分泌されたポリペプチドの生産
【課題】細胞内でのポリペプチドの分泌を改良する新規なアプローチの提供。
【解決手段】少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法であって、細胞内の少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し；そしてポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で細胞を培養することを含む方法。細胞が植物細胞、真菌細胞、グラム陰性微生物、エシェリヒア科、グラム陽性微生物、バチルス科であり、ポリペプチドがホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される方法。
【解決手段】少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法であって、細胞内の少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し；そしてポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で細胞を培養することを含む方法。細胞が植物細胞、真菌細胞、グラム陰性微生物、エシェリヒア科、グラム陽性微生物、バチルス科であり、ポリペプチドがホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛋白質、特定すれば、異種の分泌された蛋白質の生産の増加及びペプチド輸送活性を阻害された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
異種ポリペプチドの分泌は産業において広く使用される技術である。細胞は、分泌される目的の異種ポリペプチドをコードする核酸により形質転換することができ、それにより、所望のポリペプチドを大量に生産する。この技術は天然に生成されるよりも大量のポリペプチドを生産できる。目的のポリペプチドは多くの産業上の利用性を有し、治療用用途及び農業用用途、並びに食物、化粧品、洗浄組成物、動物の餌等を含む。
【０００３】
即ち、ポリペプチドの分泌の増加が目的である。ポリペプチドのペリプラズム空間又はそれらの培養培地への分泌は、様々なパラメーターに供される。典型的には、目的のポリペリプラズムの分泌のためのベクターを操作することにより、目的のＤＮＡをコードするＤＮＡの５’に、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを配置させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
分泌を増加させる試みは、以下の３つのエリアの一つにしばしば該当する：いくつかの異なるシグナル配列を試験すること（trying）、シグナル配列を変異させること、及び宿主内で分泌経路を変更すること。いくつかの成功が上記の方法において見いだされたが、一般に、それらは時間を浪費し、そして新規な方法が望まれる。よって、解決するべき課題は、シグナル配列を変更することに対して単に依存することなく、如何にしてより多くの蛋白質を生産すること及び／又は分泌することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細胞内でのポリペプチドの分泌を改良する新規なアプローチを提供する。また、本明細書に提供されるポリペプチドの分泌の方法に有用な新規な組成物、及びそのような組成物を作成する方法も本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは、ｄｃｉＡオペロンをコードする核酸の一態様を示し（配列番号：１）、その中でｄｃｉＡＡとｄｃｉＡＥをコードするヌクレオチドはそれぞれ下線を引くか又は太字で示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、ｄｃｉＡオペロンをコードする核酸の一態様を示し（配列番号：１）、その中でｄｃｉＡＡとｄｃｉＡＥをコードするヌクレオチドはそれぞれ下線を引くか又は太字で示されている。
【図２】図２は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド２１０−１０３４によりコードされるｄｃｉＡＡのアミノ酸配列の一態様を示し、その中で、本明細書に提供された不活性ｄｃｉＡＡの一つの態様においては下線を引かれたアミノ酸が除かれる。
【図３】図３は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド１０５１−１９７７によりコードされるｄｃｉＡＢのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図４】図４は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド１９８３−２９４５によりコードされるｄｃｉＡＣのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図５】図５は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド２９５０−３９５７によりコードされるｄｃｉＡＤのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図６】図６は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド３９７８−５６０９によりコードされるｄｃｉＡＥのアミノ酸配列の一態様を示し、その中で、本明細書に提供された不活性ｄｃｉＡＡの一つの態様においては下線を引かれたアミノ酸が除かれる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の概要
発明の一つの側面において、細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法を提供する。好ましい態様において、選択された上記細胞は少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現するはずである。一つの態様において、上記方法は、上記細胞内で少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し、そして上記ポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で上記細胞を培養することを含む。
【０００８】
本明細書にて提供された方法は、様々な細胞種においてポリペプチドを生産又は分泌するのに適合できる。例えば、上記細胞は、植物細胞、真菌細胞、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物からなる群から選択され得る。一つの態様において、上記細胞はグラム陰性微生物、好ましくはエシェリヒア科のメンバーである。別の態様において、上記細胞はグラム陽性微生物、好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）科のメンバーである。好ましい態様において、上記細胞はグラム陽性微生物であり、且つバチルス科のメンバーであって、但し上記バチルス科のメンバーは、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）、バチルスラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスサリンジェネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルスメタノリカス（Ｂ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）及びバチルスアンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からなる群から選択される。
【０００９】
本明細書に提供される方法により分泌又は生産されるポリペプチドはあらゆるポリペプチドであり得る。好ましい態様において、それは異種ポリペプチドである。一つの側面において、上記ポリペプチドは、ホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される。一つの態様において、上記ポリペプチドは酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、カーボヒドラーゼ、レダクターゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、セルラーゼ、エンド−グルコシダーゼＨ、オキシダーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リグノセルロースヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びリグニナーゼからなる群から選択される。一つの態様において、上記ポリペプチドは、バチルスアンスラシスプロテアーゼ、好ましくはズブチリシンである。別の態様において、上記ポリペプチドはアミラーゼ、好ましくはバチルスアミラーゼである。
【００１０】
ペプチド輸送蛋白質は様々な蛋白質であり得、そして様々な様式において不活性化できる。一つの側面において、上記ペプチド輸送蛋白質は、ｄｃｉＡオペロンの遺伝子産物であり、そして好ましくはｄｃｉＡＥ遺伝子の遺伝子産物である。上記蛋白質は蛋白質レベル又は核酸レベルにおいて不活性化され得る。一つの側面においては、上記蛋白質をコードする遺伝子が変異されたために、上記蛋白質が不活性化される。別の態様においては、上記遺伝子を含むオペロンを変異させた。上記変異は様々な様式において引き起こされることができ、一つ又は複数のフレームシフト、挿入、置換又は欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。欠失は一つのヌクレオチドの欠失又はそれ以上であり、全遺伝子の欠失を含む。
【００１１】
発明の別の側面においては、細胞内でポリペプチドを生産する方法が提供され、生産されるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を得るが、細胞はペプチド輸送オペロンを含み、但し当該オペロンの少なくとも一つの遺伝子産物が上記細胞内で不活性化されており、そして上記ポリペプチドが生産されるように発現に適した条件下で上記細胞を培養する工程を含む。好ましくは、上記ペプチド輸送オペロンがｄｃｉＡオペロンである。上記オペロンの遺伝子産物は核酸レベル又は蛋白質レベルにおいて不活性化され得る。好ましくは、不活性化された遺伝子産物がｄｃｉＡＡ又はｄｃｉＡＥによりコードされる。
【００１２】
発明の別の側面において、本明細書において提供されるのは、ペプチド輸送オペロンを含む細胞であり、但し、当該オペロンは上記細胞が増加したポリペプチドの分泌を有するように変異されている。好ましい態様において、上記オペロンはｄｃｉＡオペロンである。一つの態様において、上記オペロンは、ｄｃｉＡＡ及び／又はｄｃｉＡ遺伝子の遺伝子産物を不活性化するように変異されている。
【００１３】
発明の詳細な説明
発明の一つの側面において、細胞内でポリペプチドの生産及び／又は分泌を増加させる方法が提供される。好ましい態様において、上記方法のために選択される細胞は少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する。好ましくは、選択された細胞は上記ペプチド輸送蛋白質を内在性に発現するが、しかしながら、上記細胞は上記蛋白質を発現するように形質転換することができる。一つの態様において、上記方法は、上記細胞内で少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化することを含む。上記方法は、さらに、上記ポリペプチドの発現及び分泌のために適した条件下で上記細胞を培養することを含む。
【００１４】
本明細書にて用いられる「ペプチド輸送蛋白質」は、ペプチド輸送に関与する蛋白質を意味する。ペプチド輸送に関与する蛋白質はペプチド輸送活性を有すると考えられる。一つの態様において、ペプチド輸送蛋白質は、ジペプチド又はオリゴペプチドの輸送、好ましくはジペプチドの輸送に関与する蛋白質を含む。一つの態様において、本明細書に記載されたペプチド輸送蛋白質又は系により輸送されるペプチドは２−１０アミノ酸の長さ、好ましくは２−８、そしてより好ましくは２−６のペプチドを含む。好ましい態様において、オリゴペプチドは３−７アミノ酸の長さであり、好ましくは５又は６アミノ酸の長さであり、そしてジペプチドは２つのアミノ酸である。
【００１５】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質は、蛋白質の移入（import）に関与することが好ましい。以下においてさらに議論されるとおり、不活性化は、様々な様式において、且つ個々の変異又は変異の組み合わせによりおこり得る。ペプチド輸送系は、ペプチドを移出及び／又は移入することにおいて活性を含み得る。本明細書における好ましい態様において、ペプチド輸送活性は遮断される。好ましくは、ペプチド輸送系によりペプチドの移入を低下させるか又は排除する。ペプチド輸送蛋白質は、当業界において公知であり、そして以下において議論されて当業界において公知のペプチド輸送オペロンによりコードされる蛋白質又は遺伝子産物を含む。
【００１６】
本明細書において使用される「オペロン」は、同じプロモーターにより全て制御される遺伝子のクラスターを意味する。ペプチド輸送オペロンはペプチド輸送蛋白質をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む。ペプチド輸送オペロンは、ｏｐｐオペロン及びｄｃｉＡオペロン及びそれらの相同体を含む。本明細書中の一つの態様において、ペプチド輸送オペロンは、ｏｐｐオペロンを除外する。本明細書中の別の態様において、ペプチド輸送蛋白質は、ｏｐｐオペロンによりコードされる蛋白質を除外する。
【００１７】
ｏｐｐオペロンは、胞子形成の開始及び遺伝子応答能の発生に必要なオリゴペプチドパーメアーゼをコードすると報告された（Ｒｕｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：１３８８−１３９８）。ｏｐｐオペロンは３から５のアミノ酸のオリゴペプチドの移入又は移出に関与するＡＴＰ結合性カセットトランスポーターのファミリーのメンバーである。ｏｐｐオペロンには５つの遺伝子産物がある：ｏｐｐＡはリガンド結合蛋白質であって脂質アンカーにより細胞の外側に付着しており；ｏｐｐＢとｏｐｐＣは上記リガンドが輸送されることを通して複合体を形成する膜蛋白質であり；ｏｐｐＤとｏｐｐＦ（Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３−１８５）は、輸送のためのエネルギーを供給すると考えられたＡＴＰアーゼである（ＬｅＤｅａｕｘ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５３：６３−６９）。ｏｐｐオペロンはＲｕｄｎｅｒら、１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１３８８−１３９８によると、ＳｐｏＯＫとも呼ばれる。
【００１８】
ｏｐｐオペロンは、Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉら、１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１：１０８７−１０９９及びＴｙｎｋｋｙｎｅｎら、１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：７５２３−７５３２にも開示されている。機能するｏｐｐオペロンの存在又は不在に関する一つのアッセイは、３アミノ酸の毒性オリゴペプチドの存在下、例えば２つのＬ−アラニン分子とＬ−グルタミン酸類似体からなるトリペプチド、バイアラフォス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）（明治製菓、日本）の存在下での生育に、宿主を供することである。機能性ｏｐｐオペロンを有する細胞は阻害された生育を伴うことになる。ｏｐｐオペロン遺伝子クラスターの少なくとも一つの遺伝子に変異を有する細胞は、毒性オリゴペプチドの存在下で生育阻害を示さなくなる。
【００１９】
さらに、ペプチド輸送オペロン及びそのペプチドに関して、サルモネラティフィミリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆが、さらに、Ｈｉｌｅｓら、１９８７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９５：１２５−１４２に報告されている。バチルスサチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆは、さらに、Ｐｅｒｇｏ，Ｍ．，ら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９１，５，１７３−１８５及びＲｕｄｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９１，１７３（４）：１３８８−１３９８に報告されている。エシェリヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、さらに、Ｇｕｙｅｒら、１９８５ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：１０８１２−１０８１６に報告されている。また、ストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のａｍｉＡの報告もなされた（Ａｌｌｏｉｎｇ，Ｇ １９９４，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４１（１）：４４−５８）。バチルスサチルスのａｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、Ｋｏｉｄｅ Ａ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４ １３（３）：４１７−４２６に報告されている。さらに、エシェリヒアコリ及びサルモネラティフィミリウムのｄｐｐＡＡが、Ａｂｏｕｈａｍａｄ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５（５）：１０３５−１０４７に報告されている。さらに、ストレプマイセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のＢｌｄＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅが、Ｎｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６，２２（５）：８８１−９３に報告されている。ストレプトコッカスのｏｐｐＡが、Ｐｏｄｉｅｌｓｋｉ，Ａ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６，２１（５）：１０８７−１０９９に報告されている。さらに、サルモネラティフィミリウムのＴｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅが、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９８４ １６０：１２２−１３０に報告されている。さらに、ｏｐｐＡがクラミジアニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）からも得られるかもしれないと報告されている。
【００２０】
ペプチド輸送オペロン又はその蛋白質を得ることができる生物は、限定ではないが、アキュイフェックスエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アルケオグロバスフルギヅス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、エアロピラムペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、ボルデテラパーツーシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バチルスサチルス、クロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロロビウムテピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クラミジアニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＣＷＬ０２９、クラミジアトラコマティスセロバー（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｓｅｒｏｖａｒ）Ｄ、クロストリジウムジフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、デイノコッカスラジオヂュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エシェリヒアコリ、エンテロコッカスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｃｉｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミコバクテリウムレプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、シュードモナスエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ピロコッカスフリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカスアビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラティフィミリウムを含む。
【００２１】
ｄｃｉＡは報告されており、例えばＳｌａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１）５（８），１９１５−１９２５及びＭａｔｈｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１）５（８），１９０３−１９１３を参照されたく、バチルスにおけるジペプチド輸送オペロンとして報告された。このオペロンが報告されたが、各遺伝子産物の機能は、過去においてよく特性決定されていなかった。本明細書においては、ｄｃｉＡオペロンの蛋白質の機能が提供され、遺伝子産物が不活性化される機能特性を含む。
【００２２】
