ローソニア・イントラセルラーリスサブユニットワクチン
本発明は例えば新規Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列に関する。本発明は更にこれらの配列を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤーに関する。本発明は更に前記核酸配列、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞に関する。更に、本発明はこれらのヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質と、ワクチン製造のためのその使用に関する。本発明は更にＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンとその製造方法に関する。最後に、本発明はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡの検出、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原の検出及びＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は例えば新規Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列；これらの配列を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤー；前記核酸配列、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞；これらのヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質とワクチン製造のためのその使用；Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンとその製造方法；並びにＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡの検出、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原の検出及びＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ増殖性腸炎（ＰＰＥないしＰＥ）は近代養豚業で世界的に重要な疾患になっている。この疾患は成長中の集団の１５％〜５０％を冒し、既定問題集団における個体動物の３０％までを冒す。今日の年間経済損失は罹病したブタ１頭当たり５〜１０米ドルの飼料と施設の追加時間費用に相当すると推定されている。ＰＰＥは多様な臨床徴候（死亡、動物の蒼白及び貧血、水様性暗赤色又は茶赤色下痢、沈鬱、食欲低下及び運動失調、成長遅延及びＦＣＲ増加）からなる慢性及び急性症状である。しかし、一貫して２つの特徴がある。第１の特徴は検死でしか目に見えない病変であり、小腸及び結腸粘膜の肥厚である。第２の特徴は患部腸の腸細胞における細胞質内小型湾曲細菌の存在である。これらの細菌は現在ＰＰＥの病因物質として認められ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと呼ばれている。
【０００３】
長年にわたり、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓはサル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、及びダチョウやエミュに至る他の多様な動物を含むほぼ全動物に寄生することが認められている。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは鞭毛をもつグラム陰性菌であり、真核腸細胞のみで増殖し、無細胞培養は報告されていない。細胞中で生存増殖するためには、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは分裂中のクリプト細胞に侵入しなければならない。この細菌は細胞膜と結合し、液胞を通って腸細胞に迅速に侵入する。その後、迅速（３時間以内）に分裂し、分裂した細菌は細胞質内で自由に繁殖及び増殖する。この細菌が感染細胞の成熟を阻み、有糸分裂を続けさせ、未成熟クリプト細胞を形成させるメカニズムはまだ解明されていない。
【０００４】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染とこの疾患の治療及び防除に関する現在の研究はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを無細胞培地で培養できないという事実により阻まれている。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをラット腸細胞で同時培養するのに成功したという報告はあるが、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの防除用不活化ワクチンが明らかに必要とされているにも拘わらず、このようなワクチンの開発には至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは単独又は組み合わせてＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する防御免疫を誘導することが可能な６種の新規蛋白質を産生することが今回判明した。
【０００７】
これらの新規蛋白質を以下、３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質と言う。
【０００８】
新規蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示す。これらの蛋白質をコードする遺伝子を配列決定し、その核酸配列を配列番号１、３、５、７、９及び１１に示す。
【０００９】
多数の異なる核酸配列が同一蛋白質をコードし得ることは当分野で周知である。この現象はアミノ酸をコードする各三重項の２番目と特に３番目の塩基のゆらぎとして一般に知られている。この現象の結果、同一蛋白質をコードする２種の核酸には約３０％の不均一性が生じる。従って、約７０％の配列相同性をもつ２種の核酸配列は同一蛋白質をコードすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
従って、１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分に関し、前記核酸配列又はその部分は配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ。
【００１１】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００１２】
ヌクレオチド相同性はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅａ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００１３】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。マッチのリウォード：＋１。ミスマッチのペナルティ：−２。オープンギャップ：５。伸長ギャップ：２。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００１４】
所定核酸配列が本発明の核酸配列であるかどうかを決定するための別のアプローチはこの所定核酸配列が配列番号１（又は配列番号３、５、７、９又は１１、下記参照）に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするか否かに関する。
【００１５】
核酸配列が配列番号１、又は当然のことながら配列番号３、５、７、９及び１１に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするならば、その配列は本発明の核酸配列であるとみなされる。
【００１６】
ストリンジェント条件の定義はＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ（１９８４．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４．）の式：
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ
（式中、Ｍは１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの百分率であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである）に従う。
【００１７】
ストリンジェント条件は核酸配列又はそのフラグメントが最大１０％のミスマッチをもつ場合にも配列番号１、３、５、７、９又は１１のいずれかに記載の核酸配列とハイブリダイズする条件である。
【００１８】
本態様は配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００１９】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２０】
本態様は配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２１】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２２】
本態様は配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２３】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２４】
本態様は配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２５】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２６】
本態様は配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２７】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２８】
本発明は新規Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列を開示するので、これらの蛋白質を十分な量で獲得することが今回初めて可能になった。これは例えば前記蛋白質をコードする遺伝子を発現させるための発現システムを使用することにより実施することができる。
【００２９】
従って、より好ましい態様では、本発明は本発明の核酸配列を含むＤＮＡフラグメントに関する。このようなＤＮＡフラグメントは例えば本発明の核酸配列をクローニングするプラスミドとすることができる。このようなＤＮＡフラグメントは例えば下記のようにＤＮＡの量を増加するためにプライマー用として有用である。
【００３０】
核酸配列の発現の必須要件は核酸配列をプロモーターの制御下におくように適切なプロモーターが核酸配列に機能的に連結されていることである。当業者に自明の通り、プロモーターの選択は蛋白質発現用宿主細胞として使用される細胞で遺伝子転写を誘導することが可能な任意真核、原核又はウイルスプロモーターに及ぶ。従って、本態様の更に好ましい形態は機能的に連結されたプロモーターの制御下のおかれた本発明のＤＮＡフラグメント又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは例えば標準分子生物学技術により得られる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６））。機能的に連結されたプロモーターは連結相手の核酸配列の転写を制御することが可能なプロモーターである。
【００３１】
このようなプロモーターはＬａｗｓｏｎｉａプロモーターとすることができ、例えば、プロモーターが発現に使用される細胞中で機能的であるという条件で３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ又は３１．４ｋＤ遺伝子をコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現に関与するプロモーターである。更に異種プロモーターでもよい。宿主細胞が細菌である場合には、使用することができる有用な発現制御配列としてはＴｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）、ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）、外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）、バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）、α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに選択宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び制御配列が挙げられる。
【００３２】
宿主細胞が酵母である場合には、有用な発現制御配列としては例えばα接合因子が挙げられる。昆虫細胞には、バキュロウイルスの多核体又はｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物起源の場合には、有用な発現制御配列の例としてはＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）が挙げられる。
【００３３】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞発現システムは非常によく使用されるシステムである。このようなシステムは当分野で周知であり、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，米国から市販されている。これらの発現システムに次いで寄生虫系発現システムが非常に魅力的な発現システムである。このようなシステムは例えば仏国特許出願公開第２７１４０７４号やＵＳ ＮＴＩＳ公開ＵＳ ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）に記載されている。
【００３４】
本態様の更に好ましい形態は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、本発明のＤＮＡフラグメント又は本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー（ＬＲＣ）に関する。このようなキャリヤーは例えば細菌及びウイルスである。これらのＬＲＣは付加遺伝情報（この場合には本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列）をクローニングした微生物又はウイルスである。このようなＬＲＣを感染させた動物はキャリヤーの免疫原に対してだけでなく、その遺伝コードを付加的にＬＲＣにクローニングする蛋白質（例えば３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質）の免疫原性部分に対しても免疫応答を発生する。細菌ＬＲＣの１例としては、当分野で公知の弱毒サルモネラ株を有利に使用することができる。
【００３５】
生きた組換えキャリヤー寄生虫は例えばＶｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））により記載されている。
【００３６】
また、核酸配列をターゲット細胞に導入する手段としてＬＲＣウイルスを使用することもできる。生きた組換えキャリヤーウイルスはベクターウイルスとも言う。ベクターとして使用されることが多いウイルスはワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら；ｉｎ Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（Ｅｄｓ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））である。
【００３７】
挿入した本発明の核酸配列の発現を宿主動物で誘導することが可能な選択細菌、寄生虫又はウイルスのゲノムに組換え核酸配列を導入するためには当分野で周知のｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え技術を使用することができる。
【００３８】
最後に、本発明の本態様の別の形態は機能的に連結されたプロモーターの制御下に本発明の蛋白質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むＤＮＡフラグメント又は前記核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は更に、本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はそのフラグメントをコードする核酸配列を含む生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞にも関する。
【００３９】
宿主細胞は細菌起源の細胞とすることができ、例えば大腸菌、枯草菌及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種をｐＢＲ３２２等の細菌系プラスミド、又はｐＧＥＸ等の細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み合わせる。宿主細胞は真核起源でもよく、例えば酵母細胞と酵母特異的ベクター分子の組み合わせや、高等真核細胞では昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８８））とベクター又は組換えバキュロウイルスの組み合わせ、植物細胞と例えばＴｉプラスミド系ベクター又は植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅら；Ｃｅｌｌ ３２：１０３３（１９８３））の組み合わせ、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はネコ腎由来細胞等の哺乳動物細胞と適当なベクター又は組換えウイルスの組み合わせが挙げられる。
【００４０】
本発明の別の態様は本発明の新規蛋白質及びその免疫原性フラグメントに関する。
【００４１】
免疫原性フラグメントの概念については下記に定義する。
【００４２】
本態様の１形態は例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列相同性をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４３】
１好適形態では、本態様は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４４】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００４５】
蛋白質相同性はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００４６】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。オープンギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００４７】
本態様の別の形態は例えば配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４８】
１好適形態は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４９】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５０】
本態様の別の形態は例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５１】
１好適形態は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５２】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５３】
本態様の別の形態は例えば配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５４】
１好適形態は配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５５】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５６】
本態様の別の形態は例えば配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５７】
１好適形態は配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５８】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５９】
本態様の別の形態は例えば配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００６０】
１好適形態は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００６１】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００６２】
当然のことながら、本発明の特定蛋白質には、個々のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ株間に天然変異が存在し得る。これらの変異としては全長配列のアミノ酸変異又は前記配列中の１もしくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加が挙げられる。生物及び免疫活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は例えばＮｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。同族アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化において頻発する置換は特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）である。他のアミノ酸置換としてはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは相同蛋白質間の機能的類似度を決定する迅速で高感度な蛋白質比較法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）。得られる蛋白質がその免疫反応性を維持する限り、本発明の典型的態様のこのようなアミノ酸置換と、欠失及び／又は挿入をもつ変異も本発明の範囲に含まれる。これは、本発明のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質が異なるフィールド単離株から単離した場合に同一免疫特徴をもつ同一蛋白質でありながら約９０％の相同性でよいことを説明するものである。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染又は少なくとも前記感染の臨床徴候に対する免疫応答を誘導することが可能な蛋白質を提供する本発明の所定蛋白質のアミノ酸配列の前記変異は「免疫原性に本質的に影響を与えない」とみなされる。
【００６３】
蛋白質を例えばワクチン接種目的又は抗体生産に使用する場合には、全長蛋白質を使用する必要はない。単独又は例えばＫＬＨ等のキャリヤーと結合して該当蛋白質に対する免疫応答を誘導することが可能な該当蛋白質のフラグメント、即ち所謂免疫原性フラグメントを使用することも可能である。「免疫原性フラグメント」とは宿主に免疫応答を誘導する能力を維持している全長蛋白質のフラグメント、即ちＢ又はＴ細胞エピトープを含むフラグメントを意味する。現在、抗原フラグメント（決定基）をコードするＤＮＡフラグメントを容易に同定するための各種技術が入手可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））により記載されている方法、即ち所謂ＰＥＰＳＣＡＮ法は蛋白質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出方法として、実施し易く、迅速な確立方法である。この方法は世界中で使用されており、それ自体当業者に周知である。この（経験的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、任意蛋白質をコードする遺伝子の配列が分かっているならば、コンピューターアルゴリズムにより、現在公知のエピトープとの配列及び／又は構造一致に基づいて特定蛋白質フラグメントを免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造側面の組み合わせに基づく。Ｔ細胞エピトープもＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ０７／００５，８８５）を使用してコンピューターにより配列から同様に予測することができる。概要は一般原理についてＳｈａｎ Ｌｕ，Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープについてＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総論についてＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ １０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープについてＢｅｒｚｏｗｓｋｙ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）に夫々記載されている。
【００６４】
従って、本発明の更に別の態様の１形態はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に対してブタを防御することが可能なワクチンであって、医薬的に許容可能なキャリヤーと共に上記のような本発明の１種以上の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含むワクチンに関する。
【００６５】
本発明の更に別の態様はワクチン用としての本発明の蛋白質に関する。
【００６６】
更に別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンの製造における本発明の蛋白質の使用に関する。
【００６７】
本発明のワクチンの製造方法の１例は感染腸壁から採取した粘膜スクレーピングから得られた細菌から本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを生化学的に精製する方法である。しかし、この方法は非常に時間のかかるワクチン製造方法である。
【００６８】
従って、本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子の発現産物をワクチンで使用するほうが著しく簡便である。本発明では３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列を示す。これらの遺伝子の発現産物に基づくこのようなワクチンは下記のように本発明の１種以上の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントを医薬的に許容可能なキャリヤーと混合することにより容易に製造することができる。
【００６９】
あるいは、本発明のワクチンは本発明の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントを発現することが可能な上記のような生きた組換えキャリヤーを含むことができる。例えば腸上皮又は例えば呼吸器上皮に感染するサルモネラキャリヤー又はウイルスキャリヤーに基づくこのようなワクチンはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの自然感染方法によく似ているという点でサブユニットワクチンよりも有利である。更に、組換えキャリヤーは免疫に必要な量が非常に少量ですむのでその自己増殖も利点である。
【００７０】
上記全ワクチンは能動的ワクチン接種に利用され、即ち宿主の免疫系は本発明の１種以上の蛋白質又はその免疫原性フラグメントによりトリガされ、これらの蛋白質に対する抗体を生産する。
【００７１】
あるいは、このような抗体は例えばウサギで生産することもできるし、下記のように抗体産生細胞株から得ることもできる。その後、このような抗体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接種方法即ち受動的ワクチン接種は動物が既に感染しており、自然免疫応答をトリガさせる時間がない場合の選択ワクチン接種である。これは免疫能の低下した動物にワクチン接種するのに好適な方法でもある。投与したＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体はこれらの場合には細菌と直接結合することができる。これはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ増殖をすぐに低下又は停止させるという利点がある。
【００７２】
従って、本発明の本態様の他の１形態は本発明の６種のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質のいずれかに対する抗体を含むワクチンに関する。
【００７３】
ワクチンは本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含む上記宿主細胞に基づくことができる。
【００７４】
効率的な代替ワクチン接種方法は該当抗原をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種である。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は多種多様の蛋白質で成功している。（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：２０−２６（１９９３）参照）。
【００７５】
このワクチン接種方法はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に対するブタのワクチン接種に非常に魅力的な方法である。
【００７６】
従って、本発明の本態様の更に他の形態は本発明の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を含むワクチンと、前記核酸配列を含むＤＮＡフラグメントを含むワクチンに関する。
【００７７】
本態様の更に他の形態は本発明の組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【００７８】
ＤＮＡワクチンは例えば無針注射器を使用して皮内投与により容易に投与することができる。この投与方法はＤＮＡをワクチン接種対象動物の細胞に直接送達する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量のＤＮＡで非常に良好な結果が得られる。
【００７９】
別の態様では、本発明のワクチンは他のブタ病原生物及びウイルスに由来する１種以上の抗原、又は前記抗原をコードする遺伝情報を更に含む。
【００８０】
このような生物及びウイルスは仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから構成される群から選択することが好ましい。
【００８１】
本発明の全ワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば滅菌水又は滅菌生理的塩類溶液とすることができる。より複雑な形態では、キャリヤーは例えば緩衝液とすることができる。
【００８２】
ワクチンの製造方法は本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントと医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む。
【００８３】
本発明のワクチンは１好適形態では更にアジュバントを含有する。アジュバントは一般に非特異的に宿主の免疫応答を誘発する物質を含む。多種多様なアジュバントが当分野で公知である。アジュバントの例としてはフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）、鉱油（例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｋｏｌ（登録商標））、植物油、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅが挙げられる。ワクチンは更に所謂「ビークル」を添加することができる。ビークルはポリペプチドが共有結合せずに付着する化合物である。多くの場合に使用されるビークル化合物は例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベントナイトである。
【００８４】
抗原がビークルに部分的に埋込められるこのようなビークルの特殊形態が所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２，ＥＰ１８０．５６４，ＥＰ２４２．３８０）である。
【００８５】
更に、ワクチンは１種以上の適当な表面活性化合物又は乳化剤（例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎ）を添加することができる。
【００８６】
