乳酸の製造方法
【課題】乳酸の生産能力を有する微生物を培養して乳酸を生産するとき、乳酸を含む培養液をナノフィルターに通じることで乳酸の分離精製に関する課題を解決し、効率よく乳酸を製造する方法を提供する。
【解決手段】乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法。
【解決手段】乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物の発酵培養による乳酸の製造方法に関する。具体的には、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られた培養液をナノフィルターによって濾過して、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している水酸基の立体により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に、培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加することによる中和操作により、培養液中では乳酸塩として存在している。一方、乳酸をモノマー原料として用いる場合には、高度に分離精製されたフリー乳酸を製造する必要がある。フリー乳酸は、発酵終了後、培養液に酸性物質を添加することで得られるが、その後の分離精製が煩雑でコスト高となる。
【０００４】
これまでに、簡便にフリーの乳酸を得るために、アルカリ性物質によって中和操作を行わない微生物発酵により得られた培養液を蒸留することでフリーの乳酸を生産する技術が開示されている（特許文献１参照）。この方法では、蒸留時に培養液を加熱するエネルギーコストが高いという不具合がある。
【０００５】
次に、乳酸を含む溶液をナノフィルター処理する従来の技術に関して説明する。これまでに、乳酸カルシウム含有食品を製造する際に、乳酸カルシウムの濃縮するためにナノフィルター処理する技術が開示されているが、本技術はｐＨを６〜９に調整して乳酸カルシウムを濃縮しており、フリー乳酸を分離精製することは難しかった（特許文献２参照）。また、古紙から乳酸を製造する方法において、乳酸の精製工程としてナノフィルター処理を行うことが示されている（特許文献３参照）。しかし本工程は、乳酸の精製残査を処理廃棄するためのものであり、乳酸の分離精製に用いているものではなかった。
【０００６】
このように、従来ではフリーの乳酸を得るための分離精製には煩雑な操作を必要としており、簡便にフリー乳酸を得られる乳酸の製造法が望まれていた。
【特許文献１】特開２００２−１２８７２７号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９２８１号公報
【特許文献３】特開２００２−２３８５９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物を培養して乳酸を生産するとき、乳酸を含む培養液をナノフィルターに通じることで乳酸の分離精製に関する課題を解決し、効率よく乳酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られる培養液をナノフィルターに通じて濾過することで生産物である乳酸と不純物が分離できると考え、鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程を含む乳酸の製造方法を提供するものである。
【００１０】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記ナノフィルターの機能層はポリアミドである。
【００１１】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、以下の化学式１で示される構成成分を含有している。
【００１２】
【化１】
【００１３】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）。
【００１４】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である。
【００１５】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記培養液が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜を通じて濾過された濾液である。
【００１６】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記培養が連続培養であり、更に好ましくは培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の培養液に追加する連続培養である。
【００１７】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、乳酸の生産能力を有する微生物が酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれか１種である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の乳酸の製造方法によれば、乳酸の生産能力を有する微生物を培養して得られる乳酸を含む培養液をナノフィルターで濾過することで、所望の生産物である乳酸の効率的な製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の乳酸の製造方法は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法を提供するものである。
【００２０】
本発明の乳酸の製造方法のナノフィルターとは、ナノ濾過膜（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００２１】
ナノフィルターの素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のように、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００２２】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００２３】
ポリアミドを機能層とするナノフィルターにおいて、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００２４】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、例えばピペラジン、ピペリジンなどが挙げられ、これらを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノフィルターは耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式１中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドとしては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられる。
【００２５】
ナノフィルターは一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノフィルターも、スパイラル型の膜エレメントとして使用されることが好ましい。好ましいナノフィルターの具体例としては、例えば、東レ（株）製ポリアミド系半透膜ＵＴＣ６０を挙げられ、同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００、ＳＵ−６１０も使用することができる。またフィルムテック社製ナノフィルター膜ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−４００なども使用することができる。
【００２６】
本発明の乳酸の製造方法における、「ナノフィルターに通じて濾過する」とは、微生物の発酵培養により生産された乳酸を含む培養液を、ナノフィルターに通じて濾過し、溶解している不純物の除去または阻止または濾別し、乳酸水溶液を濾液として透過させることを意味する。本発明の乳酸の分離法における不純物としては、微生物などの懸濁物質、糖類、タンパク質、無機イオンなどが挙げられる。
【００２７】
乳酸水溶液のナノフィルター透過性の評価方法としては、乳酸透過率を算出して評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。乳酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過水（乳酸溶液）中に含まれる乳酸濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式１によって算出することができる。
【００２８】
乳酸透過率（％）＝（透過水乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式１）。
【００２９】
また、不純物のナノフィルター透過性の評価方法としては、原水（培養液）中に含まれる不純物濃度（原水乳酸濃度）および透過水（乳酸溶液）中に含まれる不純物濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式２によって算出することができる。
【００３０】
不純物透過率（％）＝（透過水不純物濃度／原水不純物濃度）×１００・・・（式２）。
尚、懸濁物質、糖類、アミノ酸類、有機酸類の不純物の定量は、それぞれの物質の定量に関する定法を用いて評価することができる。
【００３１】
膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過水量および透過水量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。
【００３２】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・ｄａｙ・ＭＰａ））＝透過水量／（膜面積×採水時間×濾過圧）・・・（式３）。
【００３３】
本発明の乳酸の製造方法において、微生物培養液のナノフィルターによる濾過は、圧力をかけて分離を行ってもよい。圧力をかけて濾過する場合、その濾過圧は、０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。さらに０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲である場合、膜透過流束が高いことから、乳酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００３４】
本発明の乳酸の製造方法において、ナノフィルターによる濾過に供する培養液のｐＨは、２以上５未満であることを特徴とする。ナノフィルターは、溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことが知られていることから、培養液のｐＨを５未満とすることで、乳酸が培養液中で解離して乳酸イオンとして存在している割合が少なくなり、乳酸が透過しやすくなる。好ましくは、ｐＨ４以下であり、より好ましくは乳酸のｐＫａが３．８６であることから、ｐＨを３．８６以下とすることで、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の方が培養溶液中に多く含まれるため、効率的に乳酸を透過させることができ、更に好ましくはｐＨ３以下である。またナノフィルターによる濾過に供する培養液のｐＨは２以上である。培養液のｐＨが２未満であるとナノフィルターの耐久性が低下しやすくなることから、所望の分離性能が得られなくなる場合がある。
【００３５】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターの膜分離性能としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。また、ナノフィルターの膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）で０．３ＭＰａの濾過圧において、ナノフィルター膜１ｍ２あたりの水の透過水量（ｍ３／ｍ２／日）が４以上のものが好ましく用いられる。
【００３６】