一つの態様において、ｄｃｉＡＡはペプチド輸送蛋白質であり、そしてｄｃｉＡＡの不活性化は増加したポリペプチドの生産及び／又は分泌を導く。別の態様において、ｄｃｉＡＥの不活性化は、低下したペプチド輸送及び増加したポリペプチド生産及び／又は分泌を導く。好ましい態様において、ｄｃｉＡＡはＲＮＡ結合活性を有する。ｄｃｉＡＡ，ｄｃｉＡＢ，ｄｃｉＡＣ，ｄｃｉＡＤ及びｄｃｉＡＥの態様をそれぞれ図２−６に示す。ｄｃｉＡはエシェリヒアコリのｄｐｐに相同性を有する。Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７３：２３４−２４４（１９９１）；Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｉ，Ｙ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ＤＮＡ Ｒｅｓ．５（２），５５−７６（１９９８）。
【００２３】
上記のものに加え、ペプチド輸送オペロンの相同体、ペプチド輸送遺伝子及びペプチド輸送蛋白質は、多数の方法により同定することができる。一つの態様において、核酸は、それが上で議論されたペプチド輸送活性を有する蛋白質をコードするなら、「蛋白質輸送遺伝子」である。好ましくは、上記核酸配列の全体の相同性は、図１に示すｄｃｉＡ遺伝子、即ちｄｃｉＡＡ，ｄｃｉＡＢ，ｄｃｉＡＣ，ｄｃｉＡＤ又はｄｃｉＡＥの一つと、好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７５％より高く、より好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは約８５％より高く、そしてもっとも好ましくは約９０％より高い。いくつかの態様においては、相同性が約９３から９５又は９８％ほどに高くなる。好ましくは、上記蛋白質は、図２、３、４、５、又は６に示すアミノ酸配列に対して、約４０％より高く、より好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７５％より高く、さらにより好ましくは約８０％より高く、さらに一層より好ましくは約８５％より高く、そしてもっとも好ましくは約９０％より高い全体の相同性を有する。いくつかの態様においては、相同性が約９３から９５又は９８％ほどに高くなる。
【００２４】
本明細書において使用される相同性は、配列類似性又は同一性に関してであり、同一性が好ましい。この相同性は当業界公知の標準技術を用いて決定され、限定ではないが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所性相同アルゴリズムを含み、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する研究法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（ウイスコンシンジェネティックスソフトウエアパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンスドライブ、マジソン、ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）により記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムによるか、好ましくは欠点セッティングを用いるか、又は視察（inspection）による。
【００２５】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、前進性の対をなす整列化を用いた関連配列のグループからの複数の配列整列化を創製する。それは、整列化を創製するために使用されるクラスター化の関係を示す木をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の前進性整列化法の簡単なものを使用する；当該方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）に記載された方法と類似している。有用なＰＩＬＥＵＰのパラメーターは３．００の欠点ギャップウエイト、０．１０の欠点ギャップ長さ、及び重くされた末端ギャップを含む。
【００２６】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＣＲＣＥ，ｈｔｍｌ］から得られる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを用い、それらのほとんどが欠点値に対して設定される。調整可能なパラメーターは以下の値を用いて設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５，ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは流動する値であり、目的の配列が検索されている特定の配列の組成及び特定のデータベースの組成にそれ自身が依存するプログラムにより確立される；しかしながら、上記値は感度を増加させるために増加させてよい。％アミノ酸配列同一性の値は、整列化された領域内の「より長い」配列の残基の全部の数で、適合する同一残基の数を割ることにより、測定される。「より長い」配列は整列化された領域内においてもっとも真の（actual）残基を有する配列である（整列化スコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップを無視する）。
【００２７】
即ち、「パーセント（％）核酸配列同一性」は、核酸の図に示される配列のヌクレオチド残基と同一の候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。好ましい方法は、欠点パラメーターに対して設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモードを利用し、オーバーラップスパンとオーバーラップフラクションをそれぞれ１と０．１２５に設定する。
【００２８】
整列化は、整列される配列内のギャップの導入を含んでよい。さらに、核酸の図の配列よりも多いか又は少ないヌクレオシドを含む配列に関しては、ヌクレオシドの全数に関して相同なヌクレオシドの数に基づいて相同生のパーセンテージが決定されることになる。即ち、例えば、本明細書において同定されて以下に議論される配列の相同性よりも低い配列相同性は、短い配列内のヌクレオシドの数を用いて決定されることになる。
【００２９】
一つの態様において、ペプチド輸送遺伝子又は蛋白質はハイブリダイゼーション研究を用いて測定される。即ち、例えば、図の中で同定された核酸配列に対して高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする核酸（オペロンのそれ、その個々の遺伝子又はその断片）、又は相補体は本明細書中の一つの態様においてペプチド輸送遺伝子と考えられる。高いストリンジェンシー条件は当業界で知られている；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，編纂Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．を参照されたく、両者は引用により本明細書に編入される。ストリンジェンシーの条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下では異なる。長い配列は高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲のガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見いだされる。一般に、ストリンジェンシーの条件は、規定されたイオン強度のｐＨにおける特定の配列に関しての熱融点（Ｔｍ）より約５−１０Ｃ低いように選択される。Ｔｍは標的に対して相補なプローブの５０％が平衡して標的配列にハイブリダイズする温度である（期待されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）（標的配列が過剰に存在すればＴｍにおいてプローブの５０％が平衡して占有される。）。ストリンジェンシーの条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低い条件になり、典型的にはｐＨ７．０から８．３にて約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度は短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０Ｃであり、そして長いプローブ（例えば、５０より長いヌクレオチド）に関しては少なくとも約６０Ｃである。ストリンジェンシーの条件は脱安定化剤、例えばフォルムアミドの添加により達成してもよい。
【００３０】
別の態様においては、低いストリンジェンシー条件を用いる；例えば、中度又は低度のストリンジェンシー条件を用いてよく、当業界では知られている；Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，前記、及びＴｉｊｓｓｅｎ，前記を参照されたい。
【００３１】
本明細書に提供される遺伝子及び蛋白質の天然に生じる対立遺伝子バリアントを本発明の方法において使用してもよい。
ペプチド輸送遺伝子、オペロン、蛋白質又はペプチドの輸送オペロン遺伝子及び蛋白質の相同体を発見するための上記技術を用いることに加えて、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）に記載されたようなポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）技術において実施された、本明細書にて提供されたような配列の断片の標準の増幅を使用してよい。本明細書にて提供されるオペロン遺伝子からの少なくとも約１０のヌクレオチド及び多くて約６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１２から３０ヌクレオチド、そしてより好ましくは約２０−２５ヌクレオチドを、プローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００３２】
本明細書にて使用される用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを意味する。特に限定しない限り、当該用語は、基準（reference）核酸と同じ結合特性を有し、そして天然に生じるヌクレオチドに類似の様式にて代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に示さなければ、特定の核酸配列は、その便利に修飾されたバリアント（例えば、コドンの置換を縮重する）及び相補配列をも明確に包含し、そして同じく配列が明確に示される。特定すれば、縮重コドンの置換は、一つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンを混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換するように配列を生じさせることにより、達成してよい（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００３３】
本明細書にて使用される「蛋白質」は、蛋白質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。当業者には認識されるとおり、発明の核酸配列を用いて蛋白質配列を生成することができる。好ましいペプチド輸送蛋白質は、不活性化の前にペプチド輸送活性を有し、そして／又はペプチド制御オペロンにより制御される。
【００３４】
本明細書に提供される方法は、真核生物及び原核生物を含む様々な細胞種におけるポリペプチドの生産又は分泌に適用可能である。例えば、上記細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、御中細胞、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物からなる群から選択することができる。
【００３５】
本明細書にて使用される真菌細胞又は真菌は、キトリジオミセテス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイフォキトリジオミセテス（Ｈｙｐｈｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プラズモジオフォロミセテス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、オーミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、トリコミセテス（Ｔｒｉｃｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びバシディオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。一つの態様においては、繊維状真菌を使用する。繊維状真菌の様々な種を発現宿主として使用してよく、以下の属を含む：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクルヤ（Ａｃｈｌｙａ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、コクリオボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）及びフィリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）。一つの態様は、ペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を含む。一つの態様は、フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）を含む。特定の発現宿主は、Ａ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５；Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ（１９８４）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６，３８６−３８９；Ｔｉｌｂｕｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ ２６，２０５−２１１；Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１２，２８４−２８９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｉ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３０７−１３１１）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｍ．Ｈｙｎｅｓ（１９８５）ＥＭＢＯ ４，４７５−４７９）、Ａ．アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）、例えばＮＲＲＬ ３１１２，ＡＴＣＣ ２２３４２，ＡＴＣＣ ４４７３３，ＡＴＣＣ １４３３１及び株ＵＶＫ １４３ｆ、Ａ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）、例えば、ＡＴＣＣ １１４９０，Ｎ．クラッサ（ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５２５９−５２６３；Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ 米国特許第４，４８６，５５３号；Ｋｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｒａｍｂｏｓｅｋ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，１１７−１２２；Ｂｕｌｌ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｗｏｏｔｏｎ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０，７０１−７０４），トリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、例えばＮＲＲＬ １５７０９，ＡＴＣＣ １３６３１，５６７６４，５６７６５，５６４６６，５６７６７，及びトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、例えばＡＴＣＣ ３２０９８及び３２０８６を含む。
【００３６】
別の態様においては、ポリペプチドの生産又は分泌のために酵母細胞を利用するか又は提供する。酵母は、ここにおいて適しており、限定ではないが、メタノール上で成育可能な酵母を含み、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる群から選択される。このクラスの酵母の例である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見いだしてよい。例えば、カンジダ種は限定ではないが、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ（トルロプシス）グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダパラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダルシタネア（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｅａｅ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）及びカンジダシュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含む。
【００３７】
一つの態様において、ここで利用されるか又は提供される細胞は、グラム陰性微生物である。一つの態様において、上記細胞は、腸内細菌由来であり、例えばエシェリヒア、例えば、エシェリヒアコリ、エンテロバクター、エルウイニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、サルモネラティフィミリウム、セラチア、例えば、セラチアマルセスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、シゲラ又はシュードモナス、例えばシュードモナスエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。
【００３８】
別の態様において、上記細胞は、グラム陽性微生物、好ましくはバチルス科のメンバーであるが、他のグラム陽性細胞、例えばストレプトミセス由来の細胞を用いることができる。好ましい態様において、上記細胞はグラム陽性微生物であり、そしてバチルス科のメンバーであり、バチルス科のメンバーは、バチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリクエファシエンス、バチルスコアグランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタス、バチルスサリンジェネシス、バチルスメタノリカス及びバチルスアンスラシスからなる群から選択される。
【００３９】
本明細書に提供される方法により分泌又は生産されるポリペプチドは、興味のある如何なるポリペプチドでもあり得る。好ましい態様において、それは異種（heterologous）ポリペプチドである。あるいは、上記蛋白質は異種同形（homologous）であり、以下に議論されるとおりである。
【００４０】
一つの側面において、生産され及び／又は分泌されるポリペプチドは、ホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される。一つの態様において、ポリペプチドは酵素である。本明細書にて使用される酵素は、限定ではないが、（ｉ）オキシドレダクターゼ；（ｉｉ）一炭素基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチル−、フォルミル−、及び関連トランスフェラーゼ、カルボキシル−及びカルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ）、アルデヒド又はケトン残基を転移させるトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ（例えば、アシルトランスフェラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ）、アルキル又は関連基を転移させるトランスフェラーゼ、窒素含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、アミノトランスフェラーゼ、オキシミノトランスフェラーゼ）、リン含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、ホスホトランスフェラーゼ、ピロホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、イオウ含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、サルファートランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）を含むトランスフェラーゼ、（ｉｉｉ）エステル結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、カルボキシルエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフォリックモノエステルヒドロラーゼ、ホスフォリックジエステルヒドロラーゼ、トリホスフォリックモノエステルヒドロラーゼ、サルファリックエステルヒドロラーゼ）、グリコシル化合物に作用するヒドロラーゼ（例えば、グリコシドヒドロラーゼ、加水分解するＮ−グリコシル化合物、加水分解するＳ−グリコシル化合物）、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、チオエステルヒドロラーゼ）、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、アミノアシル−ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ）、ペプチド結合意外のＣ−Ｎ結合に作用するヒドロラーゼ、酸無水物に作用するヒドロラーゼ、Ｃ−Ｃ結合に作用するヒドロラーゼ、ハライド結合に作用するヒドロラーゼ、Ｐ−Ｎ結合に作用するヒドロラーゼを含むヒドロラーゼ、（ｉｖ）炭素−炭素リアーゼ（例えば、カルボキシル−リアーゼ、アルデヒド−リアーゼ、ケト酸−リアーゼ）、炭素−酸素リアーゼ（例えば、ヒドロ−リアーゼ、他の炭素−酸素リアーゼ）、炭素−窒素リアーゼ（例えば、アンモニア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ）、炭素−イオウリアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ、他のリアーゼを含むリアーゼ、（ｖ）ラセマーゼ及びエピメラーゼを含むイソメラーゼ、シス−トランスイソメラーゼ、分子内オキシドレダクターゼ、分子内トランスフェラーゼ、分子内リアーゼ、他のイソメラーゼ、（ｖｉ）Ｃ−Ｏ結合を形成するか、Ｃ−Ｓ結合を形成するか、Ｃ−Ｎ結合を形成するか、Ｃ−Ｃ結合を形成するリガーゼ又はシンセターゼを含むリガーゼ又はシンセターゼを含む。
