不活性出発物質からの生理活性糖タンパク質の生成
本発明は、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質および修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法に関する。
ａ）糖タンパク質および修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質と修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法であって、
前記段階ｂ）は、好ましくは、該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成することによって行われ、その中でＺは、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基、およびチオエステル基からなる群から選択され、
−Ｚがアルデヒド基またはケト基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するアミノ基を含み、
−Ｚがアミノ基である場合、Ａは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基からなる群から選択され、
−Ｚがマレイミド基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するチオール基を含み、
−−Ａがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって行い、その一方の官能基は該ポリマーと反応し、その他方の官能基の少なくとも一つは、アルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基であるか、またはアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基が得られるようにさらに化学修飾された官能基であり、あるいは
−−−それは該ポリマーを酸化して少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基を得ることによって行い；あるいは
−−Ａが反応性カルボキシ基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、生じたカルボキシ基を活性化させることによって行い、あるいは
−−−それは該ポリマーをその酸化されていない還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって行い；あるいは
−Ｚがチオール基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するマレイミド基またはハロゲンアセチル基を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
段階ａ）において、出発糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質に変換される、請求項１の方法。
【請求項３】
段階ａ）において、修飾ポリオールが修飾糖ヌクレオチド、詳細には、修飾フコースヌクレオチド、修飾グルコースヌクレオチド、修飾マンノースヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルグルコサミンヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルガラクトサミンヌクレオチド、修飾シアル酸ヌクレオチドまたは修飾ガラクトースヌクレオチド、より詳細には、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、またはＧＤＰ−Ｆｕｃである、請求項１の方法。
【請求項４】
官能基Ｚが、ヒドラジド基、ヒドロキシルアミン、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基およびチオエステル基からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一つの方法。
【請求項５】
官能基Ｚが、リンカー分子、例えば適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基を通して糖ヌクレオチドのＣ−６ヒドロキシル基に結合する、請求項４の方法。
【請求項６】
トランスフェラーゼが、クラスＥＣ ２．４．１のグリコシルトランスフェラーゼ、特にその中で、該トランスフェラーゼが、β１−４ ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一つの方法。
【請求項７】
糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一つの方法。
【請求項８】
段階ｂ）において、段階ａ）の後に得られる修飾糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体に変換される、請求項１から７のいずれか一つの方法。
【請求項９】
ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、請求項１から８のいずれかの方法。
【請求項１０】
ヒドロキシエチルデンプンが、２から２００ｋＤ、好ましくは４から１３０ｋＤ、より好ましくは４から９０ｋＤの分子量を有する、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ａを含むポリマー誘導体とＺを含むタンパク質の反応の前に、該ポリマーを、その酸化されていない還元末端で、ポリマーの酸化されていない還元末端および化学基Ａと反応させることができる官能基を含む少なくとも二官能性の結合化合物と反応させることをさらに特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つの方法。
【請求項１２】
Ａがアミノオキシ基またはヒドラジド基である、請求項１から１１のいずれか一つの方法。
【請求項１３】
少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性化合物である、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
ホモ二官能性化合物が二つのアミノオキシ基を含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
ホモ二官能性化合物がＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応が水溶媒中で実行される、請求項１１から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応によって、オキシム結合および／またはオキシアミノ結合がもたらされる、請求項１４から１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
Ｚがアミノ基であり、タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一つの方法。
【請求項１９】
ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、その酸化されたポリマーを、その酸化された還元末端で炭酸Ｎ，Ｎ’−ジサクシンイミジルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２１】
炭酸ジエステルが対称性ジエステルである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
エステルのアルコール構成要素が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、並びにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群から選択される、請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】
ハロゲン置換フェノールが、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールからなる群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性エステル基Ａを得ることを、無水非プロトン性極性溶媒中で実行する、請求項２０から２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
溶媒がジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である、請求項１８の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａである少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含む方法。
【請求項２７】
Ｍがアミノ基を含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である請求項２６の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基でない少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含み、該官能基Ｑを少なくとも一つの適当な化合物と反応させて、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法。
