冬虫夏草の培養方法及び冬虫夏草を有効成分とする免疫賦活剤、がん細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、又は抗酸化剤
【課題】同じ菌種の冬虫夏草でも、蚕種によって優れた活性を示す冬虫夏草を見出すこと。
【解決手段】本発明の冬虫夏草の培養方法は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする。
【解決手段】本発明の冬虫夏草の培養方法は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法、及び冬虫夏草を有効成分とする免疫賦活剤、がん細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、又は抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草は、中国古来から伝わる秘薬として珍重されてきた。近年、秘薬としての冬虫夏草の効果並びに成分分析が行われている。また、生活様式の変化や健康志向の高まりから、健康食品としての利用も進んでいる。
冬虫夏草は、昆虫に寄生するキノコの総称として用いられることが多いが、子嚢菌類、バッカク菌目、バッカク菌科の一属に位置づけられている。
分類体系は未だ確立されていないと言われているが、菌種によって寄生する寄主が異なるとされ、冬虫夏草の同定には、形成される子実体の形態だけでなく、寄主となる昆虫の種類も参考にされている。
例えば、ツクツクボウシセミタケ（学名Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ，ｓｉｎｃｌａｉｒｉｉ，Ｋｏｂａｙａｓｉ）はツクツクボウシを寄主とし、コブガタアリタケ（学名Ｔｏｒｒｕｂｉｅｌｌａ ｓｐ． （ｋｏｂｕｇａｔａａｒｉｔａｋｅ））はムネアカオオアリを寄主とし、カメムシタケ（学名Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｎｕｔａｎｓ Ｐａｔ．）はカメムシを寄主とする。
その他、トンボ、ハチ、クモ類やダニ類を寄主とする冬虫夏草もある。
そして、例えばサナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）からは、コルジセピンを指標とした免疫賦活効果が知られ、ツクツクボウシに寄生するツクツクボウシタケからは、ＦＴＹ７２０という免疫抑制効果が知られているように、冬虫夏草は、その種類によって異なる活性が見つけられている。
非特許文献１では、ハナサナギタケ、ツクツクボウシセミタケ、サナギタケ、マルミノアリタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｆｏｒｍｉｃａｒｕｍ）、ウスキサナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）について、虫体成分を含まない培地で培養を行い、それぞれの有効成分について調べた結果を報告している。
また、特許文献１では、サナギタケの培養菌糸体の抽出液に強心作用や気管支拡張作用があることを開示し、特許文献２では、サナギタケに着目してコルジセピンの抽出方法を提案している。
また、特許文献３、４、５では、ハナサナギタケに着目して有効物質を見出している。
漢方薬として珍重されているコルジセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、人工的な培養によって子実体形成まで至っておらず、その代用品として、チョウ目カイコガ科を寄主とする冬虫夏草の人工培養方法が多く提案されている。
特許文献６では、冬虫夏草の菌糸又は子座胞子を、既成食品であるニンニク・醤油・砂糖を混合した培養液を殺菌し、常法により液体培養するか、又はこの液体培養液を米・麦・とうもろこし等の穀物又は蚕・セミ等の節足動物の昆虫類の成虫・蛹・幼虫等に吸着させて固体培養を行う方法が提案されている。
特許文献７では、冬虫夏草の菌糸体を、糖類、蛋白物質、ビタミン類、核酸類等の一種又は数種を主成分とし、これらの主成分に穀類を添加して立体固形培地に移植して培養し、この立体固形培地において培養した菌糸を糖類蛋白物質類、ビタミン類、核酸類等の一種又は数種を主成分とし、これにアミノ酸類の一種又は数種を添加し、水を基質としたｐH４．０〜７．０の液体培地に移植して静置培養し、液体培地表面に菌座を形成させる方法が提案されている。
特許文献８では、生きている昆虫に冬虫夏草の菌糸体を直接に感染、接種するか、あるいは３分の１量の昆虫組織体を加えた寒天を基質とする純粋分離培地に冬虫夏草の菌糸体を接種する方法である。なお、生きている昆虫を用いる場合としては、繭を形成する直前の蚕を用いている。
特許文献９では、野外に存在する冬虫夏草を採取し、寒天培地、液体培地で菌糸、分生胞子を増殖させ、最終的な大量増殖を野外栽培で行う方法が提案されている。
特許文献１０では、蚕の蛹そのものを培地として培養する方法を提案し、特許文献１１では、活きた蚕を培地とすることで更に天然に近い培養方法を提案している。
また、特許文献１２では、冬虫夏草を製造する培地に、食酢や食酢もろみを含有させることで効能の高い冬虫夏草を製造することを提案している。
【非特許文献１】矢萩信夫 「ノムジタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属菌の培養とその生理活性に関する研究」２００５年３月２９日〜３１日 第１２５回日本薬学会）
【特許文献１】特開平８−１２５８８号公報
【特許文献２】特開２００４−８９３８号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２２６７号公報
【特許文献４】特開２００３−１２８５１５号公報
【特許文献５】特開２００５−２３９５８５号公報
【特許文献６】特開昭５４−８０４８６号公報
【特許文献７】特公昭６１−５３０３３号公報
【特許文献８】特開昭６２年１０７７２５号公報
【特許文献９】特開平６−２３３６２７号公報
【特許文献１０】特許第２６７６５０２号
【特許文献１１】特許第３５９３４２９号
【特許文献１２】特開２００３−１１６３４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
非特許文献１、特許文献１から特許文献５にも示したように、現在では、冬虫夏草菌の種類に応じた薬理作用の違いが着目され、研究が進められている。
そして、同じチョウ目カイコガ科を寄主とする冬虫夏草であっても、サナギタケとハナサナギタケのように種類の異なる冬虫夏草について、薬理作用の相違が研究されている。
また、特許文献６から特許文献１２にも示したように、培地の相違による薬理効果の違いには着目されてきたが、それはあくまでも培地成分の相違、虫体と穀類との相違、虫体の成育段階の相違、又は虫体が活きているか死んだ状態かの相違によるもので、宿主となる蚕種に着目した考えは全く無く、研究もされていなかった。
本発明者らは、寄生種の冬虫夏草にも様々な特性があると同時に、寄主である蚕にも多様な品種と系統が存在することから、寄生種と寄主の組み合わせに着目して研究を行った。
特に、わが国の正倉院の絹織物にも使用されている蚕である「小石丸」（）は、わが国に限らず世界的視点においても差別化するには十分な歴史的根拠があり、しかも今日まで脈々と飼育が継続されている。さらに、「小石丸」のもうひとつの特性として、生産された生糸は細繊度であり好感触を有しており、幼虫は耐病性に優れていると考えられている。従って、「小石丸」の歴史的価値ならびに生物学的評価から、「小石丸」を冬虫夏草の寄生種として選択することに大きな意義があると考えた。
【０００４】
本発明は、同じ菌種の冬虫夏草でも、蚕種によって優れた活性を示す冬虫夏草を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１記載の本発明の冬虫夏草の培養方法は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、前記蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする。
