分析用デバイスを用いた分析方法
【課題】簡単かつ迅速に、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析の自動測定させることができる分析デバイス用分析方法を提供することを目的とする。
【解決手段】試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、前記反応液が前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させた後、凝集試薬によって凝集処理した反応液であり、前記反応液に対して回転中にアクセスして測定することを特徴とする。
【解決手段】試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、前記反応液が前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させた後、凝集試薬によって凝集処理した反応液であり、前記反応液に対して回転中にアクセスして測定することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析用デバイスに試料液をセットして分析装置本体にセットし、分析装置本体が分析用デバイスから前記試料液の成分を自動で読み取る分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、１台の装置により血液等の生物学的試料と分析試薬と反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。しかしながら、すべての病院においてそのような装置が導入されているわけではなく、特に診療所等の小規模な医療機関においては、運用コスト等の様々な理由により、試料の分析を外部委託するという形態をとる病院も少なくない。分析を外部委託する形態をとる場合、分析結果を得るまでに時間を要し、その結果、患者は検査結果に基づく適切な治療を受けるために、必然的に再来院を余儀なくされるという不便さや、急患等の緊急を要する場合の迅速対応が難しい等の問題がある。
【０００３】
そのような背景の中、市場からは、低コスト、試料液の少量化、装置の小型化、短時間測定、多項目同時測定など、より高精度で、運用の自由度が高い分析装置の登場が望まれている。
【０００４】
運用の自由度の高い分析装置を実現するためには、例えば、指先採血等で採取される少量の検体から複数種の成分濃度を短時間で高精度に測定できるという条件を満たすことが一つの理想形であろう。しかしながら、指先採血等でストレス無く得られる検体量は、せいぜい十数マイクロリットル程度であり、そのような少量の検体をそのままを分析するのでは前述の条件、特に複数種の成分分析を高精度に行うことは、技術的に難しい。
【０００５】
この課題に対する解決策の一つとして、分析システムを高感度化し、少量の検体を希釈液により希釈することにより、その容量を増加させた上で、特定の成分を分析するという方法がある。又、微量検体の対策のためだけでなく、任意の物質濃度が高い場合や分析装置の都合等の理由によっても、希釈液がよく利用される。
【０００６】
近年、各種疾病の進行度合いを検査したい項目の１つとして、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度が挙げられる。ヘモグロビン誘導体の一つである糖化ヘモグロビンは、食事による血糖値変動の影響を排除した通常時の血糖レベルの判定が可能なこともあって、生活習慣病の早期発見のためによく測定される項目である。糖化ヘモグロビンはヘモグロビンＡ１ｃとも呼ばれ、赤血球の中に含まれるヘモグロビンにブドウ糖が結合したものであり、ヘモグロビンに対して糖化ヘモグロビンが存在する比率（％）で、数値化される。糖化ヘモグロビンの一般的な測定方法としては、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法、免疫法、ホウ酸アフィニティー法などが挙げられる。またその中でも、免疫法は、ヘモグロビンＡ１ｃが存在する比率を測定するためには、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを個別に測定する必要がある。
【０００７】
ヘモグロビンの測定は、ヘモグロビン特有の光吸収特性を利用して、４１５ｎｍ近傍の波長もしくは５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法が一般的である。５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法やＳＬＳヘモグロビン法が広く知られている。
【０００８】
また、糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）を免疫法で測定するためには、最初に、血液試料を溶血させることによって、赤血球からヘモグロビンを外に取り出し、次にヘモグロビンが非糖化ヘモグロビンであるか糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）であるかを判別するために、ヘモグロビンの立体構造を変化させることによって、ヘモグロビンタンパクの糖化された部分をその立体構造の中から外に露出させる処理が必要である。これを、ヘモグロビンの変性と呼ぶが、さらに、糖化された部分を特異的に認識する抗体と反応させることによって、免疫学的に糖化ヘモグロビン量（ヘモグロビンＡ１ｃ）を測定することが可能となる。
【０００９】
なお、生物学的流体を光学的に分析する方法としては、糖化ヘモグロビンの分析用デバイスとしては非遠心性および非毛細管性の操作による逐次的反応試験実施用の反応カセットが知られている。
【００１０】
図２９は、技術文献１で公開されている生物学的流体の分析に使われるヘモグロビン比濁測定カセットを示したものであり、毛細管形状の試料液の注入手段により注入された試料液と、液体試薬（希釈液）を組み入れた液体供給手段により注入された液体試薬（希釈液）を反応路４０５内で混合し、あらかじめ試薬の担持された試薬帯４０１，４０２、４０３に混合液を移送され、反応工程の後、液体混合物の検出可能な応答を測定するにより分析が行われる。より具体的には、装置４００を所定の角度傾けることにより、重力を利用しながら流体の制御をすることが可能で、液体試料を、酸化剤４０１、変性剤７０（液体供給貯留器４０４内にあり）、抗体粒子４０２、および凝集剤４０３と順次混合させ、混合溶液中の凝集応答を比濁度を測定することにより、種々の生物化学的な分析を行える。
【００１１】
また、生物学的流体を光学的に分析する方法として、その他の先行技術文献情報としては、液体流路を形成したマイクロデバイスを用いて分析する、例えば特許文献２が知られている。
【００１２】
図３０は技術文献２で公開されている生物学的流体の分析に使われるマイクロデバイスを示したものであり、流体流路を形成したマイクロデバイス２４６は、回転装置を使って遠心力を利用しながら流体の制御をすることが可能で、サンプル溶液の計量、流体成分の遠心による分離、分離された流体成分の移送分配等を行えるため、種々の生物化学的な分析を行える。
【００１３】
より具体的には、回転装置２００は、試料入口ポート２５０を有する試料受容容器２４８と、希釈剤が含まれている希釈剤室２５２とを有し、マイクロデバイス２４６の回転２１８による遠心力を利用して、試料液と希釈剤の両方を混合室２０５に移送し、マイクロデバイス２４６の回転と減速により混合され、一定時間経過すると、濃縮された試料液中の細胞成分が、収容混合室２５４の半径方向外周に形成されている細胞保持範囲２０６である分離室に収容される。その後、この細胞成分を含む液体は、流れ制限通路２６２を経て分留室２６０に移送され、ここでさらにマイクロデバイス２４６の回転と減速により、細胞成分を含む液体の細胞成分がより濃縮され、分留室２６０の半径方向の外側に形成されている細胞保持範囲２１１で保持される。一方、細胞のない液体は分配通路２６４内および分析室２６８の光学キュベット内へ移送され、ここで特定の分析が行われる。さらに、試料液は血液であり、細胞成分は血球成分である場合、混合室２５４と分留室２６０とにより、血球成分を分離し取り除いた血漿成分を効果的に抽出分配できる。
【００１４】
このように、液状試験試料中に存在する分析対象物の量を測定するための分析方法としては、分析試薬との分析反応を包含し、分光測定法を用いて分析する方法が知られおり、これを用いた分析反応容器もしくは装置などの専用の器具は、ピペットの使用や、液状試験試料と分析試薬との混合および加温放置のような、多数の煩雑な操作段階を必要とするイムノアッセイを実施するのに、特に有用であり、又、これら専用器具を検査場所まで搬送する必要もなく、その場での迅速測定が可能である。
【特許文献１】特開平３−４６５６６号公報
【特許文献２】特表平５−５０８７０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、特許文献１では、必要な反応液量も多くデバイスの小型化が難しいという課題がある。また非遠心で行うため定量機構がなく、希釈液の保存期間中などに希釈液が保存容器外へ自然蒸発するなどにより、前記希釈液が減少する現象が発生する。その際、反応液量が変わり測定精度が悪化するという課題を有している。
【００１６】
また、特許文献２では、遠心力を利用した定量および、測定技術を有しているものの、ラテックス試薬を利用した凝集反応を利用するような反応では、測定時に発生した凝集物が遠心力により沈降が発生して、正確な測定ができないという課題を有している。
【００１７】
本発明は、簡単かつ迅速に、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析を自動測定させることができる分析デバイス用分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の請求項１記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させ、これを凝集試薬によって凝集処理して前記反応液を作成し、この反応液に前記分析用デバイスの回転中にアクセスして測定することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項２記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬の粒径平均値が０．３μｍ以下であることを特徴とする。
本発明の請求項３記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多であることを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項４記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬と前記凝集試薬による反応後３分以内の凝集物粒径の平均値が７００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項５記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記抗体が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号から産出されるモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項６記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項４において、前記凝集物にかかる測定中の遠心力が２００Ｇ以下であることを特徴とする。
本発明の請求項７記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記免疫反応が前記試料液と分析用デバイス内で計量された希釈液とを混合した混合溶液に対してラテックス試薬を反応させていることを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項８記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項７において、前記試料液が血液であり、前記血液中の血球成分を遠心力によって濃縮した後、濃縮された血球成分を含む血液を一定量採取して前記希釈液と混合させることを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項９記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項７において、前記混合溶液を更に計量してから前記ラテックス試薬と反応させることを特徴とする。
本発明の請求項１０記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記試料液中の特定成分が前記ラテックス試薬と免疫反応できるように前記試料液を変性試薬によって変性させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
この構成によると、簡単かつ迅速に、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析を自動測定させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の分析用デバイスを用いた分析方法を、具体的な実施の形態に基づいて説明する。
この実施の形態では分析用デバイス１の構成について説明する。
【００２７】
図１は、本発明の実施の形態における分析用デバイス１を分析装置本体の分析用デバイス保持部材１０３の上にセットした状態を示し、図２は分析用デバイス１の前記分析用デバイス保持部材１０３と接触している面を上側にして分解した状態を示している。
【００２８】
分析用デバイス１は、試料液飛散防止用の保護キャップ２と、ベース基板３の表面を覆うカバー基板４と、希釈液を保持している希釈液収容室５と、ベース基板３の上面に形成されている数個の凹部のうちの一つの凹部５０にセットされた希釈液収容室５内の希釈液を排出するための開封ボタン６とを合わせた５つの部品で構成されている。
【００２９】
なお、この分析用デバイスの形状は、扇形状や、立方体形状やその他の形状のものでもよく、又、これらの分析用デバイス１を複数個同時に、分析用デバイス保持部材１０３へ装着してもかまわない。
【００３０】
ベース基板３とカバー基板４は、希釈液収容室５などを内部にセットした状態で接合され、この接合された状態のものに保護キャップ２が取り付けられている。また。開封ボタン６は、カバーに形成された開封孔７の位置を中心に接合される。
【００３１】
ベース基板３の上面に形成されている数個の凹部の開口をカバー基板４で覆うことによって、後述の複数の収容エリア（後述の測定スポットと同じ）とその収容エリアの間を接続する流路などが形成される（図２を参照）。収容エリアのうちの必要なものには各種の分析に必要な試薬が予め担持されている。
【００３２】
この分析用デバイス１は、注入口１１から試料液、例えば血液などの溶液を採取することができ、保護キャップ１を閉めて分析装置本体１００の分析用デバイス保持部材１０３にセットすることで、試料液の成分分析を行うことができる。１０２は分析用デバイス保持部材１０３の回転中の軸心を示している。
【００３３】
分析用デバイス１は、注入口１１から内部に取り込んだ試料液、注入口１１よりも内周にある前記軸心１０２を中心に分析用デバイス１を回転させて発生する遠心力と、分析用デバイス１内に設けられた毛細管流路の毛細管力を用いて、分析用デバイス１の内部で溶液を移送していくように構成されており、保護キャップ２は注入口１１の付近に付着した試料液が、分析中に遠心力によって外部へ飛散するのを防止するために取り付けられている。
【００３４】
分析用デバイス１を構成する部品に材料としては、材料コストが安価で量産性に優れる樹脂材料が望ましい。前記分析装置本体１００は、分析用デバイス１を透過した光を測定する光学的測定方法によって試料液の分析を行うため、ベース基板３およびカバー基板４の材料としては、ＰＣ、ＰＭＭＡ、ＡＳ、ＭＳなどの透明性の高い樹脂が望ましい。
【００３５】
また、希釈液収容室５の材料としては、希釈液収容室５の内部に希釈液を長期間封入しておく必要があるため、ＰＰ、ＰＥなどの水分透過率の低い結晶性樹脂が望ましい。開封ボタン６については、希釈液収容室５の開封時に変形させて用いるため、弾性変形しやすいＰＰなどの結晶性樹脂が望ましい。保護キャップ２の材料としては、成形性のよい材料であれば特に問題がなく、ＰＰ、ＰＥなどの安価な樹脂が望ましい。
【００３６】
ベース基板３とカバー４との接合は、前記収容エリアに担持された試薬の反応活性に影響を与えにくい方が望ましく、接合時に反応性のガスや溶剤が出にくい超音波溶着やレーザー溶着などが好ましい。
【００３７】
また、ベース基板４とカバー基板３との接合によって両基板３，４の間の微少な隙間による毛細管力によって溶液を移送させる部分には、毛細管力を高めるための親水処理が行われており、これにより粘性抵抗を減らし流体移動をしやすくなる。具体的には、親水性材料を用いたり、親水性ポリマーや界面活性剤などを用いた親水処理が行われている。また、シリカゲルの如き親性粉末などの親水化剤を添加させて材料表面に親水性を付与させたりしてもかまわない。また、親水性処理の方法としては、プラズマ、コロナ、オゾン、フッ素等の活性ガスを用いた表面処理方法や、界面活性剤による表面処理が挙げられる。ここで親水性とは水との接触角が９０°未満のことをいい、より好ましくは接触角４０°未満である。
【００３８】
図３〜図６は、分析用デバイス１がセットされる分析装置本体１００を示す。
図３において、分析用デバイス１は、分析装置本体１００の前記軸心１０２を中心に回転する分析用デバイス保持部材１０３の上に、ベース基板３とカバー基板４のうちカバー基板４の側を下にして装着され、蓋１０１を閉じた状態で分析が行われる。
【００３９】
図４と図５に示すように、この分析装置本体１００は、分析用デバイス保持部材１０３を回転させるための回転起動手段１０７と、分析用デバイス１内の溶液を光学的に測定するための光学測定手段１０９と、分析用デバイス保持部材１０３の回転速度や回転方向、および光学的に測定するための光学測定手段１０９と、分析用デバイス保持部材１０３の回転速度や回転方向、および光学測定手段１０９の測定タイミングなどを制御する制御手段１０８と、光学測定手段１０９によって得られた信号を処理し測定結果を演算するための演算部１１０と、演算部１１０で得られた結果を表示するための表示部１１１とで構成される。
【００４０】
回転駆動手段１０７は、分析用デバイス保持部材１０３を介して分析用デバイス１を軸心１０２の回りに任意の方向に所定の回転速度で回転させるだけでなく、所定の停止位置で軸心１０２を中心に所定の振幅範囲、周期で左右に往復運動をさせて分析用デバイス１を揺動させることができるように構成されている。ここでは回転駆動手段１０７としてモータ１０４を使用して分析用デバイス保持部材１０３を軸心１０２の周りに回転させている。軸心１０２は、この軸心１０２上の所定位置を中心に傾斜角度θ°だけ傾斜して回転自在に取り付けられている。
【００４１】
なお、ここでは分析用デバイス１の回転動作と揺動動作を１つの回転駆動手段１０７で行おうとしているが、回転駆動手段１０７の負荷を軽減させるために、揺動作用の駆動手段を別に設けてもかまわない。具体的には、分析用デバイス保持部材１０３の上にセットした分析用デバイス１に対して、前記モータ１０４とは別に用意したバイブレーションモータなどの加震手段を、直接または間接的に接触させることによって分析用デバイス１を揺動させて、分析用デバイス１内の溶液に慣性力を付与する。
【００４２】
光学測定手段１０９には、分析用デバイス１の測定部にレーザー光を照射するためのレーザー光源１０５と、レーザー光源１０５から照射されたレーザー光のうち、分析用デバイス１を通過した透過光の光量を検出するフォトディテクタ１０６とを備えている。ここではレーザー光源１０５は出射光の波長を切り替え可能なものを使用し、フォトディテクタ１０６はレーザー光源１０５の出射光の何れの波長の光も検出できるものを使用している。分析用デバイス保持部材１０３が透過性に劣る材料または透過性でない材料の場合には、分析用デバイス保持部材１０３の分析用デバイス１の装着位置には、孔５１，５２が穿接されている。
【００４３】
なお、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６は、測定に必要な波長の種類に応じた複数対だけ設けることもできる。
また、分析装置本体１００には、分析用デバイス１内の希釈液収容室５を自動で開封するための開封手段、具体的には、分析用デバイス保持部材１０３にセットされた分析用デバイス１の開封ボタン６を操作できるように、分析用デバイス保持部材１０３に上下運動ができるアームを設け、開封ボタン６を前記アームによって押し上げる機構を設けてもかまわない。
【００４４】
