共焦点顕微鏡
【課題】装置構成を小型化できる共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】試料を励起する励起光を射出する光源と、試料に前記励起光を集光させることにより試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡に関する。共焦点光学系は、励起光の振幅又は位相を変調するとともに励起光を試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含む。
【解決手段】試料を励起する励起光を射出する光源と、試料に前記励起光を集光させることにより試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡に関する。共焦点光学系は、励起光の振幅又は位相を変調するとともに励起光を試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体や細胞などの観察や、半導体の表面観察などに共焦点顕微鏡システムが用いられている。このような共焦点顕微鏡システムは、レーザ光を細胞に照射するとともに細胞上の集光点を走査し、細胞からの戻り光を検出して蛍光画像を取得し、このようにして試料から得られた蛍光画像に対して必要な画像処理を施して解析することにより、試料の観察を行うことができる（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２１０８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記従来の共焦点顕微鏡システムは、回転式のピンホールアレイディスクを用いる、所謂ニポウ方式構造を採用しているため、装置構成上、ピンホールアレイディスクを回転させるための可動部が必要となり、顕微鏡システムが大型化してしまうといった問題があった。
【０００５】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、装置構成を小型化できる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様に従えば、試料を励起する励起光を射出する光源と、前記試料に前記励起光を集光させることにより当該試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡において、前記共焦点光学系は、前記励起光の振幅又は位相を変調するとともに該励起光を前記試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含む共焦点顕微鏡が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、装置構成を小型化できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第一実施形態に係る共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１空間光変調器の構成を示す図。
【図３】第１空間光変調器の動作を説明するための図。
【図４】共焦点顕微鏡の動作を説明するための図。
【図５】共焦点顕微鏡における共焦点光学系の構成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、図面を参照して本発明の共焦点顕微鏡の一実施形態に係る構成について説明する。なお、本実施形態は、発明の要旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各要請要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。
【００１０】
（第一実施形態）
図１は本実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。図１に示すように、共焦点顕微鏡１は、試料１０を載置する試料台２と、光源３と、試料１０の表面に励起光を集光させることで得た蛍光画像を撮像装置４に入力する共焦点光学系５と、制御装置７０と、を備えている。
【００１１】
光源３は試料１０に向けて励起光を射出するためのものである。光源３は、励起光として所定の波長を有するレーザー光を照射する。試料１０は、その光学的な特性により反射、吸収、蛍光、散乱などが励起光の照射領域において生じる。生物組織を蛍光観察する場合には、試料１０の組織を複数の蛍光試薬で染色して観察する。試料１０に励起光が照射されると、蛍光試薬で染色された各組織から試薬に応じた蛍光が発せられる。
【００１２】
撮像装置４は、蛍光画像を撮像するＣＣＤカメラから構成されており、撮像装置４は蛍光画像を電気信号に変換し、制御装置７０に入力するようになっている。制御装置７０は、例えば各機能の動作を制御する演算制御部（ＣＰＵ）、各種情報を格納する記憶部、外部機器とデータ通信する通信部から構成されるものである。制御装置７０の演算制御部は、主に各機能を統合的に制御し、記憶部に格納されているＯＳなどを起動して、このＯＳ上で格納されたプログラムを読み出して実行することにより、制御装置７０全体を制御し、制御装置７０固有の動作を行う。例えば記憶部のＲＡＭは、その動作の際に作業領域として使用される。
【００１３】
また制御装置７０の記憶部は、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory)、フラッシュメモリ、ハードディスクなどであって、主にＯＳや制御装置として動作するためのプログラムや、対物レンズの焦点位置などの位置情報、試料１０などのサンプル情報、画像データ、画像解析結果情報などの各種情報を格納するものでよい。
【００１４】
さらに制御装置７０の通信部は、主にケーブルや通信ネットワークなどを介して外部機器とデータ通信するインターフェースであって、撮像装置４などから撮像データなどの各種データを受信し、焦点を調整するための制御信号やその他制御信号などを送信する処理を行うものでよい。
【００１５】
共焦点光学系５は、試料１０に対向配置される対物レンズユニット６と、空間光変調装置７と、ダイクロイックプリズム１１と、を含んでいる。対物レンズユニット６は、倍率の異なる複数の対物レンズ６ａ，６ｂを有する。なお、対物レンズ６ａの倍率は、対物レンズ６ｂの倍率よりも高くなっている。
