切断可能なリンカーを有する一本鎖抗体
所望のグリコシル化を有する抗体及び抗体を作製する方法と効率的な産生が開示されている。シグナル配列、軽及び重免疫グロブリン鎖（各々可変領域と定常領域を含み、少なくとも１つのタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドによって隔てられている。）を含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された宿主細胞が、核酸を発現するために培養され、抗体を産生するために、適切なプロテアーゼによって切断される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
哺乳動物の細胞系は、治療用抗体を産生するために成功裏に使用されているが、それらは、開発するのが高価であり、抗体に対して予想される将来の需要を満たすには、現在、製造能力が十分ではない。下等な真核生物及び細菌から得られるタンパク質の発現用細胞系は、より安価であり、操作がより単純であるが、抗体の作製に他の困難を伴う。これらの細胞種での従来の研究の多くは、このような系内での折り畳み及び／又は完全な状態の抗体の収率が不良であるために、完全な状態の抗体ではなく、抗体断片の発現に限定されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１−１０４３（１９８８）参照）。しかしながら、抗体断片は、抗体の結合が治療活性に対して十分である状況においてのみ、換言すれば、エフェクター機能が必要とされていない場合にのみ有用である。
【０００２】
エフェクター機能が必要とされない場合でさえ、原核生物及び下等真核生物によって産生される抗体は、適切なグリコシル化の欠如のために、哺乳動物細胞由来のものに比べて、しばしば、有用性が劣る。同じタンパク質のグリコシル化パターン及び各オリゴ糖の組成が、当該タンパク質が発現される宿主系に応じて異なるように、様々な生物が、様々なグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転位酵素及びグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な様々な基質（ヌクレオチド糖）を有する。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、グリコシル化する場合でも、極めて非特異的な様式でグリコシル化するに過ぎない（Ｍｏｅｎｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６８（３）：１６９−１７５（１９９７））。糸状菌及び酵母などの下等真核生物は、マンノース及びマンノシルホスファート糖を主として添加する。得られるグリカンは、「高マンノース」型グリカン又はマンナンとして知られる。植物細胞及び昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）は、さらに別の方法で、タンパク質をグリコシル化する。これに対して、ヒトなどの、より高等な真核生物では、幾つかのマンノース残基を除去するために、新生オリゴ糖側鎖が装飾され得、下等真核生物のＮ−グリカン中には通例見出されない追加の糖残基で伸長され得る（Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３７：１０８１−１０９０；Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０：４７７−４８６；Ｗｅｉｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１１１６−１１２１；Ｍａｌｉｓｓａｒｄ，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２６７，１６９−１７３）。細菌又は下等真核生物によって産生される抗体中に適切なグリコシル化が欠如していることは、治療用タンパク質の免疫原性、薬物動態学的特性、輸送及び効力に悪影響を与え得る。
【０００３】
細菌及び下等真核細胞中で発現された抗体断片の一形態は、一本鎖抗体として知られている（例えば、米国特許４，９４６，７７８号及び同第５，１３２，４０５号を参照。）。このような分子は、スペーサーペプチドによって、重鎖可変領域から隔てられた軽鎖可変領域を含むが、典型的には、定常領域の幾つかを欠如し、通常は定常領域の全てを欠如している。一本鎖抗体形態は、特にファージディスプレイによって、所望の結合特異性に対して抗体の多数をスクリーニングするのに特に適している（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２，５５４（１９９０））。このようなスクリーニングでは、完全な状態の抗体に比べて一本鎖抗体のサイズがより小さいことはファージの生存性を損なわずにディスプレイを得るのに有利であり、定常領域の欠如は結合特異性とは無関係である。定常領域を欠如する一本鎖抗体の小さなサイズは、エフェクター機能を必要としない抗体の用途において、治療目的に対して利点を有することも提案されている（Ｃｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ． Ｐｒｅｖ．，２３，５０６−５１０（１９９９）；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，３６，４３３−４４５（１９９９）；Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．，４０，１５３６−１５４６（１９９９））。小さなサイズは、標的組織の改善された浸透をもたらすことが提唱されている。小さなサイズは、想定され得る抗体高次構造の数を減少させるので、不正確な折り畳みを減少させる上でも有利であるということも報告されている（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４６２，３０７−３１２（１９９９））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、抗体を作製する方法を提供する。本方法は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された真菌細胞を培養することを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンは重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質は前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドは自己プロセッシング切断部位を欠如する。融合タンパク質は、発現され、シグナル配列を除去するために前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断され、及びプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記タンパク分解部位において切断される。分子間会合された免疫グロブリン重鎖と軽鎖の対を含む抗体が作製される。
【０００５】
好ましくは、抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である。幾つかの方法では、第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は重鎖である。他の方法では、第一の免疫グロブリン鎖は重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は軽鎖である。
【０００６】
幾つかの方法では、融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合している。幾つかの方法では、タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く。幾つかの方法では、スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する。幾つかの方法では、第一及び第二のプロテアーゼは同一のプロテアーゼである。
【０００７】
幾つかの方法では、第一及び第二のタンパク分解部位の切断は細胞中で起こる。幾つかの方法では、細胞は、抗体を分泌する。幾つかの方法では、細胞は、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている。幾つかの方法では、核酸は、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす。幾つかの方法では、融合タンパク質はシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む。
【０００８】
幾つかの方法は、細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む。幾つかの方法は、抗体を実質的な均質状態まで精製することをさらに含む。幾つかの方法は、医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む。幾つかの方法は、融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む。
【０００９】
幾つかの方法では、細胞は糸状菌細胞である。幾つかの方法では、細胞は酵母細胞である。好ましい細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される株から得られる。
【００１０】
幾つかの方法において、タンパク分解切断部位はＫｅｘ２ｐ部位である。場合により、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意の疎水性又は親水性アミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＲＨＫＲを有する。場合によって、スペーサーペプチドはアミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する。場合により、抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する。
【００１１】
幾つかの方法では、四量体抗体はエフェクター機能を有する。場合によって、エフェクター機能は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である。
【００１２】
幾つかの方法では、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である。
【００１３】
幾つかの方法では、抗体は、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される。幾つかの方法では、抗体は、少なくとも位置Ａｓｎ２９７においてグリコシル化されている。
【００１４】
幾つかの方法において、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。幾つかの方法において、重鎖定常領域は、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００１５】
幾つかの方法は、抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む。
【００１６】
幾つかの方法では、融合タンパク質は、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する。
【００１７】
本発明は、さらに、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンが重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如する融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明は、制御配列に作用可能に連結されたこのような核酸を含むベクター及びこのような核酸で形質転換された細胞も提供する。
【００１８】
さらに、本発明、上記方法によって作製された抗体の分子の複数を含み、前記複数の各々が糖型を有し、並びに主な糖型が複合型であり、及びフコースを欠如する、抗体組成物を提供する。場合によって、主要なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モル％多いレベルで存在する。
【００１９】
さらに、本発明は、上記方法によって作製されたモノクローナル抗体を提供する。場合によって、前記モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３又はＴＮＦ−αに特異的に結合する。
【００２０】
本発明は、さらに、抗体を作製する方法を提供する。このような方法は、シグナル配列と、可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン軽鎖と、第一及び第二のプロテアーゼ（同一又は別異であり得、何れも、融合タンパク質とは別個の分子である。）によって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することを含み、前記スペーサーペプチドが自己切断可能なタンパク分解部位を含まず、前記融合タンパク質が発現され、シグナル配列を除去するために前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断され、及び第一及び第二のプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記第一及び第二のタンパク分解部位において切断され；並びに、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される。
【００２１】
幾つかの方法では、抗体は、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である。幾つかの方法では、第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は重鎖である。他の方法では、第一の免疫グロブリン鎖は重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は軽鎖である。
【００２２】
幾つかの方法では、融合タンパク質の軽鎖及び重鎖は、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合している。幾つかの方法では、タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く。
【００２３】
幾つかの方法では、スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する。幾つかの方法では、第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである。
【００２４】
幾つかの方法では、第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる。幾つかの方法では、細胞は、抗体を分泌する。幾つかの方法では、細胞は、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている。
【００２５】
幾つかの方法では、核酸は、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列はプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす。幾つかの方法では、融合タンパク質はシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法は、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む。幾つかの方法は、細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む。このような方法は、抗体を実質的な均質状態まで精製することをさらに含む。
【００２６】
幾つかの方法は、医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む。
【００２７】
幾つかの方法は、融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む。
【００２８】
幾つかの方法において、細胞は糸状菌細胞である。幾つかの方法において、細胞は酵母細胞である。好ましい細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される。
【００２９】
幾つかの方法では、タンパク分解切断部位はＫｅｘ２ｐ部位である。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意の疎水性又は親水性アミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＲＨＫＲを有する。場合によって、スペーサーペプチドはアミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する。場合によって、抗体はスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する。
【００３０】
幾つかの方法では、四量体抗体はエフェクター機能を有する。場合によって、エフェクター機能は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である。
【００３１】
幾つかの方法では、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である。
【００３２】
幾つかの方法では、抗体は、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される。幾つかの方法では、抗体は、少なくとも位置Ａｓｎ２９７においてグリコシル化されている。
【００３３】
幾つかの方法では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。幾つかの方法では、重鎖定常領域は、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００３４】
幾つかの方法は、抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む。
【００３５】
幾つかの方法では、融合タンパク質は、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する。
【００３６】
定義
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を有し、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に必要とされる、約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主として、エフェクター機能のために必要とされる定常領域を規定する。
【００３７】
軽鎖は、κ又はλの何れかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして、抗体のイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖は、可変領域及び定常領域へさらに細かく分けられる（一般的には、 Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７参照（あらゆる目的のために、その全体が、参照により組み込まれる。）。
【００３８】
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全な状態の抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性又は二特異的抗体を除き、２つの抗原部位は同一である。鎖は全て、３つの超可変領域によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）の同じ一般的構造を呈する。各対の２つの鎖から得られるＣＤＲは、特異的なエピトープへの結合を可能にするフレームワーク領域によって並列される。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖及び重鎖は何れも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び（幾つかの事例では）ＣＨ４領域にさらに分けられる。各ドメインへのアミノ酸の割り当て及びアミノ酸の付番は、「Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）」の定義に従う。
【００３９】
完全な状態の抗体は、完全長の免疫グロブリン可変領域及び定常領域を有する、上述のような四量体構造を意味する。完全な状態の免疫グロブリンにおける可変領域は成熟状態にあり、これは免疫グロブリンシグナル配列を欠如することを意味する。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、互換的に使用される。完全な状態の抗体の結合断片（Ｆａｂなど）も、抗体と称される。
【００４０】
疎水性アミノ酸は、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅであり、場合によって、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ、及びｔｙｒでもある。親水性アミノ酸は、ａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ及びｔｈｒである。
【００４１】
２つの要素間の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より大きな親和性が好ましい。
【００４２】
