免疫蛋白質の産生促進剤、および免疫蛋白質の産生促進方法
【課題】免疫グロブリンおよび／またはサイトカインなどの免疫蛋白質の産生を促進可能な新規な免疫蛋白質産生促進剤を提供する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、又はβ−クリプトキサンチンを含有する。
【解決手段】本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、又はβ−クリプトキサンチンを含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫蛋白質の産生促進剤、および免疫蛋白質の産生促進方法に関するものである。詳細には本発明は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）の免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤、および当該免疫蛋白質の産生促進方法に関するものである。以下では説明の便宜上、免疫グロブリンを中心に説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称Ｉｇ）は、通常抗体と呼ばれる複合蛋白質であり、ヒトにおいてはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類がある。免疫グロブリンは、体内に入った細菌などを破壊する作用、好中球の食細胞を補助する作用、細菌が産生した毒素を中和する作用を有する他、抗生物質の治療効果を高めて人体を感染から守る役割を果たすなど、免疫のなかで大きな役割を担っており、体内診断薬、治療薬等の医薬分野への応用が強く期待されている。
【０００３】
免疫グロブリンは、通常、ヒトリンパ球や、ヒト型親細胞と癌患者のリンパ球とを融合させて得られるヒト型ハイブリドーマ細胞などのヒトリンパ球類から産生されるが、その産生効率は極めて低いという問題がある。そこで、免疫グロブリンの産生能を高めるための研究が行なわれている。
【０００４】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、例えば、クラゲのコラーゲン抽出物質が免疫賦活作用を有することを知見して、コラーゲンの存在下でヒトリンパ球類を培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献１）や、放射線処理したコラーゲンなどの存在下で白血球やリンパ球ハイブリドーマを培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献２）を開示している。また、特許文献３には、複数種の乳製品と酵母を共生培養して得られる発酵乳が、ＩｇＭ産生促進作用やＩＦＮ−γ産生促進作用を有する生理活性ペプチドを含有することを開示している。更に、特許文献４には、魚類の卵の破砕液を抽出して得られた化合物が免疫調整作用を有することを開示している。
【０００５】
一方、特許文献５には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を有することが開示されている。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【０００６】
ところで、柑橘類の果皮などは、古くから漢方の原料として使用されている。例えば、温州みかんなどに多く含まれるβ−カロテノイド類のβ−クリプトキサンチンは、悪性腫瘍抑制作用を有することが報告され、注目されている。
【０００７】
β−クリプトキサンチンは、α−カロテン、β−カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、ルテインと共にヒト血液中に存在する６種類のカロテノイド類の一つであり、糖尿病、リウマチに関する疾病リスク低減作用、発がん予防作用、骨粗鬆症予防作用などが見出されている。また、特許文献６には、その特許請求の範囲にクリプトキサンチンなど多くの成分を含む免疫賦活剤が記載されている。しかし、特許文献６の実施例の欄には、クリプトキサンチンを用いた例は全く開示されておらず、そもそも特許文献６は、紫外線による皮膚の免疫機能低下を外用により防止するための皮膚免疫賦活剤およびこれを含有するクリームや乳液などの皮膚外用剤に関するものであり、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生能向上は全く意図していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２０４２４８号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２６号公報
【特許文献３】特開２００６−７６９６１号公報
【特許文献４】特開２００７−９１６５４号公報
【特許文献５】特開平６−９８７６３号公報
【特許文献６】特開平１１−２４６３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質の産生促進剤、および免疫蛋白質の産生促進方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、β−クリプトキサンチンを含有するところに要旨を有するものである。
【００１１】
好ましい実施形態において、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫グロブリンおよび／またはサイトカインの産生を促進するものであり、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進に極めて有効である。
【００１２】
また、上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進方法は、β−クリプトキサンチンを非ヒト動物に投与するところに要旨を有するものである。
【００１３】
好ましい実施形態において、上記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである。本発明の方法は特に、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進方法として極めて有効である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンや；インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子などのサイトカインの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食
品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能
性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、β−クリプトキサンチンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図３】図３は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図４】図４は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、血中の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図８】図８は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図９】図９は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、脾臓細胞のサイトカイン産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、β−クリプトキサンチンが、免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。詳細には、β−クリプトキサンチンが、ＨＢ４Ｃ５細胞［ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたものであり、ＩｇＭ産生能を有する］の抗体産生に及ぼす影響を検討した結果、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生を促進することが判明した。更に、β−クリプトキサンチンは、マウス脾臓リンパ球のＩｇＧ及びＩｇＡの産生を促進すると共に、マウス腸間膜リンパ球のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭの産生を促進した。更に、抗体の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した結果、β−クリプトキサンチンは転写段階で上方制御していることが明らかとなった。従って、β−クリプトキサンチンによる免疫蛋白質産生促進作用は、転写促進によるタンパク質性合成系の活性化によるものであることが強く示唆された。更に、β−クリプトキサンチンによる上記の免疫蛋白質産生促進作用は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても見られることが確認された。