【００４１】
目的のポリペプチドは治療上重要な蛋白質、例えば成長因子、サイトカイン、リガンド、受容体及び阻害剤、並びにワクチン及び抗体であってよい。
好ましい態様において、生産されるか又は分泌されるポリペプチドの前駆体ｍＲＮＡは、仮想ＲＮａｓｅ分割部位又はペプチド輸送蛋白質のための結合部位を含む。好ましい態様において、生産されるか又は分泌されるポリペプチドは、特定のペプチド輸送蛋白質認識部位を含む。好ましくは、認識部位は結合部位である。好ましくは、認識部位はｄｃｉＡＡの結合部位である。
【００４２】
本明細書にて使用されるとおり、用語「異種（heterologous）蛋白質」は、宿主細胞内で天然には生じない蛋白質又はポリペプチドを意味する。用語「異種同形（homologous）蛋白質」又は「内在性（endogenously）発現される」は、天然又は宿主細胞内で天然に生じる蛋白質又はポリペプチドを意味する。一つの態様において、発明は、組換えＤＮＡ技術を通して異種同形蛋白質を生産する宿主細胞を含む。組換え蛋白質は、宿主へ導入された核酸によりコードされるあらゆる蛋白質を意味する。
【００４３】
本明細書にて使用される「不活性蛋白質」又は文法上の均等物は、その野生型形態にて、例えばその変化していない宿主中で発現されたときに、上記蛋白質の検出可能な活性の低下を意味する。ペプチド輸送蛋白質の活性は、ジペプチド又は３−７アミノ酸、より好ましくは５又は６のアミノ酸のオリゴペプチドの、好ましくは細胞への移入と関連させた輸送を含む。好ましい態様において、ペプチド輸送活性を低下させるか又は排除する。
【００４４】
発明の一つの側面において、ペプチド輸送オペロンの遺伝子産物は、オペロンを活性化する場合には不活性であるか又は不活性化させる。好ましくは、不活性化された遺伝子産物はｄｃｉＡＡ及び／又はｄｃｉＡＥによりコードされる。好ましい態様において、不活性化遺伝子産物に相当する野生型遺伝子産物は、不活性化遺伝子産物が低下したか又は排除されたｍＲＮＡとの相互作用を有する、少なくともＲＮＡ結合活性又はＲｎａｓｅ活性を含む。
【００４５】
ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの遺伝子産物は、蛋白質レベル又は核酸レベルにおいて不活性化できる。本発明の細胞及び方法は一つより多い不活性化蛋白質を含んでよいことが認識される。一つの態様において、２つのオペロンを利用し、ｏｐｐオペロンとｄｃｉＡオペロンである。一つの態様において、ｏｐｐオペロン由来の少なくとも一つの遺伝子産物及びｄｃｉＡオペロン由来の少なくとも一つの遺伝子産物が不活性である。
【００４６】
多くの実施例を本明細書において考察するが、遺伝子、蛋白質又はオペロン、あるいはその組み合わせにおいて一つ又は複数の変異又は修飾により不活性が生じ得ることは認識される。例えば、一つの態様において、変異はｏｐｐＡオペロン内に作成し、そして一つの変異をｄｃｉＡオペロン内に作成し、そしてより特定すればｏｐｐＡＡ及びｄｃｉＡＡにおいてである。別の態様において、２つ又はそれより多い変異を同じ遺伝子、蛋白質又はオペロンに対して作成する。別の態様において、２つ又はそれより多い変異を作成するが、変異は同じオペロンの別の遺伝子か又は別のオペロン内であって、変異は同じ遺伝子内であるか又は変異を別のオペロン内に作成する場合には別の遺伝子内であり得る。一般に、本明細書にて使用されるとおり、変異は、本明細書にて記載される遺伝子、蛋白質、系又は活性の不活性化を意味する変化を意味する修飾と交換可能に使用される。
【００４７】
一つの側面において、上記蛋白質は当該蛋白質をコードする遺伝子が変異しているため、不活性化される。一つ又はそれより多いフレームシフト、置換、挿入及び／又は欠失を含む様々な様式にて変異を起こさせることができ、以下に詳細に説明される。欠失は単一又はそれ以上のヌクレオチドの欠失であり、遺伝子全体の欠失を含む。本明細書に記載された不活性蛋白質を含む細胞及び上記細胞の作成方法も本明細書に提供されることが認識される。
【００４８】
一つの態様において、本明細書に記載される不活性蛋白質は、宿主細胞のゲノムからの天然に生じる遺伝子の置換及び／又は不活性化により到達する。好ましい態様において、変異は非復帰変異である。
【００４９】
遺伝子をコードする核酸を変異させる方法は、当該核酸又はその一部をクローン化し、部位特異的変異導入により核酸を修飾し、そして変異した核酸を細胞内へプラスミド上にて再導入することである。相同組換えにより、変異した遺伝子を染色体に導入してよい。親宿主細胞において、結果は天然に生じた核酸及び変異した核酸が染色体上に直列に位置することである。第２の組換え後に、親宿主細胞の子孫のために染色体遺伝子に、それにより有効に変異を導入された染色体に、修飾された配列を残す。
【００５０】
遺伝子産物を不活性化する別の方法は、染色体遺伝子コピーを欠損させることによる。好ましい態様において、遺伝子全体を欠損させるが、復帰が不可能なようにさせる様式にて欠損を生じさせる。別の好ましい態様において、一部の欠失を生じさせるが、染色体内に残された核酸はプラスミドによりコードされた遺伝子と相同組換えするには短いようにする。
【００５１】
天然に生じる遺伝子の欠損は以下のとおりに実施できる。その５’及び３’領域を含む遺伝子を単離してクローニングベクターに挿入する。当該遺伝子のコーディング領域を上記ベクターからインビトロにおいて欠損させて、十分な量の５’及び３’のフランキング配列を置き去りにすることにより、親宿主細胞内における天然に生じた遺伝子との相同組換えを提供する。上記ベクターを用いて、次に、上記宿主細胞を形質転換する。ベクターは上記フランキング領域において相同組換えを通して染色体に組み込まれる。この方法は、上記遺伝子が欠失した株を導く。
【００５２】
組み込み方法において使用されるベクターは、プラスミドが好ましい。選択可能なマーカーは、所望の組換え微生物の同定の容易さを可能にさせるように含ませてよい。さらに、当業者には理解されるとおり、上記ベクターは染色体に選択的に導入可能なものが好ましい。これは、誘導可能な複製オリジン、例えば温度感受性オリジンをプラスミドに導入することにより達成することができる。複製オリジンが感受性の温度において形質転換体を成育させることにより、上記プラスミドの複製機能が不活性化され、それにより染色体組み込み体の選択手段を提供する。組み込み体は、選択可能なマーカー、例えば抗生物質の存在下で高温における成育に関して選択してよい。組み込み機構はＷＯ８８／０６６２３に記載されている。
【００５３】
キャンベルタイプの機構における組み込みは遺伝子の５’フランキング領域において起こり得て、染色体内の座において完全なプラスミドベクターを含む株をもたらす。異常な組換えは異なる結果を提供するため、全遺伝子が欠失したか否かを、例えば核酸配列決定又は制限マップにより決定する必要がある。
【００５４】
天然に生じる遺伝子を不活性化する別の方法は、変異原性のオリゴヌクレオチドにより細胞を形質転換することにより、染色体遺伝子コピーを変異させることである。あるいは、染色体プロテアーゼ遺伝子を、相同組換えにより変異遺伝子で置換することができる。
【００５５】
好ましい態様において、本発明は、さらにプロテアーゼの欠失又は変異を有する宿主細胞を包含する。例えば、バチルスにおいてよく知られたプロテアーゼの欠失は、有効な異種発現のために一般的に使用されるａｐｒ，ｎｐｒ，ｅｐｒ，ｍｐｒ内の欠失又は変異を含む。プロテアーゼの他の態様は、例えば米国特許第５，２６４，３６６号に記載される。
【００５６】
核酸レベルにおいて蛋白質を不活性化する別の方法は、アンチセンス分子の使用を含む。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、本発明によれば、ペプチド輸送蛋白質のコーディング領域の断片又はペプチド輸送オペロンの産物を含む。そのような断片は通常少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する可能性は、与えられた蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）及びｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に記載される。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、いくつかの手段の一つにより標的配列の転写又は翻訳をブロックする二重鎖の形成をもたらし、二重鎖の増強された分解、転写又は翻訳の成熟前停止を含み、あるいは他の手段による。
【００５７】
リボザイムも一つの態様において不活性化のために使用してよい。リボザイムはＲＮＡの特異的分解を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続く核酸内部分解により作用する。有力なＲＮＡ標的内の特定のリボザイム分解部位は公知の技術により同定できる。さらなる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１を参照されたい（１９９７年９月１８日に公開された）。
【００５８】
ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの産物は、蛋白質レベルにおいて不活性であるか又は不活性化してもよい。例えば、上記蛋白質又は遺伝子産物をコードする核酸は完全であってよいが、上記細胞は蛋白質又は遺伝子産物がその天然活性、例えばペプチド輸送活性又はＲＮＡ相互作用活性を有することを阻害するように、アンタゴニスト又は阻害剤、例えば抗体を含んでよい。さらに、上記蛋白質は、不活性バリアントとして発現されるか、又は例えば温度感受性ペプチド輸送を有することにより条件的に不活性でああってよい。
【００５９】
細胞内での蛋白質の生産及び／又は分泌のため、異種又は異種同形蛋白質をコードする核酸の少なくとも１コピーを含む発現ベクター、そして好ましくは複数コピーを含む発現ベクターで、蛋白質発現に適した条件下で、細胞を形質転換する。
【００６０】
本発明において使用される発現ベクターは、上記蛋白質に付随して（associated with）少なくとも一つのプロモーターを含み、当該プロモーターは上記宿主細胞内で機能する。本発明の一つの態様において、上記プロモーターは選択された蛋白質に関して野生型のプロモーターであり、そして本発明の別の態様においては、プロモーターは上記蛋白質に対して異種であるが、宿主細胞内ではやはり機能する。本発明の一つの好ましい態様において、目的のポリペプチドは安定に宿主ゲノムに組み込まれる。シグナル配列は必要なら追加してよい。
【００６１】
好ましい態様において、上記発現ベクターは、ベクターにとって唯一の少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を好ましくは含む複数クローニング部位のカセットを含むことにより、核酸の操作の容易性を楽にする。好ましい態様において、上記ベクターは一つ又は複数の選択可能なマーカーも含む。本明細書にて使用されるとおり、選択可能なマーカーなる用語は、ベクターを含む宿主の選択の容易性を可能にする宿主内で発現可能な遺伝子を意味する。そのような選択可能なマーカーの例は、限定ではないが、抗生物質、例えばエリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンを含む。
【００６２】
本発明の一つの態様において、興味のあるポリペプチド少なくとも一つをコードする核酸は、宿主細胞内で複製できる発現ベクターを通して宿主細胞に導入される。バチルスのために適した複製プラスミドは、引用により特別に編入される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，編纂、Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されており、プラスミドに関する第３章を参照されたい。バチルスサチルスに適した複製プラスミドは９２頁に掲載される。いくつかの戦略がバチルス内でＤＮＡを直接クローニングするための文献において記載された。プラスミドマーカーレスキュー形質転換は、部分的に相同な内在のプラスミドを有するコンピテント細胞によるドナープラスミドの取り込みを含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１（１９７９）；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５−１９１（１９９０）；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（３）：１２０５−１２１１（１９８７））。入って来るドナープラスミドは、染色体組換えを模倣するプロセスにおいて内在の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組換わる。
【００６３】
プロトプラストの形質転換による形質転換は、バチルスサチルスに関してはＣｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ １６８：１１１−１１５；バチルスメガテリウムに関してはＶｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７：２６１−２６３；バチルスアミロリクエファシエンスに関してはＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；バチルスサリンゲネシスに関してはＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３−２１７；バチルススフェリカスに関してはＭｃＤｏｎａｌｄ（１９８４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３；バチルスラーバエに関してはＢａｋｈｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）４９：５７７に記載されている。Ｍａｎｎら（１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１−１３５）は、バチルスプロトプラストの形質転換を報告し、そしてＨｏｌｕｂｏｖａ，（１９８５ Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７）はＤＮＡを含むリポソームを用いたプロトプラストへのＤＮＡ取り込みの方法を開示する。マーカー遺伝子の存在／不在は、目的の遺伝子が宿主細胞内に存在するか否かを示唆し得る。
【００６４】
あるいは、興味のあるポリペプチドのコーディング配列を含む宿主細胞を、当業者に知られた様々な手法により同定してよい。これらの手法は、限定ではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び蛋白質バイオアッセイ又は免疫アッセイ技術を含み、核酸又は蛋白質の検出及び／又は定量のための、膜に基づく技術、溶液に基づく技術、又はチップに基づく技術を含む。
【００６５】
分泌されたポリペプチドの活性を検出して測定するため、当業者に知られている様々なアッセイが存在する。特に、プロテアーゼに関しては、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがあり、２８０ｎｍにおいて吸光度として測定されるか又はフォーリン法を用いて比色により測定される（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。他のアッセイは発色体基質の可溶化を含む（Ｗａｒｄ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｍ．Ｆｏｇａｒｔｙ，編纂）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２５１−３１７）。
【００６６】
宿主細胞内で異種又は異種同形蛋白質の分泌のレベルを測定して、分泌された蛋白質を検出するための手段は、当該蛋白質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れかの使用を含む。例は、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。これら及び他のアッセイは、数ある部分の中でもとりわけＨａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ（１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ ＭＮ）及びＭａｄｄｏｘ ＤＥ ｅｔ ａｌ（１９８３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）に記載される。好ましい態様において、同じ方法又は組成物を用いた場合であるが、ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの遺伝子産物を不活性化しなかった場合よりも、本明細書に提供された方法又は組成物を用いると分泌は高い。好ましい態様において、ＲＮａｓｅ活性を低下させた場合に、ポリペプチドの生産及び／又は分泌を増加させる。別の好ましい態様において、ペプチド輸送活性を低下させた場合に、生産及び／又は分泌を増加させる。
【００６７】
様々な標識及び配合技術が当業者には知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。標識されたハイブリダイゼーションを生じさせる手段又は特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのＰＣＲプローブは、標識されたヌクレオチドを用いた、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化又はＰＣＲ増幅を含む。あるいは、ヌクレオチド配列、又はその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブ生産のためにベクターにクローン化してよい。そのようなベクターは、当業界において知られており、市販されており、Ｔ７，Ｔ３又はＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの添加によりインビトロにてＲＮＡプローブを合成するのに使用してよい。
【００６８】
多数の会社、例えばファルマシアバイオテック（ピスカタウエイ ＮＪ）、プロメガ（マジソン ＷＩ）、及びバイオケミカルコープ（クリーブランド ＯＨ）が、これらの手法のための市販キット及びプロトコルを供給する。適当なリポーター分子又は標識は、それらの放射線核種、酵素、蛍光、化学発光体、発色剤並びに基質、共因子、阻害剤、磁気粒子等を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９９６，３４５号；第４，２２７，４３７号；第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号を含む。また、組換えイムノグロブリンを、引用により本明細書に編入される米国特許第４，８１６，５６７号に示されたとおりにして製造してよい。
【００６９】
異種蛋白質又は異種同形蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された細胞か又は上記蛋白質を内在して有する細胞を、コードされた蛋白質の細胞培養物からの発現及び回収に適した条件下で培養してよい。他の組換え構築物は、上記の異種又は異種同形のポリヌクレオチド配列を、可溶性蛋白質の精製を楽にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列へ連結してよい（Ｋｒｏｌｌ ＤＪ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３）。
【００７０】
そのような精製を楽にするドメインは、限定ではないが、固定化された金属上での精製を可能にさせる金属キレートペプチド、例えばヒスチジン−トリプトファン分子（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３：２６３−２８１）、固定化されたイムノグロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系において利用されるドメイン（イミュネックス社、シアトル ＷＡ）を含む。精製ドメインと異種蛋白質の間の、分割可能なリンカー配列、例えば因子ＸＡ又はエンテロキナーゼ（インビトロジェン、サンディエゴ ＣＡ）の包含は、精製を楽にするために使用することができる。
【００７１】
本発明を実施する様式及び方法は、当業者であれば以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろうが、実施例は本発明又は請求の範囲に記載された範囲を限定する如何なる様式にも意図されない。本明細書において引用された全ての文献は引用によりそれらの全体を特に本明細書に編入する。
【実施例１】
【００７２】
実施例Ｉ
実施例ＩはｄｃｉＡオペロンのｄｃｉＡＥ遺伝子内に変異を有するバチルスサチルス由来のズブチリシン及びアミラーゼの生産の増加を示す。
ｄｃｉＡＥ野生型又はｄｃｉＡＥ変異体を含む株由来のズブチリシンの振盪フラスコ内での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）を含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。３０ｕｌの解凍バイアルを、６８ｇ／Ｌソイトン、３００Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｇ／Ｌグルコース（最終ｐＨ６．８）を含む４０ｍＬの培地を２５０ｍＬフラスコ中にて接種するのに使用した。振盪フラスコを３７℃において激しく振盪しながらインキュベートし、その後それらは上清のズブチリシン分析のためにサンプリングする。
【００７３】
液体培養物からの上清を生育の間の異なる時間において回収して、以前に記載されたとおりに０．３ｍＭのＮ−サクシニミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８を含む溶液中で、２５℃において、ズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，６５１８−６５２１）。