対物レンズユニット６は、光源３と試料１０との光路上に配置する対物レンズ６ａ，６ｂを例えばリボルバー機構により入れ替え可能となっている。これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、対物レンズにおける倍率を用途に応じて選択可能となっている。
【００１６】
空間光変調装置７は、光源３から射出された励起光Ｌ１の振幅又は位相を変調するとともに該励起光Ｌ１を試料１０に対して選択的に透過させるためのものである。空間光変調装置７は、光源３からの励起光Ｌ１を変調する第１空間光変調器８と、励起光Ｌ１により試料１０から発生した蛍光Ｌ２を撮像装置４に導く第２空間光変調器９と、を有する。本実施形態では、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９が液晶ライトバルブにより構成されている。なお、光源３と第１空間光変調器８との光路上には、光源３からの励起光Ｌ１を平行光に変換する不図示のコリメータレンズが設けられている。
【００１７】
ところで、上記撮像装置４は、その受光面と、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の画素２５が形成された表面及び試料１０の被観察面とが互いに光学的に共役関係になるように配置されている。そのため、撮像装置４には試料１０の光学的断面像が結像されることとなる。従って、制御装置７０は、撮像装置４からの撮像データに対して所定の画像処理を行うことで共焦点画像を得ることができる。
【００１８】
第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９は、それぞれ同じ構成を有している。そのため、以下の説明では第１空間光変調器８を例に挙げて、その構成及び動作について説明する。図２は第１空間光変調器８の構成を示す図であり、図２（ａ）は断面図、図２（ｂ）は平面図である。また、図３は第１空間光変調器８の動作を説明するための図である。
【００１９】
第１空間光変調器８は、図２（ａ），（ｂ）に示すように、一対のガラス基板２０，２１間に液晶２２を挟持することで構成されており、マトリクス状に配置された複数の画素２５を有している。ガラス基板２０の内面側には、各画素２５に対応して画素電極２３がそれぞれ設けられており、ガラス基板２１の内面側には、全画素２５に亘って共通電極２４が設けられている。第１空間光変調器８は不図示の偏光板を有しており、上記電極２３，２４間に電圧を印加することで液晶２２を画素２５毎に選択的に駆動させ、各々の画素２５について光（励起光Ｌ１及び蛍光Ｌ２）を透過或いは遮光可能となっている。
【００２０】
また、第１空間光変調器８は、画素２５毎にマイクロレンズＭが設けられている。具体的には、マイクロレンズＭは、各画素２５に対応するガラス基板２１の外面に貼着されている。すなわち、マイクロレンズＭは画素２５に一体に設けられており、これにより第１空間光変調器８は各画素２５に光を集光させて取り込むことが可能となっている。
【００２１】
第１空間光変調器８は、図３に示すように、所定の画素２５により光透過領域Ａ１を構成し、その他の画素２５により遮光領域Ａ２を構成することで光透過領域Ａ１の画素２５をピンホールと同様に機能させることが可能である。なお、図３においては図を見やすくするため、マイクロレンズＭの図示を省略している。
【００２２】
すなわち、第１空間光変調器８は、上述のように液晶２２を駆動させる画素２５を選択的に切り替えることで、ピンホール（光透過領域Ａ１）の位置を様々に変化させることができる。第１空間光変調器８と試料１０との間における励起光Ｌ１の光路の途中には、ダイクロイックプリズム１１が配置されている。ダイクロイックプリズム１１は、第１空間光変調器８における光透過領域の画素２５を透過した各励起光Ｌ１を通過させつつ、該励起光Ｌ１を試料１０に向かう励起光Ｌ１の光路上に配置された対物レンズユニット６に入射させるためのものである。また、ダイクロイックプリズム１１は、励起光Ｌ１により励起された試料１０から出力されて対物レンズユニット６を透過した蛍光Ｌ２を反射させ、撮像装置４に入力するためのものである。第２空間光変調器９に入射した蛍光Ｌ２は、不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射されるようになっている。
【００２３】
なお、第１空間光変調器８は、光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を種々に変更可能となっている。すなわち、後述するように光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を選択された対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて光透過領域Ａ１の大きさを変更することが可能となっている。また、第２空間光変調器９は、後述のように制御装置７０により第１空間光変調器８に同期して駆動されるようになっている。
【００２４】
続いて、共焦点顕微鏡１の動作について説明する。
はじめに、試料台２上に適量の試料１０を載置する。制御装置７０は、対物レンズユニット６のうち、選択された対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を設定する。
【００２５】
例えば、倍率の低い対物レンズ６ａを使用する場合には、制御装置７０は第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９に対し、光透過領域Ａ１を隣接する４つの画素２５で構成するように制御する。一方、倍率の高い対物レンズ６ｂを使用する場合には、制御装置７０は第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９に対し、光透過領域Ａ１を１つの画素２５で構成するように制御する。以下の説明では、対物レンズ６ｂを選択した場合について説明する。
【００２６】
光源３から出射された励起光Ｌ１は、不図示のコリメータレンズを介して平行光に変換された後、第１空間光変調器８に入射する。このとき、励起光Ｌ１は第１空間光変調器８の光透過領域Ａ１の画素２５のみ透過し、ダイクロイックプリズム１１に入射する。
【００２７】