本発明の抗体に対する目的の標的には、成長因子受容体（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ，ＮＧＦＲ及びＶＥＧＦ）及びそれらのリガンドが含まれる。他の標的は、Ｇタンパク質受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α及びβアドレナリン作動性受容体、セロトニン受容体及びＰＡＦ受容体が含まれる。例えば、「Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：６２５−６４９（１９８７）」を参照のこと。他の標的には、イオンチャンネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャンネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体及びドーパミン受容体が含まれる（Ｈａｒｐｏｌｄ、５，４０１，６２９及び米国特許第５，４３６，１２８号参照）。他の標的は、インテグリン、セレクチン及び免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパク質である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３４６：４２５−４３３（１９９０） Ｏｓｂｏｒｎ，Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２）を参照。）。他の標的は、インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α＆β、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍成長因子β（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインである。「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１）」参照。他の標的は、ホルモン、酵素並びにアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣなどの細胞内及び細胞間メッセンジャーである。興味深いその他の標的は、ＣＤ２０及びＣＤ３３などの白血球抗原である。薬物も、興味深い標的であり得る。標的分子は、ヒト、哺乳動物又は細菌のものであり得る。他の標的は、微生物病原体（ウイルスと細菌の両方）及び腫瘍から得られるタンパク質、糖タンパク質及び炭水化物などの抗原である。さらに別の標的が、米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００４３】
１つ又はそれ以上の記載された要素を「含む」組成物又は方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。
【００４４】
核酸が、別の核酸配列と、機能的な関係に置かれたときに、核酸は作用可能に連結されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合に、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に作用可能に連結されている。作用可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的には、連続していることを意味し、２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合には、連続的であり、及びリーディングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、最大数キロ塩基又はそれ以上、プロモーターから隔たっている場合にも、エンハンサーは、一般的には、機能するので、幾つかのポリヌクレオチド要素は作用可能に連結され得るが、連続していなくてもよい。
【００４５】
本明細書において使用される、グリカン種に対する「主に」という用語又は「主な」又は「主要である」などの変形語は、グリカン種が、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析された、糖タンパク質がＰＮＧアーゼで処理された後の総Ｎ−グリカン及び放出されたグリカンの最高モルパーセント（％）を有することを意味する。換言すれば、あらゆる他の個別の構成要素より大きなモルパーセントで存在する、個別の構成要素（特異的な糖型など）は、「主要」である。例えば、組成物が、４０モルパーセントの種Ａ、３５モルパーセントの種Ｂ及び２５モルパーセントの種Ｃからなる場合には、組成物は主に種Ａを含む。
【００４６】
本発明の抗体は、典型的には、宿主細胞の可溶性タンパク質を含む望ましくない混入物から、実質的に純粋な形態で単離される。これは、抗体が、典型的には、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であることを意味する。時には、抗体は、少なくとも約８０％ｗ／ｗの純度であり、より好ましくは、少なくとも９０又は約９５％ｗ／ｗ純度である。慣用のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも９９％ｗ／ｗ純度の抗体を取得することが可能である。非還元条件下で、ゲル上で単一のバンドとして走行する場合、及び還元条件下で、成分免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に対応する２つのバンドとして走行する場合、抗体は実質的な均一状態まで精製されている。
【００４７】
本明細書で使用される下等真核宿主細胞は、通常、高マンノース含有Ｎ−グリカンを産生する全ての真核細胞を表し、従って、幾つかの動物又は植物細胞、及び多くの典型的な下等真核細胞（酵母及び糸状菌細胞を含む。）が含まれるものとする。
【００４８】
本明細書において使用される「Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ結合型オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合されているもの）を表す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを表し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンを表す。）の共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加された末端糖（例えば、フコース及びシアル酸）を含む分岐（触覚）の数が異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分岐した構成要素（例えば、高マンノース複合体又はハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」種Ｎ−グリカンは、５又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、１，３マンノースアームに結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び「トリマンノースコア」の１，６マンノースアームに結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。「トリマンノースコア」は、Ｍａｎ３構造を有する五糖コアである。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸又は誘導体で場合によって修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基も有し得る（「ＮｅｕＡｃ」（「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表す。）。）。複合Ｎ−グリカンは、「二股」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「ｆｕｃ」）を含む鎖内置換も有し得る。「ハイブリッド」グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６マンノース上にゼロ又はそれ以上のマンノースを有する。
【００４９】
本発明中のスペーサーペプチドは、本発明の発現された融合タンパク質から軽鎖及び重鎖を切断するための１つ又はそれ以上のタンパク分解部位を含む。スペーサーペプチドは、ペプチドリンカーを含むことも可能である。リンカーの１つの機能は、本発明の融合タンパク質内に、軽鎖と重鎖の間に物理的空間と柔軟性を提供することである。場合によって、リンカーは、他の機能も有する。例えば、リンカーは、機能的な分泌されたタンパク質ドメインをコードすることが可能である。しかしながら、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の何れかは、融合タンパク質がその中で発現されるべき宿主のタンパク質由来のペプチド配列と融合される必要はない。融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列の存在は、以下に記載されているプロセッシング及び集合段階が起こるようにするために、融合タンパク質を適切な細胞位置に誘導するのに十分である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
Ｉ．総説
本発明は、様々な細胞種中で、完全な状態の抗体を発現させるのに適した方法を提供する。本方法は、下等な真核生物中での発現に特に適しているが、本方法は、高等な真核生物及び細菌中でも実施することが可能である。本方法は、単一のプロモーターの制御下にある一本鎖抗体をコードする核酸を発現させることを含む。一本鎖抗体は、可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖、スペーサーペプチド並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む。スペーサーペプチドは、少なくとも１つ、通常は、２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含む。本発明の実施は、機序の理解に依存しないが、融合タンパク質中での結合による、等モル比での重鎖及び軽鎖の発現は、下等真核生物及び細菌中で、完全な状態の抗体の集合を取得する上で以前に経験された困難を少なくとも部分的に克服すると考えられる。スペーサーペプチドは、抗体の集合の前、最中又は後に、タンパク分解切断によって除去され得る。いつ除去されるかに関わらず、スペーサーペプチドは、重鎖−軽鎖対又は四量体抗体の形成を妨げない。このような発現及びタンパク分解切断の最終産物は、重鎖及び軽鎖の少なくとも１つ、好ましくは２つの対を含み、並びにスペーサー残基の殆ど又は全てを欠如する抗体である。
【００５１】
遺伝的に修飾された下等真核生物宿主細胞の選択によって、適切なグリコシル化を達成することも可能である。これらの遺伝的に修飾された宿主によって産生された抗体の重大な利点は、このような細胞から産生される抗体が１つの主要な糖型を有し、（フコースが宿主中に加工されていなければ）フコースを欠如することである。本方法は、従って、哺乳動物細胞培養の発現に内包される非効率と出費なしに、及びグリカン構造の均一性などの潜在的に有利なある種の特性を有して、哺乳動物細胞中で産生された抗体の形質と類似の、多くの所望される形質（機能及び治療活性など）を有する抗体組成物をもたらすことが可能である。
【００５２】
ＩＩ．一本鎖抗体の成分
本発明の抗体は、当初、幾つかの成分を有する融合タンパク質として発現される。前記成分は、少なくとも、Ｎ末端からＣ末端へと、シグナル配列、第一の免疫グロブリン鎖、スペーサーペプチド及び第二の免疫グロブリン鎖を含む。軽鎖又は重鎖の何れかを第一の鎖として指定し、他方は、任意の選択として、第二の鎖として指定することができる。シグナル配列は、細胞質から細胞小器官内へ、及び／又は細胞膜を横切る（生物による）までの経路に融合タンパク質を誘導する。原核生物では、シグナル配列は、細胞膜を横切って、その中で抗体が形成する周辺質へと、融合タンパク質を誘導する。真核生物では、シグナル配列は、細胞質から小胞体、ゴルジへと融合タンパク質を誘導し、通常、細胞からの分泌が続く。融合タンパク質が本経路に沿って移動するにつれ、融合タンパク質は、以下でさらに詳しく記載されている幾つかのタンパク分解性プロセッシング工程、グリコシル化及び折り畳み工程に供される。
【００５３】
シグナル配列に連結されるのは、スペーサーペプチドによって隔てられた第一及び第二の免疫グロブリン鎖である。第一の免疫グロブリン鎖のＮ末端側に位置する単一のシグナル配列は、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の両方を含む完全な融合タンパク質の細胞小器官標的誘導及び／又は分泌を誘導する役割を果たす。従って、スペーサーペプチドと第二の免疫グロブリン鎖の間に第二のシグナル配列を含めることは不要であり、望ましくない。
【００５４】
軽鎖及び重鎖は何れも、可変領域及び定常領域を有する。可変領域は、好ましくは、完全な可変領域であり、又は、完全でなければ、可変領域は、少なくとも、合わせて、標的抗原への特異的な結合を付与するのに十分である。重鎖及び軽鎖定常領域は、重鎖及び軽鎖の安定な対（例えば、Ｆａｂ断片）の形成を可能とするのに少なくとも十分である。好ましくは、軽鎖定常領域は、重鎖及び軽鎖の対の形成を可能にするのに十分であり、並びに重鎖定常領域は、分子間ジスルフィド及び重鎖と軽鎖の定常領域の非共有結合を介した軽鎖−重鎖対の形成及び重鎖と軽鎖の２つの対を含む四量体の形成を何れも可能とするのに十分である（前記２つの対は、各重鎖領域の非共有結合及びジスルフィド結合を通じて会合されている。）。好ましくは、重鎖及び軽鎖定常領域は何れも、完全長である。好ましくは、抗体は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性などのエフェクター機能を有する四量体抗体である。エフェクター機能の性質は、イソタイプに依存する。例えば、ヒトイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は補体活性を有するが、イソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は補体活性を有しない。
【００５５】
通常、融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列は何れも、分泌経路を通じたさらなるプロセッシングのために、融合タンパク質転写物（ｍＲＮＡ）をＥＲに誘導する役割を果たす（すなわち、ゴルジを通じ、細胞外へ）。シグナル配列は、しばしば、抗体発現がその中で起こるべき細胞と同じ生物に由来する。しかしながら、このようなことは、必須ではない。使用することが可能なシグナル配列の例には、以下の分泌されるタンパク質：Ｓ．セレビシアエα接合因子プレ、アスペルギルスαアミラーゼ、アスペルギルスグルコアミラーゼ（ＧＬＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）イヌリナーゼ（ＩＮＵ）、Ｓ．セレビシアエインベルターゼ（ＩＮＶ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＡＲ２、Ｓ．セレビシアエキラートキシンプレ（ＫＩＬＭ）、Ｐ．パストリスホスファターゼＩ（ＰＨＯＩ）、Ｓ．セレビシアエα接合因子プレプロ、Ｐ．パストリスα接合因子プレプロＫＲ及びニワトリリゾチーム（ＣｈｉｃＬｙｓ）のうち１つに由来するシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、典型的には、細胞内プロセッシングの時点で、融合タンパク質転写物から切断される。
【００５６】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、抗体のあらゆる種類から得ることが可能である。ポリクローナル抗体も組換え的に発現されることができるが（例えば、米国特許６，５５５，３１０号参照）、通常、抗体はモノクローナル抗体である。発現され得る抗体の例には、ネズミ又はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体及びヒト抗体が含まれる。キメラ抗体とは、その軽鎖及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体である（例えば、Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：５２０−５３５（２００３）参照。）。例えば、マウスモノクローナル抗体から得られる遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメントに連結され得る。従って、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶ又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体由来のＣ又はエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
【００５７】
ヒト化抗体は、ヒト抗体（アクセプター抗体と名付けられる。）に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基及びマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと称される。）に実質的に由来する相補性決定領域を有する。「Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）」及びＷＯ ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号及びＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。存在すれば、定常領域も、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリンに由来する。抗体は、採取源のうち特に、慣用のハイブリドーマアプローチ、ファージディスプレイ（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９１／１７２７１及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９２／０１０４７参照）、ヒト免疫系を有するトランスジェニックマウスの使用（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７（１９９３））によって取得することができる。免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、ハイブリドーマ又は抗体産生細胞株から取得し、又は公表された文献中の免疫グロブリン核酸又はアミノ酸配列に基づいて取得することが可能である。
【００５８】
軽鎖及び重鎖は、スペーサーペプチドによって隔てられる。ペプチドは、シグナル配列に連結された鎖のＣ末端を、他の鎖のＮ末端に連結する。スペーサーペプチドは、融合タンパク質とは別の分子であるプロテアーゼによって切断可能な、少なくとも１つ、好ましくは２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する。すなわち、本発明において、タンパク分解切断部位の切断は、分子内ではなく、分子間反応である。ペプチドスペーサーは、融合タンパク質、又は特にそのスペーサーペプチド成分によって実施される分子内自己触媒的機序によって切断可能な自己プロセッシング切断部位を欠如する。自己プロセッシング切断部位の例は、「ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１１４４１−１１４４８（２００３）」によって記載されている。このような自己切断可能部位は、細胞小器官標的誘導及び抗体集合などの他のプロセッシング工程が起こる前に、ペプチドスペーサーを未成熟に切断する。このような未成熟な切断の結果、少なくとも下等な真核生物では、同じシグナルペプチドは、両免疫グロブリン鎖を、さらなるタンパク分解プロセッシングのために、小胞体へと標的誘導することができない。
【００５９】
ペプチドスペーサーが２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、タンパク分解部位は同一又は別異とすることができ、同一又は別異のプロテアーゼによって切断することが可能である。通常、ペプチドスペーサーが２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、全てが、同一のプロテアーゼによって切断される。しかしながら、ペプチドスペーサーが、異なるプロテアーゼによって切断される、２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、異なるプロテアーゼは、全て融合タンパク質とは別個の分子である。すなわち、タンパク分解切断部位は全て、自己切断タンパク分解切断部位でない。
【００６０】
場合によって、スペーサーペプチドは、１つ又はそれ以上の直列のタンパク分解切断部位からなる。あるいは、スペーサーペプチドは、タンパク分解切断部位の対によって隣接されたリンカーからなることができる。タンパク分解部位での切断が、同じ融合タンパク質の成分から重鎖及び軽鎖を分離し、それらを別個の鎖として放出するように、タンパク分解部位が配置される。ペプチド結合によって連結されていないという意味で、鎖は隔てられている。しかしながら、鎖は、重鎖と軽鎖の間の分子間ジスルフィド結合及び非共有結合によって連結することが可能である。好ましくは、タンパク分解切断部位は、いかなる免疫グロブリン残基も切断せずに、スペーサーペプチドの殆ど又は全てから、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を分離するように配置される。
【００６１】
タンパク分解部位の選択は、１つには、宿主細胞の選択に依存する。幾つかの方法では、本部位は、所望の宿主細胞中に天然に存在するプロテアーゼによって切断される部位である。他の方法では、タンパク分解部位は、遺伝子工学によって、所望の宿主細胞中に導入されたプロテアーゼによって切断される。タンパク分解切断部位は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖上に、同じ部位が存在しないように選択される。酵母宿主細胞に対する好ましいタンパク分解切断部位は、プロテアーゼＫｅｘ２ｐである。本酵素は、アミノ酸対ＫＲのＣ末端側を切断する。好ましくは、この対の前には、ＶＬなどの１つ若しくは２つの疎水性残基又はＲＨ若しくはＫＨなどの親水性残基がＮ末端側に先行する。場合によって、アルギニン残基もＲＬＶにおけるように存在する。融合タンパク質に対する好ましい規格は、シグナル配列−軽鎖−ＬＶＫＲリンカーＲＬＶＫＲ−重鎖である。Ｋｅｘ２ｐ切断は、ＫＲ残基対の両方の後に生じる。別のプロテアーゼによる分解は、ＬＶＫＲ残基を除去し、分離された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を残し、介在するスペーサー残基を残さない。
