全フェノールに富む組成物を製造するための効果的方法
本発明は、粗製植物抽出物から全フェノールに富む組成物を製造する方法を与える。この方法は、臭素化ポリスチレン樹脂を用いた新規なカラム精製を含む。本発明は、全フェノールに富む組成物も含む。富化した組成物は、単量体、オリゴマー、及び重合体フェノールを含み、図１０〜１３に記載したのと実質的に同じＨＰＬＣクロマトグラムを有することを特徴とする。本発明は、呼吸器合胞体ウィルスのようなＰａｒａｍｙｘｏｖａｒｉｄａｅ、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣ、パラインフルエンザのようなＯｒｔｈｏｍｙｏｘｏｖａｒｉｄａｅ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２のようなヘルペスウィルス、及び西ナイルウィルスのようなＦｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓに感染した人間を含めた温血動物を処置し、関節炎、ストレス、及び消化器疾患により起こされるような炎症を処置するための全フェノールに富む組成物を用いる方法を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年１１月２２日に出願された「全フェノールに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１０／３０２，２６４の優先権を主張するものであり、その出願は、２００１年８月３０日に出願した「アントシアニンに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／９４３，１５８、及び２０００年８月３１日に出願した「アントシアニンに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許仮出願Ｎｏ．６０／２２９，２０５に関する主題を含んでいる。それらは全て、この言及により全体的にここに入れてある。
【０００２】
本発明は、植物材料からフラボノイド化合物を抽出及び精製することに関し、特に全フェノールに富む組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイド化合物は、あらゆる植物領域部分に存在し、皮、樹皮、及び種子の中に高濃度で見出されている。そのような化合物は、お茶、ココア、及びワインのような植物起源の数多くの飲み物の中にも見出されている。フラボノイドは、ポリフェノールと呼ばれている大きな系列の化合物の中の一つである。即ち、これらの化合物は、一つ以上の芳香族環に二つ以上のヒドロキシル基（ＯＨ）を含んでいる。ポリフェノール、特にフラボノイドの物理的及び化学的性質、分析、及び生物学的活性は、長年に亙って研究されてきた。
【０００４】
アントシアニンは、多くの果実、野菜、粒状穀物、及び花の赤色、紫色、及び青色の原因になっている天然産のフラボノイド化合物の特別な種類のものである。例えば、ブルーベリー、ビルベリー、ストロベリー、ラズベリー、ボイゼンベリー、マリオンベリー、クランベリー、エルダーベリー等のような果物の色は、多くの異なったアントシアニンによるものである。自然界には構造的に３００を越える異なったアントシアニンが判別されている。アントシアニンは天然産なので、それらは食物及び飲料の着色剤として使用するため大きな関心を集めている。
【０００５】
最近、食物の酸化防止剤として健康に有益な可能性を持つため、アントシアニン色素に対する関心が高まってきた。例えば、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）のアントシアニン色素は、以前から見た目の鮮やかさを改良し、循環器障害を処置するために用いられてきている。或るアントシアニン及び他のフラボノイドが抗炎症性を有することが実験的に証明されている。更に、糖尿病及び潰瘍を処置するのにアントシアニンの経口投与が有益であり、抗フィルス及び抗菌活性を有するであろうと言う報告もある。フラボノイドのこれらの望ましい性質についての化学的根拠は、それらの酸化防止能力に関係していると考えられる。従って、イチゴ類及び他の果物及び野菜に伴われる酸化防止特性は、それらに含まれるアントシアニンに起因するものとされてきている。
【０００６】
「オリゴマー系プロアントシアニジン」、「ＯＰＣ」、又は「プロシアニジン」としても知られているプロアントシアニジンは、果物、野菜、ナッツ、種子、花、及び樹皮で広く入手することができる別の種類の天然産フラボノイド化合物である。プロアントシアニジンは、縮合タンニンとして知られている範疇に属する。それらは、果物及び野菜の中に見出される最も一般的な種類のタンニンであり、種子及び皮に多量に存在する。自然界では、異なったプロアントシアニジンの混合物が、個々の単位から、多くの結合単位の複雑な分子（オリゴマー又はポリマー）までの範囲で、一般に一緒に見出されている。重合体プロアントシアニジンの一般的化学構造は、共通のＣ（４）−Ｃ（６）及び／又はＣ（４）−Ｃ（８）結合によって一緒に結合されたフラボノイド３−オール単位の直鎖を含む。重合体プロアントシアニジンの構造を判定するのに１３Ｃ ＮＭＲが使用されてきており、最近の研究は、二、三、及び四量体プロアントシアニジンの化学を解明してきている。フラボノイド３−オール単位の一層長いオリゴマーは、殆どの植物に広く行き渡っており、２，０００ダルトンより大きな平均分子量を持ち、６以上の単量体単位を有することが見出されている〔ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）、その他、Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，２５：１１８（１９８７）〕。
【０００７】
かなりの最近の研究で、プロアントシアニジンの酸化防止活性によって主に知られているその治療用途が開発されてきた。しかし、これらの化合物は、抗菌性、抗ウィルス性、抗癌性、抗炎症性、抗アレルギー性、及び血管拡張性作用を示すことも報告されている。更に、それらは脂質過酸化、血小板凝集、毛細管透過性、及び脆弱性を阻止し、ホスホリパーゼＡ２、シクロオキシゲナーゼ、及びリポキシゲナーゼを含む酵素系に影響を与えることが見出されている。例えば、プロアントシアニジン単量体（即ち、アントシアニン）及び二量体は、増大した毛細管脆弱性に伴われる疾病の処置に用いられており、動物の抗炎症効果を有することも示されている〔ベラジ（Ｂｅｌａｄｉ）その他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２８４：３５８（１９７７）〕。これらの報告された発見に基づき、オリゴマープロアントシアニジン（ＯＰＣ）は、数多くの症状を処置するための有用な成分になるであろう〔Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．５（２）：１４４−１５１（２０００）〕。
【０００８】
プロアントシアニジンは、ウィルスからも保護することができる。イン・ビトロ研究では、マンサク（ｗｉｔｃｈ ｈａｚｅｌ）からのプロアントシアニジンは、単純ヘルペス１（ＨＳＶ−１）ウィルスを殺した〔Ｃ．Ａ．チナルト（Ｃｉｎａｌｔ）、Ｊ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ：６２（３）：２４１−５（１９９６）；デブルーイン（ＤｅＢｒｕｙｎｅ）Ｔ．、ピーターズ（Ｐｉｅｔｅｒｓ）Ｌ．、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｊｕｌ：６２（７）：９５４−８（１９９９）〕。種々のタンニンの抗ウィルス活性の構造・活性度関係を決定するために別の研究が行われた。化学構造を縮合する程、抗ウィルス効果は大きくなることが見出された〔タケチ（Ｔａｋｅｃｈｉ）Ｍ．、その他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｙ，２４：２２４５−５０（１９８５）〕。別の研究では、プロアントシアニジンが抗単純ヘルペス活性を有することが示されており、その場合単純ヘルペスプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を減少させるのに必要な５０％効果量は、５０％細胞毒量よりも２〜３桁小さかった〔フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）Ｋ．、その他、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１１：２８５−２９８（１９８９）〕。
【０００９】
植物生成物の抗炎症効果を測定するため、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２）、又はプロスタグランジン・エンドペルオキシドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ−１、ＰＧＨＳ−２）酸素が広く用いられている〔バイヤー（Ｂａｙｅｒ）Ｔ．、その他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｙ，２８：２３７３−２３７８（１９８９）；及びゴーダ（Ｇｏｄａ）Ｙ．、その他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２４５２−２４５７（１９９２）〕。ＣＯＸ酵素は、非ステロイド系抗炎症剤のための薬理学的標的個所である〔フメス（Ｈｕｍｅｓ）Ｊ．Ｌ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：２０５３−２０５６（１９８１）；及びローメ（Ｒｏｍｅ）Ｌ．Ｈ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２：４８６３−４８６５（１９７５）〕。プロスタグランジン合成で含まれるシクロオキシゲナーゼの二つのアイソザイムは、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）である〔ヘムラー（Ｈｅｍｌｅｒ）Ｍ．、その他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５：２５１，５５７５−５５７９（１９７６）〕。選択的ＣＯＸ−２抑制剤は主に抗炎症活性の原因になることが仮定されている〔マスフェラー（Ｍａｓｆｅｒｒｅｒ）Ｊ．Ｌ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：３２２８−３２３２（１９９４）〕。フラボノイドは、現在抗炎症性物質としてのみならず、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）抑制活性に対するそれらの構造的特徴のために研究されつつある。
【００１０】
アントシアニン及びプロアントシアニジンの上記特性及び利点により、果物、野菜、及び他の植物源からそれらの化合物を抽出することに多くの努力が払われてきた。プロアントシアニジン及びアントシアニンの外に、植物、果物、及び野菜は、ミネラル塩、クエン酸又は酒石酸のような一般的有機酸、炭水化物、フラボノイドグルコシド、及びカテキンのような他の化合物も含んでいる。アントシアニン及びプロアントシアニジンを、他の天然産化合物から分離することが屡々望ましい。アントシアニンは、種々の方法により植物及び果物から抽出されてきた。アントシアニンを抽出する一つの方法は、両性イオン性物質を形成するために硫酸水素塩の添加を用いている。抽出物を、イオン交換カラムに通し、それにより両性イオン性アントシアニン付加物を吸収し、その吸収されたアントシアニンをアセトン、アルカリ、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により樹脂から溶離する。この方法の欠点には、硫酸水素塩が存在することが含まれ、それがアントシアニンの吸着を妨害し、それにより多数のカラム吸着を必要とすることである。アルカリによる溶離はアントシアニンをかなり劣化するが、ＤＭＦは認められた食品添加物ではなく、従って、アントシアニンを食物製品に添加する前に完全に除去しなければならない。
【００１１】
これらのフラボノイド化合物を捕捉するためには、よく規定された正確な処理及び分離技術が必要である。ナフィシ・モバガール（Ｎａｆｉｓｉ−Ｍｏｖａｇｈａｒ）、その他による米国特許第５，９１２，３６３号明細書には、植物材料からプロアントシアニジンを抽出し、精製する方法で、植物材料の水性混合物を加熱し、その水溶液を限外濾過膜に通して濾過し、大きな分子量の重合体及び粒子を除去し、抽出されたプロアントシアニジンを含む透過液を生成させ、その透過液を、プロアントシアニジンを保持し、放出することができる吸着材料と接触させ、その保持されたプロアントシアニジンを極性溶媒で溶離することにより液体からプロアントシアニジンを分離することを含む方法を記載している。しかし、この方法は、非常に高い抽出温度を用いており、それがプロアントシアニジンの劣化を起こすことがある。更に限外濾過は、最終生成物から低分子量ポリフェノール物質を幾らか除去する。
【００１２】
種々の植物材料からプロアントシアニジン及び／又はアントシアニンを抽出及び分離する当分野で知られている多くの方法は、毒性及び／又は環境に有害な物質を用いている。従って、プロアントシアニジンを分離し、精製するために入手できる現在の方法は、その方法の全体的実行で種々の化学物質及び溶媒の廃棄についての考慮が重要な役割を果たす効率的な商業的方法まで規模を拡大することは容易なことではない。更に、プロアントシアニジン及びアントシアニンは、それらの劣化し易い自然的傾向を最少にするやり方で分離しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、栄養剤及び医薬で用いるためにプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を含む組成物を分離し、精製する効率的な方法で、コスト的に効果的で、規模を大きくすることができ、経済的に健全であり、毒性溶媒又は薬品を用いる必要はなく、植物材料からフェノール化合物を、それらの劣化し易い傾向を最少にするやり方で分離する方法が依然として要求されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、全フェノールに富む組成物の抽出、分離、精製のための簡単で経済的な方法を与える。特に本発明の一つの態様は、（ａ）フェノール化合物を含有する一種類以上の植物材料の粗製抽出物で、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の少量のフェノール及び非フェノール化合物を含む抽出物を与え；（ｂ）前記粗製抽出物を濾過し；（ｃ）前記粗製抽出物を、前記フェノールを放出可能に吸着するが、非フェノール化合物は実質的に保持しない臭素化ポリスチレン樹脂と接触させ；（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄し、前記非フェノール化合物を溶離し；（ｅ）前記樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノールを含む第一フラクションを収集し；（ｆ）前記樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノールを含む第二フラクションを収集し；そして（ｇ）前記工程（ｅ）又は工程（ｆ）からのフラクションを分離するか、又は工程（ｅ）及び（ｆ）からの前記フラクションを一緒にし、全フェノールに富み、前記非フェノール化合物が殆ど無くなった組成物を得る；ことを含む全フェノールに富む組成物を製造する方法を与える。本発明は、更に、本発明の方法により分離された全フェノールに富む組成物を与える。
【００１５】
本発明は、更に、全フェノールに富む組成物を精留し、非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する方法を与える。本発明は、更に極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物を与える。極性プロアントシアニジンは、非極性プロアントシアニジンとは異なった生物学的活性を有することが判明した。
【００１６】
本発明の全フェノールに富む組成物を、Ｃ−１８親油性カラムで逆相ＨＰＬＣにより分析すると、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍで吸収を示す化合物の複数の組の特性溶離ピークが観察される。特に、本発明の全フェノールに富む組成物は、ここに記載したようにＨＰＬＣ分析を行なった時、図１０〜１３に例示したのと実質的同じＨＰＬＣトレースで６０〜７５分の間の領域で一組の特性溶離ピークを有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の全フェノールに富む組成物をＩＲ分光測定により分析した場合、図３３〜４０に示したのと実質的に同じような化合物の特性吸収ピークが観察される。本発明の組成物は、栄養剤及び医薬として有用である。例えば、本発明の組成物は、抗感染（例えば、抗ウィルス、抗ＵＴＩ、及び抗菌）剤及び抗炎症剤として有用である。
【００１８】
本発明の前記及び他の特徴、有用性及び利点は、本発明の好ましい態様についての次の一層特別な記述から、図面に例示したように、また特に特許請求の範囲で指摘するように、明らかになるであろう。
【００１９】
ここに組込み、明細書の一部を形成する図面は、本発明の態様を例示するが、本発明を限定するものではなく、その記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【００２０】
本発明の詳細な記述
本発明は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのような天然にフェノール化合物を含有する植物材料から全フェノールに富む組成物を製造する方法を与える。本発明の方法は、更に全フェノールに富む組成物を与える。
【００２１】
ここで用いる用語「抽出」とは、全植物から、又は果実、葉、茎、根、樹皮等のような植物の種々の部分から、調製された抽出物を含めた、天然にフェノール化合物を含む植物源から誘導された物質を指す。従って、本発明の方法は、抽出物を調製するのに用いられる植物の特定の部分に限定されるものではない。本発明の方法は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのどのような原料でも用いることができ、最も典型的には、種子、果実、皮、野菜、ナッツ、樹皮、及びフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、フェノール化合物を含むことが知られている。フェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。植物原材料は、そのまま（湿潤状態で）用いてもよく、又は抽出する前に乾燥してもよい。場合により植物原材料は、抽出前に、アントシアニン及びプロアントシアニジン含有量の低い成分を分離及び除去することにより分類してもよい。
【００２２】
一つの態様として、本発明のフェノールに富む組成物は、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、及びグレープ（それらに限定されるものではない）を含めた、フェノール化合物を含む一種類以上のイチゴ類及び／又は果実を抽出し精製することにより得られる。
【００２３】
ここで用いられる用語「フェノール」及び「フェノール化合物」は交換することができるものとして用いられており、一つ以上のフェノール基を有する単量体、オリゴマー、及び重合体化合物が含まれ、アントシアニン、プロアントシアニジン、及びフラボノイドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２４】
ここで用いられる用語「全フェノールに富む組成物」（“ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”）とは、一種類以上のフェノール化合物に富み、植物、果実、イチゴ類、及び野菜の粗製抽出物中に存在する非フェノール化合物が実質的になくなったレベルになっている組成物を指す。そのような非フェノール化合物の例には、砂糖、セルロース、ペクチン、アミノ酸、タンパク質、核酸、植物ステロール、脂肪酸、及びトリグリセリドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の方法は、慣用的ポリスチレン樹脂又は他の当分野で用いられている樹脂によるよりも、臭素化ポリスチレン樹脂でフェノール含有抽出物を精製すると、下で詳細に論ずるように、一層大きな純度を有する全フェノールに富む組成物を与えると言う発見に基づいている。
【００２６】
図１は、全フェノールに富む組成物を製造することができる本発明の方法の一つの態様の工程を示す製造工程図である。本発明の方法は、幾つかの処理工程を除き、その処理で必要な薬剤の量を減少し、それにより製造コスト及び廃棄物を捨てる問題を少なくすることにより、経済的及び効率的に全フェノールに富む組成物を得る方法を与える。
【００２７】
本発明の方法の一つの態様として、図１の工程１０〜７０に例示したように、フェノール化合物（例えば、プロアントシアニジン及びアントシアニン）及び非フェノール化合物を、新しい又は乾燥した触媒材料から抽出する（工程１０）。当業者は、バット（ｖａｔ）抽出、浸出、向流抽出等のような種々の抽出法が文献で得られることを認めるであろう。特別な抽出方法を用いることは本発明の方法に本質的なことではない。抽出処理の前に植物材料を或る程度粉砕することは、接触させる抽出溶媒に対し充分な粒子表面積を与える筈である。
【００２８】
図１に示した方法の一つの態様として、抽出工程（工程１０）は、適当な量の抽出溶媒中に新しい又は乾燥した植物材料を入れることにより達成される。一つの態様として、抽出溶媒は、水の中に約０〜９５％のエタノールを入れ、約０〜３％、一層好ましくは約０．００６〜０．０１２重量％の量の適当な酸を含む酸性化アルコール溶液を含む。別の態様として、抽出溶媒は、水の中に約０〜１００％のメタノール、及び約０〜３重量％の適当な酸を含む酸性化アルコール溶液を含む。抽出工程で用いることができる適当な酸には、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、酢酸（ＨＯＡｃ）、又は塩酸（ＨＣｌ）が含まれるが、それらに限定されるものではない。抽出溶液に酸を添加することは、プロアントシアニジン及びアントシアニンの劣化を防ぐ。従って、一つの態様として、図１に例示したような本発明の方法の工程の殆どに亙って、酸性状態を維持する。植物材料を抽出溶液と適当な長さの時間、ほぼ室温から７５℃、好ましくは４０℃の温度で接触させ、粗製抽出物を形成する。抽出処理で用いられる抽出溶媒に対する植物材料の量は、ｇ／ｍｌの基準で、約２：１〜約１：２０の範囲にある。一つの態様として、植物材料対抽出溶媒の比は、約１：４〜１：８である。
【００２９】
粗製抽出物は、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノールのようなフェノール化合物のみならず、砂糖、ペクチン、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセリド、及び他の化合物のような望ましくない非フェノール物質も含む。粗製抽出物中に含まれている固体残留物を液体部分から分離し、それら固体を上に記載したように再抽出するか、又は廃棄する。
【００３０】
工程１０（図１）の一つの態様として、抽出処理の前又はその間に、植物材料又は抽出溶媒にペクチナーゼを添加する。別法として、抽出処理が完了した後の粗製抽出物にペクチナーゼを添加してもよい。ペクチナーゼは、抽出処理中、又はその後のいずれかの点で抽出物がゲル化するのを防ぐ働きをし、その結果抽出物はカラム精製中流動性を維持するであろう。ペクチナーゼの添加量は、勿論抽出物を製造するのに用いられる植物材料の量に依存するであろう。典型的には、ペクチナーゼは、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で添加する。
【００３１】
続けて図１を参照して、工程１０で粗製抽出物を製造するためにエタノール性又はメタノール性抽出溶媒を用いた場合、粗製抽出物が含むエタノール又はメタノールが６％より少なくなるまで粗製抽出物を濃縮し、好ましくは濃縮中４０℃以下の温度を維持しながら濃縮する（工程２０）。濃縮粗製抽出物を希釈するため水を添加し、その希釈した粗製抽出物を工程３０前に濃縮し、水で再び希釈するか、又は第二希釈を行わずに工程３０へ直接送る。勿論、粗製抽出物を製造する際に抽出溶液として水を用いたならば、工程２０は不必要であり、この場合、工程１０からの粗製抽出物を、図１の点線矢印で示したように、工程３０へ直接導入する。
【００３２】
図１で示した方法の工程３０は、工程１０又は２０からの粗製抽出物を濾過して、粗製抽出物から沈殿していることがある固体を除去することを含む。本発明者は、工程１０について記述したように、抽出条件を調節することにより、工程３０で濾過することにより粗製抽出物から沈殿した望ましくない非フェノール化合物の量が増大することを発見した。本発明の方法の濾過工程３０では、種々の濾過方法を用いることができる。工程３０で用いることができる一つの濾過方法は、測定した量の、珪藻土又はセルロースのような濾過助剤を粗製抽出物へ添加することを含む。粗製抽出物と濾過助剤との混合物は、均質になるまで振盪又は撹拌し、フィルター助剤の床に通して濾過するのが好ましい。その床は酸性水溶液、好ましくは約０．００６％の硫酸水溶液で洗浄する。
【００３３】
図１の工程３０に用いることができる他の濾過方法には、砂の床、又は好ましくはガラスウールで覆った３０μのポリプロピレンフィルターを通して粗製抽出物を濾過することが含まれる。更に別の濾過方法は、袋フィルター（ポリエチレン又はポリプロピレンから構成された袋型の布フィルター）を用いることが含まれ、それは、下に記載する工程４０の精製カラムとインライン状態に配置するのが有利であろう。上に記載したフィルターは、沈澱した固体を除去するために用いられ、粒径分離フィルターではない。
【００３４】
図１に示した方法に従いフェノール化合物を分離するためには、工程３０で分離した濾過抽出物を、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を放出可能に吸着することができる臭素化ポリスチレン吸着材料と接触させるが、それは、濾過抽出物中に存在していた望ましくない非フェノール材料は余り保持しない。本発明者は、全フェノールに富む高純度組成物は、工程３０で分離した濾過抽出物を、ミツビシ・ケミカル・アメリカにより製造されているＳＰ−２０７〔スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルバニア州ベラフォンテ〕のような臭素化ポリスチレン樹脂で精製することにより得ることができると言うことを発見した。ＳＰ−２０７樹脂は、逆相クロマトグラフィー用として設計されたマクロポーラスな臭素化スチレン重合体ビーズ型の樹脂であり、約２５０〜６００μの粒径分布、及び約１００〜３００Åの気孔孔径範囲を有する。芳香族環の臭素化は、ポリスチレン樹脂に増大した疎水性を与え、従来のスチレン・ジビニルベンゼン重合体逆相支持体に比較して疎水性分子に対する選択性が増大した樹脂を与えるように設計されている。臭素化ポリスチレン樹脂は、強い結合性のため、典型的には天然の生成物の精製には用いられてはいない。
【００３５】
このように、慣用的ポリスチレン樹脂は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を余りにも強く結合する傾向を持つため、ポリスチレン樹脂からそのような化合物を溶離することは非常に困難であることが知られており、そのため、臭素化ポリスチレン樹脂はフェノール化合物を更に一層強く結合するであろうと予想されていた。従って、臭素化ポリスチレン樹脂がフェノール化合物の精製に適していると言うことは予想されていなかったことである。しかし、本発明者は臭素化ポリスチレン樹脂が、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物と結合する強さは、非臭素化ポリスチレン樹脂よりも弱く、然も、依然としてフェノール化合物を、望ましくない非フェノール化合物から分離することができると言うことを驚いたことに予想外に発見した。
【００３６】
図１に示した方法の一つの態様として、工程３０で分離した濾過抽出物を、約２５０〜６００μの粒径分布及び約１００〜３００Åの気孔孔径範囲を有する臭素化ポリスチレン樹脂を充填したカラムにロード（ｌｏａｄ）する（工程４０）。しかし、工程４０はここではカラムに充填した樹脂と抽出物とを接触させると言う表現でここでは記述しているが、そのような記述は単に説明をし易くするためのものである。例えば、樹脂は本発明の方法を遂行するためにカラムの中へ充填する必要はない。カラムにロードする濾過抽出物の量は、粗製抽出物を調製するために用いられる植物材料に依存する。例えば、粗製抽出物をビルベリーから調製する場合には、全フェノールの約１６〜３０ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。別の例として、粗製抽出物をブルーベリーから調製する場合、全フェノールの約１５〜４５ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。粗製抽出物をエルダーベリーから調製する場合、全フェノールの約１５〜４０ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。濾過抽出物は、濃厚な粗製抽出物中の固体濃度が２００ｇ／ｌを越えるならば、ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）する前に水で希釈してもよい。工程４０（図１）でカラムにローディングしている間に溶離してくるフラクションは、「フラクション１」として収集する。
【００３７】
濾過粗製抽出物を樹脂にローディングした後、吸着剤に殆ど又は全く親和力を持たない望ましくない非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸等）を、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液のような少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶媒で樹脂から溶離する（図１、工程５０）、例えば、約３カラム体積の０．００６％の硫酸水溶液又は０．１％の酢酸水溶液を用いて余計な物質を溶離することができる。その溶離物を「フラクション２」として収集する。
【００３８】
続けて図１を参照し、カラムを次に約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶媒を含む第一溶離剤で溶離する（工程６０）。工程６０では、約２〜１２カラム体積の溶離用溶媒を用いるのが典型的である。一つの態様として、第一溶離剤は、硫酸、塩酸、又は酢酸のような酸を約０．００３％含有する。溶離工程６０中に収集されたフラクション（単数又は複数）は、「フラクション３」として収集する。「フラクション３」は、粗製抽出物中に含まれていたフェノール化合物の一部分を含有し、特にアントシアニンに富み、プロアントシアニジンを含む。
【００３９】
ＵＶ−ＶＩＳ分光分析により決定して、アントシアニンの大部分がカラムから溶離された後、アントシアニンを溶離するために用いた溶媒（工程６０）よりも一層大きな％のエタノール又はメタノールを含有する極性有機溶媒を含む第二溶離剤でカラムを溶離する（工程７０、図１）。例えば、第二溶離剤は、約５０〜９０％のエタノール／水、又は約７５〜１００％のメタノール／水を含む。溶離工程７０中で収集されたフラクション（単数又は複数）は、「フラクション４」として収集する。「フラクション４」には、粗製抽出物中に最初に含まれていたフェノール化合物の次の部分が含まれており、典型的には、プロアントシアニジンに富んでいる。「フラクション４」は、溶離工程６０で分離されなかったアントシアニンも含んでいることがある。