【請求項２９】
ＭおよびＱがアミノ基を含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】
少なくとも一つの適当な化合物が、カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基を含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
少なくとも一つの適当な化合物が、ホルミル安息香酸または４−（４−ホルミル−３，５−ジメトキシフェノキシ）酪酸である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
Ｍがアミノ基を含み、Ｑがベータヒドロキシアミノ基を含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３３】
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させる、請求項３２の方法。
【請求項３４】
ベータヒドロキシアミノ基を酸化させて、アルデヒド基を得ることをさらに特徴とする、請求項３２の方法。
【請求項３５】
過ヨウ素酸を用いて酸化反応を実行する、請求項３４の方法。
【請求項３６】
過ヨウ素酸を用いて、ポリマーに開環酸化反応を受けさせて、少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基Ａを有するポリマー誘導体を得る、請求項１８の方法。
【請求項３７】
ポリマーまたは該ポリマー誘導体のタンパク質との反応が還元的アミノ化である、請求項２６から３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
還元的アミノ化をＮａＣＮＢＨ３の存在下で実行する、請求項３７の方法。
【請求項３９】
還元的アミノ化を７以下のｐＨで実行する、請求項３７または３８の方法。
【請求項４０】
ｐＨが６以下である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
還元的アミノ化を０から２５℃の温度で実行する、請求項３７から４０のいずれかの方法。
【請求項４２】
還元的アミノ化を水溶媒中で実行する、請求項３７から４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
Ｚがチオール基である、請求項１から１１のいずれかの方法。
【請求項４４】
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
Ａがハロゲンアセチル基を含む、請求項４２または４３の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、各々がアミノ酸を含む少なくとも二つの官能基を有する少なくとも二官能性の化合物と反応させて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を有するポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法であって、該ポリマー誘導体をモノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることをさらに特徴とする方法。
【請求項４６】
ハロゲンがＢｒまたはＩである、請求項４３の方法。
【請求項４７】
少なくとも二官能性の化合物が、２から１０個の炭素原子を有するジアミノアルカンである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
【請求項４８】
少なくとも二官能性の化合物が、１から５個のアルキレン単位を有するジアミノポリエチレングリコールである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
【請求項４９】
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
【請求項５０】
ジメチルホルムアミドおよび水の混合物を含む溶媒の存在下で、ハロゲンアセチル基を含むポリマー誘導体を糖タンパク質と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
【請求項５１】
Ａがマレイミド基を含む、請求項４３または４４の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、適宜酸化された還元末端と反応させることができる官能基Ｕを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させることをさらに特徴とする方法であって、その少なくとも二官能性の化合物が、マレイミド基が得られるように化学修飾されうる官能基Ｗをさらに含み、マレイミド基が得られるように官能基Ｗを化学修飾することをさらに特徴とする方法。
【請求項５２】
Ｕがアミノ基を含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
Ｗがアミノ基を含む、請求項５１または５２の方法。
【請求項５４】
Ｗを含むポリマー誘導体を、Ｗと反応させることができる官能基を含み、さらにマレイミド基を含む少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項５０から５３のいずれかの方法。
【請求項５５】
少なくとも二官能性の化合物がＮ−（アルファ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステルである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
例えば、糖タンパク質の細胞内タンパク質分解のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を用いることによって、少なくとも一つの遊離アスパラギンおよび／またはグルタミン側鎖を含む糖タンパク質の少なくとも８０％が、すべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖において無処理のアミド基を保持している、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む組成物。
【請求項５７】
Ａが反応性カルボキシ基であり、その中でＡは、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、還元末端が酸化されていないポリマー中に導入され、前記共役複合体が、一つのポリマー分子、およびアミド結合を通して該ポリマーと結合した少なくとも一つ、特に１から１０個の糖タンパク質分子を含む、請求項５６の組成物。
【請求項５８】
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項５９】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
【請求項６０】
治療上の有効量の中に、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む医薬組成物、または特に共役複合体が濃度約１ｎＭで存在している、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
【請求項６１】
請求項６０の医薬組成物であって、少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、添加剤、または担体をさらに含み、特にその中で共役複合体が、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
【請求項６２】
白血病（例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌（例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫）および肝炎（例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎）の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮアルファである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６３】
多発性硬化症、好ましくは再発性型の多発性硬化症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮベータである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６４】
急性骨髄性白血病、骨髄移植生着の失敗または遅延、流動を有する高齢者における骨髄移植または術前化学療法後の骨髄再構成、並びに自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構成用薬剤の製造のため、タンパク質がＧＭ−ＣＳＦである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６５】
重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＰＣである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６６】
