亜セレン酸化多糖類およびその製造方法
【課題】新規医薬品となりうる（硫酸化）亜セレン酸化多糖類、およびその製法、並びにその医薬用途を提供すること。
【解決手段】硫酸基置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させることにより、セレン含量が１８重量％以上である（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を製造する。
【解決手段】硫酸基置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させることにより、セレン含量が１８重量％以上である（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜セレン酸化多糖類およびその製造方法、並びにその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、地球上で最初に造られた生体高分子であると提唱されている。多糖類は単糖モノマーで構成される生体高分子の一種である。商用および工業に利用されている多糖類は、陸上および海洋植物から単離され、または主にバクテリアの外因性代謝産物であり、その多くは部分有機合成で修飾され、またわずかのものは全生化学合成の産物である。多糖類は自然界において、強固な機械的構造の構築、即時に利用可能なエネルギーの貯蔵、生物学的認識および交信の特異性発現など、多数の重要な機能を有している。
【０００３】
多糖類は、タンパクや核酸と並び、生体に重要な生体高分子の一種であり、抗感染、抗酸化、免疫促進、および免疫障害疾患（肝炎、リウマチ、ＡＩＤＳなど）の治療に用いることができる。多糖類は、多様な機能や生物活性を有している。主鎖、分岐鎖および高次構造を含む多糖類の構造因子は、生物活性に影響を与える。多糖の活性は、糖単位と主鎖のグリコシド型の組合せによって直接的に決定される。多糖の活性は、分岐鎖のタイプ、重合度、分岐鎖の分布によって影響される。多糖の高次構造の糖鎖柔軟性および空間配置はその活性に関係している。多糖は修飾機能化されて、その活性が増強される。近年、当該分野における多くの研究で大きな進歩があった。多糖は、単糖の側鎖（ヒドロキシ、カルボキシル基、アミノ基など）で修飾機能化されている。修飾機能化には、硫酸化、エチロイル化、セレン化、メチル化、酸化、部分加水分解、リン酸化、二機能化など多くの方法が挙げられる。
【０００４】
硫酸化多糖（多糖硫酸エステルまたは硫酸エステル多糖ともいう）は、単糖の水酸基が硫酸基で修飾されている。硫酸化多糖は抗ウィルス性多糖で最も研究されている。硫酸化多糖類としては、天然または半合成硫酸化多糖が挙げられ、その抗ウィルス、抗癌、抗ＡＩＤＳなどの生物活性は非常に興味深い。
【０００５】
セレン（Ｓｅ）は、人体の必須微量元素であり、通常の酸素代謝で産生されるフリーラジカルの作用から細胞を守る抗酸化酵素の重要なパーツである。生体は、細胞を障害し、幾つかの慢性疾患の進展に寄与するフリーラジカルのレベルを制御するため、抗酸化剤のような防御機構を発達させてきた。セレン生化学の興味深い一面は、その極めて強い効能にある。亜セレン酸またはセレノメチオニンの形態のセレンは、動物食餌中〜０．１ｐｐｍレベルの必須微量栄養素として機能するが、しかし８から１０ｐｐｍのレベルでは毒となる。
このような背景の下、セレンを含む修飾基で修飾された多糖類は様々な生理活性が予想され、医薬品のターゲットとして興味深い。
【０００６】
亜セレン酸化多糖は、硫酸化多糖の硫黄がセレンで置換された半有機合成セレン化合物であり、中国で最初に合成された（特許文献１参照）。当該研究において、亜セレン酸によってエステル化された多糖が抗酸化酵素活性の増強、フリーラジカルからの細胞の保護、免疫機能の増強作用を有することが発見された。また、その報告はセレン化合物の抗発癌活性も開示している。
【０００７】
特許文献１は、三種の新規海洋医薬およびその製造方法を開示している。当該発明には、明らかに腎不全、血管障害、癌の治療効果を有する亜セレン酸化渇藻多糖、セレン化キチン、セレン化紅藻多糖の三種のセレン化多糖化合物が挙げられている。当該発明の生成物は、低毒性または無毒性であり、抗ウィルス、抗ＨＩＶ、抗癌、人体免疫増強作用を有しており、特に、セレン化紅藻多糖は、リンパ球分裂促進やヘルペスウィルスの複製抑制作用をも明らかに有している。しかし、この方法によるセレン化多糖のセレン含量はせいぜい約１２．５ｍｇ／ｇ（１．２５％ｗｔ）である。
【０００８】
特許文献２および３は、セレン化多糖の製造方法を開示している。この方法は、発酵によってセレン富化酵母を調製し、セレン化多糖が酵母溶液から分離、アルカリによって精製されている。セレン化多糖溶液は濃縮され、エタノールで沈殿されている。この方法は、多くの面倒な工程を要し、そのセレン含量は非常に低い。
【特許文献１】中国公開特許公報第１２８８８９９号公報
【特許文献２】特開昭５４−０７４０９８号公報
【特許文献３】特開平４−４０８８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規医薬品となりうる（硫酸化）亜セレン酸化多糖類、およびその製法、並びにその医薬用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、亜セレン酸化多糖類の効能の向上を図るため、セレン含量が高い亜セレン酸化多糖類の製造方法を検討した。その結果、亜セレン酸化の原料である硫酸化多糖の硫酸化度が高いものを用いることにより、従来技術に比べはるかに高いセレン含量を有する亜セレン酸化多糖類が得られることを見出した。
また、硫酸化多糖の硫酸化度や亜セレン酸化反応の条件を調整することにより、さらに硫酸基を含む硫酸化亜セレン酸化多糖類や、様々なセレン含量を有する（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を得た。
このように得られた（硫酸化）亜セレン酸化多糖類について、生物活性を検討した結果、優れた抗酸化作用および抗癌活性を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１２］を提供する；
［１］セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩；
［２］硫酸基をさらに含む、上記［１］記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩。
［３］硫酸基を含むことを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
［４］硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させる工程を含むことを特徴とする、セレン含量が１８重量％以上である亜セレン酸化多糖類またはその塩の製造方法；
［５］硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩が、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造されたものである、上記［４］記載の方法；
［６］硫酸化剤がピリジン・三酸化硫黄錯体またはクロロスルホン酸である、上記［５］記載の方法；
［７］硫酸基を含む亜セレン酸化多糖類またはその塩を製造する、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の製造方法；
［８］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、医薬組成物；
［９］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤；
［１０］亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤；
［１１］亜セレン酸化多糖類がさらに硫酸基を含む、上記［１０］記載の抗酸化剤；および
［１２］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗がん剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来技術よりもセレン含量が高い（最高４５重量％の）亜セレン酸化多糖類が提供される。さらに、硫酸基を有する硫酸化亜セレン酸化多糖類も提供される。かかる（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、医薬、特に抗酸化剤、抗癌剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．亜セレン酸化多糖類の説明
本発明において「亜セレン酸化多糖類」とは、多糖を構成する単糖単位においてグリコシド結合に関与していない官能基（例えば、水酸基、アミノ基など）の一部または全部が亜セレン酸とエステル結合、アミド結合などを形成しているものを意味する。
【００１３】
亜セレン酸化多糖類において、亜セレン酸化の対象となる「多糖類」は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく使用することができ、また、新規なものであってもよく、天然物でも合成品でもよい。
当該多糖類の構成成分である単糖は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく採用することができ、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、タロース、イドース、アルトロース、アロース、グロース、キシロース、アラビノース、ラムロース、フコース、フラクトース、リボース、デオキシリボース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸などが挙げられ、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコースなどが好ましい。
多糖類は、これら単糖の一種類のみで構成されるものでもよいし、２種以上が組み合わさって構成されるものでもよく、２種以上の場合の配列も特に限定されない。また、多糖類は枝分かれした態様であってもよい。また、多糖には至らない単糖も本発明の多糖類に包含される。
多糖類を構成するグリコシド結合様式も特に限定なく、α１→２結合、β１→２結合、α１→３結合、β１→３結合、α１→４結合、β１→４結合、α１→５結合、β１→５結合、α１→６結合、β１→６結合など、またはその組合せが挙げられる。
【００１４】
多糖類（亜セレン酸化されていないもの）の重量平均分子量は特に限定されないが、多糖類水酸基の活性の理由により、好ましい重量平均分子量は５００〜１０７であり、より好ましくは７００〜１０４程度である。高分子量の多糖を、部分加水分解、酵素処理などにより、分子量を適宜調整してもよい。多糖類の重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定することができる。
【００１５】
多糖類の具体例としては、グルカン、変性又は未変性のデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、デキストラン、セルロース及びその誘導体（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、マンナン、キシラン、リグニン、アラバン、ガラクタン、ガラクツロナン、キチン、キトサン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、キシログルカン、グルコマンナン、ペクチン酸及びペクチン、アルギン酸及びアルギナート、アラビノガラクタン、カラゲナン、寒天、グリコサミノグルカン、アラビアガム、トラガカントガム、ガッチガム、カラヤガム、キャロブガム、ガラクトマンナン、グアーガム、キサンタンガム、κ―カラギーナンなどが挙げられ、κ―カラギーナン、未変性デンプン、デキストラン、デキシトリン、セルロース、マンナン、キシログルカン、キシランなどが好ましい。