ナノフィルターによる分離で用いる微生物培養液中の乳酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、製造する乳酸量に対してナノフィルターに通じる培養液量を少なくできることからコスト削減に好適である。
【００３７】
ここで、本発明の乳酸の製造方法に用いることができるナノフィルター分離膜装置の好ましい態様について説明する。本発明の乳酸の製造方法で用いることができるナノフィルター分離膜装置の形態としては、培養液を貯留するための原水槽と、ろ過の駆動力を与える高圧ポンプとナノフィルターを装着するためのセルによって主に構成される。
【００３８】
図１は、本発明で用いることができるナノフィルター分離膜装置の例を説明するための概要図である。また、図２は本発明で用いることができるナノフィルター分離膜装置のナノフィルターが装着された例を説明するためのセル断面概要図である。次に、図１のナノフィルター分離膜装置による乳酸の分離の形態について説明する。ナノフィルター膜７をセル２に支持板８を用いて装着する。次に培養液を原水槽に投入して、高圧ポンプ３によって培養液をセルに送液することによって乳酸の分離を行う。高圧ポンプ３によるろ過圧力は０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下で行うことができる。好ましくは、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下であり、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。培養液はセル７に送液されて乳酸が分離された透過液７が得られる。セルで濃縮された濃縮液５は再び原水槽１に返送される。この時、透過液と等量の培養液を新たに原水槽に投入することで連続的に乳酸の分離を行うことも可能である（図示せず）。このようにして、培養液から所望の生産物である乳酸と不純物を分離し、簡便に乳酸を製造することができる。
【００３９】
本発明の乳酸の製造方法において、培養液をナノフィルターで濾過して得られる乳酸溶液を、さらに蒸留する工程に供することで、高純度の乳酸を得ることができる。蒸留工程は、１Ｐａ以上大気圧（常圧、約１０１ｋＰａ）以下の減圧下で行うことが好ましい。減圧下で行う場合の蒸留温度は、２０℃以上２００℃以下で行うことが好ましいが、１８０℃以上で蒸留を行った場合、不純物の影響により、乳酸がラセミ化する虞があるため、５０℃以上１８０℃以下であれば、好適に乳酸の蒸留を行うことができる。この蒸留工程に供する前に、ナノフィルターを透過した乳酸溶液を、一旦エバポレーターに代表される濃縮装置を用いて乳酸溶液を濃縮してもよい。
【００４０】
以下、本発明の乳酸の分離方法に供される微生物の発酵培養による乳酸生産について説明する。
【００４１】
本発明で使用される乳酸の生産能力を有する微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。前記微生物の中でも、酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれかから１種選択されることが好ましい。
【００４２】
本発明の乳酸の製造方法において、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸を生産する能力のある微生物を用いることができる。本発明の乳酸の分離方法において、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸を生産する能力のある微生物としては、乳酸菌、カビなどを好ましく用いることができる。
【００４３】
本発明の乳酸の製造方法で用いることができる乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。また、リゾパス属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属するカビを挙げることができる。それらの中でも、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸の対糖収率の高い乳酸菌またはカビが好ましく選択される。
【００４４】
本発明の乳酸の製造方法において、Ｌ−乳酸を製造する場合には、上記乳酸の生産能力を有する微生物のうちＬ―乳酸の生産能力が高い微生物を用いることが効率的である。また、本発明の乳酸の製造方法において、Ｄ−乳酸を製造する場合には、上記乳酸の生産能力を有する微生物のうちＤ−乳酸の生産能力が高い微生物を用いることが効率的である。ここで、Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。
【００４５】
また、本発明で用いることができる乳酸の生産能力を有する微生物として、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物を用いることができる。例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、ＬＤＨと言うことがある）を導入して、乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物を用いることができる。乳酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬＤＨを組み込むことにより乳酸生産能力を付与、あるいは増強した組換え微生物が挙げられる。
【００４６】
本発明の乳酸の製造方法において、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４７】
本発明で使用するＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、例えば、乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬＤＨを用いることができる。本発明の乳酸の製造方法において、Ｌ−乳酸を製造する場合には、上記ＬＤＨうち、ピルビン酸をＬ−乳酸に変換するＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｌ−ＬＤＨ）を導入した組換え微生物を用いることが効率的である。また、本発明の乳酸の製造方法において、Ｄ−乳酸を製造する場合には、上記ＬＤＨのうち、ピルビン酸をＤ−乳酸に変換するＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ−ＬＤＨ）を導入した組換え微生物を用いることが効率的である。
【００４８】
ここで、Ｌ−乳酸を製造する場合には、ほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨまたは両生類由来Ｌ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００４９】
本発明の乳酸の製造方法における培養液とは、本発明で用いることができる乳酸の生産能力を有する微生物を発酵培地に接種してｐＨ２以上５未満で培養し、該微生物に乳酸を発酵培養液中に産成せしめた乳酸を含む液のことである。本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物を培養する発酵培地としては、該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該微生物が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース等の糖類、これらの糖類を含有する糖蜜、デンプン又はデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。例えば、トウモロコシデンプンを加水分解した糖や、サトウキビの絞り汁やその粗生成物である粗糖を用いることが出来る。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。上記炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、又は培養中に分割して若しくは連続的に添加することもでき、２０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５０】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養は、ｐＨ２以上５未満の範囲で行い、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。
【００５１】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養方法としては、回分培養、流加培養、ならびに連続培養を採用することができ、それぞれの培養から乳酸を含む培養液を得ることができる。培養温度は２５〜４０℃がよく、培養時間は、回分培養ならびに流加培養の場合は、通常２４時間〜５日間である。
【００５２】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養は、中和剤を培養液に投入することでｐＨ２以上５未満の範囲で行うことができる。このｐＨの調整はアルカリ溶液、アルカリ懸濁液、アルカリ性のガスを培養液に投入することで行うことができる。アルカリ溶液あるいはアルカリ懸濁液には水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、炭酸カルシウムを好ましく用いることができ、水酸化カルシウムがより好ましく用いられる。アルカリ性のガスにはアンモニアを好ましく用いることができる。中和剤の投入量は培養液のｐＨが２以上４．９未満の範囲で可能な限り少なくすることが望ましい。中和剤の投入量を少なくすることによって、培養液中の乳酸として、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の割合が高くなり、効率的な乳酸の分離が実現する。
【００５３】
上記のごとく乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満の範囲で培養して得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過することで生産物である乳酸と不純物が分離でき、効率的に乳酸を製造することができる。本発明において不純物として好ましく分離されるものとしては、発酵培地または中和剤由来のカルシウムやカルシウムイオン、硫酸イオンなどを挙げることができ、更に発酵培地または微生物由来の糖およびタンパク質が挙げられる。
【００５４】
更に、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満の範囲で培養して得られた培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過した濾液をナノフィルターに通じて濾過することで乳酸と不純物を効率的に分離することも可能である。培養液を一旦、精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過することによって、微生物などの懸濁物質や、多糖類などの巨大分子などを予め除去でき、ナノフィルターの閉塞や性能悪化を回避できることから、安定して乳酸と不純物の分離が可能となる。
【００５５】
ここで本発明に用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜について説明する。精密ろ過膜は、孔径が概ね５０ナノメートルから１０マイクロメートルの多孔性膜のことであり、一般的には微生物を含む懸濁物質の除去に用いられるものである。限外ろ過膜は孔径が概ね２から２００ナノメートルの多孔性膜のことであり、一般的にはウィルスの除去、蛋白質や酵素などの除去、あるいは分離または濃縮に用いられるものである。
【００５６】
本発明で用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜としては多孔性膜を用いることが望ましい。多孔性膜とは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜の材質は前記性能を有していればよく、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【００５７】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００５８】
本発明の乳酸の製造法で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００５９】