多くの場合には、例えば分解し易いポリペプチドを分解しないようにするため、ワクチンの保存期間を延ばすため、又は凍結乾燥効率を改善するために、ワクチンを安定剤と混合する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９：５０９（１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストラン又はグルコース）、蛋白質（例えばアルブミン又はカゼイン又はその分解物）、及び緩衝液（例えばアルカリ金属リン酸塩）である。
【００８７】
更に、生理的に許容可能な希釈剤にワクチンを懸濁してもよい。
【００８８】
言うまでもなく、本発明では他のアジュバント添加、ビークル化合物もしくは希釈剤の添加、乳化又はポリペプチドの安定化方法も実施される。
【００８９】
本発明のワクチンは１〜１００μｇの量を投与すると非常に適切であるが、これ以下の量も原則として使用できる。１００μｇを越える用量は免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではない。
【００９０】
上記ＬＲＣウイルス及び細菌等の生きた弱毒組換えキャリヤーに基づくワクチンは感染中に自己増殖するので著しく低用量で投与することができる。従って、非常に適切な量は夫々細菌とウイルスで１０３ＣＦＵ／ＰＦＵ〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵである。
【００９１】
多数の投与方法を適用することができる。感染が消化管感染であるので、経口投与が非常に魅力的な投与方法である。１好適経口投与方法は胃の高酸性環境を通過後にしか崩壊しない当分野で公知であり且つ頻用されているカプセルにワクチンをパッケージングする方法である。また、胃のｐＨを一時的に上昇させるための当分野で公知の化合物とワクチンを混合してもよい。
【００９２】
例えばワクチンの筋肉内投与による全身投与も適切である。この経路を採用する場合には、全身投与について当分野で公知の標準手順が適切である。
【００９３】
疾患に対する防御の観点から、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の迅速で正確な診断が重要である。
【００９４】
従って、本発明の別の目的はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の検出に適した診断ツールを提供することである。
【００９５】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの検出用診断試験は例えば被験動物から単離した細菌ＤＮＡと３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードする遺伝子のコーディング配列に基づく特異的プローブ又はＰＣＲプライマーとの反応に基づく。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡが動物に存在するならば、例えば特異的ＰＣＲプライマーと特異的に結合した後、ＰＣＲ反応で増幅される。その後、ＰＣＲ反応産物はＤＮＡゲル電気泳動で容易に検出することができる。
【００９６】
ＤＮＡは被験動物の消化管から採取したスワブ中に存在する微生物から最も簡単に単離することができる。標準ＰＣＲ教科書にはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡとの選択的ＰＣＲ反応用プライマーの長さを決定するための方法が記載されている。少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列をもつプライマーを使用することが多いが、＞１５、より好ましくは＞１８ヌクレオチドのプライマーのほうが多少選択性が高い。特に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長のプライマーが非常に一般に適用可能である。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）に詳細に記載されている。
【００９７】
従って、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、更に好ましくは好適度の昇順で２０、２２、２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド長の前記核酸配列の部分であって、配列番号１又は３に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ核酸配列又はその部分も本発明に含まれる。このような核酸配列はこれらの配列によりコードされるＤＮＡの量を増加するためにＰＣＲ反応でプライマーとして使用することができる。こうして、例えば上記のように組織中のＬａｗｓｏｎｉａの検出用診断ツールとして使用するために特定ヌクレオチド配列を迅速に増幅することが可能になる。
【００９８】
別のＤＮＡ試験はスワブから得られた細胞材料の増殖後に慣用ＤＮＡ精製した後に３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質に特異的な放射性又は色素標識ＤＮＡフラグメントと慣用方法によりハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応はどちらも当分野で周知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。
【００９９】
従って、本発明の１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡの検出用診断試験に関する。前記試験は３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードするＤＮＡに特異的な本発明の核酸配列又はそのフラグメントを含む。前記ＤＮＡに特異的なフラグメントは他の細菌のＤＮＡよりもＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡ（例えば上記のような少なくとも１２ヌクレオチド長のプライマー）に対する相同性が高いため、同等条件下でＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡと良好に結合するフラグメントを意味する。
【０１００】
血清中のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗体の検出用診断試験は例えば本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントをＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁にコーティングする単純な標準サンドイッチＥＬＩＳＡ試験とすることができる。前記抗体の検出方法は例えば３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントを被験哺乳動物に由来する血清の存在下でインキュベーションした後に例えば該当哺乳動物抗体に対する標識抗体の存在下でインキュベーションする。その後、発色反応によりＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の有無を判定することができる。診断試験システムの別例は例えば本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントを含むウェスタンブロットを被験哺乳動物の血清の存在下でインキュベーションした後にブロットを分析する。
【０１０１】
従って、本発明の別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験に関する。前記試験は本発明の蛋白質又はそのフラグメントを含む。
【０１０２】
更に、本発明は血清中のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出方法に関し、前記方法は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントの存在下で血清をインキュベーションすることを含む。
【０１０３】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原の特異的３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質の抗原材料の検出に基づき、従ってＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の検出に適した診断試験は例えば標準ＥＬＩＳＡ試験とすることができる。前記試験の１例では、３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質に対する抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁にコーティングする。被験材料の存在下でインキュベーション後に、標識抗Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗体をウェルに添加する。その後、発色反応によりＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに由来する抗原材料の存在を検出する。
【０１０４】
従って、本発明の更に別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原材料の検出用診断試験に関する。前記試験は本発明の蛋白質又はそのフラグメントに対する抗体を含む。
【０１０５】
上記特徴をもつ本発明のポリペプチド又はその免疫原性フラグメントは抗体を生産するために使用することができ、抗体はポリクローナル、単一特異的又はモノクローナル（又はその誘導体）のいずれでもよい。ポリクローナル抗体が所望される場合には、ポリクローナル血清の作製及び処理技術は当分野で周知である（例えば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，ｅｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
【０１０６】
本発明のポリペプチド（又は本発明のその変異体又はフラグメント）に反応性のモノクローナル抗体は同様に当分野で公知の技術により近交系マウスに免疫することにより作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）。
【０１０７】
本発明の抗体の大規模製造方法も当分野で公知である。このような方法は本発明の蛋白質をコードする遺伝情報（のフラグメント）をファージディスプレイ用繊維状ファージにクローニングする。このような技術は例えばｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｇｅ”に“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ”の項目で記載されており、更にＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３−４５５、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５の各論文に記載されている。その後、ファージを使用してラクダ重鎖抗体を発現するラクダ発現ライブラリーをスクリーニングする。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーに由来する細胞を複製した後、抗体の大規模発現に使用することができる。
【０１０８】
本発明の更に別の態様は Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに由来する抗原材料の検出方法に関し、前記方法は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントに対する抗体の存在下に体液の組織である血清をインキュベーションすることを含む。
【０１０９】
最後に、本発明の１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は少なくとも２０、好ましくは好適度の昇順で２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド長の前記核酸配列の部分に関し、前記核酸配列又はその部分は配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ。このような核酸配列はこれらの配列によりコードされるＤＮＡの量を増加するためにＰＣＲ反応でプライマーとして使用することができる。こうして、例えば上記のように組織中のＬａｗｓｏｎｉａの検出用診断ツールとして使用するために特定ヌクレオチド配列を迅速に増幅することが可能になる。
【実施例１】
【０１１０】
感染ブタ回腸からのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの単離
ＰＥで死亡したブタからＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染回腸を抽出し、組織病理試験と抗酸性Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色により感染を確認し、−８０℃で保存した。解凍後、感染腸壁から採取した粘膜スクレーピングからＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ菌を単離した。Ｌａｗｓｏｎら（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３０３−３２３（１９８５））により記載されているように回腸スクレーピングをオムニミキサーでＰＢＳ中にて繰り返しホモジナイズし、細胞内細菌を遊離させた。細胞破片を除去するための低速遠心後に得られた上清を５．０、３．０、１．２、及び０．８μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。次に濾液を８０００ｇで３０分間遠心し、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ菌の小ペレットを得た。Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエントを使用してこれらの細菌を更に精製した。精製した細菌をＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２６１１−２６１５（１９９３））により同定し、位相差顕微鏡により単離細菌の純度（＞９５％）を試験し、汚染性細菌又は内臓破片の有無を調べた。
【０１１１】
細菌株及びプラスミド
ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含む大腸菌宿主株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）とプラスミドｐＥＴ２２ｂはＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，米国）から購入した。ｐＥＴ−ＨＩＳ１（１）はＳｃｈａｌｌｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５：２１０５−２１１６（１９９９）に記載されているように構築した。大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）から購入した。３０％グリセロールを加えた全細菌株のストックを−７０℃で保存した。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ細胞は上記のように感染回腸材料から単離した。
【０１１２】
培地、緩衝液及び抗生物質
Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）は常法に従って調製した。ＬＢプレートは常法に従ってＬＢ培地＋１．５％寒天を電子レンジで融解させることにより調製した。溶液を４５℃まで冷却後にプレートを注ぎ、必要に応じてアンピシリン（ＡＣＳ−Ｄｏｐｈａｒ，Ｒａａｍｓｄｏｎｋｓｖｅｅｒ，オランダ）を加えた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はＢｉｏｓｙｎｔｈ Ａｇ（Ｓｔａａｄ，スイス）から購入した。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅はＧｅｎｅａｍｐ ９７００ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して実施した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して実施した。ＰＣＲ混合物は５２Ｕ／ｍｌ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ，Ｅｘｐａｎｄ ＨＦ緩衝液に２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，米国），プライマー２０ｐｍｏｌｅ及び鋳型としてＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの染色体ＤＮＡ１５ｎｇを加えた。ＤＮＡの増幅に使用した全プライマーは表１に示す。
