分子量マーカー
【目的】室温で安定なタンパク質分子量マーカーを提供する。
【解決手段】 （イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）システイン残基を含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー。
【解決手段】 （イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）システイン残基を含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する。）ならびに質量分析等によるタンパク質の分子量分析時に広範囲の分子量にわたって便宜に使用することのできる分子量マーカー、及びその製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般にタンパク質の分子サイズや分子量の違いを利用して複数のタンパク質を分離し、検出するＳＤＳ−ＰＡＧＥや質量分析において、試料中の解析対象タンパク質の分子量を推測するためには、分子サイズや分子量が既知である複数のタンパク質の混合物が分子量マーカーとして利用される。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用マーカー製品としては、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）やＭａｒｋ １２未着色スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が知られている。これら既存の分子量マーカーには、ミオシン重鎖タンパク、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミン、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、オブアルブミン、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビター、リゾチーム、アプロチニン又はインスリン等のタンパク質が組み合わされて使用されている。
【０００３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの使用を前提とするこれらの分子量マーカー製品は、使用時の利便性を考慮してＳＤＳを含む緩衝液に分子量の異なる複数のタンパク質を溶解した溶液として調製され、使用されている。ところが一般に多くのタンパク質はこのような溶液中において不安定であるため、分子量マーカー製品は室温で数日程度放置するだけでＳＤＳ−ＰＡＧＥ時のバンドが広がったり、消失したり又は位置が変化したりして、分子量マーカーとして使用できなくなる。この様なタンパク質の変化は一般に酸化反応等による場合が多いため、品質の劣化を防ぐ目的で、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する。）やβ−メルカプトエタノール（以下、β−ＭＥと略記する。）等の還元剤がしばしば分子量マーカー製品に添加されるが、いまだ満足すべきものではない。この様な還元剤の添加によって分子量マーカー製品の保存性は多少向上するものの、これら還元剤自体も酸化を受けて分解しやすいため、長期間安定に保存するためには、４℃以下で保存しなくてはならず、中には、４℃以下の保存ではかならずしも満足すべきものではなく、−２０℃での保存が必要な場合がある。そのため使用時に室温に戻したり、解凍するといった手間がかかるうえに、製品の輸送コストが高くなる等の問題点があった。また分子量マーカーの原料として使用するタンパク質試薬の純度が低いと、目的外タンパク質の混入や、混在するタンパク質分解酵素の影響による目的タンパク質の分解等が原因となり、本来検出されるべき分子量以外のバンドが検出されたり、バックグラウンドが濃くなって目的のバンドを確認しづらくなったりする。この様な理由から、高品質な分子量マーカー製品を製造するためには、高度に精製された原料タンパク質を使用する必要があり、材料の調達、調製にコストがかかるという問題があった。
【０００４】
近年、遺伝子工学を利用して製造されたタンパク質を用いた分子量マーカー、例えばプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインＡとＢを一単位とし、このドメインＡとＢを１〜複数個連結してなるタンパク質を含む分子量マーカー(特許文献１参照。)や例えば発色団、発蛍光団、又はＵＶ吸収基で標識されたタンパク質を含む分子量マーカー(特許文献２参照。)等も知られている。しかし、これら遺伝子工学を利用して製造されたタンパク質を利用した分子量マーカーも上記したと同様に、発現させたタンパク質を分子量マーカーの材料として使用に耐える純度にまで精製する過程が煩雑でコストがかかるという問題があった。
【特許文献１】特開平５−３２６９９号公報
【特許文献２】特表２００４−５０６２２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、室温で長期間安定な保存に耐える分子量マーカーを安価に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、既存の分子量マーカー製品を室温で保存した際の各タンパク質のバンドの移動度や形状の変化を観察し、各タンパク質のバンドが変化する程度とタンパク質の持つ特性との関係を詳しく検討した結果、システイン残基（以下、Ｃｙｓと略記する。）を含まないタンパク質は、室温下の長期保存後において他のＣｙｓを含むタンパク質に比べて経時的にバンドの位置や形状が実質的に変化しにくいことを見出した。Ｃｙｓを含まない天然の公知のタンパク質としては、例えばウシカルボニックアンヒドラーゼ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ；２９．０ｋＤａ）、ウシパルブアルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ；１２．３ｋＤａ）、ウシ胸腺ヒストンＨ２Ａ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｈｙｍｕｓ Ｈｉｓｔｏｎ ２Ａ；１１．２ｋＤａ）、ヒト血清高密度リポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｐｏ Ａ−Ｉ；２８．１ｋＤａ）、大豆レグヘモグロビン（Ｓｏｙｂｅａｎ Ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；１５．２ｋＤａ）、ヒラタケセリンプロテアーゼインヒビター（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＡ−１；８．３ｋＤａ）、大腸菌ヒスチジン含有リン酸輸送タンパク質（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；９．１ｋＤａ；以下ＨＰｒと略記する。）等が知られている。本発明者らは、さらなる利便性を求めて研究を重ねたところ、上記Ｃｙｓを含まないタンパク質、例えばＨＰｒが、室温保存に対して特別に安定であることを知見した。しかし、ＨＰｒの分子量は４０，０００（４０ｋＤａ）以下であり、Ｃｙｓを含まない高分子量（１００ｋＤａ以上）の天然タンパク質を見出すのは困難である。分子量マーカーは、未知タンパク質の分子量の測定に使用され、その分子量については約５ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲をカバーするのが望まれる、例えば分子量マーカーは、約５ｋＤａから５００ｋＤａまで、例えば約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ等のように適当なきざみになっているのが好ましい。本発明者らは、例えばＨＰｒのアミノ酸配列又はその部分配列を一単位として繰返したタンパク質とヒスチジンヘキソマーとの融合タンパク質を設計し、分子量が約５，０００（５ｋＤａ）程度から約５００，０００（５００ｋＤａ）程度の間で分子量の異なる複数のタンパク質の製造に成功した。製造されたタンパク質は、ヒスチジンタグを有しているので、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー用担体を用いて容易に高純度まで精製できる。またＣｙｓを含まないので、水溶液中で室温においても長期間安定であることを確認した。さらに本発明者らは、このようなタンパク質２種以上を選択し、かつ当該２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なるとき、これら２種以上のタンパク質を組み合わせることにより、上記従来技術の問題点が一挙に解決されることを知見した。
【０００７】
すなわち本発明は、
［１］ （イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）Ｃｙｓを含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー、
［２］ タンパク質がヒスチジンヘキソマー融合タンパク質であることを特徴とする前記［１］に記載の分子量マーカー。
［３］ タンパク質が配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の分子量マーカー、
〔４〕 タンパク質が配列番号２で示されるアミノ酸配列の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の分子量マーカー、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の分子量マーカーは安定なタンパク質を使用しているので、室温で長期間、安定に保存できる。
また本発明の分子量マーカーはヒスチジンタグ融合タンパク質であるので、低コストで容易に高純度まで精製できる。
さらに本発明の分子量マーカーは室温で保存できるため、製品の輸送コストが低く、保存条件による劣化が少なく、かつ凍結の必要がないため解凍を待たずに使用でき、また使用後に再凍結するといった保存の手間がかからないので、利便性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の分子量マーカーに用いるタンパク質はＣｙｓを含まないヒスチジンタグ融合タンパク質を含有する事を特徴とするものであるので、遺伝子組換え技術によって製造されたもの（以下組換えタンパク質という。）が好ましい。
【００１０】
本発明の分子量マーカーに用いられる組換えタンパク質は、Ｃｙｓを含まないタンパク質であることに加え、公知の分子量マーカーに用いられるタンパク質の特性、例えば酸性、塩基性又は疎水性の各アミノ酸の含有率が極端に偏った組成を持たない等の特性を有することが好ましい。
【００１１】