【００４０】
「フラクション３」及び「フラクション４」中のフェノール化合物の回収は、蒸発、蒸留、冷凍乾燥等のようなどのような慣用的やり方で達成してもよく、本発明の全フェノールに富む組成物を与えることができる。
【００４１】
上で述べた方法は、エルダーベリー、プラム、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモを（それらに限定されるものではない）を含めたフェノール化合物を含む種々の植物材料から栄養剤として用いるための全フェノールに充分富む組成物を製造するのに適している。一つの態様として、本発明の富化組成物は、少なくとも１０〜８０％の全フェノールを含有する。別の態様として、それら組成物は、少なくとも１２％の全フェノールを含有する。更に別の態様として、それら組成物は、少なくとも２５％の全フェノールを含有する。
【００４２】
特に果物及びイチゴ類から製造された、全フェノールに富む組成物、特に「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せから分離された組成物は、果物及びイチゴ類とは別の植物材料から製造された組成物のＨＰＬＣクロマトグラムには含まれていない、図１２及び１３に示されているもののような特性ピークを有する同様なＨＰＬＣクロマトグラムを生ずることが発見された。例えば、図１に例示した方法に従って、果実及びイチゴ類から製造され、「フラクション４」から分離された全フェノールに富む全ての組成物のＨＰＬＣクロマトグラムは、エルダーベリーから分離された「フラクション４」組成物について図１２及び１３で示したクロマトグラム中のピークと同様に、６０〜７５分の間の特性ピークを含むことが判明した。「フラクション３」「フラクション４」、又はそれらの組合せのいずれかから分離され、特に果物及びイチゴ類から製造された本発明の全フェノールに富む組成物は、下で詳細に記述するように、抗感染（例えば、抗ウィルス）及び抗炎症活性を有する。
【００４３】
本発明の全フェノールに富む組成物をＩＲ分光測定により分析すると、フェノール化合物からの特性ピークも観察される。特に、本発明の全フェノールに富む組成物は、図３３〜４０に例示したのと実質的に同じＩＲ吸収ピークを有することを特徴とする。
【００４４】
全フェノールに富む組成物（例えば、「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せ）は、例１１に詳細に記述し、図１５に示したように、Ｃ−１８のような逆相親油性カラムによる低圧真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）を用いて更に「極性」プロアントシアニジンに富むフラクションと、「非極性」プロアントシアニジンに富むフラクションへ分配することができることも発見された。例えば、エルダーベリー抽出物から分離された「フラクション３」組成物を水に溶解し、Ｃ−１８カラムにロードする。そのカラムを１００％の水で洗浄し、Ｃ−１８媒体により強くは保持されていなかった物質を収集した。流通洗浄フラクションを「フラクション５」として一緒にし、一層極性のプロアントシアニジンを含んでいた。従って、「フラクション５」を、ここでは「極性」プロアントシアニジンに富む留分として言及する（図１５）。エルダーベリーからの極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」は、幾らか紫色を有するのが典型的であり、このフラクション中の重合体がオリゴマープロアントシアニジン鎖中に一つ以上の陽イオン性アントシアニジン・サブユニットを含んでいることを示唆している。次にＶＬＣカラムを、３０〜１００％のメタノールで溶離し、低圧カラムで用いたＣ−１８媒体により一層強く保持されていたプロアントシアニジンを収集した。メタノールフラクションを「フラクション６」として一緒にし、「フラクション５」に収集されたものよりも極性の低いプロアントシアニジンを含んでいた。従って、「フラクション６」は、ここでは「非極性」プロアントシアニジンに富むフラクションとして言及する（図１５）。非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」は、色があったとしても極めて僅かであり、このフラクション中のオリゴマープロアントシアニジン鎖は、陽イオン性アントシアニジン・サブユニットを含まないことを示唆している。
【００４５】
従って、本発明は、「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せの中に含まれている非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する便利な方法を与える。極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」及び非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」は、濾過した粗製水性抽出物（図１、工程３０）をＣ−１８ＶＬＣカラムに直接ローディングすることにより分離することができることも判明した。分離したプロアントシアニジンに富むフラクション５及び６を記載するのに用いた場合の用語「極性」及び「非極性」は、夫々、フラクション５及び６中のプロアントシアニジンの極性が互いに対し相対的なものであること、即ち、Ｃ−１８ＶＬＣカラムでの特定のフラクションがどのように挙動するかに言及したものであることを理解すべきである。本発明の極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション５）及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション６）は、実施例で論ずるように、アントシアニンのレベルが実質的に減少している。
【００４６】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション（夫々、「フラクション５」及び「フラクション６」）は、異なった生物学的活性を有することが判明しており、非極性フラクションは、例１７に記載するような或る検定では極性フラクションよりも大きな抗ウィルス活性を有することが判明している。
【００４７】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション５及び６の各々は、夫々、図１５に示し、例１２〜１４に記載するように、更に精製することができる。例えば、ＶＬＣ分離中に分離された極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」は、準分取（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムにロードし、それにより極性プロアントシアニジンを放出可能に保持することができる。次にそのカラムを、アセトニトリル、メタノール、又はエタノールをそれらの％が増大していくようにして含む濃度勾配を持つ溶媒で洗浄し、アントシアニン及び他の極性化合物の殆どを溶離し、次に少なくとも６０％のアセトニトリル、メタノール、又はエタノールで洗浄し、精製された極性プロアントシアニジンを含む「フラクション７」を溶離する（図１５）。更に、ＶＬＣ分離中に分離された非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」を、更にゲル濾過、又は逆相準分取ＨＰＬＣにより精製することができる。ゲル濾過は、サイズ排除又はゲル浸透クロマトグラフィーとも呼ばれており、分子をそれらの大きさに従い分離する液体クロマトグラフィー技術である。この種の媒体は、小さな化合物を保持するが、大きな非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション８」（図１５）は、流通する溶離剤によって溶離する。本発明の精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション７及び８は、夫々アントシアニン及びフラボノイドのレベルが実質的に減少しており、非フェノール化合物のレベルも実質的に減少している。精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション７」及び「フラクション８」は、夫々、異なった生物学的活性を有することが更に観察された。
【００４８】
本発明の全フェノールに富む組成物（「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せ）、極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション５及び７）、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション６及び８）は、或る範囲の生物学的活性を有する。例えば、本発明の組成物は、例１５及び１６に記載するように、抗ウィルス活性を有することが見出された。本発明の組成物は、それらを単独で用いるか、又は他の抗ウィルス剤と組合せて用い、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣ、パラインフルエンザウィルス、アデノウィルス型１、Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏウィルスＡ、単純ヘルペスウィルスＩ及びＩＩ、ライノウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、麻疹ウィルス（それらに限定されるものではない）を含めたウィルスによるウィルス感染により引き起こされた又はそれらと合併した病気を予防及び／又は処置するのに用いることができる。従って、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、そのようなウィルスにより引き起こされた病気に対し、本発明の組成物を治療として有効な量投与することにより予防及び治療用途で有利に用いることができる。
【００４９】
プロアントシアニジンは、それらがシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性を阻害することによる抗炎症物質として研究されてきている。抗炎症性物質は、ＣＯＸ−１阻害よりもむしろＣＯＸ−２阻害に対し選択性であることが望ましいことが示されてきている。従って、本発明の別の態様は、治療に有効な量の本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を投与することを含む哺乳類の炎症性疾患を処置する方法を含む。例えば、ブルーベリー抽出物の精製中、フラクション３及び４として分離された全フェノールに富む組成物は、大きなＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１阻害選択性及び１０８μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有することが判明した（例１７）。本発明の組成物は、単独で用いるか、又は他の抗炎症剤と組合せて用い、炎症反応を防止又は阻止することができる。そのような反応は、骨関節症、アレルギー性鼻炎、心臓血管系疾病、上気道疾病、創傷感染、神経炎、及び肝炎（それらに限定されるものではない）を含めた症状又は疾病により起こされることがある。
【００５０】
クランベリー及びブルーベリーから分離されたプロアントシアニジンは、バクテリアが膀胱壁に付着するのを防ぎ、それにより尿路感染のような疾患の可能性を減少することが知られている〔ホウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）、その他、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３９：１０８５−１０８６（１９９８）〕。プロアントシアニジンはバクテリアの付着を防ぐことによりそれらの効果を及ぼすものと仮定されている。従って、本発明の別の態様は、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物をそのような感染に伴われる症状を予防、減少、又は排除するのに充分な量の効果的な量で投与することを含む哺乳類の泌尿生殖器感染を予防又は処置する方法を含む。本発明の組成物は単独で用いるか、又は他の抗菌剤と組合せて用いることができる。
【００５１】
プロアントシアニジンは、強力な酸化防止剤であることも知られている。例えば、プロアントシアニジンの酸化防止剤としての効果は、心臓血管系及び免疫系に対するそれらの薬効の多くの原因になっていると推定されている。従って、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、人間及び哺乳類の食事の補充剤（例えば、食事の抗酸化剤）として、及び疾患の処置のために用いることができる。例えば、本発明の組成物は、目に見える激しさを改善し、循環系疾患、糖尿病、及び潰瘍を処置するために用いることができる。
【００５２】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、アラビノガラクタン、エキナセア種、ビタミン類、ミネラル類、多糖類、及び距骨（それらに限定されるものではない）を含む、免疫活性剤と組合せることもできる。
【００５３】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイド（それらに限定されるものではない）を含めた抗突然変異剤と組合せることもできる。
【００５４】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、丸薬、カプセル、液体、チンキ剤として配合してもよい。本発明による組成物を配合する場合、広い範囲の賦形剤を用いることができ、勿論、それらの性質は、組成物の目的とする用途方式に依存するであろう。賦形剤の例には、防腐剤、キャリヤー、緩衝剤、濃化剤、懸濁剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び芳香剤、特にカルボキシビニル重合体、プロピレングリコール、エチルアルコール、水、セチルアルコール、飽和植物トリグリセリド、脂肪酸エステル又はプロピレングリコール、トリエタノールアミン、グリセロール、澱粉、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、硫酸ラウリル、燐酸二カルシウム、レシチン等が含まれる。
【００５５】
上の記載は、本発明の原理を単に例示するに過ぎないものと考えられる。更に、多くの修正及び変化が容易に当業者には思いつくであろうから、上に記載し、示した構成及び方法に正確に本発明を限定することは望ましくない。従って、全ての適当な修正及び同等なものは、後の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に入るものと見做すことができる。
【００５６】
本明細書及び後の特許請求の範囲で用いられる言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、記述した特徴、整数、成分、又は工程の存在を特定化することを意図したものであるが、それらは一つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。
【実施例】
【００５７】
例１
水抽出を用いたビルベリーの精製
乾燥ビルベリー原料１ｋｇについて３回の抽出を行なった。最初の抽出は６リットルの水を用い、他の２回の抽出は４リットルの水を用いた。全ての抽出は、濃硫酸で５ｇ／ｌの酸濃度まで酸性化した。粗製抽出物には約８８％のアントシアニンが回収された。粗製抽出物の正確に２．３リットルを、フィルターの上にガラスウールの層を用いた３０μポリプロピレンフィルターに通して濾過した。ガラスウールを１回交換し、フィルターを脱イオン水で濯いだ。濾液の最終的体積は２．４３リットルであり、濾液の中には９０．９％のアントシアニンが回収された。
【００５８】
臭素化ポリスチレン樹脂ＳＰ−２０７〔スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルバニア州ベレフォンテ〕をカラムに充填し、０．１％の酢酸で平衡にした。カラムに、２９．８ｇ／ｌの固体濃度を持つ２．２４リットルの濾液を、２．２ｍｌ／分の流量を用いてロードさせた。ローディング漏洩は、導入したアントシアニンの０．９％より少なく、全損失は、ローディング及び最初の２回のカラム洗浄でアントシアニンの４．０７％であった。溶離工程ではアントシアニンの８８．４％が回収され、アントシアニンの物質収支は９２．５％であった。回転蒸発器で数百ｍｌの溶離生成物を蒸発乾固し、次に凍結乾燥した。乾燥した生成物の最終的分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。富化組成物は、合計４３重量％のアントシアニンを含んでいた。
【００５９】
例２
７０％のエタノール抽出を用いたビルベリーの精製
２．０％のアントシアニンとして分析された乾燥ビルベリー原料（６６７ｇ）を、体積で３％の硫酸を含む７０％エタノール／水を用いてパーコレーションにより抽出した。粗製抽出物中の固体は、３．９重量％の全アントシアニンを含んでいた。第一抽出体積１リットルを、１００ｍｌの脱イオン水と混合し、約４６０ｍｌまで真空蒸発してアルコールを除去した。脱イオン水（３００ｍｌ）を混合物に添加し、更に１７０ｍｌの液体を蒸発した。脱イオン水（２１０ｍｌ）を添加し、最終体積を８００ｍｌにした。その水性混合物に１５０ｇのセライト５１２（固体１ｇ当たり０．５〜０．９ｇ／ｌのセライト）を添加した。混合物を均質になるまで振盪した。セライト／抽出物混合物を、真空中で３０ｇの湿ったセライト５１２床上に注いだ。濾過が完了した後、床を２００ｍｌずつの中に１％の硫酸水溶液１．２０リットルを入れたもので洗浄した。濾液体積は１８５５ｍｌであった。その濾液に、１４５ｍｌの脱イオン水を添加し、最終的体積を２．０リットルにした。
【００６０】
濾液の一部分（６９５ｍｌ）を、１７０ｍｌの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）を充填したカラムに２．２ｍｌ／分（１．３ｍｌ／分／ｃｍ２）でロードした。これによりカラム媒体１リットル当たり１７ｇのアントシアニンの負荷値を与えた。カラムを１カラム体積の０．１％酢酸水溶液で洗浄し、次に２．５カラム体積の０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノール／９０％水で洗浄した。次にカラムを１０カラム体積の７０％エタノール／水で溶離し、７０％のエタノールフラクションを一緒にし、６０℃及び５０ミリバールで真空濃縮し、暗く輝いた乾燥無定形固体（「フラクション３」）を与えた。その乾燥生成物の最終分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。富化組成物は、合計３２重量％のアントシアニンを含んでいた。
【００６１】
図２及び３は、本発明の方法に従ってビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の、夫々５１０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００６２】
表１には、典型的なアントシアニンに富む組成物（「フラクション３」）中の各アントシアニン％が要約してある。
【００６３】
【表１】
【００６４】
例３
ブルーベリーからの全フェノールに富む組成物
１０リットルの丸底フラスコ中で、乾燥粉砕ブルーベリー〔イリノイ州、モーメンスのファン・ドルネン・フューチャー・シューティカルズ（Ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｅｕｔｉｃａｌｓ）〕９４０ｇに、４．０リットルの抽出溶媒（７０％のエタノール中に１．０％ｗ／ｖの硫酸を入れたもの）を添加した。フラスコを４０℃に維持した一定温度の水浴中で２時間回転した。混合物をかき回し、１５０ｇのセライト５１２床に真空中で通し、濾過した。ブルーベリー・バイオマス濾滓を、５００ｍｌの抽出溶媒で洗浄した。濾滓をセライト床から注意して掻き取り、丸底フラスコ中に注入し、上記手順に従って再び抽出した。次に、三回目の抽出を行なった。三つの粗製抽出物を一緒にした。
【００６５】
一緒にした抽出物の一部分（２．００リットル）を、４０℃の水浴温度で１７５ｍｌまで真空濃縮した。蒸発した抽出物を脱イオン水で希釈し、６７５ｍｌの粗製ブルーベリー抽出物を与えた。その粗製抽出物を、濾過せずに、１７０ｍｌの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）を充填した、予め調整した（即ち、アセトンで洗浄した）平衡カラムにロードした。カラムを０．１％酢酸及び０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノールで洗浄した。アントシアニンを７０％エタノールで溶離した。生成物プールを６０℃及び５０ミリバールで真空蒸発した。最終生成物分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。精製ブルーベリー組成物は、合計１８重量％のアントシアニンを含み、アントシアニンの全回収率は９５％であった。
【００６６】
図４及び５は、本発明の方法に従ってブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の、夫々５１０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００６７】
例４
ブルーベリーからの全フェノールに富む高純度組成物
この例では、例３に記載したようにして製造された、ブルーベリーから製造され、１８重量％の全アントシアニンを有する全フェノールに富む組成物の一部分を、強又は弱陰イオン交換樹脂に通して残留酸を除去し、富化組成物の純度を増大した。
【００６８】
約１．０ｇの全フェノールに富むブルーベリー組成物を、５０ｍｌの水に溶解し、強陰イオン交換樹脂〔スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｑ−６５０Ｍ；トーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）；ペンシルバニア州モントゴメリー〕、又は弱陰イオン交換樹脂〔ＤＥＭ−６３；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）〕の入った９ｍｌのカラムに通した。カラムを３０〜３５ｍｌの水で洗浄した。強陰イオン交換樹脂カラムの場合には、樹脂を更に２５ｍｌの２０％エタノールで洗浄し、次に４０％のエタノールで洗浄した。強陰イオン交換カラムから分離した組成物は、２８．３重量％の全アントシアニンを含み、回収率は８８％であった。弱陰イオン交換カラムから分離された組成物は３０．６重量％の全アントシアニンを含み、回収率は８８％であった。
【００６９】
例５
ペクチナーゼ処理を用いてビルベリーからの全フェノールに富む組成物
１０２４ｇの冷凍ビルベリーに暖かい水（５４８ｇ）を添加した。混合物を混合機中でピューレにし、次に４０℃に加熱した。次に１５０μｌのペクチナーゼ〔クエスト・スーパー（Ｑｕｅｓｔ Ｓｕｐｅｒ）７ｘ；クエスト・インターナショナル（Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ニューヨーク州ノルウィッチ〕を撹拌しながら添加し、４０℃で３０分間処理した。そのスラリーに約４ｍｌの濃硫酸を添加し、０．５％（ｗ／ｗ）の酸濃度を達成した。次に混合物を４５℃に加熱し、非常にゆっくり撹拌しながら１５分間抽出した。ジカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）（１６４ｇ）をその抽出混合物に添加し、それを次に２６ｇのジカライト床で濾過した。得られた濾滓を４００ｍｌの暖かい０．１％硫酸水溶液で３回洗浄した。この抽出物を２５μｍ加圧フィルターに通して濾過した。全ての濾過抽出物（２．４リットル）を、１７０ｍｌのＳＰ−２０７カラムにロードした。ローディング後、カラムを０．１％酢酸水溶液で洗浄し、７０％エタノール水溶液で溶離し、「フラクション３」を与えた。「フラクション３」を蒸発乾固し、次に４８時間凍結乾燥器に入れた。最終生成物を、５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計で決定することにより全アントシアニンについて分析した。全フェノールに富む組成物は、４０重量％の全アントシアニンを含んでいた。アントシアニンの全回収率は約７９％であった。
【００７０】
例６
エルダーベリー・バイオマス粉末からの富化組成物
分析によりアントシアニンが１．８８％、全フェノールが５．３１％の乾燥エルダーベリー・バイオマス粉末〔ＢＩニュートラシューテカルズ（Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カリフォルニア州ロングビーチ〕約１９０ｇを１０００ｇの暖かい水に添加した。溶液を完全に混合し、４５℃の熱い水浴へ移した。その溶液に１９０μｌのペクチナーゼ（スーパー７Ｘ、クエスト）を添加し、次に混合物を３０分間放置した。２．５ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４を用いて混合物を２．５のｐＨまで酸性化し、１０分間穏やかに混合した。この酸性化混合物に、１６４ｇのセライトを添加し、次にその酸性化混合物を２６ｇのセライト床で濾過した。濾滓を４００ｍｌの酸性化温水で３回、合計１２００ｍｌで洗浄した。次に濾液を２５μｍ加圧フィルターに通して濾過し、エルダーベリー抽出物を与えた。
【００７１】
エルダーベリー抽出物を１７０ｍｌのＳＰ−２０７（三菱化学）臭素化ポリスチレンカラムに２．３ｍｌ／分（１．３ｍｌ／分／ｃｍ２）の速度でロードした。ローディング中にカラムから収集した溶離物は、「フラクション１」として収集した。ローディング後、カラムを３カラム体積（３×１７０ｍｌ）の０．００６％の硫酸水溶液で洗浄した。この洗浄による溶離物を「フラクション２」として収集した。次にカラムを８〜１０カラム体積の７０％エタノール水溶液で溶離し、それを「フラクション３」として収集した。次にカラムを３カラム体積の９０％エタノール水溶液で洗浄し、それを「フラクション４」として収集した。カラムを、８カラム体積の０．００６％の硫酸水溶液で再び平衡にした。フラクション３及び４を蒸発乾固し、次に乾燥するまで冷凍乾燥した。臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離中に分離したフラクションの幾つかを、例７及び８に記載したようにしてアントシアニン及び全フェノールについて分析した。表２にカラムデーターを要約する。
【００７２】
【表２】
【００７３】
図６〜１３は、濾過したエルダーベリー抽出物及びカラム精製中に分離した或るフラクションのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。用いたＨＰＬＣ条件は、例９に記載した通りである。
【００７４】
図６及び７は、濾過したエルダーベリー抽出物の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７５】
図８及び９は、濾過エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂にカラム・ローディングしている間に収集された「フラクション１」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７６】
図１０及び１１は、臭素化ポリスチレン樹脂から７０％のエタノールを用いて、濾過エルダーベリー抽出物をカラム溶離している間に収集された「フラクション３」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７７】
図１２及び１３は、臭素化ポリスチレン樹脂から９０％のエタノールを用いて、濾過エルダーベリー抽出物をカラム溶離している間に収集された「フラクション４」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７８】
本発明の全フェノールに富む組成物は、図１０〜１３に示したのと実質的に同様な標準ＨＰＬＣクロマトグラムでの６０〜７５分の間の領域中でピークを示す化合物を含んでいる。
【００７９】
例７
アントシアニンの定量的決定
この方法を用いて、種々のバイオマス試料及び全フェノールに富む乾燥精製組成物中の全アントシアニンを、外部標準を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により決定する。試験した各試料（例えば、全フェノールに富む濃縮組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、下に記載するように、異なった製造手順を必要とする。
【００８０】
全フェノールに富む組成物−１００ｍｌのメスフラスコ中に全フェノールに富む精製組成物を正確に秤量して７５〜１００ｍｇ入れ、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨでその体積まで希釈する。この試料の０．４０〜１．６ｍｌを２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍｌまで希釈し、よく混合する。
【００８１】
乾燥バイオマス−コーヒー粉砕機の刃を覆うのに充分な量の乾燥バイオマスをその粉砕機中へ入れる。約１分間、又は細かく粉砕されるまで粉砕する。別法として、原料を細かく粉砕するために乳鉢及び乳棒を用いる。１００ｍｌのメスフラスコ中に細かく粉砕したバイオマスを正確に秤量して約５０〜１００ｍｇ入れ、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを約８０ｍｌ添加し、蓋をする。フラスコを５０℃の油浴又は強制空気炉中へ３０〜６０分間入れ、３０秒間穏やかに振盪し、５分間超音波にかける。溶液を室温まで冷却する。線の所まで２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、混合する。試料の一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ガラス瓶に入れる。１．０ｍｌの濾液を２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍｌまで希釈する。希釈率は１０ｍｌ／１ｍｌ、即ち、１０になるであろう。
【００８２】
冷凍／新鮮バイオマス−１０００ｍｌポリプロピレンビーカー中へ４００．０ｇの冷凍／新鮮バイオマスを秤量して入れる。４００ｇの沸騰に近い水をビーカー中へ添加する。機械混合器（ワーリング又は他のもの）を用いてピューレにする。広い穴のポリエチレン滴下器を用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取り出し、風袋を計った１００ｍｌのメスフラスコ中へ移した。８０ｍｌの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、蓋をする。そのフラスコを５０℃の油浴又は強制空気炉中へ６０〜１２０分間入れ、３０秒間穏やかに振盪し、次に５分間超音波にかける。溶液を室温まで冷却する。線の所まで２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、混合する。一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ガラス瓶に入れる。希釈率は、バイオマス及び水の全重量をバイオマスの重量で割ったもの［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ＝２］になるであろう。