ダイクロイックプリズム１１は、第１空間光変調器８における光透過領域Ａ１の画素２５を透過した各励起光Ｌ１を通過させ、光路上に設置された対物レンズ６ｂに入射させる。対物レンズ６ｂは試料台２上に載置された試料１０に集光されて微小の光スポットを形成し、試料１０を励起する。
【００２８】
励起光Ｌ１により励起された試料１０から発生した蛍光Ｌ２は、対物レンズ６ｂを透過した後、ダイクロイックプリズム１１により第２空間光変調器９に向けて反射される。蛍光Ｌ２は第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１の画素２５に入射する。
【００２９】
第２空間光変調器９は、制御装置７０により第１空間光変調器８に同期して駆動される。具体的に、制御装置７０は、第１空間光変調器８による光透過領域Ａ１と第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１とを一致させるように駆動する。これにより、第１空間光変調器８の光透過領域Ａ１を透過して試料１０の表面で生じた蛍光Ｌ２は、対応する第２空間光変調器９の各画素２５に設けられたマイクロレンズＭにより集光されて光透過領域Ａ１に集光される。第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１の画素２５を透過した蛍光Ｌ２は不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射される。撮像装置４は、入射された蛍光共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０は、撮像装置４から入力される電気信号を画像データに変換処理して記憶する。
【００３０】
制御装置７０は、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１を図４（ａ）〜（ｉ）に示すように順次切り替え、各光透過領域Ａ１からの光スポットで試料１０の観察領域全体をスキャンする。これにより、試料１０からの蛍光Ｌ２を高感度で受光でき、コントラストの高い明瞭な共焦点画像を取得することができる。
【００３１】
以上のように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１によれば、共焦点光学系５に設けられた空間光変調装置７により共焦点画像を得ることができるので、従来のニポウ方式のように複数のピンホールが形成されたニポウディスクを回転させる機構が不要となる。よって、顕微鏡を小型化することができる。また、空間光変調装置７（第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９）は、使用する対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて光透過領域Ａ１（ピンホール）の大きさを最適化できるので、所望の倍率に応じた共焦点画像を得ることができる。
【００３２】
（第二実施形態）
次に、本発明の共焦点顕微鏡の第二実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一実施形態に係る構成とは、空間光変調装置を構成する液晶ライトバルブの数が異なっている。そのため、以下の説明では空間光変調装置の構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。
【００３３】
図５は本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００における共焦点光学系１０５の構成を示す図である。共焦点光学系１０５は、対物レンズユニット６と、空間光変調装置１０７と、偏光ビームスプリッター１０８と、を含んでいる。
【００３４】
本実施形態に係る空間光変調装置１０７は、液晶ライトバルブから構成される空間光変調器１１０と、励起光Ｌ１に対して１／２の位相差を付与する波長板１１１と、偏光板１１２と、を含んでいる。波長板１１１は、偏光ビームスプリッター１０８を透過した励起光Ｌ１の偏光方向を４５°だけ回転可能となるように光学軸が位置合わせされている。また、空間光変調器１１０は、波長板１１１を透過した励起光Ｌ１が光透過領域Ａ１を通過することで偏光方向を９０°回転させるように設定されている。また、偏光板１１２は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１を通過した偏光方向を有する励起光Ｌ１を通過させるように光学軸が位置合わせされている。
【００３５】
このように本実施形態に係る空間光変調装置１０７は、第一実施形態とは異なり、１個の空間光変調器１１０のみを含んでいる。偏光ビームスプリッター１０８は、光源３と空間光変調装置１０７との間における励起光Ｌ１の光路上に配置されており、光源３から射出された所定の偏光成分からなる励起光Ｌ１を透過させることができる。また、偏光ビームスプリッター１０８は、試料１０で発生した蛍光Ｌ２を分離して撮像装置４に導くようになっている。
【００３６】
続いて、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００の動作について説明する。なお、第一実施形態と同一の動作については説明を省略するものとする。図５には光源３から出射された励起光Ｌ１及び蛍光Ｌ２が共焦点光学系１０５の各光学部材（偏光ビームスプリッター１０８、空間光変調器１１０、波長板１１１、及び偏光板１１２）を通過することにより偏光状態が変化する様子を示している。
【００３７】
偏光ビームスプリッター１０８は、に示すように光源３から出射された両矢印Ｄ１で示される偏光方向の励起光Ｌ１（例えば、Ｐ偏光）を透過させ、波長板１１１に入射させる。この励起光Ｌ１は、波長板１１１を透過することで偏光方向が４５°だけ回転し、両矢印Ｄ２で示された偏光方向となる。また、波長板１１１を透過した励起光Ｌ１は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１のみを透過することで偏光方向が９０°だけ回転し、両矢印Ｄ３で示された偏光方向となる。なお、偏光板１１２の光透過軸は両矢印Ｄ３に一致している。光透過領域Ａ１を透過した励起光Ｌ１は、偏光板１１２を透過して対物レンズ６ｂに入射する。対物レンズ６ｂは試料台２上に載置された試料１０に集光されて微小の光スポットを形成し、試料１０を励起する。
【００３８】