本発明の乳酸の製造方法で用いられる多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００６０】
また、多孔質基材の多孔質樹脂層には、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。
【００６１】
有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００６２】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００６３】
本発明で用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜の形状は、平膜、中空糸膜、スパイラル膜、ならびにチューブラー膜のいずれも選択しうる。
【００６４】
本発明の乳酸の製造方法で用いられる微生物の培養方法のうち、連続培養することで乳酸を生産することが好ましい。連続培養とは、発酵培養を行っている発酵培養槽から、培養液を連続的に抜き取り、発酵培地を前記の培養液に追加しながら培養する方法であり、こうすることで乳酸を連続発酵することができる。連続培養の利点は、発酵培地を連続的に供給することから、目的生産物である乳酸の生産速度が向上するとともに、培養液のナノフィルターへの連続供給が可能になることから、ナノフィルター処理の稼働率が向上し、その結果、効率的な乳酸の分離が実現する。培養温度は２５〜４０℃がよく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６５】
連続培養のうち、精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続培養を行うことで乳酸の連続発酵を行うこともできる。具体的には、本発明の酵母の発酵培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続発酵方法である。精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続培養では、未濾過液に含まれる酵母が再び発酵培養液に保持または還流され、発酵培養槽内の酵母濃度が向上することから、乳酸の生産速度向上が可能となる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６６】
ここで、連続培養で用いる精密ろ過膜または限外ろ過膜の好ましい態様について説明する。精密ろ過膜または限外ろ過膜として用いる多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが望ましい。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物もしくは培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍ四方の範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００６７】
精密ろ過膜または限外ろ過膜として用いる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜として用いる多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００６８】
多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
【００６９】
また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００７０】
次に、精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続発酵に用いる連続発酵装置の好ましい態様を説明する。本発明の乳酸の分離方法で用いることができる連続発酵装置の形態としては、微生物を発酵培養させるための発酵反応槽と、培養液に接触できるように配設され分離膜を備えた培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段を有する。分離膜エレメントには分離膜として上述の多孔性膜が用いることができ、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。
【００７１】
次に、本発明の乳酸の製造法で用いることができる連続発酵装置の好ましい態様として、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段からなる装置を例に挙げて具体的に図面を用いて説明する。
【００７２】
図３は、本発明で用いることができる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。図３において、連続発酵装置は、内部に分離膜エレメント１０を備えた発酵反応槽９と水頭差制御装置１１で基本的に構成されている。発酵反応槽９内の分離膜エレメント１０には、多孔性膜が組み込まれている。
【００７３】
次に、図３の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ１５によって、培地を発酵反応槽９に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて、加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽９内の攪拌機１２で発酵反応槽９内の発酵培養液を攪拌する。発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置１３によって必要とする気体を発酵反応槽９内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置１４およびｐＨ調整溶液供給ポンプ１６によって発酵反応槽９内の発酵液のｐＨを２以上５未満に調整し、必要に応じて、温度調節器１７によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰ(Oxidation Reduction Potential：酸化還元電位）の制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、各種培養条件の制御を行うことができる。
【００７４】
図３において、発酵培養液は、発酵反応槽９内に設置された分離膜エレメント１０によって、微生物と発酵生産物が、濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント１０による濾過・分離は発酵反応槽９の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ１８および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント１０の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽９内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽９内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、その培養液を必要に応じて発酵反応槽９内に供給することにより、常にフレッシュな本発明の酵母による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００７５】
以上のように、本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られる培養液をナノフィルターに通じて濾過することで不純物を除去する乳酸の製造方法を提供するものである。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。具体的には、乳酸の生産能力を有する微生物の例として酵母、乳酸の例としてＬ−乳酸、乳酸の生産能力を有する微生物の培養方法の例として回分培養と精密ろ過膜を用いた連続培養を行った実施例により、詳細に説明する。
【００７７】
参考例１ 乳酸生産能力を有する酵母の作製
本発明では、乳酸生産能力を有する酵母として、配列番号１に記載の塩基配列を有するアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子がＰＤＣ１プロモーターの下流の導入された酵母を使用した。アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、アフリカツメガエルの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【００７８】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００７９】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００８０】
上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図４に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【００８１】
このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号４は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８２】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８３】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【００８４】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００８５】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【００８６】
次に、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号公報に記載されている、ｐｄｃ１遺伝子がＴＲＰ１マーカーと置換され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＢ２株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株を選択した。得られた酵母株をＳＷ０１６株とした。
【００８７】
また、ＳＷ０１６株が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上清に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定することで確認した。
【００８８】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津製作所製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００８９】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００９０】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【００９１】
なお、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【００９２】
光学純度（%）＝100×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００９３】
ＨＰＬＣ分析の結果、Ｌ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、このＳＷ０１６株がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。
【００９４】
参考例２ 多孔性膜の作製
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００９５】
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。
【００９６】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【００９７】