【００１７】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００１８】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００１９】
（β−クリプトキサンチン）
β−クリプトキサンチンは、下記の構造式で表わされるカロテノイド類の一種である。前述したように、β−クリプトキサンチンは、発ガン抑制作用などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２０】
【化１】
【００２１】
β−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉に多く含まれているが、温州ミカンでは、果肉よりも果皮に多く含まれているといわれている。柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。β−クリプトキサンチンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、柚子、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーを使用することが好ましく、より好ましくは温州ミカンである。
【００２２】
本発明に用いられるβ−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果肉は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル等を用いて抽出すれば良い。β−クリプトキサンチンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、例えば、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２３】
あるいは、β−クリプトキサンチンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００２４】
あるいは、温州ミカンを用いる場合は、上述したように果肉のほか果皮中にも多く含まれていることから、以下のようにして抽出することが好ましい。果皮等を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕し、有機溶媒を用いて抽出することが好ましく、用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノールなどのアルコール系有機溶媒、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類を挙げることができる。これらの中でも、エタノール、メタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルから選ばれることが好ましく、より好ましくはエタノールを用いる。
【００２５】
あるいは、β−クリプトキサンチンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社）。
【００２６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、上記のβ−クリプトキサンチンを含んでいる。
【００２７】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、β−クリプトキサンチンのみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００２８】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００２９】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３０】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良いが、例えば、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日（より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）の割合で、おおむね、１週間から２週間程度以上の期間、投与することが推奨される。投与期間は、所望の効果が発揮されるまで、適切な期間、延長することができる。
【００３１】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。例えばペット飼料、養殖魚飼料、家畜飼料などとして適用することが挙げられる。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。例えば、前述したヒトを対象とした場合と同様、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日（より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）の割合で、おおむね、１週間から２週間程度以上の期間、投与することが推奨される。投与期間は、所望の効果が発揮されるまで、適切な期間、延長することができる。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメなどの魚類などが代表的に例示される。
【００３２】
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤を用い、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進する方法について説明する。本発明では、免疫蛋白質産生促進剤であるβ−クリプトキサンチンの存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。）を培養すれば、免疫蛋白質の産生促進剤を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００３３】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００３４】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００３５】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、β−クリプトキサンチンを含有する培地中で培養する。
【００３６】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００３７】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００３８】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００３９】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（β−クリプトキサンチン）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０4〜５×１０5ｃｅｌｌｓである場合、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４０】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００４１】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００４２】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００４３】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００４４】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４６】
実施例１
本実施例では、β−クリプトキサンチンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００４７】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチン（和光純薬工業株式会社製）をＤＭＳＯに溶解して図１に示すように３２〜４０００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００４８】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した。
【００４９】
これらの結果を図１に示す。
【００５０】
図１より、β−クリプトキサンチンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、最大濃度（４０００ｎｇ／ｍＬ）では、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．６倍に促進された。
【００５１】
実施例２