本発明の分子量マーカーの製造のために有用な遺伝子は、例えば上記公知の分子量マーカーに用いられるタンパク質の特性を有する天然タンパク質、例えばＨＰｒ、リボヌクレアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、アシルＣｏＡ結合タンパク質（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、セリンプロテアーゼインヒビター（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＡ−１；以下、ＳＰＩと略記する。）、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター（Ｐｕｍｐｋｉｎ Ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、システインプロテアーゼインヒビター（Ｓｈｏｒｔ ｒａｇｗｅｅｄ Ｃｙｓｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、 Ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ−Ｉ ｃｙｓｔａｔｉｎ）、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ−ＩＩＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ユビキチン（Ｈｕｍａｎ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）又はカルシウム結合タンパク質（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｌｇｒａｍｕｌｉｎ Ｃ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）等を発現する遺伝子が挙げられる。なお、タンパク質がＣｙｓを含む場合においては、前記遺伝子は、Ｃｙｓを含まないタンパク質を発現するように、遺伝子の構造を改変するのがよい。より具体的には、例えば上記天然タンパク質、好ましくはＨＰｒ又はＳＰＩのアミノ酸配列の全部若しくは一部、又はこれらアミノ酸配列と相同性を有するＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（以下、単にＤＮＡという。）を用いるのが好ましい。前記相同性とは、天然タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約４０％以上の相同性を有し、天然タンパク質と同様に微生物において製造される得る程度を意味する。
【００１２】
本発明の分子量マーカーの製造に用いられるタンパク質の製造に用いられるＤＮＡは、分子量約５〜１０ｋＤａのＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするＤＮＡを一単位として、約２〜１００単位、好ましくは約２〜５０単位が繰返し繋げられたＤＮＡのＣ末端又はＮ末端側に、例えばヒスチジンヘキソマーの様なヒスチジンタグをコードするＤＮＡが付加された形で、それぞれ目的の分子量を有するヒスチジンタグ融合タンパク質を発現するように調製される。上記一単位のポリペプチドを形成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡを２単位繋げることにより約２０ｋＤａのタンパク質を製造でき、同様に３単位で約３０ｋＤａのタンパク質、４単位で約４０ｋＤａのタンパク質、５単位で約５０ｋＤａ、１０単位で約１００ｋＤａのタンパク質、２０単位で約２００ｋＤａのタンパク質、３０単位で約３００ｋＤａのタンパク質等を製造できる。ヒスチジンタグは各分子量のタンパク質のＮ末端側又はＣ末端側に少なくとも１個あればよく、一単位となるＤＮＡを繰返し繋げたＤＮＡのＮ末端側及び／又はＣ末端側にヒスチジンタグをコードするＤＮＡを付加することで、分子量の異なる種々のヒスチジンタグ融合タンパク質を製造できる。
また最小タンパク質となるヒスチジンタグ融合タンパク質（例えば約５ｋＤａ又は約１０ｋＤａのヒスチジンタグ融合タンパク質等）をコードするＤＮＡを２種類以上、好ましくは２〜３種類準備し、これに上記一単位となる分子量約５〜１０ｋＤａのＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするＤＮＡを任意の回数だけ繰返し繋げたＤＮＡを組み合わせて繋いでもよい。例えば。Ｃ末端にヒスチジンへキソマーを有する５ｋＤａ及び１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれ準備し、そのＮ末端側に、１０ｋＤａのポリペプチドを形成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを１〜数十個繰返し繋いで目的とするタンパク質を発現させることにより、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ等の分子量を有する種々のヒスチジンへキソマー融合タンパク質を製造できる。
繰返しの単位となるＤＮＡを繋ぐことなく、Ｃ末端にヒスチジンへキソマーを有する約５ｋＤａ及び約１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、それぞれタンパク質を発現させることで、約５ｋＤａ及び約１０ｋＤａのヒスチジンヘキソマー融合タンパク質を製造できることは言うまでもない。
【００１３】
上記一単位となるＤＮＡは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列等をコードする塩基配列が好ましく挙げられる。また、上記一単位となるＤＮＡは、製造されるタンパク質の分子量が正確に、例えば約５ｋＤａ又は約１０ｋＤａとなるよう、前記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個（約２〜１５個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加等されるよう、塩基配列を改変することが好ましい。この場合、製造されるタンパク質にＣｙｓが含まれない様に改変されるのがよい。このようなＤＮＡとしては、例えば配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列等が挙げられる。
【００１４】
ヒスチジンタグをコードするＤＮＡは、ヒスチジンに対応するコドンを少なくとも２個（好ましくは約６〜８個、とりわけ好ましくは約６個）連ねたオリゴヌクレオチドが好ましい。ヒスチジンタグをコードするＤＮＡとしては、例えば特開昭６３−２５１０９５号公報又は特開平３−１０１６９３号公報に記載の金属親和性ペプチドをコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現される本発明のタンパク質は、例えば特開昭６３−４４９４７号公報に記載の金属アフィニティークロマトグラフィー等によって容易に高純度まで精製できる。
【００１５】
また、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質においては、ヒスチジンタグと共に、又はヒスチジンタグの代わりにストレプトタグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）−Ｇタグ等のタグをコードするＤＮＡ配列等を付加することもできる。これら親和性タグ配列を付加することにより、発現したタンパク質を分離、採取する際に、例えば該親和性タグに対するアフィニティーカラムを用いることができる等により、タンパク質の精製を容易にし得る。
【００１６】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質の製造方法において、まず上記一単位となるＤＮＡを繋げ、目的とする分子量のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を調製するのがよい。調製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入する。ＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞中で発現ベクターに導入されたＤＮＡを発現させることによって、目的とする分子量のタンパク質を製造することができる。
【００１７】
上記一単位となるＤＮＡは、Ｃ末端及びＮ末端に制限酵素（例えばＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ等）認識部位を有するよう、塩基配列が付加されることが好ましい。制限酵素認識部位を付加されたＤＮＡ（以下、カセットという。）としては、例えば配列番号６、９又は１２で示される塩基配列が挙げられる。配列番号６、９又は１２で示されるカセットは、例えば、配列番号３〜５で示されるアミノ酸配列等をもとにオリゴヌクレオチドが設計され、設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことによって得ることができる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、デナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約２５〜３５サイクル程度が好ましい。プライマーとしては、例えば配列番号６における第１位〜第２６位の塩基配列（配列番号７）及び第２４４位〜第２９５位の相補配列（配列番号８）、配列番号９における第１位〜第２４位の塩基配列（配列番号１０）及び第１１１位〜第１６０位の相補配列（配列番号１１）、配列番号１２における第１位〜第５０位の塩基配列（配列番号１３）及び第２４７位〜第２９５位の相補配列（配列番号１４）等が挙げられる。
【００１８】
次に得られたカセットを分子量の異なるタンパク質が製造されるよう連結し、連結したカセットを発現ベクターに組み込んで発現プラスミドを作成する。カセットの連結は、少なくとも２種の制限酵素を組み合わせて行うことができる。制限酵素の組合せとしては、例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ、ＳｐｅＩとＮｈｅＩ又はＰｓｔＩとＮｓｉＩの組み合わせのごとく、粘着末端を生じる制限酵素の組み合わせや、平滑末端を生じる制限酵素の組み合わせが挙げられる。このため、カセットの制限酵素認識部位は、これら制限酵素の組み合わせに対応する制限酵素の認識配列であることが好ましい。この様なカセットを利用して、選択した上記組み合わせの制限酵素（例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ）のどちらか一方（例えばＸｈｏＩ）で切断した発現プラスミドに、前記選択した制限酵素（例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ）で切断したカセット断片を挿入することができる。この反応を繰り返すことにより、基本ポリペプチドのＤＮＡを含むＤＮＡを同一方向に目的とする分子量のタンパク質をコードするＤＮＡとなるように何度でも連結することができる。
【００１９】
また、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは、所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡは翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２０】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡが挿入される発現ベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限りプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターも用いることができる。このような発現ベクターとしては、より詳しくは例えば、細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６、ｐＵＣ系プラスミドベクター等）、ファージＤＮＡ（ラムダファージ等）、酵母プラスミド（ｐＧ−１等）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。発現ベクターは複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２１】
複製開始点としては、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母用ベクターに対して、例えば２μｍ ＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものが挙げられる。
【００２２】