分析用デバイス保持部材１０３は、図５に示すように傾斜した軸心１０２に取り付けられて水平線に対して傾斜角度θ°だけ傾斜しており、分析用デバイス１の回転停止位置に応じて、分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の方向を制御できる。
【００４５】
具体的には、図６（ａ）に示す位置（真上を０°（３６０°）として表現した場合に１８０°付近の位置）で分析用デバイス１を停止させた場合は、分析用デバイス１の下側５３が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は外周方向（下側５３）に向かって重力を受ける。
【００４６】
また、図６（ｂ）に示す６０°付近の位置で分析用デバイス１を停止させた場合は、分析用デバイス１の左上側５４が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は左上方向に向かって重力を受ける。同様に、図６（ｃ）に示す３００°付近の位置では、分析用デバイス１の右上側５５が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は右上方向に向かって重力を受ける。
【００４７】
このように、軸心１０２に傾斜を設け、任意の位置に分析用デバイス１を停止させることで、分析用デバイス１内の溶液を所定の方向に移送させるための駆動力の１つとして利用できる。
【００４８】
分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の大きさは、軸心１０２の傾斜角度θを調整することで設定することができ、移送する液量と、分析用デバイス１内の壁面に付着する力との関係に応じて設定することが望ましい。
【００４９】
傾斜角度θは、１０°〜４５°の範囲が望ましく、傾斜角度θが１０°より小さいと溶液にかかる重力が小さすぎて移送に必要な駆動力が得られないおそれがあり、傾斜角度θが４５°より大きくなると軸心１０２への負荷が増大したり、遠心力で移送させた溶液が自重で勝手に動いて制御できなくなるおそれがある。
【００５０】
この実施の形態の分析装置本体１００では、傾斜角度θを１０°〜４５°の範囲の任意の角度に固定しており、回転駆動手段１０７であるモータ１０４や、レーザー光源１０５、フォトディテクタ１０６も傾斜を持つ軸心１０２と平行に取り付けられているが、傾斜角度θを任意の角度に調整でき、モータ１０４や、レーザー光源１０５、フォトディテクタ１０６も追従して角度が変更される構成にすることで、分析用デバイス１の仕様や、分析用デバイス１内の移送プロセスに応じて、最適な傾斜角度を設定することができる。ここで傾斜角度θを任意の角度に調整できる構成の場合は、傾斜角度θの範囲は０°〜４５°が望ましく、重力の影響を受けたくない場合には傾斜角度を０°、すなわち分析用デバイス保持部材１０３を水平にして回転させることができる。
【００５１】
図７〜図１３は分析用デバイス１の詳細を示している。
図７は分析用デバイス１の希釈ユニット開封部を示す。
図７（ａ）は開封ボタン６の取り付け位置を示す平面図、図７（ｂ）は図７（ａ）のＡ−Ａ断面図を示す。
【００５２】
希釈液収容室５の開封および排出は、図７（ｂ）に示すようにカバー基板４に接合された開封ボタン６の中心部を下方向から押し上げることで、ピン８が希釈液収容室５の表面に貼られているアルミシール１０を突き破り、希釈液収容室５が開封される。さらに、希釈液収容室５が開封された状態で分析用デバイス１を回転させると、希釈液収容室５内の希釈液は、開封孔７と排出孔９の間に形成された空間（ベース基板３とカバー基板４の間に形成された排出溝、およびカバー基板４と開封ボタン６の間に形成された空間）を経由して希釈液定量室１４に排出される。
【００５３】
図８（ａ）は分析用デバイス１の注入口周辺の拡大斜視図、図８（ｂ）はその正面図である。図９は図２に示したベース基板３の前記カバー基板４との接合面の平面図を示す。
分析用デバイス１は、注入口１１に試料液を付着させることで、試料液を内部に形成された試料収容室１７の毛細管力によって吸引させることができるため、指先などから血液を直接採取することができる。ここで注入口１１は、分析用デバイス１本体の一側面より軸心１０２の方向に突出した形状をしているため、注入口１１以外の場所に指などが接触して血液が付着し、分析時に付着した血液が外部に飛散するのを防ぐという効果を有している。
【００５４】
また、試料収容室１７の側面に、厚み方向の断面寸法が試料収容室１７よりも大きく、大気と連通しているキャビティ１２，１３を設けている。キャビティ１２，１３を設けることで、試料収容室１７内を流れる試料液は、側面部が先行して流れる毛管流ではなく、中央部が先行して流れる毛管流となって充填されるため、複数回に分けて充填させる場合でも、試料収容室１７に保持されている試料液と後から採取した試料液の中央部同士が先に接触するように流れて行き、試料収容室１７内の空気を側面のキャビティ１２，１３に排出しながら充填されていく。そのため、注入口１１に付着させる試料液の量が採取途中で不足したり、採取の途中に注入口１１から指先などが離れてしまったりした場合でも、試料収容室１７内への採取が完了するまで何度でも採取することができる。ここでは、試料収容室１７の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍ、キャビティ１２，１３の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、試料収容室１７は毛細管力で試料液を採取できる寸法、キャビティ１２，１３は毛細管力で試料液が移送されない寸法であれば特に制限はない。
【００５５】
図１０に示すＡＡ−ＡＡ，Ｂ−Ｂ，Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ，Ｅ−Ｅの各位置の断面の拡大図を図１１（ａ）〜（ｅ）に示す。
２０ａ，２０ｂ１，２０ｂ２，２０ｃ，２０ｄ，２０ｅ，２０ｆ，２０ｇ，２０ｈ，２０ｉは空気孔である。また、親水処理が施されている親水処理位置５６を図１２にハッチングで示す。
【００５６】
次に、本発明の実施の形態における分析用デバイスのマイクロチャネル構成、および溶液の移送プロセスについて詳細に説明する。
図１３は分析用デバイス１の構造をブロック図で表示したもので、分析用デバイス１の内部には、試料液を採取するための試料液採取部１５０と、試料液を希釈する希釈液を保持するための希釈液保持部１５１と、試料液採取部１５０から移送される試料液を保持し、溶液成分と固体成分とに遠心分離した後、所定量の固体成分を含む試料液を採取するための分離部１５２と、希釈液保持部１５１から移送される希釈液を計量するための希釈液計量部１５３と、分離部１５２から移送される試料液と希釈液計量部１５３から移送される希釈液を保持し、内部で混合した後、分析に必要な量に混合溶液を計量するための混合部１５４と、混合部１５４から移送される混合溶液を分析試薬と反応させて測定するための測定部１５５が形成されている。
【００５７】
試料液採取部１５０は、図９に示すように試料液を採取するための注入口１１と、注入口１１を通じて試料液を毛細管力で採取し規定量だけ保持する試料収容室１７と、試料液採取時に試料収容室１７内の空気を排出するためのキャビティ１２，１３とで構成されている。
【００５８】
希釈液保持部１５１は、図９に示すように希釈液収容室５内に希釈液が保持されており、図７で説明した開封動作によって希釈液が展開される。
分離部１５２は、試料液採取部１５０の下手側で図９に示すように、キャビティ１２を介して試料収容室１７と連通するように形成されて試料収容室１７から遠心力によって移送される試料液を保持して遠心力によって試料液を溶液成分と固体成分とに分離する分離室１８と、分離室１８と希釈液計量部１５３との間に形成されて分離室１８で分離された固体成分の一部が移送されて保持する高比重成分定量室２３と、高比重成分定量室２３と分離室１８とを連結して分離室１８内の試料液を移送するための連結流路２１と、分離室１８と希釈液計量部１５３との間に形成されて連結流路２１内で分離された試料液の溶液成分を優先的に保持して固体成分だけを高比重成分定量室２３に移送させる試料溶液溢流室２２と、分離された分離室１８内の溶液成分が高比重成分定量室２３に移送されるのを抑制するための分離室１８内に形成された毛細管キャビティ１９と、分離室１８を境に高比重成分定量室２３と反対側に形成されて分離室１８や連結流路２１、試料溶液溢流室２２内の分析に必要ない試料液を排出するための連結流路２４と、連結流路２４を介して移送される不必要な試料液を保持するための試料溶液溢流室２５，２６とで構成される。
【００５９】
ここで連結流路２１、試料溶液溢流室２２、高比重成分定量室２３、連結流路２４、毛細管キャビティ１９、試料溶液溢流室２６の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力で試料液を移送できる寸法であれば特に制限はない。また、分離室１８、試料溶液溢流室２５の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な試料液の量に応じて調整可能である。
【００６０】
希釈液計量部１５３は、図９に示すように、希釈液保持部１５１の下手側に形成されて希釈液収容室５から遠心力によって移送される希釈液を規定量だけ保持するための希釈液定量室１４と、希釈液定量室１４と分離部１５２との間に形成されて希釈液定量室１４で計量された希釈液を前記混合部１５４へ移送するためのサイフォン流路１５と、希釈液定量室１４を境にサイフォン流路１５と反対側に形成されて希釈液定量室１４へ移送される希釈液が所定量を越えた際に希釈液定量室１４外へ溢流させるための溢流流路１６と、希釈液定量室１４で保持される液面高さを規定して溢流流路１６を経由して希釈液が溢流される溢流キャビティ２７と、溢流された希釈液を保持して光学測定手段１０９の光学調整用のリファレンス測定に使用される希釈液溢流室２９と、希釈液溢流室２９内に保持された希釈液が逆流して別のエリアに流出するのを防ぐための毛細管部２８とで構成される。
【００６１】
ここでサイフォン流路１５、溢流流路１６、毛細管部２８の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、希釈液定量室１４、溢流キャビティ２７、希釈液溢流室２９の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な試料液の量や吸光度を測定するための条件(光路長、測定波長等)に応じて調整可能である。
【００６２】
混合部１５４は、図９に示すように、分離部１５２と希釈液計量部１５３の下手側で高比重成分定量室２３およびサイフォン流路１５と連通するように形成されて高比重成分定量室２３から移送される試料液と希釈液定量室１４から移送される希釈液を保持して内部で混合する混合室３０と、混合中に混合溶液が混合室３０内に設けられた空気孔２０ｃから流出するのを防止するように形成されたリブ３１と、混合室３０に保持される混合溶液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて混合されて混合室３０から移送される混合溶液を保持する保持キャビティ３２と、保持キャビティ３２の下手側に形成されて保持キャビティ３２から遠心力によって移送される混合溶液を規定量だけ保持する混合溶液定量室３５と、保持キャビティ３２と溢流キャビティ２７との間に形成されて保持キャビティ３２へ移送される混合溶液が溢流キャビティ２７へ流出するのを抑制するための毛細管部３３と、保持キャビティ３２と混合溶液定量室３５との間に形成されて保持キャビティ３２へ移送される希釈溶液が混合溶液定量室３５へ流出するのを抑制するための連結流路３４と、混合溶液定量室３５と混合溶液定量室３５の下手側に位置する測定部１５５との間に形成されて混合溶液定量室３５で計量された混合溶液を測定部１５５へ移送するためのサイフォン流路３７と、混合溶液定量室３５と溢流キャビティ２７との間に形成されて混合溶液定量室３５へ移送される混合溶液が所定量を越えた際に混合溶液定量室３５外へ溢流させるための溢流流路３６とで構成される。
【００６３】
ここで毛細管部３３、連結流路３４、溢流流路３６、サイフォン流路３７の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、保持キャビティ３２、混合溶液定量室３５の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な混合溶液の量に応じて調整可能である。
【００６４】
測定部１５５は、図９に示すように、混合部１５４の下手側でサイフォン流路３７を介して混合溶液定量室３５と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と混合溶液定量室３５からサイフォン流路３７を介して移送される混合溶液を反応させて保持し第１の測定を行うための測定スポットである変性反応室３８と、測定スポットである免疫アッセイ室４３から見て操作キャビティであるこの変性反応室３８に保持される第１反応液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて、第１反応液の測定後に変性反応室３８内の第１反応液を採取する変性溶液定量室３９と、変性反応室３８と変性溶液定量室３９との間に形成されて変性反応室３８に戻る第１反応液の量を安定させるための毛細管キャビティ４０と、変性溶液定量室３９の下手側に形成されて変性溶液定量室３９に採取された第１反応液が免疫アッセイ室４３へ流出するのを抑制する連結流路４１と、変性溶液定量室３９と毛細管キャビティ４０との連結部に位置し、遠心力によって変性溶液定量室３９内の第１反応液を破断させて所定量の混合溶液を変性反応室３８に戻すリブ４２と、変性溶液定量室３９の下手側で連結流路４１を介して変性溶液定量室３９と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と変性溶液定量室３９から連結流路４１を介して移送される第１反応液を反応させて保持し第２の測定を行うための免疫アッセイ室４３と、測定スポットである凝集反応室４６から見て操作キャビティであるこの免疫アッセイ室４３に保持される免疫アッセイ溶液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて、免疫アッセイ溶液の測定後に免疫アッセイ室４３内の免疫アッセイ溶液を採取する免疫アッセイ定量室４４と、免疫アッセイ室４３と免疫アッセイ定量室４４との間に形成されて免疫アッセイ室４３に戻る免疫アッセイ溶液の量を安定させるための毛細管キャビティ６４と、免疫アッセイ定量室４４の下手側に形成されて免疫アッセイ定量室４４に採取された免疫アッセイ溶液６２が凝集反応室４６へ流出するのを抑制する連結流路４５と、免疫アッセイ定量室４４の下手側で連結流路４５を介して免疫アッセイ定量室４４と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と免疫アッセイ定量室４４から連結流路４５を介して移送される免疫アッセイ溶液を反応させて保持し第３の測定を行うための凝集反応室４６とで構成される。
【００６５】
ここで変性溶液定量室３９、毛細管キャビティ４０、連結流路４１、免疫アッセイ定量室４４、連結流路４５の厚み方向の断面寸法を５０〜５００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、変性反応室３８、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な混合溶液の量や吸光度を測定するための条件（光路長、測定波長、サンプル溶液の反応濃度、試薬の種類等）に応じて調整可能である。
【００６６】
次に、分析用デバイス１の試料液分析工程について、血液中の血球内に含まれるヘモグロビンおよびＨｂＡ１ｃの濃度測定を例として、詳細に説明する。
なお、図１４〜図２２は分析用デバイス保持部材１０３にセットされた分析用デバイス１を分析用デバイス保持部材１０３の表面側から見た状態で図示されており、軸心１０２に対して回転方向Ｃ１が図１における左回転、軸心１０２に対して回転方向Ｃ２が図１における右回転を示している。
【００６７】
図１４は、本発明の実施の形態における分析用デバイスの注入過程および分離／計量過程を示す。
− 工程１ −
図１４（ａ）において、試料液である血液は、穿刺された指先などから分析用デバイス１の注入口１１を介して試料収容室１７の毛細管力によって、試料収容室１７内が充填されるまで採取される。ここでは、試料収容室１７の隙と対向面積によって決まる体積によって試料液、例えば約１０μｌの血液を計量できる構成としているが、分析に必要な量に応じて試料収容室１７の形状寸法を規定し、採取できる容量を調整してもかまわない。
【００６８】
必要量の血液を採取した分析用デバイス１は、分析装置本体１００の分析用デバイス保持部材１０３上に装着され、希釈液収容室５の開封手段によって開封動作が行われる。
− 工程２ −
希釈液収容室５の開封が終了した後、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・３０００ｒｐｍ）させることで試料収容室１７の内の血液と希釈液は、図１４（ｂ）に示すように分離室１８へ移送され、希釈液収容室５内の希釈液は希釈液定量室１４へ移送される。ここで血液を希釈して血球中の測定成分を取り出す際に、個人差を有するヘマトクリット値（血液中に含まれる血球成分の比率）の影響による希釈のばらつきを低減させるために、分離室１８へ移送された血液を遠心力によって血漿成分と血球成分とに分離し、外周部の高ヘマトクリット血液を採取して希釈することで、希釈のばらつきを低減している。
【００６９】
また、この回転中に希釈液定量室１４に移送されて規定量を越えた希釈液は、溢流流路１６と、溢流キャビティ２７と、毛細管部２８を介して希釈液溢流室２９内に流れ込んで保持される。
【００７０】
図１５は、毛細管キャビティ１９を有している分離室１８における前記遠心分離動作と、高比重成分定量室２３を介して混合室３０への移送フローを示している。
図１５（ａ）に示すように分離室１８の底部に溜まった血液５７は、遠心力によって図１５（ｂ）に示すように血漿成分（低比重成分）５７ａと血球成分（高比重成分）５７ｂとに分離される。回転が停止して遠心力が無くなると、図１５（ｃ）に示すように、分離室１８における血漿成分５７ａは毛細管キャビティ１９に毛細管移送され、連結流路２１の血漿成分５７ａと血球成分５７ｂは、大気に連通した空気孔２０ａを有するキャビティ５８に接続されている試料溶液溢流室２２に向かって毛細管移送される。連結流路２４の血漿成分５７ａと血球成分５７ｂは大気に連通した空気孔２０ｄを有する試料溶液溢流室２６に向かって毛細管移送される。ここで高比重成分定量室２３の端部は、血球成分５７ｂが到達している位置で連結流路２１に接続されており、図１５（ｄ）に示すように、連結流路２１から必要量の血球成分５７ｂだけが高比重成分定量室２３の毛細管力によって移送される。
【００７１】
この実施の形態では分離室１８に毛細管キャビティ１９が形成されているため、分離室１８に残っている血漿成分５７ａの殆どを毛細管キャビティ１９で保持することができ、高比重成分定量室２３に必要量の血球成分５７ｂだけを毛細管移送するのに役立っている。具体的には、図１６（ａ）に示すように分離室１８に毛細管キャビティ１９を形成しない比較例の場合には、血漿成分５７ａが分離室１８の底部に溜まっており、高比重成分定量室２３の毛細管力によって毛細管移送されると、図１６（ｂ）に示すように分離室１８の底部に溜まっていた血漿成分５７ａが、連結流路２１から高比重成分定量室２３に向かって混入して、必要量の血球成分５７ｂを得ることができない。
【００７２】
他方の、希釈液定量室１４へ移送された希釈液は、保持される液面高さが溢流流路１６と溢流キャビティ２７の連結位置を超えると、溢流流路１６を経由して溢流キャビティ２７へ排出されるため、希釈液定量室１４内に規定量だけ保持される。ここでサイフォン流路１５は、溢流流路１６と溢流キャビティ２７の連結位置より半径方向の内方に配置される曲管を備えたサイフォン形状であるため、分析用デバイス１の回転中に希釈液を希釈液定量室１４内で保持することができる。
【００７３】
また、希釈液定量室１４と溢流キャビティ２７を連結する溢流流路１６が毛細管であるため、分析用デバイス１の減速および停止時に慣性力や表面張力によって希釈液定量室１４から溢流キャビティ２７へ希釈液が流出することを毛細管力によって防ぐことができ、希釈液の計量を精度よく行うことができる。
【００７４】
− 工程３ −
分析用デバイス保持部材１０３の前記回転（Ｃ２で示す右回転・３０００ｒｐｍ）を停止させて静止した後に、図１７（ａ）から分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、高比重成分定量室２３で保持されていた必要量の血球成分５７ｂと希釈液定量室１４の希釈液が混合室３０に流れ込んで混合されて希釈され、余分な血球成分５７ｂは図１７（ｂ）に示すように試料溶液溢流室２６に保持される。そして光学測定手段１０９は、分析用デバイス１の希釈液溢流室２９の希釈液が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行うリファレンス測定を実施する。このときには、レーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍと６２５ｎｍに切り換えてリファレンス測定している。