【００１６】
本発明の亜セレン酸化多糖類は、セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする。
本発明の亜セレン酸化多糖類のセレン含量は１８重量％以上であれば特に限定されないが、好ましくは３７．５重量％以上である。セレン含量の上限は、多糖類の官能基がすべて亜セレン酸化された場合であり、採用する多糖類の種類により異なる。例えば、デンプンの水酸基を全て亜セレン酸化した場合は、約４５重量％となる。
【００１７】
本発明において「セレン含量」とは、亜セレン酸化多糖類全体の重量に対する元素としてのセレンの重量を百分率で表わしたものであり、重量％で表記される。
「セレン含量」は後掲の参考例１に記載の方法により測定される。
【００１８】
本発明において「置換度」とは、多糖類の一単糖当りの修飾された官能基の平均数を意味し、例えば、デンプンの全ての水酸基が修飾された場合は、置換度は３となる。
亜セレン酸化多糖類における亜セレン酸置換度（ＤＳ）は、上記セレン含量（Ｓｅ）から下式により算出することができる。
【００１９】
【数１】
【００２０】
本発明の亜セレン酸化多糖類において亜セレン酸化されていない官能基は、亜セレン酸以外で修飾されていてもよい。かかる修飾としては、硫酸化、リン酸化、アルキル化（例えば、メチル化、エチル化）、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられ、硫酸化が好ましい。
【００２１】
本発明の亜セレン酸化多糖類において硫酸基をさらに含む「硫酸化亜セレン酸化多糖類」は、そのセレン含量が１８重量％未満のものを含めて新規化合物であり、医薬（抗酸化剤、抗癌剤）として有用である。硫酸化亜セレン酸化多糖類における硫酸化の置換度は、後述の製造方法において説明する原料の硫酸化多糖類の硫酸置換度や亜セレン酸化の条件で調整することができる。
【００２２】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の重量平均分子量は、亜セレン酸化されていない上記多糖類の重量平均分子量から亜セレン酸化、硫酸化の置換度を考慮して算出することができる。
【００２３】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の好ましい態様は、下記式で表されるピラノース単位および／またはフラノース単位の１種または２種以上を有する。
【００２４】
【化１】
【００２５】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、硫酸オキシ、亜セレン酸オキシまたはグリコシド結合を示し、Ｒ２’は水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、亜セレン酸オキシ、亜セレン酸オキシメチルまたはメチレングリコシド結合を示す。但し、一単糖当り、少なくとも平均で０．８個の亜セレン酸オキシを有する。）
【００２６】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、塩の形態であってもよい。かかる塩としては、亜セレン酸基、硫酸基などと塩基との塩が挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの有機塩基塩が挙げられ、フリー体から常法により調製することができる。
【００２７】
２．亜セレン酸化多糖類の製造方法の説明
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、硫酸化多糖類またはその塩を、溶媒中、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させることにより製造することができる。
硫酸化多糖類とは、多糖を構成する単糖単位においてグリコシド結合に関与していない官能基（例えば、水酸基、アミノ基など）の一部または全部が硫酸とエステル結合、アミド結合などを形成しているものを意味する。硫酸化多糖類の塩としては、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の塩と同様のものが挙げられる。
【００２８】
（硫酸化）亜セレン酸化多糖類のセレン含量を１８重量％以上とするためには、原料の硫酸化多糖類の硫酸置換度を２以上とするのが好ましい。硫酸置換度が２より少ない場合であってもセレン含量１８重量％の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を製造できる場合もあるが、硫酸置換度を２以上とすることにより確実にセレン含量を１８重量％以上とすることができる。好ましい硫酸置換度は３である。硫酸置換度の上限は、官能基が全て硫酸化された場合であり、例えばデンプンの場合では３である。
【００２９】
硫酸置換度は、後掲の参考例２に記載の方法により測定される。
【００３０】
亜セレン酸の塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン酸水素ナトリウム、二酸化セレン、塩化セレニニルなどが挙げられる。
亜セレン酸またはその塩の使用量を調整することにより、目的とする（硫酸化）亜セレン酸化多糖類のセレン含量や硫酸基の有無およびその置換度を調整することができる。亜セレン酸またはその塩の使用量は、目的とするセレン含量、硫酸基の置換度、多糖類の種類などを考慮して、原料の硫酸化多糖類に存在する硫酸基のモル数を基準にして０．１〜１０倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
なお、セレン含量を１８重量％以上とするためには、例えば硫酸置換度２以上の硫酸化多糖類を原料として用いた場合、亜セレン酸またはその塩の使用量は、硫酸基のモル数に対して、等モル以上が必要であり、２．５倍モル以上が好ましい。
【００３１】
バリウム塩としては、塩化バリウム、炭酸バリウム、硝酸バリウムなどの水溶性バリウム塩の少なくとも一種が挙げられ、塩化バリウムが好ましい。バリウム塩の使用量は、硫酸基のモル数に対して０．１〜１０倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
【００３２】
酸としては、硝酸および／または塩酸が好ましく、その使用量は、反応液中の濃度が０．１〜５％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００３３】
溶媒としては水が使用され、その使用量は、使用する全試薬の濃度が０．２〜２０％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００３４】
反応温度は１０℃〜１００℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常１時間〜１００時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００３５】
反応終了後、反応液を室温に戻し、好ましくは以下の操作により、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を単離することが出来る。
（１）バリウムイオンの除去
反応溶液に硫酸水溶液を室温下徐々に適下して硫酸バリウムを沈殿させ、濾別する。
（２）過剰の亜セレン酸イオンの除去
（１）で得られた溶液をｐＨ３〜１２に調整し、塩化鉄水溶液を攪拌しながら加える。終夜反応後、沈殿物を濾別する。
（３）（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の単離
（２）で得られた溶液を１５％酢酸ナトリウム水溶液でｐＨ３〜９に調整し、エタノールをエタノール濃度が７０％以上になるまで滴下する。沈殿物を濾集し、９５％および１００％エタノールで洗浄、乾燥し、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を得る。
【００３６】
３．硫酸化多糖類およびその製造方法の説明
上記（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の製造方法の原料である硫酸化多糖類は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく使用することができ、また新規なものであってもよく、天然物でも合成品でもよい。
【００３７】
但し、置換度２以上の硫酸化多糖類は、好ましくは、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造される。以下、完全置換と部分置換の場合に分けて説明する。
３−１．完全置換の硫酸化多糖類の製造
全ての官能基が硫酸化されている硫酸化多糖類は、溶媒中、多糖類を三酸化硫黄・ピリジン錯体と反応させることにより得られる。
【００３８】
三酸化硫黄・ピリジン錯体の使用量は、多糖類の水酸基に対して１〜１５倍モルの範囲から適宜決定すればよく、３〜６倍モルが好ましい。三酸化硫黄・ピリジン錯体の使用量がこの範囲より少ない場合は、硫酸化されない水酸基が残留する場合がある。
【００３９】
溶媒としては、反応を阻害しないかぎり制限はなく、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの一種以上が挙げられ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。溶媒の使用量は、使用する全試薬の濃度が０．１〜３０％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００４０】
反応温度は３０℃〜１１５℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常０．５時間〜２４時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００４１】
反応終了後、硫酸化多糖類はピリジン塩として混合物中に存在する。水を加えることにより反応を止め、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを含むエタノール（３倍量ｖ/ｖ以上）を加えることにより、遊離の硫酸化多糖類を沈殿として単離することができる。単離された硫酸化多糖類は必要により、透析、凍結乾燥などを行うことにより精製することができる。
３−２．部分置換の硫酸化多糖類の製造
官能基の一部が硫酸化されている硫酸化多糖類は、溶媒中、塩基の存在下、多糖類をクロロスルホン酸と反応させることにより得られる。
【００４２】
クロロスルホン酸の使用量は、目的とする硫酸化多糖類の硫酸基置換度、多糖類の種類などを考慮して、原料の多糖類の水酸基のモル数を基準にして０．０００１〜３倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
硫酸置換度を２以上とするためには、クロロスルホン酸の使用量は、多糖類の水酸基のモル数に対して、２倍モル以上が必要であり、５倍モル以上が好ましい。クロロスルホン酸の使用量がこの範囲より少ない場合は、硫酸置換度が２未満となる場合がある。
【００４３】
溶媒としては、反応を阻害しないかぎり制限はなく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの一種以上が挙げられ、ジメチルスルホキシドが好ましい。多糖の溶解のために溶媒中には塩化リチウム、フッ化テトラブチルアンモニウムなどの塩が好ましく溶解される。当該塩の濃度は、０．０１〜５Ｍの範囲から適宜選択される。溶媒の使用量は、使用する全試薬の濃度が０．１〜１％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００４４】
反応温度は２０℃〜１０５℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常０．５時間〜２４時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００４５】