プロモーターは本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡの合成を指令するための調節配列であり、例えば、アデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ（例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター等）又はｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を挙げることができる。
【００２３】
選択マーカーは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型を宿主に付与するための遺伝子であり、例えば、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げられる。
【００２４】
発現ベクターは商業的に入手可能なものも好ましく使用することができる。そのような発現ベクターとしては、具体的には例えば、細菌性のものではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＥＴ−１１ａ（ＮＯＶＡＧＥＮ社製）；及び真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ ＳＶ４０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等が挙げられる。中でもｐＤＲ５４０又はｐＥＴ−１１ａがより好ましい。
【００２５】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換し、宿主細胞を適当な培地中で培養し、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを発現させ、本発明の分子量マーカー用タンパク質を製造させることができる。
【００２６】
形質転換は、自体公知の方法であればいずれも好ましく用いることができる。例えば、コンピテント細胞法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第５３巻，ｐ．１５４（１９７０）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１５巻，ｐ．１６６，（１９８２）］、インビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第７２巻，ｐ．５８１（１９７５）］、ウイルスベクター法［Ｃｅｌｌ，第３７巻，ｐ．１０５３（１９８４）］、マイクロインジェクション法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，第１５３巻，ｐ．３４７（１９８４）］、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３巻，ｐ．１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２２１巻，ｐ．５５１（１９８３）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第８４巻，ｐ．７４１３（１９８７）］又はプロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，第１７巻，ｐ．１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１６８巻，ｐ．１１１（１９７９）］に記載の方法等を挙げることができる。
【００２７】
宿主細胞の例としては、細菌細胞、例えば大腸菌（ＪＭ１０９等）、ストレプトミセス、枯草菌等；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株等；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母等；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２，スポドプテラＳｆ９等；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３，Ｃ１２７等が挙げられる。
【００２８】
発現ベクターと宿主細胞は適切な組み合わせを選んで使用するのが望ましい。発現ベクターと宿主細胞の適切な組み合わせとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｌａｃ ＵＶ５プロモーター制御系ベクターに目的タンパク質をコードするＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ、又はＴ７プロモーター制御系ベクターに目的タンパク質をコードするＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。
【００２９】
培養に使用される培地は、宿主細胞に応じて、適切な培地が選択される。例えば宿主細胞が大腸菌等の細菌の場合、培地は液体培地が適当であり、例えばＬＢ培地、Ｌブロス、２×ＴＹ培地等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。また、タンパク質の発現誘導剤として、例えばイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記する。）等を添加してもよい。培養は通常約１５〜４０℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。宿主が酵母である場合、培地としては、例えばバークホルダー最小培地等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えるのがよい。宿主が動物細胞である場合、培地としては、たとえば約５〜２０質量％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＥＭＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えるのがよい。
【００３０】
発現したタンパク質の分離、採取は、公知の方法により行うことができる。例えばタンパク質を産生している形質転換体は、その培養液上清中に該タンパク質を分泌することから、この形質転換体の培養上清から該タンパク質の抽出を行うことができる。また、形質転換体中に産生された該タンパク質の抽出を行うこともできる。タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、遠心分離やろ過等の公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム又は／及び凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００等の界面活性剤が含まれていてもよい。分子量マーカーとして用いるタンパク質に不純物が混入していると、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの特定や質量分析におけるピークの特定が困難になるので、可能な限り精製することが望ましい。一般にタンパク質の精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィー等が利用できるが、ヒスチジンタグは金属キレートカラムに結合するので、ヒスチジンタグの融合タンパク質として発現させた本発明のタンパク質は、金属キレートカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって精製するのが望ましい。
【００３１】
精製されたタンパク質に色素化合物を共有結合させることもできる。色素化合物を定法に従い共有結合させることにより、本発明の分子量マーカーのタンパク質を染色等の手段を用いなくても目視できる。
【００３２】
本発明の分子量マーカーは、分子量が異なる数個乃至十数個のタンパク質を溶媒（例えば精製水、緩衝液等）に溶解して製造される。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分子量マーカーとして製造する際には、分子量の異なる数個乃至十数個のタンパク質をそれぞれ約２０〜１００μｇ／ｍＬ程度となる様に混合するのがよい。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分子量マーカーの場合、直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用できるようにするため、ＳＤＳ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（以下ＥＤＴＡ−Ｎａと略記する）、ブロムフェノールブルー及びグリセロールを含むＴｒｉｓ緩衝液に、分子量の異なる数個乃至十数個のタンパク質を溶解した混合溶液として調製するのがよい。分子量の異なるタンパク質は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したときに、分子量の異なるタンパク質の各バンドが互いに適切な間隔をもって分離する様に選択されることが好ましい。本発明によるシステイン残基を含まないタンパク質を用いたマーカー製品は室温で極めて安定であるので、例えばＤＴＴやβ−ＭＥ等の還元剤の存在は必ずしも必要ではないが、還元剤を溶液中に加えるとさらに安定性が増すのでより好ましい。
【００３３】
精製されたタンパク質を用いて例えば質量分析用の較正標準品を製造する際には、分子量の異なる数個のタンパク質がそれぞれ約２〜２００ｐｍｏｌ／μＬ程度となる様に溶媒に溶解されるのがよい。この場合、タンパク質を溶解する溶媒としては、例えば約３０ｖ／ｖ％アセトニトリルを含む約０．０５ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸水溶液等が好ましい。また、較正標準品はバイアルビンやスクリューキャップ付きミクロチューブ等に入れて凍結乾燥すれば、較正標準品としてより安定で好ましい。
【００３４】
以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（１）ＤＮＡ断片の調製。
配列番号１で示される大腸菌ＨＰｒのアミノ酸配列を基に、配列番号６又は９に示すように５ｋＤａ、１０ｋＤａの正確な分子量を有するように一部のアミノ酸配列を改変したＨＰｒ（組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ）を設計した。この組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡを取得するために、組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡのＣ末端及びＮ末端部位の塩基配列をもとにプライマーを設計し、これを用いて大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードする塩基配列を含むＤＮＡを増幅させた。
なお、プライマーは、配列番号６に示す塩基配列の第１位から第２６位に相当する部位の塩基配列（配列番号７）及び第２４４位から第２９５位に相当する部位の相補配列（配列番号８）、並びに配列番号９に示す塩基配列の第１位から第２４位に相当する部位の塩基配列（配列番号１０）及び第１１１位から第１６０位に相当する部位の相補配列（配列番号１１）を用いた。前記配列番号７，８、１０及び１１の塩基配列又はその相補配列にはそれぞれ５’−末（Ｃ末）端側に制限酵素（ＢａｍＨＩ）認識部位が含まれている。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて９５℃、５分間保温の後、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２回繰り返し、さらに９５℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２８回繰り返し、最後に７２℃で１５分間保温する手順で行った。