【００７５】
− 工程４ −
次に、分析用デバイス１を図１８（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して希釈液を攪拌する。
【００７６】
− 工程５ −
その後に、分析用デバイス１を図１８（ｂ）に示す１８０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して希釈液を攪拌する。
【００７７】
ここで混合室３０と保持キャビティ３２の間は連結部５９で連通されており、攪拌時におけるこの連結部５９の位置が、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について混合室３０に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の希釈液が保持キャビティ３２へ流出することがない。
【００７８】
− 工程６ −
次に、分析用デバイス１を図１９（ａ）に示す３００°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、混合室３０の希釈後の血球成分５７ｂ（混合溶液）を、連結部５９を介して保持キャビティ３２に揺動移送する。
【００７９】
ここで混合室３０に保持された混合溶液は、分析用デバイス１を図１９（ａ）に示す３００°付近の位置に移動させても、混合室３０の壁面に働く表面張力によって保持されており（表面張力が混合溶液に働く重力よりも大きいため）、分析用デバイス１を揺動させて混合溶液に慣性力を与えることで、混合室３０の壁面に働く表面張力を打ち破り、混合溶液に働く慣性力と重力によって混合溶液を保持キャビティ３２に移送可能としている。
【００８０】
− 工程７ −
次に、分析用デバイス１を分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、図１９（ｂ）に示すように保持キャビティ３２から連結流路３４を介して混合溶液定量室３５に規定量の混合溶液が移送される。混合溶液定量室３５へ移送される混合溶液が所定量を越えた分は溢流流路３６を介して溢流キャビティ２７へ溢流し、混合溶液定量室３５には規定量の混合溶液６０だけが保持される。
【００８１】
− 工程８ −
分析用デバイス保持部材１０３の前記回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）を停止させて静止することによって、図２０（ａ）に示すように混合溶液定量室３５の混合溶液がサイフォン流路３７に呼び水され、さらに図２０（ａ）から分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、混合溶液定量室３５に保持された規定量の混合溶液が、サイフォン流路３７を介して変性反応室３８に移送され、変性反応室３８に予め担持されている変性試薬を溶解する。
【００８２】
− 工程９ −
その後、図２０（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の変性反応室３８の変性溶液６１を攪拌する。
【００８３】
ここで変性反応室３８と免疫アッセイ室４３の側との間は、毛細管キャビティ４０と変性溶液定量室３９を介して連通されている。ここで毛細管キャビティ４０が第２の連結部として作用しており、攪拌時におけるこの毛細管キャビティ４０の位置が、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について変性反応室３８に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の混合溶液が免疫アッセイ室４３の側の変性溶液定量室３９へ流出することがない。
【００８４】
− 工程１０ −
次に、分析用デバイス１を静止させて変性溶液６１を変性反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第１測定を実施する。
【００８５】
第１測定は、レーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍに切り換えた発光状態において、分析用デバイス１の変性反応室３８の変性反応させた変性溶液６１を、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行う。演算部１１０は、第１測定によって得られた測定値を、予め希釈液溢流室２９をレーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍにして読み取った基準値に基づいて処理して数値化した変性ヘモグロビン濃度を表示部１１１に表示する。
【００８６】
混合溶液と変性反応室３８に保持された変性試薬との反応を行った後、変性反応室内に形成された測定領域においてヘモグロビン誘導体の濃度の測定を行うことにより、混合溶液もしくは変性溶液中の総ヘモグロビンの決定を行う。
なお、変性前に混合室３０において、ヘモグロビンのγピーク（ソーレ帯）の吸収を利用して、波長４１０ｎｍのＬＥＤの光源による比色度合いによるヘモグロビンの測定を行ってもよい。
【００８７】
ここで“変性”とは、たんぱく質の構造内から特異的な箇所を構造外へ出す（露出させる）ことをいい、後述する抗原抗体反応は、そのたんぱく質の構造内から露出された部位である“変性された部位”と特異的に反応するラテックス試薬によって行われる。
【００８８】
− 工程１１ −
次に、分析用デバイス１を図２１（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１５００ｒｐｍの周波数で制御することによって、変性反応室３８に保持された変性溶液６１が変性溶液定量室３９に毛細管移送されて、変性溶液定量室３９には規定量の変性溶液６１が保持される。
【００８９】
− 工程１２ −
次に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、変性溶液定量室３９から連結流路４１を介して免疫アッセイ室４３に変性溶液６１が流入し、免疫アッセイ室４３に予め担持されているラテックス試薬を溶解する。
【００９０】
− 工程１３ −
その後、図２１（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の免疫アッセイ室４３の免疫アッセイ溶液６２を攪拌する。前記免疫アッセイ室４３において、免疫アッセイ溶液は、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体を含む試薬（例えば、ラテックス試薬）により抗原抗体反応が行われる。
【００９１】
ここで免疫アッセイ室４３と凝集反応室４６の側との間は免疫アッセイ定量室４４を介して連通されており、免疫アッセイ室４３と免疫アッセイ定量室４４とを接続する毛細管キャビティ６４の攪拌時における位置を、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について免疫アッセイ室４３に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の混合溶液が凝集反応室４６の側の免疫アッセイ定量室４４へ流出することがない。
【００９２】
− 工程１４ −
次に、分析用デバイス１を静止させて免疫アッセイ溶液６２を抗原抗体反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第２測定を実施する。
【００９３】
第２測定は、レーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍに切り換えた発光状態において、ヘモグロビン誘導体の濃度を測定するのであるが、分析用デバイス１の免疫アッセイ室４３の抗原抗体反応した免疫アッセイ溶液６２が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行うことによりブランク測定が行われる。
【００９４】
− 工程１５ −
次に、分析用デバイス１を図２２（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１５００ｒｐｍの周波数で制御して免疫アッセイ溶液６２を免疫アッセイ定量室４４に毛細管移送する。
【００９５】
− 工程１６ −
その後、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、免疫アッセイ定量室４４に保持された規定量の免疫アッセイ溶液６２が、連結流路４５を介して凝集反応室４６に流入し、凝集反応室４６に担持されている凝集試薬を溶解する。
【００９６】
− 工程１７ −
その後、図２２（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の凝集反応室４６の凝集溶液６３を攪拌する。すると、凝集反応室４６においては、凝集剤が、前記抗体がヘモグロビン誘導体と結合していない未反応体と反応結合することにより、凝集が起きる。
【００９７】
− 工程１８ −
次に、分析用デバイス１を静止させて凝集溶液６３を凝集反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第３測定を実施する。
【００９８】
第３測定は、レーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍに切り換えた発光状態において、分析用デバイス１の凝集反応室４６の凝集反応した凝集溶液６３が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行い、凝集溶液６３の濁り度合いを測定する。
【００９９】
演算部１１０は、第２測定と第３測定によって得られた測定値を、希釈液溢流室２９をレーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍにして予め読み取ってある基準値に基づいて処理して数値化したＨｂＡ１ｃ濃度と、前記変性ヘモグロビン濃度を基に算出されるＨｂＡ１ｃ％値を表示部１１１に表示する。
【０１００】
また、本実施の形態では、光源はＬＥＤを利用しているが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、又、光源波長については比色測定において、ヘモグロビンの光吸収作用がある波長領域であればよく、４００〜４５０ｎｍの領域に光吸収作用があるγピーク（ソーレ吸収帯）や、５００〜５８０ｎｍの領域に吸収作用があるヘモグロビンやヘモグロビン誘導体の可視部の光吸収作用を利用することができる。濁度については、可視光領域であれば吸収はあるものの５００〜８００ｎｍが適している。
【０１０１】
図２３は上記の工程１〜工程１８に関して、図１３をより詳細に示したものである。
分析用デバイス１に保持された試薬について、ヘモグロビン誘導体の測定の場合を、より具体的に説明する。
【０１０２】
本発明の実施の形態である、ヘモグロビン誘導体の測定方法は、変性用の試薬（変性剤）により、前記試料中のヘモグロビン誘導体を変性させる工程を含む。
ヘモグロビン（以後、Ｈｂと記載する場合もあり）とは、α鎖と非α鎖（β、γ、δ鎖）のグロビンがヘムと結合し、会合して形成される四量体構造を基本とするものである。特に糖が結合したＨｂＡ１や、飲酒によるアセトアルデヒド化Ｈｂ、透析患者などで見られるカルバミル化Ｈｂなどその種類は多岐に亘る。このように、ヘモグロビン誘導体とは、前述したようなヘモグロビンの一部の領域が修飾され、構造が異なるものを意味し、ヘモグロビン誘導体の約９０％を占めるＨｂＡ（α２β２）、約３％のＨｂＡ２（α２δ２）、約１％のＨｂＦ（α２γ２）などがある。ＨｂＡにおいては、β鎖アミノ酸末端に糖が結合していないＨｂＡ０と、糖が結合したＨｂＡ１がある。さらに、前記ＨｂＡ１の中には、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃがあり、これらもヘモグロビン誘導体である。その中でも、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端に血液中の糖が結合したヘモグロビンＡ１ｃは、過去２〜３ヶ月間の血液中の糖濃度を反映する指標として、広く知られている。
【０１０３】
ヘモグロビン誘導体を決めるポイントとしては、ペプチド構造に特異な領域のアミノ酸配列があるか、もしくは、アミノ酸残基やペプチド末端がリン酸化もしくは糖化された領域が存在するかどうかである。例えば、ＨｂＡ１ａはβ鎖Ｎ末端がリン酸化されており、ＨｂＡ１ｂはβ鎖Ｎ末端がアルデヒド化されており、またＨｂＡ１ｃはβ鎖Ｎ末端がフルクトシル化されている。また、ＨｂＦは、サブユニットがβとγで異なる。アミノ酸単位の差では、ＨｂＡ２のβサブユニットのＮ末端から９残基目、２１残基目が異なる。本発明のヘモグロビン誘導体は、このような一部の領域が異なるものをいう。さらに、これら以外にも、ヘモグロビン誘導体には様々な種類があり、上述のアルコールの乱用によるアセトアルデヒド―ヘモグロビン付加物、尿毒症患者の血液中に存在する尿素―ヘモグロビン付加物、だけでなく、例えば、アスピリン−ヘモグロビンコンプレックスや、カルボキシメチル化ヘモグロビン等、多岐に亘る。ヘモグロビン誘導体としては、特に、ヘモグロビンタンパク上の反応性アミン基とグルコースとの非酵素反応によって生成する糖化ヘモグロビンが有用な測定項目として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
本発明で示すヘモグロビン誘導体を測定する上で、ヘモグロビン誘導体のわずかに異なる領域を区別・認識して、それぞれのヘモグロビン誘導体を同定・定量する必要がある。その異なる部分、すなわちヘモグロビン誘導体の特異的な箇所をタンパク質の構造内から構造外へ出すことを、本発明では変性という。
【０１０５】
変性の程度は、４次構造を構成するサブユニット構造が解離する程度、３次構造を構成する疎水結合、水素結合、ファンデールワールス力、イオン結合を解離する程度、２次構造を構成するα−へリックスやβシートの構造を変化させる程度、あるいは、直鎖状の構造になってもよい。一般的に、タンパク質は生体内で機能性物質として存在するが、それは、タンパク質がこれらの構造から形成される精密な立体構造を保っているからである。従って、構造を変化させるということは、少なからずタンパク質の機能が変わり、性質が変わったといえる。これは、機能が低下したことも向上したことも含む。これらを達成するための変性剤としては例えば、リチウム塩形態の陰イオンでヘモグロビンを変性させる方法（特開平３−５１７５９公報）、非イオン性界面活性剤を含む方法（ＷＯ２００６／１１２３３９）などがあるがこれらに限定されるものではない。
【０１０６】
本実施の形態における、免疫アッセイ用の試薬は、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体を含む試薬であり、本発明の免疫アッセイ抗原抗体反応を基本とした測定原理であればよく、一般的に知られている、免疫比濁法、免疫比朧法、ラテックス免疫凝集法、免疫凝集阻止法、ラテックス免疫凝集阻止法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、免疫クロマト法の、いずれであってもよい。
【０１０７】
本発明のヘモグロビン誘導体の測定方法において、とくに重要なのは、ヘモグロビン誘導体の糖化部位に対する特異的な抗体を利用した免疫アッセイである。糖化されたヘモグロビンとは、上記にも示したが、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃである。この中で、とくにＨｂＡ１ｃは、近年、三大成人病の一つとして問題になっている糖尿病患者を管理するための指標になるもので、１〜３ヶ月間の長期血糖コントロールの目安となるものである。具体的には、ＨｂＡ１ｃの変性処理を行った後、ＨｂＡ１ｃ特有のβ鎖Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたものに対する抗体を含む試薬を含むものである。
【０１０８】
本実施の形態における、凝集用の凝集剤とは、抗体と特異的に抗原抗体反応をする凝集多価抗原であるものであり、ヘモグロビン誘導体に特異的な箇所に対する抗体を使用して測定する免疫測定反応であれば、上記に限定しない。
【０１０９】
本発明の試薬の保持方法としては、液体状態、乾燥物状態、凍結乾燥物状態などに限定されるものではなく、実施上有意義な方法で保持できる。
次に、ヘモグロビン誘導体の代表的検査項目であるヘモグロビンＡ１ｃについて、下記の実施例１〜実施例８おいて、図２４〜図２８と（表１）〜（表６）を用いて、より具体的に説明する。
【０１１０】
（実施例１）
本発明の実施の一例として、ＨｂＡ１ｃラテックス凝集阻止法で検討した際の試薬組成について説明する。また本実施例において抗体はラテックスビーズに標識した状態で使用する。
（ａ）モノクローナル抗体の作成
免疫原の作製
ＨｂＡ１ｃの免疫原の作製については、以下のように実施した。まずＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端部位と同等の構造を作製する為に、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−システイン（以下ＶＨＬＴＣと省略）の配列でアミノ酸を結合され構成されるポリペプチドのバリンに、フルクトースを結合させることにより、フルクトシルＶＨＬＴＣを作製した。次に免疫原性を高めるために、フルクトシルＶＨＬＴＣのシステイン残基を介して、縮合試薬Ｎ−（６−Maleimidocaproyloxy）succinimideを使用して、チキンγグロブリン（以下ＣＧＧと省略）のアミノ基に標識し、この結果得られたフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧを免疫原とした。
【０１１１】
１．マウスの免疫
生後約８週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１０匹に対して、前述のように作製した免疫原（フルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧ）をエマルジョンにして、１匹当り腹腔内に１０μｇずつ注入した。この免疫作業は２週間おきに実施した。
【０１１２】
２．抗体産生のチェック
免疫を５回実施したマウスについて、眼静脈より５０〜１００μｌの血液を遠心管に採取した。血清を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ法による抗体価の評価を行ったところ、全てのマウスについて抗ＨｂＡ１ｃ抗体の産生が確認された。
【０１１３】
３．マウスのブースト
前述の抗体価の評価で、特に力価の高かったマウスについて、マウスの脾臓を肥大させるためにブースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧ１０μｇ分をＰＢＳで希釈した溶液を使用した。
【０１１４】
４．細胞融合
ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞と融合した。この融合細胞については、９６ウェルプレート上で１５％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％のＦＣＳを含むＨＴ培地と交換した。
【０１１５】
５．クローニング
ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定を行い、力価の高いウェルを選択した。
ウェルあたり１個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレートに分注した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清についてＥＬＩＳＡ法による抗体価測定を繰り返し、ＨｂＡ１ｃに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞群を最終的に選別した。
【０１１６】
６．細胞の凍結保存
最終的に選別された細胞は、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で−８０℃で凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１１７】
７．抗体の評価