反応終了後、硫酸化多糖類は使用される塩基との塩として混合物中に存在する。水を加えることにより反応を止め、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基を含む水溶液を加え、ｐＨ８〜１１に調整することにより、遊離の硫酸化多糖類とすることができる。硫酸化多糖類は透析、凍結乾燥などを行うことにより単離、精製することができる。
【００４６】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、優れた抗酸化作用およびそれに基づくＤＮＡ保護作用を有し、ＤＮＡ損傷抑制剤として有用である。
また、本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、優れた抗癌活性を有し、肝臓癌、胃癌、腺癌、黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭部癌、頸部癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、直腸結腸癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膣癌、外陰癌、脳腫瘍、精巣癌などの治療に有用である。
【００４７】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類またはその塩を医薬として用いる場合、製薬上許容しうる担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（例えば、錠剤、液剤等）の形態とすることができる。当該医薬組成物あるいは製剤は、製剤分野における通常の方法に従って製造することができる。
【００４８】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を含有する医薬組成物あるいは製剤は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）に、経口又は非経口で投与することができる。
投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、患者のその時に治療を行っている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の１日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、例えば、経口的には０.０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、一日１〜数回に分けて投与され、また非経口的には約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日を一日１〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
ＦＴ−ＩＲスペクトルは日本分光ＦＴＩＲ−６２０を用いてＫＢｒ法で測定した。ＵＶ−可視吸収スペクトルは、日本分光Ｖ−５５０ ＵＶ−ＶＩＳを用いて測定した。
【００５０】
参考例１：亜セレン酸化多糖類のセレン含量の測定法
実施例または比較例で合成した亜セレン酸化多糖類のセレン含量は下記の比色法で定量した。
試料０．１ｇを１０ｍＬの硝酸に３０分浸漬して分解した。冷却後、０．５ｍＬの過塩素酸を加え、１０分加熱した。冷却後、１０ｍＬの水と５ｍＬの塩酸を加え、１０分間煮沸した（６価のＳｅが４価に変わる）。１０％の水酸化ナトリウムで中和後、全量を１００ｍＬとした。この時、５％のＥＤＴＡ（５ｍＬ）も添加した。この溶液の２ｍＬを１０ｍＬの標準容器に入れ、２％ヨウ化カリ１ｍＬと２Ｍの塩酸１ｍＬを加えた。この溶液を撹拌すると、ヨウ素の遊離により黄色になる。ここに、０．０５％のバリアミンブルー（Variamine Blue）０．５ｍＬと１Ｍの酢酸ナトリウム２ｍＬを加えた。水を加え、全量を１０ｍＬとした。５４６ｎｍで吸光度を測定（JASCO V-550 UV/VIS）し、検量線からセレン含量（重量％）を求めた。
【００５１】
参考例２：硫酸置換度の測定法
製造例で合成した硫酸化多糖類、および実施例または比較例で合成した硫酸化亜セレン酸化多糖類の硫酸置換度は、下記方法により測定した。
２〜４ｍｇの硫酸化多糖を、最終的な硫酸イオン濃度が４０〜９０μｇ／０．２ｍＬになるように、塩酸に溶解した。この溶液の０．５ｍＬをガラス管に入れ、１１０℃で５時間加熱した。冷却後、この溶液の０．２ｍＬを３．８ｍＬの３％トリクロロ酢酸が入った１０ｍＬの容器に入れた。これに塩化バリウム・ゼラチン試薬１ｍＬを加え、撹拌後、室温で１５〜２０分静置した。ＪＡＳＣＯ Ｖ−５５０ ＵＶ／ＶＩＳを用い、３６０ｎｍでの吸光度から硫黄含量（重量％）を測定した。（標準試薬：硫酸バリウム）
硫酸置換度（ＤＳ）は、硫黄含量（Ｓ）から下式により算出した。
【００５２】
【数２】
【００５３】
製造例１：完全置換硫酸化キシログルカン（置換度＝２．６、ＸＧ）の合成
キシログルカン（１ｇ）を１５０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁し、窒素雰囲気下、室温で１４時間撹拌した。ピリジン・三酸化イオウ錯体（８ｇ、キシログルカンの有効水酸基の１５モル当量）を加え、反応混合物を４０℃で１０時間窒素雰囲気下に撹拌した。反応混合物に１００ｍＬの水を加えることにより反応を止め、反応溶液を飽和の酢酸ナトリウムを含む冷エタノール（３倍量）に投入して沈殿させ、その後遠心分離で沈殿を回収した。得られた沈殿を水に溶解させ、透析した後、凍結乾燥して、置換度２．６の硫酸化キシログルカン（１．９ｇ）を得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図１（Fully Sulfated XGO）に、ＵＶ−可視吸収スペクトルを図２（Fully Sulfated XGO）にそれぞれ示す。
【００５４】
製造例２または３
製造例１と同様にして、置換度３の硫酸化デキストランおよび置換度３の硫酸化キシランをそれぞれ調製した。
【００５５】
製造例４：部分置換硫酸化デキストラン（置換度＝２、ＤＸ）の合成
デキストラン（１ｇ）を０．２５Ｍ ＬｉＣｌ／ＤＭＳＯ（７０ｍＬ）に浸漬させ、懸濁液を攪拌しながら３０℃に一昼夜保った。その後、ピリジン（５．９８ｍＬ、デキストランの有効水酸基の４モル当量）を加え、さらに３０分間攪拌した。クロロスルホン酸（２．４４ｍＬ、デキストランの有効水酸基の２モル当量）を反応混合物に攪拌下滴下し、次いで反応液を８０℃で３時間加熱した。室温に冷却後、１００ｍＬの蒸留水を攪拌下、反応混合物に加え、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１０に調整した。得られた反応液を弱アルカリ水（ｐＨ９）で透析を行い、ピリジンを除去し、さらに蒸留水で５日間透析した後、凍結乾燥し、置換度約２の硫酸化デキストランを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。
【００５６】
製造例５および６
製造例４と同様にして、置換度２．２の硫酸化デキストリンおよび置換度２．４の硫酸化マンナンをそれぞれ調製した。
【００５７】
実施例１：亜セレン酸化κ―カラギーナンの製造
κ―カラギーナン（１ｇ、天然物、硫酸含量１２〜１３重量％、硫酸置換度約０．９）の３％水溶液に、塩化バリウム（３．４７ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（４．０３ｇ、κ―カラギーナンの硫酸基に対して３モル当量）を加え、３０℃で３６時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムでｐＨ６．８に調整した。ＦｅＣｌ３（６．０１ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後乾燥して、セレン含量１８重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化κ―カラギーナンを得た。
【００５８】
実施例２：亜セレン酸化デキストランの製造
硫酸化デキストラン（３．２２ｇ、硫酸置換度２）の３％水溶液に、塩化バリウム（１２．４８ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（７．７４ｇ、硫酸化デキストランの硫酸基に対して３モル当量）を加え、４２℃で５７時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（９．７３ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３０重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストランを得た。
【００５９】
実施例３：亜セレン酸化マンナンの製造
硫酸化マンナン（３．５４ｇ、硫酸置換度２．４）の４％水溶液に、塩化バリウム（１５．１２ｇ）、塩酸（０．４５ｇ）および亜セレン酸（９．３４ｇ、硫酸化マンナンの硫酸基に対して３モル当量）を加え、５２℃で２０時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１１．６９ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化マンナンを得た。
【００６０】
実施例４：亜セレン酸化デキストリンの製造
硫酸化デキストリン（３．３８ｇ、硫酸置換度２．２）の５％水溶液に、塩化バリウム（１３．７２ｇ）、塩酸（０．６ｇ）および亜セレン酸（１７．６２ｇ、硫酸化デキストリンの硫酸基に対して６モル当量）を加え、３２℃で５時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１９．４６ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量２５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストリンを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図４に示す。
【００６１】
実施例５：亜セレン酸化デキストランの製造
硫酸化デキストラン（４．０２ｇ、硫酸置換度３）の３％水溶液に、塩化バリウム（３７．４４ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（１０４．５ｇ、硫酸化デキストランの硫酸基に対して９モル当量）を加え、４２℃で９８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１３１．３６ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量４５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストランを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図５に示す。
【００６２】
実施例６：亜セレン酸化キシランの製造
硫酸化キシラン（２．９２ｇ、硫酸置換度３）の１．５％水溶液に、塩化バリウム（３３．２８ｇ）、塩酸（１ｇ）および亜セレン酸（６９．６７ｇ、硫酸化キシランの硫酸基に対して９モル当量）を加え、４２℃で９８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（８８ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３６重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化キシランを得た。
【００６３】
実施例７：硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（ＸＧ）の製造