励起光Ｌ１により励起された試料１０から発生した蛍光Ｌ２は、対物レンズ６ｂを透過した後、偏光板１１２に入射する。なお、蛍光Ｌ２は種々の偏光成分を含んでいる。蛍光Ｌ２は、偏光板１１２を透過すると、再度、両矢印Ｄ３で示された偏光方向となる。すなわち、蛍光Ｌ２は偏光板１１２を透過すると、励起光Ｌ１が空間光変調器１１０を通過した後の偏光方向と同一となる。偏光板１１２を透過した蛍光Ｌ２は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１のみを透過することで、再度、両矢印Ｄ２で示された偏光方向となる。空間光変調器１１０を透過した蛍光Ｌ２は、さらに波長板１１１を通過することで偏光方向が４５°だけ回転し、両矢印Ｄ４で示された偏光方向となる。
【００３９】
両矢印Ｄ４で示された偏光方向は、両矢印Ｄ１で示された偏光方向と直交している。すなわち、蛍光Ｌ２はＳ偏光となっており、偏光ビームスプリッター１０８を通過することなく、反射されて不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射される。撮像装置４は、入射された蛍光共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０は、撮像装置４から入力される電気信号を画像データに変換処理して記憶する。
【００４０】
制御装置７０は、第一実施形態と同様、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１を順次切り替え、各光透過領域Ａ１からの光スポットで試料１０の観察領域全体をスキャンする。これにより、試料１０からの蛍光Ｌ２を高感度で受光でき、コントラストの高い明瞭な共焦点画像を取得することができる。
【００４１】
以上のように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００によれば、空間光変調装置１０７により共焦点画像を得ることができるので、第一実施形態と同様、従来のニポウ方式のように複数のピンホールが形成されたニポウディスクを回転させる機構が不要となり、顕微鏡を小型化できる。また、空間光変調装置１０７が空間光変調器１１０を１個のみ備えているので、第一実施形態に比べて、共焦点光学系１０５及びこれを備えた共焦点顕微鏡１００のさらなる小型化を実現できる。
【００４２】
なお、上述の実施形態においては、対物レンズユニット６が倍率の異なる対物レンズ６ａ，６ｂを２種類含む場合について説明したが、本発明は対物レンズユニット６が倍率の異なる対物レンズを３種類以上含む場合にも適応可能である。この場合、上述のように第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９又は空間光変調器１１０における光透過領域Ａ１の大きさを対物レンズに応じて最適な大きさに設定できるので、対物レンズの種類分だけピンホールが形成されたピンホールディスク又はピンホール数分のディスクを用意する必要が無い。
【００４３】
また、上述の実施形態においては、空間光変調器として液晶ライトバルブを用いた場合について説明したが、励起光の振幅又は位相を変調可能な装置であれば、例えば複数のピンホール状の開口を有し、開口の各々が開閉可能なシャッター機構を用いて試料１０に励起光Ｌ１を集光させるとともに試料１０から発生した蛍光Ｌ２を撮像装置４に導く構成であっても構わない。また空間光変調器として、電気刺激の印加によって透過率等の特定の光学特性が変化する電気活性材料が封入され、ＴＦＴ等の電極が形成された複数の空間を有する光学素子を用いても良い。この光学素子は密封封止されアレイ状に形成されたセルを有しており、各セルには電気活性材料が封入されている。各セルには電極が形成されてセルごとに独立に電圧をかけることができるようになっており、セルにかかる電圧を制御することによりセルを光が透過する状態及び光を透過しない状態を可逆的に変化させることができる。この光学素子では、どのセルに電圧をかけるかを制御することによりピンホール（光透過領域Ａ１）の位置を様々に変化させることができる。この光学素子の構造や動作の詳細は、例えば特表２０１０−５０７１１９に開示されている。
【符号の説明】
【００４４】
Ｌ１…励起光、Ｌ２…蛍光、Ｍ…マイクロレンズ、１，１００…共焦点顕微鏡、３…光源、４…撮像装置、５，１０５…共焦点光学系、６ａ，６ｂ…対物レンズ、７，１０７…空間光変調装置、８…第１空間光変調器、９…第２空間光変調器、１０…試料、１１…ダイクロイックプリズム、２５…画素、１０８…偏光ビームスプリッター、１１０…空間光変調器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体や細胞などの観察や、半導体の表面観察などに共焦点顕微鏡システムが用いられている。このような共焦点顕微鏡システムは、レーザ光を細胞に照射するとともに細胞上の集光点を走査し、細胞からの戻り光を検出して蛍光画像を取得し、このようにして試料から得られた蛍光画像に対して必要な画像処理を施して解析することにより、試料の観察を行うことができる（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２１０８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記従来の共焦点顕微鏡システムは、回転式のピンホールアレイディスクを用いる、所謂ニポウ方式構造を採用しているため、装置構成上、ピンホールアレイディスクを回転させるための可動部が必要となり、顕微鏡システムが大型化してしまうといった問題があった。
【０００５】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、装置構成を小型化できる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様に従えば、試料を励起する励起光を射出する光源と、前記試料に前記励起光を集光させることにより当該試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡において、前記共焦点光学系は、前記励起光の振幅又は位相を変調するとともに該励起光を前記試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含む共焦点顕微鏡が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、装置構成を小型化できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第一実施形態に係る共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１空間光変調器の構成を示す図。