得られた細胞を、マウス腹腔内に注入する一般的な手法により、腹水を作製し、ｐｒｏｔｅｉｎＡセファロースゲルを充填したカラムにより抗体を精製した。このようにして得られた抗体について、ＥＬＩＳＡプレートにコートしたヒトヘモグロビンＡ１ｃに対する上記各抗体の結合を阻害するフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧの半値（インヒビションの半値）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号（国際寄託）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号株由来のモノクローナル抗体 は２×１０−１０Ｍである。
（ｂ）ラテックス試薬
積水化学工業（株）製の０.１５μｍのポリスチレンラテックスを用い、室温にて２時間攪拌を行うことにより前記精製抗体を物理吸着法にて標識を行った。その後、０．５％ＢＳＡ(シグマ・アルドリッチ社製)／ＰＢＳ懸濁液中にてブロッキングを行い、その後遠心分離法によって未標識抗体の分離・洗浄を行い、再び０．５％ＢＳＡ(シグマ・アルドリッチ社製)／ＰＢＳ懸濁液中で再懸濁を行うことにより抗体のラテックス試薬とした。
（ｃ）凝集試薬
凝集試薬は、コバス試薬ＨｂＡ１ｃ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）の凝集試薬（合成多価ＨｂＡ１ｃ抗原）を利用した。
（ｄ）変性試薬
非イオン性界面活性剤を含む方法であり（ＷＯ２００６／１１２３３９）を参考に下記の組成を決定した。
【０１１８】
１．スクロース・モノカプレート（和光純薬製）／反応時濃度０．２５％
２．フェリシアン化カリウム（和光純薬製）／反応時濃度０．２５％
（ｅ）希釈液
希釈液は一般的なイオン交換法にて調整された純水を用いた。
【０１１９】
（実施例２）
以下に、ヘモグロビン濃度測定について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法
分析用デバイスは本実施の形態１の分析用デバイスに、実施例１に示したラテックス試薬、凝集試薬、変性試薬をそれぞれ、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６、変性反応室３８に凍結乾燥により担持することにより作成した。
（ｂ）混合溶液の調製
試料溶液（血液）は、人から採血した血液を純水を用いて、希釈することにより調整した。
【０１２０】
混合用液のＨｂ濃度の測定は、和光純薬工業株式会社より販売されている『ヘモグロビンＢ−テストワコー』を使用して濃度決定を行った。これはＳＬＳ−ヘモグロビン法によりヘモグロビンを検出する方法である。
（ｃ）分析用デバイスによるＨｂ測定
試薬を担持した分析用デバイスを用いて、混合室３０の上部に注入穴をドリルにより形成し、直接混合溶液を注入した後、注入工をシールした。その後分析用デバイス１を分析装置本体１００にセットし、実施例１に記載したとおり混合室３０から変性反応室３８への移送を行い、変性試薬と１分反応させたときの５３５ｎｍの吸光度値を検出した。
【０１２１】
図２４は、横軸に混合液のヘモグロビン濃度、縦軸には吸光度をプロットしたものである。結果、本方法により、Ｈｂ濃度と吸光度の値が、Ｈｂ濃度が、０〜５０．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、比例関係になるので、Ｈｂ濃度に応じたＨｂ測定が十分可能であることが示唆された。
【０１２２】
（実施例３）
以下に、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）測定について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法・・・実施例２に記載したとおり
（ｂ）混合溶液の調整
ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社より市販されているコバス試薬糖化ヘモグロビン同封の２４．６μＭの糖化ヘモグロビン標準液を、純水により希釈することにより、既知の糖化ヘモグロビン濃度の混合液を調整した。
（ｃ）分析用デバイスによる糖化ヘモグロビン測定
試薬を担持した分析用デバイスを用いて、混合室３０上部に注入穴をドリルにより形成し、直接に混合溶液を注入した後、注入工をシールした。その後分析用デバイス１を分析装置本体１００にセットし、実施例１に記載したとおり混合室３０から変性反応室３８への移送を行い、その移送の各工程において、変性反応室３８で変性試薬と混合溶液を１分反応を行い、免疫アッセイ室４３ではラテックス試薬と２分させた際のラテックスブランク（濁度）を６２５ｎｍで測定、最後に凝集反応させた際の凝集濁度（濁度）を６２５ｎｍで測定を行った。ラテックスブランクからの凝集濁度の変化量を算出した。
【０１２３】
図２５は、横軸に糖化ヘモグロビン濃度、縦軸に吸光度変化量をプロットした図である。なお、糖化ヘモグロビン濃度をモルからｍｇ／ｄｌにするには、ヘモグロビン分子量を６４５００として計算を行った。結果、本法により、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．１〜１０．０ｍｇ／ｄｌの範囲（より好ましくは、０．２〜４．０ｍｇ／ｄｌ）で、ほぼ比例関係になっているので、糖化ヘモグロビンの測定が十分可能であることが示唆された。
【０１２４】
（実施例４）
以下に、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比を測定する方法について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法・・・実施例２に記載のとおり
（ｂ）試料溶液の調整
試料溶液は、全血を３種類用いた。また（表１）は、その血液検体を糖化ヘモグロビン測定に広く用いられているＨＰＬＣ法を原理とした東ソー社の自動糖化ヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ）にて、糖化ヘモグロビン（％）を測定した結果である。
【０１２５】
【表１】
（ｃ）分析用デバイスによる測定
分析用デバイス１の試料収容室に前記３種類の血液試料と希釈液をそれぞれ注入し、分析装置本体１００にセットし、液体を移送し、５３５ｎｍでのヘモグロビン誘導体の吸光度と、６２５ｎｍでの濁度を測定することにより、ラテックスブランク及び、凝集度合いを吸光度により測定した。ヘモグロビン濃度の決定は、測定吸光度により実施例２のヘモグロビン濃度プロットより図２４から変性溶液３８に含まれるヘモグロビン濃度を算出した。また糖化ヘモグロビン濃度の決定は、濁度の変化量から、図２５から凝集溶液６３に含まれる糖化ヘモグロビン濃度を算出した。その結果を（表２）に示す。
【０１２６】
【表２】
（表２）によれば、本分析用デバイス１により糖化ヘモグロビンの占める割合を測定した結果は、あらかじめ東ソー社の自動糖化ヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７３２ＧＨｂＶ）にて、糖化ヘモグロビンの占める割合を測定した結果（（表１）参照）と非常に近く、本分析用デバイス１によって正確な糖化ヘモグロビン濃度の測定が可能であることが確認された。
【０１２７】
（実施例５）
以下に、希釈液の定量について、検討した結果を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成
希釈液は、保存時の蒸発を再現するため、希釈液は３００μｌデバイスに保持させた状態で、２ヶ月４℃、１５℃、２５℃、４５℃環境で保存した分析用デバイスに、実施例１に示した試薬ラテックス試薬、凝集試薬、変性試薬をそれぞれ、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６、変性反応室３８に凍結乾燥により担持し分析用デバイスとした。今回は比較のため、希釈液定量室１４に連結したサイフォン流路の変わりに、混合室３０と直接連結させたものを準備し、これを比較例とした（図示せず）。
【０１２８】
分析結果
実施例２の方法で作成した分析用デバイス１に検体試料を注入し、実施例４に基づいて、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比測定の測定を行った。各測定結果のＨｂ値と糖化ヘモグロビン値を図２６に示し、（表３）には糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比の再現性について示している。
【０１２９】
【表３】
希釈定量を行ったものは、Ｈｂ濃度が、１３．０〜１７．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、ＨｂＡ１ｃ濃度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．６〜０．８ｍｇ／ｄｌの範囲となっている。一方、希釈定量を行わなかったものは、Ｈｂ濃度が、１０．０〜２２．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、ＨｂＡ１ｃ濃度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．４〜１．０ｍｇ／ｄｌの範囲となり、希釈定量を行わなかったものに比べ、Ｈｂ値のばらつきが小さくなった。さらには、希釈定量を行わなかったものは測定ＣＶ値が４．８％であったものが、希釈定量を行うと２．４％となり、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比の再現性がよくなっていることが確認された。
【０１３０】
（実施例６）
以下に、試料溶液と各試薬との反応前において、試料溶液の分離工程の有効性について検討した実施例を詳細に記す。
【０１３１】
分析用デバイスの作成については、実施例２に記載のとおり行った。
同一検体（糖化ヘモグロビン４．８％）の血漿量を変えることにより、Ｈｂ濃度が４．０ｍｇ／ｄｌ、７．１ｍｇ／ｄｌ、１３．７ｍｇ／ｄｌ、２０．９ｍｇ／ｄｌのそれぞれ異なる試料血液４種類（検体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を調製し、これを用いて行った。各Ｈｂ濃度については、シスメックスＫＸ−２１で検定を行った。検定値と分離工程の有無による混合溶液中のＨｂ濃度を（表４）（表５）（表６）に示す。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
【表５】
【０１３４】
【表６】
まず、分離工程なしの場合には（表４）に示すように、検体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの混合溶液のＨｂ濃度は、それぞれ、７．８ｍｇ／ｄｌ、１４．１ｍｇ／ｄｌ、２７．４ｍｇ／ｄｌ、４１．６ｍｇ／ｄｌとなり、ＨｂＡ１ｃ濃度は（表５）に示すように、それぞれ、０．３０ｍｇ／ｄｌ、０．７２ｍｇ／ｄｌ、１．３４ｍｇ／ｄｌ、２．００ｍｇ／ｄｌとなることから、ＨｂＡ１ｃ／Ｈｂ存在比は（表６）に示すように、それぞれ、３．８％、５．１％、４．８％となった。
【０１３５】
一方、本実施例の分離工程を有する場合には、検体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの混合溶液のＨｂ濃度は（表４）に示すように、それぞれ１２．５ｍｇ／ｄｌ、２８．４ｍｇ／ｄｌ、３６．１ｍｇ／ｄｌ、４５．３ｍｇ／ｄｌとなり、ＨｂＡ１ｃ濃度は（表５）に示すように、それぞれ０．６０ｍｇ／ｄｌ、１．３９ｍｇ／ｄｌ、１．７３ｍｇ／ｄｌ、２．１３ｍｇ／ｄｌとなることから、ＨｂＡ１ｃ／Ｈｂ存在比は（表６）に示すように、それぞれ４．８％、４．９％、４．８％、４．７％となった。
【０１３６】
このことから、分離工程を有する場合の方が、分離工程なしの場合と比べて、当初の混合溶液の糖化ヘモグロビン濃度４．８％にほぼ近い値になり、高精度の結果が得られることがわかる。
【０１３７】
これは、極端にＨｂ濃度の低い検体Ａや検体Ｂであっても、本実施例のような分離工程を行うことによって濃縮が可能になり濃度が高く維持できるので、濃度が低い場合における測定系に与える悪影響を抑制でき、その結果、分離工程なしの場合の測定できなかった検体のＨｂ／糖化ヘモグロビンの存在比の正確な測定が可能になったものと推測される。
【０１３８】
（実施例７）
図２７は、０．１２μｍ〜０．８μｍのラテックス粒子について、遠心前の濁度と４５Ｇ〜１８０Ｇでそれぞれ５分間遠心した後の濁度の変化割合を日本分光（顕微分光光度計 ＭＳＶ３５０）により測定した結果である。０．８μｍより大きいラテックス粒子は遠心力による沈降の影響を大きく受けて濁度が減少している。その影響度合いは、粒径に大きく依存することが分る。これは、凝集後のラテックス平均粒径についても同様である。
【０１３９】
ここで、濁度の変化量は、
濁度変化量（％）＝（ 遠心後の濁度 ／ 遠心前の濁度 ）×１００
で算出される。
【０１４０】
（実施例８）
図２８は抗体を感作した粒径０．１５ｎｍのラテックス粒子を凝集反応させた後の平均粒径を粒度分布計（シスメック（株）ゼータサイザーナノ）を用いて測定した結果を示している。この結果から、反応後、３分での凝集物の平均粒径は、凝集前のラテックス粒径の２倍以内に収まる。また、好ましくはラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多状態の凝集反応では、経時的な平均粒径の増加がなく、凝集反応の粒径制御がより厳密に行うことができる。さらに、図２７より凝集物の平均粒径については、７００ｎｍ以下であれば、２００Ｇ以下の遠心力で測定時間１分とした場合の吸光度への影響は２％以下であり高精度測定が可能となる。
【０１４１】
このように、本発明の分析用デバイスを用いた分析方法によれば、希釈液の定量および混合溶液の定量が確実に行える工程を設け、さらに微量な前記試料溶液を血漿成分（低比重成分）と血球成分（高比重成分）とに確実にする前記分離工程を備え、さらには測定時の移送シーケンスや分析用デバイスの流路パターンを簡略化できることから、免疫反応等の凝集阻止反応を利用した、比色もしくは比濁測定が高精度に行えることになり、特に、ヘモグロビン誘導体（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ）の濃度を高精度に測定できる。
【０１４２】
また、血液の分離機構により、全血中のヘモグロビン濃度の個人差を低減することにより、様々な検体の測定を可能にし、かつ測定精度が向上する。
さらに、オペレータの手技の影響を受けることなく、分析用デバイス内で簡便かつ迅速な血液成分の測定を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明は、特に、簡単かつ迅速なヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析の自動測定に使用する分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明の実施の形態において分析用デバイスを分析装置本体にセットした状態の要部斜視図
【図２】同実施の形態の分析用デバイスの分解斜視図
【図３】同実施の形態の分析装置本体の外観図
【図４】同実施の形態の分析装置本体の構成図
【図５】同実施の形態の分析装置本体の断面図
【図６】同実施の形態における分析用デバイスの回転停止位置を示す図
【図７】同実施の形態における分析用デバイスの希釈ユニット開封部の平面図と断面図
【図８】同実施の形態における分析用デバイスの注入口周辺の拡大斜視図とその正面図
【図９】同実施の形態における分析用デバイスのマイクロチャネル構成を示す平面図
【図１０】同実施の形態における分析用デバイスの断面位置を示す平面図
【図１１】同実施の形態における分析用デバイスの各部の断面図
【図１２】同実施の形態における分析用デバイスの親水処理位置を示す平面図
【図１３】同実施の形態における分析用デバイスの構成図
【図１４】同実施の形態における分析用デバイスの注入および分離／計量過程の説明図
【図１５】同実施の形態における毛細管キャビティ１９を有した分離室１８の説明図
【図１６】毛細管キャビティ１９を有していない比較例の分離室１８の作用説明図
【図１７】同実施の形態における分析用デバイスの計量過程および混合過程の説明図
【図１８】同実施の形態における分析用デバイスの混合過程の説明図
【図１９】同実施の形態における分析用デバイスの混合溶液移送と計量過程の説明図
【図２０】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２１】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２２】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２３】同実施の形態における分析用デバイスの詳細な構成図
【図２４】実施例２におけるヘモグロビン濃度と吸光度との関係図
【図２５】実施例３におけるＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度変化量との関係図
【図２６】実施例５における希釈定量の有無による混合溶液中のＨｂ値と糖化ヘモグロビン値の関係図
【図２７】実施例７におけるラテックス粒子の遠心前と遠心後の濁度の変化の関係図
【図２８】実施例８における抗体を感作したラテックス粒子を凝集反応させた後の平均粒径の経時的な平均粒径の変化図
【図２９】従来技術におけるヘモグロビン比濁測定カセットを示した要部断面図
【図３０】従来技術におけるマイクロデバイスを示した平面図
【符号の説明】
【０１４５】
１ 分析用デバイス
２ 保護キャップ
３ ベース基板
４ カバー基板
５ 希釈液収容室
６ 開封ボタン
７ 開封孔
８ ピン
９ 排出孔
１０ アルミシール
１１ 注入口
１２，１３ キャビティ
１４ 希釈液定量室
１５ サイフォン流路
１６ 溢流流路
１７ 試料収容室
１８ 分離室
１９ 毛細管キャビティ
２０ａ，２０ｂ１，２０ｂ２，２０ｃ〜２０ｉ 空気孔
２１，２４ 連結流路
２２ 試料溶液溢流室
２３ 高比重成分定量室
２５，２６ 試料溶液溢流室
２７ 溢流キャビティ
２８ 毛細管部
２９ 希釈液溢流室
３０ 混合室
３１ リブ
３２ 保持キャビティ
３３ 毛細管部
３４ 連結流路
３５ 混合溶液定量室
３６ 溢流流路
３７ サイフォン流路
３８ 変性反応室（測定スポット）
３９ 変性溶液定量室
４０ 毛細管キャビティ
４１ 連結流路
４２ リブ
４３ 免疫アッセイ室（測定スポット）
４４ 免疫アッセイ定量室
４５ 連結流路
４６ 凝集反応室（測定スポット）
５６ 親水処理位置
５７ 血液（試料液）
５７ａ 血漿成分
５７ｂ 血球成分
５８ キャビティ
５９ 連結部
６０ 混合溶液
６１ 変性溶液
６２ 免疫アッセイ溶液
６３ 凝集溶液
６４ 毛細管キャビティ
１００ 分析装置本体
１０１ 蓋
１０２ 軸心
１０３ 分析用デバイス保持部材
１０４ モータ
１０５ レーザー光源
１０６ フォトディテクタ
１０７ 回転駆動手段
１０８ 制御手段
１０９ 光学測定手段
１１０ 演算部
１１１ 表示部
１５０ 試料液採取部
１５１ 希釈液保持部
１５２ 分離部
１５３ 希釈液計量部
１５４ 混合部
１５５ 測定部
Ｃ１ 左回転
Ｃ２ 右回転
θ 傾斜角度
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析用デバイスに試料液をセットして分析装置本体にセットし、分析装置本体が分析用デバイスから前記試料液の成分を自動で読み取る分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、１台の装置により血液等の生物学的試料と分析試薬と反応させ、生物学的試料中の様々な成分を定量可能な大型の自動分析装置が実用化されており、医療分野においては無くてはならない存在となっている。しかしながら、すべての病院においてそのような装置が導入されているわけではなく、特に診療所等の小規模な医療機関においては、運用コスト等の様々な理由により、試料の分析を外部委託するという形態をとる病院も少なくない。分析を外部委託する形態をとる場合、分析結果を得るまでに時間を要し、その結果、患者は検査結果に基づく適切な治療を受けるために、必然的に再来院を余儀なくされるという不便さや、急患等の緊急を要する場合の迅速対応が難しい等の問題がある。
【０００３】
そのような背景の中、市場からは、低コスト、試料液の少量化、装置の小型化、短時間測定、多項目同時測定など、より高精度で、運用の自由度が高い分析装置の登場が望まれている。
【０００４】
運用の自由度の高い分析装置を実現するためには、例えば、指先採血等で採取される少量の検体から複数種の成分濃度を短時間で高精度に測定できるという条件を満たすことが一つの理想形であろう。しかしながら、指先採血等でストレス無く得られる検体量は、せいぜい十数マイクロリットル程度であり、そのような少量の検体をそのままを分析するのでは前述の条件、特に複数種の成分分析を高精度に行うことは、技術的に難しい。
【０００５】