【００７４】
当該アッセイはｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍ／分の吸光度の増加を測定した。表１は試験された２つの株から生産されたプロテアーゼの終了を記載する。
【００７５】
２４時間後に、ｄｃｉＡＥに関して欠失させた株は対照よりも３．５倍多いズブチリシンを分泌した。４８時間後に、増加は４．９倍である（表１）。
表１
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（率）４８時間
２７９０ ｄｃｉＡＥ野生型 ０．８８８
２７９０ ｄｃｉＡＥ− ４．３８
ｄｃｉＡＥ野生型又はｄｃｉＡＥ変異体を含む株由来のアミラーゼの振盪フラスコ内での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）を含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。３０ｕｌの解凍バイアルを、６８ｇ／Ｌソイトン、３００Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｇ／Ｌグルコース（最終ｐＨ６．８）を含む４０ｍＬの培地を２５０ｍＬフラスコ中にて接種するのに使用した。振盪フラスコを３７℃において激しく振盪しながらインキュベートし、その後それらは上清のズブチリシン分析のためにサンプリングする。
【００７６】
全ブロスサンプルを生育の異なる時間においてスピンダウンして、それらの上清を以下のとおりにアッセイした。上清をキュベット中で７９０．０ｕｌの基質（メガザイム−セラルファ−アルファアミラーゼ；基質を水で希釈して１部基質プラス３部アルファアミラーゼバッファーｐＨ６．６として使用する）と２５０Ｃにおいて混合した。アルファアミラーゼバッファーは、５０ｍＭマレイン酸バッファー、５ｍＭ ＣａＣｌ２，及び０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＨ＝６．７からなる。アミラーゼは、アミラーゼ活性のためのプロトコルを用いてスペクトロニックジェネシス２スペクトロフォトメーター中で測定した（波長：４１０ｎｍ，初期ディレイ：７５秒、全測定時間：１２０秒、下限：０．０８、上限：０．１２）。
【００７７】
結果は、ｄｃｉＡＥ欠失を含む株が、ｄｃｉＡＥ野生型遺伝子が存在した時よりも４８時間目において１．８倍多いアミラーゼを生産したことを示す。６０時間目には、増加が２．５倍である（表２）。
【００７８】
表２は試験された２つの株から製造されたアミラーゼの収量を記載する。
表２
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（率）４８時間 ６０時間
２７９０ ｄｃｉＡＥ野生型 ０．０５４ ０．０６６
２７９０ ｄｃｉＡＥ− ０．０９８ ０．１６８
【実施例２】
【００７９】
実施例２
実施例２は、ｏｐｐＡオペロンのｏｐｐＡＡ中に変異を有し、そしてｄｃｉＡオペロンのｄｃｉＡＡ遺伝子の欠失を有するバチルスサチルスのズブチリシンの生産の付加的な増加を示す。
ｄｃｉＡＡ欠失及びｏｐｐＡＡ変異を含む株からの組換えズブチリシンの振盪フラスコ中での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）及び２５ｕｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。２５ｍＬのＦＮＡ３４ＥＢ培地（リットルあたり：９０．７２ｇのＰＩＰＥＳ酸形態、ｐＨ６．８に、３４．００ｇソイトン（ディフコ）、２滴のＭａｚｕ ＤＦ−２０４，４０ｍＬの５０％グルコース）を２５０ｍｌフラスコ中。
【００８０】
試験された株からのグリセロールストック１０ｕＬを各フラスコに加えた。一度接種したら、フラスコを３７℃において２５０ｒｐｍにてインキュベートし、そしてサンプルを各２４時間ごとに７５時間まで取り出した。１ｍＬのサンプルを滅菌フードの中に取り出し、そしてＯＤ５５０に関して測定した。サンプルを１分間遠心分離することにより細胞を沈殿させた。
【００８１】
液体培養物からの上清を生育の間の異なる時間に回収して、以前に記載されたとおりに、０．３ｍＭのＮ−サクシニミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６を含む溶液中で、２５℃において、ズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，６５１８−６５２１）。当該アッセイはｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。
【００８２】
表３は、２つの株から生産されたプロテアーゼの収量を記載する。結果は、ｄｃｉＡＡの欠失及びｏｐｐＡＡの変異を含む株が、ｄｃｉＡＡ野生型が存在した場合よりも１．９倍多いプロテアーゼを生産したことを示す。
表３
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（ｍｇ／Ｌ）
２７時間 ５１時間 ７５時間
００１ ｏｐｐＡＡ− ３０ １０５ １３８
０４０ ｏｐｐＡＡ−ｄｃｉＡＡ− ２８ １２４ ２６２
増加した酵素の生産においてｄｃｉＡ蛋白質を欠損させることにおいて見いだされた効果は、この蛋白質とズブチリシン（ａｐｒ）ｍＲＮＡの間の可能な相互作用のためであり得た。次のセクションにおいて示されるとおり、我々は、ｄｃｉＡＡと上記ＲＮＡと相互作用する蛋白質の間にいくらかの相同性が存在することを示し、さらにズブチリシンの非翻訳ｍＲＮＡ領域内（＋１ ｍＲＮＡにて開始する）に「仮想Ｒｎａｓｅ分割部位」が存在する事実を我々が見いだしたことを示す。ズブチリシン内のこの仮想Ｒｎａｓｅ Ｅ分割部位は、ＲＮＡ Ｉ内に同定された部位と６／７の同一性を有する（表４）。この部位はＲＮＡｓｅ Ｅにより分割される（Ｔｏｍｃｓａｎｙｉ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｓ １９８５；Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｓ １９９１；Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ １９９４）。上記仮想Ｒｎａｓｅ Ｅ部位は９Ｓ ＲＮＡ内のＲｎａｓｅ Ｅに関して証明された分割部位と７／７の同一性を有する（Ｒｏｙ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ａｐｉｒｉｏｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７４７，２００−２０８ １９８３）（表４）。
表４
ＲＮＡ 位置 配列
ズブチリシン ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＡＡＵ
ＲＮＡ Ｉ ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＵＡＵ
９Ｓ ＲＮＡ ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＡＡＵ
理論に拘束される訳ではないが、我々は、ｄｃｉＡＡ蛋白質の機能の一つがこのＲＮＡの安定性又は当該蛋白質の翻訳に影響するＲＮＡのこの領域に結合する可能性があり得ると信じる。即ち、本明細書には、仮想ｄｃｉＡＡ認識部位を含む蛋白質のペプチド生産／分泌を増加させる方法も提供される。
ｄｃｉＡＡと他の蛋白質の間の相同性
ｄｃｉＡＡ遺伝子の予期された生産を使用することにより、ジェンバンクのデータベースの翻訳を検索したところ、ｄｃｉＡＡ遺伝子産物とバチルスメタノリカスとの間（７５％同一性）、デイノクッカスラジオジュランス由来の仮想ペプチドＡＢＣ輸送体との間（３３％同一性）、及ピロコッカスアブイシ由来のｄｐｐＡジペプチド輸送蛋白質との間（２８％同一性）で、ｂｌａｓｔ相同性が見いだされた。用いた検索プログラムはＢＳＯＲＦであり、ｆａｓｔａ ３ ｔ及ｂｌａｓｔによった。バチルスメタノリカスからのいくつかのジペプチド蛋白質は、ストレプトマイセスコエリカラー内の仮想輸送関連蛋白質と７５％同一性を、ピロコッカスアビシイからのジペプチド輸送蛋白質ｄｐｐＡと３２％の同一性を示す。
【００８３】
ジェンバンクのデータベース（ｆａｓｔａ ３ ｔによるＢＳＯＲＦ及びｂｌａｓｔ）内でｄｃｉＡＡ蛋白質の別の領域を用いた検索を実施することにより、ｄｃｉＡＡ遺伝子産物の間でエシェリヒアコリ由来のリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｅ ａｋａ Ａｍｓ）と相同性が見いだされた（Ｃｌａｖｅｒｉｅ−Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２８４３−２８５１，１９９１）。両蛋白質は、両蛋白質のカルボキシ末端部分中の４７アミノ酸の領域にわたり２５％同一性（及び４８％保存性置換）を示す。ｄｃｉＡＡはヒト由来のリボヌクレオ蛋白質のカルボキシ末端とも２６％同一性を示す（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，２２３３−２２４４，１９８９）。
ｄｃｉＡＥと他の蛋白質との間の相同性
ｄｃｉＡＥの予測された産物を、ジェンバンクのデータベースの翻訳物の検索に使用した。用いた検索プログラムはｆａｓｔａ ３ ｔによるＢＳＯＲＦ及びｂｌａｓｔであった。相同性は、バチルスサチルスのＯＰＰＡオリゴペプチド結合蛋白質ＯｐｐＡ（４０％同一）、バチルスアンスラシスのｐＸ０２−６６（３２％同一）、エンテロコッカスフェーカリスのＴｒａｃ（３０％同一）、エシェリヒアコリのＭｐｐＡペリプラズムムレインペプチド結合蛋白質前駆体（３０％同一）、サルモネラティフィミリウムのＯｐｐＡ−ソルティーペリプラズムオリゴペプチド結合蛋白質（オリゴペプチド結合蛋白質前駆体）（３０％同一）、オリゴペプチドパーメアーゼ相同物ＡＩＩ（ボレリアブルグドルフェリ）（２９％同一）、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体、ペリプラズムオリゴペプチド結合蛋白質（ＯｐｐＡＶ）相同物ライム病スピロヘータ（ボレリアブルグドルフェリ）、クラミドフィラニューモニエ由来のオリゴペプチド結合蛋白質（２６％同一）、及び同じ程度トレポネマパリダム由来のオリゴペプチドＡＢＣ輸送体ペリプラズム結合ＯｐｐＡ−梅毒スピロヘータ（２６％同一）内で生じた。
ジペプチド輸送系ｄｃｉＡＡ遺伝子の欠失
ＰＣＲ技術を用いて、株００１及びＢＧ２７９０内に存在するｄｃｉＡＡ遺伝子の６４７ｂｐを欠失させた。遺伝子の５’（プライマーｄｃｉ１．ｆ及びｄｃｉ３．３を用いて）及び３’（プライマーｄｃｉ２．ｒ及びｄｃｉ４．ｆを用いて）の一部を含む２つの増幅されたＤＮＡ断片を連結して、ｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎプラスミドにクローン化した。プラスミドｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）及び温度感受性複製オリジン（ＴｓＯｒｉ）を有する。ｄｃｉＡＡ破壊プラスミドｐＭｄｃｉは、上記２つの株を形質転換したプロトプラストであった。ＴｓＯｒｉのため、このプラスミドは非許容温度、例えば４８Ｃにおいて選択圧下で培養した場合に、ｄｃｉＡＡ遺伝子との相同性領域において染色体に組み込まれた。組み込みの後に、組み込まれたプラスミドを有する株を許容温度下で大規模に成長させた。組み込まれたプラスミドの切り出しに際しては、親株００１又はＢＧ２７９０の何れかを復帰させるか、又は欠失させた遺伝子を有する株を構築する。２つの新規な株は、当該遺伝子の欠失を含むような遺伝子配列に基づく遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。
ジペプチド輸送系ｄｃｉＡＥ遺伝子の欠失
ＰＣＲ技術を用いて、株ＢＧ２９７０内に存在するｄｃｉＡＥ遺伝子の１２２８ｂｐを欠失させた。遺伝子の５’（プライマーｄｃｉＡＥ１及びｄｃｉＡＥ２を用いて）及び３’（プライマーｄｃｉＡＥ３及びｄｃｉＡＥ４を用いて）の一部を含む２つの増幅されたＤＮＡ断片を連結して、ｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎプラスミドにクローン化した。プラスミドｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）及び温度感受性複製オリジン（ＴｓＯｒｉ）を有する。ｄｃｉＡＥ破壊プラスミドｐＭｄｃｉＥは、ＢＧ２２７９０を形質転換したプロトプラストであった。ＴｓＯｒｉのため、このプラスミドは非許容温度、例えば４８Ｃにおいて選択圧下で培養した場合に、ｄｃｉＡＡ遺伝子との相同性領域において染色体に組み込まれた。組み込みの後に、組み込まれたプラスミドを有する株を許容温度下で大規模に成長させた。組み込まれたプラスミドの切り出しに際しては、親株００１又はＢＧ２７９０の何れかを復帰させるか、又は欠失させた遺伝子を有する株を構築する。２つの新規な株は、当該遺伝子の欠失を含むような遺伝子配列に基づく遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。
プライマー：
【００８４】
【化１】
【実施例３】
【００８５】
実施例３
実施例３は、蛋白質、好ましくは分泌された蛋白質の生産を増加させた微生物のスクリーン法を示す。より特定すれば、上記方法は、破壊されたペプチド輸送活性、特定すればペプチドの輸送の阻害を有する細胞のスクリーンに関し、ポリペプチドの生産の増加をもたらす。上記方法は、上記ペプチド輸送系により細胞内へ通常は輸送されるはずのペプチドのサイズである毒性ペプチドに細胞を供することを含む。好ましい態様において、毒性ペプチドはバイアラフォスである。バイアラフォスはトリペプチドであり、２つのＬ−アラニン分子とＬ−グルタミン酸類似体からなる。ペプチダーゼにより消化された場合、細胞に有害である。それは抗生物質であり、明治製菓、日本を参照されたい。
【００８６】
バチルス内の少なくとも一つのオペロンがバイアラフォス（３−アミノ酸）のサイズの分子の取り込みに関与すること、ｏｐｐＡオペロンである、が文献に報告された。バイアラフォス取り込みに関与する他の追加の遺伝子が存在するかもしれない。
【００８７】
上記の方法は破壊されたペプチド輸送及びポリペプチドの生産の増加を有する細胞のスクリーンを可能にさせる有効な方法である。特定すれば、上記方法は、低下したペプチド取り込みをもたらす変異に関してスクリーンする。バイアラフォスへの暴露に対して生き残る細胞は一つ又は複数の変異を有すると同定される。上記方法は、例えば核酸レベルにおいて変異のさらなる変異の特性決定を必要とせず、よって効率性を提供する。しかしながら、例えば、ポリペプチドの生産の増加、及び更なる特性決定及び変異の最適化に関してさらなるスクリーニングが起こり得る。バイアラフォスへの暴露は多数の様式、例えばバイアラフォスとの細胞のプレーティング、例えば５０ｕｇ／ｍｌにおいて生じ得る。
【００８８】
上記株が変異しているため、上記細胞が変異していたため、又は遺伝、蛋白質又はオペロンが変異していたか又は修飾されていることにより本明細書で前に記載されたポリペプチドの増加された生産をもたらすため、破壊されたペプチド輸送が起こり得る。一つ又は複数のペプチド輸送オペロンにおける遺伝子の何れか一つ又は全部が変異しているか又は修飾されていてよい。
【００８９】
機能性ペプチド輸送オペロン、例えばｏｐｐオペロンを有する微生物又は細胞は阻害された成長を有することになる。ｏｐｐオペロン遺伝子クラスターの少なくとも一つの遺伝子に変異を有する微生物は毒性オリゴペプチドの存在下で成長阻害を示さない。
バイアラフォス耐性変異を得るための方法
細胞が対数相に到達するまで液体培養液（ＬＢ）中で成育させる。培養液は異なる濃度のバイアラフォスを含むバチルス最小寒天プレート上にプレートする。プレートは一晩３７℃においてインキュベートし、成長するコロニーを同じ種類のプレート上で精製のためにストリークアウトする。これらの新たな株はバイアラフォス耐性であり、全てが一晩成育後に親株よりも多いプロテアーゼを生産する。
プロテアーゼアッセイ
液体培養液からの上清を成育３日後に回収して、０３ｍＭのＮ−スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６中で２５℃において、以前に記載されたとおりにズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６０：６５２１）。当該アッセイは、ｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍ／分における吸光度の増加を測定した。結果は容易に検出可能であって、ペプチドを取り込まない細胞に関してスクリーニングすることにより増加した蛋白質生産を有する細胞を同定できることを確証した。一つの態様において、ｏｐｐＡに対する変異が排除される。別の態様において、バチルスがスクリーンのための生物として排除される。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛋白質、特定すれば、異種の分泌された蛋白質の生産の増加及びペプチド輸送活性を阻害された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
異種ポリペプチドの分泌は産業において広く使用される技術である。細胞は、分泌される目的の異種ポリペプチドをコードする核酸により形質転換することができ、それにより、所望のポリペプチドを大量に生産する。この技術は天然に生成されるよりも大量のポリペプチドを生産できる。目的のポリペプチドは多くの産業上の利用性を有し、治療用用途及び農業用用途、並びに食物、化粧品、洗浄組成物、動物の餌等を含む。
【０００３】
即ち、ポリペプチドの分泌の増加が目的である。ポリペプチドのペリプラズム空間又はそれらの培養培地への分泌は、様々なパラメーターに供される。典型的には、目的のポリペリプラズムの分泌のためのベクターを操作することにより、目的のＤＮＡをコードするＤＮＡの５’に、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを配置させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
分泌を増加させる試みは、以下の３つのエリアの一つにしばしば該当する：いくつかの異なるシグナル配列を試験すること（trying）、シグナル配列を変異させること、及び宿主内で分泌経路を変更すること。いくつかの成功が上記の方法において見いだされたが、一般に、それらは時間を浪費し、そして新規な方法が望まれる。よって、解決するべき課題は、シグナル配列を変更することに対して単に依存することなく、如何にしてより多くの蛋白質を生産すること及び／又は分泌することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細胞内でのポリペプチドの分泌を改良する新規なアプローチを提供する。また、本明細書に提供されるポリペプチドの分泌の方法に有用な新規な組成物、及びそのような組成物を作成する方法も本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは、ｄｃｉＡオペロンをコードする核酸の一態様を示し（配列番号：１）、その中でｄｃｉＡＡとｄｃｉＡＥをコードするヌクレオチドはそれぞれ下線を引くか又は太字で示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、ｄｃｉＡオペロンをコードする核酸の一態様を示し（配列番号：１）、その中でｄｃｉＡＡとｄｃｉＡＥをコードするヌクレオチドはそれぞれ下線を引くか又は太字で示されている。
【図２】図２は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド２１０−１０３４によりコードされるｄｃｉＡＡのアミノ酸配列の一態様を示し、その中で、本明細書に提供された不活性ｄｃｉＡＡの一つの態様においては下線を引かれたアミノ酸が除かれる。
【図３】図３は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド１０５１−１９７７によりコードされるｄｃｉＡＢのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図４】図４は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド１９８３−２９４５によりコードされるｄｃｉＡＣのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図５】図５は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド２９５０−３９５７によりコードされるｄｃｉＡＤのアミノ酸配列の一態様を示す。
【図６】図６は、図１Ａ及び１Ｂに示された核酸配列のヌクレオチド３９７８−５６０９によりコードされるｄｃｉＡＥのアミノ酸配列の一態様を示し、その中で、本明細書に提供された不活性ｄｃｉＡＡの一つの態様においては下線を引かれたアミノ酸が除かれる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の概要
発明の一つの側面において、細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法を提供する。好ましい態様において、選択された上記細胞は少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現するはずである。一つの態様において、上記方法は、上記細胞内で少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し、そして上記ポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で上記細胞を培養することを含む。
【０００８】
本明細書にて提供された方法は、様々な細胞種においてポリペプチドを生産又は分泌するのに適合できる。例えば、上記細胞は、植物細胞、真菌細胞、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物からなる群から選択され得る。一つの態様において、上記細胞はグラム陰性微生物、好ましくはエシェリヒア科のメンバーである。別の態様において、上記細胞はグラム陽性微生物、好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）科のメンバーである。好ましい態様において、上記細胞はグラム陽性微生物であり、且つバチルス科のメンバーであって、但し上記バチルス科のメンバーは、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスコアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｒａｎｓ）、バチルスラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスサリンジェネシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルスメタノリカス（Ｂ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）及びバチルスアンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からなる群から選択される。
