工程、
（１２）ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法、
（１３）生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法、
（１４）ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬、
（１５）ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、またはその部分配列からなるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリンパ球分化または増殖調節剤は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し、新たなメカニズムのリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患予防・治療剤などとして有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでリンパ球分化または増殖を調節し得る物質を得ることができるので、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患予防・治療剤等の医薬品の開発や免疫学の研究などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＢＴＳ（B cell-specific tetra-spanning molecule）とは、Ｂ細胞に特異的に発現している４回膜貫通分子であり、そのアミノ酸配列、核酸配列は公知である。ＢＴＳは既知のモチーフを有さないが、後述の実施例から明らかなように、ＢＴＳを過剰発現させた未熟Ｂ細胞等において分化および増殖が著しく阻害されたこと等から、ＢＴＳがＢ細胞の分化または増殖を制御し得る分子であること等に基づき、以下に記載された発明が提供される。
【００１２】
（１．リンパ球分化または増殖調節剤）
本発明はＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤を提供する。
【００１３】
ＢＴＳ遺伝子の発現とは、ＢＴＳ遺伝子からの翻訳産物（即ち、ポリペプチド）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。
【００１４】
本発明において、分化または増殖調節の対象となるリンパ球としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはリンパ球系前駆細胞等が挙げられ、例えば、Ｂ細胞、リンパ球系前駆細胞が好ましい。Ｂ細胞としては、例えば、ｐｒｏ-Ｂ細胞、ｐｒｅ-Ｂ細胞、未熟（immature）Ｂ細胞、成熟（mature）Ｂ細胞、ＧＣ（germinal center）Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質（plasma）細胞等が挙げられる。
【００１５】
一実施態様では、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質は、ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質であり得る。
【００１６】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質は、ＢＴＳ遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、ＢＴＳ遺伝子の発現の促進としては、ＢＴＳポリペプチド自体の補充をも含むものとする。
【００１７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【００１８】
本発明において、ＢＴＳポリペプチドとしては、任意の哺乳動物のＢＴＳポリペプチドを用いることが出来る。
【００１９】
哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００２０】
哺乳動物のＢＴＳポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型ＢＴＳポリペプチド（例えば、配列番号２（GenBankアクセッション番号：AAH32672）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、マウス野生型ＢＴＳポリペプチド（例えば配列番号４（GenBankアクセッション番号：AAH21548）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）等が挙げられる。また、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
【００２１】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２２】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、ＢＴＳポリペプチドの機能（活性）が性質的に野生型ＢＴＳポリペプチドと同質であることを示す。したがって、ＢＴＳポリペプチドの機能（活性）が野生型ＢＴＳポリペプチドと同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうＢＴＳポリペプチドの機能（活性）としては、後述の実施例において、ＢＴＳポリペプチド強制発現Ｂ細胞では増殖阻害が見られたことより、リンパ球の分化および増殖抑制等が挙げられる。該機能の測定は、例えば、Ｂ細胞にＢＴＳポリペプチドを強制発現させ、該細胞の分化または増殖の抑制の程度を測定することにより行うことができる。
【００２３】
また、本発明においてＢＴＳポリペプチドは、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型ＢＴＳポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをも含む。該ポリペプチドとしては、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型ＢＴＳと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、ポリペプチドの細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（PTD）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。より具体的には、タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。また、PTDとしては、ANTENNAPEDIA、HIV/TAT、HSV/VP-22等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。アミノ酸が付加される位置は、当該ポリペプチドの活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、野生型ＢＴＳポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列の末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。
【００２４】
ＢＴＳポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２５】
ＢＴＳポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２６】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、該ＢＴＳポリペプチドを発現する哺乳動物の細胞又は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。ＢＴＳポリペプチドを発現する細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）等を挙げることが出来るが、特に限定されない。具体的には、該哺乳動物の細胞又は組織をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２７】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＢＴＳポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。
【００２８】
ＢＴＳポリペプチド又はその塩は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を培養してＢＴＳポリペプチドを生成せしめ、得られる培養物から該ポリペプチドを分離・精製することによって製造することもできる。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、ＢＴＳポリペプチドをコードするcDNA、mRNA、染色体DNAのヌクレオチド配列が含まれ、より具体的には、例えばヒト野生型ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号１（GenBankアクセッション番号：BC032672））、マウス野生型ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号３（GenBankアクセッション番号：BC021548））等を挙げることが出来る。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、該ヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーと、該ヌクレオチド配列を有する染色体DNA、mRNA、cDNA等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００２９】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００３０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）などが用いられる。
【００３１】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターを、自体公知の方法に従って宿主へ導入することにより、ＢＴＳポリペプチドを発現可能な形質転換体を製造することが出来る。
【００３２】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外にＢＴＳポリペプチドを生成させることができる。更に、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＢＴＳポリペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
【００３３】
ＢＴＳ遺伝子の発現又は機能を促進する物質としてＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を用いる場合、該核酸としては上述と同様のものを用いることが出来る。