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【００９８】
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【００９９】
参考例３ 回分培養によるＬ−乳酸の製造
表１に示す乳酸発酵培地を用い、回分培養によってＬ−乳酸を製造した。培地組成である粗糖には「沖縄の優糖精」（ムソー株式会社）を用いた。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ０１６株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。参考例３の運転条件を以下に示す。
【０１００】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、 温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．０２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：８Ｎ 水酸化カルシウム懸濁液により適宜調整。
【０１０１】
まず、ＳＷ０１６株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、培養を行った。培養はｐＨを５、４．５、４、３．８６にそれぞれ調整、ならびに水酸化カルシウムを添加しない培養をそれぞれ行った。回分培養の結果を表２に示す。尚、水酸化カルシウムを投入しない発酵液のｐＨは２．８であった。それぞれの回分培養で得られた培養液を参考例２で作製した多孔性膜でろ過した培養ろ液を得た。これら培養ろ液を実施例で用いた。
【０１０２】
参考例４ 連続培養によるＬ−乳酸の製造
図２に示す連続発酵装置を用いた連続培養によってＬ−乳酸を連続的に製造した。表１に示す組成の乳酸発酵培地を、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、前記の参考例２で作製した多孔性膜を用いた。参考例４における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０３】
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）（窒素：空気＝９：１で混合）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：８Ｎ 水酸化カルシウム懸濁液により適宜調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（膜間差圧として２０ ｋＰａ以下に制御した。）。
【０１０４】
微生物として前記の参考例１で造成した酵母ＳＷ０１６株を用いた。生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、前記の参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１０５】
まず、試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地を用いＳＷ０１６株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図３に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって５００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽９の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら発酵培養液を濾過・分離し連続培養することで、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置＊により、膜間差圧が０．１〜２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることによって行った。適宜、培養ろ液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続培養はｐＨを５、４．５、３．８６にそれぞれ調整ならびに水酸化カルシウムを添加しない連続培養をそれぞれ行った。各々のｐＨ条件の連続培養は３００時間行った。連続培養の結果を表２に示す。尚、結果は連続培養開始後２００時間から３００時間の間に適宜に分取した２Ｌの培養ろ液のものであり、水酸化カルシウムを投入しない培養ろ液のｐＨは２．８であった。これら培養ろ液を実施例で用いた。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
実施例１
参考例２のｐＨ４．５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液を、図１に示す膜濾過装置を用いてナノフィルターろ過を行った。２Ｌの該培養液の原水槽１に注入した。９０φナノフィルター７（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力３ＭＰａに調整し、透過水４を回収した。原水槽１、透過水４に含まれる、硫酸イオン、ならびにカルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）、糖濃度をアンスロン硫酸法、タンパク質濃度をローリー法により分析した。結果を表３に示す。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
実施例２
参考例２のｐＨ４に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１１】
実施例３
参考例２のｐＨ３．８６に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１２】
実施例４
参考例２の水酸化カルシウムを投入しない培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１３】
比較例１
参考例２のｐＨ５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。比較例１と実施例１〜４の結果から、ｐＨ２以上５未満で培養する方が透過側の乳酸の回収率が高くなることから、効率的に乳酸水溶液を得られることが明らかになった。
【０１１４】
実施例５
参考例３のｐＨ４．５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液を、図１に示す膜濾過装置を用いたナノフィルターろ過を行った。２Ｌの該培養ろ液を原水槽１に注入した。９０φナノフィルター７（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力３ＭＰａに調整し、透過水４を回収した。原水槽１、透過水４に含まれる、硫酸イオン、ならびにカルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）、糖濃度をアンスロン硫酸法、タンパク質濃度をローリー法により分析した。結果を表４に示す。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
実施例６
参考例３のｐＨ４に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１７】
実施例７
参考例３のｐＨ３．８６に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１８】
実施例８
参考例３の水酸化カルシウムを投入しない培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１９】
比較例２
参考例３のｐＨ５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。比較例２と実施例５〜８の結果から、ｐＨ２以上５未満で培養する方が透過側の乳酸の回収率が高くなることから、効率的に乳酸水溶液を得られることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は本発明で用いることができるナノフィルター膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】図２は本発明で用いることができるナノフィルター膜分離装置のナノフィルターが装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図３】図３は、本発明で用いることができる連続発酵装置の例を説明する概略側面図である。
【図４】図４は、本発明で用いることができる発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップである。
【符号の説明】
【０１２１】
１ 原水槽
２ ナノフィルター膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜透過液の流れ
５ 膜濃縮液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７ ナノフィルター
８ 支持板
９ 発酵反応槽
１０ 分離膜エレメント
１１ 水頭制御装置
１２ 攪拌機
１３ 気体供給装置
１４ 撹拌機
１５ 発酵培地供給ポンプ
１６ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
１７ 温度調節器
１８ レベルセンサ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物の発酵培養による乳酸の製造方法に関する。具体的には、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られた培養液をナノフィルターによって濾過して、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している水酸基の立体により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。
【０００３】
微生物発酵による乳酸の生産は、一般に、培養液中にアルカリ性物質を添加することで、微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加することによる中和操作により、培養液中では乳酸塩として存在している。一方、乳酸をモノマー原料として用いる場合には、高度に分離精製されたフリー乳酸を製造する必要がある。フリー乳酸は、発酵終了後、培養液に酸性物質を添加することで得られるが、その後の分離精製が煩雑でコスト高となる。
【０００４】
これまでに、簡便にフリーの乳酸を得るために、アルカリ性物質によって中和操作を行わない微生物発酵により得られた培養液を蒸留することでフリーの乳酸を生産する技術が開示されている（特許文献１参照）。この方法では、蒸留時に培養液を加熱するエネルギーコストが高いという不具合がある。
【０００５】
次に、乳酸を含む溶液をナノフィルター処理する従来の技術に関して説明する。これまでに、乳酸カルシウム含有食品を製造する際に、乳酸カルシウムの濃縮するためにナノフィルター処理する技術が開示されているが、本技術はｐＨを６〜９に調整して乳酸カルシウムを濃縮しており、フリー乳酸を分離精製することは難しかった（特許文献２参照）。また、古紙から乳酸を製造する方法において、乳酸の精製工程としてナノフィルター処理を行うことが示されている（特許文献３参照）。しかし本工程は、乳酸の精製残査を処理廃棄するためのものであり、乳酸の分離精製に用いているものではなかった。
【０００６】
このように、従来ではフリーの乳酸を得るための分離精製には煩雑な操作を必要としており、簡便にフリー乳酸を得られる乳酸の製造法が望まれていた。
【特許文献１】特開２００２−１２８７２７号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９２８１号公報
【特許文献３】特開２００２−２３８５９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物を培養して乳酸を生産するとき、乳酸を含む培養液をナノフィルターに通じることで乳酸の分離精製に関する課題を解決し、効率よく乳酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られる培養液をナノフィルターに通じて濾過することで生産物である乳酸と不純物が分離できると考え、鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過する工程を含む乳酸の製造方法を提供するものである。