【０１１４】
ＤＮＡ単離
高純度Ｌａｗｓｏｎｉａ染色体ＤＮＡを得るために、Ｂｉｏｒａｄ染色体ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｒａｄ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，オランダ）を製造業者の指示に従って使用してＤＮＡを調製した。
【０１１５】
ＤＮＡシーケンシング
ＤＮＡはＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で配列決定した。シーケンシング混合物はＰＣＲ産物１００ｎｇ、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）２μｌ、プライマー２．４ｐｍｏｌｅ、緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）６μｌに蒸留水を加えて２０μｌとした。この混合物をＧｅｎｅａｍｐ ９７００でサイクルにかけた。プログラムは１０秒９６℃、５秒５０℃及び２分６０℃を２５サイクルとした。シーケンシングサイクル産物をＤｙｅ−Ｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で製造業者の指示に従って精製し、ＡＢＩ３１０自動シーケンサーで試験した。ＡＢＩ３１０ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して配列結果を集め、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で分析した。アラインメントはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して行った。配列分析はＳｅｑｕｅｎｃｅｒ ４．１．４（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＣＡ，米国）を使用して実施した。
【０１１６】
ライゲーション及び形質転換
ライゲーションはライゲーション酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，米国）１単位を加えた１×ライゲーション緩衝液中で１６℃にて一晩実施した。ライゲーション反応物１μｌを熱ショックにより大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞とＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌コンピテント細胞は緩衝液ＴＦＢ１（３０ｍＭ ＫＯＡｃ，１００ｍＭ ＲｂＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，５０ｍＭ ＭｎＣｌ２，１５％グリセロール）とＴＦＢ２（１０ｍＭ ＲｂＣｌ，７５ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ ＭＥＳ，１５％グリセロール）を使用してＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋの方法によりコンピテントにした。１０ｍＭ ＭｇＳＯ４と２０ｍＭグルコースを補充したＳＯＣ培地中で３７℃にて１時間回復後に、適当な抗生物質を加えたＬＢプレートに細胞をプレーティングした。
【０１１７】
１０ｘＨＩＳ融合蛋白質の発現
ｐＬｙｓＳｒａｒｅと発現ベクターを含む大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）をアンピシリン含有ＬＢ５ｍｌ中で３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。一晩培養液をアンピシリン含有ＬＢ５０ｍｌで１００倍に希釈した。ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩスペクトロフォトメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，オランダ）で測定したＯＤ６００が０．５に達するまでこの培養液を同一条件下で増殖させた。この時点（ｔ＝０）で培養液に終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧを加えて誘導し、引き続き３時間（ｔ＝３）増殖を続けた。１００μｌサンプルを分析用に採取した。ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含む大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を同一条件下で増殖及び誘導し、陰性対照としてサンプルを採取した。サンプルをＳＤＳ ｐａｇｅ後にＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色により下記のように分析した。残りの培養液を５，０００ｒｐｍで遠心し、ペレットを後期使用時まで−２０℃で保存した。
【０１１８】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，米国）からの４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用して実施した。分離前にサンプルをβ−メルカプトエタノールの存在下でサンプル緩衝液（サンプル：緩衝液＝２：１）と共に５分間煮沸した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色するか又は標準半乾燥ウェスタンブロット法によりＩｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ−ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，米国）にブロットした。ｎ−ＧＮＥ（水：油＝４５：５５）中で全細胞調製物に対してニワトリ抗Ｌａｗｓｏｎｉａポリクローナル血清を調製した。血清Ｅ２−８３９はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に典型的な臨床徴候と死後病変を生じたブタから入手した。血清はベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含むＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）からの等容量粗細胞抽出液を使用して４℃で４時間予備吸着させた。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
結果
Ｔ７発現ベクターにおけるＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子のクローニング
表１に示すプライマーを使用してＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を次に表２に示すように同一の２種類の制限酵素で予め切断しておいたｐＥＴ２２ｂ又はｐＥＴ−ＨＩＳ１にライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆに形質転換し、３７℃で一晩インキュベーションした。コロニーＰＣＲを使用して推定形質転換細胞が正しいプラスミドであるかどうかをチェックした。この結果、６個の異なる発現プラスミドが得られた。これらのプラスミドをヌクレオチド配列分析によりチェックした処、配列はクローニングストラテジーにより予想された通りであった。
【０１２２】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子の発現
表２に示す全プラスミドについて組換え蛋白質産生を試験した。プラスミドをＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅに形質転換し、誘導を実施した。誘導培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動とＣＢＢ染色により分析した（図１）。全６種の遺伝子は大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅで十分な発現を生じた。発現レベルは１５０μｇ／ｍｌに達した。
【０１２３】
ウェスタンブロットにより発現産物の分析
Ｌａｗｓｏｎｉａ全細胞をワクチン接種したニワトリの血清と、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に典型的な臨床徴候と死後病変を示したブタに由来する血清を使用して発現産物をウェスタンブロットにより分析した（図２）。組換えＬａｗｓｏｎｉａ蛋白質はニワトリ及びブタ血清により陽性であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ遺伝子の過剰発現のＮｕＰＡＧＥ分析。レーン１，分子量マーカー；レーン２，ｐＥＴ７６．７ Ｔ＝０；レーン３，ｐＥＴ７６．７ Ｔ＝３；レーン４，ｐＥＴ５６．８ Ｔ＝０；レーン５，ｐＥＴ５６．８ Ｔ＝３；レーン６，ｐＥＴ２４．８ Ｔ＝０；レーン７，ｐＥＴ２４．８ Ｔ＝３；レーン８，ｐＥＴ２８．８ Ｔ＝０；レーン９，ｐＥＴ２８．８ Ｔ＝３；レーン１０，ｐＥＴ３１．０ Ｔ＝０；レーン１１，ｐＥＴ３１．０ Ｔ＝３；レーン１２，ｐＥＴ３１．４ Ｔ＝０；レーン１３，ｐＥＴ３１．４ Ｔ＝３；レーン１４，Ｔ＝３，発現ベクターなし。矢印は発現産物の位置を示す。
【図２】大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ遺伝子の発現産物のウェスタンブロット。レーン１，ｐＥＴ３１．４；レーン２，ｐＥＴ２８．８；レーン３，ｐＥＴ３１．０；レーン４，ｐＥＴ２４．８；レーン５，ｐＥＴ ７６．７；レーン６，ｐＥＴ５６．８；レーン７，発現ベクターなし。矢印は発現産物の位置を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は例えば新規Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列；これらの配列を含むＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤー；前記核酸配列、ＤＮＡフラグメント、組換えＤＮＡ分子及び生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞；これらのヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質とワクチン製造のためのその使用；Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンとその製造方法；並びにＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡの検出、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原の検出及びＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ増殖性腸炎（ＰＰＥないしＰＥ）は近代養豚業で世界的に重要な疾患になっている。この疾患は成長中の集団の１５％〜５０％を冒し、既定問題集団における個体動物の３０％までを冒す。今日の年間経済損失は罹病したブタ１頭当たり５〜１０米ドルの飼料と施設の追加時間費用に相当すると推定されている。ＰＰＥは多様な臨床徴候（死亡、動物の蒼白及び貧血、水様性暗赤色又は茶赤色下痢、沈鬱、食欲低下及び運動失調、成長遅延及びＦＣＲ増加）からなる慢性及び急性症状である。しかし、一貫して２つの特徴がある。第１の特徴は検死でしか目に見えない病変であり、小腸及び結腸粘膜の肥厚である。第２の特徴は患部腸の腸細胞における細胞質内小型湾曲細菌の存在である。これらの細菌は現在ＰＰＥの病因物質として認められ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと呼ばれている。
【０００３】
長年にわたり、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓはサル、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマ、及びダチョウやエミュに至る他の多様な動物を含むほぼ全動物に寄生することが認められている。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは鞭毛をもつグラム陰性菌であり、真核腸細胞のみで増殖し、無細胞培養は報告されていない。細胞中で生存増殖するためには、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは分裂中のクリプト細胞に侵入しなければならない。この細菌は細胞膜と結合し、液胞を通って腸細胞に迅速に侵入する。その後、迅速（３時間以内）に分裂し、分裂した細菌は細胞質内で自由に繁殖及び増殖する。この細菌が感染細胞の成熟を阻み、有糸分裂を続けさせ、未成熟クリプト細胞を形成させるメカニズムはまだ解明されていない。
【０００４】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染とこの疾患の治療及び防除に関する現在の研究はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを無細胞培地で培養できないという事実により阻まれている。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをラット腸細胞で同時培養するのに成功したという報告はあるが、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの防除用不活化ワクチンが明らかに必要とされているにも拘わらず、このようなワクチンの開発には至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは単独又は組み合わせてＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する防御免疫を誘導することが可能な６種の新規蛋白質を産生することが今回判明した。
【０００７】
これらの新規蛋白質を以下、３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質と言う。
【０００８】
新規蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２、４、６、８、１０及び１２に示す。これらの蛋白質をコードする遺伝子を配列決定し、その核酸配列を配列番号１、３、５、７、９及び１１に示す。
【０００９】
多数の異なる核酸配列が同一蛋白質をコードし得ることは当分野で周知である。この現象はアミノ酸をコードする各三重項の２番目と特に３番目の塩基のゆらぎとして一般に知られている。この現象の結果、同一蛋白質をコードする２種の核酸には約３０％の不均一性が生じる。従って、約７０％の配列相同性をもつ２種の核酸配列は同一蛋白質をコードすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
従って、１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分に関し、前記核酸配列又はその部分は配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ。
【００１１】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９５％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００１２】
ヌクレオチド相同性はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅａ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＮ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００１３】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。マッチのリウォード：＋１。ミスマッチのペナルティ：−２。オープンギャップ：５。伸長ギャップ：２。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００１４】
所定核酸配列が本発明の核酸配列であるかどうかを決定するための別のアプローチはこの所定核酸配列が配列番号１（又は配列番号３、５、７、９又は１１、下記参照）に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするか否かに関する。
【００１５】
核酸配列が配列番号１、又は当然のことながら配列番号３、５、７、９及び１１に記載のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするならば、その配列は本発明の核酸配列であるとみなされる。