心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がｔＰＡである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６７】
肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡ１ＡＴである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６８】
遺伝的欠損、静脈閉塞症、熱傷および冠状動脈バイパス手術におけるヘパリン耐性、人工呼吸療法に関連するマイクロクロット形成の予防、外傷または胃腸の手術から生じる腸穿孔；播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および／または敗血症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＴ ＩＩＩである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６９】
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子へのインヒビターを有する血友病Ａまたは血友病Ｂ患者におけるエピソードの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７０】
血友病Ａの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７１】
血友病Ｂ、好ましくは先天性第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病を有する患者における出血性エピソードの制御および予防、例えば手術環境における出血の制御および予防用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７２】
貧血障害または造血機能不全障害あるいはその関連疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＥＰＯである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７３】
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で糖タンパク質の本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、糖タンパク質およびポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
【請求項７４】
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で共役複合体の本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、糖タンパク質および該ポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
【請求項７５】
一つ以上のＨＡＳ分子を含むヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）であって、その中で各ＨＡＳが、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通してＧＰＯと共役複合し、特に、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンが、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端の糖部位をさらに含む共役複合体。
【請求項７６】
ＧＰＯが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、最も好ましくはその中で、ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項７５のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７７】
ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項７５または７６のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７８】
ＧＰＯの本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、請求項７５または７７のいずれか一つのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７９】
ＧＰＯが、少なくとも一つの末端ガラクトース部位を含む少なくとも一つのＮ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む、請求項７５から７８のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８０】
ＧＰＯが、少なくとも二つの末端ガラクトース部位を各々含む二つまたは三つのＮ−グリカンを含むＥＰＯである、請求項７９のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８１】
ＧＰＯが、哺乳類、昆虫、酵母細胞または遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項７５から８０のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８２】
ＨＡＳがリンカー分子を通してＧＰＯと共役複合した、請求項７５から８１のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８３】
ＥＰＯ １分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含む、請求項７５から８２のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８４】
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンからなる群から選択される、請求項７５から８３のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８５】
ＨＡＳがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８４のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８６】
ＨＥＳが、１から３００ｋＤａ、好ましくは５から１００ｋＤａの分子量を有する、請求項８５のＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項８７】
ＨＥＳが、ヒドロキシエチル基に関して０．１から０．８のモル置換度および２〜２０の範囲内のＣ２：Ｃ６置換比を示す、請求項８５または８６のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項８８】
請求項７５から８７のいずれか一つのヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）の生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯを提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって一つ以上のＨＡＳ分子を含むＨＡＳ−ＧＰＯ（各ＨＡＳは、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通して該ＧＰＯと共役複合し、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンは、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端糖部位をさらに含む）を生成する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項８９】
ＧＰＯがＥＰＯであり、特にその中で、該ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項８８の方法。
【請求項９０】
請求項１３の方法の前およびその間に、ＧＰＯが、常に３．０から９．０の間のｐＨで保たれ、それによってＨＡＳ−ＧＰＯが生成され、その中で該ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項８８の方法。
【請求項９１】
ＧＰＯが哺乳類、昆虫または酵母細胞、あるいは遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項８８から９０のいずれかの方法。
【請求項９２】
末端ガラクトース単位が、末端シアル酸の部分的または完全な酵素的除去の後に酸化される、請求項９０の方法。
【請求項９３】
段階ｄ）において、修飾ＨＡＳを、酸化された末端サッカライド単位と共役複合させる、請求項９１または９２の方法。
【請求項９４】
請求項１３の段階ｃ）のＨＡＳを、それが遊離ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド官能基を含むように修飾する、請求項８８から９３のいずれかの方法。
【請求項９５】
段階ｄ）が、少なくとも１０重量％のＨ２Ｏを含む反応溶媒中で行われる、請求項８８から９４のいずれかの方法。
【請求項９６】