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法において、前記冬虫夏草としてハナサナギタケを用いたことを特徴とする。
請求項３記載の本発明の免疫賦活剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項４記載の本発明のがん細胞増殖抑制剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項５記載の本発明の抗炎症剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項６記載の本発明の抗酸化剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、同じ種類の冬虫夏草菌であっても、蚕種として小石丸を用いることで、優れた活性が認められた。
【実施例】
【０００７】
１．試料
本発明では、寄主である蚕品種を小石丸とし、比較例としてわが国において普及している実用品種の（錦秋ｘ鐘和）を使用した。寄生種として、コナサナギタケ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）とハナサナギタケ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｕｉｐｅｓ）を使用した。
冬虫夏草（コナサナギタケ及びハナサナギタケ）は、蚕が繭を形成した後に蛹を取り出し、取り出した蛹に冬虫夏草の子実体に形成された子嚢胞子又は分生胞子を接種し、子実体が完全に成育するまで培養したものを用いた。子実体が完全に成育した冬虫夏草を、６０℃前後の温度で乾燥させ、その後ブレンダー（ＷＢ−１，φ１３４ｘ２７０ｍｍ，アズワン株式会社）により粉砕し、粉末状にしたものを実験に使用した。乾燥させた冬虫夏草は４℃で保存し、粉末化したものは直ちに抽出を行った。
以降の説明においては、宿主を実用品種とするコナサナギタケはコナサナギタケ（実用品種）、宿主を小石丸とするコナサナギタケはコナサナギタケ（小石丸）、実用品種とするハナサナギタケはハナサナギタケ（実用品種）、宿主を小石丸とするハナサナギタケはハナサナギタケ（小石丸）と称する。
【０００８】
２．生理活性化画分の抽出法
コナサナギタケ（実用品種）は２００ｇ、ハナサナギタケ（実用品種）は１６８ｇ、コナサナギタケ（小石丸）・ハナサナギタケ（小石丸）はそれぞれ１００ｇを用いた。秤量瓶で試料中の水分含量が１０%前後であることを確認した後に逐次抽出を行った。抽出は試料に３倍量の溶媒を加え、２５℃で２４時間静置し、ろ過して得られた上清を抽出液とした。逐次抽出法に従い、極性の低い順からｎ−ヘキサン抽出、酢酸エチル抽出、７０％アセトン（３０％水）抽出、そして水抽出を行い、それぞれをｎ−ヘキサン画分、酢酸エチル画分、７０％アセトン画分、水画分として各種の生物検定に使用した。なお、抽出はそれぞれ２回ずつ行った。
n−ヘキサン抽出液及び酢酸エチル抽出液は、ロータリーエバポレーター（Ｎ−１０００，ＥＹＥＬＡ）を用いて濃縮し、さらに窒素風乾、遠心エバポレーター（C−１００，ＥＹＥＬＡ）により濃縮した後、凍結乾燥機（ＦＤＵ８１０，ＥＹＥＬＡ）を用いて凍結乾燥をして収量を求めた。７０％アセトン抽出液は、ロータリーエバポレーターによって濃縮した後、遠心エバポレーターにより濃縮し、凍結乾燥をして収量を求めた。水抽出液は凍結乾燥をして収量を求めた。以降、これらの凍結乾燥物を各抽出の粗抽出物とした。
【０００９】
３．生物検定法
１）がん細胞増殖抑制活性試験
がん細胞増殖抑制活性は、還元型発色色素であるＭＴＴ法により検討した。ＭＴＴ｛３−（４， ５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ｝は、細胞内脱水素酵素により還元され、ホルマザンを生成する。細胞数と生成するホルマザンの量は、直線的な比例関係にあり、ホルマザンの吸光度を測定することにより、生細胞数を測定することができる（Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。この方法に従い以下の手順で実験を行った。
【００１０】
1)細胞と培地組成
活性測定は、ラット肝がん細胞（ｄＲＬｈ８４）を用い、細胞数の増加変動を指標とした。培地は、１０％ウシ新生児血清（ＮＢＳ），４ｍＭグルタミン，５０Ｕ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン，１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，日本製薬社）を使用した。培養は、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で行った。
【００１１】
2)細胞浮遊液の調整
細胞は、組織培養用ディッシュ（φ１００ｘ２０mm，グライナー社）で培養し、対数増殖期に培養液を除去した後、ＰＢＳ（−）｛ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（−）｝（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。その後２．５％トリプシンを加え、ディッシュに付着している細胞を浮遊させた。このディッシュ中の細胞濃度を５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬとすべく１０ｍｌの培地を加え、細胞浮遊液とした。
【００１２】
3)がん細胞増殖抑制活性の測定
細胞浮遊液を２０倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（旭テクノグラスサイテック）の各ｗｅｌｌに２００μｌ（マイクロリットル）ずつ添加した。５％のＣＯ２存在下において、３７℃の湿潤条件下で２４時間培養した。その後、実験区には調整した各粗抽出物を１μｌ添加し、対照区には試料の代わりに溶媒を１μｌ添加した。試料添加後４８時間同条件で培養した後、０．５５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む培地１００μｌに入れ替え、４時間培養した。その後、ＭＴＴを含む培地を取り除き、Ｄｉｍｅｔｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を２００μｌずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｉｎｉ ＮＪ−２３００，インターメッド社）で５９０ｎｍ、６２０ｎｍの２波長で吸光度を測定した。なお、使用した試薬や器具は全て滅菌した物を用いた。また、実験操作はクリーンベンチ内で行い、他の微生物による汚染を防いだ。
【００１３】
２）免疫賦活活性試験
免疫賦活活性は、マウス脾臓由来のリンパ球細胞の活性および細胞数の変化を指標とした。活性および細胞数の測定は、還元型発色試薬であるＷＳＴ−１法を用い、細胞内のミトコンドリアがもつ還元作用によって生成されるホルマザン塩量を測定した。
ＷＳＴ−１法は、細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性ホルマザンを生成する。本実験では、この水溶性ホルマザンの吸光度を測定することにより、細胞の活性を測定した。
【００１４】
1)実験動物と培地組成
実験動物は、５−７週齢のＩＣＲ系マウス（雌，日本ＳＬＣ）を用いた。
リンパ球の培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），２ｍＭグルタミン，５０μＭ ２−メルカプトエタノール，１００Ｕ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬社）を使用した。培養は、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で培養した。
【００１５】
2)リンパ球浮遊液の調整
リンパ球浮遊液の調整は、藤原・淀井（１９９６）の方法を用いた。