【００８３】
乾燥減量−上記試料中の全アントシアニン含有量を得るための計算は、材料の水分含有量、又はＬＯＤ％（乾燥減量）を決定する必要がある。ＬＯＤ％を決定するためには、正確に秤量したアルミニウム秤量皿に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分布させ、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。試料を１０５℃±３℃の炉中に２時間入れる（２時間１５分を越えないようにする）。試料を室温へ冷却した後（デシケーターを用いてもよい）、試料を秤量し、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。ＬＯＤ％は、式１を用いて０．１％の精度で決定する：
ＬＯＤ％＝［１−（ＷＤ−ＷＰ）／（ＷＳＰ−ＷＰ）］×１００ 式１
式中、ＬＯＤ％＝乾燥減量％；ＷＤ＝皿及び試料の乾燥重量（ｇ）；ＷＰ＝皿の重量（ｇ）；及びＷＳＰ＝皿及び試料の初期重量（ｇ）。
【００８４】
分析手順−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプを点灯して光度測定モードで読取るように設定する。その機器を、行路長さ１ｃｍのガラス、石英、又は使い捨てポリスチレン・セル中に入れた２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて５３５ｎｍで、０点に合わせる。調製した試料の吸光度を、同じ又は整合した１ｃｍセル中で５３５ｎｍで測定する。
【００８５】
計算−全アントシアニンの濃度を、式２で示したように計算する：
ＣＡＮＴＨＯＳ＝（ＡＢＳＳＡＭＰ×ＤＦ）／ＥＳ 式２
式中、ＣＡＮＴＨＯＳ＝試料中の全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＡＢＳＳＡＭＰ＝試料の５３５ｎｍでの吸光度；ＤＦ＝下に記載する、希釈率；及びＥＳ＝適当な外部標準、塩化シアニジン（チェリー、クランベリー、エルダーベリー、及びプラムについては１０１．１）、又は塩化デルフィニジン（ビルベリー及びブルーベリーについては１０２．０）の吸光係数（１ｃｍのセルを用いて２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中での５３５ｎｍでの１ｍｇ／ｍｌ溶液の吸光度）。乾燥バイオマスについての希釈率（ＤＦ）は１であり、新鮮／冷凍バイオマスについての希釈率は、バイオマスと水との合計重量を、バイオマスの重量で割ったものである〔例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ〕。精製した抽出物についての希釈率は、最終希釈体積を抽出溶液の体積で割ったものである（例えば、１０ｍｌ／０．４０ｍｌ）。
【００８６】
全アントシアニンの％は、式３に示したようにして計算する：
アントシアニン％＝（ＣＡＮＴＨＯＳ×体積×１００）／（ＷＳ×ＳＬＯＤ） 式３
式中、アントシアニン％＝試料中の全アントシアニンの％；ＣＡＮＴＨＯＳ＝全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；体積＝調製試料の初期体積（通常１００ｍｌ）；ＷＳ＝調製で用いたバイオマス又は全フェノールに富む組成物の重量（通常乾燥バイオマスの場合５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合５００〜１５００ｍｇ、又は精製抽出物の場合７５〜１００ｍｇ）；及びＳＬＯＤ＝乾燥又は新鮮バイオマス、又は精製抽出物の場合、［（１００−ＬＯＤ％）／１００］（新鮮又は冷凍バイオマスの場合、この因子は適用しない）。
【００８７】
例８
全ポリフェノールの定量的決定
この方法を用いて、種々のバイオマス試料及び富化乾燥精製組成物中の全ポリフェノールを、外部標準として没食子酸を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により定量的に決定する。
【００８８】
この方法は、２０％のＮａ２ＣＯ３溶液及び２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを必要とする。Ｎａ２ＣＯ３溶液を調製するためには、約３５０ｍｌの脱イオン水の入った５００ｍｌのメスフラスコ中へ、約１００ｇのＮａ２ＣＯ３を秤量して入れる。１０分間超音波にかけ、振盪して混合する。脱イオン水を用いてその体積まで希釈し、均質になるまで撹拌する。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを調製するためには、５００ｍｌメスフラスコ中へ約３５０ｍｌのメタノールを入れる。フラスコ中へ１０．０ｍｌのＨＣｌをピペットで入れる。メタノールを用いてその体積まで希釈し、均質になるまで混合する。
【００８９】
没食子酸標準ストックを調製するためには、１００ｍｌメスフラスコ中へ１００ｍｇの没食子酸〔ミズーリ州セントルイスのシグマー（Ｓｉｇｍａ）〕を正確に秤量して入れる。７０ｍｌの脱イオン水を添加し、溶解するまで５分間超音波にかける。脱イオン水を用いてその体積まで希釈し、蓋をし、均質になるまで混合する。
【００９０】
試験した各試料（例えば、全フェノールに富む組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、異なった調製方法を必要とし、例７に記載したようにして調製した。
【００９１】
乾燥減量−上記試料中の全ポリフェノール含有量を得るための計算は、材料の水分含有量、又はＬＯＤ％を決定する必要がある。ＬＯＤ％を決定するためには、正確に秤量したアルミニウム秤量皿に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分布させ、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。試料を１０５℃±３℃の炉中に２時間入れる（２時間１５分を越えないようにする）。試料を室温へ冷却した後（デシケーターを用いてもよい）、試料を秤量し、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。ＬＯＤ％は、上記式１を用いて０．１％の精度で決定する。
【００９２】
比色展開法−きれいな１００ｍｌメスフラスコを、未使用試薬として使用するため別に設定する。二つの１００ｍｌメスフラスコに、「高濃度」標準及び「低濃度」標準のラベルを付ける。没食子酸ストック溶液を用いて、「高濃度」標準フラスコには８００μｌを、「低濃度」標準フラスコには２００μｌをピペットで入れる。乾燥バイオマス試料の場合、２０ｍｌの濾過溶液をピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。新鮮／冷凍バイオマス試料の場合、１０ｍｌの濾過溶液をピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。精製試料の場合、０．８０〜２．０ｍｌをピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。上で調製したメスフラスコ（未処理試薬を含む）の各々に次のものを添加する：
１．全体積を約６５ｍｌにする充分な脱イオン水を各フラスコへ添加する。
２．各フラスコへ５．０ｍｌのＦＣフェノール試薬（シグマー）をピペットで入れ、穏やかに撹拌する。
３．各フラスコに１５±２ｍｌの２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液をピペットで入れる。
４．各フラスコ中の溶液を穏やかにかき回しながら混合し、脱イオン水でその体積まで希釈し、蓋をし、逆さにする。
５．それら溶液を少なくとも３時間であるが、４時間以内展開する。
６．０．４５μｍＰＶＤＦ注射器フィルターに通す濾過を必要とする、試料の１０ｍｌ部分を、適当な容器中へ濾過して入れる。
【００９３】
分析手順−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプを点灯して光度測定モードで読取るように設定する。分析は、行路長さ１ｃｍのガラス、石英、又は使い捨てポリスチレン・セル中で行う。その機器を、未使用試薬を用いて７６０ｎｍの所で０点に合わせる。各溶液の吸光度を、同じ又は整合した１ｃｍセル中で７６０ｎｍで測定する。
【００９４】
計算−全ポリフェノールの濃度を計算するためには、没食子酸の吸光係数を先ず決定しなければならない。この値は、式４に記載したようにして得られる：
ＥＲ＝（ＡＲ×ＤＲ）／［ＣＲ×（１−ＥＬＯＤ）］ 式４
式中、ＥＲ＝吸光度単位／ｇ／ｌで７６０ｎｍでの参照標準（没食子酸）の吸光係数；ＡＲ＝参照標準溶液の吸光度；ＣＲ＝ストック標準溶液中の没食子酸の濃度；ＤＲ＝没食子酸標準のための希釈率（「高濃度」標準の場合１２５、或は「低濃度」標準の場合５００）；及びＥＬＯＤ＝没食子酸固体の乾燥減量（％）。
【００９５】
「高濃度」及び「低濃度」標準についての吸光係数を、下の式５で用いるため平均する。色展開試料調製で全ポリフェノールの濃度は、式５に示すようにして計算する：
ＣＰ＝（ＡＲ×ＤＦＣ）／ＥＲ 式５
式中、ＣＰ＝ＦＣ調製試料の全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＡＳ＝ＦＣ調製試料の吸光度；ＤＦＣ＝試料希釈率、この場合ＤＦは、乾燥バイオマスの場合５、新鮮／冷凍バイオマスの場合１０、富化精製組成物の場合５０〜１２５であるのが典型的である；及びＥＲ＝没食子酸標準の平均吸光係数。
【００９６】
全ポリフェノール％は、式６に示したように計算する：
Ｐ％＝（ＣＰ×ＶＳ×ＤＳ×１００）／（ＷＳ×ＳＬＯＤ） 式６
式中、Ｐ％＝試料中の全ポリフェノールの％；ＣＰ＝全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＶＳ＝元の試料調製体積（通常１００ｍｌ）；ＷＳ＝元の試料調製で用いたバイオマス又は精製組成物の重量（通常、乾燥バイオマスの場合、５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合、５００〜１５００ｍｇ、精製抽出物の場合、７５〜１００ｍｇ）；ＤＳ＝元の試料希釈係数、この場合、ＤＳは、乾燥バイオマスの場合１、新鮮／冷凍バイオマスの場合２、又は精製抽出物の場合１である；及びＳＬＯＤ＝バイオマス又は精製抽出物の場合、［（１００−ＬＯＤ％）／１００］。新鮮又は冷凍バイオマスの場合、この因子は適用しない。
【００９７】
例９
ＨＰＬＣ定性分析
この方法を用いて、種々のバイオマス及び富化精製組成物中の化合物を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により品質を定める。各種類の試料は、下に記載するように異なった調製手順を必要とする。
【００９８】
乾燥バイオマス：乾燥バイオマスは、もし未だ粉末にされていない場合には、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）ミルを用いて粉砕し、１ｍｍ篩に通す。適当な大きさの抽出シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）及びソックスレー抽出装置を用いて、約１２ｇの粉末バイオマスを秤量してそのシンブル中に入れ、２００ｍｌのメタノールを用いて抽出する。少なくとも２０サイクル、又は抽出溶媒がきれいになるまで抽出を続ける。抽出物を定量的に２５０ｍｌメスフラスコへメタノールを用いて移し、その体積まで希釈し、混合する。抽出物を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶中へ入れる。
【００９９】
冷凍／新鮮バイオマス：１０００ｍｌポリプロピレンビーカー中へ４００ｇの冷凍／新鮮バイオマスを秤量して入れる。４００ｇの沸騰に近い水をビーカー中へ添加する。機械混合機（ワーリング又は他のもの）を用いてピューレにする。広い穴のポリエチレン滴下器を用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取り出し、風袋を計った１００ｍｌのメスフラスコ中へ移す。８０ｍｌのＭｅＯＨを添加し、蓋をし、５０℃に３０分間加熱する。溶液を室温まで冷却させ、メタノールでその体積まで調節し、次に均質になるまで超音波にかける。一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶に入れる。
【０１００】
富化精製組成物：富化組成物を５０〜１００ｍｇ正確に秤量し、ガラスシンチレーション瓶中に入れ、１０．０ｍｌの５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを添加する。５分間超音波にかける。０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶中に入れる。
【０１０１】
必要に応じ、ＨＰＬＣを設定する。本発明の一つの態様として、５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌの高純度、型１水の中に混合することにより移動水性相を調製した。２０μｌの試料を周囲温度で注入した。検出のため２８０ｎｍの波長を用い、流量は１．０ｍｌ／分、操作時間は１０５分であった。１５０×４．６ｍｍ内径のカラム中、ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）カラムに５μｍＳＢＣ−１８を充填した。この態様では、移動相は次のように設定した：チャンネルＡ：１００％アセトニトリル；チャンネルＢ：Ｈ２Ｏ中に入れた０．５％ＴＦＡ；及びチャンネルＣ：１００％メタノール。表３に、本発明のこの態様についてのＨＰＬＣ勾配を要約する。
【０１０２】
もし入手できるならば、試料中に存在させることが知られている標準調製化合物を、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製してもよい。これらの標準調製物を用いて、大略の保持時間を決定し、それにより試料クロマトグラム中のこれらの化合物を同定することができる。この方法は、定性的目的にのみ用いられるので、計算は不必要である。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
例１０
プロアントシアニジン％決定のための定量的ＨＰＬＣ法
このＨＰＬＣ法を用いて、種々のフラクション及び富化組成物中のプロアントシアニジンの量を決定する。各種類の試料は異なった調製法を必要とし、例９に記載したようにして調製する。この方法は、１５０×４．６ｍｍのカラム中、ステイブルボンド（Ｓｔａｂｌｅｂｏｎｄ）ＳＢＣ−１８を充填した５μｍゾルバックスカラムを用いる。流量は１．５ｍｌ／分、検出器は２８０ｎｍに設定し、注入体積は１０μｌで、操作時間は２４分であった。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝水に入れた０．１％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。表４に、用いた勾配を与える。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラム中の一群の広いピークとして溶離されるのが典型的である。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
プロアントシアニジンの量を決定するため、前に屋内で調製した９０％より大きな純度を有するプロアントシアニジン標準を用いる。この試料は７０％のエタノール中に５．５ｍｇ／ｍｌにして調製し、この例に記載するＨＰＬＣ法を用いて分析する。この標準のためのクロマトグラムは、１１〜２２分の保持時間範囲内に大きな広いピークを含み（図１４に見られるように）、それはプロアントシアニジンによるものである。１１〜２２分のピーク全体を手動で積分する。次に、式７に示したように、１１〜２２分全ピーク面積を、標準物の濃度とその純度との積で割ることにより、その標準物についてのピーク面積応答係数（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ）を決定する：
ＲＦ＝ＰＡ／（Ｃｓｔｄ×Ｐｓｔｄ） 式７
式中、ＲＦ＝標準物についてのピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍｌ）；ＰＡ＝標準物中のプロアントシアニジンのピーク面積；Ｃｓｔｄ＝標準溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）；及びＰｓｔｄ＝標準物純度（％）（通常０．９０）。
【０１０７】
試料中のプロアントシアニジン％は、上に記載した試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて決定することができる。問題の試料について、１１〜２２分の保持時間範囲中の全ピーク面積を決定する。しかし、プロアントシアニジン保持時間範囲中の非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、全ピーク面積から差し引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、広いプロアントシアニジンピークと共に、又はその上に同時に溶離して鋭いピークとして屡々現れ、ダイオード配列によるそれらのＵＶスペクトルは、屡々プロアントシアニジンピークの主要部とは異なっている。非プロアントシアニジンピークのピーク面積を決定するため、これらのピーク、それらのピーク面積の全てを手動で積分し、この面積を、１１〜２２分の全ピーク面積から差し引く。試料中のプロアントシアニジンピークの真の面積が決定されたならば、この値を、屋内標準物についてのピーク面積応答係数で割り、式８に示したように、試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る：
Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝（ＰＡｓａｍｐ×ＤＦ）／ＲＦ 式８
式中、Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝試料中の全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＰＡｓａｍｐ＝試料についての補正した全ピーク面積；ＤＦ＝希釈率（乾燥バイオマスについては１、新鮮／冷凍バイオマスについては２、富化組成物については１）；及びＲＦ＝式７を用いて計算したピーク面積応答係数。
【０１０８】
全プロアントシアニジン％は、式９に示したようにして計算する：
プロアントシアニジン％＝（Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ×Ｖ×１００）／Ｗｓ 式９
式中、プロアントシアニジン％＝試料中の全プロアントシアニジンの％；Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；Ｖ＝調製試料の体積（通常乾燥バイオマスについては２５０ｍｌ、新鮮／冷凍バイオマスについては１００ｍｌ、富化組成物については１０ｍｌ）；及びＷｓ＝試料調製で用いられたバイオマス又は富化組成物の重量（通常乾燥バイオマスについては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスについては５００〜１５００ｍｇ、又は富化組成物については５０〜１００ｍｇ）。
【０１０９】
例１１
濾過エルダーベリー抽出物から極性及び非極性プロアントシアニジンの直接分配
この例では、濾過エルダーベリー抽出物を調製し、臭素化ポリスチレン樹脂で精製するのではなく、その代わり真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）カラムに直接ロードし、図１５に例示した方法に従い、濾過抽出物から極性プロアントシアニジン及び非極性プロアントシアニジンを直接分配した。
【０１１０】
メタノール中に入れたベイカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）４０μｍフラッシュ・クロマトグラフィーＣ−１８媒体のスラリー５０ｍｌを、６０ｍｌのフリット化ガラスフィルターに通して濾過することにより５０ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムを調製した。カラムをメタノールで洗浄し、次に水で洗浄することにより調整した。１２．０ｇの固体、７４ｍｇのアントシアニン、及び約７８０ｍｇのプロアントシアニジンを含む濾過エルダーベリー抽出物の３００ｍｌ部分をカラムにロードした。例１０に記載したＨＰＬＣ法を用いた濾過抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを、図１６に示す。流通溶離物（約３００ｍｌ）及び１００ｍｌの洗浄物〔０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）〕を一緒にし、極性プロアントシアニジン「フラクション５」を与えた。「フラクション５」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に示す。次にカラムを０．１％のＴＦＡを含む３０、４０、５０、６０、７０、及び１００％のメタノール、夫々１００ｍｌで溶離した。６０％メタノール溶離剤中に分離された非極性プロアントシアニジン「フラクション６」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に示す。例７及び１０に記載した方法により、それらのフラクションをアントシアニン及びプロアントシアニジンについて分析した。この実験結果を表５に要約する。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
結果は、濾過抽出物中のプロアントシアニジンの７１％（５５８ｍｇ）がローディング及び洗浄中に収集されたことを示している。これらのプロアントシアニジンは、一層極性のプロアントシアニジンであった。非極性プロアントシアニジンは、メタノール濃度を少なくとも４０％に増大した時に溶離した。５０〜７０％メタノール・フラクション中に溶離したプロアントシアニジンの純度は、濾過エルダーベリー抽出物中に含まれていた固体の大部分がローディング溶離、水洗浄、及び３０％メタノール洗浄で溶離したことにより高かった。
【０１１３】
例１２
ＶＬＣ及びそれに続くゲル浸透クロマトグラフィー又は準分取ＨＰＬＣによる精製によるエルダーベリー・プロアントシアニジンの分配
エルダーベリー乾燥バイオマス〔マーチン・バオエル（Ｍａｒｔｉｎ Ｂａｕｅｒ）；ドイツ〕から、例６に記載した手順を用いた臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離中に７０％エタノール・フラクション（「フラクション３」）を収集することにより、全フェノールに富む組成物を製造した。この全フェノールに富む組成物の一部分（２．００ｇ）を５０ｍｌの水中に溶解し、ベイカーボンド４０μｍＣ−１８媒体を用いて調製した１５ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。流通溶離物及び２５ｍｌ水洗浄物を一緒にし、冷凍乾燥し、７３３ｍｇの極性プロアントシアニジンフラクション（「フラクション５」）を生じた。次にカラムを２５ｍｌの５０％メタノールで洗浄した。非極性プロアントシアニジン（「フラクション６」）を、２５ｍｌの７０％メタノールで溶離した。このフラクション中のメタノールを除去し、得られた水懸濁物を冷凍乾燥し、１９２ｍｇの非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与え、それはＨＰＬＣ分析により１００％プロアントシアニジンであった。このフラクションは、色があったとしても極めて少なく、このフラクション中のオリゴマープロアントシアニジン鎖は陽イオン性アントシアニン単位を含まないことを示唆していた。
【０１１４】
極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を、準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、残留アントシアニン及び他の一層極性の不純物を除去した。これらの固体の準分取ＨＰＬＣ精製のための条件を下に記載する。
【０１１５】
準分取ＨＰＬＣ法は、６μｍ、６０Å、ノバ・パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）ＨＲ Ｃ−１８媒体〔ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）；マサチューセッツ州ミルフォード〕を充填した２．５×１０ｃｍのウォーターズ・プレプパック（ＰｒｅｐＰａｋ）カートリッジを用いた。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝０．１％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。この態様で用いた勾配は、表６に示す通りであった。流量は３０ｍｌ／分であり、検出器は２８０ｎｍに設定し、注入体積は、５０〜１２５ｍｇの固体を含む溶液３〜５ｍｌであるのが典型的であった。操作時間は３０分間であった。プロアントシアニジンは、１３〜２０分で溶離した広いピーク中に収集された。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
約６００ｍｇの極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を、２５ｍｌの水に溶解した。８つの実験の各々で約３ｍｌ（７５ｍｇ）を注入した。各実験で１２〜１８分の間に溶離したプロアントシアニジンピークを収集し、プールし、回転蒸発器で蒸発し、残留水溶液を冷凍乾燥した。ＶＬＣ分離の後、６００ｍｇの極性プロアントシアニジン固体（「フラクション５」）から、約１００ｍｇの精製極性エルダーベリー・プロアントシアニジン（「フラクション７」）が得られた。準分取ＨＰＬＣ精製後のＶＬＣ分離極性プロアントシアニジンについての２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、図１９に示す。砂糖、アミノ酸、アントシアニン、有機酸、及び少量のフラボノイド化合物を含む極性フロント（ｆｒｏｎｔ）は、図１９にはこれらのピークが無いことにより証明されるように、準分取ＨＰＬＣ精製により除去された。精製極性プロアントシアニジン（「フラクション７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２０に示す。
【０１１８】
非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を、更にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。ＶＬＣ分離中に分離された非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）の一部分（４８ｍｇ）を２０ｍｌの温水に溶解し、前以て水で平衡にしておいた１４ｍｌセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０カラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、４０ｍｌのカラム水洗浄物と一緒にした。比較的小さなフラボノイド不純物の殆どが保持されている間のこの時点で、カラムから殆どの非極性プロアントシアニジンが溶離された。ローディング及び洗浄溶離物を一緒にし、冷凍乾燥して３２ｍｇの精製非極性プロアントシアニジン「フラクション８」を与えた。これらの固体は、強い抗ウィルス活性を持っていた。図２１及び２３は、セファデックスＬＨ−２０カラム精製前の非極性プロアントシアニジン（「フラクション６」）の、夫々２８０ｎｍ及び３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図２２及び２４は、精製非極性プロアントシアニジン（「フラクション８」）の、夫々２８０ｎｍ及び３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。星印をつけた図２１中のピークは、ＵＶスペクトルに基づく非プロアントシアニジン・フラボノイド化合物である。これらの化合物は、図２２の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムで示されているように、セファデックスＬＨ−２０カラム後に分離された精製非極性生成物（「フラクション８」）では減少している。ゲル精製の効果は、精製前の非極性プロアントシアニジンの３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを比較することにより一層よく知ることができる（図２３）。非プロアントシアニジン不純物は、図２３中で４〜６分及び１５〜１７分の所に現れている。５．８分の所で溶離した少量のフラボノイド化合物を別として、図２４に示したように、精製試料中にはフラボノイド化合物の痕跡はない。精製非極性プロアントシアニジン「フラクション８」の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。図３３は、フラクション７のＩＲスペクトルを示し、図３４は「フラクション８」のＩＲスペクトルを示している。
【０１１９】
例１３
ブルーベリー極性及び非極性プロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、ブルーベリーから調製され、臭素化ポリスチレン樹脂から７０％エタノール溶離中に分離された全フェノールに富む「フラクション３」であった。「フラクション３」の一部分（６．００ｇ）を８０ｍｌの水中に溶解し、前に記載したように、３０ｍのｌＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、０．１％ＴＦＡ洗浄溶離物（「フラクション５」）の１００ｍｌと一緒にした。次にカラムを８０ｍｌの４０％メタノールで洗浄し、残留極性化合物（「フラクション５」）を除去し、次に８０ｍｌの７０％メタノールで洗浄し、非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与えた。表７に、この実験の結果を要約する。
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
極性プロアントシアニジン「フラクション５」（ローディング溶離＋洗浄）及び非極性プロアントシアニジン・フラクション６（７０％メタノール溶離）を、夫々更に例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより精製し、夫々「フラクション７」及び「フラクション８」を与えた。準分取精製前及び後のブルーベリー極性プロアントシアニジン・フラクション（即ち、「フラクション５」及び「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、夫々図２６及び２７に示す。準分取精製前及び後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン・フラクション（即ち、「フラクション６」及び「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、夫々図２８及び２９に示す。図２７及び２９の約０〜８分の間にピークが無いことにより証明されるように、極性及び非極性両方のフラクションの準分取精製により、プロアントシアニジンから望ましくないアントシアニン及び極性フラボノイド化合物が除去された。図３７は、「フラクション７」のＩＲスペクトルを示し、図３８は、「フラクション８」のＩＲスペクトルを示している。
【０１２２】
例１４