【０００９】
本明細書に提供される方法により分泌又は生産されるポリペプチドはあらゆるポリペプチドであり得る。好ましい態様において、それは異種ポリペプチドである。一つの側面において、上記ポリペプチドは、ホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される。一つの態様において、上記ポリペプチドは酵素であり、好ましくはプロテアーゼ、カーボヒドラーゼ、レダクターゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、セルラーゼ、エンド−グルコシダーゼＨ、オキシダーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リグノセルロースヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びリグニナーゼからなる群から選択される。一つの態様において、上記ポリペプチドは、バチルスアンスラシスプロテアーゼ、好ましくはズブチリシンである。別の態様において、上記ポリペプチドはアミラーゼ、好ましくはバチルスアミラーゼである。
【００１０】
ペプチド輸送蛋白質は様々な蛋白質であり得、そして様々な様式において不活性化できる。一つの側面において、上記ペプチド輸送蛋白質は、ｄｃｉＡオペロンの遺伝子産物であり、そして好ましくはｄｃｉＡＥ遺伝子の遺伝子産物である。上記蛋白質は蛋白質レベル又は核酸レベルにおいて不活性化され得る。一つの側面においては、上記蛋白質をコードする遺伝子が変異されたために、上記蛋白質が不活性化される。別の態様においては、上記遺伝子を含むオペロンを変異させた。上記変異は様々な様式において引き起こされることができ、一つ又は複数のフレームシフト、挿入、置換又は欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。欠失は一つのヌクレオチドの欠失又はそれ以上であり、全遺伝子の欠失を含む。
【００１１】
発明の別の側面においては、細胞内でポリペプチドを生産する方法が提供され、生産されるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を得るが、細胞はペプチド輸送オペロンを含み、但し当該オペロンの少なくとも一つの遺伝子産物が上記細胞内で不活性化されており、そして上記ポリペプチドが生産されるように発現に適した条件下で上記細胞を培養する工程を含む。好ましくは、上記ペプチド輸送オペロンがｄｃｉＡオペロンである。上記オペロンの遺伝子産物は核酸レベル又は蛋白質レベルにおいて不活性化され得る。好ましくは、不活性化された遺伝子産物がｄｃｉＡＡ又はｄｃｉＡＥによりコードされる。
【００１２】
発明の別の側面において、本明細書において提供されるのは、ペプチド輸送オペロンを含む細胞であり、但し、当該オペロンは上記細胞が増加したポリペプチドの分泌を有するように変異されている。好ましい態様において、上記オペロンはｄｃｉＡオペロンである。一つの態様において、上記オペロンは、ｄｃｉＡＡ及び／又はｄｃｉＡ遺伝子の遺伝子産物を不活性化するように変異されている。
【００１３】
発明の詳細な説明
発明の一つの側面において、細胞内でポリペプチドの生産及び／又は分泌を増加させる方法が提供される。好ましい態様において、上記方法のために選択される細胞は少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する。好ましくは、選択された細胞は上記ペプチド輸送蛋白質を内在性に発現するが、しかしながら、上記細胞は上記蛋白質を発現するように形質転換することができる。一つの態様において、上記方法は、上記細胞内で少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化することを含む。上記方法は、さらに、上記ポリペプチドの発現及び分泌のために適した条件下で上記細胞を培養することを含む。
【００１４】
本明細書にて用いられる「ペプチド輸送蛋白質」は、ペプチド輸送に関与する蛋白質を意味する。ペプチド輸送に関与する蛋白質はペプチド輸送活性を有すると考えられる。一つの態様において、ペプチド輸送蛋白質は、ジペプチド又はオリゴペプチドの輸送、好ましくはジペプチドの輸送に関与する蛋白質を含む。一つの態様において、本明細書に記載されたペプチド輸送蛋白質又は系により輸送されるペプチドは２−１０アミノ酸の長さ、好ましくは２−８、そしてより好ましくは２−６のペプチドを含む。好ましい態様において、オリゴペプチドは３−７アミノ酸の長さであり、好ましくは５又は６アミノ酸の長さであり、そしてジペプチドは２つのアミノ酸である。
【００１５】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質は、蛋白質の移入（import）に関与することが好ましい。以下においてさらに議論されるとおり、不活性化は、様々な様式において、且つ個々の変異又は変異の組み合わせによりおこり得る。ペプチド輸送系は、ペプチドを移出及び／又は移入することにおいて活性を含み得る。本明細書における好ましい態様において、ペプチド輸送活性は遮断される。好ましくは、ペプチド輸送系によりペプチドの移入を低下させるか又は排除する。ペプチド輸送蛋白質は、当業界において公知であり、そして以下において議論されて当業界において公知のペプチド輸送オペロンによりコードされる蛋白質又は遺伝子産物を含む。
【００１６】
本明細書において使用される「オペロン」は、同じプロモーターにより全て制御される遺伝子のクラスターを意味する。ペプチド輸送オペロンはペプチド輸送蛋白質をコードする少なくとも一つの遺伝子を含む。ペプチド輸送オペロンは、ｏｐｐオペロン及びｄｃｉＡオペロン及びそれらの相同体を含む。本明細書中の一つの態様において、ペプチド輸送オペロンは、ｏｐｐオペロンを除外する。本明細書中の別の態様において、ペプチド輸送蛋白質は、ｏｐｐオペロンによりコードされる蛋白質を除外する。
【００１７】
ｏｐｐオペロンは、胞子形成の開始及び遺伝子応答能の発生に必要なオリゴペプチドパーメアーゼをコードすると報告された（Ｒｕｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：１３８８−１３９８）。ｏｐｐオペロンは３から５のアミノ酸のオリゴペプチドの移入又は移出に関与するＡＴＰ結合性カセットトランスポーターのファミリーのメンバーである。ｏｐｐオペロンには５つの遺伝子産物がある：ｏｐｐＡはリガンド結合蛋白質であって脂質アンカーにより細胞の外側に付着しており；ｏｐｐＢとｏｐｐＣは上記リガンドが輸送されることを通して複合体を形成する膜蛋白質であり；ｏｐｐＤとｏｐｐＦ（Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３−１８５）は、輸送のためのエネルギーを供給すると考えられたＡＴＰアーゼである（ＬｅＤｅａｕｘ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５３：６３−６９）。ｏｐｐオペロンはＲｕｄｎｅｒら、１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１３８８−１３９８によると、ＳｐｏＯＫとも呼ばれる。
【００１８】
ｏｐｐオペロンは、Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉら、１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１：１０８７−１０９９及びＴｙｎｋｋｙｎｅｎら、１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：７５２３−７５３２にも開示されている。機能するｏｐｐオペロンの存在又は不在に関する一つのアッセイは、３アミノ酸の毒性オリゴペプチドの存在下、例えば２つのＬ−アラニン分子とＬ−グルタミン酸類似体からなるトリペプチド、バイアラフォス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）（明治製菓、日本）の存在下での生育に、宿主を供することである。機能性ｏｐｐオペロンを有する細胞は阻害された生育を伴うことになる。ｏｐｐオペロン遺伝子クラスターの少なくとも一つの遺伝子に変異を有する細胞は、毒性オリゴペプチドの存在下で生育阻害を示さなくなる。
【００１９】
さらに、ペプチド輸送オペロン及びそのペプチドに関して、サルモネラティフィミリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆが、さらに、Ｈｉｌｅｓら、１９８７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９５：１２５−１４２に報告されている。バチルスサチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｆは、さらに、Ｐｅｒｇｏ，Ｍ．，ら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９１，５，１７３−１８５及びＲｕｄｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９１，１７３（４）：１３８８−１３９８に報告されている。エシェリヒアコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｏｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、さらに、Ｇｕｙｅｒら、１９８５ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：１０８１２−１０８１６に報告されている。また、ストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のａｍｉＡの報告もなされた（Ａｌｌｏｉｎｇ，Ｇ １９９４，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４１（１）：４４−５８）。バチルスサチルスのａｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅは、Ｋｏｉｄｅ Ａ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４ １３（３）：４１７−４２６に報告されている。さらに、エシェリヒアコリ及びサルモネラティフィミリウムのｄｐｐＡＡが、Ａｂｏｕｈａｍａｄ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５（５）：１０３５−１０４７に報告されている。さらに、ストレプマイセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のＢｌｄＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅが、Ｎｏｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６，２２（５）：８８１−９３に報告されている。ストレプトコッカスのｏｐｐＡが、Ｐｏｄｉｅｌｓｋｉ，Ａ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９６，２１（５）：１０８７−１０９９に報告されている。さらに、サルモネラティフィミリウムのＴｐｐＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅが、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９８４ １６０：１２２−１３０に報告されている。さらに、ｏｐｐＡがクラミジアニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）からも得られるかもしれないと報告されている。
【００２０】
ペプチド輸送オペロン又はその蛋白質を得ることができる生物は、限定ではないが、アキュイフェックスエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アルケオグロバスフルギヅス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、エアロピラムペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）、ボルデテラパーツーシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、バチルスサチルス、クロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロロビウムテピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クラミジアニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＣＷＬ０２９、クラミジアトラコマティスセロバー（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｓｅｒｏｖａｒ）Ｄ、クロストリジウムジフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、コリネバクテリウムジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、デイノコッカスラジオヂュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エシェリヒアコリ、エンテロコッカスフェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｃｉｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミコバクテリウムレプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、シュードモナスエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ピロコッカスフリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカスアビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ）、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラティフィミリウムを含む。
【００２１】
ｄｃｉＡは報告されており、例えばＳｌａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１）５（８），１９１５−１９２５及びＭａｔｈｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９１）５（８），１９０３−１９１３を参照されたく、バチルスにおけるジペプチド輸送オペロンとして報告された。このオペロンが報告されたが、各遺伝子産物の機能は、過去においてよく特性決定されていなかった。本明細書においては、ｄｃｉＡオペロンの蛋白質の機能が提供され、遺伝子産物が不活性化される機能特性を含む。
【００２２】
一つの態様において、ｄｃｉＡＡはペプチド輸送蛋白質であり、そしてｄｃｉＡＡの不活性化は増加したポリペプチドの生産及び／又は分泌を導く。別の態様において、ｄｃｉＡＥの不活性化は、低下したペプチド輸送及び増加したポリペプチド生産及び／又は分泌を導く。好ましい態様において、ｄｃｉＡＡはＲＮＡ結合活性を有する。ｄｃｉＡＡ，ｄｃｉＡＢ，ｄｃｉＡＣ，ｄｃｉＡＤ及びｄｃｉＡＥの態様をそれぞれ図２−６に示す。ｄｃｉＡはエシェリヒアコリのｄｐｐに相同性を有する。Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７３：２３４−２４４（１９９１）；Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｉ，Ｙ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ＤＮＡ Ｒｅｓ．５（２），５５−７６（１９９８）。
【００２３】
上記のものに加え、ペプチド輸送オペロンの相同体、ペプチド輸送遺伝子及びペプチド輸送蛋白質は、多数の方法により同定することができる。一つの態様において、核酸は、それが上で議論されたペプチド輸送活性を有する蛋白質をコードするなら、「蛋白質輸送遺伝子」である。好ましくは、上記核酸配列の全体の相同性は、図１に示すｄｃｉＡ遺伝子、即ちｄｃｉＡＡ，ｄｃｉＡＢ，ｄｃｉＡＣ，ｄｃｉＡＤ又はｄｃｉＡＥの一つと、好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７５％より高く、より好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは約８５％より高く、そしてもっとも好ましくは約９０％より高い。いくつかの態様においては、相同性が約９３から９５又は９８％ほどに高くなる。好ましくは、上記蛋白質は、図２、３、４、５、又は６に示すアミノ酸配列に対して、約４０％より高く、より好ましくは約６０％より高く、より好ましくは約７５％より高く、さらにより好ましくは約８０％より高く、さらに一層より好ましくは約８５％より高く、そしてもっとも好ましくは約９０％より高い全体の相同性を有する。いくつかの態様においては、相同性が約９３から９５又は９８％ほどに高くなる。
【００２４】
本明細書において使用される相同性は、配列類似性又は同一性に関してであり、同一性が好ましい。この相同性は当業界公知の標準技術を用いて決定され、限定ではないが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所性相同アルゴリズムを含み、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性に関する研究法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（ウイスコンシンジェネティックスソフトウエアパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンスドライブ、マジソン、ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）により記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムによるか、好ましくは欠点セッティングを用いるか、又は視察（inspection）による。
【００２５】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、前進性の対をなす整列化を用いた関連配列のグループからの複数の配列整列化を創製する。それは、整列化を創製するために使用されるクラスター化の関係を示す木をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の前進性整列化法の簡単なものを使用する；当該方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）に記載された方法と類似している。有用なＰＩＬＥＵＰのパラメーターは３．００の欠点ギャップウエイト、０．１０の欠点ギャップ長さ、及び重くされた末端ギャップを含む。
【００２６】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＣＲＣＥ，ｈｔｍｌ］から得られる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを用い、それらのほとんどが欠点値に対して設定される。調整可能なパラメーターは以下の値を用いて設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５，ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは流動する値であり、目的の配列が検索されている特定の配列の組成及び特定のデータベースの組成にそれ自身が依存するプログラムにより確立される；しかしながら、上記値は感度を増加させるために増加させてよい。％アミノ酸配列同一性の値は、整列化された領域内の「より長い」配列の残基の全部の数で、適合する同一残基の数を割ることにより、測定される。「より長い」配列は整列化された領域内においてもっとも真の（actual）残基を有する配列である（整列化スコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップを無視する）。
【００２７】
即ち、「パーセント（％）核酸配列同一性」は、核酸の図に示される配列のヌクレオチド残基と同一の候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。好ましい方法は、欠点パラメーターに対して設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモードを利用し、オーバーラップスパンとオーバーラップフラクションをそれぞれ１と０．１２５に設定する。
【００２８】
整列化は、整列される配列内のギャップの導入を含んでよい。さらに、核酸の図の配列よりも多いか又は少ないヌクレオシドを含む配列に関しては、ヌクレオシドの全数に関して相同なヌクレオシドの数に基づいて相同生のパーセンテージが決定されることになる。即ち、例えば、本明細書において同定されて以下に議論される配列の相同性よりも低い配列相同性は、短い配列内のヌクレオシドの数を用いて決定されることになる。
【００２９】