硫酸化キシログルカン（３．７ｇ、硫酸置換度２．６）の３％水溶液に、塩化バリウム（８．１６ｇ）、塩酸（０．７ｇ）および亜セレン酸（９１ｇ、硫酸化キシログルカンの硫酸基に対して９モル当量）を加え、２２℃で８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１１４ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量２９重量％、硫黄含量１６重量％（硫酸置換度１．３５）の硫酸化亜セレン酸化キシログルカンを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図６に示す。
【００６４】
実施例１〜７と同様にして、下表に示される実施例８〜１２、比較例１および２の（硫酸化）亜セレン酸化多糖を得た。表１に実施例および比較例の硫酸化亜セレン酸化多糖類のサマリーを示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実施例８のＦＴＩＲスペクトルを図１（XGO Selenite）に、ＵＶ−可視吸収スペクトルを図２（XGO Selenite）に、キシログルカン（XGO）および製造例１の硫酸化キシログルカン（Fully Sulfated XGO）とともにそれぞれ示す。
【００６７】
試験例１：抗酸化活性評価試験（ＯＨラジカル消去活性評価試験）
子牛胸腺ＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、異なる濃度の硫酸化亜セレン酸化多糖、塩化マグネシウム（５ ｍＭ）およびＦｅＣｌ３（５０ ｍＭ）を含む反応混合物（０．５ｍｌ）を３７〜８℃で１時間インキュベートした。陽性対照として安息香酸を使用した。０．０５ｍｌのＥＤＴＡの添加で反応を終了させた。０．５ｍｌのバルビツール酸（ＴＢＡ，１％，ｗｙｖ）および０．５ｍｌの塩酸（２５％，ｗ／ｗ）を添加し、３７〜８℃で１５分間加熱し、発色させた。５３２ｎｍ波長の吸光度（Ａ）を測定し、式（２）により、ＯＨラジカル消去活性（ＳＡ）を算出し、ＤＮＡ損傷を評価した。
【００６８】
【数３】
【００６９】
Ａｐはサンプル有りのＡ、Ａｓはサンプル無しのＡ、Ａ０は非加熱時のＡ（ブランク時）を示す。Ａ０がほぼ０であり、Ａｐが限りなく０に近く、Ａｓが１に近ければ、ＳＡは１００に近づく。Ａｐが０．５で、Ａｓが１であれば、ＳＡは５０％となる。したがって、ＳＡ値が大きいほどラジカル消去能力が高い。
各実施例の結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
セレン含量１０重量％の亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示さなかった。セレン含量４０重量％の亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示した。また，セレン含量５重量％であっても、硫酸基を含む硫酸化亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示した。
【００７２】
試験例２：抗酸化活性評価試験（ＤＰＰＨラジカル消去活性評価試験）
０．１ｍＭのＤＰＰＨエタノール・水（１：１）溶液を作った。各濃度の試料をエタノール・水（１：１）溶液３ｍＬに溶解し、前記ＤＰＰＨ溶液１ｍＬを加えた。よく撹拌後、３０分間室温で静置した。５２４ｎｍで吸光度を測定し、ラジカル消去活性（Ｋ％）を次式から求めた。
【００７３】
【数４】
【００７４】
Ａｓ：ＤＰＰＨと反応した試料の吸光度； Ａｉ: ＤＰＰＨと反応しないときの試料の吸光度；Ａｃ: コントロールの吸光度
結果を図７に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたＤＰＰＨラジカル消去活性を示した。
【００７５】
試験例３：抗酸化活性評価試験（フェントン反応で生成したＯＨラジカル消去活性評価試験）
ｏ−フェナントロリン（０．７５ｍＭ）、過酸化水素（２ｍＭ）および硫酸鉄（０．７５ｍＭ）を溶解した２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に各濃度の試料を溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応後、５３６ｎｍで吸光度を測定し、ヒドロキシラジカル消去活性（Ｓ％）を次式から求めた。
【００７６】
【数５】
【００７７】
Ａｓ: 過酸化水素と反応した試料の吸光度；Ａｃ：過酸化水素と反応しない試料の吸光度；Ａｏ: 試料なしでの吸光度
結果を図８に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたＯＨラジカル消去活性を示した。
【００７８】
試験例４：抗酸化活性評価試験（スーパーオキサイドアニオン消去活性評価試験）
１６ｍＭのトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)に各試料を２５℃で２０分浸した後、０．１ｍＭのピロガロールを加え、直ちに５１０ｎｍで吸光度を測定した。５分間、１分毎に吸光度測定を行った。スーパーオキシドアニオン消去活性（ＯＤ％）は、次式から計算した。
【００７９】
【数６】
【００８０】
Ａｓ: ピロガロールと反応した試料の吸光度の変化；Ａｏ： 試料なしでの吸光度の変化
結果を図９に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたスーパーオキサイドアニオンラジカル消去活性を示した。
【００８１】
試験例５：抗酸化活性評価試験（過酸化脂質生成抑制活性評価試験）
たまご由来のビテロース（vitellose）を氷冷した２０ｍＭのリン酸緩衝液中でホモジナイズした。この１ｍＬに試料を加え、５ｍＭの硫酸鉄の存在下、３７℃で１時間反応させた。酸を加えて反応を停止後、１００℃で１５分加熱した。沈殿したタンパク質を除去した後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。過酸化脂質生成抑制活性（Ｋ％）は次式から計算した。
【００８２】
【数７】
【００８３】
Ａｓ: 試料の吸光度；Ａｃ: コントロールの吸光度
結果を図１０に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れた過酸化脂質生成抑制活性を示した。
【００８４】
試験例６：抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）
ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（１５μＬ，１．８５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、２４時間後実験を行った。細胞と試料を加え、２４又は４８時間培養した後、生存細胞をＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenytetrazolium）アッセイにより評価した。すなわち、１０μｌのＭＴＴをウェルに加え、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーターで４時間培養した。１０％ＳＤＳ（１００μｌ）をウェルに加え、細胞を終夜培養した。ホルマザンの生成をマイクロプレート分光光度計（Spectra Max 190, 米国製）を用いて、５７０ｎｍで測定した。
実施例１０（６．２１Ｙ）、実施例１１（６．２８Ｙ）および実施例１２（Ｓｔａｒｃｈ）の結果を図１１に、キシログルカン（＃１）、製造例１（＃２）および比較例２（＃３）の結果を図１２に示した。
実施例１１および１２の硫酸化亜セレン酸化キシログルカンは０．０１ｇ／Ｌ以上で、実施例１３の硫酸化亜セレン酸化デンプンは０．１ｇ／Ｌ以上で抗癌作用を示した（図１１）。
セレン含量１７重量％で硫酸基を有さない硫酸化亜セレン酸化キシログルカンは抗癌活性を示さなかった（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】キシログルカン、硫酸化キシログルカン（製造例１）および亜セレン酸化キシログルカン（実施例８）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図２】キシログルカン、硫酸化キシログルカン（製造例１）および硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（実施例１０）のＵＶ−可視吸収スペクトルである。
【図３】硫酸化デキストラン（製造例４）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４】硫酸化亜セレン酸化デキストリン（実施例４）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図５】硫酸化亜セレン酸化デキストラン（実施例５）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図６】硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（実施例７）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図７】ＤＰＰＨラジカル消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例２）。
【図８】フェントン反応で生成したＯＨラジカル消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例３）。
【図９】スーパーオキサイドアニオン消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例４）。
【図１０】過酸化脂質生成抑制活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例５）。
【図１１】抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）の結果を示すグラフである（試験例６）。
【図１２】抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）の結果を示すグラフである（試験例６）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜セレン酸化多糖類およびその製造方法、並びにその医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は、地球上で最初に造られた生体高分子であると提唱されている。多糖類は単糖モノマーで構成される生体高分子の一種である。商用および工業に利用されている多糖類は、陸上および海洋植物から単離され、または主にバクテリアの外因性代謝産物であり、その多くは部分有機合成で修飾され、またわずかのものは全生化学合成の産物である。多糖類は自然界において、強固な機械的構造の構築、即時に利用可能なエネルギーの貯蔵、生物学的認識および交信の特異性発現など、多数の重要な機能を有している。
【０００３】
多糖類は、タンパクや核酸と並び、生体に重要な生体高分子の一種であり、抗感染、抗酸化、免疫促進、および免疫障害疾患（肝炎、リウマチ、ＡＩＤＳなど）の治療に用いることができる。多糖類は、多様な機能や生物活性を有している。主鎖、分岐鎖および高次構造を含む多糖類の構造因子は、生物活性に影響を与える。多糖の活性は、糖単位と主鎖のグリコシド型の組合せによって直接的に決定される。多糖の活性は、分岐鎖のタイプ、重合度、分岐鎖の分布によって影響される。多糖の高次構造の糖鎖柔軟性および空間配置はその活性に関係している。多糖は修飾機能化されて、その活性が増強される。近年、当該分野における多くの研究で大きな進歩があった。多糖は、単糖の側鎖（ヒドロキシ、カルボキシル基、アミノ基など）で修飾機能化されている。修飾機能化には、硫酸化、エチロイル化、セレン化、メチル化、酸化、部分加水分解、リン酸化、二機能化など多くの方法が挙げられる。