ジエチルエーテルで麻酔したマウスを頚椎脱臼して脾臓を摘出した。ＰＢＳ（−）の入ったディッシュ内で脾臓を磨砕し、セルストレイナー（孔径１００μｍ，ＦＡＬＣＯＮ社）でろ過し、細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社）に採取した。遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）後、上清を取り除き、リンパ球を含む沈殿に赤血球除去のために、溶血バッファー｛０．１４Ｍ塩化アンモニウム，１．７ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５６）｝を５ｍｌ加えて、５分間インキュベートした。その後、遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。これを２回繰り返し、溶血による赤血球の除去を行った。さらに、上清を取り除き、洗浄のためＰＢＳ（−）を３０ｍｌ加えて、遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）を２回行った。その後、沈殿に培地を加えて、リンパ球以外の細胞を取り除くために、ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。
インキュベート後、細胞を０．４％トリパンブルー溶液で染色し、ビュルケルチュルク血球計算板を用いて細胞数を計測した。そして、細胞数が５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で調整した。
【００１６】
3)免疫賦活活性の測定
調製したリンパ球浮遊液２００μｌを、各検定区の最も濃度が高いｗｅｌｌにのみ添加した。対照区を含む他のｗｅｌｌには、溶媒の濃度が０．５％になるように調製したリンパ球浮遊液１００μｌを、各ｗｅｌｌに添加した。各粗抽出物は、検定濃度が最も高い部分にのみ添加し、それ以外の濃度のｗｅｌｌには、一段階高い濃度のｗｅｌｌから１００μｌを取り、次のｗｅｌｌに加え希釈した。各粗抽出物を添加後、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で４８時間培養した。その後、ＷＳＴ−１溶液｛２−（４−ｌｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ｝（和光純薬）と１−Ｍｅｔｈｙｌ ＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）（和光純薬），ＰＢＳ（−）からなるＷＳＴ−１溶液（６．５ｍｇ ＷＳＴ−１，０．７ｍｇ １−Ｍｅｔｈｙｌ ＰＭＳ，ＰＢＳ（−）１０ｍｌ）を１０μｌ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーで各ｗｅｌｌの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、使用した試薬や器具は全てオートクレーブ（１２０℃、２０分間）で滅菌した物を用いた。また、実験操作はクリーンベンチ内で行い、他の微生物による汚染を防いだ．
【００１７】
３）抗酸化活性試験
抗酸化活性の測定試験には、ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｈｙｄｒａｚｙｌ）分光測定法（Yamaguchi ｅｔ al．，２０００）を用い、ＤＰＰＨ溶液中の残存ラジカル量について黒紫色の退色を分光学的に分析することで、ラジカル消去能を測定した。
ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）は、自らが安定なフリーラジカルで黒紫色を呈しているため、ＤＰＰＨ溶液中の残存ラジカル量について黒紫色の退色を分光学的に分析することにより、ラジカル消去能を測定することができる。
また、陽性対照区として、高い抗酸化活性を持つことが確認されているアスコルビン酸を用いた（Ａｒａｂｓｈａｈｉ−Ｄｅｌｏｕｅｅ ａｎｄ Ｕｒｏｏｊ，２００６）．
９６ ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに各濃度に濃度調整した試料２０ｍｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）８０ｍｌと、エタノールに溶解した５００ｍＭ ＤＰＰＨ溶液１００ｍｌを分注し、室温で２０分間放置した後、多目的マイクロプレートリーダー Ｐｏｗｅｒ ｓｃａｎ ＨＴ（大日本住友製薬）によって波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定し、残存ＤＰＰＨラジカル量を定量した。なお、ラジカル消去活性は各吸光度を用いて、以下の式により算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝（１−（試料の吸光度−ブランク値））／（コントロールの吸光度−ブランク値）ｘ１００
【００１８】
４）抗炎症活性試験
抗炎症活性試験は、奥寺（２００５）により導入された方法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＣＯＸ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ）を用いた。
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）には、二つの異性体が存在する。ＣＯＸ−１は、各種細胞で常時発現しており、特に消化管、腎臓および血小板で発現し、組織の正常な代謝を維持している。一方、ＣＯＸ−２はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などを生産し、炎症反応を拡大する。そこで本研究においては、ＣＯＸ−２の選択的な阻害物質を探索するため、Ｃｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｏｘ（ｏｖｉｎｅ）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて実験を行った。この方法は、ＣＯＸの酸化能を指標にしており、発色基質Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＭＰＤ）を酸化させ、５９０ｎｍにおける吸光度を測定するものである。
【００１９】
1)抗炎症活性の測定
Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ）をＭＱで１０倍に希釈し、９６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに細胞培養用陰性対照区には１６０μｌ、陽性対照区・実験区には１５０μｌずつ分注した。Ｈｅｍｅ ８８μｌに、調製したＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ １．９１２ｍｌの割合で希釈し、１０μｌずつ各ｗｅｌｌに分注した。ＣＯＸはシクロオキシゲナーゼ活性部位とペルオキシゲナーゼ活性部位の２つの活性部位を有しており、後者を活性化させるにはＨｅｍｅが必要である。ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２は、それぞれ酵素２００μｌに対し、調製したＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ４００μｌの割合で希釈し、陽性対照区・実験区の各ｗｅｌｌに１０μｌずつ分注した。試料は、終濃度１００μｇ／ｍｌに調製したものを実験区の各ｗｅｌｌに１０μｌずつ加え、陰性・陽性対照区には溶媒を添加し、プレートを水平に静かに振とうして、２５℃で５分静置した。その間に、アラキドン酸１００μｌに水酸化カリウム１００μｌ加え転倒混和し、ＭＱを１．８ｍｌの割合で加えた。ＴＭＰＤ溶液２０μｌ、調製したアラキドン酸２０μｌの順に各ｗｅｌｌに添加した。２５℃で５分静置した後、マイクロプレートリーダーで各ｗｅｌｌの５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２０】
冬虫夏草からの各粗抽出物の収量
図1は、本発明の各冬虫夏草からの抽出物の収量を示す表である。