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００５２】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図２（ａ）または図２（ｂ）に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、並びに抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５３】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００５４】
ＩｇＡの結果を図２（ａ）に、ＩｇＧの結果を図２（ｂ）に示す。
【００５５】
図２より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で２．５倍に増加し、ＩｇＧは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で約３．７倍にまで増加した。
【００５６】
実施例３
本実施例では、β−クリプトキサンチンの作用で、マウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００５７】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解したβ−クリプトキサンチンを終濃度５００ｎｇ／ｍＬで添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で２４時間培養したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAACである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００５８】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５９】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００６０】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図３（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図３（ｂ）に、それぞれ示す。
【００６１】
図３（ａ）および図３（ｂ）より、β−クリプトキサンチンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、いずれも約２倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００６２】
実施例４
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００６３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図４〜図６に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、並びに抗マウスＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６４】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【００６５】
ＩｇＡの結果を図４に、ＩｇＧの結果を図５に、ＩｇＭの結果を図６に、それぞれ示す。
【００６６】
図４〜図６より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．１倍に増加し、ＩｇＧは１５６ｎｇ／ｍＬの添加で約１．７倍に増加し、ＩｇＭは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．４倍に増加した。
【００６７】
実施例５
本実施例では、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における、β−クリプトキサンチンによる免疫蛋白質の産生促進効果を調べた。
【００６８】
詳細には、β−クリプトキサンチン（フナコシ株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したものを用意した。次に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を７匹／群に分け、各マウスに対し、下記要領でβ−クリプトキサンチンを１４日間経口投与した。
（Ａ）高用量投与群（上記濃度のβ−クリプトキサンチンを１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち１０ｍｇ／ｋｇ／日投与）
（Ｂ）低用量投与群（上記濃度のβ−クリプトキサンチン溶液をＤＭＳＯで５倍希釈し、濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した溶液を１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち２ｍｇ／ｋｇ／日）
（Ｃ）コントロール群（ＤＭＳＯのみ１ｍＬ／ｋｇ／日投与）
【００６９】
１４日間の経口投与終了後、１５日目にマウスを屠殺し、血清、脾臓細胞、および腸間膜リンパ節を採取した。脾臓細胞および腸間膜リンパ節から直ちにリンパ球を採取し、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）に接種し、３７℃で２４時間培養した。このようにして得られた培養後の上清中、および上記血清の各免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて測定した。これらの結果を図７、８、１０に示す。
【００７０】
更に、脾臓リンパ球の上記培養後上清中のサイトカイン［詳細にはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α］の各量を、測定キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。この測定キットは、酵素抗体法を基本としたものである。これらの結果を図９に示す。
【００７１】
また、上記と同様にして、脾臓リンパ球の上記培養後上清中の他のサイトカイン［詳細にはインターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）］の各量を、測定した結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
上記図７〜図１０には、Ｔｕｋｅｙ法による解析を行ってコントロール群と有意差のあった群にｐ値を示している。また、各図において、「なし」はコントロール群の結果を、「低」は低用量投与群の結果を、「高」は高用量投与群の結果を、それぞれ示している。
【００７４】
図７より、β−クリプトキサンチンの添加により、血清中の各抗体量は増加する傾向が見られた。特に高用量投与群のＩｇＡ産生量およびＩｇＭ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。なお、いずれの抗体についても、高用量投与群に比べて低用量投与群の方が、概して、抗体産生量が高くなる傾向が見られたが、これは、生体内における至適濃度が存在するためと考察される。
【００７５】
また、図８〜１０より、β−クリプトキサンチンの添加により、血清中の各抗体量の上昇に加え、脾臓や腸間膜リンパ節リンパ球に存在する免疫蛋白質の産生も上昇することが分かった。
【００７６】
詳細には脾臓細胞中の各抗体産生量の結果は図８に示すとおりであり、低用量投与群のＩｇＭ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。ＩｇＧでは、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示し、ＩｇＡでは、高用量投与群で上昇傾向を示した。
【００７７】
また、脾臓細胞中の各サイトカインの産生量の結果は図９および表１に示すとおりである。詳細には図９に示すように、ＩＦＮ−γの産生量は、低用量投与群および高用量投与群のいずれにおいても、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。ＴＮＦ−αについても、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示し、ＩＬ−４では、低用量投与群で上昇傾向を示した。また、表１に示すように、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のいずれにおいても、低用量投与群で上昇傾向を示し、特にＩＬ-６では、低用量投与群および高用量投与群の両方で有意な上昇が認められた。
【００７８】
また、腸間膜リンパ節リンパ球中の各抗体産生量の結果は図１０に示すとおりであり、低用量投与群のＩｇＭ産生量、並びに低用量投与群および高用量投与群のＩｇＧ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。また、ＩｇＡは、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示した。
【００７９】
実施例６
本実施例では、β−クリプトキサンチンをマウスに経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球内において、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００８０】