ＨＡＳが、リンカー分子を通してＧＰＯ、特にＥＰＯと共役複合した、請求項８８から９５のいずれかの方法。
【請求項９７】
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンまたはヒドロキシブチルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８８から９６のいずれかの方法。
【請求項９８】
ＨＥＳが、請求項８６または８７のいずれかで定義された特性を有する、請求項９７の方法。
【請求項９９】
請求項８８から９８のいずれかの方法によって得られるＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項１００】
請求項７５から８７のいずれかで定義される特徴を有するＨＡＳ−ＧＰＯ、特に請求項９９のＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項１０１】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項１０２】
請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯを含む医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＥＰＯが濃度約１ｎＭで存在している医薬組成物。
【請求項１０３】
少なくとも一つの医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１０２の医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＧＰＯが、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
【請求項１０４】
貧血障害または造血機能不全障害の治療用薬物の製造のための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯの使用。
【請求項１０５】
２０００００Ｕ／ｍｇより高いタンパク質の生理活性を有するＥＰＯの製造方法において、出発物質として４００００Ｕ／ｍｇより低いタンパク質のインビボ生理活性を有するＥＰＯの使用。
【請求項１０６】
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質としてガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの使用。
【請求項１０７】
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質として十分なシアル酸付加型のものと比較して７０％以上のインビボ生理活性を有するＧＰＯの使用。
【請求項１０８】
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０５から１０７のいずれか一つの使用。
【請求項１０９】
医薬組成物の製造に使用するのに適した修飾ＧＰＯの生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの画分が、全タンパク質の少なくとも１０％である、タンパク質の組成物を提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって医薬組成物中の使用に適したＨＡＳ−ＧＰＯを生成する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１０】
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
請求項１から５５のいずれか一つの方法によって得られる共役複合体。
【請求項１１３】
請求項１１２の共役複合体を含む組成物。
【請求項１１４】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１３の組成物。
【請求項１１５】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１２の共役複合体。
【請求項１】
糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質と修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法であって、
前記段階ｂ）は、好ましくは、該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成することによって行われ、その中でＺは、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基、およびチオエステル基からなる群から選択され、
−Ｚがアルデヒド基またはケト基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するアミノ基を含み、
−Ｚがアミノ基である場合、Ａは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基からなる群から選択され、
−Ｚがマレイミド基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するチオール基を含み、
−−Ａがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって行い、その一方の官能基は該ポリマーと反応し、その他方の官能基の少なくとも一つは、アルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基であるか、またはアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基が得られるようにさらに化学修飾された官能基であり、あるいは
−−−それは該ポリマーを酸化して少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基を得ることによって行い；あるいは
−−Ａが反応性カルボキシ基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、生じたカルボキシ基を活性化させることによって行い、あるいは
−−−それは該ポリマーをその酸化されていない還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって行い；あるいは
−Ｚがチオール基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するマレイミド基またはハロゲンアセチル基を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
段階ａ）において、出発糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質に変換される、請求項１の方法。
【請求項３】
段階ａ）において、修飾ポリオールが修飾糖ヌクレオチド、詳細には、修飾フコースヌクレオチド、修飾グルコースヌクレオチド、修飾マンノースヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルグルコサミンヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルガラクトサミンヌクレオチド、修飾シアル酸ヌクレオチドまたは修飾ガラクトースヌクレオチド、より詳細には、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、またはＧＤＰ−Ｆｕｃである、請求項１の方法。
【請求項４】
官能基Ｚが、ヒドラジド基、ヒドロキシルアミン、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基およびチオエステル基からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一つの方法。
【請求項５】
官能基Ｚが、リンカー分子、例えば適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基を通して糖ヌクレオチドのＣ−６ヒドロキシル基に結合する、請求項４の方法。
【請求項６】
トランスフェラーゼが、クラスＥＣ ２．４．１のグリコシルトランスフェラーゼ、特にその中で、該トランスフェラーゼが、β１−４ ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一つの方法。
【請求項７】
糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一つの方法。
【請求項８】
段階ｂ）において、段階ａ）の後に得られる修飾糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体に変換される、請求項１から７のいずれか一つの方法。
【請求項９】
ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、請求項１から８のいずれかの方法。
【請求項１０】
ヒドロキシエチルデンプンが、２から２００ｋＤ、好ましくは４から１３０ｋＤ、より好ましくは４から９０ｋＤの分子量を有する、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ａを含むポリマー誘導体とＺを含むタンパク質の反応の前に、該ポリマーを、その酸化されていない還元末端で、ポリマーの酸化されていない還元末端および化学基Ａと反応させることができる官能基を含む少なくとも二官能性の結合化合物と反応させることをさらに特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つの方法。