【００３４】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、適切な発現ベクターに含まれた態様で用いられることが好ましい。即ち、該核酸は適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結され得る。
【００３５】
また、リンパ球分化または増殖を効果的に調節するため、該発現ベクターは適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内で機能可能なものが用いられる。該発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物のリンパ球への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３６】
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR、ラウス肉腫ウイルスLTR、MoMuLV由来LTR、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター；ＣＤ１９プロモーター等のＢ細胞特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３７】
該発現ベクターは、好ましくはＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００３８】
一実施態様では、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質は、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質であり得る。ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質は、ＢＴＳ遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００３９】
ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質としては、例えばＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸等を挙げることが出来る。
【００４０】
目的核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４１】
ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスＢＴＳ」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、ＢＴＳ遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＢＴＳは、ＢＴＳポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすることができ、mRNAの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
【００４２】
アンチセンスＢＴＳの標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＢＴＳポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするmRNAまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＢＴＳをコードする核酸（例えばmRNA又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、ＢＴＳをコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、ＢＴＳ遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
【００４３】
さらに、アンチセンスＢＴＳは、ＢＴＳポリペプチドをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、ＢＴＳポリペプチドをコードする二本鎖DNAと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４４】
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。
【００４５】
ＢＴＳをコードするmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＢＴＳに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００４６】
ＢＴＳをコードするmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴRNA（siRNA）もまた、アンチセンスＢＴＳに包含され得る。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAの一方の鎖に相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。siRNAの大きさは、RNAiを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、15bp以上、好ましくは20bp以上であり得る。RNAｉ活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA／RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４７】
上述のＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（リンパ球等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００４８】
本発明の剤は、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
【００４９】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５０】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５１】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５２】
ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン（lipfectamine）、DOGS（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、DOPE（1,2-ジオールエオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOTAP（1,2-ジオールエオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン）、DDAB（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、DHDEAB（N,N-ジ-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、HDEAB（N-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００５３】
また、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がポリペプチドである場合、該ポリペプチドの細胞内への導入効率を高めるために、本発明の剤は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（IMGENEX社製）等を用いることが出来る。
【００５４】
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００５５】
本発明の剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。例えば、本発明の剤が医薬である場合、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の予防・治療剤として使用され得る。
【００５６】
詳細には、本発明の医薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を亢進する物質を含有する場合、該物質は、リンパ球分化または増殖を低下し得るので、例えば、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患としては、例えば、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫等）、白血病（Ｂ細胞性等）、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ・多発性硬化症・多発性筋炎・重症筋無力症・ギランバレー症候群等）、膠原病（橋本病・全身性エリテマトーデス等）、自己免疫性糸球体腎炎等が挙げられる。
【００５７】
また、本発明の医薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質を含有する場合、該物質は、リンパ球分化または増殖を亢進し得るので、例えば、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患としては、例えば、悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群（エイズ等）、多くの感染症（難治性感染症等）等が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の剤が研究用試薬である場合、例えば、実験動物におけるリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の誘発剤として使用され得る。詳細には、本発明の研究用試薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質を含有する場合、例えば、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の誘発に使用され得る。本発明の研究用試薬が、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質を含有する場合、例えば、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の誘発に使用され得る。リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患及びリンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患は、それぞれ上述と同様である。
【００５９】