【図３】第１空間光変調器の動作を説明するための図。
【図４】共焦点顕微鏡の動作を説明するための図。
【図５】共焦点顕微鏡における共焦点光学系の構成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、図面を参照して本発明の共焦点顕微鏡の一実施形態に係る構成について説明する。なお、本実施形態は、発明の要旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各要請要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。
【００１０】
（第一実施形態）
図１は本実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。図１に示すように、共焦点顕微鏡１は、試料１０を載置する試料台２と、光源３と、試料１０の表面に励起光を集光させることで得た蛍光画像を撮像装置４に入力する共焦点光学系５と、制御装置７０と、を備えている。
【００１１】
光源３は試料１０に向けて励起光を射出するためのものである。光源３は、励起光として所定の波長を有するレーザー光を照射する。試料１０は、その光学的な特性により反射、吸収、蛍光、散乱などが励起光の照射領域において生じる。生物組織を蛍光観察する場合には、試料１０の組織を複数の蛍光試薬で染色して観察する。試料１０に励起光が照射されると、蛍光試薬で染色された各組織から試薬に応じた蛍光が発せられる。
【００１２】
撮像装置４は、蛍光画像を撮像するＣＣＤカメラから構成されており、撮像装置４は蛍光画像を電気信号に変換し、制御装置７０に入力するようになっている。制御装置７０は、例えば各機能の動作を制御する演算制御部（ＣＰＵ）、各種情報を格納する記憶部、外部機器とデータ通信する通信部から構成されるものである。制御装置７０の演算制御部は、主に各機能を統合的に制御し、記憶部に格納されているＯＳなどを起動して、このＯＳ上で格納されたプログラムを読み出して実行することにより、制御装置７０全体を制御し、制御装置７０固有の動作を行う。例えば記憶部のＲＡＭは、その動作の際に作業領域として使用される。
【００１３】
また制御装置７０の記憶部は、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory)、フラッシュメモリ、ハードディスクなどであって、主にＯＳや制御装置として動作するためのプログラムや、対物レンズの焦点位置などの位置情報、試料１０などのサンプル情報、画像データ、画像解析結果情報などの各種情報を格納するものでよい。
【００１４】
さらに制御装置７０の通信部は、主にケーブルや通信ネットワークなどを介して外部機器とデータ通信するインターフェースであって、撮像装置４などから撮像データなどの各種データを受信し、焦点を調整するための制御信号やその他制御信号などを送信する処理を行うものでよい。
【００１５】
共焦点光学系５は、試料１０に対向配置される対物レンズユニット６と、空間光変調装置７と、ダイクロイックプリズム１１と、を含んでいる。対物レンズユニット６は、倍率の異なる複数の対物レンズ６ａ，６ｂを有する。なお、対物レンズ６ａの倍率は、対物レンズ６ｂの倍率よりも高くなっている。
対物レンズユニット６は、光源３と試料１０との光路上に配置する対物レンズ６ａ，６ｂを例えばリボルバー機構により入れ替え可能となっている。これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、対物レンズにおける倍率を用途に応じて選択可能となっている。
【００１６】
空間光変調装置７は、光源３から射出された励起光Ｌ１の振幅又は位相を変調するとともに該励起光Ｌ１を試料１０に対して選択的に透過させるためのものである。空間光変調装置７は、光源３からの励起光Ｌ１を変調する第１空間光変調器８と、励起光Ｌ１により試料１０から発生した蛍光Ｌ２を撮像装置４に導く第２空間光変調器９と、を有する。本実施形態では、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９が液晶ライトバルブにより構成されている。なお、光源３と第１空間光変調器８との光路上には、光源３からの励起光Ｌ１を平行光に変換する不図示のコリメータレンズが設けられている。
【００１７】
ところで、上記撮像装置４は、その受光面と、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の画素２５が形成された表面及び試料１０の被観察面とが互いに光学的に共役関係になるように配置されている。そのため、撮像装置４には試料１０の光学的断面像が結像されることとなる。従って、制御装置７０は、撮像装置４からの撮像データに対して所定の画像処理を行うことで共焦点画像を得ることができる。
【００１８】
第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９は、それぞれ同じ構成を有している。そのため、以下の説明では第１空間光変調器８を例に挙げて、その構成及び動作について説明する。図２は第１空間光変調器８の構成を示す図であり、図２（ａ）は断面図、図２（ｂ）は平面図である。また、図３は第１空間光変調器８の動作を説明するための図である。
【００１９】
第１空間光変調器８は、図２（ａ），（ｂ）に示すように、一対のガラス基板２０，２１間に液晶２２を挟持することで構成されており、マトリクス状に配置された複数の画素２５を有している。ガラス基板２０の内面側には、各画素２５に対応して画素電極２３がそれぞれ設けられており、ガラス基板２１の内面側には、全画素２５に亘って共通電極２４が設けられている。第１空間光変調器８は不図示の偏光板を有しており、上記電極２３，２４間に電圧を印加することで液晶２２を画素２５毎に選択的に駆動させ、各々の画素２５について光（励起光Ｌ１及び蛍光Ｌ２）を透過或いは遮光可能となっている。
【００２０】