プラム極性及び非極性プロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、プラムから分離され、約１７％の全プロアントシアニジンを含み、その内の６１％が極性で、３９％が非極性として判定された「フラクション３」及び「フラクション４」を一緒にしたものであった。この組成物の一部分（８．００ｇ）を０．５％のＴＦＡを含む１００ｍｌの水中に溶解し、前に記載したように４５ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、カラムを５０ｍｌの０．１％ＴＦＡで洗浄した。ローディング溶離物及び洗浄フラクションを一緒にし、極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を与えた。極性プロアントシアニジン「フラクション５」のＨＰＬＣを図３０に示す。カラムを、０．５％のＴＦＡを含む４０％のメタノール１００ｍｌで溶離し、次に０．５％のＴＦＡを含む７０％メタノール１００ｍｌで溶離した。全てのメタノールフラクションを一緒にし、非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与えた。表８にこの実験の結果を要約する。
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
極性プロアントシアニジン「フラクション５」（ローディング溶離物及び洗浄溶離物を一緒にしたもの）を、例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、「フラクション７」を与えた。アントシアニン及び他の一層極性の不純物を除去することにより、試料のプロアントシアニジン純度が１５％から１００％へ増大した。精製極性プロアントシアニジン「フラクション７」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図３１に示す。非極性「フラクション６」（４０％及び７０％のメタノール洗浄物を一緒にしたもの）は、更に精製することはしなかった。非極性プロアントシアニジン「フラクション６」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、図３２に示す。図３９は「フラクション７」のＩＲスペクトルであり、図４０は「フラクション６」のＩＲスペクトルである。
【０１２５】
例１５
エルダーベリーＶＬＣフラクションからのプロアントシアニジン・フラクションの精製
アンバークロム（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ）ＣＧ−７１ｃｄ樹脂（８０〜１６０μｍの粒径、トーソーハース；ペンシルバニア州フィラデルフィア）を用いてＶＬＣカラムを調製した。エルダーベリーの水抽出物を調製し、この抽出物の一部分をＶＬＣカラムにロードした。次にカラムを水で洗浄し、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、及び１００％メタノールを用いて溶離した。メタノールで溶離した全てのフラクションを別々に保持した。５０％メタノールで溶離したＶＬＣフラクションを回転蒸発器で蒸発し、メタノールを除去し、次に冷凍乾燥し、水を除去した。乾燥した材料を、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、粉末にした。乾燥試料を例１０に記載した方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。この分析結果を用いて分析ＨＰＬＣ法から準分取ＨＰＬＣ法を誘導し、プロアントシアニジンを分離した。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝水中に入れた０．５％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。流量は３０ｍｌ／分に設定した。用いた勾配を、表９に示す。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
約５００ｍｇの乾燥材料を水中に溶解し、約５０ｍｇ／ｍｌの固体濃度にした。非常に僅かな量を注入し、関係するピークの保持時間を決定した。この最初の注入に基づき、二つのピークを収集した：１４〜２２分の間で溶離したピークＡ、及び２６〜２８分の間で溶離したピークＢ。５回の濃厚溶液の注入を行い、各ピークの適当な収集物を各注入からプールした。ピークＡの収集により得られた試料は、プロアントシアニジンを含むことが決定され、蒸発して有機溶媒及び水の一部分を除去した。濃縮試料を、例１０に記載したＨＰＬＣ法を用いて分析した。試料のクロマトグラフィー純度は、９３．９％であることが決定された。次に試料を凍結乾燥し、乾燥材料を得た。乾燥したならば、試料の僅かな部分を７０％エタノール中に入れ、１．９１８ｍｇ／ｍｌの濃度にし、同じＨＰＬＣ法により再び分析した。この分析結果及び前に得られたクロマトグラフィー純度を用いて、ピーク面積応答係数を決定した。この情報を用いて、他の精製フラクション中のプロアントシアニジン濃度を決定した。プロアントシアニジン「標準」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１４に示す。
【０１２８】
例１６
クランベリープロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、１４％の全プロアントシアニジンを含む精製クランベリー抽出物（「フラクション３」＋「フラクション４」）の８．００ｇであった。この材料を、１ｍｌのトリフルオロ酢酸を含む水１００ｍｌ中に溶解し、前に記載したように、５０ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物（１００ｍｌ）を収集し、５０ｍｌの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離物と一緒にし、「フラクション５」を得た。次に、カラムを１００ｍｌの４０％メタノールで洗浄し、残留極性化合物を除去し、１００ｍｌの７０％メタノールで溶離し、非極性プロアントシアニジン「フラクション６」を与えた。表１０に、この実験の結果を要約する。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
極性プロアントシアニジン・フラクション（ローディング溶離＋洗浄）を、例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、「フラクション７」を得た。図４１は、準分取精製前の極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムであり、図４２は、精製後の極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムである。図４３は、非極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムである。プロアントシアニジン前に溶離したアントシアニンのような極性非プロアントシアニジン化合物は、この方法で除去された。
【０１３１】
例１７
エルダーベリーフラクションの単純ヘルペスウィルス２検定
エルダーベリー粗製抽出物及び例６に記載したようにして分離したフラクション１、３、及び４の抗ウィルス活性を、ウィルス細胞変性効果（ＣＰＥ）検定を用いて決定した。この検定は、既に報告されている〔ワイド（Ｗｙｄｅ）その他、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｐ．Ｒｅｓ．２８：４６７−４７２（１９９３）〕。全ての抗ウィルス活性は、５０％効果量（ＥＤ５０）として報告されている。
表１１に、試験した四つの組成物についてのＣＰＥ抑制についてのＥＤ５０を要約する。
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
例１８
ウィルス検定
果実及びイチゴ類から製造した本発明の全フェノールに富む組成物は、種々のＤＮＡ及びＲＮＡウィルスに対し広い活性を示し、人間及び動物の炎症を処置するのに有用な活性成分として適切である。細胞培養で、富化組成物は呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザＡ及びＢウィルス、パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）のみならず、他の呼吸器及び単純ヘルペスウィルスの隔離及び実験室的株に対し強力な活性を示す。全フェノールに富む組成物は、人間及び動物の広い範囲のウィルス感染を処置するのに有用な活性成分として適切である。
【０１３４】
各ウィルスに対する活性度を測定するのに用いられる検定は当業者によく知られている。細断した特定の標的組織を、希望のウィルスに曝し、試験材料を入れた場合と入れない場合についてウィルスの増殖速度を測定した。種々の果実及びイチゴ類から製造した精製プロアントシアニジンに富む組成物の抗ウィルス活性度を決定した。
【０１３５】
細胞系：ウィルス検定は、相対的ＥＤ５０（５０％効果量）又は５０％抑制終点を決定するために次の細胞／細胞系を用いた：ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）及びＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）検定は、アフリカ・ミドリザル腎臓から得られたＭＡ−１０４細胞を用いた；インフルエンザＡ及びＢ検定では、犬の腎臓から得られたＭＤＣＫ細胞を用いた；ライノウィルス検定では、ＨｅＬａ及びＫＢ細胞を用いた；単純ヘルペスウィルス１及び２では、人の包皮線維芽細胞から取られたＨＨＦ細胞を用いた；西ナイルウィルス検定では、アフリカ・ミドリザル腎臓から取ったＶｅｒｏ細胞を用いた；アデノウィルス型１検定では、人の肺癌から得られたＡ５４９細胞を用いた；Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏＡ検定では、アカゲザル腎臓から得られたＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた。
【０１３６】
それらの検定では、陽性対照として既知の医薬標準〔リビバリン（ｒｉｂｉｖａｒｉｎ）又はアシクロビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）〕を用いた。この例で用いた検定で、リビバリンについてのＥＤ５０は次の通りである：ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；ＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；インフルエンザＡ及びＢ検定ＥＤ５０＝２〜３μｇ／ｍｌ；ライノウィルス検定ＥＤ５０＜１μｇ／ｍｌ；西ナイルウィルス検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；アデノウィルス型１検定ＥＤ５０＝１０μｇ／ｍｌ；及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡ検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ。単純ヘルペス１及び２検定では、陽性対照としてアシクロビールを用い、それはＨＳＶ１及びＨＳＶ２検定で１〜２μｇ／ｍｌのＥＤ５０を持っていた。
【０１３７】
本発明の或る組成物についてウィルス検定で得られたデーターを、表１２に与える。細胞培養で、それら組成物は、インフルエンザＡウィルス（株Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ３）、インフルエンザＢウィルス、アデノウィルス型１、Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、及びライノウィルス型２の隔離及び実験室的株に対し強力な活性を示した。抗ウィルス・スクリーニングでアシクロビール及びリビバリンに対する表１２中の生物活性データーの比較は、本発明の組成物がこれらの検定で生物学的に活性であり、これらのウィルス疾患を処置するのに用いられているよく確立された医薬と競合して好ましいことを明らかに示している。
【０１３８】
【表１２】
【０１３９】
例１９
全フェノールに富む組成物のＣＯＸ−２活性の評価
シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）は、アラキドン酸及び他の必須脂肪酸の種々のプロスタグラジンへの転化に対し触媒作用を及ぼす。プロスタグラジンは、哺乳類の炎症の原因になにるホルモン状物質である。ＣＯＸ−２酵素の抑制は、最小限の副作用で組織の炎症を減少することができる。一方、ＣＯＸ−１の抑制は、胃潰瘍及び他の体に望ましくない副作用を起こす。ＣＯＸ−１酵素の完全な抑制は望ましくない。ＣＯＸ−２酵素を選択的に抑制する化合物は、一層よい抗炎症剤である。果実及びイチゴ類から製造された本発明の全フェノールに富む組成物は、ＣＯＸ−２酵素を抑制することが示されており、人間及び動物の炎症を処置するのに有用な活性成分として適切である。
【０１４０】
この検定では、検定すべき材料を、希望の酵素を含むことが知られている細断した特定のマウス又はうし器官組織と混合した。アラキドン酸をこの混合物に添加した。酸素取り込み速度を特定し、既知のＣＯＸ抑制剤で観察されている取り込み速度と比較する。ＣＯＸ−２検定は、人間の組み替えＣＯＸ−２陽性細胞を用いたアラキドン酸からのＰＧＥ２の定量的生成に基づいている。
【０１４１】
幾つかの組成物についての結果を表１３に示す。表１３に示した組成物についてのデーターを、既知の医薬標準（アスピリン及びインドメタシン）の決定されたＣＯＸ−２生物活性度と比較すると、本発明のプロアントシアニジンに富む精製組成物は、ＣＯＸ−２検定で生物学的に活性であることを明確に示している。アスピリンは、６６０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−２に対し活性であり、２４０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−１に対し活性である。インドメタシンは１０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−２に対し活性である。従って、表１３の組成物は、炎症に対し最も一般に用いられている処置（例えば、アスピリン）よりも、ＣＯＸ−２検定で効力に２．５〜６倍の増大を示しており、哺乳類の炎症を処置するのに本発明のプロアントシアニジンに富む精製組成物の有用性を示している。
【０１４２】
【表１３】
【０１４３】
前記記述は、本発明の原理を単に例示しているに過ぎないものと考えられる。更に、当業者には多くの修正及び変化が容易に想到されるので、本発明を上に記載し、示したのと正確に同じ構成及び方法に限定することは望ましくない。従って、全ての適当な修正及び同等なものは、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内入るものと見做すことができる。
【０１４４】
本明細書及び後の特許請求の範囲で用いられている言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、記述した特徴、整数、成分、又は工程の存在を特定化することを意図したものであるが、それらは一つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明による全フェノールに富む組成物を製造するための方法の工程図である。
【図２】図２は、ビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、ビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、ブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】図５は、ブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】図６は、濾過したエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】図７は、濾過したエルダーベリー抽出物の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は、濾過したエルダーベリー抽出物のカラムローディング中に溶離された第一フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は、濾過したエルダーベリー抽出物のカラムローディング中に溶離された第一フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、７０％エタノールで溶離された第三フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、７０％エタノールで溶離された第三フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、９０％エタノールで溶離された第四フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、９０％エタノールで溶離された第四フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４】図１４は、例１０に記載したように製造されたプロアントシアニジン標準の別のＨＰＬＣ法を用いたＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する方法の工程図である。
【図１６】図１６は、濾過したエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの一緒にした流通及び洗浄フラクションから分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの６０％メタノール溶離剤中に分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、準分取ＨＰＬＣ精製後に分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、準分取ＨＰＬＣによる精製後のエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】図２１は、非プロアントシアニジン・ピークに星印を付けた、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製する前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】図２３は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製する前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２４】図２４は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】図２５は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２６】図２６は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２７】図２７は、準分取ＨＰＬＣ精製後の、ブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２８】図２８は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２９】図２９は、準分取ＨＰＬＣによる精製後の、ブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３０】図３０は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３１】図３１は、準分取ＨＰＬＣによる精製後の、プラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３２】図３２は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから４０％及び７０％メタノール溶離中に分離されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３３】図３３は、精製エルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３４】図３４は、精製エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３５】図３５は、精製クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３６】図３６は、精製クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３７】図３７は、精製ブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３８】図３８は、精製ブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３９】図３９は、精製プラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図４０】図４０は、精製プラム非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）のＩＲスペクトルである。
【図４１】図４１は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４２】図４２は、準分取ＨＰＬＣ精製後の、クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４３】図４３は、クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年１１月２２日に出願された「全フェノールに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１０／３０２，２６４の優先権を主張するものであり、その出願は、２００１年８月３０日に出願した「アントシアニンに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／９４３，１５８、及び２０００年８月３１日に出願した「アントシアニンに富む組成物を製造するための効果的方法」と題する米国特許仮出願Ｎｏ．６０／２２９，２０５に関する主題を含んでいる。それらは全て、この言及により全体的にここに入れてある。
【０００２】
本発明は、植物材料からフラボノイド化合物を抽出及び精製することに関し、特に全フェノールに富む組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイド化合物は、あらゆる植物領域部分に存在し、皮、樹皮、及び種子の中に高濃度で見出されている。そのような化合物は、お茶、ココア、及びワインのような植物起源の数多くの飲み物の中にも見出されている。フラボノイドは、ポリフェノールと呼ばれている大きな系列の化合物の中の一つである。即ち、これらの化合物は、一つ以上の芳香族環に二つ以上のヒドロキシル基（ＯＨ）を含んでいる。ポリフェノール、特にフラボノイドの物理的及び化学的性質、分析、及び生物学的活性は、長年に亙って研究されてきた。
【０００４】
アントシアニンは、多くの果実、野菜、粒状穀物、及び花の赤色、紫色、及び青色の原因になっている天然産のフラボノイド化合物の特別な種類のものである。例えば、ブルーベリー、ビルベリー、ストロベリー、ラズベリー、ボイゼンベリー、マリオンベリー、クランベリー、エルダーベリー等のような果物の色は、多くの異なったアントシアニンによるものである。自然界には構造的に３００を越える異なったアントシアニンが判別されている。アントシアニンは天然産なので、それらは食物及び飲料の着色剤として使用するため大きな関心を集めている。
【０００５】
最近、食物の酸化防止剤として健康に有益な可能性を持つため、アントシアニン色素に対する関心が高まってきた。例えば、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ）のアントシアニン色素は、以前から見た目の鮮やかさを改良し、循環器障害を処置するために用いられてきている。或るアントシアニン及び他のフラボノイドが抗炎症性を有することが実験的に証明されている。更に、糖尿病及び潰瘍を処置するのにアントシアニンの経口投与が有益であり、抗フィルス及び抗菌活性を有するであろうと言う報告もある。フラボノイドのこれらの望ましい性質についての化学的根拠は、それらの酸化防止能力に関係していると考えられる。従って、イチゴ類及び他の果物及び野菜に伴われる酸化防止特性は、それらに含まれるアントシアニンに起因するものとされてきている。
【０００６】
「オリゴマー系プロアントシアニジン」、「ＯＰＣ」、又は「プロシアニジン」としても知られているプロアントシアニジンは、果物、野菜、ナッツ、種子、花、及び樹皮で広く入手することができる別の種類の天然産フラボノイド化合物である。プロアントシアニジンは、縮合タンニンとして知られている範疇に属する。それらは、果物及び野菜の中に見出される最も一般的な種類のタンニンであり、種子及び皮に多量に存在する。自然界では、異なったプロアントシアニジンの混合物が、個々の単位から、多くの結合単位の複雑な分子（オリゴマー又はポリマー）までの範囲で、一般に一緒に見出されている。重合体プロアントシアニジンの一般的化学構造は、共通のＣ（４）−Ｃ（６）及び／又はＣ（４）−Ｃ（８）結合によって一緒に結合されたフラボノイド３−オール単位の直鎖を含む。重合体プロアントシアニジンの構造を判定するのに１３Ｃ ＮＭＲが使用されてきており、最近の研究は、二、三、及び四量体プロアントシアニジンの化学を解明してきている。フラボノイド３−オール単位の一層長いオリゴマーは、殆どの植物に広く行き渡っており、２，０００ダルトンより大きな平均分子量を持ち、６以上の単量体単位を有することが見出されている〔ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）、その他、Ｍａｇ．Ｒｅｓ．Ｃｈｅｍ．，２５：１１８（１９８７）〕。
【０００７】
かなりの最近の研究で、プロアントシアニジンの酸化防止活性によって主に知られているその治療用途が開発されてきた。しかし、これらの化合物は、抗菌性、抗ウィルス性、抗癌性、抗炎症性、抗アレルギー性、及び血管拡張性作用を示すことも報告されている。更に、それらは脂質過酸化、血小板凝集、毛細管透過性、及び脆弱性を阻止し、ホスホリパーゼＡ２、シクロオキシゲナーゼ、及びリポキシゲナーゼを含む酵素系に影響を与えることが見出されている。例えば、プロアントシアニジン単量体（即ち、アントシアニン）及び二量体は、増大した毛細管脆弱性に伴われる疾病の処置に用いられており、動物の抗炎症効果を有することも示されている〔ベラジ（Ｂｅｌａｄｉ）その他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２８４：３５８（１９７７）〕。これらの報告された発見に基づき、オリゴマープロアントシアニジン（ＯＰＣ）は、数多くの症状を処置するための有用な成分になるであろう〔Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．５（２）：１４４−１５１（２０００）〕。
【０００８】
プロアントシアニジンは、ウィルスからも保護することができる。イン・ビトロ研究では、マンサク（ｗｉｔｃｈ ｈａｚｅｌ）からのプロアントシアニジンは、単純ヘルペス１（ＨＳＶ−１）ウィルスを殺した〔Ｃ．Ａ．チナルト（Ｃｉｎａｌｔ）、Ｊ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄ．Ｊｕｎｅ：６２（３）：２４１−５（１９９６）；デブルーイン（ＤｅＢｒｕｙｎｅ）Ｔ．、ピーターズ（Ｐｉｅｔｅｒｓ）Ｌ．、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｊｕｌ：６２（７）：９５４−８（１９９９）〕。種々のタンニンの抗ウィルス活性の構造・活性度関係を決定するために別の研究が行われた。化学構造を縮合する程、抗ウィルス効果は大きくなることが見出された〔タケチ（Ｔａｋｅｃｈｉ）Ｍ．、その他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｙ，２４：２２４５−５０（１９８５）〕。別の研究では、プロアントシアニジンが抗単純ヘルペス活性を有することが示されており、その場合単純ヘルペスプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を減少させるのに必要な５０％効果量は、５０％細胞毒量よりも２〜３桁小さかった〔フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）Ｋ．、その他、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，１１：２８５−２９８（１９８９）〕。
【０００９】
植物生成物の抗炎症効果を測定するため、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２）、又はプロスタグランジン・エンドペルオキシドＨシンターゼ（ＰＧＨＳ−１、ＰＧＨＳ−２）酸素が広く用いられている〔バイヤー（Ｂａｙｅｒ）Ｔ．、その他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｙ，２８：２３７３−２３７８（１９８９）；及びゴーダ（Ｇｏｄａ）Ｙ．、その他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：２４５２−２４５７（１９９２）〕。ＣＯＸ酵素は、非ステロイド系抗炎症剤のための薬理学的標的個所である〔フメス（Ｈｕｍｅｓ）Ｊ．Ｌ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：２０５３−２０５６（１９８１）；及びローメ（Ｒｏｍｅ）Ｌ．Ｈ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２：４８６３−４８６５（１９７５）〕。プロスタグランジン合成で含まれるシクロオキシゲナーゼの二つのアイソザイムは、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）である〔ヘムラー（Ｈｅｍｌｅｒ）Ｍ．、その他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５：２５１，５５７５−５５７９（１９７６）〕。選択的ＣＯＸ−２抑制剤は主に抗炎症活性の原因になることが仮定されている〔マスフェラー（Ｍａｓｆｅｒｒｅｒ）Ｊ．Ｌ．、その他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：３２２８−３２３２（１９９４）〕。フラボノイドは、現在抗炎症性物質としてのみならず、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）抑制活性に対するそれらの構造的特徴のために研究されつつある。
【００１０】