【０００４】
硫酸化多糖（多糖硫酸エステルまたは硫酸エステル多糖ともいう）は、単糖の水酸基が硫酸基で修飾されている。硫酸化多糖は抗ウィルス性多糖で最も研究されている。硫酸化多糖類としては、天然または半合成硫酸化多糖が挙げられ、その抗ウィルス、抗癌、抗ＡＩＤＳなどの生物活性は非常に興味深い。
【０００５】
セレン（Ｓｅ）は、人体の必須微量元素であり、通常の酸素代謝で産生されるフリーラジカルの作用から細胞を守る抗酸化酵素の重要なパーツである。生体は、細胞を障害し、幾つかの慢性疾患の進展に寄与するフリーラジカルのレベルを制御するため、抗酸化剤のような防御機構を発達させてきた。セレン生化学の興味深い一面は、その極めて強い効能にある。亜セレン酸またはセレノメチオニンの形態のセレンは、動物食餌中〜０．１ｐｐｍレベルの必須微量栄養素として機能するが、しかし８から１０ｐｐｍのレベルでは毒となる。
このような背景の下、セレンを含む修飾基で修飾された多糖類は様々な生理活性が予想され、医薬品のターゲットとして興味深い。
【０００６】
亜セレン酸化多糖は、硫酸化多糖の硫黄がセレンで置換された半有機合成セレン化合物であり、中国で最初に合成された（特許文献１参照）。当該研究において、亜セレン酸によってエステル化された多糖が抗酸化酵素活性の増強、フリーラジカルからの細胞の保護、免疫機能の増強作用を有することが発見された。また、その報告はセレン化合物の抗発癌活性も開示している。
【０００７】
特許文献１は、三種の新規海洋医薬およびその製造方法を開示している。当該発明には、明らかに腎不全、血管障害、癌の治療効果を有する亜セレン酸化渇藻多糖、セレン化キチン、セレン化紅藻多糖の三種のセレン化多糖化合物が挙げられている。当該発明の生成物は、低毒性または無毒性であり、抗ウィルス、抗ＨＩＶ、抗癌、人体免疫増強作用を有しており、特に、セレン化紅藻多糖は、リンパ球分裂促進やヘルペスウィルスの複製抑制作用をも明らかに有している。しかし、この方法によるセレン化多糖のセレン含量はせいぜい約１２．５ｍｇ／ｇ（１．２５％ｗｔ）である。
【０００８】
特許文献２および３は、セレン化多糖の製造方法を開示している。この方法は、発酵によってセレン富化酵母を調製し、セレン化多糖が酵母溶液から分離、アルカリによって精製されている。セレン化多糖溶液は濃縮され、エタノールで沈殿されている。この方法は、多くの面倒な工程を要し、そのセレン含量は非常に低い。
【特許文献１】中国公開特許公報第１２８８８９９号公報
【特許文献２】特開昭５４−０７４０９８号公報
【特許文献３】特開平４−４０８８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規医薬品となりうる（硫酸化）亜セレン酸化多糖類、およびその製法、並びにその医薬用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、亜セレン酸化多糖類の効能の向上を図るため、セレン含量が高い亜セレン酸化多糖類の製造方法を検討した。その結果、亜セレン酸化の原料である硫酸化多糖の硫酸化度が高いものを用いることにより、従来技術に比べはるかに高いセレン含量を有する亜セレン酸化多糖類が得られることを見出した。
また、硫酸化多糖の硫酸化度や亜セレン酸化反応の条件を調整することにより、さらに硫酸基を含む硫酸化亜セレン酸化多糖類や、様々なセレン含量を有する（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を得た。
このように得られた（硫酸化）亜セレン酸化多糖類について、生物活性を検討した結果、優れた抗酸化作用および抗癌活性を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１２］を提供する；
［１］セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩；
［２］硫酸基をさらに含む、上記［１］記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩。
［３］硫酸基を含むことを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
［４］硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させる工程を含むことを特徴とする、セレン含量が１８重量％以上である亜セレン酸化多糖類またはその塩の製造方法；
［５］硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩が、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造されたものである、上記［４］記載の方法；
［６］硫酸化剤がピリジン・三酸化硫黄錯体またはクロロスルホン酸である、上記［５］記載の方法；
［７］硫酸基を含む亜セレン酸化多糖類またはその塩を製造する、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の製造方法；
［８］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、医薬組成物；
［９］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤；
［１０］亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤；
［１１］亜セレン酸化多糖類がさらに硫酸基を含む、上記［１０］記載の抗酸化剤；および
［１２］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗がん剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来技術よりもセレン含量が高い（最高４５重量％の）亜セレン酸化多糖類が提供される。さらに、硫酸基を有する硫酸化亜セレン酸化多糖類も提供される。かかる（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、医薬、特に抗酸化剤、抗癌剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．亜セレン酸化多糖類の説明
本発明において「亜セレン酸化多糖類」とは、多糖を構成する単糖単位においてグリコシド結合に関与していない官能基（例えば、水酸基、アミノ基など）の一部または全部が亜セレン酸とエステル結合、アミド結合などを形成しているものを意味する。
【００１３】
亜セレン酸化多糖類において、亜セレン酸化の対象となる「多糖類」は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく使用することができ、また、新規なものであってもよく、天然物でも合成品でもよい。
当該多糖類の構成成分である単糖は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく採用することができ、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、タロース、イドース、アルトロース、アロース、グロース、キシロース、アラビノース、ラムロース、フコース、フラクトース、リボース、デオキシリボース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸などが挙げられ、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコースなどが好ましい。
多糖類は、これら単糖の一種類のみで構成されるものでもよいし、２種以上が組み合わさって構成されるものでもよく、２種以上の場合の配列も特に限定されない。また、多糖類は枝分かれした態様であってもよい。また、多糖には至らない単糖も本発明の多糖類に包含される。
多糖類を構成するグリコシド結合様式も特に限定なく、α１→２結合、β１→２結合、α１→３結合、β１→３結合、α１→４結合、β１→４結合、α１→５結合、β１→５結合、α１→６結合、β１→６結合など、またはその組合せが挙げられる。
【００１４】
多糖類（亜セレン酸化されていないもの）の重量平均分子量は特に限定されないが、多糖類水酸基の活性の理由により、好ましい重量平均分子量は５００〜１０７であり、より好ましくは７００〜１０４程度である。高分子量の多糖を、部分加水分解、酵素処理などにより、分子量を適宜調整してもよい。多糖類の重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて測定することができる。
【００１５】
多糖類の具体例としては、グルカン、変性又は未変性のデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、デキストラン、セルロース及びその誘導体（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、マンナン、キシラン、リグニン、アラバン、ガラクタン、ガラクツロナン、キチン、キトサン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、キシログルカン、グルコマンナン、ペクチン酸及びペクチン、アルギン酸及びアルギナート、アラビノガラクタン、カラゲナン、寒天、グリコサミノグルカン、アラビアガム、トラガカントガム、ガッチガム、カラヤガム、キャロブガム、ガラクトマンナン、グアーガム、キサンタンガム、κ―カラギーナンなどが挙げられ、κ―カラギーナン、未変性デンプン、デキストラン、デキシトリン、セルロース、マンナン、キシログルカン、キシランなどが好ましい。
【００１６】
本発明の亜セレン酸化多糖類は、セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする。
本発明の亜セレン酸化多糖類のセレン含量は１８重量％以上であれば特に限定されないが、好ましくは３７．５重量％以上である。セレン含量の上限は、多糖類の官能基がすべて亜セレン酸化された場合であり、採用する多糖類の種類により異なる。例えば、デンプンの水酸基を全て亜セレン酸化した場合は、約４５重量％となる。
【００１７】
本発明において「セレン含量」とは、亜セレン酸化多糖類全体の重量に対する元素としてのセレンの重量を百分率で表わしたものであり、重量％で表記される。
「セレン含量」は後掲の参考例１に記載の方法により測定される。
【００１８】
本発明において「置換度」とは、多糖類の一単糖当りの修飾された官能基の平均数を意味し、例えば、デンプンの全ての水酸基が修飾された場合は、置換度は３となる。
亜セレン酸化多糖類における亜セレン酸置換度（ＤＳ）は、上記セレン含量（Ｓｅ）から下式により算出することができる。
【００１９】
【数１】
【００２０】
本発明の亜セレン酸化多糖類において亜セレン酸化されていない官能基は、亜セレン酸以外で修飾されていてもよい。かかる修飾としては、硫酸化、リン酸化、アルキル化（例えば、メチル化、エチル化）、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられ、硫酸化が好ましい。
【００２１】
本発明の亜セレン酸化多糖類において硫酸基をさらに含む「硫酸化亜セレン酸化多糖類」は、そのセレン含量が１８重量％未満のものを含めて新規化合物であり、医薬（抗酸化剤、抗癌剤）として有用である。硫酸化亜セレン酸化多糖類における硫酸化の置換度は、後述の製造方法において説明する原料の硫酸化多糖類の硫酸置換度や亜セレン酸化の条件で調整することができる。
【００２２】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の重量平均分子量は、亜セレン酸化されていない上記多糖類の重量平均分子量から亜セレン酸化、硫酸化の置換度を考慮して算出することができる。