【００１０】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記ナノフィルターの機能層はポリアミドである。
【００１１】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、以下の化学式１で示される構成成分を含有している。
【００１２】
【化１】
【００１３】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）。
【００１４】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である。
【００１５】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記培養液が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜を通じて濾過された濾液である。
【００１６】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、前記培養が連続培養であり、更に好ましくは培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の培養液に追加する連続培養である。
【００１７】
本発明の乳酸水溶液の製造方法で好ましい態様によれば、乳酸の生産能力を有する微生物が酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれか１種である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の乳酸の製造方法によれば、乳酸の生産能力を有する微生物を培養して得られる乳酸を含む培養液をナノフィルターで濾過することで、所望の生産物である乳酸の効率的な製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の乳酸の製造方法は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法を提供するものである。
【００２０】
本発明の乳酸の製造方法のナノフィルターとは、ナノ濾過膜（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００２１】
ナノフィルターの素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のように、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。
【００２２】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。
【００２３】
ポリアミドを機能層とするナノフィルターにおいて、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。
【００２４】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、例えばピペラジン、ピペリジンなどが挙げられ、これらを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノフィルターは耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式１中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドとしては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられる。
【００２５】
ナノフィルターは一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノフィルターも、スパイラル型の膜エレメントとして使用されることが好ましい。好ましいナノフィルターの具体例としては、例えば、東レ（株）製ポリアミド系半透膜ＵＴＣ６０を挙げられ、同社製ナノフィルターモジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００、ＳＵ−６１０も使用することができる。またフィルムテック社製ナノフィルター膜ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−４００なども使用することができる。
【００２６】
本発明の乳酸の製造方法における、「ナノフィルターに通じて濾過する」とは、微生物の発酵培養により生産された乳酸を含む培養液を、ナノフィルターに通じて濾過し、溶解している不純物の除去または阻止または濾別し、乳酸水溶液を濾液として透過させることを意味する。本発明の乳酸の分離法における不純物としては、微生物などの懸濁物質、糖類、タンパク質、無機イオンなどが挙げられる。
【００２７】
乳酸水溶液のナノフィルター透過性の評価方法としては、乳酸透過率を算出して評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。乳酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過水（乳酸溶液）中に含まれる乳酸濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式１によって算出することができる。
【００２８】
乳酸透過率（％）＝（透過水乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式１）。
【００２９】
また、不純物のナノフィルター透過性の評価方法としては、原水（培養液）中に含まれる不純物濃度（原水乳酸濃度）および透過水（乳酸溶液）中に含まれる不純物濃度（透過水乳酸濃度）を測定することで、式２によって算出することができる。
【００３０】
不純物透過率（％）＝（透過水不純物濃度／原水不純物濃度）×１００・・・（式２）。
尚、懸濁物質、糖類、アミノ酸類、有機酸類の不純物の定量は、それぞれの物質の定量に関する定法を用いて評価することができる。
【００３１】
膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過水量および透過水量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。
【００３２】
膜透過流束（ｍ３／（ｍ２・ｄａｙ・ＭＰａ））＝透過水量／（膜面積×採水時間×濾過圧）・・・（式３）。
【００３３】
本発明の乳酸の製造方法において、微生物培養液のナノフィルターによる濾過は、圧力をかけて分離を行ってもよい。圧力をかけて濾過する場合、その濾過圧は、０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。さらに０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲である場合、膜透過流束が高いことから、乳酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００３４】
本発明の乳酸の製造方法において、ナノフィルターによる濾過に供する培養液のｐＨは、２以上５未満であることを特徴とする。ナノフィルターは、溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことが知られていることから、培養液のｐＨを５未満とすることで、乳酸が培養液中で解離して乳酸イオンとして存在している割合が少なくなり、乳酸が透過しやすくなる。好ましくは、ｐＨ４以下であり、より好ましくは乳酸のｐＫａが３．８６であることから、ｐＨを３．８６以下とすることで、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の方が培養溶液中に多く含まれるため、効率的に乳酸を透過させることができ、更に好ましくはｐＨ３以下である。またナノフィルターによる濾過に供する培養液のｐＨは２以上である。培養液のｐＨが２未満であるとナノフィルターの耐久性が低下しやすくなることから、所望の分離性能が得られなくなる場合がある。
【００３５】
本発明の乳酸の製造方法で用いるナノフィルターの膜分離性能としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の除去率が４５％以上のものが好ましく用いられる。また、ナノフィルターの膜の透過性能としては、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）で０．３ＭＰａの濾過圧において、ナノフィルター膜１ｍ２あたりの水の透過水量（ｍ３／ｍ２／日）が４以上のものが好ましく用いられる。
【００３６】
ナノフィルターによる分離で用いる微生物培養液中の乳酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、製造する乳酸量に対してナノフィルターに通じる培養液量を少なくできることからコスト削減に好適である。
【００３７】
ここで、本発明の乳酸の製造方法に用いることができるナノフィルター分離膜装置の好ましい態様について説明する。本発明の乳酸の製造方法で用いることができるナノフィルター分離膜装置の形態としては、培養液を貯留するための原水槽と、ろ過の駆動力を与える高圧ポンプとナノフィルターを装着するためのセルによって主に構成される。
【００３８】
図１は、本発明で用いることができるナノフィルター分離膜装置の例を説明するための概要図である。また、図２は本発明で用いることができるナノフィルター分離膜装置のナノフィルターが装着された例を説明するためのセル断面概要図である。次に、図１のナノフィルター分離膜装置による乳酸の分離の形態について説明する。ナノフィルター膜７をセル２に支持板８を用いて装着する。次に培養液を原水槽に投入して、高圧ポンプ３によって培養液をセルに送液することによって乳酸の分離を行う。高圧ポンプ３によるろ過圧力は０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下で行うことができる。好ましくは、０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下であり、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。培養液はセル７に送液されて乳酸が分離された透過液７が得られる。セルで濃縮された濃縮液５は再び原水槽１に返送される。この時、透過液と等量の培養液を新たに原水槽に投入することで連続的に乳酸の分離を行うことも可能である（図示せず）。このようにして、培養液から所望の生産物である乳酸と不純物を分離し、簡便に乳酸を製造することができる。
【００３９】
本発明の乳酸の製造方法において、培養液をナノフィルターで濾過して得られる乳酸溶液を、さらに蒸留する工程に供することで、高純度の乳酸を得ることができる。蒸留工程は、１Ｐａ以上大気圧（常圧、約１０１ｋＰａ）以下の減圧下で行うことが好ましい。減圧下で行う場合の蒸留温度は、２０℃以上２００℃以下で行うことが好ましいが、１８０℃以上で蒸留を行った場合、不純物の影響により、乳酸がラセミ化する虞があるため、５０℃以上１８０℃以下であれば、好適に乳酸の蒸留を行うことができる。この蒸留工程に供する前に、ナノフィルターを透過した乳酸溶液を、一旦エバポレーターに代表される濃縮装置を用いて乳酸溶液を濃縮してもよい。
【００４０】
以下、本発明の乳酸の分離方法に供される微生物の発酵培養による乳酸生産について説明する。
【００４１】
本発明で使用される乳酸の生産能力を有する微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。前記微生物の中でも、酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれかから１種選択されることが好ましい。
【００４２】
本発明の乳酸の製造方法において、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸を生産する能力のある微生物を用いることができる。本発明の乳酸の分離方法において、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸を生産する能力のある微生物としては、乳酸菌、カビなどを好ましく用いることができる。