図１に示すように、実用品種を寄主としたコナサナギタケ２００ｇから、ｎ−ヘキサン抽出画分では５．８％（１１．６４５ｇ）、酢酸エチル画分では２．１％（４．１７５ｇ）、７０％アセトン画分では１３％（２５．９７７ｇ）、水画分では１８％（３５．９９２ｇ）の回収率となった。また、小石丸を寄主とした同じコナサナギタケ１００ｇからはｎ−ヘキサン抽出画分で３％、酢酸エチル画分で０．５％、７０％アセトンで１３．５％、水画分で２５．９％であった。また、実用品種を寄主としたハナサナギタケ１６８ｇから、ｎ−ヘキサン抽出画分では１３．９８％（２３．３８３７ｇ）、酢酸エチル画分では０．８１％（１．３６４５ｇ）、７０％アセトン画分では１２％（２０．２６５５ｇ）、水画分では３３．４％（５６．１２２ｇ）の回収率となった。さらに、小石丸を寄主としたハナサナギタケの場合、ｎ−ヘキサン抽出画分で６．３％、酢酸エチル画分で０．６％、７０％アセトンで９．４％、水画分で３３．５％であった。
本実験結果から、実用品種では酢酸エチル画分が小石丸に比較して４〜５倍の回収率であり、逆に水画分は小石丸の方が１．６倍の回収率であった。すなわち、各抽出画分の収量は冬虫夏草の種の違いよりも、寄主となるカイコの品種によって異なると考えられる。
【００２１】
がん細胞増殖抑制活性試験
図２は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図３は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図４は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図５は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフである。
図に示すように、いずれの組み合わせでも酢酸エチル画分が最も強いがん細胞増殖抑制活性を示した。
がん細胞増殖抑制活性は、コナサナギタケで比較すると、比較例１の酢酸エチル区分のＩＣ５０値が約８０μg/ｍｌに対し、実施例１は約４５μg/ｍｌであり、優位性を示している。また、ハナサナギタケで比較しても、比較例２は約５０μg/ｍｌに対し、実施例２は約３５μg/ｍｌであり、優位性を示している。
従って、小石丸を寄主とした場合には実用品種の場合と比較して優れた活性を示していることが分かる。なお、寄主が同じ場合には、コナサナギタケよりもハナサナギタケの方が活性が強いことが分かる。
【００２２】
免疫賦活活性試験
図６は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図７は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図８は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図９は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフである。
図に示すように、実施例１及び実施例２において免疫賦活活性が確認されたのに対し、比較例１及び比較例２では免疫賦活活性が確認されなかった。活性があった水抽出物を比較すると、抽出物の濃度が５００μg/ｍｌのとき、コナサナギタケは約１４０%、ハナサナギタケでは約２２０%であった。
この結果から、寄主が小石丸のハナサナギタケの水抽出物が最も優れた免疫賦活活性を有していると考えられる。
【００２３】
抗酸化活性試験
図１０は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１１は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１２は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ、図１３は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフである。
抗酸化活性は、７０%アセトン抽出画分と水抽出物画分において確認された。実施例１を比較例１と比べると、小石丸を寄主とする方が７０%アセトン抽出物と水抽出物の両方で活性が高いことが確認された。
【００２４】
抗炎症活性試験
図１４は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１５は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフである。
抗炎症活性は、酢酸エチル抽出画分で認められ、コナサナギタケよりもハナサナギタケが高い活性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、食品、添加物、皮膚外用剤、入浴剤として利用される冬虫夏草に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の各冬虫夏草からの抽出物の収量を示す表
【図２】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図３】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図４】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図５】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図６】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図７】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図８】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図９】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図１０】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１１】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１２】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１３】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１４】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１５】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法、及び冬虫夏草を有効成分とする免疫賦活剤、がん細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、又は抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草は、中国古来から伝わる秘薬として珍重されてきた。近年、秘薬としての冬虫夏草の効果並びに成分分析が行われている。また、生活様式の変化や健康志向の高まりから、健康食品としての利用も進んでいる。
冬虫夏草は、昆虫に寄生するキノコの総称として用いられることが多いが、子嚢菌類、バッカク菌目、バッカク菌科の一属に位置づけられている。
分類体系は未だ確立されていないと言われているが、菌種によって寄生する寄主が異なるとされ、冬虫夏草の同定には、形成される子実体の形態だけでなく、寄主となる昆虫の種類も参考にされている。
例えば、ツクツクボウシセミタケ（学名Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ，ｓｉｎｃｌａｉｒｉｉ，Ｋｏｂａｙａｓｉ）はツクツクボウシを寄主とし、コブガタアリタケ（学名Ｔｏｒｒｕｂｉｅｌｌａ ｓｐ． （ｋｏｂｕｇａｔａａｒｉｔａｋｅ））はムネアカオオアリを寄主とし、カメムシタケ（学名Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｎｕｔａｎｓ Ｐａｔ．）はカメムシを寄主とする。
その他、トンボ、ハチ、クモ類やダニ類を寄主とする冬虫夏草もある。