（２．リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得る物質は、リンパ球分化または増殖を調節し得る。従って、本発明は、被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を含有してなるリンパ球分化または増殖調節剤を提供する。
【００６０】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００６１】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得るかを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得る物質を選択する工程；
（ｃ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として得、或いはＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として得る工程。
【００６２】
上記において、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得る物質を選択する場合、例えば工程（ａ）において、被験物質とＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較する。
ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞とは、ＢＴＳ遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＢＴＳ遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、ＢＴＳ遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、好ましくは上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００６３】
ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞は、ＢＴＳ遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）等を挙げることが出来るが、特に限定されない。
【００６４】
ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＢＴＳ遺伝子転写調節領域は、ＢＴＳ遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＢＴＳ遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、GUS（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、LUC（ルシフェラーゼ）遺伝子、CAT（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００６５】
ＢＴＳ遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＢＴＳ遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＢＴＳ遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＢＴＳ遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞が好ましい。また、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質を得るという目的より、リンパ球（リンパ球由来の細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１等）を含む）を用いることがより好ましい。
【００６６】
ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００６７】
次に先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＢＴＳ遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＢＴＳ遺伝子の産物、例えば、転写産物（mRNA）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。一方、ＢＴＳ遺伝子の発現を測定可能な細胞として、ＢＴＳ遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００６８】
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＢＴＳ遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００６９】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、ＢＴＳ遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得る被験物質が選択される。
【００７０】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で選択されたＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質がリンパ球分化または増殖を低下し得る物質として、或いはＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質がリンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として獲得される。
【００７１】
更に工程（ｂ）と（ｃ）の間に、工程（ｂ´）として工程（ｂ）で選択された物質がリンパ球分化または増殖を調節し得るか確認し、該効果が確認された物質を工程（ｃ）においてリンパ球分化または増殖を調節し得る物質として得ることも出来る。これにより、より高い効率で目的とする物質を獲得することが出来る。
【００７２】
工程（ｂ´）においては、例えば、工程（ｂ）で選択された物質（候補物質）とリンパ球（リンパ球由来の細胞株を含む）とを接触させ、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖を測定し、該機能を候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖と比較する。
【００７３】
リンパ球に対する候補物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）中で行われ得る。培養条件は、限定されないが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。このとき、リンパ球は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【００７４】
リンパ球分化または増殖の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、リンパ球分化（例えばリンパ球前駆細胞の成熟リンパ球への分化）は、後述の実施例のような骨髄キメラ動物の解析や、細胞表面または細胞質分子の発現・消失等の測定（例えば抗ＩｇＤ抗体を用いた染色等）等により、リンパ球増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、遺伝子発現の変化はRT-PCRやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【００７５】
次いで、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖が、候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖と比較される。リンパ球分化または増殖の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。候補物質を接触させない対照リンパ球における分化または増殖は、候補物質を接触させたリンパ球における分化または増殖の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、候補物質によるリンパ球分化または増殖の調節作用が確認される。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法はまた、被験物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現量を調節する被験物質が選択され得る。
【００７７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質はリンパ球分化または増殖を低下し得るので、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。また、ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質はリンパ球分化または増殖を亢進し得るので、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。従って、ＢＴＳ遺伝子の発現を指標として、種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【００７８】
（３．リンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法）
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖の異常をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法、当該方法により同定されるリンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型を含むポリペプチド・核酸分子を提供する。
【００７９】
ＢＴＳ遺伝子の多型とは、ある母集団において、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAにおける１以上のDNAの置換、欠失、付加（例えば、SNP、ハプロタイプ）、並びに該ゲノムDNA中の部分領域の反復、逆位、転座などであり得る。本発明の方法により同定されるＢＴＳ遺伝子の多型のタイプは、ＢＴＳ遺伝子における全てのタイプの多型のうち、リンパ球分化または増殖に異常（亢進又は低下）を有する動物と異常を有していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異であり、例えば、ＢＴＳ遺伝子の発現の変化をもたらすものであり得る。なお、ＢＴＳ遺伝子多型の解析対象となる動物は上述の哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
【００８０】