【００１６】
ストリンジェント条件の定義はＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ（１９８４．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４．）の式：
Ｔｍ＝［８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ］−１℃／１％ミスマッチ
（式中、Ｍは１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの百分率であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである）に従う。
【００１７】
ストリンジェント条件は核酸配列又はそのフラグメントが最大１０％のミスマッチをもつ場合にも配列番号１、３、５、７、９又は１１のいずれかに記載の核酸配列とハイブリダイズする条件である。
【００１８】
本態様は配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００１９】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２０】
本態様は配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２１】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２２】
本態様は配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２３】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２４】
本態様は配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２５】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２６】
本態様は配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の部分にも関する。
【００２７】
好ましくは、このＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記核酸配列の部分は配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の相同性をもつ。９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００２８】
本発明は新規Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列を開示するので、これらの蛋白質を十分な量で獲得することが今回初めて可能になった。これは例えば前記蛋白質をコードする遺伝子を発現させるための発現システムを使用することにより実施することができる。
【００２９】
従って、より好ましい態様では、本発明は本発明の核酸配列を含むＤＮＡフラグメントに関する。このようなＤＮＡフラグメントは例えば本発明の核酸配列をクローニングするプラスミドとすることができる。このようなＤＮＡフラグメントは例えば下記のようにＤＮＡの量を増加するためにプライマー用として有用である。
【００３０】
核酸配列の発現の必須要件は核酸配列をプロモーターの制御下におくように適切なプロモーターが核酸配列に機能的に連結されていることである。当業者に自明の通り、プロモーターの選択は蛋白質発現用宿主細胞として使用される細胞で遺伝子転写を誘導することが可能な任意真核、原核又はウイルスプロモーターに及ぶ。従って、本態様の更に好ましい形態は機能的に連結されたプロモーターの制御下のおかれた本発明のＤＮＡフラグメント又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは例えば標準分子生物学技術により得られる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６））。機能的に連結されたプロモーターは連結相手の核酸配列の転写を制御することが可能なプロモーターである。
【００３１】
このようなプロモーターはＬａｗｓｏｎｉａプロモーターとすることができ、例えば、プロモーターが発現に使用される細胞中で機能的であるという条件で３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ又は３１．４ｋＤ遺伝子をコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現に関与するプロモーターである。更に異種プロモーターでもよい。宿主細胞が細菌である場合には、使用することができる有用な発現制御配列としてはＴｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）、ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）、外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ Ｉｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）、バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）、α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター、終結配列並びに選択宿主細胞に適合可能な他の発現強化及び制御配列が挙げられる。
【００３２】
宿主細胞が酵母である場合には、有用な発現制御配列としては例えばα接合因子が挙げられる。昆虫細胞には、バキュロウイルスの多核体又はｐ１０プロモーターを使用することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物起源の場合には、有用な発現制御配列の例としてはＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）が挙げられる。
【００３３】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物細胞発現システムは非常によく使用されるシステムである。このようなシステムは当分野で周知であり、一般に入手可能であり、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，米国から市販されている。これらの発現システムに次いで寄生虫系発現システムが非常に魅力的な発現システムである。このようなシステムは例えば仏国特許出願公開第２７１４０７４号やＵＳ ＮＴＩＳ公開ＵＳ ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）に記載されている。
【００３４】
本態様の更に好ましい形態は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質もしくはその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列、本発明のＤＮＡフラグメント又は本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー（ＬＲＣ）に関する。このようなキャリヤーは例えば細菌及びウイルスである。これらのＬＲＣは付加遺伝情報（この場合には本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列）をクローニングした微生物又はウイルスである。このようなＬＲＣを感染させた動物はキャリヤーの免疫原に対してだけでなく、その遺伝コードを付加的にＬＲＣにクローニングする蛋白質（例えば３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質）の免疫原性部分に対しても免疫応答を発生する。細菌ＬＲＣの１例としては、当分野で公知の弱毒サルモネラ株を有利に使用することができる。
【００３５】
生きた組換えキャリヤー寄生虫は例えばＶｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））により記載されている。
【００３６】
また、核酸配列をターゲット細胞に導入する手段としてＬＲＣウイルスを使用することもできる。生きた組換えキャリヤーウイルスはベクターウイルスとも言う。ベクターとして使用されることが多いウイルスはワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２）、及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら；ｉｎ Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（Ｅｄｓ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ｐｐ．９２−９９（１９８９））である。
【００３７】
挿入した本発明の核酸配列の発現を宿主動物で誘導することが可能な選択細菌、寄生虫又はウイルスのゲノムに組換え核酸配列を導入するためには当分野で周知のｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え技術を使用することができる。
【００３８】
最後に、本発明の本態様の別の形態は機能的に連結されたプロモーターの制御下に本発明の蛋白質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むＤＮＡフラグメント又は前記核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は更に、本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はそのフラグメントをコードする核酸配列を含む生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞にも関する。
【００３９】
宿主細胞は細菌起源の細胞とすることができ、例えば大腸菌、枯草菌及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種をｐＢＲ３２２等の細菌系プラスミド、又はｐＧＥＸ等の細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み合わせる。宿主細胞は真核起源でもよく、例えば酵母細胞と酵母特異的ベクター分子の組み合わせや、高等真核細胞では昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８８））とベクター又は組換えバキュロウイルスの組み合わせ、植物細胞と例えばＴｉプラスミド系ベクター又は植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅら；Ｃｅｌｌ ３２：１０３３（１９８３））の組み合わせ、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はネコ腎由来細胞等の哺乳動物細胞と適当なベクター又は組換えウイルスの組み合わせが挙げられる。
【００４０】
本発明の別の態様は本発明の新規蛋白質及びその免疫原性フラグメントに関する。
【００４１】
免疫原性フラグメントの概念については下記に定義する。
【００４２】
本態様の１形態は例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列相同性をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４３】
１好適形態では、本態様は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４４】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００４５】
蛋白質相同性はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手可能なサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択することによりコンピュータープログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」を使用して決定することができる。
【００４６】
このプログラムの１参考文献はＴａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックスは「ｂｌｏｓｕｍ６２」である。使用するパラメーターは以下のデフォルトパラメーターである。オープンギャップ：１１。伸長ギャップ：１。ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００４７】
本態様の別の形態は例えば配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４８】
１好適形態は配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００４９】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５０】
本態様の別の形態は例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５１】
１好適形態は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５２】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５３】
本態様の別の形態は例えば配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５４】
１好適形態は配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５５】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５６】
本態様の別の形態は例えば配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５７】
１好適形態は配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００５８】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００５９】
本態様の別の形態は例えば配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同のアミノ酸配列をもつＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００６０】
１好適形態は配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９２％、好ましくは９４％、より好ましくは９６％の配列相同性をもつ前記Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質と、前記蛋白質の免疫原性フラグメントに関する。
【００６１】
９８％又は１００％の相同性が更に好ましい。
【００６２】
当然のことながら、本発明の特定蛋白質には、個々のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ株間に天然変異が存在し得る。これらの変異としては全長配列のアミノ酸変異又は前記配列中の１もしくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加が挙げられる。生物及び免疫活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は例えばＮｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。同族アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化において頻発する置換は特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）である。他のアミノ酸置換としてはＡｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは相同蛋白質間の機能的類似度を決定する迅速で高感度な蛋白質比較法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）。得られる蛋白質がその免疫反応性を維持する限り、本発明の典型的態様のこのようなアミノ酸置換と、欠失及び／又は挿入をもつ変異も本発明の範囲に含まれる。これは、本発明のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質が異なるフィールド単離株から単離した場合に同一免疫特徴をもつ同一蛋白質でありながら約９０％の相同性でよいことを説明するものである。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染又は少なくとも前記感染の臨床徴候に対する免疫応答を誘導することが可能な蛋白質を提供する本発明の所定蛋白質のアミノ酸配列の前記変異は「免疫原性に本質的に影響を与えない」とみなされる。