【００４３】
本発明の乳酸の製造方法で用いることができる乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバシラス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。また、リゾパス属（Ｇｅｎｕｓ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属するカビを挙げることができる。それらの中でも、ｐＨが２以上５未満の範囲で培養して乳酸の対糖収率の高い乳酸菌またはカビが好ましく選択される。
【００４４】
本発明の乳酸の製造方法において、Ｌ−乳酸を製造する場合には、上記乳酸の生産能力を有する微生物のうちＬ―乳酸の生産能力が高い微生物を用いることが効率的である。また、本発明の乳酸の製造方法において、Ｄ−乳酸を製造する場合には、上記乳酸の生産能力を有する微生物のうちＤ−乳酸の生産能力が高い微生物を用いることが効率的である。ここで、Ｌ−乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるＤ−乳酸と明確に区別することができる。
【００４５】
また、本発明で用いることができる乳酸の生産能力を有する微生物として、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物を用いることができる。例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、ＬＤＨと言うことがある）を導入して、乳酸生産能力を付与、あるいは増強した微生物を用いることができる。乳酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＬＤＨを組み込むことにより乳酸生産能力を付与、あるいは増強した組換え微生物が挙げられる。
【００４６】
本発明の乳酸の製造方法において、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００４７】
本発明で使用するＬＤＨとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、例えば、乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のＬＤＨを用いることができる。本発明の乳酸の製造方法において、Ｌ−乳酸を製造する場合には、上記ＬＤＨうち、ピルビン酸をＬ−乳酸に変換するＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｌ−ＬＤＨ）を導入した組換え微生物を用いることが効率的である。また、本発明の乳酸の製造方法において、Ｄ−乳酸を製造する場合には、上記ＬＤＨのうち、ピルビン酸をＤ−乳酸に変換するＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｄ−ＬＤＨ）を導入した組換え微生物を用いることが効率的である。
【００４８】
ここで、Ｌ−乳酸を製造する場合には、ほ乳類由来Ｌ−ＬＤＨまたは両生類由来Ｌ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。このうちホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来、およびカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００４９】
本発明の乳酸の製造方法における培養液とは、本発明で用いることができる乳酸の生産能力を有する微生物を発酵培地に接種してｐＨ２以上５未満で培養し、該微生物に乳酸を発酵培養液中に産成せしめた乳酸を含む液のことである。本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物を培養する発酵培地としては、該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。炭素源としては、該微生物が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース等の糖類、これらの糖類を含有する糖蜜、デンプン又はデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。例えば、トウモロコシデンプンを加水分解した糖や、サトウキビの絞り汁やその粗生成物である粗糖を用いることが出来る。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。上記炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、又は培養中に分割して若しくは連続的に添加することもでき、２０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５０】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養は、ｐＨ２以上５未満の範囲で行い、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。
【００５１】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養方法としては、回分培養、流加培養、ならびに連続培養を採用することができ、それぞれの培養から乳酸を含む培養液を得ることができる。培養温度は２５〜４０℃がよく、培養時間は、回分培養ならびに流加培養の場合は、通常２４時間〜５日間である。
【００５２】
本発明で用いる乳酸の生産能力を有する微生物の培養は、中和剤を培養液に投入することでｐＨ２以上５未満の範囲で行うことができる。このｐＨの調整はアルカリ溶液、アルカリ懸濁液、アルカリ性のガスを培養液に投入することで行うことができる。アルカリ溶液あるいはアルカリ懸濁液には水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、炭酸カルシウムを好ましく用いることができ、水酸化カルシウムがより好ましく用いられる。アルカリ性のガスにはアンモニアを好ましく用いることができる。中和剤の投入量は培養液のｐＨが２以上４．９未満の範囲で可能な限り少なくすることが望ましい。中和剤の投入量を少なくすることによって、培養液中の乳酸として、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の割合が高くなり、効率的な乳酸の分離が実現する。
【００５３】
上記のごとく乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満の範囲で培養して得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過することで生産物である乳酸と不純物が分離でき、効率的に乳酸を製造することができる。本発明において不純物として好ましく分離されるものとしては、発酵培地または中和剤由来のカルシウムやカルシウムイオン、硫酸イオンなどを挙げることができ、更に発酵培地または微生物由来の糖およびタンパク質が挙げられる。
【００５４】
更に、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満の範囲で培養して得られた培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過した濾液をナノフィルターに通じて濾過することで乳酸と不純物を効率的に分離することも可能である。培養液を一旦、精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過することによって、微生物などの懸濁物質や、多糖類などの巨大分子などを予め除去でき、ナノフィルターの閉塞や性能悪化を回避できることから、安定して乳酸と不純物の分離が可能となる。
【００５５】
ここで本発明に用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜について説明する。精密ろ過膜は、孔径が概ね５０ナノメートルから１０マイクロメートルの多孔性膜のことであり、一般的には微生物を含む懸濁物質の除去に用いられるものである。限外ろ過膜は孔径が概ね２から２００ナノメートルの多孔性膜のことであり、一般的にはウィルスの除去、蛋白質や酵素などの除去、あるいは分離または濃縮に用いられるものである。
【００５６】
本発明で用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜としては多孔性膜を用いることが望ましい。多孔性膜とは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜の材質は前記性能を有していればよく、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。
【００５７】
多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。
【００５８】
本発明の乳酸の製造法で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。
【００５９】
本発明の乳酸の製造方法で用いられる多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。
【００６０】
また、多孔質基材の多孔質樹脂層には、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。
【００６１】
有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００６２】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００６３】
本発明で用いることができる精密ろ過膜または限外ろ過膜の形状は、平膜、中空糸膜、スパイラル膜、ならびにチューブラー膜のいずれも選択しうる。
【００６４】
本発明の乳酸の製造方法で用いられる微生物の培養方法のうち、連続培養することで乳酸を生産することが好ましい。連続培養とは、発酵培養を行っている発酵培養槽から、培養液を連続的に抜き取り、発酵培地を前記の培養液に追加しながら培養する方法であり、こうすることで乳酸を連続発酵することができる。連続培養の利点は、発酵培地を連続的に供給することから、目的生産物である乳酸の生産速度が向上するとともに、培養液のナノフィルターへの連続供給が可能になることから、ナノフィルター処理の稼働率が向上し、その結果、効率的な乳酸の分離が実現する。培養温度は２５〜４０℃がよく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６５】
連続培養のうち、精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続培養を行うことで乳酸の連続発酵を行うこともできる。具体的には、本発明の酵母の発酵培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の発酵培養液に追加する連続発酵方法である。精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続培養では、未濾過液に含まれる酵母が再び発酵培養液に保持または還流され、発酵培養槽内の酵母濃度が向上することから、乳酸の生産速度向上が可能となる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は所望の連続培養時間を設定できる。
【００６６】
ここで、連続培養で用いる精密ろ過膜または限外ろ過膜の好ましい態様について説明する。精密ろ過膜または限外ろ過膜として用いる多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが望ましい。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物もしくは培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍ四方の範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００６７】