アントシアニン及びプロアントシアニジンの上記特性及び利点により、果物、野菜、及び他の植物源からそれらの化合物を抽出することに多くの努力が払われてきた。プロアントシアニジン及びアントシアニンの外に、植物、果物、及び野菜は、ミネラル塩、クエン酸又は酒石酸のような一般的有機酸、炭水化物、フラボノイドグルコシド、及びカテキンのような他の化合物も含んでいる。アントシアニン及びプロアントシアニジンを、他の天然産化合物から分離することが屡々望ましい。アントシアニンは、種々の方法により植物及び果物から抽出されてきた。アントシアニンを抽出する一つの方法は、両性イオン性物質を形成するために硫酸水素塩の添加を用いている。抽出物を、イオン交換カラムに通し、それにより両性イオン性アントシアニン付加物を吸収し、その吸収されたアントシアニンをアセトン、アルカリ、又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により樹脂から溶離する。この方法の欠点には、硫酸水素塩が存在することが含まれ、それがアントシアニンの吸着を妨害し、それにより多数のカラム吸着を必要とすることである。アルカリによる溶離はアントシアニンをかなり劣化するが、ＤＭＦは認められた食品添加物ではなく、従って、アントシアニンを食物製品に添加する前に完全に除去しなければならない。
【００１１】
これらのフラボノイド化合物を捕捉するためには、よく規定された正確な処理及び分離技術が必要である。ナフィシ・モバガール（Ｎａｆｉｓｉ−Ｍｏｖａｇｈａｒ）、その他による米国特許第５，９１２，３６３号明細書には、植物材料からプロアントシアニジンを抽出し、精製する方法で、植物材料の水性混合物を加熱し、その水溶液を限外濾過膜に通して濾過し、大きな分子量の重合体及び粒子を除去し、抽出されたプロアントシアニジンを含む透過液を生成させ、その透過液を、プロアントシアニジンを保持し、放出することができる吸着材料と接触させ、その保持されたプロアントシアニジンを極性溶媒で溶離することにより液体からプロアントシアニジンを分離することを含む方法を記載している。しかし、この方法は、非常に高い抽出温度を用いており、それがプロアントシアニジンの劣化を起こすことがある。更に限外濾過は、最終生成物から低分子量ポリフェノール物質を幾らか除去する。
【００１２】
種々の植物材料からプロアントシアニジン及び／又はアントシアニンを抽出及び分離する当分野で知られている多くの方法は、毒性及び／又は環境に有害な物質を用いている。従って、プロアントシアニジンを分離し、精製するために入手できる現在の方法は、その方法の全体的実行で種々の化学物質及び溶媒の廃棄についての考慮が重要な役割を果たす効率的な商業的方法まで規模を拡大することは容易なことではない。更に、プロアントシアニジン及びアントシアニンは、それらの劣化し易い自然的傾向を最少にするやり方で分離しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、栄養剤及び医薬で用いるためにプロアントシアニジンのようなフェノール化合物を含む組成物を分離し、精製する効率的な方法で、コスト的に効果的で、規模を大きくすることができ、経済的に健全であり、毒性溶媒又は薬品を用いる必要はなく、植物材料からフェノール化合物を、それらの劣化し易い傾向を最少にするやり方で分離する方法が依然として要求されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、全フェノールに富む組成物の抽出、分離、精製のための簡単で経済的な方法を与える。特に本発明の一つの態様は、（ａ）フェノール化合物を含有する一種類以上の植物材料の粗製抽出物で、プロアントシアニジン、アントシアニン、他の少量のフェノール及び非フェノール化合物を含む抽出物を与え；（ｂ）前記粗製抽出物を濾過し；（ｃ）前記粗製抽出物を、前記フェノールを放出可能に吸着するが、非フェノール化合物は実質的に保持しない臭素化ポリスチレン樹脂と接触させ；（ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄し、前記非フェノール化合物を溶離し；（ｅ）前記樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノールを含む第一フラクションを収集し；（ｆ）前記樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノールを含む第二フラクションを収集し；そして（ｇ）前記工程（ｅ）又は工程（ｆ）からのフラクションを分離するか、又は工程（ｅ）及び（ｆ）からの前記フラクションを一緒にし、全フェノールに富み、前記非フェノール化合物が殆ど無くなった組成物を得る；ことを含む全フェノールに富む組成物を製造する方法を与える。本発明は、更に、本発明の方法により分離された全フェノールに富む組成物を与える。
【００１５】
本発明は、更に、全フェノールに富む組成物を精留し、非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する方法を与える。本発明は、更に極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物を与える。極性プロアントシアニジンは、非極性プロアントシアニジンとは異なった生物学的活性を有することが判明した。
【００１６】
本発明の全フェノールに富む組成物を、Ｃ−１８親油性カラムで逆相ＨＰＬＣにより分析すると、２８０ｎｍ及び５１０ｎｍで吸収を示す化合物の複数の組の特性溶離ピークが観察される。特に、本発明の全フェノールに富む組成物は、ここに記載したようにＨＰＬＣ分析を行なった時、図１０〜１３に例示したのと実質的同じＨＰＬＣトレースで６０〜７５分の間の領域で一組の特性溶離ピークを有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の全フェノールに富む組成物をＩＲ分光測定により分析した場合、図３３〜４０に示したのと実質的に同じような化合物の特性吸収ピークが観察される。本発明の組成物は、栄養剤及び医薬として有用である。例えば、本発明の組成物は、抗感染（例えば、抗ウィルス、抗ＵＴＩ、及び抗菌）剤及び抗炎症剤として有用である。
【００１８】
本発明の前記及び他の特徴、有用性及び利点は、本発明の好ましい態様についての次の一層特別な記述から、図面に例示したように、また特に特許請求の範囲で指摘するように、明らかになるであろう。
【００１９】
ここに組込み、明細書の一部を形成する図面は、本発明の態様を例示するが、本発明を限定するものではなく、その記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【００２０】
本発明の詳細な記述
本発明は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのような天然にフェノール化合物を含有する植物材料から全フェノールに富む組成物を製造する方法を与える。本発明の方法は、更に全フェノールに富む組成物を与える。
【００２１】
ここで用いる用語「抽出」とは、全植物から、又は果実、葉、茎、根、樹皮等のような植物の種々の部分から、調製された抽出物を含めた、天然にフェノール化合物を含む植物源から誘導された物質を指す。従って、本発明の方法は、抽出物を調製するのに用いられる植物の特定の部分に限定されるものではない。本発明の方法は、アントシアニン及びプロアントシアニジンのどのような原料でも用いることができ、最も典型的には、種子、果実、皮、野菜、ナッツ、樹皮、及びフェノール化合物を含む他の植物材料のような、植物から誘導される植物材料からの原料を用いることができる。殆どの色のついた果実、イチゴ類、及び野菜は、フェノール化合物を含むことが知られている。フェノール化合物を含む植物、果実、イチゴ類、及び野菜の例には、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ、カーラント、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモが含まれるが、それらに限定されるものではない。植物原材料は、そのまま（湿潤状態で）用いてもよく、又は抽出する前に乾燥してもよい。場合により植物原材料は、抽出前に、アントシアニン及びプロアントシアニジン含有量の低い成分を分離及び除去することにより分類してもよい。
【００２２】
一つの態様として、本発明のフェノールに富む組成物は、ブルーベリー、ビルベリー、エルダーベリー、プラム、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、及びグレープ（それらに限定されるものではない）を含めた、フェノール化合物を含む一種類以上のイチゴ類及び／又は果実を抽出し精製することにより得られる。
【００２３】
ここで用いられる用語「フェノール」及び「フェノール化合物」は交換することができるものとして用いられており、一つ以上のフェノール基を有する単量体、オリゴマー、及び重合体化合物が含まれ、アントシアニン、プロアントシアニジン、及びフラボノイドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２４】
ここで用いられる用語「全フェノールに富む組成物」（“ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”）とは、一種類以上のフェノール化合物に富み、植物、果実、イチゴ類、及び野菜の粗製抽出物中に存在する非フェノール化合物が実質的になくなったレベルになっている組成物を指す。そのような非フェノール化合物の例には、砂糖、セルロース、ペクチン、アミノ酸、タンパク質、核酸、植物ステロール、脂肪酸、及びトリグリセリドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の方法は、慣用的ポリスチレン樹脂又は他の当分野で用いられている樹脂によるよりも、臭素化ポリスチレン樹脂でフェノール含有抽出物を精製すると、下で詳細に論ずるように、一層大きな純度を有する全フェノールに富む組成物を与えると言う発見に基づいている。
【００２６】
図１は、全フェノールに富む組成物を製造することができる本発明の方法の一つの態様の工程を示す製造工程図である。本発明の方法は、幾つかの処理工程を除き、その処理で必要な薬剤の量を減少し、それにより製造コスト及び廃棄物を捨てる問題を少なくすることにより、経済的及び効率的に全フェノールに富む組成物を得る方法を与える。
【００２７】
本発明の方法の一つの態様として、図１の工程１０〜７０に例示したように、フェノール化合物（例えば、プロアントシアニジン及びアントシアニン）及び非フェノール化合物を、新しい又は乾燥した触媒材料から抽出する（工程１０）。当業者は、バット（ｖａｔ）抽出、浸出、向流抽出等のような種々の抽出法が文献で得られることを認めるであろう。特別な抽出方法を用いることは本発明の方法に本質的なことではない。抽出処理の前に植物材料を或る程度粉砕することは、接触させる抽出溶媒に対し充分な粒子表面積を与える筈である。
【００２８】
図１に示した方法の一つの態様として、抽出工程（工程１０）は、適当な量の抽出溶媒中に新しい又は乾燥した植物材料を入れることにより達成される。一つの態様として、抽出溶媒は、水の中に約０〜９５％のエタノールを入れ、約０〜３％、一層好ましくは約０．００６〜０．０１２重量％の量の適当な酸を含む酸性化アルコール溶液を含む。別の態様として、抽出溶媒は、水の中に約０〜１００％のメタノール、及び約０〜３重量％の適当な酸を含む酸性化アルコール溶液を含む。抽出工程で用いることができる適当な酸には、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、酢酸（ＨＯＡｃ）、又は塩酸（ＨＣｌ）が含まれるが、それらに限定されるものではない。抽出溶液に酸を添加することは、プロアントシアニジン及びアントシアニンの劣化を防ぐ。従って、一つの態様として、図１に例示したような本発明の方法の工程の殆どに亙って、酸性状態を維持する。植物材料を抽出溶液と適当な長さの時間、ほぼ室温から７５℃、好ましくは４０℃の温度で接触させ、粗製抽出物を形成する。抽出処理で用いられる抽出溶媒に対する植物材料の量は、ｇ／ｍｌの基準で、約２：１〜約１：２０の範囲にある。一つの態様として、植物材料対抽出溶媒の比は、約１：４〜１：８である。
【００２９】
粗製抽出物は、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び他のフェノールのようなフェノール化合物のみならず、砂糖、ペクチン、植物ステロール、脂肪酸、トリグリセリド、及び他の化合物のような望ましくない非フェノール物質も含む。粗製抽出物中に含まれている固体残留物を液体部分から分離し、それら固体を上に記載したように再抽出するか、又は廃棄する。
【００３０】
工程１０（図１）の一つの態様として、抽出処理の前又はその間に、植物材料又は抽出溶媒にペクチナーゼを添加する。別法として、抽出処理が完了した後の粗製抽出物にペクチナーゼを添加してもよい。ペクチナーゼは、抽出処理中、又はその後のいずれかの点で抽出物がゲル化するのを防ぐ働きをし、その結果抽出物はカラム精製中流動性を維持するであろう。ペクチナーゼの添加量は、勿論抽出物を製造するのに用いられる植物材料の量に依存するであろう。典型的には、ペクチナーゼは、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で添加する。
【００３１】
続けて図１を参照して、工程１０で粗製抽出物を製造するためにエタノール性又はメタノール性抽出溶媒を用いた場合、粗製抽出物が含むエタノール又はメタノールが６％より少なくなるまで粗製抽出物を濃縮し、好ましくは濃縮中４０℃以下の温度を維持しながら濃縮する（工程２０）。濃縮粗製抽出物を希釈するため水を添加し、その希釈した粗製抽出物を工程３０前に濃縮し、水で再び希釈するか、又は第二希釈を行わずに工程３０へ直接送る。勿論、粗製抽出物を製造する際に抽出溶液として水を用いたならば、工程２０は不必要であり、この場合、工程１０からの粗製抽出物を、図１の点線矢印で示したように、工程３０へ直接導入する。
【００３２】
図１で示した方法の工程３０は、工程１０又は２０からの粗製抽出物を濾過して、粗製抽出物から沈殿していることがある固体を除去することを含む。本発明者は、工程１０について記述したように、抽出条件を調節することにより、工程３０で濾過することにより粗製抽出物から沈殿した望ましくない非フェノール化合物の量が増大することを発見した。本発明の方法の濾過工程３０では、種々の濾過方法を用いることができる。工程３０で用いることができる一つの濾過方法は、測定した量の、珪藻土又はセルロースのような濾過助剤を粗製抽出物へ添加することを含む。粗製抽出物と濾過助剤との混合物は、均質になるまで振盪又は撹拌し、フィルター助剤の床に通して濾過するのが好ましい。その床は酸性水溶液、好ましくは約０．００６％の硫酸水溶液で洗浄する。
【００３３】
図１の工程３０に用いることができる他の濾過方法には、砂の床、又は好ましくはガラスウールで覆った３０μのポリプロピレンフィルターを通して粗製抽出物を濾過することが含まれる。更に別の濾過方法は、袋フィルター（ポリエチレン又はポリプロピレンから構成された袋型の布フィルター）を用いることが含まれ、それは、下に記載する工程４０の精製カラムとインライン状態に配置するのが有利であろう。上に記載したフィルターは、沈澱した固体を除去するために用いられ、粒径分離フィルターではない。
【００３４】
図１に示した方法に従いフェノール化合物を分離するためには、工程３０で分離した濾過抽出物を、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を放出可能に吸着することができる臭素化ポリスチレン吸着材料と接触させるが、それは、濾過抽出物中に存在していた望ましくない非フェノール材料は余り保持しない。本発明者は、全フェノールに富む高純度組成物は、工程３０で分離した濾過抽出物を、ミツビシ・ケミカル・アメリカにより製造されているＳＰ−２０７〔スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルバニア州ベラフォンテ〕のような臭素化ポリスチレン樹脂で精製することにより得ることができると言うことを発見した。ＳＰ−２０７樹脂は、逆相クロマトグラフィー用として設計されたマクロポーラスな臭素化スチレン重合体ビーズ型の樹脂であり、約２５０〜６００μの粒径分布、及び約１００〜３００Åの気孔孔径範囲を有する。芳香族環の臭素化は、ポリスチレン樹脂に増大した疎水性を与え、従来のスチレン・ジビニルベンゼン重合体逆相支持体に比較して疎水性分子に対する選択性が増大した樹脂を与えるように設計されている。臭素化ポリスチレン樹脂は、強い結合性のため、典型的には天然の生成物の精製には用いられてはいない。
【００３５】
このように、慣用的ポリスチレン樹脂は、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物を余りにも強く結合する傾向を持つため、ポリスチレン樹脂からそのような化合物を溶離することは非常に困難であることが知られており、そのため、臭素化ポリスチレン樹脂はフェノール化合物を更に一層強く結合するであろうと予想されていた。従って、臭素化ポリスチレン樹脂がフェノール化合物の精製に適していると言うことは予想されていなかったことである。しかし、本発明者は臭素化ポリスチレン樹脂が、プロアントシアニジン及びアントシアニンのようなフェノール化合物と結合する強さは、非臭素化ポリスチレン樹脂よりも弱く、然も、依然としてフェノール化合物を、望ましくない非フェノール化合物から分離することができると言うことを驚いたことに予想外に発見した。
【００３６】
図１に示した方法の一つの態様として、工程３０で分離した濾過抽出物を、約２５０〜６００μの粒径分布及び約１００〜３００Åの気孔孔径範囲を有する臭素化ポリスチレン樹脂を充填したカラムにロード（ｌｏａｄ）する（工程４０）。しかし、工程４０はここではカラムに充填した樹脂と抽出物とを接触させると言う表現でここでは記述しているが、そのような記述は単に説明をし易くするためのものである。例えば、樹脂は本発明の方法を遂行するためにカラムの中へ充填する必要はない。カラムにロードする濾過抽出物の量は、粗製抽出物を調製するために用いられる植物材料に依存する。例えば、粗製抽出物をビルベリーから調製する場合には、全フェノールの約１６〜３０ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。別の例として、粗製抽出物をブルーベリーから調製する場合、全フェノールの約１５〜４５ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。粗製抽出物をエルダーベリーから調製する場合、全フェノールの約１５〜４０ｇを１リットル当たりの樹脂にロードすればよい。濾過抽出物は、濃厚な粗製抽出物中の固体濃度が２００ｇ／ｌを越えるならば、ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）する前に水で希釈してもよい。工程４０（図１）でカラムにローディングしている間に溶離してくるフラクションは、「フラクション１」として収集する。
【００３７】
濾過粗製抽出物を樹脂にローディングした後、吸着剤に殆ど又は全く親和力を持たない望ましくない非フェノール物質（例えば、砂糖、塩、有機酸等）を、硫酸水溶液、酢酸水溶液、又は塩酸水溶液のような少なくとも０．００３％の酸を含む水性洗浄溶媒で樹脂から溶離する（図１、工程５０）、例えば、約３カラム体積の０．００６％の硫酸水溶液又は０．１％の酢酸水溶液を用いて余計な物質を溶離することができる。その溶離物を「フラクション２」として収集する。
【００３８】
続けて図１を参照し、カラムを次に約５０〜７０％のエタノール／水又は約５０〜９０％のメタノール／水のような極性有機溶媒を含む第一溶離剤で溶離する（工程６０）。工程６０では、約２〜１２カラム体積の溶離用溶媒を用いるのが典型的である。一つの態様として、第一溶離剤は、硫酸、塩酸、又は酢酸のような酸を約０．００３％含有する。溶離工程６０中に収集されたフラクション（単数又は複数）は、「フラクション３」として収集する。「フラクション３」は、粗製抽出物中に含まれていたフェノール化合物の一部分を含有し、特にアントシアニンに富み、プロアントシアニジンを含む。
【００３９】
ＵＶ−ＶＩＳ分光分析により決定して、アントシアニンの大部分がカラムから溶離された後、アントシアニンを溶離するために用いた溶媒（工程６０）よりも一層大きな％のエタノール又はメタノールを含有する極性有機溶媒を含む第二溶離剤でカラムを溶離する（工程７０、図１）。例えば、第二溶離剤は、約５０〜９０％のエタノール／水、又は約７５〜１００％のメタノール／水を含む。溶離工程７０中で収集されたフラクション（単数又は複数）は、「フラクション４」として収集する。「フラクション４」には、粗製抽出物中に最初に含まれていたフェノール化合物の次の部分が含まれており、典型的には、プロアントシアニジンに富んでいる。「フラクション４」は、溶離工程６０で分離されなかったアントシアニンも含んでいることがある。
【００４０】
「フラクション３」及び「フラクション４」中のフェノール化合物の回収は、蒸発、蒸留、冷凍乾燥等のようなどのような慣用的やり方で達成してもよく、本発明の全フェノールに富む組成物を与えることができる。
【００４１】
上で述べた方法は、エルダーベリー、プラム、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、レッドカーラント、ブラックカーラント、クランベリー、チェリー、ラズベリー、グレープ、ハイビスカスの花、シシトウガラシ、豆、エンドウ豆、赤キャベツ、パープルコーン、紫サツマイモを（それらに限定されるものではない）を含めたフェノール化合物を含む種々の植物材料から栄養剤として用いるための全フェノールに充分富む組成物を製造するのに適している。一つの態様として、本発明の富化組成物は、少なくとも１０〜８０％の全フェノールを含有する。別の態様として、それら組成物は、少なくとも１２％の全フェノールを含有する。更に別の態様として、それら組成物は、少なくとも２５％の全フェノールを含有する。
【００４２】
特に果物及びイチゴ類から製造された、全フェノールに富む組成物、特に「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せから分離された組成物は、果物及びイチゴ類とは別の植物材料から製造された組成物のＨＰＬＣクロマトグラムには含まれていない、図１２及び１３に示されているもののような特性ピークを有する同様なＨＰＬＣクロマトグラムを生ずることが発見された。例えば、図１に例示した方法に従って、果実及びイチゴ類から製造され、「フラクション４」から分離された全フェノールに富む全ての組成物のＨＰＬＣクロマトグラムは、エルダーベリーから分離された「フラクション４」組成物について図１２及び１３で示したクロマトグラム中のピークと同様に、６０〜７５分の間の特性ピークを含むことが判明した。「フラクション３」「フラクション４」、又はそれらの組合せのいずれかから分離され、特に果物及びイチゴ類から製造された本発明の全フェノールに富む組成物は、下で詳細に記述するように、抗感染（例えば、抗ウィルス）及び抗炎症活性を有する。
【００４３】
本発明の全フェノールに富む組成物をＩＲ分光測定により分析すると、フェノール化合物からの特性ピークも観察される。特に、本発明の全フェノールに富む組成物は、図３３〜４０に例示したのと実質的に同じＩＲ吸収ピークを有することを特徴とする。
【００４４】
全フェノールに富む組成物（例えば、「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せ）は、例１１に詳細に記述し、図１５に示したように、Ｃ−１８のような逆相親油性カラムによる低圧真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）を用いて更に「極性」プロアントシアニジンに富むフラクションと、「非極性」プロアントシアニジンに富むフラクションへ分配することができることも発見された。例えば、エルダーベリー抽出物から分離された「フラクション３」組成物を水に溶解し、Ｃ−１８カラムにロードする。そのカラムを１００％の水で洗浄し、Ｃ−１８媒体により強くは保持されていなかった物質を収集した。流通洗浄フラクションを「フラクション５」として一緒にし、一層極性のプロアントシアニジンを含んでいた。従って、「フラクション５」を、ここでは「極性」プロアントシアニジンに富む留分として言及する（図１５）。エルダーベリーからの極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」は、幾らか紫色を有するのが典型的であり、このフラクション中の重合体がオリゴマープロアントシアニジン鎖中に一つ以上の陽イオン性アントシアニジン・サブユニットを含んでいることを示唆している。次にＶＬＣカラムを、３０〜１００％のメタノールで溶離し、低圧カラムで用いたＣ−１８媒体により一層強く保持されていたプロアントシアニジンを収集した。メタノールフラクションを「フラクション６」として一緒にし、「フラクション５」に収集されたものよりも極性の低いプロアントシアニジンを含んでいた。従って、「フラクション６」は、ここでは「非極性」プロアントシアニジンに富むフラクションとして言及する（図１５）。非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」は、色があったとしても極めて僅かであり、このフラクション中のオリゴマープロアントシアニジン鎖は、陽イオン性アントシアニジン・サブユニットを含まないことを示唆している。
【００４５】
従って、本発明は、「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せの中に含まれている非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する便利な方法を与える。極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」及び非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」は、濾過した粗製水性抽出物（図１、工程３０）をＣ−１８ＶＬＣカラムに直接ローディングすることにより分離することができることも判明した。分離したプロアントシアニジンに富むフラクション５及び６を記載するのに用いた場合の用語「極性」及び「非極性」は、夫々、フラクション５及び６中のプロアントシアニジンの極性が互いに対し相対的なものであること、即ち、Ｃ−１８ＶＬＣカラムでの特定のフラクションがどのように挙動するかに言及したものであることを理解すべきである。本発明の極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション５）及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション６）は、実施例で論ずるように、アントシアニンのレベルが実質的に減少している。
【００４６】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション（夫々、「フラクション５」及び「フラクション６」）は、異なった生物学的活性を有することが判明しており、非極性フラクションは、例１７に記載するような或る検定では極性フラクションよりも大きな抗ウィルス活性を有することが判明している。
【００４７】
極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション５及び６の各々は、夫々、図１５に示し、例１２〜１４に記載するように、更に精製することができる。例えば、ＶＬＣ分離中に分離された極性プロアントシアニジンに富む「フラクション５」は、準分取（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムにロードし、それにより極性プロアントシアニジンを放出可能に保持することができる。次にそのカラムを、アセトニトリル、メタノール、又はエタノールをそれらの％が増大していくようにして含む濃度勾配を持つ溶媒で洗浄し、アントシアニン及び他の極性化合物の殆どを溶離し、次に少なくとも６０％のアセトニトリル、メタノール、又はエタノールで洗浄し、精製された極性プロアントシアニジンを含む「フラクション７」を溶離する（図１５）。更に、ＶＬＣ分離中に分離された非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション６」を、更にゲル濾過、又は逆相準分取ＨＰＬＣにより精製することができる。ゲル濾過は、サイズ排除又はゲル浸透クロマトグラフィーとも呼ばれており、分子をそれらの大きさに従い分離する液体クロマトグラフィー技術である。この種の媒体は、小さな化合物を保持するが、大きな非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション８」（図１５）は、流通する溶離剤によって溶離する。本発明の精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富むフラクション７及び８は、夫々アントシアニン及びフラボノイドのレベルが実質的に減少しており、非フェノール化合物のレベルも実質的に減少している。精製された極性及び非極性プロアントシアニジンに富む「フラクション７」及び「フラクション８」は、夫々、異なった生物学的活性を有することが更に観察された。
【００４８】
本発明の全フェノールに富む組成物（「フラクション３」、「フラクション４」、又はそれらの組合せ）、極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション５及び７）、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物（フラクション６及び８）は、或る範囲の生物学的活性を有する。例えば、本発明の組成物は、例１５及び１６に記載するように、抗ウィルス活性を有することが見出された。本発明の組成物は、それらを単独で用いるか、又は他の抗ウィルス剤と組合せて用い、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣ、パラインフルエンザウィルス、アデノウィルス型１、Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏウィルスＡ、単純ヘルペスウィルスＩ及びＩＩ、ライノウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、麻疹ウィルス（それらに限定されるものではない）を含めたウィルスによるウィルス感染により引き起こされた又はそれらと合併した病気を予防及び／又は処置するのに用いることができる。従って、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、そのようなウィルスにより引き起こされた病気に対し、本発明の組成物を治療として有効な量投与することにより予防及び治療用途で有利に用いることができる。
【００４９】
プロアントシアニジンは、それらがシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性を阻害することによる抗炎症物質として研究されてきている。抗炎症性物質は、ＣＯＸ−１阻害よりもむしろＣＯＸ−２阻害に対し選択性であることが望ましいことが示されてきている。従って、本発明の別の態様は、治療に有効な量の本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物を投与することを含む哺乳類の炎症性疾患を処置する方法を含む。例えば、ブルーベリー抽出物の精製中、フラクション３及び４として分離された全フェノールに富む組成物は、大きなＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１阻害選択性及び１０８μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有することが判明した（例１７）。本発明の組成物は、単独で用いるか、又は他の抗炎症剤と組合せて用い、炎症反応を防止又は阻止することができる。そのような反応は、骨関節症、アレルギー性鼻炎、心臓血管系疾病、上気道疾病、創傷感染、神経炎、及び肝炎（それらに限定されるものではない）を含めた症状又は疾病により起こされることがある。
【００５０】