そして、例えばサナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）からは、コルジセピンを指標とした免疫賦活効果が知られ、ツクツクボウシに寄生するツクツクボウシタケからは、ＦＴＹ７２０という免疫抑制効果が知られているように、冬虫夏草は、その種類によって異なる活性が見つけられている。
非特許文献１では、ハナサナギタケ、ツクツクボウシセミタケ、サナギタケ、マルミノアリタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｆｏｒｍｉｃａｒｕｍ）、ウスキサナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）について、虫体成分を含まない培地で培養を行い、それぞれの有効成分について調べた結果を報告している。
また、特許文献１では、サナギタケの培養菌糸体の抽出液に強心作用や気管支拡張作用があることを開示し、特許文献２では、サナギタケに着目してコルジセピンの抽出方法を提案している。
また、特許文献３、４、５では、ハナサナギタケに着目して有効物質を見出している。
漢方薬として珍重されているコルジセプス・シネンシス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、人工的な培養によって子実体形成まで至っておらず、その代用品として、チョウ目カイコガ科を寄主とする冬虫夏草の人工培養方法が多く提案されている。
特許文献６では、冬虫夏草の菌糸又は子座胞子を、既成食品であるニンニク・醤油・砂糖を混合した培養液を殺菌し、常法により液体培養するか、又はこの液体培養液を米・麦・とうもろこし等の穀物又は蚕・セミ等の節足動物の昆虫類の成虫・蛹・幼虫等に吸着させて固体培養を行う方法が提案されている。
特許文献７では、冬虫夏草の菌糸体を、糖類、蛋白物質、ビタミン類、核酸類等の一種又は数種を主成分とし、これらの主成分に穀類を添加して立体固形培地に移植して培養し、この立体固形培地において培養した菌糸を糖類蛋白物質類、ビタミン類、核酸類等の一種又は数種を主成分とし、これにアミノ酸類の一種又は数種を添加し、水を基質としたｐH４．０〜７．０の液体培地に移植して静置培養し、液体培地表面に菌座を形成させる方法が提案されている。
特許文献８では、生きている昆虫に冬虫夏草の菌糸体を直接に感染、接種するか、あるいは３分の１量の昆虫組織体を加えた寒天を基質とする純粋分離培地に冬虫夏草の菌糸体を接種する方法である。なお、生きている昆虫を用いる場合としては、繭を形成する直前の蚕を用いている。
特許文献９では、野外に存在する冬虫夏草を採取し、寒天培地、液体培地で菌糸、分生胞子を増殖させ、最終的な大量増殖を野外栽培で行う方法が提案されている。
特許文献１０では、蚕の蛹そのものを培地として培養する方法を提案し、特許文献１１では、活きた蚕を培地とすることで更に天然に近い培養方法を提案している。
また、特許文献１２では、冬虫夏草を製造する培地に、食酢や食酢もろみを含有させることで効能の高い冬虫夏草を製造することを提案している。
【非特許文献１】矢萩信夫 「ノムジタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属菌の培養とその生理活性に関する研究」２００５年３月２９日〜３１日 第１２５回日本薬学会）
【特許文献１】特開平８−１２５８８号公報
【特許文献２】特開２００４−８９３８号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２２６７号公報
【特許文献４】特開２００３−１２８５１５号公報
【特許文献５】特開２００５−２３９５８５号公報
【特許文献６】特開昭５４−８０４８６号公報
【特許文献７】特公昭６１−５３０３３号公報
【特許文献８】特開昭６２年１０７７２５号公報
【特許文献９】特開平６−２３３６２７号公報
【特許文献１０】特許第２６７６５０２号
【特許文献１１】特許第３５９３４２９号
【特許文献１２】特開２００３−１１６３４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
非特許文献１、特許文献１から特許文献５にも示したように、現在では、冬虫夏草菌の種類に応じた薬理作用の違いが着目され、研究が進められている。
そして、同じチョウ目カイコガ科を寄主とする冬虫夏草であっても、サナギタケとハナサナギタケのように種類の異なる冬虫夏草について、薬理作用の相違が研究されている。
また、特許文献６から特許文献１２にも示したように、培地の相違による薬理効果の違いには着目されてきたが、それはあくまでも培地成分の相違、虫体と穀類との相違、虫体の成育段階の相違、又は虫体が活きているか死んだ状態かの相違によるもので、宿主となる蚕種に着目した考えは全く無く、研究もされていなかった。
本発明者らは、寄生種の冬虫夏草にも様々な特性があると同時に、寄主である蚕にも多様な品種と系統が存在することから、寄生種と寄主の組み合わせに着目して研究を行った。
特に、わが国の正倉院の絹織物にも使用されている蚕である「小石丸」（）は、わが国に限らず世界的視点においても差別化するには十分な歴史的根拠があり、しかも今日まで脈々と飼育が継続されている。さらに、「小石丸」のもうひとつの特性として、生産された生糸は細繊度であり好感触を有しており、幼虫は耐病性に優れていると考えられている。従って、「小石丸」の歴史的価値ならびに生物学的評価から、「小石丸」を冬虫夏草の寄生種として選択することに大きな意義があると考えた。
【０００４】
本発明は、同じ菌種の冬虫夏草でも、蚕種によって優れた活性を示す冬虫夏草を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１記載の本発明の冬虫夏草の培養方法は、蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、前記蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする。
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法において、前記冬虫夏草としてハナサナギタケを用いたことを特徴とする。
請求項３記載の本発明の免疫賦活剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項４記載の本発明のがん細胞増殖抑制剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項５記載の本発明の抗炎症剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
請求項６記載の本発明の抗酸化剤は、小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、同じ種類の冬虫夏草菌であっても、蚕種として小石丸を用いることで、優れた活性が認められた。
【実施例】
【０００７】
１．試料
本発明では、寄主である蚕品種を小石丸とし、比較例としてわが国において普及している実用品種の（錦秋ｘ鐘和）を使用した。寄生種として、コナサナギタケ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆａｒｉｎｏｓｕｓ）とハナサナギタケ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｕｉｐｅｓ）を使用した。
冬虫夏草（コナサナギタケ及びハナサナギタケ）は、蚕が繭を形成した後に蛹を取り出し、取り出した蛹に冬虫夏草の子実体に形成された子嚢胞子又は分生胞子を接種し、子実体が完全に成育するまで培養したものを用いた。子実体が完全に成育した冬虫夏草を、６０℃前後の温度で乾燥させ、その後ブレンダー（ＷＢ−１，φ１３４ｘ２７０ｍｍ，アズワン株式会社）により粉砕し、粉末状にしたものを実験に使用した。乾燥させた冬虫夏草は４℃で保存し、粉末化したものは直ちに抽出を行った。
以降の説明においては、宿主を実用品種とするコナサナギタケはコナサナギタケ（実用品種）、宿主を小石丸とするコナサナギタケはコナサナギタケ（小石丸）、実用品種とするハナサナギタケはハナサナギタケ（実用品種）、宿主を小石丸とするハナサナギタケはハナサナギタケ（小石丸）と称する。