解析工程は、連鎖解析等の自体公知の方法により行われ得る。リンパ球分化または増殖の異常、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の有無により特定の遺伝子多型の保有頻度に有意差が認められたとき、そのタイプの遺伝子多型を保有する対象は、保有しない対象よりもリンパ球分化または増殖に異常を有するリスク、又はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクが相対的に高い又は低いと判定される。
【００８１】
本発明の同定方法は、哺乳動物由来の生体試料から調製されたDNAサンプルをシークエンシング (sequencing) に供し、ＢＴＳ多型の新たなタイプを決定する工程をさらに含むこともできる。生体試料は、ＢＴＳ遺伝子の発現組織又は細胞（例えば、リンパ球）を含む試料（例えば、血液）のみならず、毛髪、爪、皮膚、粘膜等のゲノムDNAを含む任意の組織も使用できる。入手の容易性、人体への負担等を考慮すれば、生体試料は、毛髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましい。遺伝子多型の決定は、由来が異なる生体試料に含まれるゲノム又は転写産物のヌクレオチド配列を多数解析し、決定されたヌクレオチド配列中に一定頻度で見出される変異を同定することで行われ得る。
【００８２】
更に、見出された変異が実際にＢＴＳ遺伝子の発現に変化をもたらし得るか、確認してもよい。例えば、該変異を有するＢＴＳ遺伝子を、ＢＴＳ遺伝子の機能的欠損を有するリンパ球（又はその細胞株）へ導入し、該リンパ球における該ＢＴＳ遺伝子の発現を、該変異を有さないＢＴＳ遺伝子（野生型ＢＴＳ遺伝子等）の発現と比較することが出来る。或いは該変異を有するＢＴＳ遺伝子が導入されたリンパ球における分化または増殖を、該変異を有さないＢＴＳ遺伝子が導入されたリンパ球におけるものと比較してもよい。ＢＴＳ遺伝子の発現、リンパ球分化または増殖の測定は、上述と同様に行うことが出来る。
【００８３】
見出されたＢＴＳ遺伝子の変異がリンパ球分化または増殖の低下をもたらすものである場合、該変異はリンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることができる。また、見出されたＢＴＳ遺伝子の変異がリンパ球分化または増殖の亢進をもたらすものである場合、該変異はリンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることが出来る。
【００８４】
本発明の同定方法および当該方法により決定されたリンパ球分化または増殖の異常をもたらすＢＴＳ遺伝子多型は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定に有用である。
【００８５】
（４．リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法）
（４−１．発現量の測定に基づく判定方法および診断薬）
上述の様に、ＢＴＳポリペプチドはリンパ球分化または増殖を調節している。従って、本発明は、動物由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【００８６】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現量に基づきリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを評価する工程。
【００８７】
上記方法の工程（ａ）では、生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量が測定される。生体試料はリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを評価することが所望される動物、好ましくは哺乳動物由来である。ヒト由来の試料が最も好ましい。生体試料は、ＢＴＳ遺伝子を発現している組織又は細胞（例えば、リンパ球）を含む試料（例えば、血液）、あるいは該試料から分離された細胞であり得るが、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを判定する目的より、生体試料は、リンパ球またはそれを含む試料が好ましい。また、ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定は、上述と同様に行われ得る。
【００８８】
上記方法の工程（ｂ）では、ＢＴＳ遺伝子の発現量に基づき、生体試料が由来する動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患しているか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。
【００８９】
詳細には、先ず、測定されたＢＴＳ遺伝子の発現量が、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患していない動物（例えば、正常動物）由来の生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００９０】
次いで、ＢＴＳ遺伝子の発現量の比較結果より、生体試料が由来する動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。従って、ＢＴＳ遺伝子の発現が低下している場合には、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。また、本明細書中に開示された知見より、ＢＴＳ遺伝子の発現が促進している場合には、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。
【００９１】
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬を提供する。本発明の診断薬を用いれば、上記判定方法により、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクを容易に判定することが出来る。
【００９２】
ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬は、ＢＴＳ遺伝子の発現を定量可能である限り特に限定されないが、例えば、ＢＴＳポリペプチドを特異的に認識する抗体、ＢＴＳ遺伝子転写産物に対する核酸プローブ、またはＢＴＳ遺伝子転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断薬は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、FITC、FAM等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、3H、14C、32P、35S、125I等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００９３】
ＢＴＳ遺伝子転写産物に対する核酸プローブは、DNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、ＢＴＳ遺伝子の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【００９４】
ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＢＴＳ遺伝子転写産物を定量可能な試薬がプライマーである場合、本発明の診断薬は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【００９５】
本発明の上記判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の有無、あるいは該疾患に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、本発明は、例えば、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の容易且つ早期の発見などに有用である。
【００９６】
（４−２．多型の測定に基づく判定方法および診断薬）
本発明は、動物の生体試料を用いてＢＴＳ遺伝子の多型を測定することを含む、動物におけるリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【００９７】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物から採取した生体試料においてＢＴＳ遺伝子の多型を測定する工程；
（ｂ）多型のタイプに基づきリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症可能性を評価する工程。
【００９８】
上記方法の工程（ａ）では、動物から採取された生体試料においてＢＴＳ遺伝子の多型のタイプが測定される。動物としては、上述の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。生体試料は、本発明の多型の同定方法で使用し得るものと同様である。
【００９９】
多型のタイプの測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、RFLP（制限酵素切断断片長多型）法、PCR-SSCP（一本鎖DNA高次構造多型解析）法、ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ARMS（Amplification Refracting Mutation System）法、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法、RNAseA切断法、DOL（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、TaqMan PCR法、インベーダー法などが使用できる。
【０１００】
上記方法の工程（ｂ）では、多型のタイプに基づき、動物がリンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。特定の疾患を発症しやすい動物では、当該疾患に関連する遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られている。従って、ＢＴＳ遺伝子の機能を低下させるような多型を含む動物は、リンパ球分化または増殖の亢進に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。同様に、ＢＴＳ遺伝子の機能を促進するような多型を含む動物は、リンパ球分化または増殖の低下に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。従って、ＢＴＳ遺伝子の多型の解析より、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症可能性を判断することが可能である。なお、本工程で測定対象となる多型のタイプは、例えば、本発明の同定方法により得られたものであり得る。
【０１０１】
本発明はまた、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬を提供する。
【０１０２】
ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬は、ＢＴＳ遺伝子の多型を決定可能である限り特に限定されない。該試薬は、標識用物質で標識されていてもよい。また、該試薬が標識用物質で標識されていない場合、本キットは、該標識用物質をさらに含むこともできる。
【０１０３】
詳細には、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬は、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブ、あるいは特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマーを含むものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、ＢＴＳ遺伝子を含むゲノムDNAまたはＢＴＳ遺伝子転写産物に対するものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、転写産物またはゲノムDNAの抽出用試薬とともに提供されてもよい。
【０１０４】
特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブは、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を選別可能である限り特に限定されない。該プローブはDNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を選別可能とするため短ければ短いほどよく、例えば、約１５〜３０ｂｐのサイズであり得る。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。該プローブにより、例えばＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法が可能となる。
【０１０５】
特定のタイプの多型を有するＢＴＳ遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。このような複数のプライマーは、例えば、いずれか一方のプライマーの３’末端に多型部位を含むように設計される。測定可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＢＴＳ遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＢＴＳ遺伝子の多型を測定し得る手段がＢＴＳ遺伝子転写産物に対するプライマー対である場合、判定キットは、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１０６】
また、ＢＴＳ遺伝子の多型の測定用試薬として、特定のタイプの多型部位を認識する制限酵素を含むものを挙げることもできる。このような試薬によれば、ＲＦＬＰによる多型解析が可能となる。
【０１０７】
本発明の上記判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定を可能とする。従って、本発明の判定方法及び診断薬は、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の予防を目的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
【０１０８】
（５．ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸）
（５−１．ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチド）
後述の実施例から明らかなように、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域を欠失させると、ＢＴＳによるリンパ球増殖抑制作用が減少することから、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はリンパ球分化または増殖の調節に大きく関与していることが理解される。したがって、本発明はまた、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドを提供する。
【０１０９】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域は、例えば、該ポリペプチドの推定アミノ酸配列の疎水性解析等により特定することができる。例えばマウスでは、Ｎ末端側から９８〜１１８アミノ酸が膜貫通領域であるため、マウスにおけるＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はＮ末端側から１〜９７アミノ酸の領域（配列番号６）であるといえる。また、ヒトでは、Ｎ末端側から１０２〜１２２アミノ酸が膜貫通領域であるため、ヒトにおけるＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はＮ末端側から１〜１０１アミノ酸の領域（配列番号８）であるといえる。なお、該ポリペプチドは、上述のＢＴＳポリペプチドと同様の方法にて得ることができる。
【０１１０】
また、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列の部分配列（少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは４３アミノ酸以上）からなるポリペプチドは特に制限されないが、後述の実施例において、Ｎ末端から５３アミノ酸を欠失させたマウスＢＴＳポリペプチドではＢＴＳによる増殖阻害作用に変化がなかったのに対し、Ｎ末端から８１アミノ酸を欠失させたマウスＢＴＳポリペプチドではＢＴＳによる増殖阻害作用に変化が見られたことより、例えばマウスでは、Ｎ末端側から５３〜９８アミノ酸の領域を含むことが好ましい。
【０１１１】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチド等は、以下に示すリンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法に使用することができるので有用である。
【０１１２】
（５−２．ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸）
本発明はまた、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸も提供する。該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、上述のように、該ヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーと、該ヌクレオチド配列を有する染色体DNA、mRNA、cDNA等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。なお、該核酸としては、例えば、配列番号５又は配列番号７で表されるヌクレオチド配列等が挙げられる。
【０１１３】
（６．リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法）
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域は、リンパ球の分化および増殖の調節に大きく関わり得ることから、当該領域に相互作用しうる物質はリンパ球分化および増殖を調節し得る。したがって、本発明はまた、被験物質がＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、または部分配列からなるポリペプチドと相互作用し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１１４】
スクリーニング方法に供される被験物質としては、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【０１１５】
本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドに接触させる工程；
（ｂ）被験物質の該ポリペプチドに対する結合能を測定する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドに結合能を有する被験物質を選択する工程。
【０１１６】
上記方法の工程（ａ）では、被験物質が該ポリペプチドと接触条件下におかれる。被験物質の該ポリペプチドに対する接触は、溶液中での被験物質と該ポリペプチドとの混合により行われ得る。
【０１１７】
該ポリペプチドは自体公知の方法により調製できる。例えば、上述のＢＴＳポリペプチドと同様の方法にて得ることができる。
【０１１８】
上記方法の工程（ｂ）では、該ポリペプチドに対する被験物質の結合能が測定される。結合能の測定は、自体公知の方法、例えば、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の使用）により行われ得る。
【０１１９】
また一つの態様として、被験物質はＢＴＳを天然で発現している細胞中で存在する分子（ポリペプチド等）であり得る。この場合、ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列または部分配列からなるポリペプチドを当該細胞に発現させ、該ポリペプチドを免疫沈降し、該ポリペプチドと共に沈殿する分子を同定することにより、該ペプチドと相互作用し得る分子を得ることができる。
【０１２０】
上記方法の工程（ｃ）では、該ポリペプチドに結合能を有する被験物質が選択される。ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域はリンパ球分化または増殖の調節に大きく関与しているので、該ポリペプチドに結合能を有する物質は、リンパ球分化および増殖を調節し得る。また、被験物質がＢＴＳを天然で発現している細胞中で存在する分子（ポリペプチド等）の場合、該ポリペプチドと相互作用する物質は、リンパ球分化および増殖に関与する分子であり得る。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
【０１２２】
〔１〕実験方法
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本ＳＬＣ（静岡、日本）より購入した。
【０１２３】
（試薬および抗体）
N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(O-Me)fluoromethyl ketone(Z-VAD-FMK）はＳｉｇｍａ（St Louis、MO）より購入した。ＰＥ結合抗ＩｇＭ、ＣＤ４３、ＣＤ４５．１、ＣＤ２１、ＣＤ４、ＣＤ３抗体、ＡＰＣ結合抗ＣＤ２５、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ８抗体、ビオチン結合抗ＩｇＤ、ＣＤ２３、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２抗体、ＰｅｒＣＰ結合抗Ｂ２２０抗体、ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５結合ストレプトアビジンはBD Pharmingenより購入した。抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２はＩＣＮ（Costa Mesa、CA）より購入した。