また、第１空間光変調器８は、画素２５毎にマイクロレンズＭが設けられている。具体的には、マイクロレンズＭは、各画素２５に対応するガラス基板２１の外面に貼着されている。すなわち、マイクロレンズＭは画素２５に一体に設けられており、これにより第１空間光変調器８は各画素２５に光を集光させて取り込むことが可能となっている。
【００２１】
第１空間光変調器８は、図３に示すように、所定の画素２５により光透過領域Ａ１を構成し、その他の画素２５により遮光領域Ａ２を構成することで光透過領域Ａ１の画素２５をピンホールと同様に機能させることが可能である。なお、図３においては図を見やすくするため、マイクロレンズＭの図示を省略している。
【００２２】
すなわち、第１空間光変調器８は、上述のように液晶２２を駆動させる画素２５を選択的に切り替えることで、ピンホール（光透過領域Ａ１）の位置を様々に変化させることができる。第１空間光変調器８と試料１０との間における励起光Ｌ１の光路の途中には、ダイクロイックプリズム１１が配置されている。ダイクロイックプリズム１１は、第１空間光変調器８における光透過領域の画素２５を透過した各励起光Ｌ１を通過させつつ、該励起光Ｌ１を試料１０に向かう励起光Ｌ１の光路上に配置された対物レンズユニット６に入射させるためのものである。また、ダイクロイックプリズム１１は、励起光Ｌ１により励起された試料１０から出力されて対物レンズユニット６を透過した蛍光Ｌ２を反射させ、撮像装置４に入力するためのものである。第２空間光変調器９に入射した蛍光Ｌ２は、不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射されるようになっている。
【００２３】
なお、第１空間光変調器８は、光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を種々に変更可能となっている。すなわち、後述するように光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を選択された対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて光透過領域Ａ１の大きさを変更することが可能となっている。また、第２空間光変調器９は、後述のように制御装置７０により第１空間光変調器８に同期して駆動されるようになっている。
【００２４】
続いて、共焦点顕微鏡１の動作について説明する。
はじめに、試料台２上に適量の試料１０を載置する。制御装置７０は、対物レンズユニット６のうち、選択された対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１を構成する画素２５の数を設定する。
【００２５】
例えば、倍率の低い対物レンズ６ａを使用する場合には、制御装置７０は第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９に対し、光透過領域Ａ１を隣接する４つの画素２５で構成するように制御する。一方、倍率の高い対物レンズ６ｂを使用する場合には、制御装置７０は第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９に対し、光透過領域Ａ１を１つの画素２５で構成するように制御する。以下の説明では、対物レンズ６ｂを選択した場合について説明する。
【００２６】
光源３から出射された励起光Ｌ１は、不図示のコリメータレンズを介して平行光に変換された後、第１空間光変調器８に入射する。このとき、励起光Ｌ１は第１空間光変調器８の光透過領域Ａ１の画素２５のみ透過し、ダイクロイックプリズム１１に入射する。
【００２７】
ダイクロイックプリズム１１は、第１空間光変調器８における光透過領域Ａ１の画素２５を透過した各励起光Ｌ１を通過させ、光路上に設置された対物レンズ６ｂに入射させる。対物レンズ６ｂは試料台２上に載置された試料１０に集光されて微小の光スポットを形成し、試料１０を励起する。
【００２８】
励起光Ｌ１により励起された試料１０から発生した蛍光Ｌ２は、対物レンズ６ｂを透過した後、ダイクロイックプリズム１１により第２空間光変調器９に向けて反射される。蛍光Ｌ２は第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１の画素２５に入射する。
【００２９】
第２空間光変調器９は、制御装置７０により第１空間光変調器８に同期して駆動される。具体的に、制御装置７０は、第１空間光変調器８による光透過領域Ａ１と第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１とを一致させるように駆動する。これにより、第１空間光変調器８の光透過領域Ａ１を透過して試料１０の表面で生じた蛍光Ｌ２は、対応する第２空間光変調器９の各画素２５に設けられたマイクロレンズＭにより集光されて光透過領域Ａ１に集光される。第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１の画素２５を透過した蛍光Ｌ２は不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射される。撮像装置４は、入射された蛍光共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０は、撮像装置４から入力される電気信号を画像データに変換処理して記憶する。
【００３０】
制御装置７０は、第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９の光透過領域Ａ１を図４（ａ）〜（ｉ）に示すように順次切り替え、各光透過領域Ａ１からの光スポットで試料１０の観察領域全体をスキャンする。これにより、試料１０からの蛍光Ｌ２を高感度で受光でき、コントラストの高い明瞭な共焦点画像を取得することができる。
【００３１】
以上のように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１によれば、共焦点光学系５に設けられた空間光変調装置７により共焦点画像を得ることができるので、従来のニポウ方式のように複数のピンホールが形成されたニポウディスクを回転させる機構が不要となる。よって、顕微鏡を小型化することができる。また、空間光変調装置７（第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９）は、使用する対物レンズ６ａ，６ｂの倍率に応じて光透過領域Ａ１（ピンホール）の大きさを最適化できるので、所望の倍率に応じた共焦点画像を得ることができる。