【０００８】
２．生理活性化画分の抽出法
コナサナギタケ（実用品種）は２００ｇ、ハナサナギタケ（実用品種）は１６８ｇ、コナサナギタケ（小石丸）・ハナサナギタケ（小石丸）はそれぞれ１００ｇを用いた。秤量瓶で試料中の水分含量が１０%前後であることを確認した後に逐次抽出を行った。抽出は試料に３倍量の溶媒を加え、２５℃で２４時間静置し、ろ過して得られた上清を抽出液とした。逐次抽出法に従い、極性の低い順からｎ−ヘキサン抽出、酢酸エチル抽出、７０％アセトン（３０％水）抽出、そして水抽出を行い、それぞれをｎ−ヘキサン画分、酢酸エチル画分、７０％アセトン画分、水画分として各種の生物検定に使用した。なお、抽出はそれぞれ２回ずつ行った。
n−ヘキサン抽出液及び酢酸エチル抽出液は、ロータリーエバポレーター（Ｎ−１０００，ＥＹＥＬＡ）を用いて濃縮し、さらに窒素風乾、遠心エバポレーター（C−１００，ＥＹＥＬＡ）により濃縮した後、凍結乾燥機（ＦＤＵ８１０，ＥＹＥＬＡ）を用いて凍結乾燥をして収量を求めた。７０％アセトン抽出液は、ロータリーエバポレーターによって濃縮した後、遠心エバポレーターにより濃縮し、凍結乾燥をして収量を求めた。水抽出液は凍結乾燥をして収量を求めた。以降、これらの凍結乾燥物を各抽出の粗抽出物とした。
【０００９】
３．生物検定法
１）がん細胞増殖抑制活性試験
がん細胞増殖抑制活性は、還元型発色色素であるＭＴＴ法により検討した。ＭＴＴ｛３−（４， ５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ｝は、細胞内脱水素酵素により還元され、ホルマザンを生成する。細胞数と生成するホルマザンの量は、直線的な比例関係にあり、ホルマザンの吸光度を測定することにより、生細胞数を測定することができる（Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。この方法に従い以下の手順で実験を行った。
【００１０】
1)細胞と培地組成
活性測定は、ラット肝がん細胞（ｄＲＬｈ８４）を用い、細胞数の増加変動を指標とした。培地は、１０％ウシ新生児血清（ＮＢＳ），４ｍＭグルタミン，５０Ｕ／ｍｌペニシリン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン，１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，日本製薬社）を使用した。培養は、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で行った。
【００１１】
2)細胞浮遊液の調整
細胞は、組織培養用ディッシュ（φ１００ｘ２０mm，グライナー社）で培養し、対数増殖期に培養液を除去した後、ＰＢＳ（−）｛ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（−）｝（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。その後２．５％トリプシンを加え、ディッシュに付着している細胞を浮遊させた。このディッシュ中の細胞濃度を５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬとすべく１０ｍｌの培地を加え、細胞浮遊液とした。
【００１２】
3)がん細胞増殖抑制活性の測定
細胞浮遊液を２０倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（旭テクノグラスサイテック）の各ｗｅｌｌに２００μｌ（マイクロリットル）ずつ添加した。５％のＣＯ２存在下において、３７℃の湿潤条件下で２４時間培養した。その後、実験区には調整した各粗抽出物を１μｌ添加し、対照区には試料の代わりに溶媒を１μｌ添加した。試料添加後４８時間同条件で培養した後、０．５５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む培地１００μｌに入れ替え、４時間培養した。その後、ＭＴＴを含む培地を取り除き、Ｄｉｍｅｔｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を２００μｌずつ加え、マイクロプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｉｎｉ ＮＪ−２３００，インターメッド社）で５９０ｎｍ、６２０ｎｍの２波長で吸光度を測定した。なお、使用した試薬や器具は全て滅菌した物を用いた。また、実験操作はクリーンベンチ内で行い、他の微生物による汚染を防いだ。
【００１３】
２）免疫賦活活性試験
免疫賦活活性は、マウス脾臓由来のリンパ球細胞の活性および細胞数の変化を指標とした。活性および細胞数の測定は、還元型発色試薬であるＷＳＴ−１法を用い、細胞内のミトコンドリアがもつ還元作用によって生成されるホルマザン塩量を測定した。
ＷＳＴ−１法は、細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性ホルマザンを生成する。本実験では、この水溶性ホルマザンの吸光度を測定することにより、細胞の活性を測定した。
【００１４】
1)実験動物と培地組成
実験動物は、５−７週齢のＩＣＲ系マウス（雌，日本ＳＬＣ）を用いた。
リンパ球の培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），２ｍＭグルタミン，５０μＭ ２−メルカプトエタノール，１００Ｕ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬社）を使用した。培養は、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で培養した。
【００１５】
2)リンパ球浮遊液の調整
リンパ球浮遊液の調整は、藤原・淀井（１９９６）の方法を用いた。
ジエチルエーテルで麻酔したマウスを頚椎脱臼して脾臓を摘出した。ＰＢＳ（−）の入ったディッシュ内で脾臓を磨砕し、セルストレイナー（孔径１００μｍ，ＦＡＬＣＯＮ社）でろ過し、細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社）に採取した。遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）後、上清を取り除き、リンパ球を含む沈殿に赤血球除去のために、溶血バッファー｛０．１４Ｍ塩化アンモニウム，１．７ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５６）｝を５ｍｌ加えて、５分間インキュベートした。その後、遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。これを２回繰り返し、溶血による赤血球の除去を行った。さらに、上清を取り除き、洗浄のためＰＢＳ（−）を３０ｍｌ加えて、遠心分離（１，１００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）を２回行った。その後、沈殿に培地を加えて、リンパ球以外の細胞を取り除くために、ＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートした。
インキュベート後、細胞を０．４％トリパンブルー溶液で染色し、ビュルケルチュルク血球計算板を用いて細胞数を計測した。そして、細胞数が５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で調整した。
【００１６】
3)免疫賦活活性の測定