【００６３】
蛋白質を例えばワクチン接種目的又は抗体生産に使用する場合には、全長蛋白質を使用する必要はない。単独又は例えばＫＬＨ等のキャリヤーと結合して該当蛋白質に対する免疫応答を誘導することが可能な該当蛋白質のフラグメント、即ち所謂免疫原性フラグメントを使用することも可能である。「免疫原性フラグメント」とは宿主に免疫応答を誘導する能力を維持している全長蛋白質のフラグメント、即ちＢ又はＴ細胞エピトープを含むフラグメントを意味する。現在、抗原フラグメント（決定基）をコードするＤＮＡフラグメントを容易に同定するための各種技術が入手可能である。Ｇｅｙｓｅｎら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ８６／０６４８７、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））により記載されている方法、即ち所謂ＰＥＰＳＣＡＮ法は蛋白質の免疫学的に重要な領域であるエピトープの検出方法として、実施し易く、迅速な確立方法である。この方法は世界中で使用されており、それ自体当業者に周知である。この（経験的）方法はＢ細胞エピトープの検出に特に適している。また、任意蛋白質をコードする遺伝子の配列が分かっているならば、コンピューターアルゴリズムにより、現在公知のエピトープとの配列及び／又は構造一致に基づいて特定蛋白質フラグメントを免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定はＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造側面の組み合わせに基づく。Ｔ細胞エピトープもＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ０７／００５，８８５）を使用してコンピューターにより配列から同様に予測することができる。概要は一般原理についてＳｈａｎ Ｌｕ，Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープについてＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総論についてＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ １０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープについてＢｅｒｚｏｗｓｋｙ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）に夫々記載されている。
【００６４】
従って、本発明の更に別の態様の１形態はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に対してブタを防御することが可能なワクチンであって、医薬的に許容可能なキャリヤーと共に上記のような本発明の１種以上の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含むワクチンに関する。
【００６５】
本発明の更に別の態様はワクチン用としての本発明の蛋白質に関する。
【００６６】
更に別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンの製造における本発明の蛋白質の使用に関する。
【００６７】
本発明のワクチンの製造方法の１例は感染腸壁から採取した粘膜スクレーピングから得られた細菌から本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを生化学的に精製する方法である。しかし、この方法は非常に時間のかかるワクチン製造方法である。
【００６８】
従って、本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子の発現産物をワクチンで使用するほうが著しく簡便である。本発明では３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードする遺伝子の核酸配列を示す。これらの遺伝子の発現産物に基づくこのようなワクチンは下記のように本発明の１種以上の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントを医薬的に許容可能なキャリヤーと混合することにより容易に製造することができる。
【００６９】
あるいは、本発明のワクチンは本発明の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントを発現することが可能な上記のような生きた組換えキャリヤーを含むことができる。例えば腸上皮又は例えば呼吸器上皮に感染するサルモネラキャリヤー又はウイルスキャリヤーに基づくこのようなワクチンはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの自然感染方法によく似ているという点でサブユニットワクチンよりも有利である。更に、組換えキャリヤーは免疫に必要な量が非常に少量ですむのでその自己増殖も利点である。
【００７０】
上記全ワクチンは能動的ワクチン接種に利用され、即ち宿主の免疫系は本発明の１種以上の蛋白質又はその免疫原性フラグメントによりトリガされ、これらの蛋白質に対する抗体を生産する。
【００７１】
あるいは、このような抗体は例えばウサギで生産することもできるし、下記のように抗体産生細胞株から得ることもできる。その後、このような抗体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接種方法即ち受動的ワクチン接種は動物が既に感染しており、自然免疫応答をトリガさせる時間がない場合の選択ワクチン接種である。これは免疫能の低下した動物にワクチン接種するのに好適な方法でもある。投与したＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体はこれらの場合には細菌と直接結合することができる。これはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ増殖をすぐに低下又は停止させるという利点がある。
【００７２】
従って、本発明の本態様の他の１形態は本発明の６種のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質のいずれかに対する抗体を含むワクチンに関する。
【００７３】
ワクチンは本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントを含む上記宿主細胞に基づくことができる。
【００７４】
効率的な代替ワクチン接種方法は該当抗原をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種である。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は多種多様の蛋白質で成功している。（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：２０−２６（１９９３）参照）。
【００７５】
このワクチン接種方法はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に対するブタのワクチン接種に非常に魅力的な方法である。
【００７６】
従って、本発明の本態様の更に他の形態は本発明の蛋白質又は本発明のその免疫原性フラグメントをコードする核酸配列を含むワクチンと、前記核酸配列を含むＤＮＡフラグメントを含むワクチンに関する。
【００７７】
本態様の更に他の形態は本発明の組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【００７８】
ＤＮＡワクチンは例えば無針注射器を使用して皮内投与により容易に投与することができる。この投与方法はＤＮＡをワクチン接種対象動物の細胞に直接送達する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量のＤＮＡで非常に良好な結果が得られる。
【００７９】
別の態様では、本発明のワクチンは他のブタ病原生物及びウイルスに由来する１種以上の抗原、又は前記抗原をコードする遺伝情報を更に含む。
【００８０】
このような生物及びウイルスは仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから構成される群から選択することが好ましい。
【００８１】
本発明の全ワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば滅菌水又は滅菌生理的塩類溶液とすることができる。より複雑な形態では、キャリヤーは例えば緩衝液とすることができる。
【００８２】
ワクチンの製造方法は本発明の蛋白質又はその免疫原性フラグメントと医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む。
【００８３】
本発明のワクチンは１好適形態では更にアジュバントを含有する。アジュバントは一般に非特異的に宿主の免疫応答を誘発する物質を含む。多種多様なアジュバントが当分野で公知である。アジュバントの例としてはフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ（登録商標）、鉱油（例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｋｏｌ（登録商標））、植物油、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）Ｆｏｒｔｅが挙げられる。ワクチンは更に所謂「ビークル」を添加することができる。ビークルはポリペプチドが共有結合せずに付着する化合物である。多くの場合に使用されるビークル化合物は例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベントナイトである。
【００８４】
抗原がビークルに部分的に埋込められるこのようなビークルの特殊形態が所謂ＩＳＣＯＭ（ＥＰ１０９．９４２，ＥＰ１８０．５６４，ＥＰ２４２．３８０）である。
【００８５】
更に、ワクチンは１種以上の適当な表面活性化合物又は乳化剤（例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎ）を添加することができる。
【００８６】
多くの場合には、例えば分解し易いポリペプチドを分解しないようにするため、ワクチンの保存期間を延ばすため、又は凍結乾燥効率を改善するために、ワクチンを安定剤と混合する。有用な安定剤は例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ５９：５０９（１９５０））、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、澱粉、スクロース、デキストラン又はグルコース）、蛋白質（例えばアルブミン又はカゼイン又はその分解物）、及び緩衝液（例えばアルカリ金属リン酸塩）である。
【００８７】
更に、生理的に許容可能な希釈剤にワクチンを懸濁してもよい。
【００８８】
言うまでもなく、本発明では他のアジュバント添加、ビークル化合物もしくは希釈剤の添加、乳化又はポリペプチドの安定化方法も実施される。
【００８９】
本発明のワクチンは１〜１００μｇの量を投与すると非常に適切であるが、これ以下の量も原則として使用できる。１００μｇを越える用量は免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではない。
【００９０】
上記ＬＲＣウイルス及び細菌等の生きた弱毒組換えキャリヤーに基づくワクチンは感染中に自己増殖するので著しく低用量で投与することができる。従って、非常に適切な量は夫々細菌とウイルスで１０３ＣＦＵ／ＰＦＵ〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵである。
【００９１】
多数の投与方法を適用することができる。感染が消化管感染であるので、経口投与が非常に魅力的な投与方法である。１好適経口投与方法は胃の高酸性環境を通過後にしか崩壊しない当分野で公知であり且つ頻用されているカプセルにワクチンをパッケージングする方法である。また、胃のｐＨを一時的に上昇させるための当分野で公知の化合物とワクチンを混合してもよい。
【００９２】
例えばワクチンの筋肉内投与による全身投与も適切である。この経路を採用する場合には、全身投与について当分野で公知の標準手順が適切である。
【００９３】
疾患に対する防御の観点から、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の迅速で正確な診断が重要である。
【００９４】
従って、本発明の別の目的はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の検出に適した診断ツールを提供することである。
【００９５】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの検出用診断試験は例えば被験動物から単離した細菌ＤＮＡと３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードする遺伝子のコーディング配列に基づく特異的プローブ又はＰＣＲプライマーとの反応に基づく。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡが動物に存在するならば、例えば特異的ＰＣＲプライマーと特異的に結合した後、ＰＣＲ反応で増幅される。その後、ＰＣＲ反応産物はＤＮＡゲル電気泳動で容易に検出することができる。
【００９６】
ＤＮＡは被験動物の消化管から採取したスワブ中に存在する微生物から最も簡単に単離することができる。標準ＰＣＲ教科書にはＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡとの選択的ＰＣＲ反応用プライマーの長さを決定するための方法が記載されている。少なくとも１２ヌクレオチド長のヌクレオチド配列をもつプライマーを使用することが多いが、＞１５、より好ましくは＞１８ヌクレオチドのプライマーのほうが多少選択性が高い。特に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長のプライマーが非常に一般に適用可能である。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）に詳細に記載されている。
【００９７】
従って、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、更に好ましくは好適度の昇順で２０、２２、２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド長の前記核酸配列の部分であって、配列番号１又は３に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ核酸配列又はその部分も本発明に含まれる。このような核酸配列はこれらの配列によりコードされるＤＮＡの量を増加するためにＰＣＲ反応でプライマーとして使用することができる。こうして、例えば上記のように組織中のＬａｗｓｏｎｉａの検出用診断ツールとして使用するために特定ヌクレオチド配列を迅速に増幅することが可能になる。
【００９８】
別のＤＮＡ試験はスワブから得られた細胞材料の増殖後に慣用ＤＮＡ精製した後に３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質に特異的な放射性又は色素標識ＤＮＡフラグメントと慣用方法によりハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応はどちらも当分野で周知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。
【００９９】
従って、本発明の１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡの検出用診断試験に関する。前記試験は３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質をコードするＤＮＡに特異的な本発明の核酸配列又はそのフラグメントを含む。前記ＤＮＡに特異的なフラグメントは他の細菌のＤＮＡよりもＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡ（例えば上記のような少なくとも１２ヌクレオチド長のプライマー）に対する相同性が高いため、同等条件下でＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＤＮＡと良好に結合するフラグメントを意味する。
【０１００】