クランベリー及びブルーベリーから分離されたプロアントシアニジンは、バクテリアが膀胱壁に付着するのを防ぎ、それにより尿路感染のような疾患の可能性を減少することが知られている〔ホウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）、その他、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３９：１０８５−１０８６（１９９８）〕。プロアントシアニジンはバクテリアの付着を防ぐことによりそれらの効果を及ぼすものと仮定されている。従って、本発明の別の態様は、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、又は非極性プロアントシアニジンに富む組成物をそのような感染に伴われる症状を予防、減少、又は排除するのに充分な量の効果的な量で投与することを含む哺乳類の泌尿生殖器感染を予防又は処置する方法を含む。本発明の組成物は単独で用いるか、又は他の抗菌剤と組合せて用いることができる。
【００５１】
プロアントシアニジンは、強力な酸化防止剤であることも知られている。例えば、プロアントシアニジンの酸化防止剤としての効果は、心臓血管系及び免疫系に対するそれらの薬効の多くの原因になっていると推定されている。従って、本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、人間及び哺乳類の食事の補充剤（例えば、食事の抗酸化剤）として、及び疾患の処置のために用いることができる。例えば、本発明の組成物は、目に見える激しさを改善し、循環系疾患、糖尿病、及び潰瘍を処置するために用いることができる。
【００５２】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、アラビノガラクタン、エキナセア種、ビタミン類、ミネラル類、多糖類、及び距骨（それらに限定されるものではない）を含む、免疫活性剤と組合せることもできる。
【００５３】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイド（それらに限定されるものではない）を含めた抗突然変異剤と組合せることもできる。
【００５４】
本発明の全フェノールに富む組成物、極性プロアントシアニジンに富む組成物、及び非極性プロアントシアニジンに富む組成物は、丸薬、カプセル、液体、チンキ剤として配合してもよい。本発明による組成物を配合する場合、広い範囲の賦形剤を用いることができ、勿論、それらの性質は、組成物の目的とする用途方式に依存するであろう。賦形剤の例には、防腐剤、キャリヤー、緩衝剤、濃化剤、懸濁剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び芳香剤、特にカルボキシビニル重合体、プロピレングリコール、エチルアルコール、水、セチルアルコール、飽和植物トリグリセリド、脂肪酸エステル又はプロピレングリコール、トリエタノールアミン、グリセロール、澱粉、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、硫酸ラウリル、燐酸二カルシウム、レシチン等が含まれる。
【００５５】
上の記載は、本発明の原理を単に例示するに過ぎないものと考えられる。更に、多くの修正及び変化が容易に当業者には思いつくであろうから、上に記載し、示した構成及び方法に正確に本発明を限定することは望ましくない。従って、全ての適当な修正及び同等なものは、後の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に入るものと見做すことができる。
【００５６】
本明細書及び後の特許請求の範囲で用いられる言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、記述した特徴、整数、成分、又は工程の存在を特定化することを意図したものであるが、それらは一つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。
【実施例】
【００５７】
例１
水抽出を用いたビルベリーの精製
乾燥ビルベリー原料１ｋｇについて３回の抽出を行なった。最初の抽出は６リットルの水を用い、他の２回の抽出は４リットルの水を用いた。全ての抽出は、濃硫酸で５ｇ／ｌの酸濃度まで酸性化した。粗製抽出物には約８８％のアントシアニンが回収された。粗製抽出物の正確に２．３リットルを、フィルターの上にガラスウールの層を用いた３０μポリプロピレンフィルターに通して濾過した。ガラスウールを１回交換し、フィルターを脱イオン水で濯いだ。濾液の最終的体積は２．４３リットルであり、濾液の中には９０．９％のアントシアニンが回収された。
【００５８】
臭素化ポリスチレン樹脂ＳＰ−２０７〔スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；ペンシルバニア州ベレフォンテ〕をカラムに充填し、０．１％の酢酸で平衡にした。カラムに、２９．８ｇ／ｌの固体濃度を持つ２．２４リットルの濾液を、２．２ｍｌ／分の流量を用いてロードさせた。ローディング漏洩は、導入したアントシアニンの０．９％より少なく、全損失は、ローディング及び最初の２回のカラム洗浄でアントシアニンの４．０７％であった。溶離工程ではアントシアニンの８８．４％が回収され、アントシアニンの物質収支は９２．５％であった。回転蒸発器で数百ｍｌの溶離生成物を蒸発乾固し、次に凍結乾燥した。乾燥した生成物の最終的分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。富化組成物は、合計４３重量％のアントシアニンを含んでいた。
【００５９】
例２
７０％のエタノール抽出を用いたビルベリーの精製
２．０％のアントシアニンとして分析された乾燥ビルベリー原料（６６７ｇ）を、体積で３％の硫酸を含む７０％エタノール／水を用いてパーコレーションにより抽出した。粗製抽出物中の固体は、３．９重量％の全アントシアニンを含んでいた。第一抽出体積１リットルを、１００ｍｌの脱イオン水と混合し、約４６０ｍｌまで真空蒸発してアルコールを除去した。脱イオン水（３００ｍｌ）を混合物に添加し、更に１７０ｍｌの液体を蒸発した。脱イオン水（２１０ｍｌ）を添加し、最終体積を８００ｍｌにした。その水性混合物に１５０ｇのセライト５１２（固体１ｇ当たり０．５〜０．９ｇ／ｌのセライト）を添加した。混合物を均質になるまで振盪した。セライト／抽出物混合物を、真空中で３０ｇの湿ったセライト５１２床上に注いだ。濾過が完了した後、床を２００ｍｌずつの中に１％の硫酸水溶液１．２０リットルを入れたもので洗浄した。濾液体積は１８５５ｍｌであった。その濾液に、１４５ｍｌの脱イオン水を添加し、最終的体積を２．０リットルにした。
【００６０】
濾液の一部分（６９５ｍｌ）を、１７０ｍｌの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）を充填したカラムに２．２ｍｌ／分（１．３ｍｌ／分／ｃｍ２）でロードした。これによりカラム媒体１リットル当たり１７ｇのアントシアニンの負荷値を与えた。カラムを１カラム体積の０．１％酢酸水溶液で洗浄し、次に２．５カラム体積の０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノール／９０％水で洗浄した。次にカラムを１０カラム体積の７０％エタノール／水で溶離し、７０％のエタノールフラクションを一緒にし、６０℃及び５０ミリバールで真空濃縮し、暗く輝いた乾燥無定形固体（「フラクション３」）を与えた。その乾燥生成物の最終分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。富化組成物は、合計３２重量％のアントシアニンを含んでいた。
【００６１】
図２及び３は、本発明の方法に従ってビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の、夫々５１０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００６２】
表１には、典型的なアントシアニンに富む組成物（「フラクション３」）中の各アントシアニン％が要約してある。
【００６３】
【表１】
【００６４】
例３
ブルーベリーからの全フェノールに富む組成物
１０リットルの丸底フラスコ中で、乾燥粉砕ブルーベリー〔イリノイ州、モーメンスのファン・ドルネン・フューチャー・シューティカルズ（Ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃｅｕｔｉｃａｌｓ）〕９４０ｇに、４．０リットルの抽出溶媒（７０％のエタノール中に１．０％ｗ／ｖの硫酸を入れたもの）を添加した。フラスコを４０℃に維持した一定温度の水浴中で２時間回転した。混合物をかき回し、１５０ｇのセライト５１２床に真空中で通し、濾過した。ブルーベリー・バイオマス濾滓を、５００ｍｌの抽出溶媒で洗浄した。濾滓をセライト床から注意して掻き取り、丸底フラスコ中に注入し、上記手順に従って再び抽出した。次に、三回目の抽出を行なった。三つの粗製抽出物を一緒にした。
【００６５】
一緒にした抽出物の一部分（２．００リットル）を、４０℃の水浴温度で１７５ｍｌまで真空濃縮した。蒸発した抽出物を脱イオン水で希釈し、６７５ｍｌの粗製ブルーベリー抽出物を与えた。その粗製抽出物を、濾過せずに、１７０ｍｌの臭素化ポリスチレン樹脂（ＳＰ−２０７）を充填した、予め調整した（即ち、アセトンで洗浄した）平衡カラムにロードした。カラムを０．１％酢酸及び０．１％ＨＯＡｃ／１０％エタノールで洗浄した。アントシアニンを７０％エタノールで溶離した。生成物プールを６０℃及び５０ミリバールで真空蒸発した。最終生成物分析は、塩化デルフィニジン標準（１．０ｃｍで１０２吸光度単位／ｇ／ｌ）に対し５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計により決定した。精製ブルーベリー組成物は、合計１８重量％のアントシアニンを含み、アントシアニンの全回収率は９５％であった。
【００６６】
図４及び５は、本発明の方法に従ってブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の、夫々５１０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００６７】
例４
ブルーベリーからの全フェノールに富む高純度組成物
この例では、例３に記載したようにして製造された、ブルーベリーから製造され、１８重量％の全アントシアニンを有する全フェノールに富む組成物の一部分を、強又は弱陰イオン交換樹脂に通して残留酸を除去し、富化組成物の純度を増大した。
【００６８】
約１．０ｇの全フェノールに富むブルーベリー組成物を、５０ｍｌの水に溶解し、強陰イオン交換樹脂〔スーパー（Ｓｕｐｅｒ）Ｑ−６５０Ｍ；トーソーハース（ＴｏｓｏＨａａｓ）；ペンシルバニア州モントゴメリー〕、又は弱陰イオン交換樹脂〔ＤＥＭ−６３；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）〕の入った９ｍｌのカラムに通した。カラムを３０〜３５ｍｌの水で洗浄した。強陰イオン交換樹脂カラムの場合には、樹脂を更に２５ｍｌの２０％エタノールで洗浄し、次に４０％のエタノールで洗浄した。強陰イオン交換カラムから分離した組成物は、２８．３重量％の全アントシアニンを含み、回収率は８８％であった。弱陰イオン交換カラムから分離された組成物は３０．６重量％の全アントシアニンを含み、回収率は８８％であった。
【００６９】
例５
ペクチナーゼ処理を用いてビルベリーからの全フェノールに富む組成物
１０２４ｇの冷凍ビルベリーに暖かい水（５４８ｇ）を添加した。混合物を混合機中でピューレにし、次に４０℃に加熱した。次に１５０μｌのペクチナーゼ〔クエスト・スーパー（Ｑｕｅｓｔ Ｓｕｐｅｒ）７ｘ；クエスト・インターナショナル（Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ニューヨーク州ノルウィッチ〕を撹拌しながら添加し、４０℃で３０分間処理した。そのスラリーに約４ｍｌの濃硫酸を添加し、０．５％（ｗ／ｗ）の酸濃度を達成した。次に混合物を４５℃に加熱し、非常にゆっくり撹拌しながら１５分間抽出した。ジカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）（１６４ｇ）をその抽出混合物に添加し、それを次に２６ｇのジカライト床で濾過した。得られた濾滓を４００ｍｌの暖かい０．１％硫酸水溶液で３回洗浄した。この抽出物を２５μｍ加圧フィルターに通して濾過した。全ての濾過抽出物（２．４リットル）を、１７０ｍｌのＳＰ−２０７カラムにロードした。ローディング後、カラムを０．１％酢酸水溶液で洗浄し、７０％エタノール水溶液で溶離し、「フラクション３」を与えた。「フラクション３」を蒸発乾固し、次に４８時間凍結乾燥器に入れた。最終生成物を、５３５ｎｍでの吸光度を標準分光光度計で決定することにより全アントシアニンについて分析した。全フェノールに富む組成物は、４０重量％の全アントシアニンを含んでいた。アントシアニンの全回収率は約７９％であった。
【００７０】
例６
エルダーベリー・バイオマス粉末からの富化組成物
分析によりアントシアニンが１．８８％、全フェノールが５．３１％の乾燥エルダーベリー・バイオマス粉末〔ＢＩニュートラシューテカルズ（Ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カリフォルニア州ロングビーチ〕約１９０ｇを１０００ｇの暖かい水に添加した。溶液を完全に混合し、４５℃の熱い水浴へ移した。その溶液に１９０μｌのペクチナーゼ（スーパー７Ｘ、クエスト）を添加し、次に混合物を３０分間放置した。２．５ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４を用いて混合物を２．５のｐＨまで酸性化し、１０分間穏やかに混合した。この酸性化混合物に、１６４ｇのセライトを添加し、次にその酸性化混合物を２６ｇのセライト床で濾過した。濾滓を４００ｍｌの酸性化温水で３回、合計１２００ｍｌで洗浄した。次に濾液を２５μｍ加圧フィルターに通して濾過し、エルダーベリー抽出物を与えた。
【００７１】
エルダーベリー抽出物を１７０ｍｌのＳＰ−２０７（三菱化学）臭素化ポリスチレンカラムに２．３ｍｌ／分（１．３ｍｌ／分／ｃｍ２）の速度でロードした。ローディング中にカラムから収集した溶離物は、「フラクション１」として収集した。ローディング後、カラムを３カラム体積（３×１７０ｍｌ）の０．００６％の硫酸水溶液で洗浄した。この洗浄による溶離物を「フラクション２」として収集した。次にカラムを８〜１０カラム体積の７０％エタノール水溶液で溶離し、それを「フラクション３」として収集した。次にカラムを３カラム体積の９０％エタノール水溶液で洗浄し、それを「フラクション４」として収集した。カラムを、８カラム体積の０．００６％の硫酸水溶液で再び平衡にした。フラクション３及び４を蒸発乾固し、次に乾燥するまで冷凍乾燥した。臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離中に分離したフラクションの幾つかを、例７及び８に記載したようにしてアントシアニン及び全フェノールについて分析した。表２にカラムデーターを要約する。
【００７２】
【表２】
【００７３】
図６〜１３は、濾過したエルダーベリー抽出物及びカラム精製中に分離した或るフラクションのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。用いたＨＰＬＣ条件は、例９に記載した通りである。
【００７４】
図６及び７は、濾過したエルダーベリー抽出物の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７５】
図８及び９は、濾過エルダーベリー抽出物を臭素化ポリスチレン樹脂にカラム・ローディングしている間に収集された「フラクション１」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７６】
図１０及び１１は、臭素化ポリスチレン樹脂から７０％のエタノールを用いて、濾過エルダーベリー抽出物をカラム溶離している間に収集された「フラクション３」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７７】
図１２及び１３は、臭素化ポリスチレン樹脂から９０％のエタノールを用いて、濾過エルダーベリー抽出物をカラム溶離している間に収集された「フラクション４」の、夫々２８０ｎｍ及び５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【００７８】
本発明の全フェノールに富む組成物は、図１０〜１３に示したのと実質的に同様な標準ＨＰＬＣクロマトグラムでの６０〜７５分の間の領域中でピークを示す化合物を含んでいる。
【００７９】
例７
アントシアニンの定量的決定
この方法を用いて、種々のバイオマス試料及び全フェノールに富む乾燥精製組成物中の全アントシアニンを、外部標準を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により決定する。試験した各試料（例えば、全フェノールに富む濃縮組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、下に記載するように、異なった製造手順を必要とする。
【００８０】
全フェノールに富む組成物−１００ｍｌのメスフラスコ中に全フェノールに富む精製組成物を正確に秤量して７５〜１００ｍｇ入れ、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨでその体積まで希釈する。この試料の０．４０〜１．６ｍｌを２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍｌまで希釈し、よく混合する。
【００８１】
乾燥バイオマス−コーヒー粉砕機の刃を覆うのに充分な量の乾燥バイオマスをその粉砕機中へ入れる。約１分間、又は細かく粉砕されるまで粉砕する。別法として、原料を細かく粉砕するために乳鉢及び乳棒を用いる。１００ｍｌのメスフラスコ中に細かく粉砕したバイオマスを正確に秤量して約５０〜１００ｍｇ入れ、２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを約８０ｍｌ添加し、蓋をする。フラスコを５０℃の油浴又は強制空気炉中へ３０〜６０分間入れ、３０秒間穏やかに振盪し、５分間超音波にかける。溶液を室温まで冷却する。線の所まで２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、混合する。試料の一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ガラス瓶に入れる。１．０ｍｌの濾液を２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨで１０．０ｍｌまで希釈する。希釈率は１０ｍｌ／１ｍｌ、即ち、１０になるであろう。
【００８２】
冷凍／新鮮バイオマス−１０００ｍｌポリプロピレンビーカー中へ４００．０ｇの冷凍／新鮮バイオマスを秤量して入れる。４００ｇの沸騰に近い水をビーカー中へ添加する。機械混合器（ワーリング又は他のもの）を用いてピューレにする。広い穴のポリエチレン滴下器を用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取り出し、風袋を計った１００ｍｌのメスフラスコ中へ移した。８０ｍｌの２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、蓋をする。そのフラスコを５０℃の油浴又は強制空気炉中へ６０〜１２０分間入れ、３０秒間穏やかに振盪し、次に５分間超音波にかける。溶液を室温まで冷却する。線の所まで２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを添加し、混合する。一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ガラス瓶に入れる。希釈率は、バイオマス及び水の全重量をバイオマスの重量で割ったもの［例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ＝２］になるであろう。
【００８３】
乾燥減量−上記試料中の全アントシアニン含有量を得るための計算は、材料の水分含有量、又はＬＯＤ％（乾燥減量）を決定する必要がある。ＬＯＤ％を決定するためには、正確に秤量したアルミニウム秤量皿に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分布させ、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。試料を１０５℃±３℃の炉中に２時間入れる（２時間１５分を越えないようにする）。試料を室温へ冷却した後（デシケーターを用いてもよい）、試料を秤量し、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。ＬＯＤ％は、式１を用いて０．１％の精度で決定する：
ＬＯＤ％＝［１−（ＷＤ−ＷＰ）／（ＷＳＰ−ＷＰ）］×１００ 式１
式中、ＬＯＤ％＝乾燥減量％；ＷＤ＝皿及び試料の乾燥重量（ｇ）；ＷＰ＝皿の重量（ｇ）；及びＷＳＰ＝皿及び試料の初期重量（ｇ）。
【００８４】
分析手順−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプを点灯して光度測定モードで読取るように設定する。その機器を、行路長さ１ｃｍのガラス、石英、又は使い捨てポリスチレン・セル中に入れた２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて５３５ｎｍで、０点に合わせる。調製した試料の吸光度を、同じ又は整合した１ｃｍセル中で５３５ｎｍで測定する。
【００８５】
計算−全アントシアニンの濃度を、式２で示したように計算する：
ＣＡＮＴＨＯＳ＝（ＡＢＳＳＡＭＰ×ＤＦ）／ＥＳ 式２
式中、ＣＡＮＴＨＯＳ＝試料中の全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＡＢＳＳＡＭＰ＝試料の５３５ｎｍでの吸光度；ＤＦ＝下に記載する、希釈率；及びＥＳ＝適当な外部標準、塩化シアニジン（チェリー、クランベリー、エルダーベリー、及びプラムについては１０１．１）、又は塩化デルフィニジン（ビルベリー及びブルーベリーについては１０２．０）の吸光係数（１ｃｍのセルを用いて２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨ中での５３５ｎｍでの１ｍｇ／ｍｌ溶液の吸光度）。乾燥バイオマスについての希釈率（ＤＦ）は１であり、新鮮／冷凍バイオマスについての希釈率は、バイオマスと水との合計重量を、バイオマスの重量で割ったものである〔例えば、（４００ｇ＋４００ｇ）／４００ｇ〕。精製した抽出物についての希釈率は、最終希釈体積を抽出溶液の体積で割ったものである（例えば、１０ｍｌ／０．４０ｍｌ）。
【００８６】
全アントシアニンの％は、式３に示したようにして計算する：
アントシアニン％＝（ＣＡＮＴＨＯＳ×体積×１００）／（ＷＳ×ＳＬＯＤ） 式３
式中、アントシアニン％＝試料中の全アントシアニンの％；ＣＡＮＴＨＯＳ＝全アントシアニンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；体積＝調製試料の初期体積（通常１００ｍｌ）；ＷＳ＝調製で用いたバイオマス又は全フェノールに富む組成物の重量（通常乾燥バイオマスの場合５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合５００〜１５００ｍｇ、又は精製抽出物の場合７５〜１００ｍｇ）；及びＳＬＯＤ＝乾燥又は新鮮バイオマス、又は精製抽出物の場合、［（１００−ＬＯＤ％）／１００］（新鮮又は冷凍バイオマスの場合、この因子は適用しない）。
【００８７】
例８
全ポリフェノールの定量的決定
この方法を用いて、種々のバイオマス試料及び富化乾燥精製組成物中の全ポリフェノールを、外部標準として没食子酸を用いたＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により定量的に決定する。
【００８８】
この方法は、２０％のＮａ２ＣＯ３溶液及び２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを必要とする。Ｎａ２ＣＯ３溶液を調製するためには、約３５０ｍｌの脱イオン水の入った５００ｍｌのメスフラスコ中へ、約１００ｇのＮａ２ＣＯ３を秤量して入れる。１０分間超音波にかけ、振盪して混合する。脱イオン水を用いてその体積まで希釈し、均質になるまで撹拌する。２％ＨＣｌ／ＭｅＯＨを調製するためには、５００ｍｌメスフラスコ中へ約３５０ｍｌのメタノールを入れる。フラスコ中へ１０．０ｍｌのＨＣｌをピペットで入れる。メタノールを用いてその体積まで希釈し、均質になるまで混合する。
【００８９】
没食子酸標準ストックを調製するためには、１００ｍｌメスフラスコ中へ１００ｍｇの没食子酸〔ミズーリ州セントルイスのシグマー（Ｓｉｇｍａ）〕を正確に秤量して入れる。７０ｍｌの脱イオン水を添加し、溶解するまで５分間超音波にかける。脱イオン水を用いてその体積まで希釈し、蓋をし、均質になるまで混合する。
【００９０】
試験した各試料（例えば、全フェノールに富む組成物、乾燥バイオマス、又は新鮮／冷凍バイオマス）は、異なった調製方法を必要とし、例７に記載したようにして調製した。
【００９１】
乾燥減量−上記試料中の全ポリフェノール含有量を得るための計算は、材料の水分含有量、又はＬＯＤ％を決定する必要がある。ＬＯＤ％を決定するためには、正確に秤量したアルミニウム秤量皿に０．５〜３．０ｇの試料を移して均一に分布させ、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。試料を１０５℃±３℃の炉中に２時間入れる（２時間１５分を越えないようにする）。試料を室温へ冷却した後（デシケーターを用いてもよい）、試料を秤量し、その重量を０．１ｍｇの精度で記録する。ＬＯＤ％は、上記式１を用いて０．１％の精度で決定する。
【００９２】
比色展開法−きれいな１００ｍｌメスフラスコを、未使用試薬として使用するため別に設定する。二つの１００ｍｌメスフラスコに、「高濃度」標準及び「低濃度」標準のラベルを付ける。没食子酸ストック溶液を用いて、「高濃度」標準フラスコには８００μｌを、「低濃度」標準フラスコには２００μｌをピペットで入れる。乾燥バイオマス試料の場合、２０ｍｌの濾過溶液をピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。新鮮／冷凍バイオマス試料の場合、１０ｍｌの濾過溶液をピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。精製試料の場合、０．８０〜２．０ｍｌをピペットで１００ｍｌメスフラスコ中へ入れる。上で調製したメスフラスコ（未処理試薬を含む）の各々に次のものを添加する：
１．全体積を約６５ｍｌにする充分な脱イオン水を各フラスコへ添加する。
２．各フラスコへ５．０ｍｌのＦＣフェノール試薬（シグマー）をピペットで入れ、穏やかに撹拌する。
３．各フラスコに１５±２ｍｌの２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液をピペットで入れる。
４．各フラスコ中の溶液を穏やかにかき回しながら混合し、脱イオン水でその体積まで希釈し、蓋をし、逆さにする。
５．それら溶液を少なくとも３時間であるが、４時間以内展開する。
６．０．４５μｍＰＶＤＦ注射器フィルターに通す濾過を必要とする、試料の１０ｍｌ部分を、適当な容器中へ濾過して入れる。
【００９３】
分析手順−ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を、可視ランプを点灯して光度測定モードで読取るように設定する。分析は、行路長さ１ｃｍのガラス、石英、又は使い捨てポリスチレン・セル中で行う。その機器を、未使用試薬を用いて７６０ｎｍの所で０点に合わせる。各溶液の吸光度を、同じ又は整合した１ｃｍセル中で７６０ｎｍで測定する。
【００９４】
計算−全ポリフェノールの濃度を計算するためには、没食子酸の吸光係数を先ず決定しなければならない。この値は、式４に記載したようにして得られる：
ＥＲ＝（ＡＲ×ＤＲ）／［ＣＲ×（１−ＥＬＯＤ）］ 式４
式中、ＥＲ＝吸光度単位／ｇ／ｌで７６０ｎｍでの参照標準（没食子酸）の吸光係数；ＡＲ＝参照標準溶液の吸光度；ＣＲ＝ストック標準溶液中の没食子酸の濃度；ＤＲ＝没食子酸標準のための希釈率（「高濃度」標準の場合１２５、或は「低濃度」標準の場合５００）；及びＥＬＯＤ＝没食子酸固体の乾燥減量（％）。
【００９５】
「高濃度」及び「低濃度」標準についての吸光係数を、下の式５で用いるため平均する。色展開試料調製で全ポリフェノールの濃度は、式５に示すようにして計算する：
ＣＰ＝（ＡＲ×ＤＦＣ）／ＥＲ 式５
式中、ＣＰ＝ＦＣ調製試料の全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＡＳ＝ＦＣ調製試料の吸光度；ＤＦＣ＝試料希釈率、この場合ＤＦは、乾燥バイオマスの場合５、新鮮／冷凍バイオマスの場合１０、富化精製組成物の場合５０〜１２５であるのが典型的である；及びＥＲ＝没食子酸標準の平均吸光係数。
【００９６】
全ポリフェノール％は、式６に示したように計算する：
Ｐ％＝（ＣＰ×ＶＳ×ＤＳ×１００）／（ＷＳ×ＳＬＯＤ） 式６
式中、Ｐ％＝試料中の全ポリフェノールの％；ＣＰ＝全ポリフェノールの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＶＳ＝元の試料調製体積（通常１００ｍｌ）；ＷＳ＝元の試料調製で用いたバイオマス又は精製組成物の重量（通常、乾燥バイオマスの場合、５０〜１００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスの場合、５００〜１５００ｍｇ、精製抽出物の場合、７５〜１００ｍｇ）；ＤＳ＝元の試料希釈係数、この場合、ＤＳは、乾燥バイオマスの場合１、新鮮／冷凍バイオマスの場合２、又は精製抽出物の場合１である；及びＳＬＯＤ＝バイオマス又は精製抽出物の場合、［（１００−ＬＯＤ％）／１００］。新鮮又は冷凍バイオマスの場合、この因子は適用しない。
【００９７】
例９
ＨＰＬＣ定性分析
この方法を用いて、種々のバイオマス及び富化精製組成物中の化合物を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により品質を定める。各種類の試料は、下に記載するように異なった調製手順を必要とする。
【００９８】
乾燥バイオマス：乾燥バイオマスは、もし未だ粉末にされていない場合には、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）ミルを用いて粉砕し、１ｍｍ篩に通す。適当な大きさの抽出シンブル（ｔｈｉｍｂｌｅ）及びソックスレー抽出装置を用いて、約１２ｇの粉末バイオマスを秤量してそのシンブル中に入れ、２００ｍｌのメタノールを用いて抽出する。少なくとも２０サイクル、又は抽出溶媒がきれいになるまで抽出を続ける。抽出物を定量的に２５０ｍｌメスフラスコへメタノールを用いて移し、その体積まで希釈し、混合する。抽出物を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶中へ入れる。
【００９９】
冷凍／新鮮バイオマス：１０００ｍｌポリプロピレンビーカー中へ４００ｇの冷凍／新鮮バイオマスを秤量して入れる。４００ｇの沸騰に近い水をビーカー中へ添加する。機械混合機（ワーリング又は他のもの）を用いてピューレにする。広い穴のポリエチレン滴下器を用いて、０．５〜１．５ｇの代表的試料を取り出し、風袋を計った１００ｍｌのメスフラスコ中へ移す。８０ｍｌのＭｅＯＨを添加し、蓋をし、５０℃に３０分間加熱する。溶液を室温まで冷却させ、メタノールでその体積まで調節し、次に均質になるまで超音波にかける。一部分を０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶に入れる。
【０１００】