【００６２】
Ｋｅｘ２ｐの他に、他の公知の内在性酵母タンパク分解酵素には、何れもゴルジ後部中に位置するＫｅｘ１Ｐ及びＳｔｅ１３ｐ並びに液胞（リソゾーム）中に位置するＢｐｌＩｐ、ＣＰＹｐ及びＰｅｐ４ｐが含まれる。これらの酵素に対する切断配列は、以前に開示されている（ＪＣＢ，１９９２，１１９：１４５９−１４６８；Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：８０１−８１０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，１９９５，１３０：２２１−２２９；Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１９８４，１８：２３３−２７０）。内在性Ｋｅｘ２ｐの発現が低い場合には、リンカー中のＫｅｘ２ｐ部位の一方又は両方の後へのＥＡＥＡの付加は（例えば、ＬＶＫＲＥＡＥＡ）、Ｋｅｘ２ｐ及び／又はＳｔｅ１３ｐによる切断を改善する。ＥＡＥＡの付加は、第二のＫｅｘ２ｐ部位後に特に有用である。場合によって、Ｓ．セレビシアエ又はＰ．パストリス由来のＫｅｘ２ｐは、切断を改善するために、誘導性プロモーターの調節下で、宿主細胞中において過剰発現される。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞中でのインビボ切断の場合、使用できるタンパク分解部位及び酵素には、第Ｘａ因子、トロンビン、シグナルペプチダーゼＩ及びフリンが含まれ得る。これらのタンパク分解酵素は、本分野において周知である。
【００６４】
タンパク分解切断部位以外では、スペーサーペプチドの組成は重要でない。スペーサーペプチドが、タンパク分解切断部位より多くからなり、及びリンカー、一本鎖抗体の発現に適した様々なリンカーを含有するのであれば、それらの設計のための原理は本分野において公知である（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ ５８７９− ５８８３（１９８８）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３−４２６（１９８８）；米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号及び米国特許第５，４８２，８５８号、米国特許第５，２５８，４９８号）。一般に、リンカーは、同じ融合タンパク質の重鎖及び軽鎖の分子内会合又は異なる融合タンパク質上の重鎖及び軽鎖間の分子間会合を許容するのに十分な長さと柔軟性を有するべきである。グリシン及び／又はセリンは、特に、リンカー中に含めるのに適している。適切な長さは、約０から１００アミノ酸の範囲である。１５アミノ酸又はそれ以上の総スペーサーペプチド長（タンパク分解切断部位を含む。）は、重鎖及び軽鎖の分子内結合を好む。より短いスペーサーペプチド長は、分子間結合を好む。適切なリンカーの一例は、１６回反復される４つのグリシン及び１つのセリンモチーフの後に、プロリン（Ｐ）及びＣ末端タンパク分解切断部位の直前に位置する５つのさらなるグリシン残基が続く［（ＧＧＧＧＳ）１６ＰＧＧＧＧＧ］。箱型の環構造を有するプロリンは、柔軟なグリシンリンカーに安定な蝶番様構造を与える。柔軟なリンカーの別の例は、ｇｌｙ、ｓｅｒの少なくとも３単位の反復［例えば、ＧＳＧＳＧＳ］である。さらなる代替として、スペーサーは、タンパク分解切断部位（例えば、５−３０個のＫｅｘ２部位）の鎖を直列に有することが可能である。
【００６５】
上記成分の他に、ペプチドスペーサーは、分泌されたタンパク質ドメインを含むことが可能である。分泌されたタンパク質ドメインは、少なくとも２つの役割で機能することが可能である。第一に、分泌されたタンパク質ドメインは、下流鎖の分泌及び集合を増強及び／又は促進することが可能である。第二に、下等な真核生物宿主では、この分泌されたタンパク質ドメインは、Ｏ−グリコシル化酵素を飽和するために使用することにより、発現された重鎖及び軽鎖上に存在する非ヒトＯ−グリコシル化の程度を低減することが可能である。
【００６６】
しかしながら、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の何れかは、融合タンパク質がその中で発現されるべき宿主のタンパク質由来のペプチド配列と融合される必要はない。融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列の存在は、以下に記載されているプロセッシング及び集合段階が起こるようにするために、融合タンパク質を適切な細胞位置に誘導するのに十分である。従って、例えば、シグナル配列は、介在するアミノ酸なしに、第一の免疫グロブリン鎖に直接融合させることが可能であり、スペーサーペプチドは、第二の免疫グロブリン鎖に直接融合させることが可能であり、スペーサーペプチド自体は、宿主タンパク質由来のペプチド配列を一切含まないことができる。
【００６７】
融合タンパク質の場合によって使用されるさらなる成分は、融合タンパク質又は融合タンパク質のプロセッシングによって生じる融合タンパク質又は抗体の同定又は精製を補助するためのペプチドタグである。このようなタグは、スペーサーペプチド内の、若しくはスペーサーペプチドの一方端に連結された第一の免疫グロブリン鎖のＮ末端又は第二の免疫グロブリン鎖のＣ末端に配置することが可能である。タグの例は、ＦＬＡＧＴＭ系（Ｋｏｄａｋ）である。ＦＬＡＧＴＭ分子タグは、標的結合部分に連結された８アミノ酸ＦＬＡＧペプチドマーカーからなる。ＦＬＡＧペプチドマーカーとの使用に適した抗体。別の例は、金属キレートリガンドによって結合されることが可能なポリヒスチジンタグ（Ｈｏｃｈｕｌｉ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ｅｄ． ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ），Ｃｈ． １８，ｐｐ．８７−９６参照）及びマルトース結合タンパク質（Ｍａｉｎａ，ｅｔ ａｔ，Ｇｅｎｅ ７４：３６５−３７３（１９８８））である。幾つかの他のペプチドタグが公知であり、容易に入手可能である。
【００６８】
ＩＩＩ．融合タンパク質をコードする核酸
上記融合タンパク質は、核酸によってコードされる。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり得る。融合タンパク質をコードする核酸は、融合タンパク質の発現を可能とする制御配列へ、作用可能に連結されている。このような制御配列には、融合タンパク質をコードする核酸に対して上流又は５’に位置するプロモーター及び場合によって使用されるエンハンサー並びに融合タンパク質をコードする核酸から３’又は下流に位置する転写終結部位が含まれる。核酸は、典型的には、リボソーム結合部位を有する５’ＵＴＲ及び３’非翻訳領域もコードする。核酸は、しばしば、抗体がその中で発現される細胞中で複製可能なベクターの成分である。ベクターは、形質転換された細胞の認識を可能とするためにマーカーを含有することもできる。しかしながら、幾つかの細胞種、特に酵母は、外来ベクター配列を欠く核酸で首尾よく形質転換することが可能である。
【００６９】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードする核酸は、幾つかの採取源から取得することが可能である。ｃＤＮＡ配列は、保存された領域に対するプライマーを用いて、抗体を発現するハイブリドーマ又は他の細胞株から増幅することが可能である（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｔ Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）参照。）。核酸は、科学文献中の配列に基づいて、新規に合成することも可能である。所望の配列を包含する、重複するオリゴヌクレオチドの伸長によって、核酸を合成することも可能である（例えば、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）参照）。
【００７０】
ＩＶ．宿主細胞
下等真核生物は、経済的に培養し、高い収率を与えることができ、適切に修飾した場合には、適切なグリコシル化を行うことができるので、抗体の発現のために好ましい。酵母及び糸状菌は、特に、確立された遺伝学を提供し、迅速な形質転換、検査されたタンパク質局在化戦略及び容易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする。適切なベクターは、所望に応じて、プロモーターなどの発現調節配列（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素を含む。）、及び複製起点、終結配列などを有する。ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードする核酸に隣接するセグメント（このセグメントは、宿主染色体の選択された領域と組み換えることができる。）を含むことも可能であり、これにより、発現を好む染色体位置へと核酸を標的誘導する。
【００７１】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの様々な酵母は、高い細胞密度まで増殖し、組換えタンパク質の大量を分泌することが可能であるので、これらは、細胞培養のために好ましい。同様に、本発明のグリコシル化された抗体を産業規模で製造するために、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの糸状菌（例えば、米国特許５，３６４，７７０号、ＥＰ２１４，９１４号及びＷＯ９０／１５８６０号）などの糸状真菌及びその他を使用することが可能である。
【００７２】
下等な真核生物、特に酵母及び糸状菌は、グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化されている抗体（又はその他のタンパク質）を発現するように、遺伝的に修飾することが可能である。このようなことは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ ２００４００１８５９０；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１ ：１２４４−１２４６）によって記載されているように、特定の内在性グリコシル化酵素を除去し、及び／又は外在性酵素を供給することによって達成することが可能である。例えば、宿主細胞は、本来、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加するα−１，６−マンノシル転位酵素活性が枯渇されるように選択し、又は操作することが可能である。
【００７３】
このような宿主細胞は、これに加えて又はこれに代えて、インビボで、複合炭水化物構造（及びその合成中間体）の産生を可能とする１つ又はそれ以上の酵素を発現するように操作することが可能である。このような酵素は、例えば、酵素に本来伴っていないシグナルペプチドを用いて、酵素がその中で最適な活性を有する宿主細胞内小器官へと標的誘導されることが可能である。このような宿主細胞は、糖ヌクレオチド輸送体及び／又はヌクレオチドジホスファターゼ酵素を発現するように修飾することも可能である。輸送体及びジホスファターゼ酵素は、適切な区画中にグリコシル化酵素に対する適切な基質を提供することにより、競合産物阻害を減少することにより、及びヌクレオチド二リン酸の除去を促進することにより、操作されたグリコシル化工程の効率を改善する。
【００７４】
これらの操作された宿主細胞の別の利点は、フコースが特異的に操作されていなければフコースを欠如する主に１つの糖型構造を有する抗体組成物を産生するためにそれらを使用できることである。他の糖タンパク質におけるグリコシル化の役割と同様に、抗体のオリゴ糖側鎖はこの糖タンパク質の機能に影響を与える。例えば、減少したフコシル化されたＮ結合型グリカンを有する抗体組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの結合を増大させ、従って、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させることが示されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：３４６６−３４７３）。ＣＨＯ細胞中で作製された、フコシル化されたＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）ＩｇＧの均一な形態は、不均一な抗体より大きな程度まで、ＣＤＣ活性を増加させる（Ｒａｊｕ，２００４，米国特許出願第２００４／０１３６９８６号）。
【００７５】
適切に操作された下等真核生物の宿主細胞中での本発明の方法の実施は、主に均一な糖型をもたらす。すなわち、このような細胞によって産生された抗体は、対応するＮ−グリコシル化部位に主なＮ−グリカン構造を有する。さらに、本発明に開示されている酵母及び糸状菌宿主中で産生されたグリカンは、天然には、フコースを欠如する。従って、本発明の操作された宿主細胞は、主に１つの糖型構造の複合Ｎ−グリカンを有し、（フコースが特異的に操作されていなければ）フコースを欠如する抗体を産生することが可能である。一実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約２５〜５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７９】
抗体を発現するために使用することが可能な原核生物宿主には、Ｅ．コリ、バチルス・ズブチリスなどの桿菌並びにサルモネラ、セラチア及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科が含まれる。原核生物は、培養の容易さの観点で、下等な真核生物の利点の幾つかを有するが、適切なグリコシル化を実施することはできない。原核生物宿主では、発現ベクターを作製することも可能であり、これは、典型的には、宿主細胞と適合性のある発現調節配列（例えば、複製起点）を含有する。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系又はλファージ由来のプロモーター系など、周知の様々なプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、場合によってオペレーター配列とともに、発現を制御し、並びに転写及び翻訳を開始及び完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【００８０】
植物及び植物細胞培養物は、本発明の抗体を発現するために使用し得る。（Ｌａｒｒｉｃｋ ＆ Ｆｒｙ，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２（４）：１７２−８９（１９９１）；Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７（４）：８６５−７４（１９９１）；Ｄｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（２）：２８１−９３（１９９０）；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７６−８（１９８９））。好ましい植物宿主には、例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ラスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）及びソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）が含まれる。
【００８１】
典型的には、バキュロウイルスをベースとした発現系を用いて、本発明の抗体を作製するために昆虫細胞培養物を使用することも可能である（Ｐｕｔｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６５１−６５４（１９９０）参照）。
【００８２】
下等真核生物及び原核生物ほど培養が経済的ではないが、哺乳動物の組織細胞も、本発明のポリペプチドを発現及び産生するために使用することが可能である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７参照。）。適切な宿主には、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株など、又は形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマが含まれる。これらの細胞に対する発現ベクターは、複製起点、１つ又はそれ以上のプロモーター、１つ又はそれ以上のエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８（１９８６））などの発現調節配列、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結因子配列などの必要なプロセッシング情報部位を含むことが可能である。発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターであり得る。好ましいプロモーターは、恒常性又は誘導性であり得る。一般的には、ｎｅｏＲ発現カセットなどの選択可能なマーカーが発現ベクター中に含められる。
【００８３】
発現されるべき免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、細胞宿主の種類に応じて異なる慣用の方法によって宿主細胞中に導入することが可能である。例えば、塩化カルシウム形質移入は原核細胞に対して一般に使用されるのに対して、リン酸カルシウム処理、プロトプラスト融合、天然の増殖、リポフェクション、粒子衝撃、ウイルスベースの形質導入又は電気穿孔を、他の細胞宿主に対して使用することが可能である。植物細胞及び組織に対しては、タングステン粒子衝撃遺伝子組み換えが好ましい。（一般的には、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）を参照、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）好ましくは、核酸は、エピスームとして、又は宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、宿主細胞中に安定に維持される。
【００８４】
一旦発現されると、本発明の抗体は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの、本分野の標準的な手法に従って精製することが可能である（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ． Ｙ．，１９８２）を参照、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）。医薬に使用するためには、少なくとも約９０〜９５％の均一状態の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一状態が最も好ましい。部分的に、又は所望の均一状態まで一旦精製されると、次いで、ポリペプチドは治療的に使用されるか（体外での使用を含む。）、又はアッセイ操作、免疫蛍光染色などの開発及び実行において使用することが可能である。（一般的には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ． Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９ ａｎｄ １９８１）を参照。）
【００８５】
Ｖ．抗体発現、プロセッシング、集合及び分泌
シグナル配列、免疫グロブリン軽鎖、スペーサーペプチド及び免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸は、当初、融合タンパク質として発現される。次いで、融合タンパク質は、鎖が分子内会合ではなく分子間会合された、重鎖と軽鎖の対を含む抗体を産生する一連のプロセッシング及び折り畳み現象に供される。これらの現象には、細胞小器官への融合タンパク質の標的誘導及び／又はシグナル配列によって媒介される宿主からの分泌、シグナル配列のプロセッシング、ヘテロ二量体の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子内又は分子間会合、四量体を形成するための２つのヘテロ二量体の対合、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、及び重鎖と軽鎖がもはや同じペプチド鎖の成分でないようにする、スペーサー中のタンパク分解部位の切断が含まれ得る。これらの現象の順序及び正確な性質は、培養条件、構築物の性質、シグナル配列、スペーサーペプチド及び宿主細胞に応じて変動し得る。機序の理解は、本発明の実施に必要でない。
【００８６】
図２は、融合タンパク質の翻訳後修飾の１つの可能な配列における中間体を示している。図は、２つの融合タンパク質の会合によって形成された四量体抗体を示している。各融合タンパク質において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、軽鎖及び重鎖可変領域間の非共有結合及び定常領域間のジスルフィド結合によって分子内会合される。２つの融合タンパク質は、各重鎖のＦｃ領域間の非共有相互作用及びジスルフィド相互作用によって一緒に保たれる。重鎖定常領域の残基Ａｓｎ２９７は、両融合タンパク質においてグリコシル化されている。図３は、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位の切断後における同じ抗体を示している。四量体抗体の立体構造は、同じ融合タンパク質の一部であり、分子間会合されている重鎖及び軽鎖が、この段階では、別個の鎖であり、及び分子間会合されていることを除き不変である。抗体に結合されたまま残存しているスペーサーペプチドが存在している場合、その長さは、スペーサーペプチド中の切断部位の位置及び何れかの残存スペーサーペプチドを分解する上での何れかのエキソぺプチダーゼの作用に依存する。Ｋｅｘ２ｐ部位ＬＶＫＲ及びＲＬＶＫＲによって隣接されたリンカーは、Ｒ残基後に、Ｋｅｘ２Ｐ切断によって除去ｓれ、その後のエキソプロテアーゼ活性は、第一の（Ｎ末端）タンパク分解切断からＬＶＫＲを除去して、スペーサーペプチド残基を欠如する実質的に均一な抗体産物を与える。抗体産物に不均一性が存在する限り、抗体の望ましい形態は、インビトロで行われるさらなる切断、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び陽イオン交換クロマトグラフィーによって、他の切断産物から分離され得る（実施例３参照）。