【０１２４】
（全長ＢＴＳのクローニング）
全長ＢＴＳは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベースに基づき、脾臓のｃＤＮＡからクローン化した。ＢＴＳのｃＤＮＡは、プライマー（５’プライマー、ＡＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＣ：配列番号９；３’プライマー、ＧＣＴＧＣＡＡＧＣＧＴＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＣ：配列番号１０）を用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１２５】
（定量的リアルタイムＰＣＲ）
定量的リアルタイムＰＣＲはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭＳＹＢＲＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ試薬（QIAGEN、UK）とプライマー（５’プライマー、ＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＴ：配列番号１１；３’プライマー、ＡＡＣＴＣＴＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡＡ：配列番号１２）とともに、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ（Hercules、CA）を用いて行った。
【０１２６】
（生化学的解析）
細胞表面ビオチン化、免疫沈降、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは既知の方法（Okazakiら、J. Bio. Chem.、vol.275：p35751-35758、（2000））にて行った。使用した抗体は抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Sigma、St Louis、MO）であった。
【０１２７】
（遺伝子導入）
ＢＴＳのｃＤＮＡをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（東京大学T.Kitamura博士提供）にサブクローニングし、Lipofectamine Plus（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅ細胞に遺伝子導入した。レトロウィルスを介した遺伝子導入は既知の方法（Yokosukaら、J. Exp. Med.、vol.195：p991-1001、（2002））にて行った。
【０１２８】
（細胞培養）
ＷＥＨＩ２３１細胞はT.Tsubata博士（東京医科歯科大学）により、７０ｚ３、ＣＨ３１，ＷＥＨＩ２７９細胞はO-Wang J博士（ＲＩＫＥＮ）により提供された。未熟胸腺ダブルネガティブ細胞株ＳＣＩＤは、Wiest博士（Fox Chase Institute、Philadelphia）により提供された。全ての細胞は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
【０１２９】
（顕微解析）
細胞はポリ−Ｌ−リジン（Sigma、St Louis、MO）コートしたカバースリップ上で培養し、遺伝子導入した。遺伝子導入４８時間後、細胞は４％パラフォルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで二回洗い、０．３％サポニン（Saponin）で膜透過性化した。その後抗−Ｆｌａｇ Ｍ２ビオチン（Sigma、St Louis、MO）とストレプトアビジン−ＰＥ（BD Pharmingen）で染色した。画像はライカ共焦点顕微鏡にて解析した。
【０１３０】
（細胞周期とアポトーシスの解析）
細胞周期解析は既知の方法（Hataら、J. Immunol.、vol.173(4)：p2453-61、(2004)）にて行った。つまり、ろ過の前に細胞を集め、ＰＢＳで洗い、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＰＢＳ液で、または氷上にて７０％エタノールで膜透過性化し、そしてＤＮＡを５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピヂウム（ＰＩ）、５０μｇ／ｍｌＲＮａｓｅ（Roche、Germany）で染色した。細胞周期プロファイルは、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒとＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ソフトウェア（BD Bioscience、San Jose、CA）を用いて解析した。アポトーシス細胞は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで解析する前に、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死同定キット、ＴＭＲレッド（Roche、Germany）を用い、terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling（ＴＵＮＥＬ）で算定した。
【０１３１】
（細胞増殖解析）
細胞増殖解析は既知の方法（Kohnoら、Blood、vol.105(5)：p2059-65、(2005)）にて行った。つまり、１×１０５細胞を２４ウェルプレート（FALCON、Lincoln Park、NJ）で培養し、表示時間にヨウ化プロピヂウムで染色し、生細胞（ＰＩネガティブ細胞）をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Bioscience、San Jose、CA）でカウントした。
【０１３２】
（骨髄（ＢＭ）キメラの産出）
Ｌｙ５．１＋Ｃ５７ＢＬ／６マウス（三共、東京、日本）に５−フルオロウラシル（Sigma、St Louis、MO）を腹腔内投与した（１５０ｍｇ／ｋｇ）。４日後、ＢＭ細胞を抗ＳｃａＩ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec、Germany）で染色し、続けて磁気細胞分離（MACS、Miltenyi Biotec、Germany）した。細胞は、サイトカイン混合物[２０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３（Peprotech、UK）、１００ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ（Peprotech、UK）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６]を含む培地で、ＩＲＥＳ−ＧＦＰの形態でレトロウィルス構成物を含むウィルス上清と１０μｇ／ｍｌポリブレン（polybrene；Sigma、St Louis、MO）と共に３日間培養した。ＧＦＰ＋細胞はＦＡＣＳＡｒｉａ（BD Bioscience、San Jose、CA）で、９７％以上の精度で分離した。計６×１０５ＧＦＰ＋細胞を致死的な放射線を浴びたレピシエントＬｙ５．２＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャーリスリバー、横浜、日本）に注入した。マウスはＰＢＣ解析し、最終的には移植６週間後に解剖した。
【０１３３】
〔２〕結果
（Ｂ細胞特異的membrane tetra-spanning分子、ＢＴＳのクローニング）
本願発明者らは以前、ＣＤ８−キメラｃＤＮＡライブラリーを用いて、細胞活性を誘発する遺伝子をクローン化する機能的ｃＤＮＡクローニングシステムを開発した（Ohtsukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、vol.101：p8126-8131、（2004））。このシステムによりクローン化されたｃＤＮＡのひとつは、ＢＴＳと命名された（Ｂ細胞特異的Tetra-Spanning）（GenBank accession no.BC021548：配列番号１）。全長マウスおよびヒトＢＴＳのｃＤＮＡはクローン化され（GenBank accession no.BC009731）、推定アミノ酸配列を図１に示した。マウスおよびヒトＢＴＳはそれぞれ２６９、２７４アミノ酸をコード化し、既知のどのようなモチーフも有していない。疎水性解析により、ＢＴＳはＴＭ３とＴＭ４の間に明確な細胞外領域を有さない、４つの膜貫通領域を有することが示された。ＢＴＳはシグナルペプチドを有さないという事実と共に、ＢＴＳは４ＴＭ含有分子でＮ、Ｃ両末端が細胞内にある構造を有する。
【０１３４】
様々なＢ細胞サブセットと異なる発育段階でのＢＴＳ発現を解析した。様々な組織でのＢＴＳの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ（図２）とノザンブロット（データ未掲載）で解析した。ＢＴＳは主に脾臓で発現しており、他の組織では、あったとしても非常に低レベルで発現していた（図２Ａ）。脾臓では、Ｂ細胞は主にＢＴＳを発現していた（図２Ｂ）。ＢＴＳはｐｒｅ−Ｂ細胞段階以降に発現し、その発現レベルはＢＭの発達段階に従い上昇した（図２Ｃ）。脾臓のサブ集団の中で、濾胞期のＢ細胞において、新生Ｂ細胞や辺縁層Ｂ細胞と比べてＢＴＳの高い発現が見られた（図２Ｄ）。
【０１３５】
（ＢＴＳの細胞内および細胞表面局在）
ＢＴＳの局在性を検証するために、ＢＴＳ−ＧＦＰ融合タンパクと同様に、ＢＴＳのアミノ（Ｎ）またはカルボキシル（Ｃ）末端にＦｌａｇタグのついたＢＴＳを用意した。これらの改変ＢＴＳは、マウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４やヒト繊維芽細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅと同様、マウス未熟Ｂ細胞株ＷＥＨＩ２３１でも発現した。一方、これらのＮ、Ｃ末端ＦｌａｇタグＢＴＳを発現している細胞は、細胞表面が抗Ｆｌａｇで染色されず、細胞内が明らかに染色された。このことは、ＢＴＳは主に細胞内で発現していることを示している（図３Ｂ）。しかしながら、導入体が表面ビオチン化や抗Ｆｌａｇで免疫沈降したとき、ビオチン化ＢＴＳが約３０ｋＤａタンパクとして同定された（図３Ａ）。このことは、ＢＴＳは細胞表面でも低レベルで発現していることを示している。これらのデータと一致し、ＢＴＳは共焦点顕微鏡解析により主に細胞内顆粒で検出された（図３Ｃ）。Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒと抗ｌｇｐ８５抗体で、ＢＴＳ導入体は共染色されなかったことから、ＢＴＳを含む顆粒はミトコンドリアやリソソームではないということが示された（データ未掲載）。
【０１３６】
（ＢＴＳのＢ細胞株増殖阻害誘発）