詳細には、前述した実施例５において採取した腸間膜リンパ節リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した。ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAAC、ＩｇＧ１に対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CACTGTTGACCCTGCATTTG、リバース：GCACACAGCTCAGACGAAAC、である。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００８１】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８２】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００８３】
これらの結果を図１１に示す。
【００８４】
図１１より、β−クリプトキサンチンの経口投与により、腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡ、ＩｇＧ１−ｍＲＮＡ、およびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性はいずれも、上昇し、β−クリプトキサンチンの投与量が増加すると、これらの転写活性も上昇することが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによる上記抗体の産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。すなわち、腸間膜リンパ節リンパ球の上記抗体産生の上昇は、リンパ球内の遺伝子発現レベルの上昇による可能性が示唆された。
【００８５】
以上の実験結果より、β−クリプトキサンチンは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも免疫蛋白質の産生促進効果を有することが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫蛋白質の産生促進剤、および免疫蛋白質の産生促進方法に関するものである。詳細には本発明は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、およびＩｇＥ抗体の免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）の免疫蛋白質の産生を促進することが可能な免疫蛋白質の産生促進剤、および当該免疫蛋白質の産生促進方法に関するものである。以下では説明の便宜上、免疫グロブリンを中心に説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、略称Ｉｇ）は、通常抗体と呼ばれる複合蛋白質であり、ヒトにおいてはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ，ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類がある。免疫グロブリンは、体内に入った細菌などを破壊する作用、好中球の食細胞を補助する作用、細菌が産生した毒素を中和する作用を有する他、抗生物質の治療効果を高めて人体を感染から守る役割を果たすなど、免疫のなかで大きな役割を担っており、体内診断薬、治療薬等の医薬分野への応用が強く期待されている。
【０００３】
免疫グロブリンは、通常、ヒトリンパ球や、ヒト型親細胞と癌患者のリンパ球とを融合させて得られるヒト型ハイブリドーマ細胞などのヒトリンパ球類から産生されるが、その産生効率は極めて低いという問題がある。そこで、免疫グロブリンの産生能を高めるための研究が行なわれている。
【０００４】
本発明者らは、免疫賦活活性を有する生体機能調節因子の研究を長年の間、行なっており、例えば、クラゲのコラーゲン抽出物質が免疫賦活作用を有することを知見して、コラーゲンの存在下でヒトリンパ球類を培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献１）や、放射線処理したコラーゲンなどの存在下で白血球やリンパ球ハイブリドーマを培養して免疫蛋白質を製造する方法（特許文献２）を開示している。また、特許文献３には、複数種の乳製品と酵母を共生培養して得られる発酵乳が、ＩｇＭ産生促進作用やＩＦＮ−γ産生促進作用を有する生理活性ペプチドを含有することを開示している。更に、特許文献４には、魚類の卵の破砕液を抽出して得られた化合物が免疫調整作用を有することを開示している。
【０００５】
一方、特許文献５には、搾汁した温州ミカン果汁を遠心分離して得た上澄み液に所定の処理を施した抽出物が、ヒト型ハイブリドーマ細胞の抗体産生を有することが開示されている。この方法によって得られる抽出物は、分子量が少なくとも１万以上のタンパク質であると推察され、産生効率が低いという問題がある。
【０００６】
ところで、柑橘類の果皮などは、古くから漢方の原料として使用されている。例えば、温州みかんなどに多く含まれるβ−カロテノイド類のβ−クリプトキサンチンは、悪性腫瘍抑制作用を有することが報告され、注目されている。
【０００７】
β−クリプトキサンチンは、α−カロテン、β−カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、ルテインと共にヒト血液中に存在する６種類のカロテノイド類の一つであり、糖尿病、リウマチに関する疾病リスク低減作用、発がん予防作用、骨粗鬆症予防作用などが見出されている。また、特許文献６には、その特許請求の範囲にクリプトキサンチンなど多くの成分を含む免疫賦活剤が記載されている。しかし、特許文献６の実施例の欄には、クリプトキサンチンを用いた例は全く開示されておらず、そもそも特許文献６は、紫外線による皮膚の免疫機能低下を外用により防止するための皮膚免疫賦活剤およびこれを含有するクリームや乳液などの皮膚外用剤に関するものであり、免疫グロブリンやサイトカインなどの免疫蛋白質の産生能向上は全く意図していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２０４２４８号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２６号公報
【特許文献３】特開２００６−７６９６１号公報
【特許文献４】特開２００７−９１６５４号公報
【特許文献５】特開平６−９８７６３号公報
【特許文献６】特開平１１−２４６３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、免疫グロブリンやサイトカインなどに代表される免疫蛋白質の産生を促進させる新規な免疫蛋白質の産生促進剤、および免疫蛋白質の産生促進方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、β−クリプトキサンチンを含有するところに要旨を有するものである。
【００１１】
好ましい実施形態において、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫グロブリンおよび／またはサイトカインの産生を促進するものであり、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進に極めて有効である。
【００１２】
また、上記課題を解決し得た本発明に係る免疫蛋白質の産生促進方法は、β−クリプトキサンチンを非ヒト動物に投与するところに要旨を有するものである。
【００１３】
好ましい実施形態において、上記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである。本発明の方法は特に、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭの免疫グロブリン；インターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生促進方法として極めて有効である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特にＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンや；インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子などのサイトカインの産生能が著しく向上するため、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、免疫蛋白質を用いた種々の医療用途に好適に用いられる。具体的には、例えば、免疫グロブリンやサイトカインを原料とする免疫グロブリン製剤、免疫疾患治療薬、免疫機能薬、免疫促進効果を有する健康食品(機能性食
品)・サプリメント、健康維持を目的とした飲料、魚類用機能性飼料、家畜・家禽用機能