血清中のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗体の検出用診断試験は例えば本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントをＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁にコーティングする単純な標準サンドイッチＥＬＩＳＡ試験とすることができる。前記抗体の検出方法は例えば３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントを被験哺乳動物に由来する血清の存在下でインキュベーションした後に例えば該当哺乳動物抗体に対する標識抗体の存在下でインキュベーションする。その後、発色反応によりＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の有無を判定することができる。診断試験システムの別例は例えば本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントを含むウェスタンブロットを被験哺乳動物の血清の存在下でインキュベーションした後にブロットを分析する。
【０１０１】
従って、本発明の別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験に関する。前記試験は本発明の蛋白質又はそのフラグメントを含む。
【０１０２】
更に、本発明は血清中のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出方法に関し、前記方法は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントの存在下で血清をインキュベーションすることを含む。
【０１０３】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原の特異的３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質の抗原材料の検出に基づき、従ってＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の検出に適した診断試験は例えば標準ＥＬＩＳＡ試験とすることができる。前記試験の１例では、３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質に対する抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁にコーティングする。被験材料の存在下でインキュベーション後に、標識抗Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗体をウェルに添加する。その後、発色反応によりＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに由来する抗原材料の存在を検出する。
【０１０４】
従って、本発明の更に別の態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原材料の検出用診断試験に関する。前記試験は本発明の蛋白質又はそのフラグメントに対する抗体を含む。
【０１０５】
上記特徴をもつ本発明のポリペプチド又はその免疫原性フラグメントは抗体を生産するために使用することができ、抗体はポリクローナル、単一特異的又はモノクローナル（又はその誘導体）のいずれでもよい。ポリクローナル抗体が所望される場合には、ポリクローナル血清の作製及び処理技術は当分野で周知である（例えば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ，ｅｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
【０１０６】
本発明のポリペプチド（又は本発明のその変異体又はフラグメント）に反応性のモノクローナル抗体は同様に当分野で公知の技術により近交系マウスに免疫することにより作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）。
【０１０７】
本発明の抗体の大規模製造方法も当分野で公知である。このような方法は本発明の蛋白質をコードする遺伝情報（のフラグメント）をファージディスプレイ用繊維状ファージにクローニングする。このような技術は例えばｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌ．の“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｇｅ”に“ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ”の項目で記載されており、更にＣｏｒｔｅｓｅ，Ｒ．ら，（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：２６２−２６７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２：１７３−１８３、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：４３３−４５５、及びＬｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら，（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ａｄｖ．１２：５３９−５５５の各論文に記載されている。その後、ファージを使用してラクダ重鎖抗体を発現するラクダ発現ライブラリーをスクリーニングする。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．１２：１３１−１４０（１９９９）及びＧｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーに由来する細胞を複製した後、抗体の大規模発現に使用することができる。
【０１０８】
本発明の更に別の態様は Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに由来する抗原材料の検出方法に関し、前記方法は本発明の３１．０ｋＤ、２４．８ｋＤ、７６．７Ｄ、５６．８ｋＤ、２８．８ｋＤ及び３１．４ｋＤ蛋白質又はその抗原フラグメントに対する抗体の存在下に体液の組織である血清をインキュベーションすることを含む。
【０１０９】
最後に、本発明の１態様はＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は少なくとも２０、好ましくは好適度の昇順で２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド長の前記核酸配列の部分に関し、前記核酸配列又はその部分は配列番号１、３、５、７、９又は１１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつ。このような核酸配列はこれらの配列によりコードされるＤＮＡの量を増加するためにＰＣＲ反応でプライマーとして使用することができる。こうして、例えば上記のように組織中のＬａｗｓｏｎｉａの検出用診断ツールとして使用するために特定ヌクレオチド配列を迅速に増幅することが可能になる。
【実施例１】
【０１１０】
感染ブタ回腸からのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの単離
ＰＥで死亡したブタからＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染回腸を抽出し、組織病理試験と抗酸性Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色により感染を確認し、−８０℃で保存した。解凍後、感染腸壁から採取した粘膜スクレーピングからＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ菌を単離した。Ｌａｗｓｏｎら（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３０３−３２３（１９８５））により記載されているように回腸スクレーピングをオムニミキサーでＰＢＳ中にて繰り返しホモジナイズし、細胞内細菌を遊離させた。細胞破片を除去するための低速遠心後に得られた上清を５．０、３．０、１．２、及び０．８μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。次に濾液を８０００ｇで３０分間遠心し、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ菌の小ペレットを得た。Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエントを使用してこれらの細菌を更に精製した。精製した細菌をＰＣＲ（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：２６１１−２６１５（１９９３））により同定し、位相差顕微鏡により単離細菌の純度（＞９５％）を試験し、汚染性細菌又は内臓破片の有無を調べた。
【０１１１】
細菌株及びプラスミド
ベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含む大腸菌宿主株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）とプラスミドｐＥＴ２２ｂはＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，米国）から購入した。ｐＥＴ−ＨＩＳ１（１）はＳｃｈａｌｌｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５：２１０５−２１１６（１９９９）に記載されているように構築した。大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）から購入した。３０％グリセロールを加えた全細菌株のストックを−７０℃で保存した。Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ細胞は上記のように感染回腸材料から単離した。
【０１１２】
培地、緩衝液及び抗生物質
Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）は常法に従って調製した。ＬＢプレートは常法に従ってＬＢ培地＋１．５％寒天を電子レンジで融解させることにより調製した。溶液を４５℃まで冷却後にプレートを注ぎ、必要に応じてアンピシリン（ＡＣＳ−Ｄｏｐｈａｒ，Ｒａａｍｓｄｏｎｋｓｖｅｅｒ，オランダ）を加えた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はＢｉｏｓｙｎｔｈ Ａｇ（Ｓｔａａｄ，スイス）から購入した。
【０１１３】
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅はＧｅｎｅａｍｐ ９７００ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して実施した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して実施した。ＰＣＲ混合物は５２Ｕ／ｍｌ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ，Ｅｘｐａｎｄ ＨＦ緩衝液に２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１６ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，米国），プライマー２０ｐｍｏｌｅ及び鋳型としてＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの染色体ＤＮＡ１５ｎｇを加えた。ＤＮＡの増幅に使用した全プライマーは表１に示す。
【０１１４】
ＤＮＡ単離
高純度Ｌａｗｓｏｎｉａ染色体ＤＮＡを得るために、Ｂｉｏｒａｄ染色体ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｒａｄ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，オランダ）を製造業者の指示に従って使用してＤＮＡを調製した。
【０１１５】
ＤＮＡシーケンシング
ＤＮＡはＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で配列決定した。シーケンシング混合物はＰＣＲ産物１００ｎｇ、ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）２μｌ、プライマー２．４ｐｍｏｌｅ、緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）６μｌに蒸留水を加えて２０μｌとした。この混合物をＧｅｎｅａｍｐ ９７００でサイクルにかけた。プログラムは１０秒９６℃、５秒５０℃及び２分６０℃を２５サイクルとした。シーケンシングサイクル産物をＤｙｅ−Ｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で製造業者の指示に従って精製し、ＡＢＩ３１０自動シーケンサーで試験した。ＡＢＩ３１０ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して配列結果を集め、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）で分析した。アラインメントはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，米国）を使用して行った。配列分析はＳｅｑｕｅｎｃｅｒ ４．１．４（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＣＡ，米国）を使用して実施した。
【０１１６】
ライゲーション及び形質転換
ライゲーションはライゲーション酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，米国）１単位を加えた１×ライゲーション緩衝液中で１６℃にて一晩実施した。ライゲーション反応物１μｌを熱ショックにより大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌コンピテント細胞とＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌コンピテント細胞は緩衝液ＴＦＢ１（３０ｍＭ ＫＯＡｃ，１００ｍＭ ＲｂＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，５０ｍＭ ＭｎＣｌ２，１５％グリセロール）とＴＦＢ２（１０ｍＭ ＲｂＣｌ，７５ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ ＭＥＳ，１５％グリセロール）を使用してＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋの方法によりコンピテントにした。１０ｍＭ ＭｇＳＯ４と２０ｍＭグルコースを補充したＳＯＣ培地中で３７℃にて１時間回復後に、適当な抗生物質を加えたＬＢプレートに細胞をプレーティングした。
【０１１７】
１０ｘＨＩＳ融合蛋白質の発現
ｐＬｙｓＳｒａｒｅと発現ベクターを含む大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）をアンピシリン含有ＬＢ５ｍｌ中で３７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。一晩培養液をアンピシリン含有ＬＢ５０ｍｌで１００倍に希釈した。ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩスペクトロフォトメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，オランダ）で測定したＯＤ６００が０．５に達するまでこの培養液を同一条件下で増殖させた。この時点（ｔ＝０）で培養液に終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧを加えて誘導し、引き続き３時間（ｔ＝３）増殖を続けた。１００μｌサンプルを分析用に採取した。ｐＬｙｓＳｒａｒｅを含む大腸菌株ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）を同一条件下で増殖及び誘導し、陰性対照としてサンプルを採取した。サンプルをＳＤＳ ｐａｇｅ後にＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ染色により下記のように分析した。残りの培養液を５，０００ｒｐｍで遠心し、ペレットを後期使用時まで−２０℃で保存した。