【００８７】
タンパク分解部位の切断はインビボで好ましく生じるが、インビトロで実施することも可能である。抗体は、宿主細胞から分泌又はその他の方法で放出され、タンパク分解部位を切断することが知られたプロテアーゼで処理される。幾つかのタンパク分解部位を使用することが可能である。宿主細胞中で見られるものに加え、融合タンパク質構築物中に他のタンパク分解部位を導入することが可能である。これらの部位は、インビトロ切断のために、タンパク分解酵素を宿主細胞中に導入することによって、又は切断されていない融合タンパク質を発現及び精製し、インビトロ反応においてリンカー領域を切断することによって切断することが可能である。インビトロ切断反応において使用するために、インビボで機能することが開示されている全てのタンパク分解酵素を精製又は購入することが可能である。
【００８８】
インビトロでのＫｅｘ２ｐ切断のために、Ｋｅｘ２ｐをまず精製し（ＰＮＡＳ，１９９２，８９：９２２−９２６）、次いで、Ｋｅｘ２ｐ及びプロテインＡ精製された切断されていない抗体（例Ｘ）の両方を、記載のとおり（ＪＢＣ，１９９５，２７０：３１５４−３１５９）、温置する。このインビトロ切断の後には、Ｋｅｘ２ｐタンパク質から重鎖及び軽鎖を単離するための第二のプロテインＡクロマトグラフィーが続く。
【００８９】
通常、シグナル配列は、シグナル配列に融合されたタンパク質を宿主細胞から分泌される。分泌が起こらない場合には、抗体は、誘導された溶解によって宿主細胞から放出され得る。溶解は、数ある方法のうち、とりわけ、音波処理、凍結融解の繰り返し又はリゾチームでの処理によって誘導することが可能である。
【００９０】
ＶＩＩ．変形
上述のとおり、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するために必要なプロテアーゼは、細胞中に天然に存在するか、細胞へ外来的に供給されるか、又はインビトロで提供されることが可能である。変形では、適切なシグナルペプチドの選択によって、プロテアーゼは、分泌経路中の細胞小器官へ標的誘導される。このような標的誘導は、プロテアーゼに連結されたシグナルペプチドの選択によって達成することが可能である。このような標的誘導は、宿主細胞とともに自然に見出されるプロテアーゼ（例えば、酵母細胞中のＫｅｘ２ｐ）又は外来的に供給されるプロテアーゼの両方に対して使用することが可能である。標的誘導は、他のプロセッシング工程に対してタンパク分解切断が生じるタイミングに影響を与える。例えば、分泌経路の初期細胞小器官にプロテアーゼが標的誘導される場合、タンパク分解プロセッシングは、融合タンパク質の折り畳みより初期に生じる。このような状況では、タンパク分解プロセッシングは、完全である可能性がより高い。例えば、天然の酵母細胞では、多くのＫｅｘ２ｐプロセッシングがゴルジ後部において起こる。融合タンパク質がゴルジ後部に達する時点までに、抗体集合は実質的完了する。ＥＲ標的誘導ペプチドに連結されたさらなるＫｅｘ２ｐを発現させることによって、Ｋｅｘ２ｐは、小胞体中で発現される。この場合には、実質的な抗体折り畳みが起こる前に、タンパク分解切断部位がプロセッシングされ、より効率的な切断をもたらす。
【００９１】
本発明の方法によって産生された抗体の収率は、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／Ｌ培地、より好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ又は２ｇ／Ｌ培地である。
【００９２】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療剤としての抗体と、及び医薬として許容される他の様々な成分とを含む医薬組成物中に取り込ませることが可能である。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）」を参照されたい。好ましい形態は、予定される投与の様式及び治療用途に依存する。組成物は、所望される製剤に応じて、医薬として許容される無毒の担体又は希釈剤（動物又はヒトに投与するための医薬組成物を調合するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される。）も含むことが可能である。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及びハンクの溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は無毒、非治療的、非免疫原性安定化剤なども含むことが可能である。
【００９３】
非経口投与用医薬組成物は、無菌であり、実質的に等張であり、発熱物質を含まず、ＦＤＡ又は類似機関のＧＭＰに従って調製される。抗体は、水、油、生理的食塩水、グリセロール又はエタノールなどの無菌の液体であり得る医薬担体とともに、生理的に許容される希釈剤中で、物質の溶液又は懸濁液の注射可能な投薬として投与することが可能である。さらに、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在することも可能である。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源の成分、例えば、落花生油、大豆油及び鉱物油である。一般的に、プロピレングリオール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射可能溶液に対して好ましい液体担体である。抗体は、活性成分の持続的放出を可能とする様式で調合することが可能なデポ注射又はインプラント調製物の形態で投与することも可能である。典型的には、組成物は、注射可能剤として（液体溶液又は懸濁液の何れかとして、）調製される。注射前に液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態も調製することが可能である。調製物は、上記のように、はポリラクチド、ポリグリコリドなどのリポソーム若しくは微粒子中に、又は増強したアジュバント効果のための共重合体中に乳化又は封入することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１５２７（１９９０） ａｎｄ Ｈａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８，９７−１１９（１９９７）参照）。
【００９４】
ＩＸ．診断用製品
本発明の抗体は、アレイなどの様々な診断キット及びその他の診断用製品中に取り込ませることも可能である。抗体は、しばしば、マイクロタイター皿のウェルなどの固相に予め結合されて提供される。キットは、しばしば、抗体結合を検出するための試薬及びキットの使用について指示を与えるラベルも含む。免疫計測的又はサンドイッチアッセイは、診断キットに対して好ましい規格である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号及び同第５，９６５，３７５号を参照。）。抗体アレイは、例えば、米国特許第５，９２２，６１５号、同第５，４５８，８５２号、同第６，０１９，９４４号及び同第６，１４３，５７６号によって記載されている。
【実施例】
【００９５】
１．融合タンパク質及び融合タンパク質をコードする核酸の設計
抗体抗ＤＸを発現するための融合タンパク質を、以下のように設計した。
【００９６】
【化１】
αアミラーゼシグナル配列は、斜字体で示されている。成熟した軽鎖と重鎖間のスペーサーペプチドは、下線で示されている。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【００９７】
【化２】
【００９８】
リンカーをコードするＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【００９９】
【化３】
【０１００】
抗ＤＸ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲオーバーラップによって合成され、第一の免疫グロブリン鎖の上流にＭｌｙ１部位を付加した。ＩｇＧ１の軽鎖定常領域をコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃから注文した。完全な軽鎖をコードするＤＮＡは、ＰＣＲオーバーラップ伸長によって調製され、ｐＣＲ２．１トポベクターをクローニングした。完全な軽鎖は、５’末端にＭｌｙ１部位及び停止コドンの３’にＮｏｔ１部位を有していた。完全な軽鎖をコードするＤＮＡは、αアミラーゼシグナル配列をコードするＤＮＡとともに、ｐＰＩＣＺＡベクター中に連結された。αアミラーゼシグナル配列は、重複するオリゴヌクレオチドから合成された。シグナル配列は、ＡＴＧの前にＫｏｚａｋ配列を有し、５’末端にＥｃｏＲ１部位も有する。ｐＰＩＣＺＡは、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１によって消化された。αアミラーゼシグナル配列は、平滑末端化された５’及び３’末端に突出するＥｃｏＲ１部位を有する。軽断片は、ｐＣＲ２．１トポベクターから、Ｍｌｙ１及びＮｏｔ１によって消化され、これら３つの片を一緒に連結した。得られたプラスミドは、ｐＤＸ３９８である。
【０１０１】
抗ＤＸ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは、重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成された。ＩｇＧ１の重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃから注文した。次いで、オーバーラップＰＣＲによって、完全な状態の重鎖をコードするＤＮＡを調製し、ｐＣＲ２．１トポベクター中にクローニングして、プラスミドＤＸ３４４を得た。
【０１０２】
ベクターｐＰＩＣＺＡは、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１によって切断された。軽鎖定常領域の末端に位置するＥｃｏＲ１及びＳｐｈ１によって、αアミラーゼシグナル配列を含む軽鎖断片を消化した。重複するオリゴヌクレオチドによって、軽鎖定常領域の一部を含むリンカーを合成した（５’末端のオリゴヌクレオチドは１つのＳｐｈ１部位を含有する。）。Ｍｌｙ１及びＮｏｔ１によって、重鎖を有するプラスミドｐＣＲ２．１トポを消化し、アガロースゲルからバンドを回収した。４つの断片を連結して、図４に示されているベクターを得た。
【０１０３】
Ｐｍｅ１によってプラスミドｐＤＸ５６０を直鎖化し、幾つかのピチア・パストリス株、例えば、α１，６マンノシル転位酵素（Δｏｃｈ１）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，１００：５０２２−５０２７）、マンノシルホスファート（Δｐｎｏ１、Δｍｎｎ４ｂ）（米国特許出願１１／０２０８０８号）及びαマンノシダーゼ耐性２（Δａｍｒ２）遺伝子を欠如する背景で、α−マンノシダーゼＩ、ＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミン転位酵素Ｉ、ＩＩ及びガラクトシル転位酵素で形質転換された株ＹＡＳ３０６中に形質転換された。（米国特許出願６０／５６６７３６号及び６０／６２０１８６号）。
【０１０４】
２．Ｐ．パストリス株−例えば、ＹＡＳ３０６用の培養条件
１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン及び１％グリセロールからなる緩衝化されたグリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）の１０ｍＬ培養物を、プラスミドｐＤＸ５６０を含有するＹＡＳ３０６の新鮮なコロニーに播種し、２日間増殖させた。次いで、１Ｌフラスコ中の新鮮なＢＭＧＹ１００ｍＬ中に、培養物を１日間移した。次いで、この培養物を遠心し、ＢＭＭＹ（緩衝化された最小メタノール：１％グリセロールの代わりの０．５％メタノールを除き、ＢＭＧＹと同一）で細胞ペレットを洗浄した。元のＭＢＧＹ培養物の１／５容積まで、細胞ペレットをＢＭＭＹ中に再懸濁し、１．５Ｌの発酵反応装置中に２４時間配置した。遠心によってバイオマスを沈降させ、培地を新鮮なチューブに移すことによって、分泌されたタンパク質を採集した。分泌された抗体を含有する上清を、精製のために集めた。
【０１０５】
３．融合タンパク質の精製
Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて、モノクローナル抗体を培養上清から捕捉した。Ｔｒｉｓ−グリシンｐＨ３．５中に抗体を溶出し、１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０を用いて中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、さらなる精製を実施した。ＨＩＣカラムの具体的種類は、抗体に依存する。抗ＤＸ抗体の場合、２０ｍＭＴｒｉｓ（７．０）、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４緩衝液とともに、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用し、１Ｍから０Ｍへの（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線グラジエント緩衝液を用いて溶出した。フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた抗体画分をプールし、陽イオン交換（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを通じた最終精製のために、５０ｍＭＮａＯＡｃ／ＴｒｉｓｐＨ５．２緩衝液中に交換した。５０ｍＭＴｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いて、直線グラジエントで抗体を溶出した。
【０１０６】
図５は、重鎖及び軽鎖の四量体集合物について予測されるとおり、約１５０ｋＤａで移動する重鎖及び軽鎖を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。レーン１は、商業的に調製されたＩｇＧ対照を示し、レーン２は、別個のプロモーターによって、重鎖及び軽鎖の発現が駆動される組換え抗体産生のための伝統的方法を用いてＰ．パストリス中に産生されたＤＸ−ＩｇＧを示し、レーン３は、本発明の単一プロモーター法によって、Ｐ．パストリス中に産生されたＳＣ−ＤＸ−ＩｇＧを示す。
【０１０７】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（４〜２０％グラジエント及び１５％）を購入し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓから分子量マーカーを購入した。クマシーブルータンパク質株は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した。
【０１０８】
公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０，１９７０）に従って、抗ＤＸ抗体２０μｇを産生し、上記例に開示されているとおりに精製し、分子量及び精製の程度を分析するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図５に示されているように、分子量中の約１５０ｋＤａの単一バンドが、非還元条件下で存在した。この分子量は、ＩｇＧ抗体が、非還元条件下で約１５０ｋＤａの分子量を有すること、並びに分子中のジスルフィド結合の切断のために、約５０ｋＤａの分子量を有する重鎖及び約２５ｋＤａの分子量を有する軽鎖に分解されることを述べる報告と合致する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。
【０１０９】
４．抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の抗原１０μｇで、高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を被覆し、４℃で一晩温置した。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）を添加し、次いで、室温で１時間温置する。ブロッキング緩衝液を除去し、ＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。最後の洗浄後、０．２ｎｇから１００ｎｇまでの精製された抗体の漸増量を添加し、室温で１時間温置する。次いで、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを洗浄する。最後の洗浄後、１：２０００ＰＢＳ溶液中に抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを添加し、次いで、室温で１時間温置する。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを４回洗浄する。製造業者の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、ＴＭＢ基質キットを用いてプレートを分析した。
【０１１０】
５．Ｆｃ受容体結合アッセイ
前記プロトコールに従って、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲｎに対するＦｃ受容体結合アッセイを実施した（ＪＢＣ，２００１，２７６：６５９１−６６０４）。ＦｃγＲＩＩＩ結合の場合、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩ融合タンパク質を、４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上に被覆する。２５℃で１時間、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロッキングした。２５℃で１時間、抗ＤＸＩｇＧ及びＨＲＰ抱合されたＦ（Ａｂ’）２抗Ｆ（Ａｂ’）２の２：１モル量を混合することによって、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に、抗ＤＸＩｇＧ１二量体複合体を調製する。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：２で、二量体複合体を系列希釈し、２５℃で１時間、プレート上に被覆した。使用した基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。製造業者の指示書に従って（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４５０ｎｍの吸光度を読み取る。図６は、Ｐ．パストリス中で産生された、ＤＸＩｇＧとＳＣＤＸＩｇＧの結合を比較する。
【０１１１】
６．ＥｒＢ２／Ｆｃ抗原への抗体の結合
室温で２時間、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍＬの組換えＥｒｂＢ２／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１００μＬ／ウェルで、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）を被覆した。上清を吸引し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）の２５０μＬ／ウェルを添加し、１時間温置した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に抗体を希釈し、ブロッキング溶液を吸引した後、１００μＬ／ウェルを添加した。次いで、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＰＢＳの２５０μＬ／ウェルで、プレートを３回洗浄した。ＨＲＰ抱合された抗ＦＡＢ抗体（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬ／ウェルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に１：１０００希釈し、１時間温置した。上記のようにプレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬ／ウェルを添加した。青い色を呈した時点で、１ＭＨ２ＳＯ４によって反応を停止し、４５０ｎｍの吸収を読み取った。図７は、何れもＰ．パストリス中で産生された、ＤＸＩｇＧとＳＣ−ＤＸＩｇＧを比較する。
【０１１２】
理解を明確にするために、先述の発明を詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲に記されている本発明の範囲内である種の修飾を実施し得ることは当業者に自明である。本明細書に引用されている全ての公報及び特許文献は、各々が個別に表記されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。各実施形態の文脈から別段の意味であることが自明でなければ、本発明の特徴、態様、要素又は工程は、他の全ての実施形態、特徴、態様、要素又は工程と組み合わせて使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、転写及び翻訳制御配列の単一のセットに由来する単一の転写及び翻訳単位として表されている重鎖及び軽鎖を示している。
【図２】図２は、ペプチドスペーサーを有する集合された抗体を示している。
【図３】図３は、インビトロ又はインビボで切断されて、完全に集合された抗体を残存させるペプチドスペーサーを示している。
【図４】図４は、一本鎖抗体を発現するために使用された構築物を示している。
【図５】図５は、四量体抗体の発現を確認するゲルを示している。
【図６】図６は、ＦＣγＲＩＩＩＡ−ＬＶへの抗体二量体の結合を示している。