性飼料などの用途に好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、β−クリプトキサンチンがヒトハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の産生に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡの産生に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＧの産生に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図３】図３は、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓細胞の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフであり、（ａ）はＩｇＡ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、（ｂ）はＩｇＭ−ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、それぞれ示している。
【図４】図４は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】図５は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＧの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】図６は、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＭの産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図７】図７は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、血中の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図８】図８は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図９】図９は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、脾臓細胞のサイトカイン産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼすβ−クリプトキサンチンの影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウスにβ−クリプトキサンチンを経口投与したとき、β−クリプトキサンチンがマウス腸間膜リンパ節リンパ球の抗体遺伝子の転写活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、新規な免疫蛋白質の産生促進剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、β−クリプトキサンチンが、免疫蛋白質の産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。詳細には、β−クリプトキサンチンが、ＨＢ４Ｃ５細胞［ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたものであり、ＩｇＭ産生能を有する］の抗体産生に及ぼす影響を検討した結果、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生を促進することが判明した。更に、β−クリプトキサンチンは、マウス脾臓リンパ球のＩｇＧ及びＩｇＡの産生を促進すると共に、マウス腸間膜リンパ球のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭの産生を促進した。更に、抗体の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した結果、β−クリプトキサンチンは転写段階で上方制御していることが明らかとなった。従って、β−クリプトキサンチンによる免疫蛋白質産生促進作用は、転写促進によるタンパク質性合成系の活性化によるものであることが強く示唆された。更に、β−クリプトキサンチンによる上記の免疫蛋白質産生促進作用は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても見られることが確認された。
【００１７】
本明細書において、免疫蛋白質とは、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体などの免疫グロブリン；インターロイキン（ＩＬ−１〜１８など）、インターフェロン（ＩＦＮ−α，β，γなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αなど）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＳＣＦなど）、成長因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦなど）などのサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）を意味する。
【００１８】
本明細書において、「免疫蛋白質産生促進作用を有する」とは、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。詳細は後述する。）数の増加、または免疫蛋白質産生細胞における免疫グロブリンやサイトカインなどの産生量の増加を意味する。
【００１９】
（β−クリプトキサンチン）
β−クリプトキサンチンは、下記の構造式で表わされるカロテノイド類の一種である。前述したように、β−クリプトキサンチンは、発ガン抑制作用などの生理活性を有することは報告されているが、免疫蛋白質の産生促進作用については報告されていない。
【００２０】
【化１】
【００２１】
β−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉に多く含まれているが、温州ミカンでは、果肉よりも果皮に多く含まれているといわれている。柑橘類としては、例えば、夏みかん、甘夏、イヨカン、温州ミカン、はっさく、夏ダイダイ、ネーブル、柚子、かぼす、グレープフルーツ、すだち、レモン、ポンカン、キンカン、シークワーサーなどのミカン科植物が挙げられる。β−クリプトキサンチンによる高い免疫蛋白質産生促進作用を得るためには、このうち特に、温州ミカン、夏みかん、柚子、イヨカン、ポンカン、キンカン、シークワーサーを使用することが好ましく、より好ましくは温州ミカンである。
【００２２】
本発明に用いられるβ−クリプトキサンチンは、柑橘類の果肉を原料とし、公知の方法で抽出することができる。柑橘類の果肉は、予め凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕してから、抽出を行なうことが好ましい。具体的には、エタノール、メタノール、ヘキサン、酢酸エチル等を用いて抽出すれば良い。β−クリプトキサンチンを効率よく抽出するためには、特に、抽出時間に留意することが好ましく、例えば、室温で６時間以上に制御することが好ましい。
【００２３】
あるいは、β−クリプトキサンチンは、本発明者の一人によって発明された独自のパウダー製造方法（特開２００９−１７８２２号公報）から得ることもできる。
【００２４】
あるいは、温州ミカンを用いる場合は、上述したように果肉のほか果皮中にも多く含まれていることから、以下のようにして抽出することが好ましい。果皮等を凍結乾燥した後、できるだけ細かく粉砕し、有機溶媒を用いて抽出することが好ましく、用いる有機溶媒としては、エタノール、メタノールなどのアルコール系有機溶媒、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類を挙げることができる。これらの中でも、エタノール、メタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチルから選ばれることが好ましく、より好ましくはエタノールを用いる。
【００２５】
あるいは、β−クリプトキサンチンは市販品を用いることもできる（例えば、和光純薬工業株式会社）。
【００２６】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、上記のβ−クリプトキサンチンを含んでいる。
【００２７】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、β−クリプトキサンチンのみから構成されていても良いし、医薬などに通常用いられる公知の担体を組み合わせて用いることもできる。具体的には、製剤学的に許容される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、賦形剤、希釈剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの担体が挙げられる。また、食品分野で慣用されている各種の栄養源、例えば糖質、脂質、蛋白質素材などを添加しても良い。更に、必要に応じて、他の医薬品と併用しても良い。