この課題に対する解決策の一つとして、分析システムを高感度化し、少量の検体を希釈液により希釈することにより、その容量を増加させた上で、特定の成分を分析するという方法がある。又、微量検体の対策のためだけでなく、任意の物質濃度が高い場合や分析装置の都合等の理由によっても、希釈液がよく利用される。
【０００６】
近年、各種疾病の進行度合いを検査したい項目の１つとして、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度が挙げられる。ヘモグロビン誘導体の一つである糖化ヘモグロビンは、食事による血糖値変動の影響を排除した通常時の血糖レベルの判定が可能なこともあって、生活習慣病の早期発見のためによく測定される項目である。糖化ヘモグロビンはヘモグロビンＡ１ｃとも呼ばれ、赤血球の中に含まれるヘモグロビンにブドウ糖が結合したものであり、ヘモグロビンに対して糖化ヘモグロビンが存在する比率（％）で、数値化される。糖化ヘモグロビンの一般的な測定方法としては、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法、免疫法、ホウ酸アフィニティー法などが挙げられる。またその中でも、免疫法は、ヘモグロビンＡ１ｃが存在する比率を測定するためには、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃを個別に測定する必要がある。
【０００７】
ヘモグロビンの測定は、ヘモグロビン特有の光吸収特性を利用して、４１５ｎｍ近傍の波長もしくは５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法が一般的である。５４０ｎｍ近傍の波長で測定する方法としては、シアンメトヘモグロビン法やＳＬＳヘモグロビン法が広く知られている。
【０００８】
また、糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）を免疫法で測定するためには、最初に、血液試料を溶血させることによって、赤血球からヘモグロビンを外に取り出し、次にヘモグロビンが非糖化ヘモグロビンであるか糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ）であるかを判別するために、ヘモグロビンの立体構造を変化させることによって、ヘモグロビンタンパクの糖化された部分をその立体構造の中から外に露出させる処理が必要である。これを、ヘモグロビンの変性と呼ぶが、さらに、糖化された部分を特異的に認識する抗体と反応させることによって、免疫学的に糖化ヘモグロビン量（ヘモグロビンＡ１ｃ）を測定することが可能となる。
【０００９】
なお、生物学的流体を光学的に分析する方法としては、糖化ヘモグロビンの分析用デバイスとしては非遠心性および非毛細管性の操作による逐次的反応試験実施用の反応カセットが知られている。
【００１０】
図２９は、技術文献１で公開されている生物学的流体の分析に使われるヘモグロビン比濁測定カセットを示したものであり、毛細管形状の試料液の注入手段により注入された試料液と、液体試薬（希釈液）を組み入れた液体供給手段により注入された液体試薬（希釈液）を反応路４０５内で混合し、あらかじめ試薬の担持された試薬帯４０１，４０２、４０３に混合液を移送され、反応工程の後、液体混合物の検出可能な応答を測定するにより分析が行われる。より具体的には、装置４００を所定の角度傾けることにより、重力を利用しながら流体の制御をすることが可能で、液体試料を、酸化剤４０１、変性剤７０（液体供給貯留器４０４内にあり）、抗体粒子４０２、および凝集剤４０３と順次混合させ、混合溶液中の凝集応答を比濁度を測定することにより、種々の生物化学的な分析を行える。
【００１１】
また、生物学的流体を光学的に分析する方法として、その他の先行技術文献情報としては、液体流路を形成したマイクロデバイスを用いて分析する、例えば特許文献２が知られている。
【００１２】
図３０は技術文献２で公開されている生物学的流体の分析に使われるマイクロデバイスを示したものであり、流体流路を形成したマイクロデバイス２４６は、回転装置を使って遠心力を利用しながら流体の制御をすることが可能で、サンプル溶液の計量、流体成分の遠心による分離、分離された流体成分の移送分配等を行えるため、種々の生物化学的な分析を行える。
【００１３】
より具体的には、回転装置２００は、試料入口ポート２５０を有する試料受容容器２４８と、希釈剤が含まれている希釈剤室２５２とを有し、マイクロデバイス２４６の回転２１８による遠心力を利用して、試料液と希釈剤の両方を混合室２０５に移送し、マイクロデバイス２４６の回転と減速により混合され、一定時間経過すると、濃縮された試料液中の細胞成分が、収容混合室２５４の半径方向外周に形成されている細胞保持範囲２０６である分離室に収容される。その後、この細胞成分を含む液体は、流れ制限通路２６２を経て分留室２６０に移送され、ここでさらにマイクロデバイス２４６の回転と減速により、細胞成分を含む液体の細胞成分がより濃縮され、分留室２６０の半径方向の外側に形成されている細胞保持範囲２１１で保持される。一方、細胞のない液体は分配通路２６４内および分析室２６８の光学キュベット内へ移送され、ここで特定の分析が行われる。さらに、試料液は血液であり、細胞成分は血球成分である場合、混合室２５４と分留室２６０とにより、血球成分を分離し取り除いた血漿成分を効果的に抽出分配できる。
【００１４】
このように、液状試験試料中に存在する分析対象物の量を測定するための分析方法としては、分析試薬との分析反応を包含し、分光測定法を用いて分析する方法が知られおり、これを用いた分析反応容器もしくは装置などの専用の器具は、ピペットの使用や、液状試験試料と分析試薬との混合および加温放置のような、多数の煩雑な操作段階を必要とするイムノアッセイを実施するのに、特に有用であり、又、これら専用器具を検査場所まで搬送する必要もなく、その場での迅速測定が可能である。
【特許文献１】特開平３−４６５６６号公報
【特許文献２】特表平５−５０８７０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、特許文献１では、必要な反応液量も多くデバイスの小型化が難しいという課題がある。また非遠心で行うため定量機構がなく、希釈液の保存期間中などに希釈液が保存容器外へ自然蒸発するなどにより、前記希釈液が減少する現象が発生する。その際、反応液量が変わり測定精度が悪化するという課題を有している。
【００１６】
また、特許文献２では、遠心力を利用した定量および、測定技術を有しているものの、ラテックス試薬を利用した凝集反応を利用するような反応では、測定時に発生した凝集物が遠心力により沈降が発生して、正確な測定ができないという課題を有している。
【００１７】
本発明は、簡単かつ迅速に、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析を自動測定させることができる分析デバイス用分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の請求項１記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させ、これを凝集試薬によって凝集処理して前記反応液を作成し、この反応液に前記分析用デバイスの回転中にアクセスして測定することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項２記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬の粒径平均値が０．３μｍ以下であることを特徴とする。
本発明の請求項３記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多であることを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項４記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記ラテックス試薬と前記凝集試薬による反応後３分以内の凝集物粒径の平均値が７００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項５記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記抗体が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号から産出されるモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項６記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項４において、前記凝集物にかかる測定中の遠心力が２００Ｇ以下であることを特徴とする。
本発明の請求項７記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記免疫反応が前記試料液と分析用デバイス内で計量された希釈液とを混合した混合溶液に対してラテックス試薬を反応させていることを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項８記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項７において、前記試料液が血液であり、前記血液中の血球成分を遠心力によって濃縮した後、濃縮された血球成分を含む血液を一定量採取して前記希釈液と混合させることを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項９記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項７において、前記混合溶液を更に計量してから前記ラテックス試薬と反応させることを特徴とする。
本発明の請求項１０記載の分析用デバイスを用いた分析方法は、請求項１において、前記試料液中の特定成分が前記ラテックス試薬と免疫反応できるように前記試料液を変性試薬によって変性させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
この構成によると、簡単かつ迅速に、ヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析を自動測定させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の分析用デバイスを用いた分析方法を、具体的な実施の形態に基づいて説明する。
この実施の形態では分析用デバイス１の構成について説明する。
【００２７】
図１は、本発明の実施の形態における分析用デバイス１を分析装置本体の分析用デバイス保持部材１０３の上にセットした状態を示し、図２は分析用デバイス１の前記分析用デバイス保持部材１０３と接触している面を上側にして分解した状態を示している。
【００２８】
分析用デバイス１は、試料液飛散防止用の保護キャップ２と、ベース基板３の表面を覆うカバー基板４と、希釈液を保持している希釈液収容室５と、ベース基板３の上面に形成されている数個の凹部のうちの一つの凹部５０にセットされた希釈液収容室５内の希釈液を排出するための開封ボタン６とを合わせた５つの部品で構成されている。
【００２９】
なお、この分析用デバイスの形状は、扇形状や、立方体形状やその他の形状のものでもよく、又、これらの分析用デバイス１を複数個同時に、分析用デバイス保持部材１０３へ装着してもかまわない。
【００３０】
ベース基板３とカバー基板４は、希釈液収容室５などを内部にセットした状態で接合され、この接合された状態のものに保護キャップ２が取り付けられている。また。開封ボタン６は、カバーに形成された開封孔７の位置を中心に接合される。
【００３１】
ベース基板３の上面に形成されている数個の凹部の開口をカバー基板４で覆うことによって、後述の複数の収容エリア（後述の測定スポットと同じ）とその収容エリアの間を接続する流路などが形成される（図２を参照）。収容エリアのうちの必要なものには各種の分析に必要な試薬が予め担持されている。
【００３２】
この分析用デバイス１は、注入口１１から試料液、例えば血液などの溶液を採取することができ、保護キャップ１を閉めて分析装置本体１００の分析用デバイス保持部材１０３にセットすることで、試料液の成分分析を行うことができる。１０２は分析用デバイス保持部材１０３の回転中の軸心を示している。
【００３３】
分析用デバイス１は、注入口１１から内部に取り込んだ試料液、注入口１１よりも内周にある前記軸心１０２を中心に分析用デバイス１を回転させて発生する遠心力と、分析用デバイス１内に設けられた毛細管流路の毛細管力を用いて、分析用デバイス１の内部で溶液を移送していくように構成されており、保護キャップ２は注入口１１の付近に付着した試料液が、分析中に遠心力によって外部へ飛散するのを防止するために取り付けられている。
【００３４】
分析用デバイス１を構成する部品に材料としては、材料コストが安価で量産性に優れる樹脂材料が望ましい。前記分析装置本体１００は、分析用デバイス１を透過した光を測定する光学的測定方法によって試料液の分析を行うため、ベース基板３およびカバー基板４の材料としては、ＰＣ、ＰＭＭＡ、ＡＳ、ＭＳなどの透明性の高い樹脂が望ましい。
【００３５】
また、希釈液収容室５の材料としては、希釈液収容室５の内部に希釈液を長期間封入しておく必要があるため、ＰＰ、ＰＥなどの水分透過率の低い結晶性樹脂が望ましい。開封ボタン６については、希釈液収容室５の開封時に変形させて用いるため、弾性変形しやすいＰＰなどの結晶性樹脂が望ましい。保護キャップ２の材料としては、成形性のよい材料であれば特に問題がなく、ＰＰ、ＰＥなどの安価な樹脂が望ましい。
【００３６】
ベース基板３とカバー４との接合は、前記収容エリアに担持された試薬の反応活性に影響を与えにくい方が望ましく、接合時に反応性のガスや溶剤が出にくい超音波溶着やレーザー溶着などが好ましい。
【００３７】
また、ベース基板４とカバー基板３との接合によって両基板３，４の間の微少な隙間による毛細管力によって溶液を移送させる部分には、毛細管力を高めるための親水処理が行われており、これにより粘性抵抗を減らし流体移動をしやすくなる。具体的には、親水性材料を用いたり、親水性ポリマーや界面活性剤などを用いた親水処理が行われている。また、シリカゲルの如き親性粉末などの親水化剤を添加させて材料表面に親水性を付与させたりしてもかまわない。また、親水性処理の方法としては、プラズマ、コロナ、オゾン、フッ素等の活性ガスを用いた表面処理方法や、界面活性剤による表面処理が挙げられる。ここで親水性とは水との接触角が９０°未満のことをいい、より好ましくは接触角４０°未満である。
【００３８】
図３〜図６は、分析用デバイス１がセットされる分析装置本体１００を示す。
図３において、分析用デバイス１は、分析装置本体１００の前記軸心１０２を中心に回転する分析用デバイス保持部材１０３の上に、ベース基板３とカバー基板４のうちカバー基板４の側を下にして装着され、蓋１０１を閉じた状態で分析が行われる。
【００３９】
図４と図５に示すように、この分析装置本体１００は、分析用デバイス保持部材１０３を回転させるための回転起動手段１０７と、分析用デバイス１内の溶液を光学的に測定するための光学測定手段１０９と、分析用デバイス保持部材１０３の回転速度や回転方向、および光学的に測定するための光学測定手段１０９と、分析用デバイス保持部材１０３の回転速度や回転方向、および光学測定手段１０９の測定タイミングなどを制御する制御手段１０８と、光学測定手段１０９によって得られた信号を処理し測定結果を演算するための演算部１１０と、演算部１１０で得られた結果を表示するための表示部１１１とで構成される。
【００４０】
回転駆動手段１０７は、分析用デバイス保持部材１０３を介して分析用デバイス１を軸心１０２の回りに任意の方向に所定の回転速度で回転させるだけでなく、所定の停止位置で軸心１０２を中心に所定の振幅範囲、周期で左右に往復運動をさせて分析用デバイス１を揺動させることができるように構成されている。ここでは回転駆動手段１０７としてモータ１０４を使用して分析用デバイス保持部材１０３を軸心１０２の周りに回転させている。軸心１０２は、この軸心１０２上の所定位置を中心に傾斜角度θ°だけ傾斜して回転自在に取り付けられている。
【００４１】
なお、ここでは分析用デバイス１の回転動作と揺動動作を１つの回転駆動手段１０７で行おうとしているが、回転駆動手段１０７の負荷を軽減させるために、揺動作用の駆動手段を別に設けてもかまわない。具体的には、分析用デバイス保持部材１０３の上にセットした分析用デバイス１に対して、前記モータ１０４とは別に用意したバイブレーションモータなどの加震手段を、直接または間接的に接触させることによって分析用デバイス１を揺動させて、分析用デバイス１内の溶液に慣性力を付与する。
【００４２】
光学測定手段１０９には、分析用デバイス１の測定部にレーザー光を照射するためのレーザー光源１０５と、レーザー光源１０５から照射されたレーザー光のうち、分析用デバイス１を通過した透過光の光量を検出するフォトディテクタ１０６とを備えている。ここではレーザー光源１０５は出射光の波長を切り替え可能なものを使用し、フォトディテクタ１０６はレーザー光源１０５の出射光の何れの波長の光も検出できるものを使用している。分析用デバイス保持部材１０３が透過性に劣る材料または透過性でない材料の場合には、分析用デバイス保持部材１０３の分析用デバイス１の装着位置には、孔５１，５２が穿接されている。
【００４３】
なお、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６は、測定に必要な波長の種類に応じた複数対だけ設けることもできる。
また、分析装置本体１００には、分析用デバイス１内の希釈液収容室５を自動で開封するための開封手段、具体的には、分析用デバイス保持部材１０３にセットされた分析用デバイス１の開封ボタン６を操作できるように、分析用デバイス保持部材１０３に上下運動ができるアームを設け、開封ボタン６を前記アームによって押し上げる機構を設けてもかまわない。
【００４４】
分析用デバイス保持部材１０３は、図５に示すように傾斜した軸心１０２に取り付けられて水平線に対して傾斜角度θ°だけ傾斜しており、分析用デバイス１の回転停止位置に応じて、分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の方向を制御できる。
【００４５】
具体的には、図６（ａ）に示す位置（真上を０°（３６０°）として表現した場合に１８０°付近の位置）で分析用デバイス１を停止させた場合は、分析用デバイス１の下側５３が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は外周方向（下側５３）に向かって重力を受ける。
【００４６】
また、図６（ｂ）に示す６０°付近の位置で分析用デバイス１を停止させた場合は、分析用デバイス１の左上側５４が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は左上方向に向かって重力を受ける。同様に、図６（ｃ）に示す３００°付近の位置では、分析用デバイス１の右上側５５が正面から見て下側に向くため、分析用デバイス１内の溶液は右上方向に向かって重力を受ける。
【００４７】
このように、軸心１０２に傾斜を設け、任意の位置に分析用デバイス１を停止させることで、分析用デバイス１内の溶液を所定の方向に移送させるための駆動力の１つとして利用できる。
【００４８】
分析用デバイス１内の溶液にかかる重力の大きさは、軸心１０２の傾斜角度θを調整することで設定することができ、移送する液量と、分析用デバイス１内の壁面に付着する力との関係に応じて設定することが望ましい。
【００４９】
傾斜角度θは、１０°〜４５°の範囲が望ましく、傾斜角度θが１０°より小さいと溶液にかかる重力が小さすぎて移送に必要な駆動力が得られないおそれがあり、傾斜角度θが４５°より大きくなると軸心１０２への負荷が増大したり、遠心力で移送させた溶液が自重で勝手に動いて制御できなくなるおそれがある。
【００５０】
この実施の形態の分析装置本体１００では、傾斜角度θを１０°〜４５°の範囲の任意の角度に固定しており、回転駆動手段１０７であるモータ１０４や、レーザー光源１０５、フォトディテクタ１０６も傾斜を持つ軸心１０２と平行に取り付けられているが、傾斜角度θを任意の角度に調整でき、モータ１０４や、レーザー光源１０５、フォトディテクタ１０６も追従して角度が変更される構成にすることで、分析用デバイス１の仕様や、分析用デバイス１内の移送プロセスに応じて、最適な傾斜角度を設定することができる。ここで傾斜角度θを任意の角度に調整できる構成の場合は、傾斜角度θの範囲は０°〜４５°が望ましく、重力の影響を受けたくない場合には傾斜角度を０°、すなわち分析用デバイス保持部材１０３を水平にして回転させることができる。
【００５１】
図７〜図１３は分析用デバイス１の詳細を示している。
図７は分析用デバイス１の希釈ユニット開封部を示す。
図７（ａ）は開封ボタン６の取り付け位置を示す平面図、図７（ｂ）は図７（ａ）のＡ−Ａ断面図を示す。