一つの態様において、ペプチド輸送遺伝子又は蛋白質はハイブリダイゼーション研究を用いて測定される。即ち、例えば、図の中で同定された核酸配列に対して高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする核酸（オペロンのそれ、その個々の遺伝子又はその断片）、又は相補体は本明細書中の一つの態様においてペプチド輸送遺伝子と考えられる。高いストリンジェンシー条件は当業界で知られている；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，編纂Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．を参照されたく、両者は引用により本明細書に編入される。ストリンジェンシーの条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下では異なる。長い配列は高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲のガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見いだされる。一般に、ストリンジェンシーの条件は、規定されたイオン強度のｐＨにおける特定の配列に関しての熱融点（Ｔｍ）より約５−１０Ｃ低いように選択される。Ｔｍは標的に対して相補なプローブの５０％が平衡して標的配列にハイブリダイズする温度である（期待されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）（標的配列が過剰に存在すればＴｍにおいてプローブの５０％が平衡して占有される。）。ストリンジェンシーの条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低い条件になり、典型的にはｐＨ７．０から８．３にて約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度は短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０Ｃであり、そして長いプローブ（例えば、５０より長いヌクレオチド）に関しては少なくとも約６０Ｃである。ストリンジェンシーの条件は脱安定化剤、例えばフォルムアミドの添加により達成してもよい。
【００３０】
別の態様においては、低いストリンジェンシー条件を用いる；例えば、中度又は低度のストリンジェンシー条件を用いてよく、当業界では知られている；Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，前記、及びＴｉｊｓｓｅｎ，前記を参照されたい。
【００３１】
本明細書に提供される遺伝子及び蛋白質の天然に生じる対立遺伝子バリアントを本発明の方法において使用してもよい。
ペプチド輸送遺伝子、オペロン、蛋白質又はペプチドの輸送オペロン遺伝子及び蛋白質の相同体を発見するための上記技術を用いることに加えて、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）に記載されたようなポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）技術において実施された、本明細書にて提供されたような配列の断片の標準の増幅を使用してよい。本明細書にて提供されるオペロン遺伝子からの少なくとも約１０のヌクレオチド及び多くて約６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１２から３０ヌクレオチド、そしてより好ましくは約２０−２５ヌクレオチドを、プローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００３２】
本明細書にて使用される用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを意味する。特に限定しない限り、当該用語は、基準（reference）核酸と同じ結合特性を有し、そして天然に生じるヌクレオチドに類似の様式にて代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に示さなければ、特定の核酸配列は、その便利に修飾されたバリアント（例えば、コドンの置換を縮重する）及び相補配列をも明確に包含し、そして同じく配列が明確に示される。特定すれば、縮重コドンの置換は、一つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンを混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換するように配列を生じさせることにより、達成してよい（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。核酸なる用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００３３】
本明細書にて使用される「蛋白質」は、蛋白質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。当業者には認識されるとおり、発明の核酸配列を用いて蛋白質配列を生成することができる。好ましいペプチド輸送蛋白質は、不活性化の前にペプチド輸送活性を有し、そして／又はペプチド制御オペロンにより制御される。
【００３４】
本明細書に提供される方法は、真核生物及び原核生物を含む様々な細胞種におけるポリペプチドの生産又は分泌に適用可能である。例えば、上記細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、御中細胞、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物からなる群から選択することができる。
【００３５】
本明細書にて使用される真菌細胞又は真菌は、キトリジオミセテス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ハイフォキトリジオミセテス（Ｈｙｐｈｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、プラズモジオフォロミセテス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、オーミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、トリコミセテス（Ｔｒｉｃｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）及びバシディオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。一つの態様においては、繊維状真菌を使用する。繊維状真菌の様々な種を発現宿主として使用してよく、以下の属を含む：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクルヤ（Ａｃｈｌｙａ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、コクリオボラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）及びフィリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）。一つの態様は、ペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を含む。一つの態様は、フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）を含む。特定の発現宿主は、Ａ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５；Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ（１９８４）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６，３８６−３８９；Ｔｉｌｂｕｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ ２６，２０５−２１１；Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１２，２８４−２８９；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｉ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４，１３０７−１３１１）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｍ．Ｈｙｎｅｓ（１９８５）ＥＭＢＯ ４，４７５−４７９）、Ａ．アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）、例えばＮＲＲＬ ３１１２，ＡＴＣＣ ２２３４２，ＡＴＣＣ ４４７３３，ＡＴＣＣ １４３３１及び株ＵＶＫ １４３ｆ、Ａ．オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）、例えば、ＡＴＣＣ １１４９０，Ｎ．クラッサ（ｃｒａｓｓａ）（Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５２５９−５２６３；Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ 米国特許第４，４８６，５５３号；Ｋｉｎｓｅｙ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｒａｍｂｏｓｅｋ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，１１７−１２２；Ｂｕｌｌ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｗｏｏｔｏｎ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０，７０１−７０４），トリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、例えばＮＲＲＬ １５７０９，ＡＴＣＣ １３６３１，５６７６４，５６７６５，５６４６６，５６７６７，及びトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、例えばＡＴＣＣ ３２０９８及び３２０８６を含む。
【００３６】
別の態様においては、ポリペプチドの生産又は分泌のために酵母細胞を利用するか又は提供する。酵母は、ここにおいて適しており、限定ではないが、メタノール上で成育可能な酵母を含み、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる群から選択される。このクラスの酵母の例である特定の種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見いだしてよい。例えば、カンジダ種は限定ではないが、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ（トルロプシス）グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダパラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダルシタネア（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｅａｅ）、カンジダルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）及びカンジダシュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含む。
【００３７】
一つの態様において、ここで利用されるか又は提供される細胞は、グラム陰性微生物である。一つの態様において、上記細胞は、腸内細菌由来であり、例えばエシェリヒア、例えば、エシェリヒアコリ、エンテロバクター、エルウイニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、サルモネラティフィミリウム、セラチア、例えば、セラチアマルセスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、シゲラ又はシュードモナス、例えばシュードモナスエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。
【００３８】
別の態様において、上記細胞は、グラム陽性微生物、好ましくはバチルス科のメンバーであるが、他のグラム陽性細胞、例えばストレプトミセス由来の細胞を用いることができる。好ましい態様において、上記細胞はグラム陽性微生物であり、そしてバチルス科のメンバーであり、バチルス科のメンバーは、バチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリクエファシエンス、バチルスコアグランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタス、バチルスサリンジェネシス、バチルスメタノリカス及びバチルスアンスラシスからなる群から選択される。
【００３９】
本明細書に提供される方法により分泌又は生産されるポリペプチドは、興味のある如何なるポリペプチドでもあり得る。好ましい態様において、それは異種（heterologous）ポリペプチドである。あるいは、上記蛋白質は異種同形（homologous）であり、以下に議論されるとおりである。
【００４０】
一つの側面において、生産され及び／又は分泌されるポリペプチドは、ホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される。一つの態様において、ポリペプチドは酵素である。本明細書にて使用される酵素は、限定ではないが、（ｉ）オキシドレダクターゼ；（ｉｉ）一炭素基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチル−、フォルミル−、及び関連トランスフェラーゼ、カルボキシル−及びカルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ）、アルデヒド又はケトン残基を転移させるトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ（例えば、アシルトランスフェラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ）、アルキル又は関連基を転移させるトランスフェラーゼ、窒素含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、アミノトランスフェラーゼ、オキシミノトランスフェラーゼ）、リン含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、ホスホトランスフェラーゼ、ピロホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、イオウ含有基を転移させるトランスフェラーゼ（例えば、サルファートランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）を含むトランスフェラーゼ、（ｉｉｉ）エステル結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、カルボキシルエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフォリックモノエステルヒドロラーゼ、ホスフォリックジエステルヒドロラーゼ、トリホスフォリックモノエステルヒドロラーゼ、サルファリックエステルヒドロラーゼ）、グリコシル化合物に作用するヒドロラーゼ（例えば、グリコシドヒドロラーゼ、加水分解するＮ−グリコシル化合物、加水分解するＳ−グリコシル化合物）、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、チオエステルヒドロラーゼ）、ペプチド結合に作用するヒドロラーゼ（例えば、アミノアシル−ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ）、ペプチド結合意外のＣ−Ｎ結合に作用するヒドロラーゼ、酸無水物に作用するヒドロラーゼ、Ｃ−Ｃ結合に作用するヒドロラーゼ、ハライド結合に作用するヒドロラーゼ、Ｐ−Ｎ結合に作用するヒドロラーゼを含むヒドロラーゼ、（ｉｖ）炭素−炭素リアーゼ（例えば、カルボキシル−リアーゼ、アルデヒド−リアーゼ、ケト酸−リアーゼ）、炭素−酸素リアーゼ（例えば、ヒドロ−リアーゼ、他の炭素−酸素リアーゼ）、炭素−窒素リアーゼ（例えば、アンモニア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ）、炭素−イオウリアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ、他のリアーゼを含むリアーゼ、（ｖ）ラセマーゼ及びエピメラーゼを含むイソメラーゼ、シス−トランスイソメラーゼ、分子内オキシドレダクターゼ、分子内トランスフェラーゼ、分子内リアーゼ、他のイソメラーゼ、（ｖｉ）Ｃ−Ｏ結合を形成するか、Ｃ−Ｓ結合を形成するか、Ｃ−Ｎ結合を形成するか、Ｃ−Ｃ結合を形成するリガーゼ又はシンセターゼを含むリガーゼ又はシンセターゼを含む。
【００４１】
目的のポリペプチドは治療上重要な蛋白質、例えば成長因子、サイトカイン、リガンド、受容体及び阻害剤、並びにワクチン及び抗体であってよい。
好ましい態様において、生産されるか又は分泌されるポリペプチドの前駆体ｍＲＮＡは、仮想ＲＮａｓｅ分割部位又はペプチド輸送蛋白質のための結合部位を含む。好ましい態様において、生産されるか又は分泌されるポリペプチドは、特定のペプチド輸送蛋白質認識部位を含む。好ましくは、認識部位は結合部位である。好ましくは、認識部位はｄｃｉＡＡの結合部位である。
【００４２】
本明細書にて使用されるとおり、用語「異種（heterologous）蛋白質」は、宿主細胞内で天然には生じない蛋白質又はポリペプチドを意味する。用語「異種同形（homologous）蛋白質」又は「内在性（endogenously）発現される」は、天然又は宿主細胞内で天然に生じる蛋白質又はポリペプチドを意味する。一つの態様において、発明は、組換えＤＮＡ技術を通して異種同形蛋白質を生産する宿主細胞を含む。組換え蛋白質は、宿主へ導入された核酸によりコードされるあらゆる蛋白質を意味する。
【００４３】
本明細書にて使用される「不活性蛋白質」又は文法上の均等物は、その野生型形態にて、例えばその変化していない宿主中で発現されたときに、上記蛋白質の検出可能な活性の低下を意味する。ペプチド輸送蛋白質の活性は、ジペプチド又は３−７アミノ酸、より好ましくは５又は６のアミノ酸のオリゴペプチドの、好ましくは細胞への移入と関連させた輸送を含む。好ましい態様において、ペプチド輸送活性を低下させるか又は排除する。
【００４４】
発明の一つの側面において、ペプチド輸送オペロンの遺伝子産物は、オペロンを活性化する場合には不活性であるか又は不活性化させる。好ましくは、不活性化された遺伝子産物はｄｃｉＡＡ及び／又はｄｃｉＡＥによりコードされる。好ましい態様において、不活性化遺伝子産物に相当する野生型遺伝子産物は、不活性化遺伝子産物が低下したか又は排除されたｍＲＮＡとの相互作用を有する、少なくともＲＮＡ結合活性又はＲｎａｓｅ活性を含む。
【００４５】
ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの遺伝子産物は、蛋白質レベル又は核酸レベルにおいて不活性化できる。本発明の細胞及び方法は一つより多い不活性化蛋白質を含んでよいことが認識される。一つの態様において、２つのオペロンを利用し、ｏｐｐオペロンとｄｃｉＡオペロンである。一つの態様において、ｏｐｐオペロン由来の少なくとも一つの遺伝子産物及びｄｃｉＡオペロン由来の少なくとも一つの遺伝子産物が不活性である。
【００４６】
多くの実施例を本明細書において考察するが、遺伝子、蛋白質又はオペロン、あるいはその組み合わせにおいて一つ又は複数の変異又は修飾により不活性が生じ得ることは認識される。例えば、一つの態様において、変異はｏｐｐＡオペロン内に作成し、そして一つの変異をｄｃｉＡオペロン内に作成し、そしてより特定すればｏｐｐＡＡ及びｄｃｉＡＡにおいてである。別の態様において、２つ又はそれより多い変異を同じ遺伝子、蛋白質又はオペロンに対して作成する。別の態様において、２つ又はそれより多い変異を作成するが、変異は同じオペロンの別の遺伝子か又は別のオペロン内であって、変異は同じ遺伝子内であるか又は変異を別のオペロン内に作成する場合には別の遺伝子内であり得る。一般に、本明細書にて使用されるとおり、変異は、本明細書にて記載される遺伝子、蛋白質、系又は活性の不活性化を意味する変化を意味する修飾と交換可能に使用される。
【００４７】
一つの側面において、上記蛋白質は当該蛋白質をコードする遺伝子が変異しているため、不活性化される。一つ又はそれより多いフレームシフト、置換、挿入及び／又は欠失を含む様々な様式にて変異を起こさせることができ、以下に詳細に説明される。欠失は単一又はそれ以上のヌクレオチドの欠失であり、遺伝子全体の欠失を含む。本明細書に記載された不活性蛋白質を含む細胞及び上記細胞の作成方法も本明細書に提供されることが認識される。
【００４８】
一つの態様において、本明細書に記載される不活性蛋白質は、宿主細胞のゲノムからの天然に生じる遺伝子の置換及び／又は不活性化により到達する。好ましい態様において、変異は非復帰変異である。
【００４９】
遺伝子をコードする核酸を変異させる方法は、当該核酸又はその一部をクローン化し、部位特異的変異導入により核酸を修飾し、そして変異した核酸を細胞内へプラスミド上にて再導入することである。相同組換えにより、変異した遺伝子を染色体に導入してよい。親宿主細胞において、結果は天然に生じた核酸及び変異した核酸が染色体上に直列に位置することである。第２の組換え後に、親宿主細胞の子孫のために染色体遺伝子に、それにより有効に変異を導入された染色体に、修飾された配列を残す。
【００５０】
遺伝子産物を不活性化する別の方法は、染色体遺伝子コピーを欠損させることによる。好ましい態様において、遺伝子全体を欠損させるが、復帰が不可能なようにさせる様式にて欠損を生じさせる。別の好ましい態様において、一部の欠失を生じさせるが、染色体内に残された核酸はプラスミドによりコードされた遺伝子と相同組換えするには短いようにする。
【００５１】
天然に生じる遺伝子の欠損は以下のとおりに実施できる。その５’及び３’領域を含む遺伝子を単離してクローニングベクターに挿入する。当該遺伝子のコーディング領域を上記ベクターからインビトロにおいて欠損させて、十分な量の５’及び３’のフランキング配列を置き去りにすることにより、親宿主細胞内における天然に生じた遺伝子との相同組換えを提供する。上記ベクターを用いて、次に、上記宿主細胞を形質転換する。ベクターは上記フランキング領域において相同組換えを通して染色体に組み込まれる。この方法は、上記遺伝子が欠失した株を導く。
【００５２】
組み込み方法において使用されるベクターは、プラスミドが好ましい。選択可能なマーカーは、所望の組換え微生物の同定の容易さを可能にさせるように含ませてよい。さらに、当業者には理解されるとおり、上記ベクターは染色体に選択的に導入可能なものが好ましい。これは、誘導可能な複製オリジン、例えば温度感受性オリジンをプラスミドに導入することにより達成することができる。複製オリジンが感受性の温度において形質転換体を成育させることにより、上記プラスミドの複製機能が不活性化され、それにより染色体組み込み体の選択手段を提供する。組み込み体は、選択可能なマーカー、例えば抗生物質の存在下で高温における成育に関して選択してよい。組み込み機構はＷＯ８８／０６６２３に記載されている。
【００５３】