【００２８】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の形態は特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤(懸濁剤、乳剤、注射剤など)、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、軟膏剤などが挙げられる。これら各形態への調製は、上述した慣用の担体を用い、常法に従って行なうことができる。
【００２９】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与形態は、その製剤形態に応じて適切に選択すれば良い。例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤などの場合は経口投与の形態で用いられ、注射剤などの場合は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与などの形態で用いられ、坐剤の場合は直腸内投与の形態で用いられる。
【００３０】
本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤の投与量は、一律に限定されず、被験者の年齢、性別、疾患の程度などに応じ、所望の効果が発揮されるように適宜調整すれば良いが、例えば、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日（より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）の割合で、おおむね、１週間から２週間程度以上の期間、投与することが推奨される。投与期間は、所望の効果が発揮されるまで、適切な期間、延長することができる。
【００３１】
また、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤は、家畜・家禽、魚類などの非ヒト動物用の飼料の形態で用いても良く、これにより、非ヒト動物の免疫蛋白質産生能が促進される。例えばペット飼料、養殖魚飼料、家畜飼料などとして適用することが挙げられる。具体的には、例えば、非ヒト動物用の飼料中に本発明の免疫蛋白質産生促進剤を、非ヒト動物の症状などに応じ、適切な量だけ配合すれば良い。例えば、前述したヒトを対象とした場合と同様、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日（より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日）の割合で、おおむね、１週間から２週間程度以上の期間、投与することが推奨される。投与期間は、所望の効果が発揮されるまで、適切な期間、延長することができる。用いられる非ヒト動物用の飼料の組成は限定されず、例えば、市販品を用いることもできる。また、対象となる非ヒト動物も限定されず、例えば、豚、牛、馬、ヤギ、ウサギ、羊などの家畜類；鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽類；タイ、ハマチ、マグロ、コイ、エビ、アユ、ヒラメなどの魚類などが代表的に例示される。
【００３２】
次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、本発明に係る免疫蛋白質の産生促進剤を用い、免疫グロブリンやサイトカインに代表される免疫蛋白質の産生を促進する方法について説明する。本発明では、免疫蛋白質産生促進剤であるβ−クリプトキサンチンの存在下で、免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞（以下、「免疫蛋白質産生細胞」と呼ぶ。）を培養すれば、免疫蛋白質の産生促進剤を添加せずに培養した場合に比べ、上記免疫蛋白質産生細胞中の免疫グロブリンやサイトカインなどの産生が著しく向上する（後記する実施例を参照）。
【００３３】
本明細書において、「免疫蛋白質産生細胞」とは、好ましくは免疫グロブリンやサイトカインの免疫蛋白質を産生する能力を有する細胞であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）やマクロファージなどの白血球；上記リンパ球（特にＢ細胞）と自立増殖能を有する多発性骨髄腫やリンパ腫などのミエローマ細胞との融合細胞（リンパ球ハイブリドーマ）などが代表的に例示される。後者のリンパ球ハイブリドーマは、例えばセンダイウイルスを用いた細胞融合法、ポリエチレングリコール法、または電気パルスによる電気融合など、慣用方法に従って調製することができる。好ましいリンパ球ハイブリドーマとしては、後記する実施例で用いた、ヒト骨髄腫細胞株とリンパ球（Ｂ細胞）とを細胞融合させたヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞が挙げられる。ＨＢ４Ｃ５細胞を使用すると、当該細胞から分泌されるＩｇＭを指標として、免疫蛋白質産生能を容易に測定することができる。
【００３４】
これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマは、単一種類のものに限定されず、２種以上を組み合わせて使用することもできる。また、これらの白血球およびリンパ球ハイブリドーマの由来は特に制限されないが、本発明ではヒト由来の免疫蛋白質の産生を促進するという観点から、好ましくはヒト由来である。
【００３５】
本発明では、これらの白血球またはリンパ球ハイブリドーマに代表される免疫蛋白質産生細胞を、β−クリプトキサンチンを含有する培地中で培養する。
【００３６】
ここで、上記の培地は、上記の免疫蛋白質産生細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地または７Ａ培地、ＨａｍのＦ１０培地またはＦ１２培地、１９９培地、ＥＤＲＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などや、これらの改良型培地などが挙げられる。これらの培地は、市販品を用いることができる。
【００３７】
本発明では、本発明による作用を損なわない限り、上記の培地中に、ウシ血清等の血清を添加しても良い。ただし、血清成分による免疫蛋白質の産生を促進するという観点からは、血清を添加しない無血清培地の使用が好ましい。
【００３８】
本発明で使用する上記培地には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム等の各種添加剤を適宜添加することもできる。例えば、ＥＤＲＦ培地に、上記のインスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、及び亜セレン酸ナトリウム（以下、ＩＴＥＳと呼ぶ場合がある。）を添加すると、血清の影響を受けずに活性を測定できるという利点があることから、後記するハイブリドーマを用いた培養実験では、上記のＩＴＥＳを所定の濃度で添加したＥＤＲＦ培地（ＩＴＥＳ−ＥＤＲＦ培地）を使用している。
【００３９】
培地中に添加する免疫蛋白質の産生促進剤（β−クリプトキサンチン）の量は、前述したように、所望の効果を発揮することができる程度に適宜調整すれば良いが、例えば、培養する白血球またはリンパ球ハイブリドーマの量が培地１ｍＬあたり１×１０4〜５×１０5ｃｅｌｌｓである場合、培地１ｍＬあたり、おおむね、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で添加することが望ましい。
【００４０】
培養時の温度は、免疫蛋白質を産生できる温度であれば特に制限されず、おおむね、３０〜４５℃の範囲である。好ましくは３５〜４２℃であり、より好ましくは３６〜３８℃である。また、湿度も特に制限されず、相対湿度は、おおむね、８０〜１００％の範囲であり、好ましくは９０〜１００％、より好ましくは９５〜１００％である。
【００４１】
また、培養に当たり、炭酸ガスを１〜１０体積％程度の割合で含む空気の雰囲気下で培養することが好ましい。炭酸ガスの好ましい濃度は、おおむね、３〜８体積％の範囲である。
【００４２】
培養時間は、上記免疫蛋白質の産生促進剤の免疫グロブリン産生効率によっても相違するが、おおむね、５時間〜２週間の範囲である。
【００４３】
このようにして培地中に免疫蛋白質を効率よく産生した後は、定法に従い、培地から固液分離して免疫蛋白質を単離し、必要に応じてアフィニティクロマトグラフィー等の液体クロマトグラフ法等を用いて精製することにより、所望の免疫蛋白質を取得することができる。
【００４４】
このようにして得られる免疫蛋白質、好ましくは前述する免疫グロブリンやサイトカイン（リンフォカイン、モノカイン）、より好ましくは免疫グロブリンは、例えば、免疫疾患治療薬、免疫機能検査薬の有効成分として広く用いることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４６】
実施例１
本実施例では、β−クリプトキサンチンが、ＩｇＭを産生するヒト型ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生に及ぼす影響を検討した。