Ｂ細胞におけるＢＴＳの機能を解析するために、ＢＴＳをｐＭＸ−ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウィルスベクターを用いてＷＥＨＩ２３１細胞に導入した（Kitamuraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、vol.92：p9146-9150、（1995））。ＧＦＰ発現はウィルス感染から４８時間後にフローサイトメトリーにより観察した。ＧＦＰのみを導入した集団のＧＦＰ＋細胞の比率は感染後１４４時間にいたるまで一定であった。対照的に、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入した集団のＧＦＰ＋細胞の数は時間経過と共に減少し、ＢＴＳ発現がＷＥＨＩ２３１細胞の増殖阻害を誘導したことを示した（図４）。観察された増殖阻害が他の細胞でも誘導されるかどうかを検証するため、ＢＴＳを、ｐｒｅ−Ｂ細胞リンパ球７０ｚ３、未熟Ｂ細胞リンパ球ＣＨ３１、成熟Ｂ細胞株ＷＥＨＩ２７９とＩＩＡ１．６、プラズマ細胞株Ｊ５５８、Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４、未熟Ｔ細胞株ＳＣＩＤを含む様々なタイプの細胞に、同様に導入した。ＧＦＰ＋集団の減少は未熟Ｂ細胞株（７０ｚ３、ＣＨ３１，ＷＥＨＩ２３１）でのみ観察され、成熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２７９，ＩＩＡ１．６）やプラズマ細胞株（Ｊ５５８）やＴ細胞株（２Ｂ４）では観察されなかった。
【０１３７】
ＢＴＳ誘導増殖阻害を確認するために、感染後、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞の細胞数を観察した。図５Ａに示すように、ＧＦＰ＋細胞は時間経過と共に増殖遅延を示し、最終的に増殖阻害を示した。ＧＦＰ＋ＢＴＳ導入体の減少は、ＢＴＳの過剰発現によるアポトーシスの誘導によるものと思われた。この可能性を検証するため、ＢＴＳ導入体にパンカスパーゼ（pan-caspase）阻害剤であるｚ−ＶＡＤを添加し、フローサイトメトリーで観察した。ＧＦＰ＋集団の減少はｚ−ＶＡＤの添加により変化しなかった（図５Ｂ）。一方、同量のｚ−ＶＡＤは抗ＩｇＭによるアポトーシスを阻害した（データ未掲載）。さらに、ＷＥＨＩ２３１導入体を、ＴＵＮＥＬ解析を用いてアポトーシス細胞を検出することにより、この結果を確認した。ＢＴＳ導入によりＴＵＮＥＬ陽性細胞の明らかな誘導は観察されなかった（図５Ｃ）。これらの結果より、未熟Ｂ細胞株において、ＢＴＳの過剰発現は増殖阻害を誘導するが、それは主にアポトーシスではないということが示唆された。
【０１３８】
（ＢＴＳの細胞周期進行・細胞分裂の阻害）
次に、ＢＴＳによる増殖阻害が細胞分裂の阻害によるものかどうかについて解析した。ＷＥＨＩ２３１細胞は抗ＣＤ２染色で導入体を分離するために、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ｒａｔＣＤ２構成物またはただのＩＲＥＳ−ｒａｔＣＤ２を用いて遺伝子導入し、ＣＦＳＥでラベルした。ラットＣＤ２発現細胞は、抗ラットＣＤ２染色と磁気ビーズで分離した。感染２４時間後のＣＦＳＥ染色解析により、ＢＴＳ導入体による細胞分裂の阻害が観察された（データ未掲載）。それから、血清飢餓状態において、ヨウ化プロピヂウム（ＰＩ）染色で細胞周期の進行状況を解析した。分離したラットＣＤ２＋導入体は、血清にさらされるか、ＦＣＳ含有培地飢餓で１１時間培養した。ＰＩ染色によりＢＴＳ導入体は明らかにＧ２／Ｍ期への細胞周期の進行を阻害し、一方、血清飢餓後の細胞の状況は、同レベルのＧ０／Ｇ１アレストを誘導した（図６Ａ）。これらのデータは、ＢＴＳが細胞周期の進行を阻害することを示している。ＢＴＳの細胞周期進行阻害活性に付け加えて、ＢＴＳ導入体の細胞サイズは、同じ細胞培養物のＧＦＰ−細胞や擬似導入体のものに比べて明らかに小さかった。このことは、ＢＴＳは細胞サイズの調節に関与することを示唆している（図６Ｂ）。
【０１３９】
（ＢＴＳのＮ末端による細胞増殖阻害機能）
ＢＴＳのどの部分が、観察された細胞分裂と増殖の阻害的機能に関与するかを調べるために、図７Ａに示すようなＮまたはＣ末端のどちらかが欠損したＢＴＳ変異体を用意した。これらの変異ＢＴＳをＷＥＨＩ２３１細胞に導入し、細胞増殖における阻害活性を解析した。図７Ｂに示されるようにＣ末端欠損導入体は阻害作用に変化がなかったのに対し（右のパネル）、ＢＴＳのＮ末端を欠失させるにしたがって、ＧＦＰ＋集団減少は徐々に弱化していった（左のパネル）。このことはＢＴＳのＮ末端がＢ細胞増殖の阻害作用に関連するということを明示している。
【０１４０】
（ＢＣＲ刺激におけるＢＴＳの減少）
Ｂ細胞における内因性ＢＴＳの機能を解析するために、抗ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２によるＢＣＲ刺激下での、ＷＥＨＩ２３１におけるＢＴＳ発現を解析した。ｍＲＮＡ発現はＢＣＲ刺激数時間以内に減少した（図７Ｃ）。この結果は、ＢＴＳは定常状態で阻害的機能を示しており、ＢＣＲ刺激によるＢＴＳの減少はＢ細胞の増殖／生存を増加させるということを示唆しているかもしれない。しかしながら、ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１は、ＢＣＲ刺激による細胞死に対し、擬似導入体と比べて抵抗性がある（データ未掲載）。
【０１４１】
（ＢＴＳ発現キメラマウスにおけるＩｎ ｖｉｖｏ機能）
ＢＴＳの生理的機能を、ＢＴＳを発現している骨髄（ＢＭ）キメラを産出することにより検証した。このようなキメラマウスを産出するため、Ｌｙ５．１＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来Ｓｃａ−Ｉ＋ ＢＭ幹細胞を細胞分離により質を高め、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはコントロールＧＦＰのみを含むレトロウィルスを感染させ、致死的な量の放射線を浴びたＬｙ５．２＋マウスに導入した。ＧＦＰ＋細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、胸腺、脾臓、ＢＭ、リンパ節（ＬＮ）で観察され、６週間後に解析した。図８Ａに示すように、擬似キメラ由来のものと比べ、ＢＴＳキメラマウス由来のＰＢＬ、脾臓、ＢＭにおけるＢ２２０＋、Ｂ２２０−両集団のＧＦＰ＋細胞は際立って減少していた。この状態で全ての集団においてドナーの起源細胞（Ｌｙ５．１＋）の割合は８０％以上であり、導入したＧＦＰ＋細胞の純度はＳｃａ−１の質を高めた集団で９７％以上であったことより、これらの結果はＢＴＳの過剰発現はＢ細胞系細胞だけでなく未熟リンパ球系前駆細胞でも増殖阻害を引き起こすということを示している。さらにＢＴＳキメラマウスで、特定のＢ細胞の発達段階が強い効果を有するかどうかを解析した。しかしながら、ＢＭの集団（ｐｒｏ−、ｐｒｅ−、未熟、循環Ｂ細胞）の多くは同様の阻害を示し、同様に脾臓の全ての集団（新生、濾胞期、辺縁層Ｂ細胞）は同様の発達の機能的障害を示した（図８Ｂ）。ＧＦＰ＋細胞の形態は、全てのＢ細胞のサブセットにかかわらず、ＢＴＳと擬似キメラマウスでほぼ同じであった。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明のリンパ球分化または増殖調節剤、リンパ球分化または増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法は、リンパ球分化または増殖調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ＢＴＳの構造を示す図である。 マウスおよびヒトＢＴＳのアミノ酸配列である。下線は４回膜貫通領域を示している。
【図２】ＢＴＳの発現を示す図である。（Ａ）−（Ｄ）様々な組織（Ａ）、脾臓の様々な細胞タイプ（Ｂ）、ＢＭのＢ細胞サブ集団（Ｃ）、脾臓のＢ細胞サブ集団（Ｄ）におけるＢＴＳｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ解析である。ＢＭと脾臓のＢ細胞サブ集団は以下のように定義した：ｐｒｏ−Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ４３＋；ｐｒｅ−Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２５＋；ＢＭ未熟Ｂ細胞、Ｂ２２０ｍｉｄＩｇＭ＋ＩｇＤ−；循環Ｂ細胞、Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋ＩｇＤ＋：新生Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１−ＣＤ２３−：濾胞期Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋；辺縁層Ｂ細胞、Ｂ２２０＋ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３−。データは３個の平均±ＳＤを示している。
【図３】ＢＴＳの局在とトポロジーを示す図である。（Ａ）ＢＴＳ導入細胞の細胞表面におけるＢＴＳの発現。ＮおよびＣ末端にＦｌａｇタグを付したＢＴＳの発現しているＴ細胞ハイブリドーマは、表面をビオチン化し、細胞溶解物を抗Ｆｌａｇと免疫沈降（ＩＰ）し（上図）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。同じメンブレンを抗ＦｌａｇＭ２ｍ抗体で再ブロットした（下図）。（Ｂ）導入体におけるＢＴＳの細胞表面および細胞内染色。擬似（影）、Ｎ末端（細線）およびＣ末端（太線）にＦｌａｇタグしたＢＴＳを導入したＰｈｏｅｎｉｘ細胞を、細胞表面染色として抗ＦｌａｇＭ２で染色した（左図）。細胞内染色として（右図）、細胞を固定し０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で膜透過性化し、その後抗ＦｌａｇＭ２で染色した。（Ｃ）導入体におけるＢＴＳの細胞内局在。擬似（左図）、Ｎ末端（中央図）およびＣ末端（右図）にＦｌａｇタグしたＢＴＳを導入したＰｈｏｅｎｉｘ細胞をカバーガラス上に培養し、固定し、０．３％サポニンで膜透過性化し、抗ＦｌａｇＭ２−ビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色した（×１００）。
【図４】ＢＴＳの過剰発現がＢ細胞株において増殖阻害を誘導する図である。成熟Ｂ細胞やＴ細胞ではなく、未熟Ｂ細胞株においてＢＴＳ導入による増殖阻害がみられた。未熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２３１、ＣＨ３１、７０ｚ３）、成熟Ｂ細胞株（ＷＥＨＩ２７９、ＩＩＡ１．６）、プラズマ細胞株（Ｊ５５８）、Ｔ細胞株（ＳＣＩＤ、２Ｂ４）に、レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（白四角）またはＩＲＥＳ−ＧＦＰ（黒菱形）を導入し、ＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリーで解析した。感染後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と感染４８時間後におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。