また、１０ｋＤａ増加用のＤＮＡの製造は下記の通りである。上記組換え５ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡに、繰り返し繋ぐことで発現するタンパク質の分子量が１０ｋＤａずつ増加するように設計したＤＮＡ断片（１０ｋＤａカセット；配列番号１２）を同様に増幅した。この場合のプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列の第１位から第５０位に相当する部位の塩基配列（配列番号１３）及び第２４７位から第２９５位に相当する部位の相補配列（配列番号１４）を用いた。前記塩基配列又はその相補配列には制限酵素［配列番号１３の５’−末（Ｃ末）端側にＳａｌＩ、配列番号１４の５’−末（Ｃ末）端側にＸｈｏＩ］認識部位が含まれている。
【００３６】
（２）プラスミドの構築
プラスミド構築手順を図１に記載した。
ｐＤＲ５４０プラスミドのｌａｃＵＶ５プロモーター領域（ｌａｃＵＶ５プロモーター配列の上流にＥｃｏＲＩ認識部位、下流にＢａｍＨＩ認識部位を持つ領域）を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて切り出した。次いで、ｐＵＣ８プラスミドのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩの切断部位に切り出したｌａｃＵＶ５プロモーター領域を挿入し、得られたプラスミド（ｐＵＣ５４０）を発現ベクターとして用いた。上記（１）で増幅した組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒの塩基配列を含むＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＣ５４０のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、それぞれ組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドとした。また１０ｋＤａカセットを含む配列をＰＣＲで増幅後、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩにて切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩプラスミドのＳａｌＩ、ＸｈｏＩの切断部位にサブクローニングした。こうして作成した１０ｋＤａカセットプラスミドを大量に製造し、これを制限酵素（ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ）にて消化後、アガロースゲル電気泳動し、１０ｋＤａカセットを精製した。この１０ｋＤａカセットを組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドのＸｈｏＩ切断部位にそれぞれ挿入し、それぞれ組換え１５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミド又は組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドとした。同様の操作を繰り返して、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドを作成した。
【００３７】
（３）組換えＨＰｒタンパク質の発現
（２）で作成した例えば組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドをＪＭ１０９コンピーテントセル（高形質転換効率大腸菌細胞）と混合後３０分間氷上に置き、９０秒間４２℃に置いた後直ちに氷上に５分間置くことで形質転換し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（以下、ＬＢａｍｐ＋と略記する）培地プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢａｍｐ＋液体培地に接種し、増殖させ、組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドで形質転換されたＪＭ１０９クローンを選択した。前記形質転換されたＪＭ１０９クローンをＬＢａｍｐ＋液体培地中で３７℃にて濁度が０．５前後に達するまで増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えてさらに３７℃にて６時間培養した。前記形質転換されたＪＭ１０９クローンを液体培地中で増殖させた。組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドの代わりに、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドを用い、同様にＪＭ１０９コンピーテントセルを形質転換し、同様に増殖した。
【００３８】
（４）組換えＨＰｒの精製
上記（３）で培養した液体培地を４℃で遠心分離（５０００×ｇ、１５分間）して大腸菌を沈澱させ、上清を捨てた。集めた大腸菌を０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、超音波処理にて大腸菌を破砕した。次にこの懸濁液を遠心分離し、得られた沈殿を４質量％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した後、再度遠心分離する操作を３回繰り返して、沈殿を洗浄した。こうして得られた沈殿を８Ｍ尿素含有リン酸緩衝液に溶解し、これを遠心分離して澄明なタンパク質溶液を得た。このタンパク質溶液をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライし、Ｈｉｓ−ｔａｇの付いた目的タンパク質をカラムに結合させた。次いでカラムを８Ｍ尿素含有緩衝液にて洗浄した後、５００ｍＭのイミダゾールを含む４Ｍ尿素含有リン酸緩衝液にて目的タンパク質を溶出させた。精製された組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒを含む画分を得た。
このようにして得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色にて検出すると、各タンパク質は予想される位置にほぼ単一のバンドとして確認された。
これら精製された画分の組換えタンパク質について質量分析計による精密質量測定を行った。表１にその結果を示した。
【００３９】
【表１】
【実施例２】
【００４０】
分子量マーカータンパク質の安定性試験
実施例１で作成した各分子量の組換えタンパク質を１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で透析後、凍結乾燥した。乾燥した各分子量の組換えタンパク質のうち１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ及び１５０ｋＤａのタンパク質を分子量マーカー用試料緩衝液（２質量％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ、１ｍＭグルタチオン、３５質量％グリセロール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）にそれぞれ溶解し混合し、本発明の分子量マーカーとした。本発明の分子量マーカーを２５℃にて３５日間保存した。また、天然に存在するタンパク質を用いた分子量マーカー（ＳＤＳ―ＰＡＧＥスタンダード；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、及び従来技術により作製された市販のラダータンパク質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）も同条件にて２１日間保存した。２５℃でそれぞれの期間保存した後の各分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。各分子量マーカーを−２０℃でそれぞれの期間保存したものを、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、２５℃でそれぞれの期間保存したおのと比較することで、各分子量マーカーの安定性を評価した。
【００４１】
その結果を図２に示す。図２中、Ａは本発明の分子量マーカー、Ｎは天然タンパク質分子量マーカー（ＳＤＳ―ＰＡＧＥスタンダード）、Ｂは従来技術のラダータンパク質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したレーンを示す。なお、ＲＴは２５℃で保存した後の分子量マーカー、ｃｏｎｔ．は−２０℃で保存した後の分子量マーカーを示す。
天然タンパク質分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したレーン（Ｎ）では、２５℃で３週間保存すると各タンパク質のバンドに乱れが生じた。また、従来技術を用いたラダータンパク質分子量マーカーのレーン（Ｂ）でも一部バンドの乱れが観察された。しかし、実施例１で作成した本発明の分子量マーカーに用いられる組換えタンパク質は２５℃で５週間保存後も単一のバンドの乱れは見られなかった。
この結果から、本発明の分子量マーカーに用いるタンパク質は、従来の分子量マーカーに比べ室温で高い安定性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の分子量マーカーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は質量分析用の分子量マーカーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】発現プラスミド構築手順の模式図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する。）ならびに質量分析等によるタンパク質の分子量分析時に広範囲の分子量にわたって便宜に使用することのできる分子量マーカー、及びその製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般にタンパク質の分子サイズや分子量の違いを利用して複数のタンパク質を分離し、検出するＳＤＳ−ＰＡＧＥや質量分析において、試料中の解析対象タンパク質の分子量を推測するためには、分子サイズや分子量が既知である複数のタンパク質の混合物が分子量マーカーとして利用される。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用マーカー製品としては、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ スタンダード（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）やＭａｒｋ １２未着色スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が知られている。これら既存の分子量マーカーには、ミオシン重鎖タンパク、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミン、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、オブアルブミン、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビター、リゾチーム、アプロチニン又はインスリン等のタンパク質が組み合わされて使用されている。