【請求項１２】
Ａがアミノオキシ基またはヒドラジド基である、請求項１から１１のいずれか一つの方法。
【請求項１３】
少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性化合物である、請求項１１または１２の方法。
【請求項１４】
ホモ二官能性化合物が二つのアミノオキシ基を含む、請求項１２の方法。
【請求項１５】
ホモ二官能性化合物がＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応が水溶媒中で実行される、請求項１１から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応によって、オキシム結合および／またはオキシアミノ結合がもたらされる、請求項１４から１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
Ｚがアミノ基であり、タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一つの方法。
【請求項１９】
ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、その酸化されたポリマーを、その酸化された還元末端で炭酸Ｎ，Ｎ’−ジサクシンイミジルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２１】
炭酸ジエステルが対称性ジエステルである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
エステルのアルコール構成要素が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、並びにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群から選択される、請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】
ハロゲン置換フェノールが、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールからなる群から選択される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性エステル基Ａを得ることを、無水非プロトン性極性溶媒中で実行する、請求項２０から２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
溶媒がジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である、請求項１８の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａである少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含む方法。
【請求項２７】
Ｍがアミノ基を含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である請求項２６の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基でない少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含み、該官能基Ｑを少なくとも一つの適当な化合物と反応させて、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法。
【請求項２９】
ＭおよびＱがアミノ基を含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】
少なくとも一つの適当な化合物が、カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基を含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
少なくとも一つの適当な化合物が、ホルミル安息香酸または４−（４−ホルミル−３，５−ジメトキシフェノキシ）酪酸である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
Ｍがアミノ基を含み、Ｑがベータヒドロキシアミノ基を含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３３】
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させる、請求項３２の方法。
【請求項３４】
ベータヒドロキシアミノ基を酸化させて、アルデヒド基を得ることをさらに特徴とする、請求項３２の方法。
【請求項３５】
過ヨウ素酸を用いて酸化反応を実行する、請求項３４の方法。
【請求項３６】
過ヨウ素酸を用いて、ポリマーに開環酸化反応を受けさせて、少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基Ａを有するポリマー誘導体を得る、請求項１８の方法。
【請求項３７】
ポリマーまたは該ポリマー誘導体のタンパク質との反応が還元的アミノ化である、請求項２６から３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
還元的アミノ化をＮａＣＮＢＨ３の存在下で実行する、請求項３７の方法。
【請求項３９】
還元的アミノ化を７以下のｐＨで実行する、請求項３７または３８の方法。
【請求項４０】
ｐＨが６以下である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
還元的アミノ化を０から２５℃の温度で実行する、請求項３７から４０のいずれかの方法。
【請求項４２】
還元的アミノ化を水溶媒中で実行する、請求項３７から４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
Ｚがチオール基である、請求項１から１１のいずれかの方法。
【請求項４４】
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
Ａがハロゲンアセチル基を含む、請求項４２または４３の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、各々がアミノ酸を含む少なくとも二つの官能基を有する少なくとも二官能性の化合物と反応させて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を有するポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法であって、該ポリマー誘導体をモノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることをさらに特徴とする方法。
【請求項４６】
ハロゲンがＢｒまたはＩである、請求項４３の方法。
【請求項４７】
少なくとも二官能性の化合物が、２から１０個の炭素原子を有するジアミノアルカンである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
【請求項４８】
少なくとも二官能性の化合物が、１から５個のアルキレン単位を有するジアミノポリエチレングリコールである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
【請求項４９】
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
【請求項５０】
ジメチルホルムアミドおよび水の混合物を含む溶媒の存在下で、ハロゲンアセチル基を含むポリマー誘導体を糖タンパク質と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
【請求項５１】
Ａがマレイミド基を含む、請求項４３または４４の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、適宜酸化された還元末端と反応させることができる官能基Ｕを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させることをさらに特徴とする方法であって、その少なくとも二官能性の化合物が、マレイミド基が得られるように化学修飾されうる官能基Ｗをさらに含み、マレイミド基が得られるように官能基Ｗを化学修飾することをさらに特徴とする方法。
【請求項５２】
Ｕがアミノ基を含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
Ｗがアミノ基を含む、請求項５１または５２の方法。
【請求項５４】
Ｗを含むポリマー誘導体を、Ｗと反応させることができる官能基を含み、さらにマレイミド基を含む少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項５０から５３のいずれかの方法。
【請求項５５】
少なくとも二官能性の化合物がＮ−（アルファ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステルである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