調製したリンパ球浮遊液２００μｌを、各検定区の最も濃度が高いｗｅｌｌにのみ添加した。対照区を含む他のｗｅｌｌには、溶媒の濃度が０．５％になるように調製したリンパ球浮遊液１００μｌを、各ｗｅｌｌに添加した。各粗抽出物は、検定濃度が最も高い部分にのみ添加し、それ以外の濃度のｗｅｌｌには、一段階高い濃度のｗｅｌｌから１００μｌを取り、次のｗｅｌｌに加え希釈した。各粗抽出物を添加後、５％ＣＯ２存在下、３７℃湿潤条件で４８時間培養した。その後、ＷＳＴ−１溶液｛２−（４−ｌｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ｝（和光純薬）と１−Ｍｅｔｈｙｌ ＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）（和光純薬），ＰＢＳ（−）からなるＷＳＴ−１溶液（６．５ｍｇ ＷＳＴ−１，０．７ｍｇ １−Ｍｅｔｈｙｌ ＰＭＳ，ＰＢＳ（−）１０ｍｌ）を１０μｌ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーで各ｗｅｌｌの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、使用した試薬や器具は全てオートクレーブ（１２０℃、２０分間）で滅菌した物を用いた。また、実験操作はクリーンベンチ内で行い、他の微生物による汚染を防いだ．
【００１７】
３）抗酸化活性試験
抗酸化活性の測定試験には、ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｈｙｄｒａｚｙｌ）分光測定法（Yamaguchi ｅｔ al．，２０００）を用い、ＤＰＰＨ溶液中の残存ラジカル量について黒紫色の退色を分光学的に分析することで、ラジカル消去能を測定した。
ＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）は、自らが安定なフリーラジカルで黒紫色を呈しているため、ＤＰＰＨ溶液中の残存ラジカル量について黒紫色の退色を分光学的に分析することにより、ラジカル消去能を測定することができる。
また、陽性対照区として、高い抗酸化活性を持つことが確認されているアスコルビン酸を用いた（Ａｒａｂｓｈａｈｉ−Ｄｅｌｏｕｅｅ ａｎｄ Ｕｒｏｏｊ，２００６）．
９６ ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに各濃度に濃度調整した試料２０ｍｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）８０ｍｌと、エタノールに溶解した５００ｍＭ ＤＰＰＨ溶液１００ｍｌを分注し、室温で２０分間放置した後、多目的マイクロプレートリーダー Ｐｏｗｅｒ ｓｃａｎ ＨＴ（大日本住友製薬）によって波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定し、残存ＤＰＰＨラジカル量を定量した。なお、ラジカル消去活性は各吸光度を用いて、以下の式により算出した。
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝（１−（試料の吸光度−ブランク値））／（コントロールの吸光度−ブランク値）ｘ１００
【００１８】
４）抗炎症活性試験
抗炎症活性試験は、奥寺（２００５）により導入された方法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＣＯＸ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ）を用いた。
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）には、二つの異性体が存在する。ＣＯＸ−１は、各種細胞で常時発現しており、特に消化管、腎臓および血小板で発現し、組織の正常な代謝を維持している。一方、ＣＯＸ−２はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などを生産し、炎症反応を拡大する。そこで本研究においては、ＣＯＸ−２の選択的な阻害物質を探索するため、Ｃｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｏｘ（ｏｖｉｎｅ）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて実験を行った。この方法は、ＣＯＸの酸化能を指標にしており、発色基質Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＭＰＤ）を酸化させ、５９０ｎｍにおける吸光度を測定するものである。
【００１９】
1)抗炎症活性の測定
Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｘ）をＭＱで１０倍に希釈し、９６穴マイクロプレートの各ｗｅｌｌに細胞培養用陰性対照区には１６０μｌ、陽性対照区・実験区には１５０μｌずつ分注した。Ｈｅｍｅ ８８μｌに、調製したＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ １．９１２ｍｌの割合で希釈し、１０μｌずつ各ｗｅｌｌに分注した。ＣＯＸはシクロオキシゲナーゼ活性部位とペルオキシゲナーゼ活性部位の２つの活性部位を有しており、後者を活性化させるにはＨｅｍｅが必要である。ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２は、それぞれ酵素２００μｌに対し、調製したＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ４００μｌの割合で希釈し、陽性対照区・実験区の各ｗｅｌｌに１０μｌずつ分注した。試料は、終濃度１００μｇ／ｍｌに調製したものを実験区の各ｗｅｌｌに１０μｌずつ加え、陰性・陽性対照区には溶媒を添加し、プレートを水平に静かに振とうして、２５℃で５分静置した。その間に、アラキドン酸１００μｌに水酸化カリウム１００μｌ加え転倒混和し、ＭＱを１．８ｍｌの割合で加えた。ＴＭＰＤ溶液２０μｌ、調製したアラキドン酸２０μｌの順に各ｗｅｌｌに添加した。２５℃で５分静置した後、マイクロプレートリーダーで各ｗｅｌｌの５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２０】
冬虫夏草からの各粗抽出物の収量
図1は、本発明の各冬虫夏草からの抽出物の収量を示す表である。
図１に示すように、実用品種を寄主としたコナサナギタケ２００ｇから、ｎ−ヘキサン抽出画分では５．８％（１１．６４５ｇ）、酢酸エチル画分では２．１％（４．１７５ｇ）、７０％アセトン画分では１３％（２５．９７７ｇ）、水画分では１８％（３５．９９２ｇ）の回収率となった。また、小石丸を寄主とした同じコナサナギタケ１００ｇからはｎ−ヘキサン抽出画分で３％、酢酸エチル画分で０．５％、７０％アセトンで１３．５％、水画分で２５．９％であった。また、実用品種を寄主としたハナサナギタケ１６８ｇから、ｎ−ヘキサン抽出画分では１３．９８％（２３．３８３７ｇ）、酢酸エチル画分では０．８１％（１．３６４５ｇ）、７０％アセトン画分では１２％（２０．２６５５ｇ）、水画分では３３．４％（５６．１２２ｇ）の回収率となった。さらに、小石丸を寄主としたハナサナギタケの場合、ｎ−ヘキサン抽出画分で６．３％、酢酸エチル画分で０．６％、７０％アセトンで９．４％、水画分で３３．５％であった。
本実験結果から、実用品種では酢酸エチル画分が小石丸に比較して４〜５倍の回収率であり、逆に水画分は小石丸の方が１．６倍の回収率であった。すなわち、各抽出画分の収量は冬虫夏草の種の違いよりも、寄主となるカイコの品種によって異なると考えられる。
【００２１】
がん細胞増殖抑制活性試験
図２は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図３は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図４は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ、図５は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフである。
図に示すように、いずれの組み合わせでも酢酸エチル画分が最も強いがん細胞増殖抑制活性を示した。
がん細胞増殖抑制活性は、コナサナギタケで比較すると、比較例１の酢酸エチル区分のＩＣ５０値が約８０μg/ｍｌに対し、実施例１は約４５μg/ｍｌであり、優位性を示している。また、ハナサナギタケで比較しても、比較例２は約５０μg/ｍｌに対し、実施例２は約３５μg/ｍｌであり、優位性を示している。