【０００３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの使用を前提とするこれらの分子量マーカー製品は、使用時の利便性を考慮してＳＤＳを含む緩衝液に分子量の異なる複数のタンパク質を溶解した溶液として調製され、使用されている。ところが一般に多くのタンパク質はこのような溶液中において不安定であるため、分子量マーカー製品は室温で数日程度放置するだけでＳＤＳ−ＰＡＧＥ時のバンドが広がったり、消失したり又は位置が変化したりして、分子量マーカーとして使用できなくなる。この様なタンパク質の変化は一般に酸化反応等による場合が多いため、品質の劣化を防ぐ目的で、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する。）やβ−メルカプトエタノール（以下、β−ＭＥと略記する。）等の還元剤がしばしば分子量マーカー製品に添加されるが、いまだ満足すべきものではない。この様な還元剤の添加によって分子量マーカー製品の保存性は多少向上するものの、これら還元剤自体も酸化を受けて分解しやすいため、長期間安定に保存するためには、４℃以下で保存しなくてはならず、中には、４℃以下の保存ではかならずしも満足すべきものではなく、−２０℃での保存が必要な場合がある。そのため使用時に室温に戻したり、解凍するといった手間がかかるうえに、製品の輸送コストが高くなる等の問題点があった。また分子量マーカーの原料として使用するタンパク質試薬の純度が低いと、目的外タンパク質の混入や、混在するタンパク質分解酵素の影響による目的タンパク質の分解等が原因となり、本来検出されるべき分子量以外のバンドが検出されたり、バックグラウンドが濃くなって目的のバンドを確認しづらくなったりする。この様な理由から、高品質な分子量マーカー製品を製造するためには、高度に精製された原料タンパク質を使用する必要があり、材料の調達、調製にコストがかかるという問題があった。
【０００４】
近年、遺伝子工学を利用して製造されたタンパク質を用いた分子量マーカー、例えばプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインＡとＢを一単位とし、このドメインＡとＢを１〜複数個連結してなるタンパク質を含む分子量マーカー(特許文献１参照。)や例えば発色団、発蛍光団、又はＵＶ吸収基で標識されたタンパク質を含む分子量マーカー(特許文献２参照。)等も知られている。しかし、これら遺伝子工学を利用して製造されたタンパク質を利用した分子量マーカーも上記したと同様に、発現させたタンパク質を分子量マーカーの材料として使用に耐える純度にまで精製する過程が煩雑でコストがかかるという問題があった。
【特許文献１】特開平５−３２６９９号公報
【特許文献２】特表２００４−５０６２２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、室温で長期間安定な保存に耐える分子量マーカーを安価に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、既存の分子量マーカー製品を室温で保存した際の各タンパク質のバンドの移動度や形状の変化を観察し、各タンパク質のバンドが変化する程度とタンパク質の持つ特性との関係を詳しく検討した結果、システイン残基（以下、Ｃｙｓと略記する。）を含まないタンパク質は、室温下の長期保存後において他のＣｙｓを含むタンパク質に比べて経時的にバンドの位置や形状が実質的に変化しにくいことを見出した。Ｃｙｓを含まない天然の公知のタンパク質としては、例えばウシカルボニックアンヒドラーゼ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｒａｓｅ；２９．０ｋＤａ）、ウシパルブアルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ；１２．３ｋＤａ）、ウシ胸腺ヒストンＨ２Ａ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｈｙｍｕｓ Ｈｉｓｔｏｎ ２Ａ；１１．２ｋＤａ）、ヒト血清高密度リポタンパク質Ａ−Ｉ（Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｐｏ Ａ−Ｉ；２８．１ｋＤａ）、大豆レグヘモグロビン（Ｓｏｙｂｅａｎ Ｌｅｇｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；１５．２ｋＤａ）、ヒラタケセリンプロテアーゼインヒビター（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＡ−１；８．３ｋＤａ）、大腸菌ヒスチジン含有リン酸輸送タンパク質（Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；９．１ｋＤａ；以下ＨＰｒと略記する。）等が知られている。本発明者らは、さらなる利便性を求めて研究を重ねたところ、上記Ｃｙｓを含まないタンパク質、例えばＨＰｒが、室温保存に対して特別に安定であることを知見した。しかし、ＨＰｒの分子量は４０，０００（４０ｋＤａ）以下であり、Ｃｙｓを含まない高分子量（１００ｋＤａ以上）の天然タンパク質を見出すのは困難である。分子量マーカーは、未知タンパク質の分子量の測定に使用され、その分子量については約５ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲をカバーするのが望まれる、例えば分子量マーカーは、約５ｋＤａから５００ｋＤａまで、例えば約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約３５０ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約４５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ等のように適当なきざみになっているのが好ましい。本発明者らは、例えばＨＰｒのアミノ酸配列又はその部分配列を一単位として繰返したタンパク質とヒスチジンヘキソマーとの融合タンパク質を設計し、分子量が約５，０００（５ｋＤａ）程度から約５００，０００（５００ｋＤａ）程度の間で分子量の異なる複数のタンパク質の製造に成功した。製造されたタンパク質は、ヒスチジンタグを有しているので、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー用担体を用いて容易に高純度まで精製できる。またＣｙｓを含まないので、水溶液中で室温においても長期間安定であることを確認した。さらに本発明者らは、このようなタンパク質２種以上を選択し、かつ当該２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なるとき、これら２種以上のタンパク質を組み合わせることにより、上記従来技術の問題点が一挙に解決されることを知見した。
【０００７】
すなわち本発明は、
［１］ （イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）Ｃｙｓを含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー、
［２］ タンパク質がヒスチジンヘキソマー融合タンパク質であることを特徴とする前記［１］に記載の分子量マーカー。
［３］ タンパク質が配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の分子量マーカー、
〔４〕 タンパク質が配列番号２で示されるアミノ酸配列の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の分子量マーカー、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の分子量マーカーは安定なタンパク質を使用しているので、室温で長期間、安定に保存できる。
また本発明の分子量マーカーはヒスチジンタグ融合タンパク質であるので、低コストで容易に高純度まで精製できる。
さらに本発明の分子量マーカーは室温で保存できるため、製品の輸送コストが低く、保存条件による劣化が少なく、かつ凍結の必要がないため解凍を待たずに使用でき、また使用後に再凍結するといった保存の手間がかからないので、利便性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の分子量マーカーに用いるタンパク質はＣｙｓを含まないヒスチジンタグ融合タンパク質を含有する事を特徴とするものであるので、遺伝子組換え技術によって製造されたもの（以下組換えタンパク質という。）が好ましい。
【００１０】
本発明の分子量マーカーに用いられる組換えタンパク質は、Ｃｙｓを含まないタンパク質であることに加え、公知の分子量マーカーに用いられるタンパク質の特性、例えば酸性、塩基性又は疎水性の各アミノ酸の含有率が極端に偏った組成を持たない等の特性を有することが好ましい。
【００１１】
本発明の分子量マーカーの製造のために有用な遺伝子は、例えば上記公知の分子量マーカーに用いられるタンパク質の特性を有する天然タンパク質、例えばＨＰｒ、リボヌクレアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、アシルＣｏＡ結合タンパク質（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ Ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、セリンプロテアーゼインヒビター（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＡ−１；以下、ＳＰＩと略記する。）、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター（Ｐｕｍｐｋｉｎ Ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、システインプロテアーゼインヒビター（Ｓｈｏｒｔ ｒａｇｗｅｅｄ Ｃｙｓｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、 Ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ−Ｉ ｃｙｓｔａｔｉｎ）、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ｈｕｍａｎ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ−ＩＩＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ユビキチン（Ｈｕｍａｎ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）又はカルシウム結合タンパク質（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｌｇｒａｍｕｌｉｎ Ｃ、Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）等を発現する遺伝子が挙げられる。なお、タンパク質がＣｙｓを含む場合においては、前記遺伝子は、Ｃｙｓを含まないタンパク質を発現するように、遺伝子の構造を改変するのがよい。より具体的には、例えば上記天然タンパク質、好ましくはＨＰｒ又はＳＰＩのアミノ酸配列の全部若しくは一部、又はこれらアミノ酸配列と相同性を有するＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（以下、単にＤＮＡという。）を用いるのが好ましい。前記相同性とは、天然タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約４０％以上の相同性を有し、天然タンパク質と同様に微生物において製造される得る程度を意味する。
【００１２】