【図５】ＢＴＳの過剰発現がＢ細胞株において増殖阻害を誘導する図である。（Ａ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞の増殖遅延である。レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したＷＥＨＩ２３１を、フローサイトメトリーにて解析した。ＢＴＳ導入細胞におけるＧＦＰ＋（黒四角）およびＧＦＰ−（白四角）細胞の比率を感染４８時間後のＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞数の比率に対する割合として示した。（Ｂ）ＢＴＳによる増殖阻害はカスパーゼ依存性アポトーシスによるものではない。ｚ−ＶＡＤまたはコントロールのＤＭＳＯを、ＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＲＰまたはＩＲＥＳ−ＧＦＰを導入したＷＥＨＩ２３１に、感染４８時間後に添加した。ｚ−ＶＡＤ添加後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と時間０におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。記号；白菱形：添加なしのＢＴＳ導入体、白四角：ＤＭＳＯ添加ＢＴＳ導入体、星印：ｚ−ＶＡＤ添加ＢＴＳ導入体、黒菱形：添加なし擬似導入体、黒四角：ＤＭＳＯ添加擬似導入体、バツ印：ｚ−ＶＡＤ添加擬似導入体。（Ｃ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞のＴＵＮＥＬ解析。ＷＥＨＩ２３１にＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＢＴＳ）（右図）またはＩＲＥＳ−ＧＦＰ（擬似）（中央図）を導入した。感染３６時間後に死細胞を除去した後、細胞を固定し、膜透過性化し、製造元のマニュアルに従ってＴｄＴ活性を染色した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理した擬似導入体をポジティブコントロールとした（左図）。
【図６】細胞周期進行と細胞サイズ成長におけるＢＴＳの阻害的機能を示す図である。（Ａ）ＢＴＳ導入ＷＥＨＩ２３１細胞の細胞周期解析。ＢＴＳ導入体は、血清枯渇後１１時間（左図）または継続してＦＣＳ含有培地で１１時間（右図）のどちらかで培養した。細胞は抗ラットＣＤ２と磁気ビーズで分離し、ＰＩ染色した。数字はＧ０／Ｇ１期（左）とＳ／Ｇ２／Ｍ期（右）の集団の割合を示している。擬似およびＢＴＳ導入細胞をそれぞれ上図、下図に示している。（Ｂ）ＢＴＳ発現は細胞サイズを小さく戻す。レトロウィルス感染によりＢＴＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（下図）または擬似−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（上図）を導入したＷＥＨＩ２３１は、フローサイトメトリーにより前方散乱を用いて細胞サイズを計測した。細線はＧＦＰ−の集団を、太線はＧＦＰ＋の集団を示している。右の表はそれぞれの集団における平均蛍光強度を示している。
【図７】ＢＴＳの構造−機能相関関係を示す図である。（Ａ）４回膜貫通領域を有するＢＴＳの予想トポロジーである。それぞれの数字は膜貫通領域の両端のアミノ酸残基を示している。矢印のついた数字はＢＴＳ欠失変異の位置を示している。Ｎ：Ｎ末端からの欠失、Ｃ：Ｃ末端からの欠失。（Ｂ）ＢＴＳのＮ末端細胞内領域はＢ細胞増殖阻害に関与する。レトロウィルス感染によりＢＴＳの全長またはＮ末端欠失変異（左図）またはＣ末端欠失変異（右図）を導入したＷＥＨＩ２３１を、フローサイトメトリーにより解析した。感染後の表示時間におけるＧＦＰ＋細胞と感染４８時間後におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ比率をプロットした。それぞれの記号は凡例に示されているそれぞれの欠失変異を示す。（Ｃ）ＢＣＲ刺激によるＢＴＳｍＲＮＡ発現の減少。ＷＥＨＩ２３１細胞を抗ＩｇＭＦａｂ（１０μｇ／ｍｌ）で表示時間刺激した。各時間におけるＢＴＳの相対的ｍＲＮＡ発現を、０時間におけるＢＴＳの相対的ｍＲＮＡ発現との比率で示している。
【図８】ＢＭキメラマウスにおけるＢＴＳのインビボ解析を示す図である。（Ａ）ＢＴＳキメラマウスのＰＢＬ，脾臓、ＢＭ由来のＢ細胞および非Ｂ細胞の発達。ＧＦＰ＋細胞とＧＦＰ−細胞の比率を測定した。データはＢ２２０＋細胞（黒棒）とＢ２２０−細胞（白棒）の平均±ＳＤを示している。（Ｂ）ＢＴＳ変換キメラマウスと擬似変換キメラマウス由来のＢＭおよび脾臓細胞を、サブ集団に分けるために染色した。それぞれのサブ集団は図１に示すように染色した。ＧＦＰ＋／−Ｂ２２０＋／−のパーセンテージを示す（上図）。それぞれのマウスのＧＦＰ＋またはＧＦＰ−集団中で、それぞれ表示したサブ集団のパーセンテージを示す。ＢＭおよび脾臓のサブ集団は表示した通り中央図および下図に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤。
【請求項２】
該リンパ球がＢ細胞またはリンパ球系前駆細胞である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）である、請求項３記載の剤：
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項５】
リンパ腫、白血病、自己免疫疾患、膠原病、自己免疫性糸球体腎炎の予防・治療剤である、請求項３記載の剤。
【請求項６】
該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質が、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群、感染症の予防・治療剤である、請求項６記載の剤。
【請求項９】
被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として選択する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項９記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として選択する工程。
【請求項１２】
ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法。
【請求項１３】
生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１４】
ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
【請求項１５】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、またはその部分配列からなるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項１】
ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質を含有してなる、リンパ球分化または増殖調節剤。
【請求項２】
該リンパ球がＢ細胞またはリンパ球系前駆細胞である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
ＢＴＳ遺伝子の発現を促進する物質が、以下の（ｉ）または（ｉｉ）である、請求項３記載の剤：
（ｉ）ＢＴＳポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項５】
リンパ腫、白血病、自己免疫疾患、膠原病、自己免疫性糸球体腎炎の予防・治療剤である、請求項３記載の剤。
【請求項６】
該ＢＴＳ遺伝子の発現を調節する物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項７】
ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制する物質が、ＢＴＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を有する核酸である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
悪性腫瘍、心不全、尿毒症、免疫不全症候群、感染症の予防・治療剤である、請求項６記載の剤。
【請求項９】
被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を調節し得るか否かを評価することを含む、リンパ球分化および増殖を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を促進し得る物質を、リンパ球分化または増殖を低下し得る物質として選択する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項９記載の方法：
（ａ）被験物質がＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＢＴＳ遺伝子の発現を抑制し得る物質を、リンパ球分化または増殖を亢進し得る物質として選択する工程。
【請求項１２】
ＢＴＳ遺伝子の特定の多型がリンパ球分化または増殖に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患をもたらすＢＴＳ遺伝子多型の同定方法。
【請求項１３】
生体試料におけるＢＴＳ遺伝子の発現量を測定することを含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１４】
ＢＴＳ遺伝子の発現量の測定用試薬を含む、リンパ球分化または増殖の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
【請求項１５】
ＢＴＳポリペプチドのＮ末端細胞内領域のアミノ酸配列、またはその部分配列からなるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２９８８４８（Ｐ２００６−２９８８４８Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２４２７３（Ｐ２００５−１２４２７３）
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１１月５日 日本免疫学会発行の「日本免疫学会総会・学術集会記録 第３４巻」に発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１１月５日 日本免疫学会発行の「日本免疫学会総会・学術集会記録 第３４巻」に発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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