【図７】図７は、抗体の、その抗原への結合を示している。
【背景技術】
【０００１】
哺乳動物の細胞系は、治療用抗体を産生するために成功裏に使用されているが、それらは、開発するのが高価であり、抗体に対して予想される将来の需要を満たすには、現在、製造能力が十分ではない。下等な真核生物及び細菌から得られるタンパク質の発現用細胞系は、より安価であり、操作がより単純であるが、抗体の作製に他の困難を伴う。これらの細胞種での従来の研究の多くは、このような系内での折り畳み及び／又は完全な状態の抗体の収率が不良であるために、完全な状態の抗体ではなく、抗体断片の発現に限定されている（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１−１０４３（１９８８）参照）。しかしながら、抗体断片は、抗体の結合が治療活性に対して十分である状況においてのみ、換言すれば、エフェクター機能が必要とされていない場合にのみ有用である。
【０００２】
エフェクター機能が必要とされない場合でさえ、原核生物及び下等真核生物によって産生される抗体は、適切なグリコシル化の欠如のために、哺乳動物細胞由来のものに比べて、しばしば、有用性が劣る。同じタンパク質のグリコシル化パターン及び各オリゴ糖の組成が、当該タンパク質が発現される宿主系に応じて異なるように、様々な生物が、様々なグリコシル化酵素（例えば、グリコシル転位酵素及びグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な様々な基質（ヌクレオチド糖）を有する。細菌は、典型的には、タンパク質をグリコシル化せず、グリコシル化する場合でも、極めて非特異的な様式でグリコシル化するに過ぎない（Ｍｏｅｎｓ ａｎｄ Ｖａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６８（３）：１６９−１７５（１９９７））。糸状菌及び酵母などの下等真核生物は、マンノース及びマンノシルホスファート糖を主として添加する。得られるグリカンは、「高マンノース」型グリカン又はマンナンとして知られる。植物細胞及び昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）は、さらに別の方法で、タンパク質をグリコシル化する。これに対して、ヒトなどの、より高等な真核生物では、幾つかのマンノース残基を除去するために、新生オリゴ糖側鎖が装飾され得、下等真核生物のＮ−グリカン中には通例見出されない追加の糖残基で伸長され得る（Ｃｏｌｏｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３７：１０８１−１０９０；Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０：４７７−４８６；Ｗｅｉｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１１１６−１１２１；Ｍａｌｉｓｓａｒｄ，ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，２６７，１６９−１７３）。細菌又は下等真核生物によって産生される抗体中に適切なグリコシル化が欠如していることは、治療用タンパク質の免疫原性、薬物動態学的特性、輸送及び効力に悪影響を与え得る。
【０００３】
細菌及び下等真核細胞中で発現された抗体断片の一形態は、一本鎖抗体として知られている（例えば、米国特許４，９４６，７７８号及び同第５，１３２，４０５号を参照。）。このような分子は、スペーサーペプチドによって、重鎖可変領域から隔てられた軽鎖可変領域を含むが、典型的には、定常領域の幾つかを欠如し、通常は定常領域の全てを欠如している。一本鎖抗体形態は、特にファージディスプレイによって、所望の結合特異性に対して抗体の多数をスクリーニングするのに特に適している（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２，５５４（１９９０））。このようなスクリーニングでは、完全な状態の抗体に比べて一本鎖抗体のサイズがより小さいことはファージの生存性を損なわずにディスプレイを得るのに有利であり、定常領域の欠如は結合特異性とは無関係である。定常領域を欠如する一本鎖抗体の小さなサイズは、エフェクター機能を必要としない抗体の用途において、治療目的に対して利点を有することも提案されている（Ｃｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ． Ｐｒｅｖ．，２３，５０６−５１０（１９９９）；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，３６，４３３−４４５（１９９９）；Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．，４０，１５３６−１５４６（１９９９））。小さなサイズは、標的組織の改善された浸透をもたらすことが提唱されている。小さなサイズは、想定され得る抗体高次構造の数を減少させるので、不正確な折り畳みを減少させる上でも有利であるということも報告されている（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４６２，３０７−３１２（１９９９））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、抗体を作製する方法を提供する。本方法は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された真菌細胞を培養することを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンは重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質は前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドは自己プロセッシング切断部位を欠如する。融合タンパク質は、発現され、シグナル配列を除去するために前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断され、及びプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記タンパク分解部位において切断される。分子間会合された免疫グロブリン重鎖と軽鎖の対を含む抗体が作製される。
【０００５】
好ましくは、抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である。幾つかの方法では、第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は重鎖である。他の方法では、第一の免疫グロブリン鎖は重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は軽鎖である。
【０００６】
幾つかの方法では、融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合している。幾つかの方法では、タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く。幾つかの方法では、スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する。幾つかの方法では、第一及び第二のプロテアーゼは同一のプロテアーゼである。
【０００７】
幾つかの方法では、第一及び第二のタンパク分解部位の切断は細胞中で起こる。幾つかの方法では、細胞は、抗体を分泌する。幾つかの方法では、細胞は、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている。幾つかの方法では、核酸は、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす。幾つかの方法では、融合タンパク質はシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む。
【０００８】
幾つかの方法は、細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む。幾つかの方法は、抗体を実質的な均質状態まで精製することをさらに含む。幾つかの方法は、医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む。幾つかの方法は、融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む。
【０００９】
幾つかの方法では、細胞は糸状菌細胞である。幾つかの方法では、細胞は酵母細胞である。好ましい細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される株から得られる。
【００１０】
幾つかの方法において、タンパク分解切断部位はＫｅｘ２ｐ部位である。場合により、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意の疎水性又は親水性アミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＲＨＫＲを有する。場合によって、スペーサーペプチドはアミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する。場合により、抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する。
【００１１】
幾つかの方法では、四量体抗体はエフェクター機能を有する。場合によって、エフェクター機能は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である。
【００１２】
幾つかの方法では、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である。
【００１３】
幾つかの方法では、抗体は、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される。幾つかの方法では、抗体は、少なくとも位置Ａｓｎ２９７においてグリコシル化されている。
【００１４】
幾つかの方法において、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。幾つかの方法において、重鎖定常領域は、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００１５】
幾つかの方法は、抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む。
【００１６】
幾つかの方法では、融合タンパク質は、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する。
【００１７】
本発明は、さらに、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンが重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如する融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明は、制御配列に作用可能に連結されたこのような核酸を含むベクター及びこのような核酸で形質転換された細胞も提供する。
【００１８】
さらに、本発明、上記方法によって作製された抗体の分子の複数を含み、前記複数の各々が糖型を有し、並びに主な糖型が複合型であり、及びフコースを欠如する、抗体組成物を提供する。場合によって、主要なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モル％多いレベルで存在する。
【００１９】
さらに、本発明は、上記方法によって作製されたモノクローナル抗体を提供する。場合によって、前記モノクローナル抗体は、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３又はＴＮＦ−αに特異的に結合する。
【００２０】
本発明は、さらに、抗体を作製する方法を提供する。このような方法は、シグナル配列と、可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン軽鎖と、第一及び第二のプロテアーゼ（同一又は別異であり得、何れも、融合タンパク質とは別個の分子である。）によって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することを含み、前記スペーサーペプチドが自己切断可能なタンパク分解部位を含まず、前記融合タンパク質が発現され、シグナル配列を除去するために前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断され、及び第一及び第二のプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記第一及び第二のタンパク分解部位において切断され；並びに、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される。
【００２１】
幾つかの方法では、抗体は、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である。幾つかの方法では、第一の免疫グロブリン鎖は軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は重鎖である。他の方法では、第一の免疫グロブリン鎖は重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖は軽鎖である。
【００２２】
幾つかの方法では、融合タンパク質の軽鎖及び重鎖は、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合している。幾つかの方法では、タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く。
【００２３】
幾つかの方法では、スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する。幾つかの方法では、第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである。
【００２４】
幾つかの方法では、第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる。幾つかの方法では、細胞は、抗体を分泌する。幾つかの方法では、細胞は、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている。
【００２５】
幾つかの方法では、核酸は、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列はプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす。幾つかの方法では、融合タンパク質はシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法は、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む。幾つかの方法は、細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む。このような方法は、抗体を実質的な均質状態まで精製することをさらに含む。
【００２６】
幾つかの方法は、医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む。
【００２７】
幾つかの方法は、融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む。
【００２８】
幾つかの方法において、細胞は糸状菌細胞である。幾つかの方法において、細胞は酵母細胞である。好ましい細胞は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される。
【００２９】
幾つかの方法では、タンパク分解切断部位はＫｅｘ２ｐ部位である。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意の疎水性又は親水性アミノ酸である。）を有する。場合によって、タンパク分解切断部位はアミノ酸配列ＲＨＫＲを有する。場合によって、スペーサーペプチドはアミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する。場合によって、抗体はスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する。
【００３０】
幾つかの方法では、四量体抗体はエフェクター機能を有する。場合によって、エフェクター機能は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である。
【００３１】
幾つかの方法では、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である。
【００３２】
幾つかの方法では、抗体は、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される。幾つかの方法では、抗体は、少なくとも位置Ａｓｎ２９７においてグリコシル化されている。
【００３３】
幾つかの方法では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。幾つかの方法では、重鎖定常領域は、ＣＨ４領域をさらに含む。
【００３４】
幾つかの方法は、抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む。
【００３５】
幾つかの方法では、融合タンパク質は、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する。
【００３６】
定義
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を有し、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に必要とされる、約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主として、エフェクター機能のために必要とされる定常領域を規定する。
【００３７】
軽鎖は、κ又はλの何れかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして、抗体のイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖は、可変領域及び定常領域へさらに細かく分けられる（一般的には、 Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７参照（あらゆる目的のために、その全体が、参照により組み込まれる。）。
【００３８】
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、完全な状態の抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性又は二特異的抗体を除き、２つの抗原部位は同一である。鎖は全て、３つの超可変領域によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）の同じ一般的構造を呈する。各対の２つの鎖から得られるＣＤＲは、特異的なエピトープへの結合を可能にするフレームワーク領域によって並列される。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖及び重鎖は何れも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び（幾つかの事例では）ＣＨ４領域にさらに分けられる。各ドメインへのアミノ酸の割り当て及びアミノ酸の付番は、「Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）」の定義に従う。
【００３９】
完全な状態の抗体は、完全長の免疫グロブリン可変領域及び定常領域を有する、上述のような四量体構造を意味する。完全な状態の免疫グロブリンにおける可変領域は成熟状態にあり、これは免疫グロブリンシグナル配列を欠如することを意味する。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、互換的に使用される。完全な状態の抗体の結合断片（Ｆａｂなど）も、抗体と称される。
【００４０】
疎水性アミノ酸は、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅであり、場合によって、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ、及びｔｙｒでもある。親水性アミノ酸は、ａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ及びｔｈｒである。
【００４１】
２つの要素間の特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より大きな親和性が好ましい。
【００４２】