本発明の分子量マーカーの製造に用いられるタンパク質の製造に用いられるＤＮＡは、分子量約５〜１０ｋＤａのＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするＤＮＡを一単位として、約２〜１００単位、好ましくは約２〜５０単位が繰返し繋げられたＤＮＡのＣ末端又はＮ末端側に、例えばヒスチジンヘキソマーの様なヒスチジンタグをコードするＤＮＡが付加された形で、それぞれ目的の分子量を有するヒスチジンタグ融合タンパク質を発現するように調製される。上記一単位のポリペプチドを形成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡを２単位繋げることにより約２０ｋＤａのタンパク質を製造でき、同様に３単位で約３０ｋＤａのタンパク質、４単位で約４０ｋＤａのタンパク質、５単位で約５０ｋＤａ、１０単位で約１００ｋＤａのタンパク質、２０単位で約２００ｋＤａのタンパク質、３０単位で約３００ｋＤａのタンパク質等を製造できる。ヒスチジンタグは各分子量のタンパク質のＮ末端側又はＣ末端側に少なくとも１個あればよく、一単位となるＤＮＡを繰返し繋げたＤＮＡのＮ末端側及び／又はＣ末端側にヒスチジンタグをコードするＤＮＡを付加することで、分子量の異なる種々のヒスチジンタグ融合タンパク質を製造できる。
また最小タンパク質となるヒスチジンタグ融合タンパク質（例えば約５ｋＤａ又は約１０ｋＤａのヒスチジンタグ融合タンパク質等）をコードするＤＮＡを２種類以上、好ましくは２〜３種類準備し、これに上記一単位となる分子量約５〜１０ｋＤａのＣｙｓを含まないアミノ酸配列をコードするＤＮＡを任意の回数だけ繰返し繋げたＤＮＡを組み合わせて繋いでもよい。例えば。Ｃ末端にヒスチジンへキソマーを有する５ｋＤａ及び１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれ準備し、そのＮ末端側に、１０ｋＤａのポリペプチドを形成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを１〜数十個繰返し繋いで目的とするタンパク質を発現させることにより、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ、約４００ｋＤａ、約５００ｋＤａ等の分子量を有する種々のヒスチジンへキソマー融合タンパク質を製造できる。
繰返しの単位となるＤＮＡを繋ぐことなく、Ｃ末端にヒスチジンへキソマーを有する約５ｋＤａ及び約１０ｋＤａのポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、それぞれタンパク質を発現させることで、約５ｋＤａ及び約１０ｋＤａのヒスチジンヘキソマー融合タンパク質を製造できることは言うまでもない。
【００１３】
上記一単位となるＤＮＡは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号１の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列若しくは配列番号２の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列等をコードする塩基配列が好ましく挙げられる。また、上記一単位となるＤＮＡは、製造されるタンパク質の分子量が正確に、例えば約５ｋＤａ又は約１０ｋＤａとなるよう、前記配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個（約２〜１５個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加等されるよう、塩基配列を改変することが好ましい。この場合、製造されるタンパク質にＣｙｓが含まれない様に改変されるのがよい。このようなＤＮＡとしては、例えば配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列等が挙げられる。
【００１４】
ヒスチジンタグをコードするＤＮＡは、ヒスチジンに対応するコドンを少なくとも２個（好ましくは約６〜８個、とりわけ好ましくは約６個）連ねたオリゴヌクレオチドが好ましい。ヒスチジンタグをコードするＤＮＡとしては、例えば特開昭６３−２５１０９５号公報又は特開平３−１０１６９３号公報に記載の金属親和性ペプチドをコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現される本発明のタンパク質は、例えば特開昭６３−４４９４７号公報に記載の金属アフィニティークロマトグラフィー等によって容易に高純度まで精製できる。
【００１５】
また、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質においては、ヒスチジンタグと共に、又はヒスチジンタグの代わりにストレプトタグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）−Ｇタグ等のタグをコードするＤＮＡ配列等を付加することもできる。これら親和性タグ配列を付加することにより、発現したタンパク質を分離、採取する際に、例えば該親和性タグに対するアフィニティーカラムを用いることができる等により、タンパク質の精製を容易にし得る。
【００１６】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質の製造方法において、まず上記一単位となるＤＮＡを繋げ、目的とする分子量のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を調製するのがよい。調製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに挿入する。ＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞中で発現ベクターに導入されたＤＮＡを発現させることによって、目的とする分子量のタンパク質を製造することができる。
【００１７】
上記一単位となるＤＮＡは、Ｃ末端及びＮ末端に制限酵素（例えばＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ等）認識部位を有するよう、塩基配列が付加されることが好ましい。制限酵素認識部位を付加されたＤＮＡ（以下、カセットという。）としては、例えば配列番号６、９又は１２で示される塩基配列が挙げられる。配列番号６、９又は１２で示されるカセットは、例えば、配列番号３〜５で示されるアミノ酸配列等をもとにオリゴヌクレオチドが設計され、設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことによって得ることができる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、デナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約２５〜３５サイクル程度が好ましい。プライマーとしては、例えば配列番号６における第１位〜第２６位の塩基配列（配列番号７）及び第２４４位〜第２９５位の相補配列（配列番号８）、配列番号９における第１位〜第２４位の塩基配列（配列番号１０）及び第１１１位〜第１６０位の相補配列（配列番号１１）、配列番号１２における第１位〜第５０位の塩基配列（配列番号１３）及び第２４７位〜第２９５位の相補配列（配列番号１４）等が挙げられる。
【００１８】
次に得られたカセットを分子量の異なるタンパク質が製造されるよう連結し、連結したカセットを発現ベクターに組み込んで発現プラスミドを作成する。カセットの連結は、少なくとも２種の制限酵素を組み合わせて行うことができる。制限酵素の組合せとしては、例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ、ＳｐｅＩとＮｈｅＩ又はＰｓｔＩとＮｓｉＩの組み合わせのごとく、粘着末端を生じる制限酵素の組み合わせや、平滑末端を生じる制限酵素の組み合わせが挙げられる。このため、カセットの制限酵素認識部位は、これら制限酵素の組み合わせに対応する制限酵素の認識配列であることが好ましい。この様なカセットを利用して、選択した上記組み合わせの制限酵素（例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ）のどちらか一方（例えばＸｈｏＩ）で切断した発現プラスミドに、前記選択した制限酵素（例えばＸｈｏＩとＳａｌＩ）で切断したカセット断片を挿入することができる。この反応を繰り返すことにより、基本ポリペプチドのＤＮＡを含むＤＮＡを同一方向に目的とする分子量のタンパク質をコードするＤＮＡとなるように何度でも連結することができる。
【００１９】
また、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは、所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡは翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２０】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡが挿入される発現ベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限りプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターも用いることができる。このような発現ベクターとしては、より詳しくは例えば、細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６、ｐＵＣ系プラスミドベクター等）、ファージＤＮＡ（ラムダファージ等）、酵母プラスミド（ｐＧ−１等）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。発現ベクターは複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２１】
複製開始点としては、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母用ベクターに対して、例えば２μｍ ＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものが挙げられる。
【００２２】
プロモーターは本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするｍＲＮＡの合成を指令するための調節配列であり、例えば、アデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ（例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター等）又はｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を挙げることができる。
【００２３】
選択マーカーは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型を宿主に付与するための遺伝子であり、例えば、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げられる。
【００２４】
発現ベクターは商業的に入手可能なものも好ましく使用することができる。そのような発現ベクターとしては、具体的には例えば、細菌性のものではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＥＴ−１１ａ（ＮＯＶＡＧＥＮ社製）；及び真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ ＳＶ４０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等が挙げられる。中でもｐＤＲ５４０又はｐＥＴ−１１ａがより好ましい。
【００２５】