【００４７】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチン（和光純薬工業株式会社製）をＤＭＳＯに溶解して図１に示すように３２〜４０００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを添加すると共に、ＨＢ４Ｃ５細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて６時間培養した。培養後、培地中に生成した免疫グロブリン（ＩｇＭ）の量を、抗ヒトＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００４８】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＭの産生量を測定した。
【００４９】
これらの結果を図１に示す。
【００５０】
図１より、β−クリプトキサンチンの添加によってＩｇＭは、ほぼ濃度依存的に増加し、最大濃度（４０００ｎｇ／ｍＬ）では、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＨＢ４Ｃ５細胞のＩｇＭ産生量が１．６倍に促進された。
【００５１】
実施例２
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス脾臓リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００５２】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図２（ａ）または図２（ｂ）に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した脾臓から脾臓リンパ球（１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡおよびＩｇＧ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、並びに抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５３】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡおよびＩｇＧの産生量を測定した。
【００５４】
ＩｇＡの結果を図２（ａ）に、ＩｇＧの結果を図２（ｂ）に示す。
【００５５】
図２より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス脾臓リンパ球のＩｇＡおよびＩｇＧの産生は、ほぼ濃度依存的に促進された。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で２．５倍に増加し、ＩｇＧは２５００ｎｇ／ｍＬの添加で約３．７倍にまで増加した。
【００５６】
実施例３
本実施例では、β−クリプトキサンチンの作用で、マウス脾臓リンパ球内において、ＩｇＡおよびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００５７】
詳細には、ＤＭＳＯに溶解したβ−クリプトキサンチンを終濃度５００ｎｇ／ｍＬで添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地で２４時間培養したＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した、ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAACである。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００５８】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００５９】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００６０】
ＩｇＡ−ｍＲＮＡの結果を図３（ａ）に、ＩｇＭ−ｍＲＮＡの結果を図３（ｂ）に、それぞれ示す。
【００６１】
図３（ａ）および図３（ｂ）より、β−クリプトキサンチンの刺激により、脾臓リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡおよびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性は、いずれも約２倍程度促進されることが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによるＩｇＡおよびＩｇＭの産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。
【００６２】
実施例４
本実施例では、培養系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、β−クリプトキサンチンがマウス腸管膜リンパ節リンパ球の抗体産生に及ぼす影響を調べた。
【００６３】
詳細には、１０μｇ／ｍＬインスリン、２０μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０μＭエタノールアミン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウムを添加したＩＴＥＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用意し、これに、β−クリプトキサンチンをＤＭＳＯに溶解して図４〜図６に示す濃度に調整したものを添加すると共に、６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスより摘出した腸間膜リンパ節からリンパ球（１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃、炭酸ガス体積５％−空気９５体積％の雰囲気下、湿度１００％の条件下にて２４時間培養した。培養後、培養上清中の免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の量を、抗マウスＩｇＡおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ、抗マウスＩｇＧおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ、並びに抗マウスＩｇＭおよびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭを用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定した。同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００６４】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生量を測定した。
【００６５】
ＩｇＡの結果を図４に、ＩｇＧの結果を図５に、ＩｇＭの結果を図６に、それぞれ示す。
【００６６】
図４〜図６より、β−クリプトキサンチンの添加により、マウス腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの産生は促進されることが分かった。詳細には、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べ、ＩｇＡは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約２．１倍に増加し、ＩｇＧは１５６ｎｇ／ｍＬの添加で約１．７倍に増加し、ＩｇＭは６２５ｎｇ／ｍＬの添加で約１．４倍に増加した。
【００６７】
実施例５
本実施例では、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における、β−クリプトキサンチンによる免疫蛋白質の産生促進効果を調べた。
【００６８】
詳細には、β−クリプトキサンチン（フナコシ株式会社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したものを用意した。次に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（約６週齢）を７匹／群に分け、各マウスに対し、下記要領でβ−クリプトキサンチンを１４日間経口投与した。
（Ａ）高用量投与群（上記濃度のβ−クリプトキサンチンを１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち１０ｍｇ／ｋｇ／日投与）
（Ｂ）低用量投与群（上記濃度のβ−クリプトキサンチン溶液をＤＭＳＯで５倍希釈し、濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した溶液を１ｍＬ／ｋｇ／日投与、すなわち２ｍｇ／ｋｇ／日）
（Ｃ）コントロール群（ＤＭＳＯのみ１ｍＬ／ｋｇ／日投与）
【００６９】
１４日間の経口投与終了後、１５日目にマウスを屠殺し、血清、脾臓細胞、および腸間膜リンパ節を採取した。脾臓細胞および腸間膜リンパ節から直ちにリンパ球を採取し、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）に接種し、３７℃で２４時間培養した。このようにして得られた培養後の上清中、および上記血清の各免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の量を、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて測定した。これらの結果を図７、８、１０に示す。