キャンベルタイプの機構における組み込みは遺伝子の５’フランキング領域において起こり得て、染色体内の座において完全なプラスミドベクターを含む株をもたらす。異常な組換えは異なる結果を提供するため、全遺伝子が欠失したか否かを、例えば核酸配列決定又は制限マップにより決定する必要がある。
【００５４】
天然に生じる遺伝子を不活性化する別の方法は、変異原性のオリゴヌクレオチドにより細胞を形質転換することにより、染色体遺伝子コピーを変異させることである。あるいは、染色体プロテアーゼ遺伝子を、相同組換えにより変異遺伝子で置換することができる。
【００５５】
好ましい態様において、本発明は、さらにプロテアーゼの欠失又は変異を有する宿主細胞を包含する。例えば、バチルスにおいてよく知られたプロテアーゼの欠失は、有効な異種発現のために一般的に使用されるａｐｒ，ｎｐｒ，ｅｐｒ，ｍｐｒ内の欠失又は変異を含む。プロテアーゼの他の態様は、例えば米国特許第５，２６４，３６６号に記載される。
【００５６】
核酸レベルにおいて蛋白質を不活性化する別の方法は、アンチセンス分子の使用を含む。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、本発明によれば、ペプチド輸送蛋白質のコーディング領域の断片又はペプチド輸送オペロンの産物を含む。そのような断片は通常少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する可能性は、与えられた蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）及びｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９８８）に記載される。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、いくつかの手段の一つにより標的配列の転写又は翻訳をブロックする二重鎖の形成をもたらし、二重鎖の増強された分解、転写又は翻訳の成熟前停止を含み、あるいは他の手段による。
【００５７】
リボザイムも一つの態様において不活性化のために使用してよい。リボザイムはＲＮＡの特異的分解を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、続く核酸内部分解により作用する。有力なＲＮＡ標的内の特定のリボザイム分解部位は公知の技術により同定できる。さらなる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５１を参照されたい（１９９７年９月１８日に公開された）。
【００５８】
ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの産物は、蛋白質レベルにおいて不活性であるか又は不活性化してもよい。例えば、上記蛋白質又は遺伝子産物をコードする核酸は完全であってよいが、上記細胞は蛋白質又は遺伝子産物がその天然活性、例えばペプチド輸送活性又はＲＮＡ相互作用活性を有することを阻害するように、アンタゴニスト又は阻害剤、例えば抗体を含んでよい。さらに、上記蛋白質は、不活性バリアントとして発現されるか、又は例えば温度感受性ペプチド輸送を有することにより条件的に不活性でああってよい。
【００５９】
細胞内での蛋白質の生産及び／又は分泌のため、異種又は異種同形蛋白質をコードする核酸の少なくとも１コピーを含む発現ベクター、そして好ましくは複数コピーを含む発現ベクターで、蛋白質発現に適した条件下で、細胞を形質転換する。
【００６０】
本発明において使用される発現ベクターは、上記蛋白質に付随して（associated with）少なくとも一つのプロモーターを含み、当該プロモーターは上記宿主細胞内で機能する。本発明の一つの態様において、上記プロモーターは選択された蛋白質に関して野生型のプロモーターであり、そして本発明の別の態様においては、プロモーターは上記蛋白質に対して異種であるが、宿主細胞内ではやはり機能する。本発明の一つの好ましい態様において、目的のポリペプチドは安定に宿主ゲノムに組み込まれる。シグナル配列は必要なら追加してよい。
【００６１】
好ましい態様において、上記発現ベクターは、ベクターにとって唯一の少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を好ましくは含む複数クローニング部位のカセットを含むことにより、核酸の操作の容易性を楽にする。好ましい態様において、上記ベクターは一つ又は複数の選択可能なマーカーも含む。本明細書にて使用されるとおり、選択可能なマーカーなる用語は、ベクターを含む宿主の選択の容易性を可能にする宿主内で発現可能な遺伝子を意味する。そのような選択可能なマーカーの例は、限定ではないが、抗生物質、例えばエリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンを含む。
【００６２】
本発明の一つの態様において、興味のあるポリペプチド少なくとも一つをコードする核酸は、宿主細胞内で複製できる発現ベクターを通して宿主細胞に導入される。バチルスのために適した複製プラスミドは、引用により特別に編入される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，編纂、Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されており、プラスミドに関する第３章を参照されたい。バチルスサチルスに適した複製プラスミドは９２頁に掲載される。いくつかの戦略がバチルス内でＤＮＡを直接クローニングするための文献において記載された。プラスミドマーカーレスキュー形質転換は、部分的に相同な内在のプラスミドを有するコンピテント細胞によるドナープラスミドの取り込みを含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１（１９７９）；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５−１９１（１９９０）；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（３）：１２０５−１２１１（１９８７））。入って来るドナープラスミドは、染色体組換えを模倣するプロセスにおいて内在の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組換わる。
【００６３】
プロトプラストの形質転換による形質転換は、バチルスサチルスに関してはＣｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ １６８：１１１−１１５；バチルスメガテリウムに関してはＶｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ７：２６１−２６３；バチルスアミロリクエファシエンスに関してはＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；バチルスサリンゲネシスに関してはＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３−２１７；バチルススフェリカスに関してはＭｃＤｏｎａｌｄ（１９８４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３；バチルスラーバエに関してはＢａｋｈｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）４９：５７７に記載されている。Ｍａｎｎら（１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１−１３５）は、バチルスプロトプラストの形質転換を報告し、そしてＨｏｌｕｂｏｖａ，（１９８５ Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７）はＤＮＡを含むリポソームを用いたプロトプラストへのＤＮＡ取り込みの方法を開示する。マーカー遺伝子の存在／不在は、目的の遺伝子が宿主細胞内に存在するか否かを示唆し得る。
【００６４】
あるいは、興味のあるポリペプチドのコーディング配列を含む宿主細胞を、当業者に知られた様々な手法により同定してよい。これらの手法は、限定ではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び蛋白質バイオアッセイ又は免疫アッセイ技術を含み、核酸又は蛋白質の検出及び／又は定量のための、膜に基づく技術、溶液に基づく技術、又はチップに基づく技術を含む。
【００６５】
分泌されたポリペプチドの活性を検出して測定するため、当業者に知られている様々なアッセイが存在する。特に、プロテアーゼに関しては、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがあり、２８０ｎｍにおいて吸光度として測定されるか又はフォーリン法を用いて比色により測定される（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。他のアッセイは発色体基質の可溶化を含む（Ｗａｒｄ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｍ．Ｆｏｇａｒｔｙ，編纂）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２５１−３１７）。
【００６６】
宿主細胞内で異種又は異種同形蛋白質の分泌のレベルを測定して、分泌された蛋白質を検出するための手段は、当該蛋白質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れかの使用を含む。例は、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。これら及び他のアッセイは、数ある部分の中でもとりわけＨａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ（１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ ＭＮ）及びＭａｄｄｏｘ ＤＥ ｅｔ ａｌ（１９８３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）に記載される。好ましい態様において、同じ方法又は組成物を用いた場合であるが、ペプチド輸送蛋白質又はペプチド輸送オペロンの遺伝子産物を不活性化しなかった場合よりも、本明細書に提供された方法又は組成物を用いると分泌は高い。好ましい態様において、ＲＮａｓｅ活性を低下させた場合に、ポリペプチドの生産及び／又は分泌を増加させる。別の好ましい態様において、ペプチド輸送活性を低下させた場合に、生産及び／又は分泌を増加させる。
【００６７】
様々な標識及び配合技術が当業者には知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイにおいて使用することができる。標識されたハイブリダイゼーションを生じさせる手段又は特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのＰＣＲプローブは、標識されたヌクレオチドを用いた、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化又はＰＣＲ増幅を含む。あるいは、ヌクレオチド配列、又はその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブ生産のためにベクターにクローン化してよい。そのようなベクターは、当業界において知られており、市販されており、Ｔ７，Ｔ３又はＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの添加によりインビトロにてＲＮＡプローブを合成するのに使用してよい。
【００６８】
多数の会社、例えばファルマシアバイオテック（ピスカタウエイ ＮＪ）、プロメガ（マジソン ＷＩ）、及びバイオケミカルコープ（クリーブランド ＯＨ）が、これらの手法のための市販キット及びプロトコルを供給する。適当なリポーター分子又は標識は、それらの放射線核種、酵素、蛍光、化学発光体、発色剤並びに基質、共因子、阻害剤、磁気粒子等を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９９６，３４５号；第４，２２７，４３７号；第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号を含む。また、組換えイムノグロブリンを、引用により本明細書に編入される米国特許第４，８１６，５６７号に示されたとおりにして製造してよい。
【００６９】
異種蛋白質又は異種同形蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された細胞か又は上記蛋白質を内在して有する細胞を、コードされた蛋白質の細胞培養物からの発現及び回収に適した条件下で培養してよい。他の組換え構築物は、上記の異種又は異種同形のポリヌクレオチド配列を、可溶性蛋白質の精製を楽にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列へ連結してよい（Ｋｒｏｌｌ ＤＪ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：４４１−５３）。
【００７０】
そのような精製を楽にするドメインは、限定ではないが、固定化された金属上での精製を可能にさせる金属キレートペプチド、例えばヒスチジン−トリプトファン分子（Ｐｏｒａｔｈ Ｊ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３：２６３−２８１）、固定化されたイムノグロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系において利用されるドメイン（イミュネックス社、シアトル ＷＡ）を含む。精製ドメインと異種蛋白質の間の、分割可能なリンカー配列、例えば因子ＸＡ又はエンテロキナーゼ（インビトロジェン、サンディエゴ ＣＡ）の包含は、精製を楽にするために使用することができる。
【００７１】
本発明を実施する様式及び方法は、当業者であれば以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろうが、実施例は本発明又は請求の範囲に記載された範囲を限定する如何なる様式にも意図されない。本明細書において引用された全ての文献は引用によりそれらの全体を特に本明細書に編入する。
【実施例１】
【００７２】
実施例Ｉ
実施例ＩはｄｃｉＡオペロンのｄｃｉＡＥ遺伝子内に変異を有するバチルスサチルス由来のズブチリシン及びアミラーゼの生産の増加を示す。
ｄｃｉＡＥ野生型又はｄｃｉＡＥ変異体を含む株由来のズブチリシンの振盪フラスコ内での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）を含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。３０ｕｌの解凍バイアルを、６８ｇ／Ｌソイトン、３００Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｇ／Ｌグルコース（最終ｐＨ６．８）を含む４０ｍＬの培地を２５０ｍＬフラスコ中にて接種するのに使用した。振盪フラスコを３７℃において激しく振盪しながらインキュベートし、その後それらは上清のズブチリシン分析のためにサンプリングする。
【００７３】
液体培養物からの上清を生育の間の異なる時間において回収して、以前に記載されたとおりに０．３ｍＭのＮ−サクシニミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８を含む溶液中で、２５℃において、ズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，６５１８−６５２１）。
【００７４】
当該アッセイはｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍ／分の吸光度の増加を測定した。表１は試験された２つの株から生産されたプロテアーゼの終了を記載する。
【００７５】
２４時間後に、ｄｃｉＡＥに関して欠失させた株は対照よりも３．５倍多いズブチリシンを分泌した。４８時間後に、増加は４．９倍である（表１）。
表１
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（率）４８時間
２７９０ ｄｃｉＡＥ野生型 ０．８８８
２７９０ ｄｃｉＡＥ− ４．３８
ｄｃｉＡＥ野生型又はｄｃｉＡＥ変異体を含む株由来のアミラーゼの振盪フラスコ内での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）を含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。３０ｕｌの解凍バイアルを、６８ｇ／Ｌソイトン、３００Ｍ ＰＩＰＥＳ、２０ｇ／Ｌグルコース（最終ｐＨ６．８）を含む４０ｍＬの培地を２５０ｍＬフラスコ中にて接種するのに使用した。振盪フラスコを３７℃において激しく振盪しながらインキュベートし、その後それらは上清のズブチリシン分析のためにサンプリングする。
【００７６】
全ブロスサンプルを生育の異なる時間においてスピンダウンして、それらの上清を以下のとおりにアッセイした。上清をキュベット中で７９０．０ｕｌの基質（メガザイム−セラルファ−アルファアミラーゼ；基質を水で希釈して１部基質プラス３部アルファアミラーゼバッファーｐＨ６．６として使用する）と２５０Ｃにおいて混合した。アルファアミラーゼバッファーは、５０ｍＭマレイン酸バッファー、５ｍＭ ＣａＣｌ２，及び０．００２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＨ＝６．７からなる。アミラーゼは、アミラーゼ活性のためのプロトコルを用いてスペクトロニックジェネシス２スペクトロフォトメーター中で測定した（波長：４１０ｎｍ，初期ディレイ：７５秒、全測定時間：１２０秒、下限：０．０８、上限：０．１２）。
【００７７】
結果は、ｄｃｉＡＥ欠失を含む株が、ｄｃｉＡＥ野生型遺伝子が存在した時よりも４８時間目において１．８倍多いアミラーゼを生産したことを示す。６０時間目には、増加が２．５倍である（表２）。
【００７８】
表２は試験された２つの株から製造されたアミラーゼの収量を記載する。
表２
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（率）４８時間 ６０時間
２７９０ ｄｃｉＡＥ野生型 ０．０５４ ０．０６６
２７９０ ｄｃｉＡＥ− ０．０９８ ０．１６８
【実施例２】
【００７９】
実施例２
実施例２は、ｏｐｐＡオペロンのｏｐｐＡＡ中に変異を有し、そしてｄｃｉＡオペロンのｄｃｉＡＡ遺伝子の欠失を有するバチルスサチルスのズブチリシンの生産の付加的な増加を示す。
ｄｃｉＡＡ欠失及びｏｐｐＡＡ変異を含む株からの組換えズブチリシンの振盪フラスコ中での生産
試験される株は２５０ｍＬフラスコ内に２５ｍＬのＬＢ（ディフコ）及び２５ｕｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む振盪フラスコ内で生育させた。振盪フラスコを３７℃において激しい振盪を伴いインキュベートし、そしてＯＤ５５０が０．８の時に、１ｍＬの培養液を０．５ｍＬの３０％グリセロールと混合して、さらなる実験のために凍結させた。２５ｍＬのＦＮＡ３４ＥＢ培地（リットルあたり：９０．７２ｇのＰＩＰＥＳ酸形態、ｐＨ６．８に、３４．００ｇソイトン（ディフコ）、２滴のＭａｚｕ ＤＦ−２０４，４０ｍＬの５０％グルコース）を２５０ｍｌフラスコ中。
【００８０】
試験された株からのグリセロールストック１０ｕＬを各フラスコに加えた。一度接種したら、フラスコを３７℃において２５０ｒｐｍにてインキュベートし、そしてサンプルを各２４時間ごとに７５時間まで取り出した。１ｍＬのサンプルを滅菌フードの中に取り出し、そしてＯＤ５５０に関して測定した。サンプルを１分間遠心分離することにより細胞を沈殿させた。
【００８１】
液体培養物からの上清を生育の間の異なる時間に回収して、以前に記載されたとおりに、０．３ｍＭのＮ−サクシニミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６を含む溶液中で、２５℃において、ズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，６５１８−６５２１）。当該アッセイはｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。
【００８２】
表３は、２つの株から生産されたプロテアーゼの収量を記載する。結果は、ｄｃｉＡＡの欠失及びｏｐｐＡＡの変異を含む株が、ｄｃｉＡＡ野生型が存在した場合よりも１．９倍多いプロテアーゼを生産したことを示す。
表３
Ｂ．サチルス株 遺伝子型 ズブチリシン（ｍｇ／Ｌ）
２７時間 ５１時間 ７５時間
００１ ｏｐｐＡＡ− ３０ １０５ １３８
０４０ ｏｐｐＡＡ−ｄｃｉＡＡ− ２８ １２４ ２６２
増加した酵素の生産においてｄｃｉＡ蛋白質を欠損させることにおいて見いだされた効果は、この蛋白質とズブチリシン（ａｐｒ）ｍＲＮＡの間の可能な相互作用のためであり得た。次のセクションにおいて示されるとおり、我々は、ｄｃｉＡＡと上記ＲＮＡと相互作用する蛋白質の間にいくらかの相同性が存在することを示し、さらにズブチリシンの非翻訳ｍＲＮＡ領域内（＋１ ｍＲＮＡにて開始する）に「仮想Ｒｎａｓｅ分割部位」が存在する事実を我々が見いだしたことを示す。ズブチリシン内のこの仮想Ｒｎａｓｅ Ｅ分割部位は、ＲＮＡ Ｉ内に同定された部位と６／７の同一性を有する（表４）。この部位はＲＮＡｓｅ Ｅにより分割される（Ｔｏｍｃｓａｎｙｉ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｓ １９８５；Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ Ｓ １９９１；Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ １９９４）。上記仮想Ｒｎａｓｅ Ｅ部位は９Ｓ ＲＮＡ内のＲｎａｓｅ Ｅに関して証明された分割部位と７／７の同一性を有する（Ｒｏｙ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ａｐｉｒｉｏｎ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７４７，２００−２０８ １９８３）（表４）。
表４
ＲＮＡ 位置 配列
ズブチリシン ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＡＡＵ
ＲＮＡ Ｉ ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＵＡＵ
９Ｓ ＲＮＡ ＋１ ５’ｍＲＮＡ ＡＣＡＧＡＡＵ
理論に拘束される訳ではないが、我々は、ｄｃｉＡＡ蛋白質の機能の一つがこのＲＮＡの安定性又は当該蛋白質の翻訳に影響するＲＮＡのこの領域に結合する可能性があり得ると信じる。即ち、本明細書には、仮想ｄｃｉＡＡ認識部位を含む蛋白質のペプチド生産／分泌を増加させる方法も提供される。