本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡが挿入された発現ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換し、宿主細胞を適当な培地中で培養し、本発明の分子量マーカーに用いられるタンパク質をコードするＤＮＡを発現させ、本発明の分子量マーカー用タンパク質を製造させることができる。
【００２６】
形質転換は、自体公知の方法であればいずれも好ましく用いることができる。例えば、コンピテント細胞法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第５３巻，ｐ．１５４（１９７０）］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２１５巻，ｐ．１６６，（１９８２）］、インビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第７２巻，ｐ．５８１（１９７５）］、ウイルスベクター法［Ｃｅｌｌ，第３７巻，ｐ．１０５３（１９８４）］、マイクロインジェクション法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，第１５３巻，ｐ．３４７（１９８４）］、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３巻，ｐ．１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２２１巻，ｐ．５５１（１９８３）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，第８４巻，ｐ．７４１３（１９８７）］又はプロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，第１７巻，ｐ．１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１６８巻，ｐ．１１１（１９７９）］に記載の方法等を挙げることができる。
【００２７】
宿主細胞の例としては、細菌細胞、例えば大腸菌（ＪＭ１０９等）、ストレプトミセス、枯草菌等；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株等；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母等；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２，スポドプテラＳｆ９等；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３，Ｃ１２７等が挙げられる。
【００２８】
発現ベクターと宿主細胞は適切な組み合わせを選んで使用するのが望ましい。発現ベクターと宿主細胞の適切な組み合わせとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｌａｃ ＵＶ５プロモーター制御系ベクターに目的タンパク質をコードするＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ、又はＴ７プロモーター制御系ベクターに目的タンパク質をコードするＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。
【００２９】
培養に使用される培地は、宿主細胞に応じて、適切な培地が選択される。例えば宿主細胞が大腸菌等の細菌の場合、培地は液体培地が適当であり、例えばＬＢ培地、Ｌブロス、２×ＴＹ培地等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。また、タンパク質の発現誘導剤として、例えばイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記する。）等を添加してもよい。培養は通常約１５〜４０℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。宿主が酵母である場合、培地としては、例えばバークホルダー最小培地等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えるのがよい。宿主が動物細胞である場合、培地としては、たとえば約５〜２０質量％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＥＭＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えるのがよい。
【００３０】
発現したタンパク質の分離、採取は、公知の方法により行うことができる。例えばタンパク質を産生している形質転換体は、その培養液上清中に該タンパク質を分泌することから、この形質転換体の培養上清から該タンパク質の抽出を行うことができる。また、形質転換体中に産生された該タンパク質の抽出を行うこともできる。タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、遠心分離やろ過等の公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム又は／及び凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００等の界面活性剤が含まれていてもよい。分子量マーカーとして用いるタンパク質に不純物が混入していると、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドの特定や質量分析におけるピークの特定が困難になるので、可能な限り精製することが望ましい。一般にタンパク質の精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィー等が利用できるが、ヒスチジンタグは金属キレートカラムに結合するので、ヒスチジンタグの融合タンパク質として発現させた本発明のタンパク質は、金属キレートカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー等によって精製するのが望ましい。
【００３１】
精製されたタンパク質に色素化合物を共有結合させることもできる。色素化合物を定法に従い共有結合させることにより、本発明の分子量マーカーのタンパク質を染色等の手段を用いなくても目視できる。
【００３２】
本発明の分子量マーカーは、分子量が異なる数個乃至十数個のタンパク質を溶媒（例えば精製水、緩衝液等）に溶解して製造される。例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分子量マーカーとして製造する際には、分子量の異なる数個乃至十数個のタンパク質をそれぞれ約２０〜１００μｇ／ｍＬ程度となる様に混合するのがよい。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の分子量マーカーの場合、直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用できるようにするため、ＳＤＳ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（以下ＥＤＴＡ−Ｎａと略記する）、ブロムフェノールブルー及びグリセロールを含むＴｒｉｓ緩衝液に、分子量の異なる数個乃至十数個のタンパク質を溶解した混合溶液として調製するのがよい。分子量の異なるタンパク質は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したときに、分子量の異なるタンパク質の各バンドが互いに適切な間隔をもって分離する様に選択されることが好ましい。本発明によるシステイン残基を含まないタンパク質を用いたマーカー製品は室温で極めて安定であるので、例えばＤＴＴやβ−ＭＥ等の還元剤の存在は必ずしも必要ではないが、還元剤を溶液中に加えるとさらに安定性が増すのでより好ましい。
【００３３】
精製されたタンパク質を用いて例えば質量分析用の較正標準品を製造する際には、分子量の異なる数個のタンパク質がそれぞれ約２〜２００ｐｍｏｌ／μＬ程度となる様に溶媒に溶解されるのがよい。この場合、タンパク質を溶解する溶媒としては、例えば約３０ｖ／ｖ％アセトニトリルを含む約０．０５ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸水溶液等が好ましい。また、較正標準品はバイアルビンやスクリューキャップ付きミクロチューブ等に入れて凍結乾燥すれば、較正標準品としてより安定で好ましい。
【００３４】
以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（１）ＤＮＡ断片の調製。
配列番号１で示される大腸菌ＨＰｒのアミノ酸配列を基に、配列番号６又は９に示すように５ｋＤａ、１０ｋＤａの正確な分子量を有するように一部のアミノ酸配列を改変したＨＰｒ（組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ）を設計した。この組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡを取得するために、組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡのＣ末端及びＮ末端部位の塩基配列をもとにプライマーを設計し、これを用いて大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードする塩基配列を含むＤＮＡを増幅させた。
なお、プライマーは、配列番号６に示す塩基配列の第１位から第２６位に相当する部位の塩基配列（配列番号７）及び第２４４位から第２９５位に相当する部位の相補配列（配列番号８）、並びに配列番号９に示す塩基配列の第１位から第２４位に相当する部位の塩基配列（配列番号１０）及び第１１１位から第１６０位に相当する部位の相補配列（配列番号１１）を用いた。前記配列番号７，８、１０及び１１の塩基配列又はその相補配列にはそれぞれ５’−末（Ｃ末）端側に制限酵素（ＢａｍＨＩ）認識部位が含まれている。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて９５℃、５分間保温の後、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２回繰り返し、さらに９５℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２８回繰り返し、最後に７２℃で１５分間保温する手順で行った。
また、１０ｋＤａ増加用のＤＮＡの製造は下記の通りである。上記組換え５ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒをコードするｃＤＮＡに、繰り返し繋ぐことで発現するタンパク質の分子量が１０ｋＤａずつ増加するように設計したＤＮＡ断片（１０ｋＤａカセット；配列番号１２）を同様に増幅した。この場合のプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列の第１位から第５０位に相当する部位の塩基配列（配列番号１３）及び第２４７位から第２９５位に相当する部位の相補配列（配列番号１４）を用いた。前記塩基配列又はその相補配列には制限酵素［配列番号１３の５’−末（Ｃ末）端側にＳａｌＩ、配列番号１４の５’−末（Ｃ末）端側にＸｈｏＩ］認識部位が含まれている。
【００３６】
（２）プラスミドの構築
プラスミド構築手順を図１に記載した。