【００５２】
希釈液収容室５の開封および排出は、図７（ｂ）に示すようにカバー基板４に接合された開封ボタン６の中心部を下方向から押し上げることで、ピン８が希釈液収容室５の表面に貼られているアルミシール１０を突き破り、希釈液収容室５が開封される。さらに、希釈液収容室５が開封された状態で分析用デバイス１を回転させると、希釈液収容室５内の希釈液は、開封孔７と排出孔９の間に形成された空間（ベース基板３とカバー基板４の間に形成された排出溝、およびカバー基板４と開封ボタン６の間に形成された空間）を経由して希釈液定量室１４に排出される。
【００５３】
図８（ａ）は分析用デバイス１の注入口周辺の拡大斜視図、図８（ｂ）はその正面図である。図９は図２に示したベース基板３の前記カバー基板４との接合面の平面図を示す。
分析用デバイス１は、注入口１１に試料液を付着させることで、試料液を内部に形成された試料収容室１７の毛細管力によって吸引させることができるため、指先などから血液を直接採取することができる。ここで注入口１１は、分析用デバイス１本体の一側面より軸心１０２の方向に突出した形状をしているため、注入口１１以外の場所に指などが接触して血液が付着し、分析時に付着した血液が外部に飛散するのを防ぐという効果を有している。
【００５４】
また、試料収容室１７の側面に、厚み方向の断面寸法が試料収容室１７よりも大きく、大気と連通しているキャビティ１２，１３を設けている。キャビティ１２，１３を設けることで、試料収容室１７内を流れる試料液は、側面部が先行して流れる毛管流ではなく、中央部が先行して流れる毛管流となって充填されるため、複数回に分けて充填させる場合でも、試料収容室１７に保持されている試料液と後から採取した試料液の中央部同士が先に接触するように流れて行き、試料収容室１７内の空気を側面のキャビティ１２，１３に排出しながら充填されていく。そのため、注入口１１に付着させる試料液の量が採取途中で不足したり、採取の途中に注入口１１から指先などが離れてしまったりした場合でも、試料収容室１７内への採取が完了するまで何度でも採取することができる。ここでは、試料収容室１７の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍ、キャビティ１２，１３の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、試料収容室１７は毛細管力で試料液を採取できる寸法、キャビティ１２，１３は毛細管力で試料液が移送されない寸法であれば特に制限はない。
【００５５】
図１０に示すＡＡ−ＡＡ，Ｂ−Ｂ，Ｃ−Ｃ，Ｄ−Ｄ，Ｅ−Ｅの各位置の断面の拡大図を図１１（ａ）〜（ｅ）に示す。
２０ａ，２０ｂ１，２０ｂ２，２０ｃ，２０ｄ，２０ｅ，２０ｆ，２０ｇ，２０ｈ，２０ｉは空気孔である。また、親水処理が施されている親水処理位置５６を図１２にハッチングで示す。
【００５６】
次に、本発明の実施の形態における分析用デバイスのマイクロチャネル構成、および溶液の移送プロセスについて詳細に説明する。
図１３は分析用デバイス１の構造をブロック図で表示したもので、分析用デバイス１の内部には、試料液を採取するための試料液採取部１５０と、試料液を希釈する希釈液を保持するための希釈液保持部１５１と、試料液採取部１５０から移送される試料液を保持し、溶液成分と固体成分とに遠心分離した後、所定量の固体成分を含む試料液を採取するための分離部１５２と、希釈液保持部１５１から移送される希釈液を計量するための希釈液計量部１５３と、分離部１５２から移送される試料液と希釈液計量部１５３から移送される希釈液を保持し、内部で混合した後、分析に必要な量に混合溶液を計量するための混合部１５４と、混合部１５４から移送される混合溶液を分析試薬と反応させて測定するための測定部１５５が形成されている。
【００５７】
試料液採取部１５０は、図９に示すように試料液を採取するための注入口１１と、注入口１１を通じて試料液を毛細管力で採取し規定量だけ保持する試料収容室１７と、試料液採取時に試料収容室１７内の空気を排出するためのキャビティ１２，１３とで構成されている。
【００５８】
希釈液保持部１５１は、図９に示すように希釈液収容室５内に希釈液が保持されており、図７で説明した開封動作によって希釈液が展開される。
分離部１５２は、試料液採取部１５０の下手側で図９に示すように、キャビティ１２を介して試料収容室１７と連通するように形成されて試料収容室１７から遠心力によって移送される試料液を保持して遠心力によって試料液を溶液成分と固体成分とに分離する分離室１８と、分離室１８と希釈液計量部１５３との間に形成されて分離室１８で分離された固体成分の一部が移送されて保持する高比重成分定量室２３と、高比重成分定量室２３と分離室１８とを連結して分離室１８内の試料液を移送するための連結流路２１と、分離室１８と希釈液計量部１５３との間に形成されて連結流路２１内で分離された試料液の溶液成分を優先的に保持して固体成分だけを高比重成分定量室２３に移送させる試料溶液溢流室２２と、分離された分離室１８内の溶液成分が高比重成分定量室２３に移送されるのを抑制するための分離室１８内に形成された毛細管キャビティ１９と、分離室１８を境に高比重成分定量室２３と反対側に形成されて分離室１８や連結流路２１、試料溶液溢流室２２内の分析に必要ない試料液を排出するための連結流路２４と、連結流路２４を介して移送される不必要な試料液を保持するための試料溶液溢流室２５，２６とで構成される。
【００５９】
ここで連結流路２１、試料溶液溢流室２２、高比重成分定量室２３、連結流路２４、毛細管キャビティ１９、試料溶液溢流室２６の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力で試料液を移送できる寸法であれば特に制限はない。また、分離室１８、試料溶液溢流室２５の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な試料液の量に応じて調整可能である。
【００６０】
希釈液計量部１５３は、図９に示すように、希釈液保持部１５１の下手側に形成されて希釈液収容室５から遠心力によって移送される希釈液を規定量だけ保持するための希釈液定量室１４と、希釈液定量室１４と分離部１５２との間に形成されて希釈液定量室１４で計量された希釈液を前記混合部１５４へ移送するためのサイフォン流路１５と、希釈液定量室１４を境にサイフォン流路１５と反対側に形成されて希釈液定量室１４へ移送される希釈液が所定量を越えた際に希釈液定量室１４外へ溢流させるための溢流流路１６と、希釈液定量室１４で保持される液面高さを規定して溢流流路１６を経由して希釈液が溢流される溢流キャビティ２７と、溢流された希釈液を保持して光学測定手段１０９の光学調整用のリファレンス測定に使用される希釈液溢流室２９と、希釈液溢流室２９内に保持された希釈液が逆流して別のエリアに流出するのを防ぐための毛細管部２８とで構成される。
【００６１】
ここでサイフォン流路１５、溢流流路１６、毛細管部２８の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、希釈液定量室１４、溢流キャビティ２７、希釈液溢流室２９の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な試料液の量や吸光度を測定するための条件(光路長、測定波長等)に応じて調整可能である。
【００６２】
混合部１５４は、図９に示すように、分離部１５２と希釈液計量部１５３の下手側で高比重成分定量室２３およびサイフォン流路１５と連通するように形成されて高比重成分定量室２３から移送される試料液と希釈液定量室１４から移送される希釈液を保持して内部で混合する混合室３０と、混合中に混合溶液が混合室３０内に設けられた空気孔２０ｃから流出するのを防止するように形成されたリブ３１と、混合室３０に保持される混合溶液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて混合されて混合室３０から移送される混合溶液を保持する保持キャビティ３２と、保持キャビティ３２の下手側に形成されて保持キャビティ３２から遠心力によって移送される混合溶液を規定量だけ保持する混合溶液定量室３５と、保持キャビティ３２と溢流キャビティ２７との間に形成されて保持キャビティ３２へ移送される混合溶液が溢流キャビティ２７へ流出するのを抑制するための毛細管部３３と、保持キャビティ３２と混合溶液定量室３５との間に形成されて保持キャビティ３２へ移送される希釈溶液が混合溶液定量室３５へ流出するのを抑制するための連結流路３４と、混合溶液定量室３５と混合溶液定量室３５の下手側に位置する測定部１５５との間に形成されて混合溶液定量室３５で計量された混合溶液を測定部１５５へ移送するためのサイフォン流路３７と、混合溶液定量室３５と溢流キャビティ２７との間に形成されて混合溶液定量室３５へ移送される混合溶液が所定量を越えた際に混合溶液定量室３５外へ溢流させるための溢流流路３６とで構成される。
【００６３】
ここで毛細管部３３、連結流路３４、溢流流路３６、サイフォン流路３７の厚み方向の断面寸法を５０〜３００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、保持キャビティ３２、混合溶液定量室３５の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な混合溶液の量に応じて調整可能である。
【００６４】
測定部１５５は、図９に示すように、混合部１５４の下手側でサイフォン流路３７を介して混合溶液定量室３５と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と混合溶液定量室３５からサイフォン流路３７を介して移送される混合溶液を反応させて保持し第１の測定を行うための測定スポットである変性反応室３８と、測定スポットである免疫アッセイ室４３から見て操作キャビティであるこの変性反応室３８に保持される第１反応液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて、第１反応液の測定後に変性反応室３８内の第１反応液を採取する変性溶液定量室３９と、変性反応室３８と変性溶液定量室３９との間に形成されて変性反応室３８に戻る第１反応液の量を安定させるための毛細管キャビティ４０と、変性溶液定量室３９の下手側に形成されて変性溶液定量室３９に採取された第１反応液が免疫アッセイ室４３へ流出するのを抑制する連結流路４１と、変性溶液定量室３９と毛細管キャビティ４０との連結部に位置し、遠心力によって変性溶液定量室３９内の第１反応液を破断させて所定量の混合溶液を変性反応室３８に戻すリブ４２と、変性溶液定量室３９の下手側で連結流路４１を介して変性溶液定量室３９と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と変性溶液定量室３９から連結流路４１を介して移送される第１反応液を反応させて保持し第２の測定を行うための免疫アッセイ室４３と、測定スポットである凝集反応室４６から見て操作キャビティであるこの免疫アッセイ室４３に保持される免疫アッセイ溶液の軸心１０２方向に対する液面高さよりも内側に形成されて、免疫アッセイ溶液の測定後に免疫アッセイ室４３内の免疫アッセイ溶液を採取する免疫アッセイ定量室４４と、免疫アッセイ室４３と免疫アッセイ定量室４４との間に形成されて免疫アッセイ室４３に戻る免疫アッセイ溶液の量を安定させるための毛細管キャビティ６４と、免疫アッセイ定量室４４の下手側に形成されて免疫アッセイ定量室４４に採取された免疫アッセイ溶液６２が凝集反応室４６へ流出するのを抑制する連結流路４５と、免疫アッセイ定量室４４の下手側で連結流路４５を介して免疫アッセイ定量室４４と連通するように形成されて内部に担持されている試薬と免疫アッセイ定量室４４から連結流路４５を介して移送される免疫アッセイ溶液を反応させて保持し第３の測定を行うための凝集反応室４６とで構成される。
【００６５】
ここで変性溶液定量室３９、毛細管キャビティ４０、連結流路４１、免疫アッセイ定量室４４、連結流路４５の厚み方向の断面寸法を５０〜５００μｍで構成しているが、毛細管力が働く寸法であれば特に制限はない。また、変性反応室３８、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６の厚み方向の断面寸法を１０００〜３０００μｍで構成しているが、必要な混合溶液の量や吸光度を測定するための条件（光路長、測定波長、サンプル溶液の反応濃度、試薬の種類等）に応じて調整可能である。
【００６６】
次に、分析用デバイス１の試料液分析工程について、血液中の血球内に含まれるヘモグロビンおよびＨｂＡ１ｃの濃度測定を例として、詳細に説明する。
なお、図１４〜図２２は分析用デバイス保持部材１０３にセットされた分析用デバイス１を分析用デバイス保持部材１０３の表面側から見た状態で図示されており、軸心１０２に対して回転方向Ｃ１が図１における左回転、軸心１０２に対して回転方向Ｃ２が図１における右回転を示している。
【００６７】
図１４は、本発明の実施の形態における分析用デバイスの注入過程および分離／計量過程を示す。
− 工程１ −
図１４（ａ）において、試料液である血液は、穿刺された指先などから分析用デバイス１の注入口１１を介して試料収容室１７の毛細管力によって、試料収容室１７内が充填されるまで採取される。ここでは、試料収容室１７の隙と対向面積によって決まる体積によって試料液、例えば約１０μｌの血液を計量できる構成としているが、分析に必要な量に応じて試料収容室１７の形状寸法を規定し、採取できる容量を調整してもかまわない。
【００６８】
必要量の血液を採取した分析用デバイス１は、分析装置本体１００の分析用デバイス保持部材１０３上に装着され、希釈液収容室５の開封手段によって開封動作が行われる。
− 工程２ −
希釈液収容室５の開封が終了した後、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・３０００ｒｐｍ）させることで試料収容室１７の内の血液と希釈液は、図１４（ｂ）に示すように分離室１８へ移送され、希釈液収容室５内の希釈液は希釈液定量室１４へ移送される。ここで血液を希釈して血球中の測定成分を取り出す際に、個人差を有するヘマトクリット値（血液中に含まれる血球成分の比率）の影響による希釈のばらつきを低減させるために、分離室１８へ移送された血液を遠心力によって血漿成分と血球成分とに分離し、外周部の高ヘマトクリット血液を採取して希釈することで、希釈のばらつきを低減している。
【００６９】
また、この回転中に希釈液定量室１４に移送されて規定量を越えた希釈液は、溢流流路１６と、溢流キャビティ２７と、毛細管部２８を介して希釈液溢流室２９内に流れ込んで保持される。
【００７０】
図１５は、毛細管キャビティ１９を有している分離室１８における前記遠心分離動作と、高比重成分定量室２３を介して混合室３０への移送フローを示している。
図１５（ａ）に示すように分離室１８の底部に溜まった血液５７は、遠心力によって図１５（ｂ）に示すように血漿成分（低比重成分）５７ａと血球成分（高比重成分）５７ｂとに分離される。回転が停止して遠心力が無くなると、図１５（ｃ）に示すように、分離室１８における血漿成分５７ａは毛細管キャビティ１９に毛細管移送され、連結流路２１の血漿成分５７ａと血球成分５７ｂは、大気に連通した空気孔２０ａを有するキャビティ５８に接続されている試料溶液溢流室２２に向かって毛細管移送される。連結流路２４の血漿成分５７ａと血球成分５７ｂは大気に連通した空気孔２０ｄを有する試料溶液溢流室２６に向かって毛細管移送される。ここで高比重成分定量室２３の端部は、血球成分５７ｂが到達している位置で連結流路２１に接続されており、図１５（ｄ）に示すように、連結流路２１から必要量の血球成分５７ｂだけが高比重成分定量室２３の毛細管力によって移送される。
【００７１】
この実施の形態では分離室１８に毛細管キャビティ１９が形成されているため、分離室１８に残っている血漿成分５７ａの殆どを毛細管キャビティ１９で保持することができ、高比重成分定量室２３に必要量の血球成分５７ｂだけを毛細管移送するのに役立っている。具体的には、図１６（ａ）に示すように分離室１８に毛細管キャビティ１９を形成しない比較例の場合には、血漿成分５７ａが分離室１８の底部に溜まっており、高比重成分定量室２３の毛細管力によって毛細管移送されると、図１６（ｂ）に示すように分離室１８の底部に溜まっていた血漿成分５７ａが、連結流路２１から高比重成分定量室２３に向かって混入して、必要量の血球成分５７ｂを得ることができない。
【００７２】
他方の、希釈液定量室１４へ移送された希釈液は、保持される液面高さが溢流流路１６と溢流キャビティ２７の連結位置を超えると、溢流流路１６を経由して溢流キャビティ２７へ排出されるため、希釈液定量室１４内に規定量だけ保持される。ここでサイフォン流路１５は、溢流流路１６と溢流キャビティ２７の連結位置より半径方向の内方に配置される曲管を備えたサイフォン形状であるため、分析用デバイス１の回転中に希釈液を希釈液定量室１４内で保持することができる。
【００７３】
また、希釈液定量室１４と溢流キャビティ２７を連結する溢流流路１６が毛細管であるため、分析用デバイス１の減速および停止時に慣性力や表面張力によって希釈液定量室１４から溢流キャビティ２７へ希釈液が流出することを毛細管力によって防ぐことができ、希釈液の計量を精度よく行うことができる。
【００７４】
− 工程３ −
分析用デバイス保持部材１０３の前記回転（Ｃ２で示す右回転・３０００ｒｐｍ）を停止させて静止した後に、図１７（ａ）から分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、高比重成分定量室２３で保持されていた必要量の血球成分５７ｂと希釈液定量室１４の希釈液が混合室３０に流れ込んで混合されて希釈され、余分な血球成分５７ｂは図１７（ｂ）に示すように試料溶液溢流室２６に保持される。そして光学測定手段１０９は、分析用デバイス１の希釈液溢流室２９の希釈液が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行うリファレンス測定を実施する。このときには、レーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍと６２５ｎｍに切り換えてリファレンス測定している。
【００７５】
− 工程４ −
次に、分析用デバイス１を図１８（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して希釈液を攪拌する。
【００７６】
− 工程５ −
その後に、分析用デバイス１を図１８（ｂ）に示す１８０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して希釈液を攪拌する。
【００７７】
ここで混合室３０と保持キャビティ３２の間は連結部５９で連通されており、攪拌時におけるこの連結部５９の位置が、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について混合室３０に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の希釈液が保持キャビティ３２へ流出することがない。
【００７８】
− 工程６ −
次に、分析用デバイス１を図１９（ａ）に示す３００°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、混合室３０の希釈後の血球成分５７ｂ（混合溶液）を、連結部５９を介して保持キャビティ３２に揺動移送する。
【００７９】
ここで混合室３０に保持された混合溶液は、分析用デバイス１を図１９（ａ）に示す３００°付近の位置に移動させても、混合室３０の壁面に働く表面張力によって保持されており（表面張力が混合溶液に働く重力よりも大きいため）、分析用デバイス１を揺動させて混合溶液に慣性力を与えることで、混合室３０の壁面に働く表面張力を打ち破り、混合溶液に働く慣性力と重力によって混合溶液を保持キャビティ３２に移送可能としている。
【００８０】
− 工程７ −
次に、分析用デバイス１を分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、図１９（ｂ）に示すように保持キャビティ３２から連結流路３４を介して混合溶液定量室３５に規定量の混合溶液が移送される。混合溶液定量室３５へ移送される混合溶液が所定量を越えた分は溢流流路３６を介して溢流キャビティ２７へ溢流し、混合溶液定量室３５には規定量の混合溶液６０だけが保持される。
【００８１】
− 工程８ −
分析用デバイス保持部材１０３の前記回転（Ｃ２で示す右回転・２０００ｒｐｍ）を停止させて静止することによって、図２０（ａ）に示すように混合溶液定量室３５の混合溶液がサイフォン流路３７に呼び水され、さらに図２０（ａ）から分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、混合溶液定量室３５に保持された規定量の混合溶液が、サイフォン流路３７を介して変性反応室３８に移送され、変性反応室３８に予め担持されている変性試薬を溶解する。