【００３２】
（第二実施形態）
次に、本発明の共焦点顕微鏡の第二実施形態について説明する。なお、本実施形態に係る構成と第一実施形態に係る構成とは、空間光変調装置を構成する液晶ライトバルブの数が異なっている。そのため、以下の説明では空間光変調装置の構成を主に説明し、第一実施形態と同じ構成及び部材については同一の符号を付し、その詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。
【００３３】
図５は本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００における共焦点光学系１０５の構成を示す図である。共焦点光学系１０５は、対物レンズユニット６と、空間光変調装置１０７と、偏光ビームスプリッター１０８と、を含んでいる。
【００３４】
本実施形態に係る空間光変調装置１０７は、液晶ライトバルブから構成される空間光変調器１１０と、励起光Ｌ１に対して１／２の位相差を付与する波長板１１１と、偏光板１１２と、を含んでいる。波長板１１１は、偏光ビームスプリッター１０８を透過した励起光Ｌ１の偏光方向を４５°だけ回転可能となるように光学軸が位置合わせされている。また、空間光変調器１１０は、波長板１１１を透過した励起光Ｌ１が光透過領域Ａ１を通過することで偏光方向を９０°回転させるように設定されている。また、偏光板１１２は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１を通過した偏光方向を有する励起光Ｌ１を通過させるように光学軸が位置合わせされている。
【００３５】
このように本実施形態に係る空間光変調装置１０７は、第一実施形態とは異なり、１個の空間光変調器１１０のみを含んでいる。偏光ビームスプリッター１０８は、光源３と空間光変調装置１０７との間における励起光Ｌ１の光路上に配置されており、光源３から射出された所定の偏光成分からなる励起光Ｌ１を透過させることができる。また、偏光ビームスプリッター１０８は、試料１０で発生した蛍光Ｌ２を分離して撮像装置４に導くようになっている。
【００３６】
続いて、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００の動作について説明する。なお、第一実施形態と同一の動作については説明を省略するものとする。図５には光源３から出射された励起光Ｌ１及び蛍光Ｌ２が共焦点光学系１０５の各光学部材（偏光ビームスプリッター１０８、空間光変調器１１０、波長板１１１、及び偏光板１１２）を通過することにより偏光状態が変化する様子を示している。
【００３７】
偏光ビームスプリッター１０８は、に示すように光源３から出射された両矢印Ｄ１で示される偏光方向の励起光Ｌ１（例えば、Ｐ偏光）を透過させ、波長板１１１に入射させる。この励起光Ｌ１は、波長板１１１を透過することで偏光方向が４５°だけ回転し、両矢印Ｄ２で示された偏光方向となる。また、波長板１１１を透過した励起光Ｌ１は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１のみを透過することで偏光方向が９０°だけ回転し、両矢印Ｄ３で示された偏光方向となる。なお、偏光板１１２の光透過軸は両矢印Ｄ３に一致している。光透過領域Ａ１を透過した励起光Ｌ１は、偏光板１１２を透過して対物レンズ６ｂに入射する。対物レンズ６ｂは試料台２上に載置された試料１０に集光されて微小の光スポットを形成し、試料１０を励起する。
【００３８】
励起光Ｌ１により励起された試料１０から発生した蛍光Ｌ２は、対物レンズ６ｂを透過した後、偏光板１１２に入射する。なお、蛍光Ｌ２は種々の偏光成分を含んでいる。蛍光Ｌ２は、偏光板１１２を透過すると、再度、両矢印Ｄ３で示された偏光方向となる。すなわち、蛍光Ｌ２は偏光板１１２を透過すると、励起光Ｌ１が空間光変調器１１０を通過した後の偏光方向と同一となる。偏光板１１２を透過した蛍光Ｌ２は、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１のみを透過することで、再度、両矢印Ｄ２で示された偏光方向となる。空間光変調器１１０を透過した蛍光Ｌ２は、さらに波長板１１１を通過することで偏光方向が４５°だけ回転し、両矢印Ｄ４で示された偏光方向となる。
【００３９】
両矢印Ｄ４で示された偏光方向は、両矢印Ｄ１で示された偏光方向と直交している。すなわち、蛍光Ｌ２はＳ偏光となっており、偏光ビームスプリッター１０８を通過することなく、反射されて不図示のリレーレンズを介して撮像装置４に入射される。撮像装置４は、入射された蛍光共焦点画像を電気信号に変換して出力する。制御装置７０は、撮像装置４から入力される電気信号を画像データに変換処理して記憶する。
【００４０】
制御装置７０は、第一実施形態と同様、空間光変調器１１０の光透過領域Ａ１を順次切り替え、各光透過領域Ａ１からの光スポットで試料１０の観察領域全体をスキャンする。これにより、試料１０からの蛍光Ｌ２を高感度で受光でき、コントラストの高い明瞭な共焦点画像を取得することができる。
【００４１】
以上のように、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１００によれば、空間光変調装置１０７により共焦点画像を得ることができるので、第一実施形態と同様、従来のニポウ方式のように複数のピンホールが形成されたニポウディスクを回転させる機構が不要となり、顕微鏡を小型化できる。また、空間光変調装置１０７が空間光変調器１１０を１個のみ備えているので、第一実施形態に比べて、共焦点光学系１０５及びこれを備えた共焦点顕微鏡１００のさらなる小型化を実現できる。
【００４２】
なお、上述の実施形態においては、対物レンズユニット６が倍率の異なる対物レンズ６ａ，６ｂを２種類含む場合について説明したが、本発明は対物レンズユニット６が倍率の異なる対物レンズを３種類以上含む場合にも適応可能である。この場合、上述のように第１空間光変調器８及び第２空間光変調器９又は空間光変調器１１０における光透過領域Ａ１の大きさを対物レンズに応じて最適な大きさに設定できるので、対物レンズの種類分だけピンホールが形成されたピンホールディスク又はピンホール数分のディスクを用意する必要が無い。
【００４３】