ｐＤＲ５４０プラスミドのｌａｃＵＶ５プロモーター領域（ｌａｃＵＶ５プロモーター配列の上流にＥｃｏＲＩ認識部位、下流にＢａｍＨＩ認識部位を持つ領域）を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて切り出した。次いで、ｐＵＣ８プラスミドのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩの切断部位に切り出したｌａｃＵＶ５プロモーター領域を挿入し、得られたプラスミド（ｐＵＣ５４０）を発現ベクターとして用いた。上記（１）で増幅した組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒの塩基配列を含むＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＣ５４０のＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、それぞれ組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドとした。また１０ｋＤａカセットを含む配列をＰＣＲで増幅後、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩにて切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩプラスミドのＳａｌＩ、ＸｈｏＩの切断部位にサブクローニングした。こうして作成した１０ｋＤａカセットプラスミドを大量に製造し、これを制限酵素（ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ）にて消化後、アガロースゲル電気泳動し、１０ｋＤａカセットを精製した。この１０ｋＤａカセットを組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドのＸｈｏＩ切断部位にそれぞれ挿入し、それぞれ組換え１５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミド又は組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドとした。同様の操作を繰り返して、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドを作成した。
【００３７】
（３）組換えＨＰｒタンパク質の発現
（２）で作成した例えば組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドをＪＭ１０９コンピーテントセル（高形質転換効率大腸菌細胞）と混合後３０分間氷上に置き、９０秒間４２℃に置いた後直ちに氷上に５分間置くことで形質転換し、０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（以下、ＬＢａｍｐ＋と略記する）培地プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢａｍｐ＋液体培地に接種し、増殖させ、組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドで形質転換されたＪＭ１０９クローンを選択した。前記形質転換されたＪＭ１０９クローンをＬＢａｍｐ＋液体培地中で３７℃にて濁度が０．５前後に達するまで増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えてさらに３７℃にて６時間培養した。前記形質転換されたＪＭ１０９クローンを液体培地中で増殖させた。組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドの代わりに、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒ発現プラスミドを用い、同様にＪＭ１０９コンピーテントセルを形質転換し、同様に増殖した。
【００３８】
（４）組換えＨＰｒの精製
上記（３）で培養した液体培地を４℃で遠心分離（５０００×ｇ、１５分間）して大腸菌を沈澱させ、上清を捨てた。集めた大腸菌を０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁し、超音波処理にて大腸菌を破砕した。次にこの懸濁液を遠心分離し、得られた沈殿を４質量％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した後、再度遠心分離する操作を３回繰り返して、沈殿を洗浄した。こうして得られた沈殿を８Ｍ尿素含有リン酸緩衝液に溶解し、これを遠心分離して澄明なタンパク質溶液を得た。このタンパク質溶液をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にアプライし、Ｈｉｓ−ｔａｇの付いた目的タンパク質をカラムに結合させた。次いでカラムを８Ｍ尿素含有緩衝液にて洗浄した後、５００ｍＭのイミダゾールを含む４Ｍ尿素含有リン酸緩衝液にて目的タンパク質を溶出させた。精製された組換え５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え２５ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え３０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え４０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え５０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え６０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え８０ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１００ｋＤａ−ＨＰｒ、組換え１５０ｋＤａ−ＨＰｒ又は組換え２５０ｋＤａ−ＨＰｒを含む画分を得た。
このようにして得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色にて検出すると、各タンパク質は予想される位置にほぼ単一のバンドとして確認された。
これら精製された画分の組換えタンパク質について質量分析計による精密質量測定を行った。表１にその結果を示した。
【００３９】
【表１】
【実施例２】
【００４０】
分子量マーカータンパク質の安定性試験
実施例１で作成した各分子量の組換えタンパク質を１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で透析後、凍結乾燥した。乾燥した各分子量の組換えタンパク質のうち１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ及び１５０ｋＤａのタンパク質を分子量マーカー用試料緩衝液（２質量％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ、１ｍＭグルタチオン、３５質量％グリセロール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）にそれぞれ溶解し混合し、本発明の分子量マーカーとした。本発明の分子量マーカーを２５℃にて３５日間保存した。また、天然に存在するタンパク質を用いた分子量マーカー（ＳＤＳ―ＰＡＧＥスタンダード；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、及び従来技術により作製された市販のラダータンパク質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）も同条件にて２１日間保存した。２５℃でそれぞれの期間保存した後の各分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。各分子量マーカーを−２０℃でそれぞれの期間保存したものを、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、２５℃でそれぞれの期間保存したおのと比較することで、各分子量マーカーの安定性を評価した。
【００４１】
その結果を図２に示す。図２中、Ａは本発明の分子量マーカー、Ｎは天然タンパク質分子量マーカー（ＳＤＳ―ＰＡＧＥスタンダード）、Ｂは従来技術のラダータンパク質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したレーンを示す。なお、ＲＴは２５℃で保存した後の分子量マーカー、ｃｏｎｔ．は−２０℃で保存した後の分子量マーカーを示す。
天然タンパク質分子量マーカーをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したレーン（Ｎ）では、２５℃で３週間保存すると各タンパク質のバンドに乱れが生じた。また、従来技術を用いたラダータンパク質分子量マーカーのレーン（Ｂ）でも一部バンドの乱れが観察された。しかし、実施例１で作成した本発明の分子量マーカーに用いられる組換えタンパク質は２５℃で５週間保存後も単一のバンドの乱れは見られなかった。
この結果から、本発明の分子量マーカーに用いるタンパク質は、従来の分子量マーカーに比べ室温で高い安定性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の分子量マーカーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は質量分析用の分子量マーカーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】発現プラスミド構築手順の模式図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）システイン残基を含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー。
【請求項２】
タンパク質がヒスチジンヘキソマー融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項３】
タンパク質が配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分子量マーカー。
【請求項４】
タンパク質が配列番号２で示されるアミノ酸配列の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分子量マーカー。
【請求項１】
（イ）分子量が５ｋＤａ乃至５００ｋＤａの範囲内であり、
（ロ）システイン残基を含まず、
（ハ）Ｎ末端又は／及びＣ末端にヒスチジンタグが融合されている
タンパク質を少なくとも２種以上含有し、かつ２種以上のタンパク質の分子量がそれぞれ異なることを特徴とするタンパク質分子量マーカー。
【請求項２】
タンパク質がヒスチジンヘキソマー融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の分子量マーカー。
【請求項３】
タンパク質が配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３２位〜第６８位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分子量マーカー。
【請求項４】
タンパク質が配列番号２で示されるアミノ酸配列の第３１位〜第７１位のアミノ酸配列又はその繰り返しを含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分子量マーカー。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２７５５９８（Ｐ２００６−２７５５９８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９１６７０（Ｐ２００５−９１６７０）
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
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