ｄｃｉＡＡと他の蛋白質の間の相同性
ｄｃｉＡＡ遺伝子の予期された生産を使用することにより、ジェンバンクのデータベースの翻訳を検索したところ、ｄｃｉＡＡ遺伝子産物とバチルスメタノリカスとの間（７５％同一性）、デイノクッカスラジオジュランス由来の仮想ペプチドＡＢＣ輸送体との間（３３％同一性）、及ピロコッカスアブイシ由来のｄｐｐＡジペプチド輸送蛋白質との間（２８％同一性）で、ｂｌａｓｔ相同性が見いだされた。用いた検索プログラムはＢＳＯＲＦであり、ｆａｓｔａ ３ ｔ及ｂｌａｓｔによった。バチルスメタノリカスからのいくつかのジペプチド蛋白質は、ストレプトマイセスコエリカラー内の仮想輸送関連蛋白質と７５％同一性を、ピロコッカスアビシイからのジペプチド輸送蛋白質ｄｐｐＡと３２％の同一性を示す。
【００８３】
ジェンバンクのデータベース（ｆａｓｔａ ３ ｔによるＢＳＯＲＦ及びｂｌａｓｔ）内でｄｃｉＡＡ蛋白質の別の領域を用いた検索を実施することにより、ｄｃｉＡＡ遺伝子産物の間でエシェリヒアコリ由来のリボヌクレアーゼＲｎａｓｅ Ｅ ａｋａ Ａｍｓ）と相同性が見いだされた（Ｃｌａｖｅｒｉｅ−Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２８４３−２８５１，１９９１）。両蛋白質は、両蛋白質のカルボキシ末端部分中の４７アミノ酸の領域にわたり２５％同一性（及び４８％保存性置換）を示す。ｄｃｉＡＡはヒト由来のリボヌクレオ蛋白質のカルボキシ末端とも２６％同一性を示す（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，２２３３−２２４４，１９８９）。
ｄｃｉＡＥと他の蛋白質との間の相同性
ｄｃｉＡＥの予測された産物を、ジェンバンクのデータベースの翻訳物の検索に使用した。用いた検索プログラムはｆａｓｔａ ３ ｔによるＢＳＯＲＦ及びｂｌａｓｔであった。相同性は、バチルスサチルスのＯＰＰＡオリゴペプチド結合蛋白質ＯｐｐＡ（４０％同一）、バチルスアンスラシスのｐＸ０２−６６（３２％同一）、エンテロコッカスフェーカリスのＴｒａｃ（３０％同一）、エシェリヒアコリのＭｐｐＡペリプラズムムレインペプチド結合蛋白質前駆体（３０％同一）、サルモネラティフィミリウムのＯｐｐＡ−ソルティーペリプラズムオリゴペプチド結合蛋白質（オリゴペプチド結合蛋白質前駆体）（３０％同一）、オリゴペプチドパーメアーゼ相同物ＡＩＩ（ボレリアブルグドルフェリ）（２９％同一）、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体、ペリプラズムオリゴペプチド結合蛋白質（ＯｐｐＡＶ）相同物ライム病スピロヘータ（ボレリアブルグドルフェリ）、クラミドフィラニューモニエ由来のオリゴペプチド結合蛋白質（２６％同一）、及び同じ程度トレポネマパリダム由来のオリゴペプチドＡＢＣ輸送体ペリプラズム結合ＯｐｐＡ−梅毒スピロヘータ（２６％同一）内で生じた。
ジペプチド輸送系ｄｃｉＡＡ遺伝子の欠失
ＰＣＲ技術を用いて、株００１及びＢＧ２７９０内に存在するｄｃｉＡＡ遺伝子の６４７ｂｐを欠失させた。遺伝子の５’（プライマーｄｃｉ１．ｆ及びｄｃｉ３．３を用いて）及び３’（プライマーｄｃｉ２．ｒ及びｄｃｉ４．ｆを用いて）の一部を含む２つの増幅されたＤＮＡ断片を連結して、ｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎプラスミドにクローン化した。プラスミドｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）及び温度感受性複製オリジン（ＴｓＯｒｉ）を有する。ｄｃｉＡＡ破壊プラスミドｐＭｄｃｉは、上記２つの株を形質転換したプロトプラストであった。ＴｓＯｒｉのため、このプラスミドは非許容温度、例えば４８Ｃにおいて選択圧下で培養した場合に、ｄｃｉＡＡ遺伝子との相同性領域において染色体に組み込まれた。組み込みの後に、組み込まれたプラスミドを有する株を許容温度下で大規模に成長させた。組み込まれたプラスミドの切り出しに際しては、親株００１又はＢＧ２７９０の何れかを復帰させるか、又は欠失させた遺伝子を有する株を構築する。２つの新規な株は、当該遺伝子の欠失を含むような遺伝子配列に基づく遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。
ジペプチド輸送系ｄｃｉＡＥ遺伝子の欠失
ＰＣＲ技術を用いて、株ＢＧ２９７０内に存在するｄｃｉＡＥ遺伝子の１２２８ｂｐを欠失させた。遺伝子の５’（プライマーｄｃｉＡＥ１及びｄｃｉＡＥ２を用いて）及び３’（プライマーｄｃｉＡＥ３及びｄｃｉＡＥ４を用いて）の一部を含む２つの増幅されたＤＮＡ断片を連結して、ｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎプラスミドにクローン化した。プラスミドｐＴＳｐＵＣ１９Ｋａｎはカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）及び温度感受性複製オリジン（ＴｓＯｒｉ）を有する。ｄｃｉＡＥ破壊プラスミドｐＭｄｃｉＥは、ＢＧ２２７９０を形質転換したプロトプラストであった。ＴｓＯｒｉのため、このプラスミドは非許容温度、例えば４８Ｃにおいて選択圧下で培養した場合に、ｄｃｉＡＡ遺伝子との相同性領域において染色体に組み込まれた。組み込みの後に、組み込まれたプラスミドを有する株を許容温度下で大規模に成長させた。組み込まれたプラスミドの切り出しに際しては、親株００１又はＢＧ２７９０の何れかを復帰させるか、又は欠失させた遺伝子を有する株を構築する。２つの新規な株は、当該遺伝子の欠失を含むような遺伝子配列に基づく遺伝子のＰＣＲ増幅により確認した。
プライマー：
【００８４】
【化１】
【実施例３】
【００８５】
実施例３
実施例３は、蛋白質、好ましくは分泌された蛋白質の生産を増加させた微生物のスクリーン法を示す。より特定すれば、上記方法は、破壊されたペプチド輸送活性、特定すればペプチドの輸送の阻害を有する細胞のスクリーンに関し、ポリペプチドの生産の増加をもたらす。上記方法は、上記ペプチド輸送系により細胞内へ通常は輸送されるはずのペプチドのサイズである毒性ペプチドに細胞を供することを含む。好ましい態様において、毒性ペプチドはバイアラフォスである。バイアラフォスはトリペプチドであり、２つのＬ−アラニン分子とＬ−グルタミン酸類似体からなる。ペプチダーゼにより消化された場合、細胞に有害である。それは抗生物質であり、明治製菓、日本を参照されたい。
【００８６】
バチルス内の少なくとも一つのオペロンがバイアラフォス（３−アミノ酸）のサイズの分子の取り込みに関与すること、ｏｐｐＡオペロンである、が文献に報告された。バイアラフォス取り込みに関与する他の追加の遺伝子が存在するかもしれない。
【００８７】
上記の方法は破壊されたペプチド輸送及びポリペプチドの生産の増加を有する細胞のスクリーンを可能にさせる有効な方法である。特定すれば、上記方法は、低下したペプチド取り込みをもたらす変異に関してスクリーンする。バイアラフォスへの暴露に対して生き残る細胞は一つ又は複数の変異を有すると同定される。上記方法は、例えば核酸レベルにおいて変異のさらなる変異の特性決定を必要とせず、よって効率性を提供する。しかしながら、例えば、ポリペプチドの生産の増加、及び更なる特性決定及び変異の最適化に関してさらなるスクリーニングが起こり得る。バイアラフォスへの暴露は多数の様式、例えばバイアラフォスとの細胞のプレーティング、例えば５０ｕｇ／ｍｌにおいて生じ得る。
【００８８】
上記株が変異しているため、上記細胞が変異していたため、又は遺伝、蛋白質又はオペロンが変異していたか又は修飾されていることにより本明細書で前に記載されたポリペプチドの増加された生産をもたらすため、破壊されたペプチド輸送が起こり得る。一つ又は複数のペプチド輸送オペロンにおける遺伝子の何れか一つ又は全部が変異しているか又は修飾されていてよい。
【００８９】
機能性ペプチド輸送オペロン、例えばｏｐｐオペロンを有する微生物又は細胞は阻害された成長を有することになる。ｏｐｐオペロン遺伝子クラスターの少なくとも一つの遺伝子に変異を有する微生物は毒性オリゴペプチドの存在下で成長阻害を示さない。
バイアラフォス耐性変異を得るための方法
細胞が対数相に到達するまで液体培養液（ＬＢ）中で成育させる。培養液は異なる濃度のバイアラフォスを含むバチルス最小寒天プレート上にプレートする。プレートは一晩３７℃においてインキュベートし、成長するコロニーを同じ種類のプレート上で精製のためにストリークアウトする。これらの新たな株はバイアラフォス耐性であり、全てが一晩成育後に親株よりも多いプロテアーゼを生産する。
プロテアーゼアッセイ
液体培養液からの上清を成育３日後に回収して、０３ｍＭのＮ−スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（ベガバイオケミカルズ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６中で２５℃において、以前に記載されたとおりにズブチリシンに関してアッセイした（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．，Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６０：６５２１）。当該アッセイは、ｐ−ニトロアナリンの加水分解及び放出による４１０ｎｍ／分における吸光度の増加を測定した。結果は容易に検出可能であって、ペプチドを取り込まない細胞に関してスクリーニングすることにより増加した蛋白質生産を有する細胞を同定できることを確証した。一つの態様において、ｏｐｐＡに対する変異が排除される。別の態様において、バチルスがスクリーンのための生物として排除される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法であって、
細胞内の少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し；そして
ポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２】
細胞が植物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が真菌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞がグラム陽性微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーであるが、バチルス科はバチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリクエファシエンス、バチルスコアグランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタス、バチルスメタノリカス、バチルスアンスラシス及びバチルスサリンジェネシスからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドがホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが異種（heterologous）ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、プロテアーゼ、カーボヒドラーゼ、レダクターゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、セルラーゼ、エンド−グルコシダーゼＨ、オキシダーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リグノセルロースヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びリグニナーゼからなる群から選択される酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがバチルスプロテアーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドがズブチリシンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがアミラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドがバチルスアミラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質がｄｃｉＡオペロンの遺伝子産物である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質がｄｃｉＡＥである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
不活性化がペプチド輸送蛋白質をコードする核酸を含む核酸を変異させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
変異させることがフレームシフトの原因となる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
変異させることが一つ又は複数のヌクレオチドを欠失させることである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
細胞内でポリペプチドを生産する方法であって、工程：
ａ）生産さえるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を得るが、当該細胞はペプチド輸送オペロンをさらに含み、但し当該オペロンの少なくとも一つの遺伝子産物が当該細胞内で不活性であり；そして
ｂ）ポリペプチドが生産されるように発現のために適した条件下細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが異種（heterologous）ポリペプチドである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
オペロンがｄｃｉＡオペロンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子産物がオペロン内の変異の結果として不活性である、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
変異がフレームシフト変異である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
変異が一つ又は複数のヌクレオチドの欠失である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
不活性な遺伝子産物がｄｃｉＡＥ又はｄｃｉＡＡである、請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
細胞が増加したポリペプチド分泌を有するように変異されたペプチド輸送オペロンを含む細胞。
【請求項３２】
オペロンがｄｃｉＡオペロンである、請求項３１記載の細胞。
【請求項３３】
ｄｃｉＡＥ遺伝子又はｄｃｉＡＡ遺伝子の遺伝子産物を不活性化するようにオペロンが変異されている、請求項３１記載の細胞。
【請求項３４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項３１記載の細胞。
【請求項３５】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項３１記載の細胞。
【請求項３６】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項３１記載の細胞。
【請求項３７】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項３１記載の細胞。
【請求項１】
少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を発現する細胞内でポリペプチドの分泌を増加させる方法であって、
細胞内の少なくとも一つのペプチド輸送蛋白質を不活性化し；そして
ポリペプチドの発現及び分泌に適した条件下で細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２】
細胞が植物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が真菌細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞がグラム陽性微生物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーであるが、バチルス科はバチルスリケニフォルミス、バチルスレンタス、バチルスブレビス、バチルスステアロサーモフィルス、バチルスアルカロフィルス、バチルスアミロリクエファシエンス、バチルスコアグランス、バチルスサーキュランス、バチルスラウタス、バチルスメタノリカス、バチルスアンスラシス及びバチルスサリンジェネシスからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドがホルモン、酵素、成長因子及びサイトカインからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが異種（heterologous）ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、プロテアーゼ、カーボヒドラーゼ、レダクターゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、セルラーゼ、エンド−グルコシダーゼＨ、オキシダーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リグノセルロースヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ及びリグニナーゼからなる群から選択される酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドがバチルスプロテアーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドがズブチリシンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがアミラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドがバチルスアミラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質がｄｃｉＡオペロンの遺伝子産物である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
不活性化されるペプチド輸送蛋白質がｄｃｉＡＥである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
不活性化がペプチド輸送蛋白質をコードする核酸を含む核酸を変異させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
変異させることがフレームシフトの原因となる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
変異させることが一つ又は複数のヌクレオチドを欠失させることである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
細胞内でポリペプチドを生産する方法であって、工程：
ａ）生産さえるポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を得るが、当該細胞はペプチド輸送オペロンをさらに含み、但し当該オペロンの少なくとも一つの遺伝子産物が当該細胞内で不活性であり；そして
ｂ）ポリペプチドが生産されるように発現のために適した条件下細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが異種（heterologous）ポリペプチドである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
オペロンがｄｃｉＡオペロンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子産物がオペロン内の変異の結果として不活性である、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
変異がフレームシフト変異である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
変異が一つ又は複数のヌクレオチドの欠失である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
不活性な遺伝子産物がｄｃｉＡＥ又はｄｃｉＡＡである、請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
細胞が増加したポリペプチド分泌を有するように変異されたペプチド輸送オペロンを含む細胞。
【請求項３２】
オペロンがｄｃｉＡオペロンである、請求項３１記載の細胞。
【請求項３３】
ｄｃｉＡＥ遺伝子又はｄｃｉＡＡ遺伝子の遺伝子産物を不活性化するようにオペロンが変異されている、請求項３１記載の細胞。
【請求項３４】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項３１記載の細胞。
【請求項３５】
細胞がグラム陽性微生物であって、バチルス科のメンバーである、請求項３１記載の細胞。
【請求項３６】
細胞がグラム陰性微生物である、請求項３１記載の細胞。
【請求項３７】
細胞がグラム陰性微生物であって、エシェリヒア科のメンバーである、請求項３１記載の細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２００２４１（Ｐ２０１１−２００２４１Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１０１２６（Ｐ２０１１−１１０１２６）
【出願日】平成２３年５月１７日（２０１１．５．１７）
【分割の表示】特願２００２−５１０６９１（Ｐ２００２−５１０６９１）の分割
【原出願日】平成１２年６月１４日（２０００．６．１４）
【出願人】（３９８０５６５０６）ダニスコ・ユーエス・インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１７日（２０１１．５．１７）
【分割の表示】特願２００２−５１０６９１（Ｐ２００２−５１０６９１）の分割
【原出願日】平成１２年６月１４日（２０００．６．１４）
【出願人】（３９８０５６５０６）ダニスコ・ユーエス・インコーポレーテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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