精密ろ過膜または限外ろ過膜として用いる多孔性膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜として用いる多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００６８】
多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。
【００６９】
また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００７０】
次に、精密ろ過膜または限外ろ過膜を用いた連続発酵に用いる連続発酵装置の好ましい態様を説明する。本発明の乳酸の分離方法で用いることができる連続発酵装置の形態としては、微生物を発酵培養させるための発酵反応槽と、培養液に接触できるように配設され分離膜を備えた培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段を有する。分離膜エレメントには分離膜として上述の多孔性膜が用いることができ、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。
【００７１】
次に、本発明の乳酸の製造法で用いることができる連続発酵装置の好ましい態様として、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段からなる装置を例に挙げて具体的に図面を用いて説明する。
【００７２】
図３は、本発明で用いることができる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。図３において、連続発酵装置は、内部に分離膜エレメント１０を備えた発酵反応槽９と水頭差制御装置１１で基本的に構成されている。発酵反応槽９内の分離膜エレメント１０には、多孔性膜が組み込まれている。
【００７３】
次に、図３の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ１５によって、培地を発酵反応槽９に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて、加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽９内の攪拌機１２で発酵反応槽９内の発酵培養液を攪拌する。発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置１３によって必要とする気体を発酵反応槽９内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置１４およびｐＨ調整溶液供給ポンプ１６によって発酵反応槽９内の発酵液のｐＨを２以上５未満に調整し、必要に応じて、温度調節器１７によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰ(Oxidation Reduction Potential：酸化還元電位）の制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、各種培養条件の制御を行うことができる。
【００７４】
図３において、発酵培養液は、発酵反応槽９内に設置された分離膜エレメント１０によって、微生物と発酵生産物が、濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント１０による濾過・分離は発酵反応槽９の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ１８および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント１０の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽９内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽９内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、その培養液を必要に応じて発酵反応槽９内に供給することにより、常にフレッシュな本発明の酵母による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００７５】
以上のように、本発明は、乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養して得られる培養液をナノフィルターに通じて濾過することで不純物を除去する乳酸の製造方法を提供するものである。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。具体的には、乳酸の生産能力を有する微生物の例として酵母、乳酸の例としてＬ−乳酸、乳酸の生産能力を有する微生物の培養方法の例として回分培養と精密ろ過膜を用いた連続培養を行った実施例により、詳細に説明する。
【００７７】
参考例１ 乳酸生産能力を有する酵母の作製
本発明では、乳酸生産能力を有する酵母として、配列番号１に記載の塩基配列を有するアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子がＰＤＣ１プロモーターの下流の導入された酵母を使用した。アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、アフリカツメガエルの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（STRATAGENE社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【００７８】
ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymeraseを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００７９】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をT4 polynucleotide Kinase（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００８０】
上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従いアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を含む断片を精製した。得られたｌｄｈ遺伝子を含む断片を、図４に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作製したアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とする。
【００８１】
このｐＴＲＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子及びＴＤＨ３ターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで配列番号４は、ＰＤＣ１遺伝子の開始コドンから上流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８２】
次に、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ＰＤＣ１遺伝子の終始コドンから下流６０ｂｐに相当する配列が付加されるようデザインした。
【００８３】
それぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、５末端・３末端にそれぞれＰＤＣ１遺伝子の上流・下流６０ｂｐに相当する配列が付加された、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子、ＴＤＨ３ターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
【００８４】
上記のＰＣＲ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００８５】
上記のようにして得られた形質転換株が、アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記アフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が染色体上のＰＤＣ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。なお、ＰＤＣ１遺伝子の上流及び下流配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（URL:http://www.yeastgenome.org/）より取得することができる。
【００８６】
次に、国際公開ＷＯ２００７／０９７２６０号公報に記載されている、ｐｄｃ１遺伝子がＴＲＰ１マーカーと置換され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する酵母ＳＷ０１５株と上記得られたＢ２株とを接合させ２倍体細胞を得た。該２倍体細胞を子嚢形成培地で子嚢形成させた。マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞の栄養要求性を調べた。取得した一倍体細胞の中から、ｐｄｃ１遺伝子座にアフリカツメガエル由来のｌｄｈ遺伝子が挿入され、かつ、ｐｄｃ５遺伝子に温度感受性変異を有する（３４℃で生育不能）株を選択した。得られた酵母株をＳＷ０１６株とした。
【００８７】
また、ＳＷ０１６株が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上清に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定することで確認した。
【００８８】
カラム：Shim-Pack SPR-H（島津製作所製）
移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００８９】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００９０】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。
【００９１】
なお、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【００９２】
光学純度（%）＝100×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００９３】
ＨＰＬＣ分析の結果、Ｌ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、このＳＷ０１６株がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。
【００９４】
参考例２ 多孔性膜の作製
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【００９５】
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。
【００９６】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【００９７】
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【００９８】
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【００９９】
参考例３ 回分培養によるＬ−乳酸の製造
表１に示す乳酸発酵培地を用い、回分培養によってＬ−乳酸を製造した。培地組成である粗糖には「沖縄の優糖精」（ムソー株式会社）を用いた。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ０１６株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。参考例３の運転条件を以下に示す。
【０１００】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、 温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．０２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：８Ｎ 水酸化カルシウム懸濁液により適宜調整。