例えば、糖タンパク質の細胞内タンパク質分解のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を用いることによって、少なくとも一つの遊離アスパラギンおよび／またはグルタミン側鎖を含む糖タンパク質の少なくとも８０％が、すべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖において無処理のアミド基を保持している、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む組成物。
【請求項５７】
Ａが反応性カルボキシ基であり、その中でＡは、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、還元末端が酸化されていないポリマー中に導入され、前記共役複合体が、一つのポリマー分子、およびアミド結合を通して該ポリマーと結合した少なくとも一つ、特に１から１０個の糖タンパク質分子を含む、請求項５６の組成物。
【請求項５８】
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項５７の方法。
【請求項５９】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
【請求項６０】
治療上の有効量の中に、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む医薬組成物、または特に共役複合体が濃度約１ｎＭで存在している、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
【請求項６１】
請求項６０の医薬組成物であって、少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、添加剤、または担体をさらに含み、特にその中で共役複合体が、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
【請求項６２】
白血病（例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌（例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫）および肝炎（例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎）の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮアルファである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６３】
多発性硬化症、好ましくは再発性型の多発性硬化症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮベータである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６４】
急性骨髄性白血病、骨髄移植生着の失敗または遅延、流動を有する高齢者における骨髄移植または術前化学療法後の骨髄再構成、並びに自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構成用薬剤の製造のため、タンパク質がＧＭ−ＣＳＦである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６５】
重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＰＣである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６６】
心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がｔＰＡである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６７】
肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡ１ＡＴである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６８】
遺伝的欠損、静脈閉塞症、熱傷および冠状動脈バイパス手術におけるヘパリン耐性、人工呼吸療法に関連するマイクロクロット形成の予防、外傷または胃腸の手術から生じる腸穿孔；播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および／または敗血症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＴ ＩＩＩである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項６９】
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子へのインヒビターを有する血友病Ａまたは血友病Ｂ患者におけるエピソードの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７０】
血友病Ａの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７１】
血友病Ｂ、好ましくは先天性第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病を有する患者における出血性エピソードの制御および予防、例えば手術環境における出血の制御および予防用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７２】
貧血障害または造血機能不全障害あるいはその関連疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＥＰＯである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
【請求項７３】
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で糖タンパク質の本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、糖タンパク質およびポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
【請求項７４】
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で共役複合体の本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、糖タンパク質および該ポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
【請求項７５】
一つ以上のＨＡＳ分子を含むヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）であって、その中で各ＨＡＳが、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通してＧＰＯと共役複合し、特に、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンが、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端の糖部位をさらに含む共役複合体。
【請求項７６】
ＧＰＯが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴ ＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、最も好ましくはその中で、ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項７５のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７７】
ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項７５または７６のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７８】
ＧＰＯの本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、請求項７５または７７のいずれか一つのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項７９】
ＧＰＯが、少なくとも一つの末端ガラクトース部位を含む少なくとも一つのＮ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む、請求項７５から７８のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８０】
ＧＰＯが、少なくとも二つの末端ガラクトース部位を各々含む二つまたは三つのＮ−グリカンを含むＥＰＯである、請求項７９のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８１】
ＧＰＯが、哺乳類、昆虫、酵母細胞または遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項７５から８０のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８２】
ＨＡＳがリンカー分子を通してＧＰＯと共役複合した、請求項７５から８１のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８３】