本発明の抗体に対する目的の標的には、成長因子受容体（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ，ＮＧＦＲ及びＶＥＧＦ）及びそれらのリガンドが含まれる。他の標的は、Ｇタンパク質受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α及びβアドレナリン作動性受容体、セロトニン受容体及びＰＡＦ受容体が含まれる。例えば、「Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：６２５−６４９（１９８７）」を参照のこと。他の標的には、イオンチャンネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャンネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体及びドーパミン受容体が含まれる（Ｈａｒｐｏｌｄ、５，４０１，６２９及び米国特許第５，４３６，１２８号参照）。他の標的は、インテグリン、セレクチン及び免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパク質である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３４６：４２５−４３３（１９９０） Ｏｓｂｏｒｎ，Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２）を参照。）。他の標的は、インターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α＆β、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍成長因子β（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカインである。「Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１）」参照。他の標的は、ホルモン、酵素並びにアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣなどの細胞内及び細胞間メッセンジャーである。興味深いその他の標的は、ＣＤ２０及びＣＤ３３などの白血球抗原である。薬物も、興味深い標的であり得る。標的分子は、ヒト、哺乳動物又は細菌のものであり得る。他の標的は、微生物病原体（ウイルスと細菌の両方）及び腫瘍から得られるタンパク質、糖タンパク質及び炭水化物などの抗原である。さらに別の標的が、米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００４３】
１つ又はそれ以上の記載された要素を「含む」組成物又は方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。
【００４４】
核酸が、別の核酸配列と、機能的な関係に置かれたときに、核酸は作用可能に連結されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合に、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に作用可能に連結されている。作用可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的には、連続していることを意味し、２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合には、連続的であり、及びリーディングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、最大数キロ塩基又はそれ以上、プロモーターから隔たっている場合にも、エンハンサーは、一般的には、機能するので、幾つかのポリヌクレオチド要素は作用可能に連結され得るが、連続していなくてもよい。
【００４５】
本明細書において使用される、グリカン種に対する「主に」という用語又は「主な」又は「主要である」などの変形語は、グリカン種が、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって分析された、糖タンパク質がＰＮＧアーゼで処理された後の総Ｎ−グリカン及び放出されたグリカンの最高モルパーセント（％）を有することを意味する。換言すれば、あらゆる他の個別の構成要素より大きなモルパーセントで存在する、個別の構成要素（特異的な糖型など）は、「主要」である。例えば、組成物が、４０モルパーセントの種Ａ、３５モルパーセントの種Ｂ及び２５モルパーセントの種Ｃからなる場合には、組成物は主に種Ａを含む。
【００４６】
本発明の抗体は、典型的には、宿主細胞の可溶性タンパク質を含む望ましくない混入物から、実質的に純粋な形態で単離される。これは、抗体が、典型的には、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であることを意味する。時には、抗体は、少なくとも約８０％ｗ／ｗの純度であり、より好ましくは、少なくとも９０又は約９５％ｗ／ｗ純度である。慣用のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも９９％ｗ／ｗ純度の抗体を取得することが可能である。非還元条件下で、ゲル上で単一のバンドとして走行する場合、及び還元条件下で、成分免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に対応する２つのバンドとして走行する場合、抗体は実質的な均一状態まで精製されている。
【００４７】
本明細書で使用される下等真核宿主細胞は、通常、高マンノース含有Ｎ−グリカンを産生する全ての真核細胞を表し、従って、幾つかの動物又は植物細胞、及び多くの典型的な下等真核細胞（酵母及び糸状菌細胞を含む。）が含まれるものとする。
【００４８】
本明細書において使用される「Ｎ−グリカン」という用語は、Ｎ結合型オリゴ糖（例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によって結合されているもの）を表す。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを表し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンを表す。）の共通の五糖コアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加された末端糖（例えば、フコース及びシアル酸）を含む分岐（触覚）の数が異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分岐した構成要素（例えば、高マンノース複合体又はハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」種Ｎ−グリカンは、５又はそれ以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、１，３マンノースアームに結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及び「トリマンノースコア」の１，６マンノースアームに結合された少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。「トリマンノースコア」は、Ｍａｎ３構造を有する五糖コアである。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸又は誘導体で場合によって修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基も有し得る（「ＮｅｕＡｃ」（「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表す。）。）。複合Ｎ−グリカンは、「二股」ＧｌｃＮＡｃ及びコアフコース（「ｆｕｃ」）を含む鎖内置換も有し得る。「ハイブリッド」グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ及びトリマンノースコアの１，６マンノース上にゼロ又はそれ以上のマンノースを有する。
【００４９】
本発明中のスペーサーペプチドは、本発明の発現された融合タンパク質から軽鎖及び重鎖を切断するための１つ又はそれ以上のタンパク分解部位を含む。スペーサーペプチドは、ペプチドリンカーを含むことも可能である。リンカーの１つの機能は、本発明の融合タンパク質内に、軽鎖と重鎖の間に物理的空間と柔軟性を提供することである。場合によって、リンカーは、他の機能も有する。例えば、リンカーは、機能的な分泌されたタンパク質ドメインをコードすることが可能である。しかしながら、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の何れかは、融合タンパク質がその中で発現されるべき宿主のタンパク質由来のペプチド配列と融合される必要はない。融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列の存在は、以下に記載されているプロセッシング及び集合段階が起こるようにするために、融合タンパク質を適切な細胞位置に誘導するのに十分である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
Ｉ．総説
本発明は、様々な細胞種中で、完全な状態の抗体を発現させるのに適した方法を提供する。本方法は、下等な真核生物中での発現に特に適しているが、本方法は、高等な真核生物及び細菌中でも実施することが可能である。本方法は、単一のプロモーターの制御下にある一本鎖抗体をコードする核酸を発現させることを含む。一本鎖抗体は、可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖、スペーサーペプチド並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む。スペーサーペプチドは、少なくとも１つ、通常は、２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含む。本発明の実施は、機序の理解に依存しないが、融合タンパク質中での結合による、等モル比での重鎖及び軽鎖の発現は、下等真核生物及び細菌中で、完全な状態の抗体の集合を取得する上で以前に経験された困難を少なくとも部分的に克服すると考えられる。スペーサーペプチドは、抗体の集合の前、最中又は後に、タンパク分解切断によって除去され得る。いつ除去されるかに関わらず、スペーサーペプチドは、重鎖−軽鎖対又は四量体抗体の形成を妨げない。このような発現及びタンパク分解切断の最終産物は、重鎖及び軽鎖の少なくとも１つ、好ましくは２つの対を含み、並びにスペーサー残基の殆ど又は全てを欠如する抗体である。
【００５１】
遺伝的に修飾された下等真核生物宿主細胞の選択によって、適切なグリコシル化を達成することも可能である。これらの遺伝的に修飾された宿主によって産生された抗体の重大な利点は、このような細胞から産生される抗体が１つの主要な糖型を有し、（フコースが宿主中に加工されていなければ）フコースを欠如することである。本方法は、従って、哺乳動物細胞培養の発現に内包される非効率と出費なしに、及びグリカン構造の均一性などの潜在的に有利なある種の特性を有して、哺乳動物細胞中で産生された抗体の形質と類似の、多くの所望される形質（機能及び治療活性など）を有する抗体組成物をもたらすことが可能である。
【００５２】
ＩＩ．一本鎖抗体の成分
本発明の抗体は、当初、幾つかの成分を有する融合タンパク質として発現される。前記成分は、少なくとも、Ｎ末端からＣ末端へと、シグナル配列、第一の免疫グロブリン鎖、スペーサーペプチド及び第二の免疫グロブリン鎖を含む。軽鎖又は重鎖の何れかを第一の鎖として指定し、他方は、任意の選択として、第二の鎖として指定することができる。シグナル配列は、細胞質から細胞小器官内へ、及び／又は細胞膜を横切る（生物による）までの経路に融合タンパク質を誘導する。原核生物では、シグナル配列は、細胞膜を横切って、その中で抗体が形成する周辺質へと、融合タンパク質を誘導する。真核生物では、シグナル配列は、細胞質から小胞体、ゴルジへと融合タンパク質を誘導し、通常、細胞からの分泌が続く。融合タンパク質が本経路に沿って移動するにつれ、融合タンパク質は、以下でさらに詳しく記載されている幾つかのタンパク分解性プロセッシング工程、グリコシル化及び折り畳み工程に供される。
【００５３】
シグナル配列に連結されるのは、スペーサーペプチドによって隔てられた第一及び第二の免疫グロブリン鎖である。第一の免疫グロブリン鎖のＮ末端側に位置する単一のシグナル配列は、免疫グロブリン重鎖と軽鎖の両方を含む完全な融合タンパク質の細胞小器官標的誘導及び／又は分泌を誘導する役割を果たす。従って、スペーサーペプチドと第二の免疫グロブリン鎖の間に第二のシグナル配列を含めることは不要であり、望ましくない。
【００５４】
軽鎖及び重鎖は何れも、可変領域及び定常領域を有する。可変領域は、好ましくは、完全な可変領域であり、又は、完全でなければ、可変領域は、少なくとも、合わせて、標的抗原への特異的な結合を付与するのに十分である。重鎖及び軽鎖定常領域は、重鎖及び軽鎖の安定な対（例えば、Ｆａｂ断片）の形成を可能とするのに少なくとも十分である。好ましくは、軽鎖定常領域は、重鎖及び軽鎖の対の形成を可能にするのに十分であり、並びに重鎖定常領域は、分子間ジスルフィド及び重鎖と軽鎖の定常領域の非共有結合を介した軽鎖−重鎖対の形成及び重鎖と軽鎖の２つの対を含む四量体の形成を何れも可能とするのに十分である（前記２つの対は、各重鎖領域の非共有結合及びジスルフィド結合を通じて会合されている。）。好ましくは、重鎖及び軽鎖定常領域は何れも、完全長である。好ましくは、抗体は、補体固定又は抗体依存性細胞毒性などのエフェクター機能を有する四量体抗体である。エフェクター機能の性質は、イソタイプに依存する。例えば、ヒトイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は補体活性を有するが、イソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は補体活性を有しない。
【００５５】
通常、融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列は何れも、分泌経路を通じたさらなるプロセッシングのために、融合タンパク質転写物（ｍＲＮＡ）をＥＲに誘導する役割を果たす（すなわち、ゴルジを通じ、細胞外へ）。シグナル配列は、しばしば、抗体発現がその中で起こるべき細胞と同じ生物に由来する。しかしながら、このようなことは、必須ではない。使用することが可能なシグナル配列の例には、以下の分泌されるタンパク質：Ｓ．セレビシアエα接合因子プレ、アスペルギルスαアミラーゼ、アスペルギルスグルコアミラーゼ（ＧＬＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）イヌリナーゼ（ＩＮＵ）、Ｓ．セレビシアエインベルターゼ（ＩＮＶ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＡＲ２、Ｓ．セレビシアエキラートキシンプレ（ＫＩＬＭ）、Ｐ．パストリスホスファターゼＩ（ＰＨＯＩ）、Ｓ．セレビシアエα接合因子プレプロ、Ｐ．パストリスα接合因子プレプロＫＲ及びニワトリリゾチーム（ＣｈｉｃＬｙｓ）のうち１つに由来するシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、典型的には、細胞内プロセッシングの時点で、融合タンパク質転写物から切断される。
【００５６】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、抗体のあらゆる種類から得ることが可能である。ポリクローナル抗体も組換え的に発現されることができるが（例えば、米国特許６，５５５，３１０号参照）、通常、抗体はモノクローナル抗体である。発現され得る抗体の例には、ネズミ又はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体及びヒト抗体が含まれる。キメラ抗体とは、その軽鎖及び重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体である（例えば、Ｂｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：５２０−５３５（２００３）参照。）。例えば、マウスモノクローナル抗体から得られる遺伝子の可変（Ｖ）セグメントは、ヒト定常（Ｃ）セグメントに連結され得る。従って、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶ又は抗原結合ドメイン及びヒト抗体由来のＣ又はエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
【００５７】
ヒト化抗体は、ヒト抗体（アクセプター抗体と名付けられる。）に実質的に由来する可変領域フレームワーク残基及びマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと称される。）に実質的に由来する相補性決定領域を有する。「Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）」及びＷＯ ９０／０７８６１、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号及びＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。存在すれば、定常領域も、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリンに由来する。抗体は、採取源のうち特に、慣用のハイブリドーマアプローチ、ファージディスプレイ（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９１／１７２７１及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９２／０１０４７参照）、ヒト免疫系を有するトランスジェニックマウスの使用（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７（１９９３））によって取得することができる。免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、ハイブリドーマ又は抗体産生細胞株から取得し、又は公表された文献中の免疫グロブリン核酸又はアミノ酸配列に基づいて取得することが可能である。
【００５８】
軽鎖及び重鎖は、スペーサーペプチドによって隔てられる。ペプチドは、シグナル配列に連結された鎖のＣ末端を、他の鎖のＮ末端に連結する。スペーサーペプチドは、融合タンパク質とは別の分子であるプロテアーゼによって切断可能な、少なくとも１つ、好ましくは２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する。すなわち、本発明において、タンパク分解切断部位の切断は、分子内ではなく、分子間反応である。ペプチドスペーサーは、融合タンパク質、又は特にそのスペーサーペプチド成分によって実施される分子内自己触媒的機序によって切断可能な自己プロセッシング切断部位を欠如する。自己プロセッシング切断部位の例は、「ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，１１４４１−１１４４８（２００３）」によって記載されている。このような自己切断可能部位は、細胞小器官標的誘導及び抗体集合などの他のプロセッシング工程が起こる前に、ペプチドスペーサーを未成熟に切断する。このような未成熟な切断の結果、少なくとも下等な真核生物では、同じシグナルペプチドは、両免疫グロブリン鎖を、さらなるタンパク分解プロセッシングのために、小胞体へと標的誘導することができない。
【００５９】
ペプチドスペーサーが２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、タンパク分解部位は同一又は別異とすることができ、同一又は別異のプロテアーゼによって切断することが可能である。通常、ペプチドスペーサーが２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、全てが、同一のプロテアーゼによって切断される。しかしながら、ペプチドスペーサーが、異なるプロテアーゼによって切断される、２つ又はそれ以上のタンパク分解切断部位を含有する場合には、異なるプロテアーゼは、全て融合タンパク質とは別個の分子である。すなわち、タンパク分解切断部位は全て、自己切断タンパク分解切断部位でない。
【００６０】
場合によって、スペーサーペプチドは、１つ又はそれ以上の直列のタンパク分解切断部位からなる。あるいは、スペーサーペプチドは、タンパク分解切断部位の対によって隣接されたリンカーからなることができる。タンパク分解部位での切断が、同じ融合タンパク質の成分から重鎖及び軽鎖を分離し、それらを別個の鎖として放出するように、タンパク分解部位が配置される。ペプチド結合によって連結されていないという意味で、鎖は隔てられている。しかしながら、鎖は、重鎖と軽鎖の間の分子間ジスルフィド結合及び非共有結合によって連結することが可能である。好ましくは、タンパク分解切断部位は、いかなる免疫グロブリン残基も切断せずに、スペーサーペプチドの殆ど又は全てから、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を分離するように配置される。
【００６１】
タンパク分解部位の選択は、１つには、宿主細胞の選択に依存する。幾つかの方法では、本部位は、所望の宿主細胞中に天然に存在するプロテアーゼによって切断される部位である。他の方法では、タンパク分解部位は、遺伝子工学によって、所望の宿主細胞中に導入されたプロテアーゼによって切断される。タンパク分解切断部位は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖上に、同じ部位が存在しないように選択される。酵母宿主細胞に対する好ましいタンパク分解切断部位は、プロテアーゼＫｅｘ２ｐである。本酵素は、アミノ酸対ＫＲのＣ末端側を切断する。好ましくは、この対の前には、ＶＬなどの１つ若しくは２つの疎水性残基又はＲＨ若しくはＫＨなどの親水性残基がＮ末端側に先行する。場合によって、アルギニン残基もＲＬＶにおけるように存在する。融合タンパク質に対する好ましい規格は、シグナル配列−軽鎖−ＬＶＫＲリンカーＲＬＶＫＲ−重鎖である。Ｋｅｘ２ｐ切断は、ＫＲ残基対の両方の後に生じる。別のプロテアーゼによる分解は、ＬＶＫＲ残基を除去し、分離された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を残し、介在するスペーサー残基を残さない。
【００６２】
Ｋｅｘ２ｐの他に、他の公知の内在性酵母タンパク分解酵素には、何れもゴルジ後部中に位置するＫｅｘ１Ｐ及びＳｔｅ１３ｐ並びに液胞（リソゾーム）中に位置するＢｐｌＩｐ、ＣＰＹｐ及びＰｅｐ４ｐが含まれる。これらの酵素に対する切断配列は、以前に開示されている（ＪＣＢ，１９９２，１１９：１４５９−１４６８；Ｙｅａｓｔ，１９９４，１０：８０１−８１０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，１９９５，１３０：２２１−２２９；Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１９８４，１８：２３３−２７０）。内在性Ｋｅｘ２ｐの発現が低い場合には、リンカー中のＫｅｘ２ｐ部位の一方又は両方の後へのＥＡＥＡの付加は（例えば、ＬＶＫＲＥＡＥＡ）、Ｋｅｘ２ｐ及び／又はＳｔｅ１３ｐによる切断を改善する。ＥＡＥＡの付加は、第二のＫｅｘ２ｐ部位後に特に有用である。場合によって、Ｓ．セレビシアエ又はＰ．パストリス由来のＫｅｘ２ｐは、切断を改善するために、誘導性プロモーターの調節下で、宿主細胞中において過剰発現される。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞中でのインビボ切断の場合、使用できるタンパク分解部位及び酵素には、第Ｘａ因子、トロンビン、シグナルペプチダーゼＩ及びフリンが含まれ得る。これらのタンパク分解酵素は、本分野において周知である。