【００７０】
更に、脾臓リンパ球の上記培養後上清中のサイトカイン［詳細にはインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α］の各量を、測定キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。この測定キットは、酵素抗体法を基本としたものである。これらの結果を図９に示す。
【００７１】
また、上記と同様にして、脾臓リンパ球の上記培養後上清中の他のサイトカイン［詳細にはインターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）］の各量を、測定した結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
上記図７〜図１０には、Ｔｕｋｅｙ法による解析を行ってコントロール群と有意差のあった群にｐ値を示している。また、各図において、「なし」はコントロール群の結果を、「低」は低用量投与群の結果を、「高」は高用量投与群の結果を、それぞれ示している。
【００７４】
図７より、β−クリプトキサンチンの添加により、血清中の各抗体量は増加する傾向が見られた。特に高用量投与群のＩｇＡ産生量およびＩｇＭ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。なお、いずれの抗体についても、高用量投与群に比べて低用量投与群の方が、概して、抗体産生量が高くなる傾向が見られたが、これは、生体内における至適濃度が存在するためと考察される。
【００７５】
また、図８〜１０より、β−クリプトキサンチンの添加により、血清中の各抗体量の上昇に加え、脾臓や腸間膜リンパ節リンパ球に存在する免疫蛋白質の産生も上昇することが分かった。
【００７６】
詳細には脾臓細胞中の各抗体産生量の結果は図８に示すとおりであり、低用量投与群のＩｇＭ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。ＩｇＧでは、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示し、ＩｇＡでは、高用量投与群で上昇傾向を示した。
【００７７】
また、脾臓細胞中の各サイトカインの産生量の結果は図９および表１に示すとおりである。詳細には図９に示すように、ＩＦＮ−γの産生量は、低用量投与群および高用量投与群のいずれにおいても、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。ＴＮＦ−αについても、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示し、ＩＬ−４では、低用量投与群で上昇傾向を示した。また、表１に示すように、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のいずれにおいても、低用量投与群で上昇傾向を示し、特にＩＬ-６では、低用量投与群および高用量投与群の両方で有意な上昇が認められた。
【００７８】
また、腸間膜リンパ節リンパ球中の各抗体産生量の結果は図１０に示すとおりであり、低用量投与群のＩｇＭ産生量、並びに低用量投与群および高用量投与群のＩｇＧ産生量は、β−クリプトキサンチンを添加しないコントロール群に比べて有意に上昇した。また、ＩｇＡは、低用量投与群および高用量投与群の両方で上昇傾向を示した。
【００７９】
実施例６
本実施例では、β−クリプトキサンチンをマウスに経口投与したとき、腸間膜リンパ節リンパ球内において、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＭをコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写活性がどの様に変化するかを検討した。
【００８０】
詳細には、前述した実施例５において採取した腸間膜リンパ節リンパ球からセパゾール（ナカライテスク製）でＲＮＡを抽出し、逆転写後、リアルタイムＰＣＲ法によりｍＲＮＡの相対発現量を解析した。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した。ＩｇＡに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：TGCACAGCTTTCTTCTGCAC、リバース：TGCCAGCCTCACATGTACTC、ＩｇＭに対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：GGGGCACTGGTCACATACTT、リバース：CAGCTCGTGAGCAACTGAAC、ＩｇＧ１に対するｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマー配列は、フォワード：CACTGTTGACCCTGCATTTG、リバース：GCACACAGCTCAGACGAAAC、である。本実施例では、βアクチン遺伝子を内部標準物質として用いた。リアルタイムＰＣＲには、ステップワンプラスリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオサイエンス社製）を用いた。
【００８１】
同様の実験を３回繰り返して行い（ｎ＝３）、平均値±標準偏差（ＳＤ）を算出した。
【００８２】
比較のため、β−クリプトキサンチンを添加せずに上記と同様に培養を行い、ｍＲＮＡの相対発現量を解析した。
【００８３】
これらの結果を図１１に示す。
【００８４】
図１１より、β−クリプトキサンチンの経口投与により、腸間膜リンパ節リンパ球のＩｇＡ−ｍＲＮＡ、ＩｇＧ１−ｍＲＮＡ、およびＩｇＭ−ｍＲＮＡの転写活性はいずれも、上昇し、β−クリプトキサンチンの投与量が増加すると、これらの転写活性も上昇することが分かった。この実験結果より、β−クリプトキサンチンによる上記抗体の産生促進作用は、ｍＲＮＡの転写量の増加に起因すると推察される。すなわち、腸間膜リンパ節リンパ球の上記抗体産生の上昇は、リンパ球内の遺伝子発現レベルの上昇による可能性が示唆された。
【００８５】
以上の実験結果より、β−クリプトキサンチンは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも免疫蛋白質の産生促進効果を有することが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クリプトキサンチンを含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項２】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、または腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項２に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項４】
β−クリプトキサンチンを非ヒト動物に投与して免疫蛋白質の産生を促進する方法。
【請求項５】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、または腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項５に記載の方法。
【請求項１】
β−クリプトキサンチンを含有することを特徴とする免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項２】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項１に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、または腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項２に記載の免疫蛋白質の産生促進剤。
【請求項４】
β−クリプトキサンチンを非ヒト動物に投与して免疫蛋白質の産生を促進する方法。
【請求項５】
前記免疫蛋白質は免疫グロブリンおよび／またはサイトカインである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、前記サイトカインはインターフェロン−γ、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン１０、または腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αである請求項５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１８０３０３（Ｐ２０１２−１８０３０３Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４３８５０（Ｐ２０１１−４３８５０）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５０７１９２３７８）伊方サービス株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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