富化精製組成物：富化組成物を５０〜１００ｍｇ正確に秤量し、ガラスシンチレーション瓶中に入れ、１０．０ｍｌの５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを添加する。５分間超音波にかける。０．４５μｍＰＴＦＥ注射器フィルターに通して濾過し、ＨＰＬＣガラス瓶中に入れる。
【０１０１】
必要に応じ、ＨＰＬＣを設定する。本発明の一つの態様として、５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１０００ｍｌの高純度、型１水の中に混合することにより移動水性相を調製した。２０μｌの試料を周囲温度で注入した。検出のため２８０ｎｍの波長を用い、流量は１．０ｍｌ／分、操作時間は１０５分であった。１５０×４．６ｍｍ内径のカラム中、ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）カラムに５μｍＳＢＣ−１８を充填した。この態様では、移動相は次のように設定した：チャンネルＡ：１００％アセトニトリル；チャンネルＢ：Ｈ２Ｏ中に入れた０．５％ＴＦＡ；及びチャンネルＣ：１００％メタノール。表３に、本発明のこの態様についてのＨＰＬＣ勾配を要約する。
【０１０２】
もし入手できるならば、試料中に存在させることが知られている標準調製化合物を、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製してもよい。これらの標準調製物を用いて、大略の保持時間を決定し、それにより試料クロマトグラム中のこれらの化合物を同定することができる。この方法は、定性的目的にのみ用いられるので、計算は不必要である。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
例１０
プロアントシアニジン％決定のための定量的ＨＰＬＣ法
このＨＰＬＣ法を用いて、種々のフラクション及び富化組成物中のプロアントシアニジンの量を決定する。各種類の試料は異なった調製法を必要とし、例９に記載したようにして調製する。この方法は、１５０×４．６ｍｍのカラム中、ステイブルボンド（Ｓｔａｂｌｅｂｏｎｄ）ＳＢＣ−１８を充填した５μｍゾルバックスカラムを用いる。流量は１．５ｍｌ／分、検出器は２８０ｎｍに設定し、注入体積は１０μｌで、操作時間は２４分であった。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝水に入れた０．１％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。表４に、用いた勾配を与える。プロアントシアニジンは、１１〜２２分の溶離時間でＨＰＬＣクロマトグラム中の一群の広いピークとして溶離されるのが典型的である。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
プロアントシアニジンの量を決定するため、前に屋内で調製した９０％より大きな純度を有するプロアントシアニジン標準を用いる。この試料は７０％のエタノール中に５．５ｍｇ／ｍｌにして調製し、この例に記載するＨＰＬＣ法を用いて分析する。この標準のためのクロマトグラムは、１１〜２２分の保持時間範囲内に大きな広いピークを含み（図１４に見られるように）、それはプロアントシアニジンによるものである。１１〜２２分のピーク全体を手動で積分する。次に、式７に示したように、１１〜２２分全ピーク面積を、標準物の濃度とその純度との積で割ることにより、その標準物についてのピーク面積応答係数（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ）を決定する：
ＲＦ＝ＰＡ／（Ｃｓｔｄ×Ｐｓｔｄ） 式７
式中、ＲＦ＝標準物についてのピーク面積応答係数（面積単位／ｍｇ／ｍｌ）；ＰＡ＝標準物中のプロアントシアニジンのピーク面積；Ｃｓｔｄ＝標準溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）；及びＰｓｔｄ＝標準物純度（％）（通常０．９０）。
【０１０７】
試料中のプロアントシアニジン％は、上に記載した試料調製及びＨＰＬＣ分析法を用いて決定することができる。問題の試料について、１１〜２２分の保持時間範囲中の全ピーク面積を決定する。しかし、プロアントシアニジン保持時間範囲中の非プロアントシアニジン化合物のピーク面積を、全ピーク面積から差し引かなければならない。非プロアントシアニジン化合物は、広いプロアントシアニジンピークと共に、又はその上に同時に溶離して鋭いピークとして屡々現れ、ダイオード配列によるそれらのＵＶスペクトルは、屡々プロアントシアニジンピークの主要部とは異なっている。非プロアントシアニジンピークのピーク面積を決定するため、これらのピーク、それらのピーク面積の全てを手動で積分し、この面積を、１１〜２２分の全ピーク面積から差し引く。試料中のプロアントシアニジンピークの真の面積が決定されたならば、この値を、屋内標準物についてのピーク面積応答係数で割り、式８に示したように、試料中のプロアントシアニジンの濃度を得る：
Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝（ＰＡｓａｍｐ×ＤＦ）／ＲＦ 式８
式中、Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝試料中の全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；ＰＡｓａｍｐ＝試料についての補正した全ピーク面積；ＤＦ＝希釈率（乾燥バイオマスについては１、新鮮／冷凍バイオマスについては２、富化組成物については１）；及びＲＦ＝式７を用いて計算したピーク面積応答係数。
【０１０８】
全プロアントシアニジン％は、式９に示したようにして計算する：
プロアントシアニジン％＝（Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ×Ｖ×１００）／Ｗｓ 式９
式中、プロアントシアニジン％＝試料中の全プロアントシアニジンの％；Ｃｐｒｏａｎｔｈｏｓ＝全プロアントシアニジンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）；Ｖ＝調製試料の体積（通常乾燥バイオマスについては２５０ｍｌ、新鮮／冷凍バイオマスについては１００ｍｌ、富化組成物については１０ｍｌ）；及びＷｓ＝試料調製で用いられたバイオマス又は富化組成物の重量（通常乾燥バイオマスについては１２，０００ｍｇ、新鮮／冷凍バイオマスについては５００〜１５００ｍｇ、又は富化組成物については５０〜１００ｍｇ）。
【０１０９】
例１１
濾過エルダーベリー抽出物から極性及び非極性プロアントシアニジンの直接分配
この例では、濾過エルダーベリー抽出物を調製し、臭素化ポリスチレン樹脂で精製するのではなく、その代わり真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）カラムに直接ロードし、図１５に例示した方法に従い、濾過抽出物から極性プロアントシアニジン及び非極性プロアントシアニジンを直接分配した。
【０１１０】
メタノール中に入れたベイカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）４０μｍフラッシュ・クロマトグラフィーＣ−１８媒体のスラリー５０ｍｌを、６０ｍｌのフリット化ガラスフィルターに通して濾過することにより５０ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムを調製した。カラムをメタノールで洗浄し、次に水で洗浄することにより調整した。１２．０ｇの固体、７４ｍｇのアントシアニン、及び約７８０ｍｇのプロアントシアニジンを含む濾過エルダーベリー抽出物の３００ｍｌ部分をカラムにロードした。例１０に記載したＨＰＬＣ法を用いた濾過抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを、図１６に示す。流通溶離物（約３００ｍｌ）及び１００ｍｌの洗浄物〔０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）〕を一緒にし、極性プロアントシアニジン「フラクション５」を与えた。「フラクション５」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に示す。次にカラムを０．１％のＴＦＡを含む３０、４０、５０、６０、７０、及び１００％のメタノール、夫々１００ｍｌで溶離した。６０％メタノール溶離剤中に分離された非極性プロアントシアニジン「フラクション６」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に示す。例７及び１０に記載した方法により、それらのフラクションをアントシアニン及びプロアントシアニジンについて分析した。この実験結果を表５に要約する。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
結果は、濾過抽出物中のプロアントシアニジンの７１％（５５８ｍｇ）がローディング及び洗浄中に収集されたことを示している。これらのプロアントシアニジンは、一層極性のプロアントシアニジンであった。非極性プロアントシアニジンは、メタノール濃度を少なくとも４０％に増大した時に溶離した。５０〜７０％メタノール・フラクション中に溶離したプロアントシアニジンの純度は、濾過エルダーベリー抽出物中に含まれていた固体の大部分がローディング溶離、水洗浄、及び３０％メタノール洗浄で溶離したことにより高かった。
【０１１３】
例１２
ＶＬＣ及びそれに続くゲル浸透クロマトグラフィー又は準分取ＨＰＬＣによる精製によるエルダーベリー・プロアントシアニジンの分配
エルダーベリー乾燥バイオマス〔マーチン・バオエル（Ｍａｒｔｉｎ Ｂａｕｅｒ）；ドイツ〕から、例６に記載した手順を用いた臭素化ポリスチレン樹脂からの溶離中に７０％エタノール・フラクション（「フラクション３」）を収集することにより、全フェノールに富む組成物を製造した。この全フェノールに富む組成物の一部分（２．００ｇ）を５０ｍｌの水中に溶解し、ベイカーボンド４０μｍＣ−１８媒体を用いて調製した１５ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。流通溶離物及び２５ｍｌ水洗浄物を一緒にし、冷凍乾燥し、７３３ｍｇの極性プロアントシアニジンフラクション（「フラクション５」）を生じた。次にカラムを２５ｍｌの５０％メタノールで洗浄した。非極性プロアントシアニジン（「フラクション６」）を、２５ｍｌの７０％メタノールで溶離した。このフラクション中のメタノールを除去し、得られた水懸濁物を冷凍乾燥し、１９２ｍｇの非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与え、それはＨＰＬＣ分析により１００％プロアントシアニジンであった。このフラクションは、色があったとしても極めて少なく、このフラクション中のオリゴマープロアントシアニジン鎖は陽イオン性アントシアニン単位を含まないことを示唆していた。
【０１１４】
極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を、準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、残留アントシアニン及び他の一層極性の不純物を除去した。これらの固体の準分取ＨＰＬＣ精製のための条件を下に記載する。
【０１１５】
準分取ＨＰＬＣ法は、６μｍ、６０Å、ノバ・パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）ＨＲ Ｃ−１８媒体〔ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）；マサチューセッツ州ミルフォード〕を充填した２．５×１０ｃｍのウォーターズ・プレプパック（ＰｒｅｐＰａｋ）カートリッジを用いた。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝０．１％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。この態様で用いた勾配は、表６に示す通りであった。流量は３０ｍｌ／分であり、検出器は２８０ｎｍに設定し、注入体積は、５０〜１２５ｍｇの固体を含む溶液３〜５ｍｌであるのが典型的であった。操作時間は３０分間であった。プロアントシアニジンは、１３〜２０分で溶離した広いピーク中に収集された。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
約６００ｍｇの極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を、２５ｍｌの水に溶解した。８つの実験の各々で約３ｍｌ（７５ｍｇ）を注入した。各実験で１２〜１８分の間に溶離したプロアントシアニジンピークを収集し、プールし、回転蒸発器で蒸発し、残留水溶液を冷凍乾燥した。ＶＬＣ分離の後、６００ｍｇの極性プロアントシアニジン固体（「フラクション５」）から、約１００ｍｇの精製極性エルダーベリー・プロアントシアニジン（「フラクション７」）が得られた。準分取ＨＰＬＣ精製後のＶＬＣ分離極性プロアントシアニジンについての２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、図１９に示す。砂糖、アミノ酸、アントシアニン、有機酸、及び少量のフラボノイド化合物を含む極性フロント（ｆｒｏｎｔ）は、図１９にはこれらのピークが無いことにより証明されるように、準分取ＨＰＬＣ精製により除去された。精製極性プロアントシアニジン（「フラクション７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２０に示す。
【０１１８】
非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を、更にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。ＶＬＣ分離中に分離された非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）の一部分（４８ｍｇ）を２０ｍｌの温水に溶解し、前以て水で平衡にしておいた１４ｍｌセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０カラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、４０ｍｌのカラム水洗浄物と一緒にした。比較的小さなフラボノイド不純物の殆どが保持されている間のこの時点で、カラムから殆どの非極性プロアントシアニジンが溶離された。ローディング及び洗浄溶離物を一緒にし、冷凍乾燥して３２ｍｇの精製非極性プロアントシアニジン「フラクション８」を与えた。これらの固体は、強い抗ウィルス活性を持っていた。図２１及び２３は、セファデックスＬＨ−２０カラム精製前の非極性プロアントシアニジン（「フラクション６」）の、夫々２８０ｎｍ及び３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図２２及び２４は、精製非極性プロアントシアニジン（「フラクション８」）の、夫々２８０ｎｍ及び３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。星印をつけた図２１中のピークは、ＵＶスペクトルに基づく非プロアントシアニジン・フラボノイド化合物である。これらの化合物は、図２２の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムで示されているように、セファデックスＬＨ−２０カラム後に分離された精製非極性生成物（「フラクション８」）では減少している。ゲル精製の効果は、精製前の非極性プロアントシアニジンの３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを比較することにより一層よく知ることができる（図２３）。非プロアントシアニジン不純物は、図２３中で４〜６分及び１５〜１７分の所に現れている。５．８分の所で溶離した少量のフラボノイド化合物を別として、図２４に示したように、精製試料中にはフラボノイド化合物の痕跡はない。精製非極性プロアントシアニジン「フラクション８」の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを図２５に示す。図３３は、フラクション７のＩＲスペクトルを示し、図３４は「フラクション８」のＩＲスペクトルを示している。
【０１１９】
例１３
ブルーベリー極性及び非極性プロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、ブルーベリーから調製され、臭素化ポリスチレン樹脂から７０％エタノール溶離中に分離された全フェノールに富む「フラクション３」であった。「フラクション３」の一部分（６．００ｇ）を８０ｍｌの水中に溶解し、前に記載したように、３０ｍのｌＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、０．１％ＴＦＡ洗浄溶離物（「フラクション５」）の１００ｍｌと一緒にした。次にカラムを８０ｍｌの４０％メタノールで洗浄し、残留極性化合物（「フラクション５」）を除去し、次に８０ｍｌの７０％メタノールで洗浄し、非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与えた。表７に、この実験の結果を要約する。
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
極性プロアントシアニジン「フラクション５」（ローディング溶離＋洗浄）及び非極性プロアントシアニジン・フラクション６（７０％メタノール溶離）を、夫々更に例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより精製し、夫々「フラクション７」及び「フラクション８」を与えた。準分取精製前及び後のブルーベリー極性プロアントシアニジン・フラクション（即ち、「フラクション５」及び「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、夫々図２６及び２７に示す。準分取精製前及び後のブルーベリー非極性プロアントシアニジン・フラクション（即ち、「フラクション６」及び「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、夫々図２８及び２９に示す。図２７及び２９の約０〜８分の間にピークが無いことにより証明されるように、極性及び非極性両方のフラクションの準分取精製により、プロアントシアニジンから望ましくないアントシアニン及び極性フラボノイド化合物が除去された。図３７は、「フラクション７」のＩＲスペクトルを示し、図３８は、「フラクション８」のＩＲスペクトルを示している。
【０１２２】
例１４
プラム極性及び非極性プロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、プラムから分離され、約１７％の全プロアントシアニジンを含み、その内の６１％が極性で、３９％が非極性として判定された「フラクション３」及び「フラクション４」を一緒にしたものであった。この組成物の一部分（８．００ｇ）を０．５％のＴＦＡを含む１００ｍｌの水中に溶解し、前に記載したように４５ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物を収集し、カラムを５０ｍｌの０．１％ＴＦＡで洗浄した。ローディング溶離物及び洗浄フラクションを一緒にし、極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション５」）を与えた。極性プロアントシアニジン「フラクション５」のＨＰＬＣを図３０に示す。カラムを、０．５％のＴＦＡを含む４０％のメタノール１００ｍｌで溶離し、次に０．５％のＴＦＡを含む７０％メタノール１００ｍｌで溶離した。全てのメタノールフラクションを一緒にし、非極性プロアントシアニジン・フラクション（「フラクション６」）を与えた。表８にこの実験の結果を要約する。
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
極性プロアントシアニジン「フラクション５」（ローディング溶離物及び洗浄溶離物を一緒にしたもの）を、例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、「フラクション７」を与えた。アントシアニン及び他の一層極性の不純物を除去することにより、試料のプロアントシアニジン純度が１５％から１００％へ増大した。精製極性プロアントシアニジン「フラクション７」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図３１に示す。非極性「フラクション６」（４０％及び７０％のメタノール洗浄物を一緒にしたもの）は、更に精製することはしなかった。非極性プロアントシアニジン「フラクション６」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを、図３２に示す。図３９は「フラクション７」のＩＲスペクトルであり、図４０は「フラクション６」のＩＲスペクトルである。
【０１２５】
例１５
エルダーベリーＶＬＣフラクションからのプロアントシアニジン・フラクションの精製
アンバークロム（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ）ＣＧ−７１ｃｄ樹脂（８０〜１６０μｍの粒径、トーソーハース；ペンシルバニア州フィラデルフィア）を用いてＶＬＣカラムを調製した。エルダーベリーの水抽出物を調製し、この抽出物の一部分をＶＬＣカラムにロードした。次にカラムを水で洗浄し、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、及び１００％メタノールを用いて溶離した。メタノールで溶離した全てのフラクションを別々に保持した。５０％メタノールで溶離したＶＬＣフラクションを回転蒸発器で蒸発し、メタノールを除去し、次に冷凍乾燥し、水を除去した。乾燥した材料を、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、粉末にした。乾燥試料を例１０に記載した方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。この分析結果を用いて分析ＨＰＬＣ法から準分取ＨＰＬＣ法を誘導し、プロアントシアニジンを分離した。移動相は次の通りであった：チャンネルＡ＝１００％アセトニトリル；チャンネルＢ＝水中に入れた０．５％トリフルオロ酢酸；チャンネルＣ＝１００％メタノール。流量は３０ｍｌ／分に設定した。用いた勾配を、表９に示す。
【０１２６】
【表９】
【０１２７】
約５００ｍｇの乾燥材料を水中に溶解し、約５０ｍｇ／ｍｌの固体濃度にした。非常に僅かな量を注入し、関係するピークの保持時間を決定した。この最初の注入に基づき、二つのピークを収集した：１４〜２２分の間で溶離したピークＡ、及び２６〜２８分の間で溶離したピークＢ。５回の濃厚溶液の注入を行い、各ピークの適当な収集物を各注入からプールした。ピークＡの収集により得られた試料は、プロアントシアニジンを含むことが決定され、蒸発して有機溶媒及び水の一部分を除去した。濃縮試料を、例１０に記載したＨＰＬＣ法を用いて分析した。試料のクロマトグラフィー純度は、９３．９％であることが決定された。次に試料を凍結乾燥し、乾燥材料を得た。乾燥したならば、試料の僅かな部分を７０％エタノール中に入れ、１．９１８ｍｇ／ｍｌの濃度にし、同じＨＰＬＣ法により再び分析した。この分析結果及び前に得られたクロマトグラフィー純度を用いて、ピーク面積応答係数を決定した。この情報を用いて、他の精製フラクション中のプロアントシアニジン濃度を決定した。プロアントシアニジン「標準」の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１４に示す。
【０１２８】
例１６
クランベリープロアントシアニジンの、ＶＬＣ及びそれに続く準分取ＨＰＬＣによる精製
この例の出発材料は、１４％の全プロアントシアニジンを含む精製クランベリー抽出物（「フラクション３」＋「フラクション４」）の８．００ｇであった。この材料を、１ｍｌのトリフルオロ酢酸を含む水１００ｍｌ中に溶解し、前に記載したように、５０ｍｌのＣ−１８ＶＬＣカラムにロードした。ローディング溶離物（１００ｍｌ）を収集し、５０ｍｌの０．１％ＴＦＡ洗浄溶離物と一緒にし、「フラクション５」を得た。次に、カラムを１００ｍｌの４０％メタノールで洗浄し、残留極性化合物を除去し、１００ｍｌの７０％メタノールで溶離し、非極性プロアントシアニジン「フラクション６」を与えた。表１０に、この実験の結果を要約する。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
極性プロアントシアニジン・フラクション（ローディング溶離＋洗浄）を、例１２に記載した方法により準分取ＨＰＬＣにより更に精製し、「フラクション７」を得た。図４１は、準分取精製前の極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムであり、図４２は、精製後の極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムである。図４３は、非極性プロアントシアニジン・フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムである。プロアントシアニジン前に溶離したアントシアニンのような極性非プロアントシアニジン化合物は、この方法で除去された。
【０１３１】
例１７
エルダーベリーフラクションの単純ヘルペスウィルス２検定
エルダーベリー粗製抽出物及び例６に記載したようにして分離したフラクション１、３、及び４の抗ウィルス活性を、ウィルス細胞変性効果（ＣＰＥ）検定を用いて決定した。この検定は、既に報告されている〔ワイド（Ｗｙｄｅ）その他、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｐ．Ｒｅｓ．２８：４６７−４７２（１９９３）〕。全ての抗ウィルス活性は、５０％効果量（ＥＤ５０）として報告されている。
表１１に、試験した四つの組成物についてのＣＰＥ抑制についてのＥＤ５０を要約する。
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
例１８
ウィルス検定
果実及びイチゴ類から製造した本発明の全フェノールに富む組成物は、種々のＤＮＡ及びＲＮＡウィルスに対し広い活性を示し、人間及び動物の炎症を処置するのに有用な活性成分として適切である。細胞培養で、富化組成物は呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザＡ及びＢウィルス、パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）のみならず、他の呼吸器及び単純ヘルペスウィルスの隔離及び実験室的株に対し強力な活性を示す。全フェノールに富む組成物は、人間及び動物の広い範囲のウィルス感染を処置するのに有用な活性成分として適切である。
【０１３４】
各ウィルスに対する活性度を測定するのに用いられる検定は当業者によく知られている。細断した特定の標的組織を、希望のウィルスに曝し、試験材料を入れた場合と入れない場合についてウィルスの増殖速度を測定した。種々の果実及びイチゴ類から製造した精製プロアントシアニジンに富む組成物の抗ウィルス活性度を決定した。
【０１３５】
細胞系：ウィルス検定は、相対的ＥＤ５０（５０％効果量）又は５０％抑制終点を決定するために次の細胞／細胞系を用いた：ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）及びＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）検定は、アフリカ・ミドリザル腎臓から得られたＭＡ−１０４細胞を用いた；インフルエンザＡ及びＢ検定では、犬の腎臓から得られたＭＤＣＫ細胞を用いた；ライノウィルス検定では、ＨｅＬａ及びＫＢ細胞を用いた；単純ヘルペスウィルス１及び２では、人の包皮線維芽細胞から取られたＨＨＦ細胞を用いた；西ナイルウィルス検定では、アフリカ・ミドリザル腎臓から取ったＶｅｒｏ細胞を用いた；アデノウィルス型１検定では、人の肺癌から得られたＡ５４９細胞を用いた；Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏＡ検定では、アカゲザル腎臓から得られたＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた。
【０１３６】
それらの検定では、陽性対照として既知の医薬標準〔リビバリン（ｒｉｂｉｖａｒｉｎ）又はアシクロビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）〕を用いた。この例で用いた検定で、リビバリンについてのＥＤ５０は次の通りである：ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス）検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；ＰＩＶ（パラインフルエンザウィルス）検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；インフルエンザＡ及びＢ検定ＥＤ５０＝２〜３μｇ／ｍｌ；ライノウィルス検定ＥＤ５０＜１μｇ／ｍｌ；西ナイルウィルス検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ；アデノウィルス型１検定ＥＤ５０＝１０μｇ／ｍｌ；及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡ検定ＥＤ５０＝２０μｇ／ｍｌ。単純ヘルペス１及び２検定では、陽性対照としてアシクロビールを用い、それはＨＳＶ１及びＨＳＶ２検定で１〜２μｇ／ｍｌのＥＤ５０を持っていた。
【０１３７】
本発明の或る組成物についてウィルス検定で得られたデーターを、表１２に与える。細胞培養で、それら組成物は、インフルエンザＡウィルス（株Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ３）、インフルエンザＢウィルス、アデノウィルス型１、Ｐｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、及びライノウィルス型２の隔離及び実験室的株に対し強力な活性を示した。抗ウィルス・スクリーニングでアシクロビール及びリビバリンに対する表１２中の生物活性データーの比較は、本発明の組成物がこれらの検定で生物学的に活性であり、これらのウィルス疾患を処置するのに用いられているよく確立された医薬と競合して好ましいことを明らかに示している。
【０１３８】
【表１２】
【０１３９】
例１９
全フェノールに富む組成物のＣＯＸ−２活性の評価
シクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）は、アラキドン酸及び他の必須脂肪酸の種々のプロスタグラジンへの転化に対し触媒作用を及ぼす。プロスタグラジンは、哺乳類の炎症の原因になにるホルモン状物質である。ＣＯＸ−２酵素の抑制は、最小限の副作用で組織の炎症を減少することができる。一方、ＣＯＸ−１の抑制は、胃潰瘍及び他の体に望ましくない副作用を起こす。ＣＯＸ−１酵素の完全な抑制は望ましくない。ＣＯＸ−２酵素を選択的に抑制する化合物は、一層よい抗炎症剤である。果実及びイチゴ類から製造された本発明の全フェノールに富む組成物は、ＣＯＸ−２酵素を抑制することが示されており、人間及び動物の炎症を処置するのに有用な活性成分として適切である。
【０１４０】
この検定では、検定すべき材料を、希望の酵素を含むことが知られている細断した特定のマウス又はうし器官組織と混合した。アラキドン酸をこの混合物に添加した。酸素取り込み速度を特定し、既知のＣＯＸ抑制剤で観察されている取り込み速度と比較する。ＣＯＸ−２検定は、人間の組み替えＣＯＸ−２陽性細胞を用いたアラキドン酸からのＰＧＥ２の定量的生成に基づいている。