【００６４】
タンパク分解切断部位以外では、スペーサーペプチドの組成は重要でない。スペーサーペプチドが、タンパク分解切断部位より多くからなり、及びリンカー、一本鎖抗体の発現に適した様々なリンカーを含有するのであれば、それらの設計のための原理は本分野において公知である（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ ５８７９− ５８８３（１９８８）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３−４２６（１９８８）；米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号及び米国特許第５，４８２，８５８号、米国特許第５，２５８，４９８号）。一般に、リンカーは、同じ融合タンパク質の重鎖及び軽鎖の分子内会合又は異なる融合タンパク質上の重鎖及び軽鎖間の分子間会合を許容するのに十分な長さと柔軟性を有するべきである。グリシン及び／又はセリンは、特に、リンカー中に含めるのに適している。適切な長さは、約０から１００アミノ酸の範囲である。１５アミノ酸又はそれ以上の総スペーサーペプチド長（タンパク分解切断部位を含む。）は、重鎖及び軽鎖の分子内結合を好む。より短いスペーサーペプチド長は、分子間結合を好む。適切なリンカーの一例は、１６回反復される４つのグリシン及び１つのセリンモチーフの後に、プロリン（Ｐ）及びＣ末端タンパク分解切断部位の直前に位置する５つのさらなるグリシン残基が続く［（ＧＧＧＧＳ）１６ＰＧＧＧＧＧ］。箱型の環構造を有するプロリンは、柔軟なグリシンリンカーに安定な蝶番様構造を与える。柔軟なリンカーの別の例は、ｇｌｙ、ｓｅｒの少なくとも３単位の反復［例えば、ＧＳＧＳＧＳ］である。さらなる代替として、スペーサーは、タンパク分解切断部位（例えば、５−３０個のＫｅｘ２部位）の鎖を直列に有することが可能である。
【００６５】
上記成分の他に、ペプチドスペーサーは、分泌されたタンパク質ドメインを含むことが可能である。分泌されたタンパク質ドメインは、少なくとも２つの役割で機能することが可能である。第一に、分泌されたタンパク質ドメインは、下流鎖の分泌及び集合を増強及び／又は促進することが可能である。第二に、下等な真核生物宿主では、この分泌されたタンパク質ドメインは、Ｏ−グリコシル化酵素を飽和するために使用することにより、発現された重鎖及び軽鎖上に存在する非ヒトＯ−グリコシル化の程度を低減することが可能である。
【００６６】
しかしながら、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の何れかは、融合タンパク質がその中で発現されるべき宿主のタンパク質由来のペプチド配列と融合される必要はない。融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列の存在は、以下に記載されているプロセッシング及び集合段階が起こるようにするために、融合タンパク質を適切な細胞位置に誘導するのに十分である。従って、例えば、シグナル配列は、介在するアミノ酸なしに、第一の免疫グロブリン鎖に直接融合させることが可能であり、スペーサーペプチドは、第二の免疫グロブリン鎖に直接融合させることが可能であり、スペーサーペプチド自体は、宿主タンパク質由来のペプチド配列を一切含まないことができる。
【００６７】
融合タンパク質の場合によって使用されるさらなる成分は、融合タンパク質又は融合タンパク質のプロセッシングによって生じる融合タンパク質又は抗体の同定又は精製を補助するためのペプチドタグである。このようなタグは、スペーサーペプチド内の、若しくはスペーサーペプチドの一方端に連結された第一の免疫グロブリン鎖のＮ末端又は第二の免疫グロブリン鎖のＣ末端に配置することが可能である。タグの例は、ＦＬＡＧＴＭ系（Ｋｏｄａｋ）である。ＦＬＡＧＴＭ分子タグは、標的結合部分に連結された８アミノ酸ＦＬＡＧペプチドマーカーからなる。ＦＬＡＧペプチドマーカーとの使用に適した抗体。別の例は、金属キレートリガンドによって結合されることが可能なポリヒスチジンタグ（Ｈｏｃｈｕｌｉ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ｅｄ． ＪＫ Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ），Ｃｈ． １８，ｐｐ．８７−９６参照）及びマルトース結合タンパク質（Ｍａｉｎａ，ｅｔ ａｔ，Ｇｅｎｅ ７４：３６５−３７３（１９８８））である。幾つかの他のペプチドタグが公知であり、容易に入手可能である。
【００６８】
ＩＩＩ．融合タンパク質をコードする核酸
上記融合タンパク質は、核酸によってコードされる。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり得る。融合タンパク質をコードする核酸は、融合タンパク質の発現を可能とする制御配列へ、作用可能に連結されている。このような制御配列には、融合タンパク質をコードする核酸に対して上流又は５’に位置するプロモーター及び場合によって使用されるエンハンサー並びに融合タンパク質をコードする核酸から３’又は下流に位置する転写終結部位が含まれる。核酸は、典型的には、リボソーム結合部位を有する５’ＵＴＲ及び３’非翻訳領域もコードする。核酸は、しばしば、抗体がその中で発現される細胞中で複製可能なベクターの成分である。ベクターは、形質転換された細胞の認識を可能とするためにマーカーを含有することもできる。しかしながら、幾つかの細胞種、特に酵母は、外来ベクター配列を欠く核酸で首尾よく形質転換することが可能である。
【００６９】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードする核酸は、幾つかの採取源から取得することが可能である。ｃＤＮＡ配列は、保存された領域に対するプライマーを用いて、抗体を発現するハイブリドーマ又は他の細胞株から増幅することが可能である（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｔ Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）参照。）。核酸は、科学文献中の配列に基づいて、新規に合成することも可能である。所望の配列を包含する、重複するオリゴヌクレオチドの伸長によって、核酸を合成することも可能である（例えば、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）参照）。
【００７０】
ＩＶ．宿主細胞
下等真核生物は、経済的に培養し、高い収率を与えることができ、適切に修飾した場合には、適切なグリコシル化を行うことができるので、抗体の発現のために好ましい。酵母及び糸状菌は、特に、確立された遺伝学を提供し、迅速な形質転換、検査されたタンパク質局在化戦略及び容易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする。適切なベクターは、所望に応じて、プロモーターなどの発現調節配列（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素を含む。）、及び複製起点、終結配列などを有する。ベクターは、本発明の融合タンパク質をコードする核酸に隣接するセグメント（このセグメントは、宿主染色体の選択された領域と組み換えることができる。）を含むことも可能であり、これにより、発現を好む染色体位置へと核酸を標的誘導する。
【００７１】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などの様々な酵母は、高い細胞密度まで増殖し、組換えタンパク質の大量を分泌することが可能であるので、これらは、細胞培養のために好ましい。同様に、本発明のグリコシル化された抗体を産業規模で製造するために、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの糸状菌（例えば、米国特許５，３６４，７７０号、ＥＰ２１４，９１４号及びＷＯ９０／１５８６０号）などの糸状真菌及びその他を使用することが可能である。
【００７２】
下等な真核生物、特に酵母及び糸状菌は、グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化されている抗体（又はその他のタンパク質）を発現するように、遺伝的に修飾することが可能である。このようなことは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ ２００４００１８５９０；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１ ：１２４４−１２４６）によって記載されているように、特定の内在性グリコシル化酵素を除去し、及び／又は外在性酵素を供給することによって達成することが可能である。例えば、宿主細胞は、本来、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加するα−１，６−マンノシル転位酵素活性が枯渇されるように選択し、又は操作することが可能である。
【００７３】
このような宿主細胞は、これに加えて又はこれに代えて、インビボで、複合炭水化物構造（及びその合成中間体）の産生を可能とする１つ又はそれ以上の酵素を発現するように操作することが可能である。このような酵素は、例えば、酵素に本来伴っていないシグナルペプチドを用いて、酵素がその中で最適な活性を有する宿主細胞内小器官へと標的誘導されることが可能である。このような宿主細胞は、糖ヌクレオチド輸送体及び／又はヌクレオチドジホスファターゼ酵素を発現するように修飾することも可能である。輸送体及びジホスファターゼ酵素は、適切な区画中にグリコシル化酵素に対する適切な基質を提供することにより、競合産物阻害を減少することにより、及びヌクレオチド二リン酸の除去を促進することにより、操作されたグリコシル化工程の効率を改善する。
【００７４】
これらの操作された宿主細胞の別の利点は、フコースが特異的に操作されていなければフコースを欠如する主に１つの糖型構造を有する抗体組成物を産生するためにそれらを使用できることである。他の糖タンパク質におけるグリコシル化の役割と同様に、抗体のオリゴ糖側鎖はこの糖タンパク質の機能に影響を与える。例えば、減少したフコシル化されたＮ結合型グリカンを有する抗体組成物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩへの結合を増大させ、従って、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増大させることが示されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：３４６６−３４７３）。ＣＨＯ細胞中で作製された、フコシル化されたＧ２（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）ＩｇＧの均一な形態は、不均一な抗体より大きな程度まで、ＣＤＣ活性を増加させる（Ｒａｊｕ，２００４，米国特許出願第２００４／０１３６９８６号）。
【００７５】
適切に操作された下等真核生物の宿主細胞中での本発明の方法の実施は、主に均一な糖型をもたらす。すなわち、このような細胞によって産生された抗体は、対応するＮ−グリコシル化部位に主なＮ−グリカン構造を有する。さらに、本発明に開示されている酵母及び糸状菌宿主中で産生されたグリカンは、天然には、フコースを欠如する。従って、本発明の操作された宿主細胞は、主に１つの糖型構造の複合Ｎ−グリカンを有し、（フコースが特異的に操作されていなければ）フコースを欠如する抗体を産生することが可能である。一実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約５モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約２５〜５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７８】
別の実施形態において、本発明は、主に１つのグリカン構造を含む、本発明の方法によって作製された抗体組成物を提供し、ここにおいて、主なグリカン構造は、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約５０モルパーセント多いレベルで存在する。
【００７９】
抗体を発現するために使用することが可能な原核生物宿主には、Ｅ．コリ、バチルス・ズブチリスなどの桿菌並びにサルモネラ、セラチア及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科が含まれる。原核生物は、培養の容易さの観点で、下等な真核生物の利点の幾つかを有するが、適切なグリコシル化を実施することはできない。原核生物宿主では、発現ベクターを作製することも可能であり、これは、典型的には、宿主細胞と適合性のある発現調節配列（例えば、複製起点）を含有する。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系又はλファージ由来のプロモーター系など、周知の様々なプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的には、場合によってオペレーター配列とともに、発現を制御し、並びに転写及び翻訳を開始及び完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【００８０】
植物及び植物細胞培養物は、本発明の抗体を発現するために使用し得る。（Ｌａｒｒｉｃｋ ＆ Ｆｒｙ，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２（４）：１７２−８９（１９９１）；Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７（４）：８６５−７４（１９９１）；Ｄｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（２）：２８１−９３（１９９０）；Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７６−８（１９８９））。好ましい植物宿主には、例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ラスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）及びソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）が含まれる。
【００８１】
典型的には、バキュロウイルスをベースとした発現系を用いて、本発明の抗体を作製するために昆虫細胞培養物を使用することも可能である（Ｐｕｔｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６５１−６５４（１９９０）参照）。
【００８２】
下等真核生物及び原核生物ほど培養が経済的ではないが、哺乳動物の組織細胞も、本発明のポリペプチドを発現及び産生するために使用することが可能である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７参照。）。適切な宿主には、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株など、又は形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマが含まれる。これらの細胞に対する発現ベクターは、複製起点、１つ又はそれ以上のプロモーター、１つ又はそれ以上のエンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８（１９８６））などの発現調節配列、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結因子配列などの必要なプロセッシング情報部位を含むことが可能である。発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターであり得る。好ましいプロモーターは、恒常性又は誘導性であり得る。一般的には、ｎｅｏＲ発現カセットなどの選択可能なマーカーが発現ベクター中に含められる。
【００８３】
発現されるべき免疫グロブリン鎖をコードする核酸は、細胞宿主の種類に応じて異なる慣用の方法によって宿主細胞中に導入することが可能である。例えば、塩化カルシウム形質移入は原核細胞に対して一般に使用されるのに対して、リン酸カルシウム処理、プロトプラスト融合、天然の増殖、リポフェクション、粒子衝撃、ウイルスベースの形質導入又は電気穿孔を、他の細胞宿主に対して使用することが可能である。植物細胞及び組織に対しては、タングステン粒子衝撃遺伝子組み換えが好ましい。（一般的には、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）を参照、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）好ましくは、核酸は、エピスームとして、又は宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、宿主細胞中に安定に維持される。
【００８４】
一旦発現されると、本発明の抗体は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの、本分野の標準的な手法に従って精製することが可能である（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ． Ｙ．，１９８２）を参照、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）。医薬に使用するためには、少なくとも約９０〜９５％の均一状態の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一状態が最も好ましい。部分的に、又は所望の均一状態まで一旦精製されると、次いで、ポリペプチドは治療的に使用されるか（体外での使用を含む。）、又はアッセイ操作、免疫蛍光染色などの開発及び実行において使用することが可能である。（一般的には、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ． Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９ ａｎｄ １９８１）を参照。）
【００８５】
Ｖ．抗体発現、プロセッシング、集合及び分泌
シグナル配列、免疫グロブリン軽鎖、スペーサーペプチド及び免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸は、当初、融合タンパク質として発現される。次いで、融合タンパク質は、鎖が分子内会合ではなく分子間会合された、重鎖と軽鎖の対を含む抗体を産生する一連のプロセッシング及び折り畳み現象に供される。これらの現象には、細胞小器官への融合タンパク質の標的誘導及び／又はシグナル配列によって媒介される宿主からの分泌、シグナル配列のプロセッシング、ヘテロ二量体の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子内又は分子間会合、四量体を形成するための２つのヘテロ二量体の対合、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、及び重鎖と軽鎖がもはや同じペプチド鎖の成分でないようにする、スペーサー中のタンパク分解部位の切断が含まれ得る。これらの現象の順序及び正確な性質は、培養条件、構築物の性質、シグナル配列、スペーサーペプチド及び宿主細胞に応じて変動し得る。機序の理解は、本発明の実施に必要でない。
【００８６】
図２は、融合タンパク質の翻訳後修飾の１つの可能な配列における中間体を示している。図は、２つの融合タンパク質の会合によって形成された四量体抗体を示している。各融合タンパク質において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は、軽鎖及び重鎖可変領域間の非共有結合及び定常領域間のジスルフィド結合によって分子内会合される。２つの融合タンパク質は、各重鎖のＦｃ領域間の非共有相互作用及びジスルフィド相互作用によって一緒に保たれる。重鎖定常領域の残基Ａｓｎ２９７は、両融合タンパク質においてグリコシル化されている。図３は、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位の切断後における同じ抗体を示している。四量体抗体の立体構造は、同じ融合タンパク質の一部であり、分子間会合されている重鎖及び軽鎖が、この段階では、別個の鎖であり、及び分子間会合されていることを除き不変である。抗体に結合されたまま残存しているスペーサーペプチドが存在している場合、その長さは、スペーサーペプチド中の切断部位の位置及び何れかの残存スペーサーペプチドを分解する上での何れかのエキソぺプチダーゼの作用に依存する。Ｋｅｘ２ｐ部位ＬＶＫＲ及びＲＬＶＫＲによって隣接されたリンカーは、Ｒ残基後に、Ｋｅｘ２Ｐ切断によって除去ｓれ、その後のエキソプロテアーゼ活性は、第一の（Ｎ末端）タンパク分解切断からＬＶＫＲを除去して、スペーサーペプチド残基を欠如する実質的に均一な抗体産物を与える。抗体産物に不均一性が存在する限り、抗体の望ましい形態は、インビトロで行われるさらなる切断、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び陽イオン交換クロマトグラフィーによって、他の切断産物から分離され得る（実施例３参照）。
【００８７】
タンパク分解部位の切断はインビボで好ましく生じるが、インビトロで実施することも可能である。抗体は、宿主細胞から分泌又はその他の方法で放出され、タンパク分解部位を切断することが知られたプロテアーゼで処理される。幾つかのタンパク分解部位を使用することが可能である。宿主細胞中で見られるものに加え、融合タンパク質構築物中に他のタンパク分解部位を導入することが可能である。これらの部位は、インビトロ切断のために、タンパク分解酵素を宿主細胞中に導入することによって、又は切断されていない融合タンパク質を発現及び精製し、インビトロ反応においてリンカー領域を切断することによって切断することが可能である。インビトロ切断反応において使用するために、インビボで機能することが開示されている全てのタンパク分解酵素を精製又は購入することが可能である。