【００８２】
− 工程９ −
その後、図２０（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の変性反応室３８の変性溶液６１を攪拌する。
【００８３】
ここで変性反応室３８と免疫アッセイ室４３の側との間は、毛細管キャビティ４０と変性溶液定量室３９を介して連通されている。ここで毛細管キャビティ４０が第２の連結部として作用しており、攪拌時におけるこの毛細管キャビティ４０の位置が、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について変性反応室３８に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の混合溶液が免疫アッセイ室４３の側の変性溶液定量室３９へ流出することがない。
【００８４】
− 工程１０ −
次に、分析用デバイス１を静止させて変性溶液６１を変性反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第１測定を実施する。
【００８５】
第１測定は、レーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍに切り換えた発光状態において、分析用デバイス１の変性反応室３８の変性反応させた変性溶液６１を、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行う。演算部１１０は、第１測定によって得られた測定値を、予め希釈液溢流室２９をレーザー光源１０５の波長を５３５ｎｍにして読み取った基準値に基づいて処理して数値化した変性ヘモグロビン濃度を表示部１１１に表示する。
【００８６】
混合溶液と変性反応室３８に保持された変性試薬との反応を行った後、変性反応室内に形成された測定領域においてヘモグロビン誘導体の濃度の測定を行うことにより、混合溶液もしくは変性溶液中の総ヘモグロビンの決定を行う。
なお、変性前に混合室３０において、ヘモグロビンのγピーク（ソーレ帯）の吸収を利用して、波長４１０ｎｍのＬＥＤの光源による比色度合いによるヘモグロビンの測定を行ってもよい。
【００８７】
ここで“変性”とは、たんぱく質の構造内から特異的な箇所を構造外へ出す（露出させる）ことをいい、後述する抗原抗体反応は、そのたんぱく質の構造内から露出された部位である“変性された部位”と特異的に反応するラテックス試薬によって行われる。
【００８８】
− 工程１１ −
次に、分析用デバイス１を図２１（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１５００ｒｐｍの周波数で制御することによって、変性反応室３８に保持された変性溶液６１が変性溶液定量室３９に毛細管移送されて、変性溶液定量室３９には規定量の変性溶液６１が保持される。
【００８９】
− 工程１２ −
次に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、変性溶液定量室３９から連結流路４１を介して免疫アッセイ室４３に変性溶液６１が流入し、免疫アッセイ室４３に予め担持されているラテックス試薬を溶解する。
【００９０】
− 工程１３ −
その後、図２１（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の免疫アッセイ室４３の免疫アッセイ溶液６２を攪拌する。前記免疫アッセイ室４３において、免疫アッセイ溶液は、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体を含む試薬（例えば、ラテックス試薬）により抗原抗体反応が行われる。
【００９１】
ここで免疫アッセイ室４３と凝集反応室４６の側との間は免疫アッセイ定量室４４を介して連通されており、免疫アッセイ室４３と免疫アッセイ定量室４４とを接続する毛細管キャビティ６４の攪拌時における位置を、遠心力を発生させる回転の軸心１０２について免疫アッセイ室４３に保持された混合溶液の液面よりも内周側に位置させたため、攪拌混合中の混合溶液が凝集反応室４６の側の免疫アッセイ定量室４４へ流出することがない。
【００９２】
− 工程１４ −
次に、分析用デバイス１を静止させて免疫アッセイ溶液６２を抗原抗体反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第２測定を実施する。
【００９３】
第２測定は、レーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍに切り換えた発光状態において、ヘモグロビン誘導体の濃度を測定するのであるが、分析用デバイス１の免疫アッセイ室４３の抗原抗体反応した免疫アッセイ溶液６２が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行うことによりブランク測定が行われる。
【００９４】
− 工程１５ −
次に、分析用デバイス１を図２２（ａ）に示す６０°付近の位置にして、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１５００ｒｐｍの周波数で制御して免疫アッセイ溶液６２を免疫アッセイ定量室４４に毛細管移送する。
【００９５】
− 工程１６ −
その後、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・２０００ｒｐｍ）させることによって、免疫アッセイ定量室４４に保持された規定量の免疫アッセイ溶液６２が、連結流路４５を介して凝集反応室４６に流入し、凝集反応室４６に担持されている凝集試薬を溶解する。
【００９６】
− 工程１７ −
その後、図２２（ｂ）に示す１８０°付近の位置において、±１ｍｍ程度の揺動を分析用デバイス１に与えるようにモータ１０４を１０００ｒｐｍの周波数で制御して、分析用デバイス１の凝集反応室４６の凝集溶液６３を攪拌する。すると、凝集反応室４６においては、凝集剤が、前記抗体がヘモグロビン誘導体と結合していない未反応体と反応結合することにより、凝集が起きる。
【００９７】
− 工程１８ −
次に、分析用デバイス１を静止させて凝集溶液６３を凝集反応させた後に、分析用デバイス保持部材１０３を回転（Ｃ１で示す左回転・１５００ｒｐｍ）させて第３測定を実施する。
【００９８】
第３測定は、レーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍに切り換えた発光状態において、分析用デバイス１の凝集反応室４６の凝集反応した凝集溶液６３が、レーザー光源１０５とフォトディテクタ１０６の間に介在するタイミングで読み取りを行い、凝集溶液６３の濁り度合いを測定する。
【００９９】
演算部１１０は、第２測定と第３測定によって得られた測定値を、希釈液溢流室２９をレーザー光源１０５の波長を６２５ｎｍにして予め読み取ってある基準値に基づいて処理して数値化したＨｂＡ１ｃ濃度と、前記変性ヘモグロビン濃度を基に算出されるＨｂＡ１ｃ％値を表示部１１１に表示する。
【０１００】
また、本実施の形態では、光源はＬＥＤを利用しているが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、又、光源波長については比色測定において、ヘモグロビンの光吸収作用がある波長領域であればよく、４００〜４５０ｎｍの領域に光吸収作用があるγピーク（ソーレ吸収帯）や、５００〜５８０ｎｍの領域に吸収作用があるヘモグロビンやヘモグロビン誘導体の可視部の光吸収作用を利用することができる。濁度については、可視光領域であれば吸収はあるものの５００〜８００ｎｍが適している。
【０１０１】
図２３は上記の工程１〜工程１８に関して、図１３をより詳細に示したものである。
分析用デバイス１に保持された試薬について、ヘモグロビン誘導体の測定の場合を、より具体的に説明する。
【０１０２】
本発明の実施の形態である、ヘモグロビン誘導体の測定方法は、変性用の試薬（変性剤）により、前記試料中のヘモグロビン誘導体を変性させる工程を含む。
ヘモグロビン（以後、Ｈｂと記載する場合もあり）とは、α鎖と非α鎖（β、γ、δ鎖）のグロビンがヘムと結合し、会合して形成される四量体構造を基本とするものである。特に糖が結合したＨｂＡ１や、飲酒によるアセトアルデヒド化Ｈｂ、透析患者などで見られるカルバミル化Ｈｂなどその種類は多岐に亘る。このように、ヘモグロビン誘導体とは、前述したようなヘモグロビンの一部の領域が修飾され、構造が異なるものを意味し、ヘモグロビン誘導体の約９０％を占めるＨｂＡ（α２β２）、約３％のＨｂＡ２（α２δ２）、約１％のＨｂＦ（α２γ２）などがある。ＨｂＡにおいては、β鎖アミノ酸末端に糖が結合していないＨｂＡ０と、糖が結合したＨｂＡ１がある。さらに、前記ＨｂＡ１の中には、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃがあり、これらもヘモグロビン誘導体である。その中でも、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端に血液中の糖が結合したヘモグロビンＡ１ｃは、過去２〜３ヶ月間の血液中の糖濃度を反映する指標として、広く知られている。
【０１０３】
ヘモグロビン誘導体を決めるポイントとしては、ペプチド構造に特異な領域のアミノ酸配列があるか、もしくは、アミノ酸残基やペプチド末端がリン酸化もしくは糖化された領域が存在するかどうかである。例えば、ＨｂＡ１ａはβ鎖Ｎ末端がリン酸化されており、ＨｂＡ１ｂはβ鎖Ｎ末端がアルデヒド化されており、またＨｂＡ１ｃはβ鎖Ｎ末端がフルクトシル化されている。また、ＨｂＦは、サブユニットがβとγで異なる。アミノ酸単位の差では、ＨｂＡ２のβサブユニットのＮ末端から９残基目、２１残基目が異なる。本発明のヘモグロビン誘導体は、このような一部の領域が異なるものをいう。さらに、これら以外にも、ヘモグロビン誘導体には様々な種類があり、上述のアルコールの乱用によるアセトアルデヒド―ヘモグロビン付加物、尿毒症患者の血液中に存在する尿素―ヘモグロビン付加物、だけでなく、例えば、アスピリン−ヘモグロビンコンプレックスや、カルボキシメチル化ヘモグロビン等、多岐に亘る。ヘモグロビン誘導体としては、特に、ヘモグロビンタンパク上の反応性アミン基とグルコースとの非酵素反応によって生成する糖化ヘモグロビンが有用な測定項目として挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
本発明で示すヘモグロビン誘導体を測定する上で、ヘモグロビン誘導体のわずかに異なる領域を区別・認識して、それぞれのヘモグロビン誘導体を同定・定量する必要がある。その異なる部分、すなわちヘモグロビン誘導体の特異的な箇所をタンパク質の構造内から構造外へ出すことを、本発明では変性という。
【０１０５】
変性の程度は、４次構造を構成するサブユニット構造が解離する程度、３次構造を構成する疎水結合、水素結合、ファンデールワールス力、イオン結合を解離する程度、２次構造を構成するα−へリックスやβシートの構造を変化させる程度、あるいは、直鎖状の構造になってもよい。一般的に、タンパク質は生体内で機能性物質として存在するが、それは、タンパク質がこれらの構造から形成される精密な立体構造を保っているからである。従って、構造を変化させるということは、少なからずタンパク質の機能が変わり、性質が変わったといえる。これは、機能が低下したことも向上したことも含む。これらを達成するための変性剤としては例えば、リチウム塩形態の陰イオンでヘモグロビンを変性させる方法（特開平３−５１７５９公報）、非イオン性界面活性剤を含む方法（ＷＯ２００６／１１２３３９）などがあるがこれらに限定されるものではない。
【０１０６】
本実施の形態における、免疫アッセイ用の試薬は、ヘモグロビン誘導体の変性された部位に対して特異的な抗体を含む試薬であり、本発明の免疫アッセイ抗原抗体反応を基本とした測定原理であればよく、一般的に知られている、免疫比濁法、免疫比朧法、ラテックス免疫凝集法、免疫凝集阻止法、ラテックス免疫凝集阻止法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、電気化学免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、免疫クロマト法の、いずれであってもよい。
【０１０７】
本発明のヘモグロビン誘導体の測定方法において、とくに重要なのは、ヘモグロビン誘導体の糖化部位に対する特異的な抗体を利用した免疫アッセイである。糖化されたヘモグロビンとは、上記にも示したが、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃである。この中で、とくにＨｂＡ１ｃは、近年、三大成人病の一つとして問題になっている糖尿病患者を管理するための指標になるもので、１〜３ヶ月間の長期血糖コントロールの目安となるものである。具体的には、ＨｂＡ１ｃの変性処理を行った後、ＨｂＡ１ｃ特有のβ鎖Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたものに対する抗体を含む試薬を含むものである。
【０１０８】
本実施の形態における、凝集用の凝集剤とは、抗体と特異的に抗原抗体反応をする凝集多価抗原であるものであり、ヘモグロビン誘導体に特異的な箇所に対する抗体を使用して測定する免疫測定反応であれば、上記に限定しない。
【０１０９】
本発明の試薬の保持方法としては、液体状態、乾燥物状態、凍結乾燥物状態などに限定されるものではなく、実施上有意義な方法で保持できる。
次に、ヘモグロビン誘導体の代表的検査項目であるヘモグロビンＡ１ｃについて、下記の実施例１〜実施例８おいて、図２４〜図２８と（表１）〜（表６）を用いて、より具体的に説明する。
【０１１０】
（実施例１）
本発明の実施の一例として、ＨｂＡ１ｃラテックス凝集阻止法で検討した際の試薬組成について説明する。また本実施例において抗体はラテックスビーズに標識した状態で使用する。
（ａ）モノクローナル抗体の作成
免疫原の作製
ＨｂＡ１ｃの免疫原の作製については、以下のように実施した。まずＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端部位と同等の構造を作製する為に、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−システイン（以下ＶＨＬＴＣと省略）の配列でアミノ酸を結合され構成されるポリペプチドのバリンに、フルクトースを結合させることにより、フルクトシルＶＨＬＴＣを作製した。次に免疫原性を高めるために、フルクトシルＶＨＬＴＣのシステイン残基を介して、縮合試薬Ｎ−（６−Maleimidocaproyloxy）succinimideを使用して、チキンγグロブリン（以下ＣＧＧと省略）のアミノ基に標識し、この結果得られたフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧを免疫原とした。
【０１１１】
１．マウスの免疫
生後約８週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）１０匹に対して、前述のように作製した免疫原（フルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧ）をエマルジョンにして、１匹当り腹腔内に１０μｇずつ注入した。この免疫作業は２週間おきに実施した。
【０１１２】
２．抗体産生のチェック
免疫を５回実施したマウスについて、眼静脈より５０〜１００μｌの血液を遠心管に採取した。血清を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ法による抗体価の評価を行ったところ、全てのマウスについて抗ＨｂＡ１ｃ抗体の産生が確認された。
【０１１３】
３．マウスのブースト
前述の抗体価の評価で、特に力価の高かったマウスについて、マウスの脾臓を肥大させるためにブースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧ１０μｇ分をＰＢＳで希釈した溶液を使用した。
【０１１４】
４．細胞融合
ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞と融合した。この融合細胞については、９６ウェルプレート上で１５％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％のＦＣＳを含むＨＴ培地と交換した。
【０１１５】
５．クローニング
ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定を行い、力価の高いウェルを選択した。
ウェルあたり１個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレートに分注した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清についてＥＬＩＳＡ法による抗体価測定を繰り返し、ＨｂＡ１ｃに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞群を最終的に選別した。
【０１１６】
６．細胞の凍結保存
最終的に選別された細胞は、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で−８０℃で凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１１７】
７．抗体の評価
得られた細胞を、マウス腹腔内に注入する一般的な手法により、腹水を作製し、ｐｒｏｔｅｉｎＡセファロースゲルを充填したカラムにより抗体を精製した。このようにして得られた抗体について、ＥＬＩＳＡプレートにコートしたヒトヘモグロビンＡ１ｃに対する上記各抗体の結合を阻害するフルクトシルＶＨＬＴＣ標識ＣＧＧの半値（インヒビションの半値）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号（国際寄託）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号株由来のモノクローナル抗体 は２×１０−１０Ｍである。
（ｂ）ラテックス試薬
積水化学工業（株）製の０.１５μｍのポリスチレンラテックスを用い、室温にて２時間攪拌を行うことにより前記精製抗体を物理吸着法にて標識を行った。その後、０．５％ＢＳＡ(シグマ・アルドリッチ社製)／ＰＢＳ懸濁液中にてブロッキングを行い、その後遠心分離法によって未標識抗体の分離・洗浄を行い、再び０．５％ＢＳＡ(シグマ・アルドリッチ社製)／ＰＢＳ懸濁液中で再懸濁を行うことにより抗体のラテックス試薬とした。
（ｃ）凝集試薬
凝集試薬は、コバス試薬ＨｂＡ１ｃ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）の凝集試薬（合成多価ＨｂＡ１ｃ抗原）を利用した。
（ｄ）変性試薬
非イオン性界面活性剤を含む方法であり（ＷＯ２００６／１１２３３９）を参考に下記の組成を決定した。
【０１１８】
１．スクロース・モノカプレート（和光純薬製）／反応時濃度０．２５％
２．フェリシアン化カリウム（和光純薬製）／反応時濃度０．２５％
（ｅ）希釈液
希釈液は一般的なイオン交換法にて調整された純水を用いた。
【０１１９】
（実施例２）
以下に、ヘモグロビン濃度測定について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法
分析用デバイスは本実施の形態１の分析用デバイスに、実施例１に示したラテックス試薬、凝集試薬、変性試薬をそれぞれ、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６、変性反応室３８に凍結乾燥により担持することにより作成した。
（ｂ）混合溶液の調製
試料溶液（血液）は、人から採血した血液を純水を用いて、希釈することにより調整した。
【０１２０】
混合用液のＨｂ濃度の測定は、和光純薬工業株式会社より販売されている『ヘモグロビンＢ−テストワコー』を使用して濃度決定を行った。これはＳＬＳ−ヘモグロビン法によりヘモグロビンを検出する方法である。
（ｃ）分析用デバイスによるＨｂ測定
試薬を担持した分析用デバイスを用いて、混合室３０の上部に注入穴をドリルにより形成し、直接混合溶液を注入した後、注入工をシールした。その後分析用デバイス１を分析装置本体１００にセットし、実施例１に記載したとおり混合室３０から変性反応室３８への移送を行い、変性試薬と１分反応させたときの５３５ｎｍの吸光度値を検出した。
【０１２１】
図２４は、横軸に混合液のヘモグロビン濃度、縦軸には吸光度をプロットしたものである。結果、本方法により、Ｈｂ濃度と吸光度の値が、Ｈｂ濃度が、０〜５０．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、比例関係になるので、Ｈｂ濃度に応じたＨｂ測定が十分可能であることが示唆された。
【０１２２】
（実施例３）
以下に、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）測定について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法・・・実施例２に記載したとおり