【００２３】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の好ましい態様は、下記式で表されるピラノース単位および／またはフラノース単位の１種または２種以上を有する。
【００２４】
【化１】
【００２５】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ６およびＲ６’は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、硫酸オキシ、亜セレン酸オキシまたはグリコシド結合を示し、Ｒ２’は水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、亜セレン酸オキシ、亜セレン酸オキシメチルまたはメチレングリコシド結合を示す。但し、一単糖当り、少なくとも平均で０．８個の亜セレン酸オキシを有する。）
【００２６】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、塩の形態であってもよい。かかる塩としては、亜セレン酸基、硫酸基などと塩基との塩が挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの有機塩基塩が挙げられ、フリー体から常法により調製することができる。
【００２７】
２．亜セレン酸化多糖類の製造方法の説明
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、硫酸化多糖類またはその塩を、溶媒中、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させることにより製造することができる。
硫酸化多糖類とは、多糖を構成する単糖単位においてグリコシド結合に関与していない官能基（例えば、水酸基、アミノ基など）の一部または全部が硫酸とエステル結合、アミド結合などを形成しているものを意味する。硫酸化多糖類の塩としては、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の塩と同様のものが挙げられる。
【００２８】
（硫酸化）亜セレン酸化多糖類のセレン含量を１８重量％以上とするためには、原料の硫酸化多糖類の硫酸置換度を２以上とするのが好ましい。硫酸置換度が２より少ない場合であってもセレン含量１８重量％の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を製造できる場合もあるが、硫酸置換度を２以上とすることにより確実にセレン含量を１８重量％以上とすることができる。好ましい硫酸置換度は３である。硫酸置換度の上限は、官能基が全て硫酸化された場合であり、例えばデンプンの場合では３である。
【００２９】
硫酸置換度は、後掲の参考例２に記載の方法により測定される。
【００３０】
亜セレン酸の塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン酸水素ナトリウム、二酸化セレン、塩化セレニニルなどが挙げられる。
亜セレン酸またはその塩の使用量を調整することにより、目的とする（硫酸化）亜セレン酸化多糖類のセレン含量や硫酸基の有無およびその置換度を調整することができる。亜セレン酸またはその塩の使用量は、目的とするセレン含量、硫酸基の置換度、多糖類の種類などを考慮して、原料の硫酸化多糖類に存在する硫酸基のモル数を基準にして０．１〜１０倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
なお、セレン含量を１８重量％以上とするためには、例えば硫酸置換度２以上の硫酸化多糖類を原料として用いた場合、亜セレン酸またはその塩の使用量は、硫酸基のモル数に対して、等モル以上が必要であり、２．５倍モル以上が好ましい。
【００３１】
バリウム塩としては、塩化バリウム、炭酸バリウム、硝酸バリウムなどの水溶性バリウム塩の少なくとも一種が挙げられ、塩化バリウムが好ましい。バリウム塩の使用量は、硫酸基のモル数に対して０．１〜１０倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
【００３２】
酸としては、硝酸および／または塩酸が好ましく、その使用量は、反応液中の濃度が０．１〜５％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００３３】
溶媒としては水が使用され、その使用量は、使用する全試薬の濃度が０．２〜２０％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００３４】
反応温度は１０℃〜１００℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常１時間〜１００時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００３５】
反応終了後、反応液を室温に戻し、好ましくは以下の操作により、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を単離することが出来る。
（１）バリウムイオンの除去
反応溶液に硫酸水溶液を室温下徐々に適下して硫酸バリウムを沈殿させ、濾別する。
（２）過剰の亜セレン酸イオンの除去
（１）で得られた溶液をｐＨ３〜１２に調整し、塩化鉄水溶液を攪拌しながら加える。終夜反応後、沈殿物を濾別する。
（３）（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の単離
（２）で得られた溶液を１５％酢酸ナトリウム水溶液でｐＨ３〜９に調整し、エタノールをエタノール濃度が７０％以上になるまで滴下する。沈殿物を濾集し、９５％および１００％エタノールで洗浄、乾燥し、（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を得る。
【００３６】
３．硫酸化多糖類およびその製造方法の説明
上記（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の製造方法の原料である硫酸化多糖類は、当該技術分野で公知のものを特に限定なく使用することができ、また新規なものであってもよく、天然物でも合成品でもよい。
【００３７】
但し、置換度２以上の硫酸化多糖類は、好ましくは、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造される。以下、完全置換と部分置換の場合に分けて説明する。
３−１．完全置換の硫酸化多糖類の製造
全ての官能基が硫酸化されている硫酸化多糖類は、溶媒中、多糖類を三酸化硫黄・ピリジン錯体と反応させることにより得られる。
【００３８】
三酸化硫黄・ピリジン錯体の使用量は、多糖類の水酸基に対して１〜１５倍モルの範囲から適宜決定すればよく、３〜６倍モルが好ましい。三酸化硫黄・ピリジン錯体の使用量がこの範囲より少ない場合は、硫酸化されない水酸基が残留する場合がある。
【００３９】
溶媒としては、反応を阻害しないかぎり制限はなく、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの一種以上が挙げられ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。溶媒の使用量は、使用する全試薬の濃度が０．１〜３０％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００４０】
反応温度は３０℃〜１１５℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常０．５時間〜２４時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００４１】
反応終了後、硫酸化多糖類はピリジン塩として混合物中に存在する。水を加えることにより反応を止め、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどを含むエタノール（３倍量ｖ/ｖ以上）を加えることにより、遊離の硫酸化多糖類を沈殿として単離することができる。単離された硫酸化多糖類は必要により、透析、凍結乾燥などを行うことにより精製することができる。
３−２．部分置換の硫酸化多糖類の製造
官能基の一部が硫酸化されている硫酸化多糖類は、溶媒中、塩基の存在下、多糖類をクロロスルホン酸と反応させることにより得られる。
【００４２】
クロロスルホン酸の使用量は、目的とする硫酸化多糖類の硫酸基置換度、多糖類の種類などを考慮して、原料の多糖類の水酸基のモル数を基準にして０．０００１〜３倍モルの範囲から適宜決定すればよい。
硫酸置換度を２以上とするためには、クロロスルホン酸の使用量は、多糖類の水酸基のモル数に対して、２倍モル以上が必要であり、５倍モル以上が好ましい。クロロスルホン酸の使用量がこの範囲より少ない場合は、硫酸置換度が２未満となる場合がある。
【００４３】
溶媒としては、反応を阻害しないかぎり制限はなく、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの一種以上が挙げられ、ジメチルスルホキシドが好ましい。多糖の溶解のために溶媒中には塩化リチウム、フッ化テトラブチルアンモニウムなどの塩が好ましく溶解される。当該塩の濃度は、０．０１〜５Ｍの範囲から適宜選択される。溶媒の使用量は、使用する全試薬の濃度が０．１〜１％（ｗ／Ｖ）となる範囲から適宜決定すればよい。
【００４４】
反応温度は２０℃〜１０５℃、反応時間は用いられる試薬や反応温度にも依存するが、通常０．５時間〜２４時間の範囲からそれぞれ選択される。
【００４５】
反応終了後、硫酸化多糖類は使用される塩基との塩として混合物中に存在する。水を加えることにより反応を止め、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基を含む水溶液を加え、ｐＨ８〜１１に調整することにより、遊離の硫酸化多糖類とすることができる。硫酸化多糖類は透析、凍結乾燥などを行うことにより単離、精製することができる。
【００４６】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、優れた抗酸化作用およびそれに基づくＤＮＡ保護作用を有し、ＤＮＡ損傷抑制剤として有用である。
また、本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類は、優れた抗癌活性を有し、肝臓癌、胃癌、腺癌、黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、乳癌、卵巣癌、頭部癌、頸部癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、直腸結腸癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、膣癌、外陰癌、脳腫瘍、精巣癌などの治療に有用である。
【００４７】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類またはその塩を医薬として用いる場合、製薬上許容しうる担体（例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（例えば、錠剤、液剤等）の形態とすることができる。当該医薬組成物あるいは製剤は、製剤分野における通常の方法に従って製造することができる。
【００４８】
本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類を含有する医薬組成物あるいは製剤は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）に、経口又は非経口で投与することができる。