ＥＰＯ １分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含む、請求項７５から８２のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８４】
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンからなる群から選択される、請求項７５から８３のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８５】
ＨＡＳがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８４のＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項８６】
ＨＥＳが、１から３００ｋＤａ、好ましくは５から１００ｋＤａの分子量を有する、請求項８５のＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項８７】
ＨＥＳが、ヒドロキシエチル基に関して０．１から０．８のモル置換度および２〜２０の範囲内のＣ２：Ｃ６置換比を示す、請求項８５または８６のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項８８】
請求項７５から８７のいずれか一つのヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）の生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯを提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって一つ以上のＨＡＳ分子を含むＨＡＳ−ＧＰＯ（各ＨＡＳは、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通して該ＧＰＯと共役複合し、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンは、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端糖部位をさらに含む）を生成する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項８９】
ＧＰＯがＥＰＯであり、特にその中で、該ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項８８の方法。
【請求項９０】
請求項１３の方法の前およびその間に、ＧＰＯが、常に３．０から９．０の間のｐＨで保たれ、それによってＨＡＳ−ＧＰＯが生成され、その中で該ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項８８の方法。
【請求項９１】
ＧＰＯが哺乳類、昆虫または酵母細胞、あるいは遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項８８から９０のいずれかの方法。
【請求項９２】
末端ガラクトース単位が、末端シアル酸の部分的または完全な酵素的除去の後に酸化される、請求項９０の方法。
【請求項９３】
段階ｄ）において、修飾ＨＡＳを、酸化された末端サッカライド単位と共役複合させる、請求項９１または９２の方法。
【請求項９４】
請求項１３の段階ｃ）のＨＡＳを、それが遊離ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド官能基を含むように修飾する、請求項８８から９３のいずれかの方法。
【請求項９５】
段階ｄ）が、少なくとも１０重量％のＨ２Ｏを含む反応溶媒中で行われる、請求項８８から９４のいずれかの方法。
【請求項９６】
ＨＡＳが、リンカー分子を通してＧＰＯ、特にＥＰＯと共役複合した、請求項８８から９５のいずれかの方法。
【請求項９７】
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンまたはヒドロキシブチルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８８から９６のいずれかの方法。
【請求項９８】
ＨＥＳが、請求項８６または８７のいずれかで定義された特性を有する、請求項９７の方法。
【請求項９９】
請求項８８から９８のいずれかの方法によって得られるＨＡＳ−ＧＰＯ。
【請求項１００】
請求項７５から８７のいずれかで定義される特徴を有するＨＡＳ−ＧＰＯ、特に請求項９９のＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項１０１】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯ。
【請求項１０２】
請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯを含む医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＥＰＯが濃度約１ｎＭで存在している医薬組成物。
【請求項１０３】
少なくとも一つの医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１０２の医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＧＰＯが、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
【請求項１０４】
貧血障害または造血機能不全障害の治療用薬物の製造のための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯの使用。
【請求項１０５】
２０００００Ｕ／ｍｇより高いタンパク質の生理活性を有するＥＰＯの製造方法において、出発物質として４００００Ｕ／ｍｇより低いタンパク質のインビボ生理活性を有するＥＰＯの使用。
【請求項１０６】
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質としてガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの使用。
【請求項１０７】
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質として十分なシアル酸付加型のものと比較して７０％以上のインビボ生理活性を有するＧＰＯの使用。
【請求項１０８】
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０５から１０７のいずれか一つの使用。
【請求項１０９】
医薬組成物の製造に使用するのに適した修飾ＧＰＯの生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの画分が、全タンパク質の少なくとも１０％である、タンパク質の組成物を提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって医薬組成物中の使用に適したＨＡＳ−ＧＰＯを生成する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１０】
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
請求項１から５５のいずれか一つの方法によって得られる共役複合体。
【請求項１１３】
請求項１１２の共役複合体を含む組成物。
【請求項１１４】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１３の組成物。
【請求項１１５】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１２の共役複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５３２９６６（Ｐ２００８−５３２９６６Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５００１２９（Ｐ２００８−５００１２９）
【出願日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００２１７９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４８１０
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５３４４０２９）フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】ＦＲＥＳＥＮＩＵＳ ＫＡＢＩ ＤＥＵＴＳＣＨＬＡＮＤ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００２１７９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４８１０
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５３４４０２９）フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】ＦＲＥＳＥＮＩＵＳ ＫＡＢＩ ＤＥＵＴＳＣＨＬＡＮＤ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
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