【０１１８】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，米国）からの４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用して実施した。分離前にサンプルをβ−メルカプトエタノールの存在下でサンプル緩衝液（サンプル：緩衝液＝２：１）と共に５分間煮沸した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色するか又は標準半乾燥ウェスタンブロット法によりＩｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ−ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，米国）にブロットした。ｎ−ＧＮＥ（水：油＝４５：５５）中で全細胞調製物に対してニワトリ抗Ｌａｗｓｏｎｉａポリクローナル血清を調製した。血清Ｅ２−８３９はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に典型的な臨床徴候と死後病変を生じたブタから入手した。血清はベクターｐＬｙｓＳｒａｒｅを含むＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）からの等容量粗細胞抽出液を使用して４℃で４時間予備吸着させた。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
結果
Ｔ７発現ベクターにおけるＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子のクローニング
表１に示すプライマーを使用してＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化したＰＣＲ産物を次に表２に示すように同一の２種類の制限酵素で予め切断しておいたｐＥＴ２２ｂ又はｐＥＴ−ＨＩＳ１にライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆに形質転換し、３７℃で一晩インキュベーションした。コロニーＰＣＲを使用して推定形質転換細胞が正しいプラスミドであるかどうかをチェックした。この結果、６個の異なる発現プラスミドが得られた。これらのプラスミドをヌクレオチド配列分析によりチェックした処、配列はクローニングストラテジーにより予想された通りであった。
【０１２２】
大腸菌におけるＴ７プロモーターからのＬａｗｓｏｎｉａ遺伝子の発現
表２に示す全プラスミドについて組換え蛋白質産生を試験した。プラスミドをＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅに形質転換し、誘導を実施した。誘導培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動とＣＢＢ染色により分析した（図１）。全６種の遺伝子は大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｒａｒｅで十分な発現を生じた。発現レベルは１５０μｇ／ｍｌに達した。
【０１２３】
ウェスタンブロットにより発現産物の分析
Ｌａｗｓｏｎｉａ全細胞をワクチン接種したニワトリの血清と、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染に典型的な臨床徴候と死後病変を示したブタに由来する血清を使用して発現産物をウェスタンブロットにより分析した（図２）。組換えＬａｗｓｏｎｉａ蛋白質はニワトリ及びブタ血清により陽性であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ遺伝子の過剰発現のＮｕＰＡＧＥ分析。レーン１，分子量マーカー；レーン２，ｐＥＴ７６．７ Ｔ＝０；レーン３，ｐＥＴ７６．７ Ｔ＝３；レーン４，ｐＥＴ５６．８ Ｔ＝０；レーン５，ｐＥＴ５６．８ Ｔ＝３；レーン６，ｐＥＴ２４．８ Ｔ＝０；レーン７，ｐＥＴ２４．８ Ｔ＝３；レーン８，ｐＥＴ２８．８ Ｔ＝０；レーン９，ｐＥＴ２８．８ Ｔ＝３；レーン１０，ｐＥＴ３１．０ Ｔ＝０；レーン１１，ｐＥＴ３１．０ Ｔ＝３；レーン１２，ｐＥＴ３１．４ Ｔ＝０；レーン１３，ｐＥＴ３１．４ Ｔ＝３；レーン１４，Ｔ＝３，発現ベクターなし。矢印は発現産物の位置を示す。
【図２】大腸菌ＢＬ２１ＳＴＡＲ／ｐＬｙｓＳＲＡＲＥにおけるＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ遺伝子の発現産物のウェスタンブロット。レーン１，ｐＥＴ３１．４；レーン２，ｐＥＴ２８．８；レーン３，ｐＥＴ３１．０；レーン４，ｐＥＴ２４．８；レーン５，ｐＥＴ ７６．７；レーン６，ｐＥＴ５６．８；レーン７，発現ベクターなし。矢印は発現産物の位置を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項２】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号３に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項３】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号５に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項４】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号７に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項５】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号９に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項６】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号１１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項７】
請求項１から６に記載の核酸配列を含むＤＮＡフラグメント。
【請求項８】
機能的に連結されたプロモーターの制御下に請求項１から６に記載の核酸配列又は請求項７に記載のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント又は請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー。
【請求項１０】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項９に記載の生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１３】
配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１４】
配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１５】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１６】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１７】
ワクチンで使用するための請求項１１から１６に記載のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質。
【請求項１８】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンの製造における請求項１１から１６に記載のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質の使用。
【請求項１９】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項１０に記載の宿主細胞又は請求項１１から１６に記載の蛋白質と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチン。
【請求項２０】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
ブタに対して病原性のウイルスもしくは微生物に由来する付加抗原又は前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする請求項１９又は２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ブタに対して病原性のウイルスもしくは微生物が仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
請求項１１から１６に記載の蛋白質に対する抗体を含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチン。
【請求項２４】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項１０に記載の宿主細胞、請求項１１から１６に記載の蛋白質、又は請求項１１から１６に記載の蛋白質に対する抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む請求項１９から２３に記載のワクチンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１から６に記載の核酸配列、又は少なくとも１２、好ましくは１５，より好ましくは１８ヌクレオチド長のそのフラグメントを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに特異的なＤＮＡの検出用診断試験。
【請求項２６】
請求項１１から１６に定義された蛋白質又はそのフラグメントを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験。
【請求項２７】
請求項１１から１６に定義された蛋白質又はそのフラグメントに対する抗体を含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原材料の検出用診断試験。
【請求項１】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項２】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号３に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項３】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号５に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項４】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号７に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項５】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号９に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項６】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質をコードする核酸配列又は前記蛋白質の免疫原性フラグメントをコードする前記核酸配列の一部であって、前記核酸配列又は前記その一部が配列番号１１に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％の相同性をもつ前記核酸配列又はその一部。
【請求項７】
請求項１から６に記載の核酸配列を含むＤＮＡフラグメント。
【請求項８】
機能的に連結されたプロモーターの制御下に請求項１から６に記載の核酸配列又は請求項７に記載のＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント又は請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生きた組換えキャリヤー。
【請求項１０】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項９に記載の生きた組換えキャリヤーを含む宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１３】
配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１４】
配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１５】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１６】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％、更に好ましくは９６％相同のアミノ酸配列を含むＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質、又は前記蛋白質の免疫原性フラグメント。
【請求項１７】
ワクチンで使用するための請求項１１から１６に記載のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質。
【請求項１８】
Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチンの製造における請求項１１から１６に記載のＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ蛋白質の使用。
【請求項１９】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項１０に記載の宿主細胞又は請求項１１から１６に記載の蛋白質と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチン。
【請求項２０】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
ブタに対して病原性のウイルスもしくは微生物に由来する付加抗原又は前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする請求項１９又は２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ブタに対して病原性のウイルスもしくは微生物が仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
請求項１１から１６に記載の蛋白質に対する抗体を含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染の防除用ワクチン。
【請求項２４】
請求項１から６に記載の核酸配列、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント、請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項９に記載の生きた組換えキャリヤー、請求項１０に記載の宿主細胞、請求項１１から１６に記載の蛋白質、又は請求項１１から１６に記載の蛋白質に対する抗体と、医薬的に許容可能なキャリヤーを混合する段階を含む請求項１９から２３に記載のワクチンの製造方法。
【請求項２５】
請求項１から６に記載の核酸配列、又は少なくとも１２、好ましくは１５，より好ましくは１８ヌクレオチド長のそのフラグメントを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに特異的なＤＮＡの検出用診断試験。
【請求項２６】
請求項１１から１６に定義された蛋白質又はそのフラグメントを含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体の検出用診断試験。
【請求項２７】
請求項１１から１６に定義された蛋白質又はそのフラグメントに対する抗体を含むことを特徴とするＬａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原材料の検出用診断試験。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２７７０６（Ｐ２００７−５２７７０６Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５７５２（Ｐ２００６−５２５７５２）
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９９９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６２００
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月８日（２００４．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９９９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６２００
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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