従って、小石丸を寄主とした場合には実用品種の場合と比較して優れた活性を示していることが分かる。なお、寄主が同じ場合には、コナサナギタケよりもハナサナギタケの方が活性が強いことが分かる。
【００２２】
免疫賦活活性試験
図６は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図７は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図８は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ、図９は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフである。
図に示すように、実施例１及び実施例２において免疫賦活活性が確認されたのに対し、比較例１及び比較例２では免疫賦活活性が確認されなかった。活性があった水抽出物を比較すると、抽出物の濃度が５００μg/ｍｌのとき、コナサナギタケは約１４０%、ハナサナギタケでは約２２０%であった。
この結果から、寄主が小石丸のハナサナギタケの水抽出物が最も優れた免疫賦活活性を有していると考えられる。
【００２３】
抗酸化活性試験
図１０は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１１は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１２は比較例１（コナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ、図１３は比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフである。
抗酸化活性は、７０%アセトン抽出画分と水抽出物画分において確認された。実施例１を比較例１と比べると、小石丸を寄主とする方が７０%アセトン抽出物と水抽出物の両方で活性が高いことが確認された。
【００２４】
抗炎症活性試験
図１４は本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ、図１５は本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフである。
抗炎症活性は、酢酸エチル抽出画分で認められ、コナサナギタケよりもハナサナギタケが高い活性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、食品、添加物、皮膚外用剤、入浴剤として利用される冬虫夏草に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の各冬虫夏草からの抽出物の収量を示す表
【図２】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図３】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図４】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図５】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるガン細胞に対する増殖抑制活性を示すグラフ
【図６】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図７】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図８】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図９】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））によるリンパ細胞に対する免疫賦活活性を示すグラフ
【図１０】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１１】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１２】比較例１（コナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１３】比較例２（ハナサナギタケ（実用品種））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１４】本発明の実施例１（コナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【図１５】本発明の実施例２（ハナサナギタケ（小石丸））による抗酸化活性を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、前記蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
【請求項２】
前記冬虫夏草としてハナサナギタケを用いたことを特徴とする請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項３】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項４】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
【請求項６】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項１】
蚕を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、前記蚕種として小石丸を用いたことを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
【請求項２】
前記冬虫夏草としてハナサナギタケを用いたことを特徴とする請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項３】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項４】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
【請求項６】
小石丸を寄主とした冬虫夏草又は前記冬虫夏草の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする抗酸化剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−８４２４８（Ｐ２００９−８４２４８Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５９０５３（Ｐ２００７−２５９０５３）
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年４月３日 社団法人 日本蚕糸学会らの主催の「平成１９年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会 日本蚕糸学会第７７回大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１６５５９１）国立大学法人岩手大学 (222)
【出願人】（５０６０１５２３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２日（２００７．１０．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年４月３日 社団法人 日本蚕糸学会らの主催の「平成１９年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会 日本蚕糸学会第７７回大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１６５５９１）国立大学法人岩手大学 (222)
【出願人】（５０６０１５２３６）
【Ｆターム（参考）】
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