投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、患者のその時に治療を行っている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。本発明の（硫酸化）亜セレン酸化多糖類の１日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、例えば、経口的には０.０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、一日１〜数回に分けて投与され、また非経口的には約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日を一日１〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
ＦＴ−ＩＲスペクトルは日本分光ＦＴＩＲ−６２０を用いてＫＢｒ法で測定した。ＵＶ−可視吸収スペクトルは、日本分光Ｖ−５５０ ＵＶ−ＶＩＳを用いて測定した。
【００５０】
参考例１：亜セレン酸化多糖類のセレン含量の測定法
実施例または比較例で合成した亜セレン酸化多糖類のセレン含量は下記の比色法で定量した。
試料０．１ｇを１０ｍＬの硝酸に３０分浸漬して分解した。冷却後、０．５ｍＬの過塩素酸を加え、１０分加熱した。冷却後、１０ｍＬの水と５ｍＬの塩酸を加え、１０分間煮沸した（６価のＳｅが４価に変わる）。１０％の水酸化ナトリウムで中和後、全量を１００ｍＬとした。この時、５％のＥＤＴＡ（５ｍＬ）も添加した。この溶液の２ｍＬを１０ｍＬの標準容器に入れ、２％ヨウ化カリ１ｍＬと２Ｍの塩酸１ｍＬを加えた。この溶液を撹拌すると、ヨウ素の遊離により黄色になる。ここに、０．０５％のバリアミンブルー（Variamine Blue）０．５ｍＬと１Ｍの酢酸ナトリウム２ｍＬを加えた。水を加え、全量を１０ｍＬとした。５４６ｎｍで吸光度を測定（JASCO V-550 UV/VIS）し、検量線からセレン含量（重量％）を求めた。
【００５１】
参考例２：硫酸置換度の測定法
製造例で合成した硫酸化多糖類、および実施例または比較例で合成した硫酸化亜セレン酸化多糖類の硫酸置換度は、下記方法により測定した。
２〜４ｍｇの硫酸化多糖を、最終的な硫酸イオン濃度が４０〜９０μｇ／０．２ｍＬになるように、塩酸に溶解した。この溶液の０．５ｍＬをガラス管に入れ、１１０℃で５時間加熱した。冷却後、この溶液の０．２ｍＬを３．８ｍＬの３％トリクロロ酢酸が入った１０ｍＬの容器に入れた。これに塩化バリウム・ゼラチン試薬１ｍＬを加え、撹拌後、室温で１５〜２０分静置した。ＪＡＳＣＯ Ｖ−５５０ ＵＶ／ＶＩＳを用い、３６０ｎｍでの吸光度から硫黄含量（重量％）を測定した。（標準試薬：硫酸バリウム）
硫酸置換度（ＤＳ）は、硫黄含量（Ｓ）から下式により算出した。
【００５２】
【数２】
【００５３】
製造例１：完全置換硫酸化キシログルカン（置換度＝２．６、ＸＧ）の合成
キシログルカン（１ｇ）を１５０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁し、窒素雰囲気下、室温で１４時間撹拌した。ピリジン・三酸化イオウ錯体（８ｇ、キシログルカンの有効水酸基の１５モル当量）を加え、反応混合物を４０℃で１０時間窒素雰囲気下に撹拌した。反応混合物に１００ｍＬの水を加えることにより反応を止め、反応溶液を飽和の酢酸ナトリウムを含む冷エタノール（３倍量）に投入して沈殿させ、その後遠心分離で沈殿を回収した。得られた沈殿を水に溶解させ、透析した後、凍結乾燥して、置換度２．６の硫酸化キシログルカン（１．９ｇ）を得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図１（Fully Sulfated XGO）に、ＵＶ−可視吸収スペクトルを図２（Fully Sulfated XGO）にそれぞれ示す。
【００５４】
製造例２または３
製造例１と同様にして、置換度３の硫酸化デキストランおよび置換度３の硫酸化キシランをそれぞれ調製した。
【００５５】
製造例４：部分置換硫酸化デキストラン（置換度＝２、ＤＸ）の合成
デキストラン（１ｇ）を０．２５Ｍ ＬｉＣｌ／ＤＭＳＯ（７０ｍＬ）に浸漬させ、懸濁液を攪拌しながら３０℃に一昼夜保った。その後、ピリジン（５．９８ｍＬ、デキストランの有効水酸基の４モル当量）を加え、さらに３０分間攪拌した。クロロスルホン酸（２．４４ｍＬ、デキストランの有効水酸基の２モル当量）を反応混合物に攪拌下滴下し、次いで反応液を８０℃で３時間加熱した。室温に冷却後、１００ｍＬの蒸留水を攪拌下、反応混合物に加え、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１０に調整した。得られた反応液を弱アルカリ水（ｐＨ９）で透析を行い、ピリジンを除去し、さらに蒸留水で５日間透析した後、凍結乾燥し、置換度約２の硫酸化デキストランを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。
【００５６】
製造例５および６
製造例４と同様にして、置換度２．２の硫酸化デキストリンおよび置換度２．４の硫酸化マンナンをそれぞれ調製した。
【００５７】
実施例１：亜セレン酸化κ―カラギーナンの製造
κ―カラギーナン（１ｇ、天然物、硫酸含量１２〜１３重量％、硫酸置換度約０．９）の３％水溶液に、塩化バリウム（３．４７ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（４．０３ｇ、κ―カラギーナンの硫酸基に対して３モル当量）を加え、３０℃で３６時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムでｐＨ６．８に調整した。ＦｅＣｌ３（６．０１ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後乾燥して、セレン含量１８重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化κ―カラギーナンを得た。
【００５８】
実施例２：亜セレン酸化デキストランの製造
硫酸化デキストラン（３．２２ｇ、硫酸置換度２）の３％水溶液に、塩化バリウム（１２．４８ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（７．７４ｇ、硫酸化デキストランの硫酸基に対して３モル当量）を加え、４２℃で５７時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（９．７３ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３０重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストランを得た。
【００５９】
実施例３：亜セレン酸化マンナンの製造
硫酸化マンナン（３．５４ｇ、硫酸置換度２．４）の４％水溶液に、塩化バリウム（１５．１２ｇ）、塩酸（０．４５ｇ）および亜セレン酸（９．３４ｇ、硫酸化マンナンの硫酸基に対して３モル当量）を加え、５２℃で２０時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１１．６９ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化マンナンを得た。
【００６０】
実施例４：亜セレン酸化デキストリンの製造
硫酸化デキストリン（３．３８ｇ、硫酸置換度２．２）の５％水溶液に、塩化バリウム（１３．７２ｇ）、塩酸（０．６ｇ）および亜セレン酸（１７．６２ｇ、硫酸化デキストリンの硫酸基に対して６モル当量）を加え、３２℃で５時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１９．４６ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量２５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストリンを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図４に示す。
【００６１】
実施例５：亜セレン酸化デキストランの製造
硫酸化デキストラン（４．０２ｇ、硫酸置換度３）の３％水溶液に、塩化バリウム（３７．４４ｇ）、塩酸（０．５ｇ）および亜セレン酸（１０４．５ｇ、硫酸化デキストランの硫酸基に対して９モル当量）を加え、４２℃で９８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１３１．３６ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量４５重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化デキストランを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図５に示す。
【００６２】
実施例６：亜セレン酸化キシランの製造
硫酸化キシラン（２．９２ｇ、硫酸置換度３）の１．５％水溶液に、塩化バリウム（３３．２８ｇ）、塩酸（１ｇ）および亜セレン酸（６９．６７ｇ、硫酸化キシランの硫酸基に対して９モル当量）を加え、４２℃で９８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（８８ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量３６重量％、硫酸置換度０の亜セレン酸化キシランを得た。
【００６３】
実施例７：硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（ＸＧ）の製造
硫酸化キシログルカン（３．７ｇ、硫酸置換度２．６）の３％水溶液に、塩化バリウム（８．１６ｇ）、塩酸（０．７ｇ）および亜セレン酸（９１ｇ、硫酸化キシログルカンの硫酸基に対して９モル当量）を加え、２２℃で８時間反応させた。硫酸水溶液を徐々に反応混合物に室温で滴下してｐＨ４〜６とし、硫酸バリウムを沈殿させた。硫酸バリウムを濾別し、上清液を酢酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整した。ＦｅＣｌ３（１１４ｇ）水溶液を加え、析出した沈殿を濾別した。濾液にエタノールを滴下し、エタノール７０％溶液とした。析出した沈殿を９５％および１００％エタノールで順次洗浄後、乾燥して、セレン含量２９重量％、硫黄含量１６重量％（硫酸置換度１．３５）の硫酸化亜セレン酸化キシログルカンを得た。ＦＴ−ＩＲスペクトルを図６に示す。
【００６４】
実施例１〜７と同様にして、下表に示される実施例８〜１２、比較例１および２の（硫酸化）亜セレン酸化多糖を得た。表１に実施例および比較例の硫酸化亜セレン酸化多糖類のサマリーを示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実施例８のＦＴＩＲスペクトルを図１（XGO Selenite）に、ＵＶ−可視吸収スペクトルを図２（XGO Selenite）に、キシログルカン（XGO）および製造例１の硫酸化キシログルカン（Fully Sulfated XGO）とともにそれぞれ示す。
【００６７】
試験例１：抗酸化活性評価試験（ＯＨラジカル消去活性評価試験）
子牛胸腺ＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、異なる濃度の硫酸化亜セレン酸化多糖、塩化マグネシウム（５ ｍＭ）およびＦｅＣｌ３（５０ ｍＭ）を含む反応混合物（０．５ｍｌ）を３７〜８℃で１時間インキュベートした。陽性対照として安息香酸を使用した。０．０５ｍｌのＥＤＴＡの添加で反応を終了させた。０．５ｍｌのバルビツール酸（ＴＢＡ，１％，ｗｙｖ）および０．５ｍｌの塩酸（２５％，ｗ／ｗ）を添加し、３７〜８℃で１５分間加熱し、発色させた。５３２ｎｍ波長の吸光度（Ａ）を測定し、式（２）により、ＯＨラジカル消去活性（ＳＡ）を算出し、ＤＮＡ損傷を評価した。
【００６８】
【数３】
【００６９】
Ａｐはサンプル有りのＡ、Ａｓはサンプル無しのＡ、Ａ０は非加熱時のＡ（ブランク時）を示す。Ａ０がほぼ０であり、Ａｐが限りなく０に近く、Ａｓが１に近ければ、ＳＡは１００に近づく。Ａｐが０．５で、Ａｓが１であれば、ＳＡは５０％となる。したがって、ＳＡ値が大きいほどラジカル消去能力が高い。