また、上述の実施形態においては、空間光変調器として液晶ライトバルブを用いた場合について説明したが、励起光の振幅又は位相を変調可能な装置であれば、例えば複数のピンホール状の開口を有し、開口の各々が開閉可能なシャッター機構を用いて試料１０に励起光Ｌ１を集光させるとともに試料１０から発生した蛍光Ｌ２を撮像装置４に導く構成であっても構わない。また空間光変調器として、電気刺激の印加によって透過率等の特定の光学特性が変化する電気活性材料が封入され、ＴＦＴ等の電極が形成された複数の空間を有する光学素子を用いても良い。この光学素子は密封封止されアレイ状に形成されたセルを有しており、各セルには電気活性材料が封入されている。各セルには電極が形成されてセルごとに独立に電圧をかけることができるようになっており、セルにかかる電圧を制御することによりセルを光が透過する状態及び光を透過しない状態を可逆的に変化させることができる。この光学素子では、どのセルに電圧をかけるかを制御することによりピンホール（光透過領域Ａ１）の位置を様々に変化させることができる。この光学素子の構造や動作の詳細は、例えば特表２０１０−５０７１１９に開示されている。
【符号の説明】
【００４４】
Ｌ１…励起光、Ｌ２…蛍光、Ｍ…マイクロレンズ、１，１００…共焦点顕微鏡、３…光源、４…撮像装置、５，１０５…共焦点光学系、６ａ，６ｂ…対物レンズ、７，１０７…空間光変調装置、８…第１空間光変調器、９…第２空間光変調器、１０…試料、１１…ダイクロイックプリズム、２５…画素、１０８…偏光ビームスプリッター、１１０…空間光変調器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を励起する励起光を射出する光源と、前記試料に前記励起光を集光させることにより当該試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡において、
前記共焦点光学系は、前記励起光の振幅又は位相を変調するとともに該励起光を前記試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含むことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記空間光変調装置は複数の画素を有し、
前記共焦点光学系は、前記複数の画素の各々に対応する複数のマイクロレンズを含むことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記マイクロレンズは、前記画素に一体に設けられることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記空間光変調装置が、液晶ライトバルブであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記空間光変調装置は、前記光源からの前記励起光を変調する第１空間光変調器と、前記試料による蛍光を第１空間光変調器に同期して変調することで前記撮像装置に入力する第２空間光変調器と、を有し、
前記第１空間変調器と前記試料との間における前記励起光の光路の途中に、前記第１空間光変調器による変調後の前記励起光を透過させるとともに前記試料から生じた蛍光を前記第２空間光変調器に向けて反射させるダイクロイックプリズムが設けられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記共焦点光学系は、前記光源と前記空間光変調装置との間における前記励起光の光路の途中に設けられ、前記光源からの前記励起光を透過させるとともに前記試料から生じた蛍光を反射させることで前記撮像装置に入力させる偏光ビームスプリッターを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項１】
試料を励起する励起光を射出する光源と、前記試料に前記励起光を集光させることにより当該試料から発生した蛍光を撮像装置に導く共焦点光学系と、を備えた共焦点顕微鏡において、
前記共焦点光学系は、前記励起光の振幅又は位相を変調するとともに該励起光を前記試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を含むことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記空間光変調装置は複数の画素を有し、
前記共焦点光学系は、前記複数の画素の各々に対応する複数のマイクロレンズを含むことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記マイクロレンズは、前記画素に一体に設けられることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記空間光変調装置が、液晶ライトバルブであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記空間光変調装置は、前記光源からの前記励起光を変調する第１空間光変調器と、前記試料による蛍光を第１空間光変調器に同期して変調することで前記撮像装置に入力する第２空間光変調器と、を有し、
前記第１空間変調器と前記試料との間における前記励起光の光路の途中に、前記第１空間光変調器による変調後の前記励起光を透過させるとともに前記試料から生じた蛍光を前記第２空間光変調器に向けて反射させるダイクロイックプリズムが設けられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記共焦点光学系は、前記光源と前記空間光変調装置との間における前記励起光の光路の途中に設けられ、前記光源からの前記励起光を透過させるとともに前記試料から生じた蛍光を反射させることで前記撮像装置に入力させる偏光ビームスプリッターを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−７８６５２（Ｐ２０１２−７８６５２Ａ）
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２４９７１（Ｐ２０１０−２２４９７１）
【出願日】平成２２年１０月４日（２０１０．１０．４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月４日（２０１０．１０．４）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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