【０１４１】
幾つかの組成物についての結果を表１３に示す。表１３に示した組成物についてのデーターを、既知の医薬標準（アスピリン及びインドメタシン）の決定されたＣＯＸ−２生物活性度と比較すると、本発明のプロアントシアニジンに富む精製組成物は、ＣＯＸ−２検定で生物学的に活性であることを明確に示している。アスピリンは、６６０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−２に対し活性であり、２４０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−１に対し活性である。インドメタシンは１０μｇ／ｍｌでＣＯＸ−２に対し活性である。従って、表１３の組成物は、炎症に対し最も一般に用いられている処置（例えば、アスピリン）よりも、ＣＯＸ−２検定で効力に２．５〜６倍の増大を示しており、哺乳類の炎症を処置するのに本発明のプロアントシアニジンに富む精製組成物の有用性を示している。
【０１４２】
【表１３】
【０１４３】
前記記述は、本発明の原理を単に例示しているに過ぎないものと考えられる。更に、当業者には多くの修正及び変化が容易に想到されるので、本発明を上に記載し、示したのと正確に同じ構成及び方法に限定することは望ましくない。従って、全ての適当な修正及び同等なものは、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内入るものと見做すことができる。
【０１４４】
本明細書及び後の特許請求の範囲で用いられている言葉「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、記述した特徴、整数、成分、又は工程の存在を特定化することを意図したものであるが、それらは一つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明による全フェノールに富む組成物を製造するための方法の工程図である。
【図２】図２は、ビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、ビルベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、ブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】図５は、ブルーベリーから製造された全フェノールに富む組成物（「フラクション３」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】図６は、濾過したエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】図７は、濾過したエルダーベリー抽出物の５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は、濾過したエルダーベリー抽出物のカラムローディング中に溶離された第一フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】図９は、濾過したエルダーベリー抽出物のカラムローディング中に溶離された第一フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、７０％エタノールで溶離された第三フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、７０％エタノールで溶離された第三フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、９０％エタノールで溶離された第四フラクションの２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、臭素化ポリスチレン樹脂でエルダーベリー抽出物をカラム精製している間に、９０％エタノールで溶離された第四フラクションの５１０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４】図１４は、例１０に記載したように製造されたプロアントシアニジン標準の別のＨＰＬＣ法を用いたＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、非極性プロアントシアニジンから極性プロアントシアニジンを分離する方法の工程図である。
【図１６】図１６は、濾過したエルダーベリー抽出物の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの一緒にした流通及び洗浄フラクションから分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムからの６０％メタノール溶離剤中に分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、準分取ＨＰＬＣ精製後に分離されたエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、準分取ＨＰＬＣによる精製後のエルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】図２１は、非プロアントシアニジン・ピークに星印を付けた、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製する前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】図２３は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製する前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたエルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２４】図２４は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の３６８ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】図２５は、セファデックスＬＨ−２０カラムで精製した後の、エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図２６】図２６は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２７】図２７は、準分取ＨＰＬＣ精製後の、ブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２８】図２８は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２９】図２９は、準分取ＨＰＬＣによる精製後の、ブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３０】図３０は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、Ｃ−１８媒体によるＶＬＣクロマトグラフィー中に分離されたプラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３１】図３１は、準分取ＨＰＬＣによる精製後の、プラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３２】図３２は、ＶＬＣ Ｃ−１８カラムから４０％及び７０％メタノール溶離中に分離されたプラム非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３３】図３３は、精製エルダーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３４】図３４は、精製エルダーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３５】図３５は、精製クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３６】図３６は、精製クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３７】図３７は、精製ブルーベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図３８】図３８は、精製ブルーベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション８」）のＩＲスペクトルである。
【図３９】図３９は、精製プラム極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）のＩＲスペクトルである。
【図４０】図４０は、精製プラム非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）のＩＲスペクトルである。
【図４１】図４１は、準分取ＨＰＬＣ精製前の、クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション５」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４２】図４２は、準分取ＨＰＬＣ精製後の、クランベリー極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション７」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４３】図４３は、クランベリー非極性プロアントシアニジン組成物（「フラクション６」）の２８０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）フェノール化合物を含む一種類以上の植物材料の粗製抽出物で、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び非フェノール化合物を含む抽出物を与えること；
ｂ）前記粗製抽出物を濾過すること；
ｃ）前記濾過した粗製抽出物を、前記フェノールを放出可能に吸着するが、前記非フェノール化合物は保持しない臭素化ポリスチレン樹脂と接触させること；
ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄し、前記非フェノール化合物を溶離すること；
ｅ）前記樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノールを含む第一フラクションを収集すること；
ｆ）前記樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノールを含む第二フラクションを収集すること；そして
ｇ）前記工程（ｅ）又は工程（ｆ）からのフラクションを分離するか、又は工程（ｅ）及び（ｆ）からの前記フラクションを一緒にし、全フェノールに富み、前記非フェノール化合物が実質的に無くなった組成物を得ること；
を含む、全フェノールに富む組成物の製造方法。
【請求項２】
粗製抽出物を、乾燥又は新鮮な植物材料（単数又は複数）を酸性化抽出溶媒で抽出することにより製造する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性化抽出溶媒が、約０〜９５％のエタノール及び約０〜３％の酸を含む水溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸が、硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酸性化抽出溶媒が、約０〜１００％のメタノール及び約０〜３％の酸を含む水溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酸が、硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
洗浄溶離剤が少なくとも０．００３％の酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
酸が、酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一溶離剤が、水中に約５０〜７０％のエタノール及び約０．００３％の酸を入れたものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酸が、酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二溶離剤が、水中に約７０〜９０％のエタノールを入れたものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、約１０〜８０％の全フェノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、少なくとも１２％の全フェノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、少なくとも２５％の全フェノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、図１２及び１３に例示したのと実質的に同じ、ＨＰＬＣトレースで６０〜７５分の間の領域でピークを生ずる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
植物材料が、果実及び（又は）イチゴ類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
果実及び／又はイチゴ類が、エルダーベリー、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、クランベリー、ラズベリー、プラム、レッドカーラント、ブラックカーラント、チェリー、及びグレープからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）が、更に、粗製抽出物にペクチナーゼを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ペクチナーゼが、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更に、組成物に賦形剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
賦形剤が、防腐剤、キャリヤー、緩衝剤、濃化剤、懸濁剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び芳香剤からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
更に、
ｈ）工程ｅ）からの組成物、工程ｆ）からの組成物、又は工程ｇ）からの組成物を、逆相親油性樹脂を充填した低圧真空液体クロマトグラフィーカラムにローディングし、そのローディング中に溶離したフラクションを収集すること；
ｉ）前記樹脂を水で溶離すること；
ｊ）工程ｈ）及びｉ）からのフラクションを一緒にして、極性プロアントシアニジンに富む第一組成物を得ること；
ｋ）前記樹脂を極性有機溶媒で、その量を増大させながら溶離し、非極性プロアントシアニジンに富む第二組成物を得ること；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、逆相分取ＨＰＬＣにより第一組成物を精製し、アントシアニンを実質的に含まない一層極性のプロアントシアニジンを得ることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
更に、ゲル濾過、又は分取ＨＰＬＣにより第二組成物を精製し、アントシアニンを実質的に含まない極性の低いプロアントシアニジンを得ることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により製造された、全フェノールに富む組成物。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法により製造された、極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項２７】
植物材料が、果実及び（又は）イチゴ類である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
果実及び（又は）イチゴ類が、エルダーベリー、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、クランベリー、ラズベリー、プラム、レッドカーラント、ブラックカーラント、チェリー、及びグレープからなる群から選択されている、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が、１２．５％より大きい全フェノール濃度を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項２３に記載の方法により製造された、極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法により製造された、非極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３２】
請求項２４に記載の方法により製造された、非極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３３】
図１２及び１３に例示したのと実質的に同じ、６０〜７５分の間の領域でピークを有するＨＰＬＣクロマトグラムを特徴とする、全フェノールに富む組成物。
【請求項３４】
更に、Ａ型インフルエンザウィルス、Ｂ型インフルエンザウィルス、２型ライノウィルス、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、２型ライノウィルス、１型アデノウィルス、及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、からなる群から選択されたウィルスに対する抗ウィルス活性についてイン・ビトロ検定で実証される抗ウィルス活性を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
更に、抗炎症活性についてのイン・ビトロ検定で実証される抗炎症効果を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
更に、抗菌活性についてのイン・ビトロ検定で実証される抗菌効果を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
更に、一種類以上の免疫活性剤を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫活性剤が、アラビノガラクタン、エキナセア種、ビタミン、ミネラル、多糖類、及び距骨からなる群から選択されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
更に、一種類以上の抗突然変異剤を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４０】
抗突然変異剤が、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイドからなる群から選択されている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法により分離された組成物を、効果的な量投与することを含む、感染性有機体又は病因により起こされた哺乳類の症状を処置する方法。
【請求項４２】
有機体が、Ａ型インフルエンザウィルス、Ｂ型インフルエンザウィルス、２型ライノウィルス、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、２型ライノウィルス、１型アデノウィルス、及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、からなる群から選択されたウィルスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法により分離された組成物を、効果的な量投与することを含む、非ウィルス細菌感染により起こされた哺乳類の症状を処置する方法。
【請求項１】
ａ）フェノール化合物を含む一種類以上の植物材料の粗製抽出物で、プロアントシアニジン、アントシアニン、及び非フェノール化合物を含む抽出物を与えること；
ｂ）前記粗製抽出物を濾過すること；
ｃ）前記濾過した粗製抽出物を、前記フェノールを放出可能に吸着するが、前記非フェノール化合物は保持しない臭素化ポリスチレン樹脂と接触させること；
ｄ）前記樹脂を洗浄溶離剤で洗浄し、前記非フェノール化合物を溶離すること；
ｅ）前記樹脂を第一溶離剤で溶離し、フェノールを含む第一フラクションを収集すること；
ｆ）前記樹脂を第二溶離剤で溶離し、フェノールを含む第二フラクションを収集すること；そして
ｇ）前記工程（ｅ）又は工程（ｆ）からのフラクションを分離するか、又は工程（ｅ）及び（ｆ）からの前記フラクションを一緒にし、全フェノールに富み、前記非フェノール化合物が実質的に無くなった組成物を得ること；
を含む、全フェノールに富む組成物の製造方法。
【請求項２】
粗製抽出物を、乾燥又は新鮮な植物材料（単数又は複数）を酸性化抽出溶媒で抽出することにより製造する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性化抽出溶媒が、約０〜９５％のエタノール及び約０〜３％の酸を含む水溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸が、硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酸性化抽出溶媒が、約０〜１００％のメタノール及び約０〜３％の酸を含む水溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酸が、硫酸、酢酸、又は塩酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
洗浄溶離剤が少なくとも０．００３％の酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
酸が、酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第一溶離剤が、水中に約５０〜７０％のエタノール及び約０．００３％の酸を入れたものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酸が、酢酸、塩酸、又は硫酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第二溶離剤が、水中に約７０〜９０％のエタノールを入れたものを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、約１０〜８０％の全フェノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、少なくとも１２％の全フェノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、少なくとも２５％の全フェノールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、図１２及び１３に例示したのと実質的に同じ、ＨＰＬＣトレースで６０〜７５分の間の領域でピークを生ずる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
植物材料が、果実及び（又は）イチゴ類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
果実及び／又はイチゴ類が、エルダーベリー、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、クランベリー、ラズベリー、プラム、レッドカーラント、ブラックカーラント、チェリー、及びグレープからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）が、更に、粗製抽出物にペクチナーゼを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ペクチナーゼが、植物材料の約０〜０．１２重量％の量で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更に、組成物に賦形剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
賦形剤が、防腐剤、キャリヤー、緩衝剤、濃化剤、懸濁剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、及び芳香剤からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
更に、
ｈ）工程ｅ）からの組成物、工程ｆ）からの組成物、又は工程ｇ）からの組成物を、逆相親油性樹脂を充填した低圧真空液体クロマトグラフィーカラムにローディングし、そのローディング中に溶離したフラクションを収集すること；
ｉ）前記樹脂を水で溶離すること；
ｊ）工程ｈ）及びｉ）からのフラクションを一緒にして、極性プロアントシアニジンに富む第一組成物を得ること；
ｋ）前記樹脂を極性有機溶媒で、その量を増大させながら溶離し、非極性プロアントシアニジンに富む第二組成物を得ること；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、逆相分取ＨＰＬＣにより第一組成物を精製し、アントシアニンを実質的に含まない一層極性のプロアントシアニジンを得ることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
更に、ゲル濾過、又は分取ＨＰＬＣにより第二組成物を精製し、アントシアニンを実質的に含まない極性の低いプロアントシアニジンを得ることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により製造された、全フェノールに富む組成物。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法により製造された、極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項２７】
植物材料が、果実及び（又は）イチゴ類である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
果実及び（又は）イチゴ類が、エルダーベリー、ブルーベリー、ビルベリー、ブラックベリー、ストロベリー、クランベリー、ラズベリー、プラム、レッドカーラント、ブラックカーラント、チェリー、及びグレープからなる群から選択されている、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が、１２．５％より大きい全フェノール濃度を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項２３に記載の方法により製造された、極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法により製造された、非極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３２】
請求項２４に記載の方法により製造された、非極性プロアントシアニジンに富む組成物。
【請求項３３】
図１２及び１３に例示したのと実質的に同じ、６０〜７５分の間の領域でピークを有するＨＰＬＣクロマトグラムを特徴とする、全フェノールに富む組成物。
【請求項３４】
更に、Ａ型インフルエンザウィルス、Ｂ型インフルエンザウィルス、２型ライノウィルス、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、２型ライノウィルス、１型アデノウィルス、及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、からなる群から選択されたウィルスに対する抗ウィルス活性についてイン・ビトロ検定で実証される抗ウィルス活性を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
更に、抗炎症活性についてのイン・ビトロ検定で実証される抗炎症効果を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
更に、抗菌活性についてのイン・ビトロ検定で実証される抗菌効果を示すことができる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
更に、一種類以上の免疫活性剤を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫活性剤が、アラビノガラクタン、エキナセア種、ビタミン、ミネラル、多糖類、及び距骨からなる群から選択されている、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
更に、一種類以上の抗突然変異剤を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４０】
抗突然変異剤が、緑茶抽出物、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、及びフラボノイドからなる群から選択されている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法により分離された組成物を、効果的な量投与することを含む、感染性有機体又は病因により起こされた哺乳類の症状を処置する方法。
【請求項４２】
有機体が、Ａ型インフルエンザウィルス、Ｂ型インフルエンザウィルス、２型ライノウィルス、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、パラインフルエンザウィルス、西ナイルウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、２型ライノウィルス、１型アデノウィルス、及びＰｕｎｔａ ＴｏｒｏＡウィルス、からなる群から選択されたウィルスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法により分離された組成物を、効果的な量投与することを含む、非ウィルス細菌感染により起こされた哺乳類の症状を処置する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【公表番号】特表２００６−５１１５０９（Ｐ２００６−５１１５０９Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５６５０（Ｐ２００４−５５５６５０）
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４７８４７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１８７４８２）フェノーリックス、エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２１日（２００３．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３７４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４７８４７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５１８７４８２）フェノーリックス、エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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