各実施例の結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
セレン含量１０重量％の亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示さなかった。セレン含量４０重量％の亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示した。また，セレン含量５重量％であっても、硫酸基を含む硫酸化亜セレン酸化キシログルカンはラジカル消去活性を示した。
【００７２】
試験例２：抗酸化活性評価試験（ＤＰＰＨラジカル消去活性評価試験）
０．１ｍＭのＤＰＰＨエタノール・水（１：１）溶液を作った。各濃度の試料をエタノール・水（１：１）溶液３ｍＬに溶解し、前記ＤＰＰＨ溶液１ｍＬを加えた。よく撹拌後、３０分間室温で静置した。５２４ｎｍで吸光度を測定し、ラジカル消去活性（Ｋ％）を次式から求めた。
【００７３】
【数４】
【００７４】
Ａｓ：ＤＰＰＨと反応した試料の吸光度； Ａｉ: ＤＰＰＨと反応しないときの試料の吸光度；Ａｃ: コントロールの吸光度
結果を図７に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたＤＰＰＨラジカル消去活性を示した。
【００７５】
試験例３：抗酸化活性評価試験（フェントン反応で生成したＯＨラジカル消去活性評価試験）
ｏ−フェナントロリン（０．７５ｍＭ）、過酸化水素（２ｍＭ）および硫酸鉄（０．７５ｍＭ）を溶解した２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に各濃度の試料を溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応後、５３６ｎｍで吸光度を測定し、ヒドロキシラジカル消去活性（Ｓ％）を次式から求めた。
【００７６】
【数５】
【００７７】
Ａｓ: 過酸化水素と反応した試料の吸光度；Ａｃ：過酸化水素と反応しない試料の吸光度；Ａｏ: 試料なしでの吸光度
結果を図８に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたＯＨラジカル消去活性を示した。
【００７８】
試験例４：抗酸化活性評価試験（スーパーオキサイドアニオン消去活性評価試験）
１６ｍＭのトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)に各試料を２５℃で２０分浸した後、０．１ｍＭのピロガロールを加え、直ちに５１０ｎｍで吸光度を測定した。５分間、１分毎に吸光度測定を行った。スーパーオキシドアニオン消去活性（ＯＤ％）は、次式から計算した。
【００７９】
【数６】
【００８０】
Ａｓ: ピロガロールと反応した試料の吸光度の変化；Ａｏ： 試料なしでの吸光度の変化
結果を図９に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れたスーパーオキサイドアニオンラジカル消去活性を示した。
【００８１】
試験例５：抗酸化活性評価試験（過酸化脂質生成抑制活性評価試験）
たまご由来のビテロース（vitellose）を氷冷した２０ｍＭのリン酸緩衝液中でホモジナイズした。この１ｍＬに試料を加え、５ｍＭの硫酸鉄の存在下、３７℃で１時間反応させた。酸を加えて反応を停止後、１００℃で１５分加熱した。沈殿したタンパク質を除去した後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。過酸化脂質生成抑制活性（Ｋ％）は次式から計算した。
【００８２】
【数７】
【００８３】
Ａｓ: 試料の吸光度；Ａｃ: コントロールの吸光度
結果を図１０に示す。実施例８の亜セレン酸化キシログルカン（XGO-Se）は製造例１の硫酸化キシログルカン（XGO-S）より優れた過酸化脂質生成抑制活性を示した。
【００８４】
試験例６：抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）
ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液（１５μＬ，１．８５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、２４時間後実験を行った。細胞と試料を加え、２４又は４８時間培養した後、生存細胞をＭＴＴ（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenytetrazolium）アッセイにより評価した。すなわち、１０μｌのＭＴＴをウェルに加え、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベーターで４時間培養した。１０％ＳＤＳ（１００μｌ）をウェルに加え、細胞を終夜培養した。ホルマザンの生成をマイクロプレート分光光度計（Spectra Max 190, 米国製）を用いて、５７０ｎｍで測定した。
実施例１０（６．２１Ｙ）、実施例１１（６．２８Ｙ）および実施例１２（Ｓｔａｒｃｈ）の結果を図１１に、キシログルカン（＃１）、製造例１（＃２）および比較例２（＃３）の結果を図１２に示した。
実施例１１および１２の硫酸化亜セレン酸化キシログルカンは０．０１ｇ／Ｌ以上で、実施例１３の硫酸化亜セレン酸化デンプンは０．１ｇ／Ｌ以上で抗癌作用を示した（図１１）。
セレン含量１７重量％で硫酸基を有さない硫酸化亜セレン酸化キシログルカンは抗癌活性を示さなかった（図１２）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】キシログルカン、硫酸化キシログルカン（製造例１）および亜セレン酸化キシログルカン（実施例８）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図２】キシログルカン、硫酸化キシログルカン（製造例１）および硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（実施例１０）のＵＶ−可視吸収スペクトルである。
【図３】硫酸化デキストラン（製造例４）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４】硫酸化亜セレン酸化デキストリン（実施例４）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図５】硫酸化亜セレン酸化デキストラン（実施例５）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図６】硫酸化亜セレン酸化キシログルカン（実施例７）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図７】ＤＰＰＨラジカル消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例２）。
【図８】フェントン反応で生成したＯＨラジカル消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例３）。
【図９】スーパーオキサイドアニオン消去活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例４）。
【図１０】過酸化脂質生成抑制活性評価試験の結果を示すグラフである（試験例５）。
【図１１】抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）の結果を示すグラフである（試験例６）。
【図１２】抗癌活性評価試験（ＭＴＴアッセイ）の結果を示すグラフである（試験例６）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項２】
硫酸基をさらに含む、請求項１記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項３】
硫酸基を含むことを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項４】
硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させる工程を含むことを特徴とする、セレン含量が１８重量％以上である亜セレン酸化多糖類またはその塩の製造方法。
【請求項５】
硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩が、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造されたものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
硫酸化剤がピリジン・三酸化硫黄錯体またはクロロスルホン酸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
硫酸基を含む亜セレン酸化多糖類またはその塩を製造する、請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤。
【請求項１０】
亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤。
【請求項１１】
亜セレン酸化多糖類がさらに硫酸基を含む、請求項１０記載の抗酸化剤。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗がん剤。
【請求項１】
セレン含量が１８重量％以上であることを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項２】
硫酸基をさらに含む、請求項１記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項３】
硫酸基を含むことを特徴とする、亜セレン酸化多糖類またはその塩。
【請求項４】
硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩を、バリウム塩または酸の存在下、亜セレン酸またはその塩と反応させる工程を含むことを特徴とする、セレン含量が１８重量％以上である亜セレン酸化多糖類またはその塩の製造方法。
【請求項５】
硫酸置換度が２以上である硫酸化多糖類またはその塩が、多糖類を硫酸化剤と反応させることにより製造されたものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
硫酸化剤がピリジン・三酸化硫黄錯体またはクロロスルホン酸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
硫酸基を含む亜セレン酸化多糖類またはその塩を製造する、請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤。
【請求項１０】
亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗酸化剤。
【請求項１１】
亜セレン酸化多糖類がさらに硫酸基を含む、請求項１０記載の抗酸化剤。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載の亜セレン酸化多糖類またはその塩を含む、抗がん剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−２６０８２３（Ｐ２００８−２６０８２３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０３７２８（Ｐ２００７−１０３７２８）
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１１日（２００７．４．１１）
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
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