【０１０１】
まず、ＳＷ０１６株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、培養を行った。培養はｐＨを５、４．５、４、３．８６にそれぞれ調整、ならびに水酸化カルシウムを添加しない培養をそれぞれ行った。回分培養の結果を表２に示す。尚、水酸化カルシウムを投入しない発酵液のｐＨは２．８であった。それぞれの回分培養で得られた培養液を参考例２で作製した多孔性膜でろ過した培養ろ液を得た。これら培養ろ液を実施例で用いた。
【０１０２】
参考例４ 連続培養によるＬ−乳酸の製造
図２に示す連続発酵装置を用いた連続培養によってＬ−乳酸を連続的に製造した。表１に示す組成の乳酸発酵培地を、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜には、前記の参考例２で作製した多孔性膜を用いた。参考例４における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０３】
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）（窒素：空気＝９：１で混合）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：８Ｎ 水酸化カルシウム懸濁液により適宜調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（膜間差圧として２０ ｋＰａ以下に制御した。）。
【０１０４】
微生物として前記の参考例１で造成した酵母ＳＷ０１６株を用いた。生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、前記の参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１０５】
まず、試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地を用いＳＷ０１６株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図３に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって５００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽９の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後、直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら発酵培養液を濾過・分離し連続培養することで、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置＊により、膜間差圧が０．１〜２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることによって行った。適宜、培養ろ液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続培養はｐＨを５、４．５、３．８６にそれぞれ調整ならびに水酸化カルシウムを添加しない連続培養をそれぞれ行った。各々のｐＨ条件の連続培養は３００時間行った。連続培養の結果を表２に示す。尚、結果は連続培養開始後２００時間から３００時間の間に適宜に分取した２Ｌの培養ろ液のものであり、水酸化カルシウムを投入しない培養ろ液のｐＨは２．８であった。これら培養ろ液を実施例で用いた。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
実施例１
参考例２のｐＨ４．５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液を、図１に示す膜濾過装置を用いてナノフィルターろ過を行った。２Ｌの該培養液の原水槽１に注入した。９０φナノフィルター７（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力３ＭＰａに調整し、透過水４を回収した。原水槽１、透過水４に含まれる、硫酸イオン、ならびにカルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）、糖濃度をアンスロン硫酸法、タンパク質濃度をローリー法により分析した。結果を表３に示す。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
実施例２
参考例２のｐＨ４に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１１】
実施例３
参考例２のｐＨ３．８６に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１２】
実施例４
参考例２の水酸化カルシウムを投入しない培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。
【０１１３】
比較例１
参考例２のｐＨ５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表３に示す。比較例１と実施例１〜４の結果から、ｐＨ２以上５未満で培養する方が透過側の乳酸の回収率が高くなることから、効率的に乳酸水溶液を得られることが明らかになった。
【０１１４】
実施例５
参考例３のｐＨ４．５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液を、図１に示す膜濾過装置を用いたナノフィルターろ過を行った。２Ｌの該培養ろ液を原水槽１に注入した。９０φナノフィルター７（ピペラジンポリアミド半透膜ＵＴＣ６０、東レ社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、高圧ポンプ３の圧力３ＭＰａに調整し、透過水４を回収した。原水槽１、透過水４に含まれる、硫酸イオン、ならびにカルシウムイオンの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）、糖濃度をアンスロン硫酸法、タンパク質濃度をローリー法により分析した。結果を表４に示す。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
実施例６
参考例３のｐＨ４に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１７】
実施例７
参考例３のｐＨ３．８６に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１８】
実施例８
参考例３の水酸化カルシウムを投入しない培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。
【０１１９】
比較例２
参考例３のｐＨ５に調整した培養で得られた乳酸を含む培養ろ液（２L）を実施例１と同様の方法でろ過した。その結果を表４に示す。比較例２と実施例５〜８の結果から、ｐＨ２以上５未満で培養する方が透過側の乳酸の回収率が高くなることから、効率的に乳酸水溶液を得られることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は本発明で用いることができるナノフィルター膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】図２は本発明で用いることができるナノフィルター膜分離装置のナノフィルターが装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図３】図３は、本発明で用いることができる連続発酵装置の例を説明する概略側面図である。
【図４】図４は、本発明で用いることができる発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップである。
【符号の説明】
【０１２１】
１ 原水槽
２ ナノフィルター膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜透過液の流れ
５ 膜濃縮液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７ ナノフィルター
８ 支持板
９ 発酵反応槽
１０ 分離膜エレメント
１１ 水頭制御装置
１２ 攪拌機
１３ 気体供給装置
１４ 撹拌機
１５ 発酵培地供給ポンプ
１６ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
１７ 温度調節器
１８ レベルセンサ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記ナノフィルターの機能層がポリアミドである、請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項４】
培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記培養液が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜を通じて濾過された濾液である請求項１から４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記培養が連続培養である、請求項１から５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
前記連続培養が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の培養液に追加する連続培養である、請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
乳酸の生産能力を有する微生物が酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれか１種である請求項１から７のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項１】
乳酸の生産能力を有する微生物をｐＨ２以上５未満で培養し、得られた培養液をナノフィルターに通じて濾過し、透過側に乳酸を回収する工程を含む乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記ナノフィルターの機能層がポリアミドである、請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項４】
培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記培養液が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜を通じて濾過された濾液である請求項１から４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記培養が連続培養である、請求項１から５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
前記連続培養が、培養液を精密ろ過膜または限外ろ過膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵培地を前記の培養液に追加する連続培養である、請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
乳酸の生産能力を有する微生物が酵母、乳酸菌および大腸菌のいずれか１種である請求項１から７のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１７１８７９（Ｐ２００９−１７１８７９Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２３７４（Ｐ２００８−１２３７４）
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２３日（２００８．１．２３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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