（ｂ）混合溶液の調整
ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社より市販されているコバス試薬糖化ヘモグロビン同封の２４．６μＭの糖化ヘモグロビン標準液を、純水により希釈することにより、既知の糖化ヘモグロビン濃度の混合液を調整した。
（ｃ）分析用デバイスによる糖化ヘモグロビン測定
試薬を担持した分析用デバイスを用いて、混合室３０上部に注入穴をドリルにより形成し、直接に混合溶液を注入した後、注入工をシールした。その後分析用デバイス１を分析装置本体１００にセットし、実施例１に記載したとおり混合室３０から変性反応室３８への移送を行い、その移送の各工程において、変性反応室３８で変性試薬と混合溶液を１分反応を行い、免疫アッセイ室４３ではラテックス試薬と２分させた際のラテックスブランク（濁度）を６２５ｎｍで測定、最後に凝集反応させた際の凝集濁度（濁度）を６２５ｎｍで測定を行った。ラテックスブランクからの凝集濁度の変化量を算出した。
【０１２３】
図２５は、横軸に糖化ヘモグロビン濃度、縦軸に吸光度変化量をプロットした図である。なお、糖化ヘモグロビン濃度をモルからｍｇ／ｄｌにするには、ヘモグロビン分子量を６４５００として計算を行った。結果、本法により、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．１〜１０．０ｍｇ／ｄｌの範囲（より好ましくは、０．２〜４．０ｍｇ／ｄｌ）で、ほぼ比例関係になっているので、糖化ヘモグロビンの測定が十分可能であることが示唆された。
【０１２４】
（実施例４）
以下に、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比を測定する方法について検討した実施例を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成方法・・・実施例２に記載のとおり
（ｂ）試料溶液の調整
試料溶液は、全血を３種類用いた。また（表１）は、その血液検体を糖化ヘモグロビン測定に広く用いられているＨＰＬＣ法を原理とした東ソー社の自動糖化ヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ）にて、糖化ヘモグロビン（％）を測定した結果である。
【０１２５】
【表１】
（ｃ）分析用デバイスによる測定
分析用デバイス１の試料収容室に前記３種類の血液試料と希釈液をそれぞれ注入し、分析装置本体１００にセットし、液体を移送し、５３５ｎｍでのヘモグロビン誘導体の吸光度と、６２５ｎｍでの濁度を測定することにより、ラテックスブランク及び、凝集度合いを吸光度により測定した。ヘモグロビン濃度の決定は、測定吸光度により実施例２のヘモグロビン濃度プロットより図２４から変性溶液３８に含まれるヘモグロビン濃度を算出した。また糖化ヘモグロビン濃度の決定は、濁度の変化量から、図２５から凝集溶液６３に含まれる糖化ヘモグロビン濃度を算出した。その結果を（表２）に示す。
【０１２６】
【表２】
（表２）によれば、本分析用デバイス１により糖化ヘモグロビンの占める割合を測定した結果は、あらかじめ東ソー社の自動糖化ヘモグロビン分析計（ＨＬＣ−７３２ＧＨｂＶ）にて、糖化ヘモグロビンの占める割合を測定した結果（（表１）参照）と非常に近く、本分析用デバイス１によって正確な糖化ヘモグロビン濃度の測定が可能であることが確認された。
【０１２７】
（実施例５）
以下に、希釈液の定量について、検討した結果を詳細に記す。
（ａ）分析用デバイスの作成
希釈液は、保存時の蒸発を再現するため、希釈液は３００μｌデバイスに保持させた状態で、２ヶ月４℃、１５℃、２５℃、４５℃環境で保存した分析用デバイスに、実施例１に示した試薬ラテックス試薬、凝集試薬、変性試薬をそれぞれ、免疫アッセイ室４３、凝集反応室４６、変性反応室３８に凍結乾燥により担持し分析用デバイスとした。今回は比較のため、希釈液定量室１４に連結したサイフォン流路の変わりに、混合室３０と直接連結させたものを準備し、これを比較例とした（図示せず）。
【０１２８】
分析結果
実施例２の方法で作成した分析用デバイス１に検体試料を注入し、実施例４に基づいて、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比測定の測定を行った。各測定結果のＨｂ値と糖化ヘモグロビン値を図２６に示し、（表３）には糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比の再現性について示している。
【０１２９】
【表３】
希釈定量を行ったものは、Ｈｂ濃度が、１３．０〜１７．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、ＨｂＡ１ｃ濃度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．６〜０．８ｍｇ／ｄｌの範囲となっている。一方、希釈定量を行わなかったものは、Ｈｂ濃度が、１０．０〜２２．０ｍｇ／ｄｌの範囲で、ＨｂＡ１ｃ濃度の値が、ＨｂＡ１ｃ濃度が０．４〜１．０ｍｇ／ｄｌの範囲となり、希釈定量を行わなかったものに比べ、Ｈｂ値のばらつきが小さくなった。さらには、希釈定量を行わなかったものは測定ＣＶ値が４．８％であったものが、希釈定量を行うと２．４％となり、糖化ヘモグロビン／Ｈｂの存在比の再現性がよくなっていることが確認された。
【０１３０】
（実施例６）
以下に、試料溶液と各試薬との反応前において、試料溶液の分離工程の有効性について検討した実施例を詳細に記す。
【０１３１】
分析用デバイスの作成については、実施例２に記載のとおり行った。
同一検体（糖化ヘモグロビン４．８％）の血漿量を変えることにより、Ｈｂ濃度が４．０ｍｇ／ｄｌ、７．１ｍｇ／ｄｌ、１３．７ｍｇ／ｄｌ、２０．９ｍｇ／ｄｌのそれぞれ異なる試料血液４種類（検体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を調製し、これを用いて行った。各Ｈｂ濃度については、シスメックスＫＸ−２１で検定を行った。検定値と分離工程の有無による混合溶液中のＨｂ濃度を（表４）（表５）（表６）に示す。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】
【表５】
【０１３４】
【表６】
まず、分離工程なしの場合には（表４）に示すように、検体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの混合溶液のＨｂ濃度は、それぞれ、７．８ｍｇ／ｄｌ、１４．１ｍｇ／ｄｌ、２７．４ｍｇ／ｄｌ、４１．６ｍｇ／ｄｌとなり、ＨｂＡ１ｃ濃度は（表５）に示すように、それぞれ、０．３０ｍｇ／ｄｌ、０．７２ｍｇ／ｄｌ、１．３４ｍｇ／ｄｌ、２．００ｍｇ／ｄｌとなることから、ＨｂＡ１ｃ／Ｈｂ存在比は（表６）に示すように、それぞれ、３．８％、５．１％、４．８％となった。
【０１３５】
一方、本実施例の分離工程を有する場合には、検体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの混合溶液のＨｂ濃度は（表４）に示すように、それぞれ１２．５ｍｇ／ｄｌ、２８．４ｍｇ／ｄｌ、３６．１ｍｇ／ｄｌ、４５．３ｍｇ／ｄｌとなり、ＨｂＡ１ｃ濃度は（表５）に示すように、それぞれ０．６０ｍｇ／ｄｌ、１．３９ｍｇ／ｄｌ、１．７３ｍｇ／ｄｌ、２．１３ｍｇ／ｄｌとなることから、ＨｂＡ１ｃ／Ｈｂ存在比は（表６）に示すように、それぞれ４．８％、４．９％、４．８％、４．７％となった。
【０１３６】
このことから、分離工程を有する場合の方が、分離工程なしの場合と比べて、当初の混合溶液の糖化ヘモグロビン濃度４．８％にほぼ近い値になり、高精度の結果が得られることがわかる。
【０１３７】
これは、極端にＨｂ濃度の低い検体Ａや検体Ｂであっても、本実施例のような分離工程を行うことによって濃縮が可能になり濃度が高く維持できるので、濃度が低い場合における測定系に与える悪影響を抑制でき、その結果、分離工程なしの場合の測定できなかった検体のＨｂ／糖化ヘモグロビンの存在比の正確な測定が可能になったものと推測される。
【０１３８】
（実施例７）
図２７は、０．１２μｍ〜０．８μｍのラテックス粒子について、遠心前の濁度と４５Ｇ〜１８０Ｇでそれぞれ５分間遠心した後の濁度の変化割合を日本分光（顕微分光光度計 ＭＳＶ３５０）により測定した結果である。０．８μｍより大きいラテックス粒子は遠心力による沈降の影響を大きく受けて濁度が減少している。その影響度合いは、粒径に大きく依存することが分る。これは、凝集後のラテックス平均粒径についても同様である。
【０１３９】
ここで、濁度の変化量は、
濁度変化量（％）＝（ 遠心後の濁度 ／ 遠心前の濁度 ）×１００
で算出される。
【０１４０】
（実施例８）
図２８は抗体を感作した粒径０．１５ｎｍのラテックス粒子を凝集反応させた後の平均粒径を粒度分布計（シスメック（株）ゼータサイザーナノ）を用いて測定した結果を示している。この結果から、反応後、３分での凝集物の平均粒径は、凝集前のラテックス粒径の２倍以内に収まる。また、好ましくはラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多状態の凝集反応では、経時的な平均粒径の増加がなく、凝集反応の粒径制御がより厳密に行うことができる。さらに、図２７より凝集物の平均粒径については、７００ｎｍ以下であれば、２００Ｇ以下の遠心力で測定時間１分とした場合の吸光度への影響は２％以下であり高精度測定が可能となる。
【０１４１】
このように、本発明の分析用デバイスを用いた分析方法によれば、希釈液の定量および混合溶液の定量が確実に行える工程を設け、さらに微量な前記試料溶液を血漿成分（低比重成分）と血球成分（高比重成分）とに確実にする前記分離工程を備え、さらには測定時の移送シーケンスや分析用デバイスの流路パターンを簡略化できることから、免疫反応等の凝集阻止反応を利用した、比色もしくは比濁測定が高精度に行えることになり、特に、ヘモグロビン誘導体（例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ）の濃度を高精度に測定できる。
【０１４２】
また、血液の分離機構により、全血中のヘモグロビン濃度の個人差を低減することにより、様々な検体の測定を可能にし、かつ測定精度が向上する。
さらに、オペレータの手技の影響を受けることなく、分析用デバイス内で簡便かつ迅速な血液成分の測定を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明は、特に、簡単かつ迅速なヘモグロビン及びヘモグロビンＡ１ｃの成分分析の自動測定に使用する分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明の実施の形態において分析用デバイスを分析装置本体にセットした状態の要部斜視図
【図２】同実施の形態の分析用デバイスの分解斜視図
【図３】同実施の形態の分析装置本体の外観図
【図４】同実施の形態の分析装置本体の構成図
【図５】同実施の形態の分析装置本体の断面図
【図６】同実施の形態における分析用デバイスの回転停止位置を示す図
【図７】同実施の形態における分析用デバイスの希釈ユニット開封部の平面図と断面図
【図８】同実施の形態における分析用デバイスの注入口周辺の拡大斜視図とその正面図
【図９】同実施の形態における分析用デバイスのマイクロチャネル構成を示す平面図
【図１０】同実施の形態における分析用デバイスの断面位置を示す平面図
【図１１】同実施の形態における分析用デバイスの各部の断面図
【図１２】同実施の形態における分析用デバイスの親水処理位置を示す平面図
【図１３】同実施の形態における分析用デバイスの構成図
【図１４】同実施の形態における分析用デバイスの注入および分離／計量過程の説明図
【図１５】同実施の形態における毛細管キャビティ１９を有した分離室１８の説明図
【図１６】毛細管キャビティ１９を有していない比較例の分離室１８の作用説明図
【図１７】同実施の形態における分析用デバイスの計量過程および混合過程の説明図
【図１８】同実施の形態における分析用デバイスの混合過程の説明図
【図１９】同実施の形態における分析用デバイスの混合溶液移送と計量過程の説明図
【図２０】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２１】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２２】同実施の形態における分析用デバイスの移送と試薬反応／測定過程の説明図
【図２３】同実施の形態における分析用デバイスの詳細な構成図
【図２４】実施例２におけるヘモグロビン濃度と吸光度との関係図
【図２５】実施例３におけるＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度変化量との関係図
【図２６】実施例５における希釈定量の有無による混合溶液中のＨｂ値と糖化ヘモグロビン値の関係図
【図２７】実施例７におけるラテックス粒子の遠心前と遠心後の濁度の変化の関係図
【図２８】実施例８における抗体を感作したラテックス粒子を凝集反応させた後の平均粒径の経時的な平均粒径の変化図
【図２９】従来技術におけるヘモグロビン比濁測定カセットを示した要部断面図
【図３０】従来技術におけるマイクロデバイスを示した平面図
【符号の説明】
【０１４５】
１ 分析用デバイス
２ 保護キャップ
３ ベース基板
４ カバー基板
５ 希釈液収容室
６ 開封ボタン
７ 開封孔
８ ピン
９ 排出孔
１０ アルミシール
１１ 注入口
１２，１３ キャビティ
１４ 希釈液定量室
１５ サイフォン流路
１６ 溢流流路
１７ 試料収容室
１８ 分離室
１９ 毛細管キャビティ
２０ａ，２０ｂ１，２０ｂ２，２０ｃ〜２０ｉ 空気孔
２１，２４ 連結流路
２２ 試料溶液溢流室
２３ 高比重成分定量室
２５，２６ 試料溶液溢流室
２７ 溢流キャビティ
２８ 毛細管部
２９ 希釈液溢流室
３０ 混合室
３１ リブ
３２ 保持キャビティ
３３ 毛細管部
３４ 連結流路
３５ 混合溶液定量室
３６ 溢流流路
３７ サイフォン流路
３８ 変性反応室（測定スポット）
３９ 変性溶液定量室
４０ 毛細管キャビティ
４１ 連結流路
４２ リブ
４３ 免疫アッセイ室（測定スポット）
４４ 免疫アッセイ定量室
４５ 連結流路
４６ 凝集反応室（測定スポット）
５６ 親水処理位置
５７ 血液（試料液）
５７ａ 血漿成分
５７ｂ 血球成分
５８ キャビティ
５９ 連結部
６０ 混合溶液
６１ 変性溶液
６２ 免疫アッセイ溶液
６３ 凝集溶液
６４ 毛細管キャビティ
１００ 分析装置本体
１０１ 蓋
１０２ 軸心
１０３ 分析用デバイス保持部材
１０４ モータ
１０５ レーザー光源
１０６ フォトディテクタ
１０７ 回転駆動手段
１０８ 制御手段
１０９ 光学測定手段
１１０ 演算部
１１１ 表示部
１５０ 試料液採取部
１５１ 希釈液保持部
１５２ 分離部
１５３ 希釈液計量部
１５４ 混合部
１５５ 測定部
Ｃ１ 左回転
Ｃ２ 右回転
θ 傾斜角度
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、
前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させ、これを凝集試薬によって凝集処理して前記反応液を作成し、この反応液に前記分析用デバイスの回転中にアクセスして測定する
分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項２】
前記ラテックス試薬の粒径平均値が０．３μｍ以下であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項３】
前記ラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項４】
前記ラテックス試薬と前記凝集試薬による反応後３分以内の凝集物粒径の平均値が７００ｎｍ以下であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項５】
前記抗体が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号から産出されるモノクローナル抗体であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項６】
前記凝集物にかかる測定中の遠心力が２００Ｇ以下であることを特徴とする
請求項４に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項７】
前記免疫反応が前記試料液と分析用デバイス内で計量された希釈液とを混合した混合溶液に対してラテックス試薬を反応させていることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項８】
前記試料液が血液であり、前記血液中の血球成分を遠心力によって濃縮した後、濃縮された血球成分を含む血液を一定量採取して前記希釈液と混合させることを特徴とする
請求項７に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項９】
前記混合溶液を更に計量してから前記ラテックス試薬と反応させることを特徴とする
請求項７に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項１０】
前記試料液中の特定成分が前記ラテックス試薬と免疫反応できるように前記試料液を変性試薬によって変性させることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項１】
試料液を遠心力によって測定スポットに向かって移送するマイクロチャネル構造を有し、前記測定スポットにおける反応液にアクセスする読み取りに使用される分析用デバイスを用いた分析方法であって、
前記試料液と前記試料液中の特定成分と特異的に反応する抗体を感作したラテックス試薬を免疫反応させ、これを凝集試薬によって凝集処理して前記反応液を作成し、この反応液に前記分析用デバイスの回転中にアクセスして測定する
分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項２】
前記ラテックス試薬の粒径平均値が０．３μｍ以下であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項３】
前記ラテックス試薬に感作された抗体と凝集試薬内の抗原との混合比が抗原過多であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項４】
前記ラテックス試薬と前記凝集試薬による反応後３分以内の凝集物粒径の平均値が７００ｎｍ以下であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項５】
前記抗体が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９５号から産出されるモノクローナル抗体であることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項６】
前記凝集物にかかる測定中の遠心力が２００Ｇ以下であることを特徴とする
請求項４に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項７】
前記免疫反応が前記試料液と分析用デバイス内で計量された希釈液とを混合した混合溶液に対してラテックス試薬を反応させていることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項８】
前記試料液が血液であり、前記血液中の血球成分を遠心力によって濃縮した後、濃縮された血球成分を含む血液を一定量採取して前記希釈液と混合させることを特徴とする
請求項７に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項９】
前記混合溶液を更に計量してから前記ラテックス試薬と反応させることを特徴とする
請求項７に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【請求項１０】
前記試料液中の特定成分が前記ラテックス試薬と免疫反応できるように前記試料液を変性試薬によって変性させることを特徴とする
請求項１に記載の分析用デバイスを用いた分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００９−１８０６８８（Ｐ２００９−１８０６８８Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２１９５（Ｐ２００８−２２１９５）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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