【００８８】
インビトロでのＫｅｘ２ｐ切断のために、Ｋｅｘ２ｐをまず精製し（ＰＮＡＳ，１９９２，８９：９２２−９２６）、次いで、Ｋｅｘ２ｐ及びプロテインＡ精製された切断されていない抗体（例Ｘ）の両方を、記載のとおり（ＪＢＣ，１９９５，２７０：３１５４−３１５９）、温置する。このインビトロ切断の後には、Ｋｅｘ２ｐタンパク質から重鎖及び軽鎖を単離するための第二のプロテインＡクロマトグラフィーが続く。
【００８９】
通常、シグナル配列は、シグナル配列に融合されたタンパク質を宿主細胞から分泌される。分泌が起こらない場合には、抗体は、誘導された溶解によって宿主細胞から放出され得る。溶解は、数ある方法のうち、とりわけ、音波処理、凍結融解の繰り返し又はリゾチームでの処理によって誘導することが可能である。
【００９０】
ＶＩＩ．変形
上述のとおり、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するために必要なプロテアーゼは、細胞中に天然に存在するか、細胞へ外来的に供給されるか、又はインビトロで提供されることが可能である。変形では、適切なシグナルペプチドの選択によって、プロテアーゼは、分泌経路中の細胞小器官へ標的誘導される。このような標的誘導は、プロテアーゼに連結されたシグナルペプチドの選択によって達成することが可能である。このような標的誘導は、宿主細胞とともに自然に見出されるプロテアーゼ（例えば、酵母細胞中のＫｅｘ２ｐ）又は外来的に供給されるプロテアーゼの両方に対して使用することが可能である。標的誘導は、他のプロセッシング工程に対してタンパク分解切断が生じるタイミングに影響を与える。例えば、分泌経路の初期細胞小器官にプロテアーゼが標的誘導される場合、タンパク分解プロセッシングは、融合タンパク質の折り畳みより初期に生じる。このような状況では、タンパク分解プロセッシングは、完全である可能性がより高い。例えば、天然の酵母細胞では、多くのＫｅｘ２ｐプロセッシングがゴルジ後部において起こる。融合タンパク質がゴルジ後部に達する時点までに、抗体集合は実質的完了する。ＥＲ標的誘導ペプチドに連結されたさらなるＫｅｘ２ｐを発現させることによって、Ｋｅｘ２ｐは、小胞体中で発現される。この場合には、実質的な抗体折り畳みが起こる前に、タンパク分解切断部位がプロセッシングされ、より効率的な切断をもたらす。
【００９１】
本発明の方法によって産生された抗体の収率は、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／Ｌ培地、より好ましくは少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ又は２ｇ／Ｌ培地である。
【００９２】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明の抗体は、活性治療剤としての抗体と、及び医薬として許容される他の様々な成分とを含む医薬組成物中に取り込ませることが可能である。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）」を参照されたい。好ましい形態は、予定される投与の様式及び治療用途に依存する。組成物は、所望される製剤に応じて、医薬として許容される無毒の担体又は希釈剤（動物又はヒトに投与するための医薬組成物を調合するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される。）も含むことが可能である。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及びハンクの溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は無毒、非治療的、非免疫原性安定化剤なども含むことが可能である。
【００９３】
非経口投与用医薬組成物は、無菌であり、実質的に等張であり、発熱物質を含まず、ＦＤＡ又は類似機関のＧＭＰに従って調製される。抗体は、水、油、生理的食塩水、グリセロール又はエタノールなどの無菌の液体であり得る医薬担体とともに、生理的に許容される希釈剤中で、物質の溶液又は懸濁液の注射可能な投薬として投与することが可能である。さらに、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在することも可能である。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源の成分、例えば、落花生油、大豆油及び鉱物油である。一般的に、プロピレングリオール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射可能溶液に対して好ましい液体担体である。抗体は、活性成分の持続的放出を可能とする様式で調合することが可能なデポ注射又はインプラント調製物の形態で投与することも可能である。典型的には、組成物は、注射可能剤として（液体溶液又は懸濁液の何れかとして、）調製される。注射前に液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態も調製することが可能である。調製物は、上記のように、はポリラクチド、ポリグリコリドなどのリポソーム若しくは微粒子中に、又は増強したアジュバント効果のための共重合体中に乳化又は封入することも可能である（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，１５２７（１９９０） ａｎｄ Ｈａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８，９７−１１９（１９９７）参照）。
【００９４】
ＩＸ．診断用製品
本発明の抗体は、アレイなどの様々な診断キット及びその他の診断用製品中に取り込ませることも可能である。抗体は、しばしば、マイクロタイター皿のウェルなどの固相に予め結合されて提供される。キットは、しばしば、抗体結合を検出するための試薬及びキットの使用について指示を与えるラベルも含む。免疫計測的又はサンドイッチアッセイは、診断キットに対して好ましい規格である（米国特許第４，３７６，１１０号、同第４，４８６，５３０号、同第５，９１４，２４１号及び同第５，９６５，３７５号を参照。）。抗体アレイは、例えば、米国特許第５，９２２，６１５号、同第５，４５８，８５２号、同第６，０１９，９４４号及び同第６，１４３，５７６号によって記載されている。
【実施例】
【００９５】
１．融合タンパク質及び融合タンパク質をコードする核酸の設計
抗体抗ＤＸを発現するための融合タンパク質を、以下のように設計した。
【００９６】
【化１】
αアミラーゼシグナル配列は、斜字体で示されている。成熟した軽鎖と重鎖間のスペーサーペプチドは、下線で示されている。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【００９７】
【化２】
【００９８】
リンカーをコードするＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【００９９】
【化３】
【０１００】
抗ＤＸ抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲオーバーラップによって合成され、第一の免疫グロブリン鎖の上流にＭｌｙ１部位を付加した。ＩｇＧ１の軽鎖定常領域をコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃから注文した。完全な軽鎖をコードするＤＮＡは、ＰＣＲオーバーラップ伸長によって調製され、ｐＣＲ２．１トポベクターをクローニングした。完全な軽鎖は、５’末端にＭｌｙ１部位及び停止コドンの３’にＮｏｔ１部位を有していた。完全な軽鎖をコードするＤＮＡは、αアミラーゼシグナル配列をコードするＤＮＡとともに、ｐＰＩＣＺＡベクター中に連結された。αアミラーゼシグナル配列は、重複するオリゴヌクレオチドから合成された。シグナル配列は、ＡＴＧの前にＫｏｚａｋ配列を有し、５’末端にＥｃｏＲ１部位も有する。ｐＰＩＣＺＡは、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１によって消化された。αアミラーゼシグナル配列は、平滑末端化された５’及び３’末端に突出するＥｃｏＲ１部位を有する。軽断片は、ｐＣＲ２．１トポベクターから、Ｍｌｙ１及びＮｏｔ１によって消化され、これら３つの片を一緒に連結した。得られたプラスミドは、ｐＤＸ３９８である。
【０１０１】
抗ＤＸ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは、重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成された。ＩｇＧ１の重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃから注文した。次いで、オーバーラップＰＣＲによって、完全な状態の重鎖をコードするＤＮＡを調製し、ｐＣＲ２．１トポベクター中にクローニングして、プラスミドＤＸ３４４を得た。
【０１０２】
ベクターｐＰＩＣＺＡは、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１によって切断された。軽鎖定常領域の末端に位置するＥｃｏＲ１及びＳｐｈ１によって、αアミラーゼシグナル配列を含む軽鎖断片を消化した。重複するオリゴヌクレオチドによって、軽鎖定常領域の一部を含むリンカーを合成した（５’末端のオリゴヌクレオチドは１つのＳｐｈ１部位を含有する。）。Ｍｌｙ１及びＮｏｔ１によって、重鎖を有するプラスミドｐＣＲ２．１トポを消化し、アガロースゲルからバンドを回収した。４つの断片を連結して、図４に示されているベクターを得た。
【０１０３】
Ｐｍｅ１によってプラスミドｐＤＸ５６０を直鎖化し、幾つかのピチア・パストリス株、例えば、α１，６マンノシル転位酵素（Δｏｃｈ１）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，１００：５０２２−５０２７）、マンノシルホスファート（Δｐｎｏ１、Δｍｎｎ４ｂ）（米国特許出願１１／０２０８０８号）及びαマンノシダーゼ耐性２（Δａｍｒ２）遺伝子を欠如する背景で、α−マンノシダーゼＩ、ＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミン転位酵素Ｉ、ＩＩ及びガラクトシル転位酵素で形質転換された株ＹＡＳ３０６中に形質転換された。（米国特許出願６０／５６６７３６号及び６０／６２０１８６号）。
【０１０４】
２．Ｐ．パストリス株−例えば、ＹＡＳ３０６用の培養条件
１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン及び１％グリセロールからなる緩衝化されたグリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）の１０ｍＬ培養物を、プラスミドｐＤＸ５６０を含有するＹＡＳ３０６の新鮮なコロニーに播種し、２日間増殖させた。次いで、１Ｌフラスコ中の新鮮なＢＭＧＹ１００ｍＬ中に、培養物を１日間移した。次いで、この培養物を遠心し、ＢＭＭＹ（緩衝化された最小メタノール：１％グリセロールの代わりの０．５％メタノールを除き、ＢＭＧＹと同一）で細胞ペレットを洗浄した。元のＭＢＧＹ培養物の１／５容積まで、細胞ペレットをＢＭＭＹ中に再懸濁し、１．５Ｌの発酵反応装置中に２４時間配置した。遠心によってバイオマスを沈降させ、培地を新鮮なチューブに移すことによって、分泌されたタンパク質を採集した。分泌された抗体を含有する上清を、精製のために集めた。
【０１０５】
３．融合タンパク質の精製
Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて、モノクローナル抗体を培養上清から捕捉した。Ｔｒｉｓ−グリシンｐＨ３．５中に抗体を溶出し、１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０を用いて中和した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、さらなる精製を実施した。ＨＩＣカラムの具体的種類は、抗体に依存する。抗ＤＸ抗体の場合、２０ｍＭＴｒｉｓ（７．０）、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４緩衝液とともに、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用し、１Ｍから０Ｍへの（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線グラジエント緩衝液を用いて溶出した。フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた抗体画分をプールし、陽イオン交換（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを通じた最終精製のために、５０ｍＭＮａＯＡｃ／ＴｒｉｓｐＨ５．２緩衝液中に交換した。５０ｍＭＴｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いて、直線グラジエントで抗体を溶出した。
【０１０６】
図５は、重鎖及び軽鎖の四量体集合物について予測されるとおり、約１５０ｋＤａで移動する重鎖及び軽鎖を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。レーン１は、商業的に調製されたＩｇＧ対照を示し、レーン２は、別個のプロモーターによって、重鎖及び軽鎖の発現が駆動される組換え抗体産生のための伝統的方法を用いてＰ．パストリス中に産生されたＤＸ−ＩｇＧを示し、レーン３は、本発明の単一プロモーター法によって、Ｐ．パストリス中に産生されたＳＣ−ＤＸ−ＩｇＧを示す。
【０１０７】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（４〜２０％グラジエント及び１５％）を購入し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓから分子量マーカーを購入した。クマシーブルータンパク質株は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した。
【０１０８】
公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０，１９７０）に従って、抗ＤＸ抗体２０μｇを産生し、上記例に開示されているとおりに精製し、分子量及び精製の程度を分析するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図５に示されているように、分子量中の約１５０ｋＤａの単一バンドが、非還元条件下で存在した。この分子量は、ＩｇＧ抗体が、非還元条件下で約１５０ｋＤａの分子量を有すること、並びに分子中のジスルフィド結合の切断のために、約５０ｋＤａの分子量を有する重鎖及び約２５ｋＤａの分子量を有する軽鎖に分解されることを述べる報告と合致する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。
【０１０９】
４．抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の抗原１０μｇで、高結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）を被覆し、４℃で一晩温置した。緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ）を添加し、次いで、室温で１時間温置する。ブロッキング緩衝液を除去し、ＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。最後の洗浄後、０．２ｎｇから１００ｎｇまでの精製された抗体の漸増量を添加し、室温で１時間温置する。次いで、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを洗浄する。最後の洗浄後、１：２０００ＰＢＳ溶液中に抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを添加し、次いで、室温で１時間温置する。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを４回洗浄する。製造業者の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って、ＴＭＢ基質キットを用いてプレートを分析した。
【０１１０】
５．Ｆｃ受容体結合アッセイ
前記プロトコールに従って、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲｎに対するＦｃ受容体結合アッセイを実施した（ＪＢＣ，２００１，２７６：６５９１−６６０４）。ＦｃγＲＩＩＩ結合の場合、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩ融合タンパク質を、４℃で４８時間、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上に被覆する。２５℃で１時間、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロッキングした。２５℃で１時間、抗ＤＸＩｇＧ及びＨＲＰ抱合されたＦ（Ａｂ’）２抗Ｆ（Ａｂ’）２の２：１モル量を混合することによって、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に、抗ＤＸＩｇＧ１二量体複合体を調製する。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：２で、二量体複合体を系列希釈し、２５℃で１時間、プレート上に被覆した。使用した基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。製造業者の指示書に従って（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４５０ｎｍの吸光度を読み取る。図６は、Ｐ．パストリス中で産生された、ＤＸＩｇＧとＳＣＤＸＩｇＧの結合を比較する。
【０１１１】
６．ＥｒＢ２／Ｆｃ抗原への抗体の結合
室温で２時間、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍＬの組換えＥｒｂＢ２／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１００μＬ／ウェルで、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）を被覆した。上清を吸引し、ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）の２５０μＬ／ウェルを添加し、１時間温置した。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に抗体を希釈し、ブロッキング溶液を吸引した後、１００μＬ／ウェルを添加した。次いで、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＰＢＳの２５０μＬ／ウェルで、プレートを３回洗浄した。ＨＲＰ抱合された抗ＦＡＢ抗体（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬ／ウェルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に１：１０００希釈し、１時間温置した。上記のようにプレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬ／ウェルを添加した。青い色を呈した時点で、１ＭＨ２ＳＯ４によって反応を停止し、４５０ｎｍの吸収を読み取った。図７は、何れもＰ．パストリス中で産生された、ＤＸＩｇＧとＳＣ−ＤＸＩｇＧを比較する。
【０１１２】
理解を明確にするために、先述の発明を詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲に記されている本発明の範囲内である種の修飾を実施し得ることは当業者に自明である。本明細書に引用されている全ての公報及び特許文献は、各々が個別に表記されているのと同じ程度まで、あらゆる目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。各実施形態の文脈から別段の意味であることが自明でなければ、本発明の特徴、態様、要素又は工程は、他の全ての実施形態、特徴、態様、要素又は工程と組み合わせて使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、転写及び翻訳制御配列の単一のセットに由来する単一の転写及び翻訳単位として表されている重鎖及び軽鎖を示している。
【図２】図２は、ペプチドスペーサーを有する集合された抗体を示している。
【図３】図３は、インビトロ又はインビボで切断されて、完全に集合された抗体を残存させるペプチドスペーサーを示している。
【図４】図４は、一本鎖抗体を発現するために使用された構築物を示している。
【図５】図５は、四量体抗体の発現を確認するゲルを示している。
【図６】図６は、ＦＣγＲＩＩＩＡ−ＬＶへの抗体二量体の結合を示している。
【図７】図７は、抗体の、その抗原への結合を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を作製する方法であり、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された真菌細胞を培養することを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如し、；
前記融合タンパク質が発現され、前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断されてシグナル配列が除去され、及び前記プロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記タンパク分解部位において切断され；並びに、
分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される、前記方法。
【請求項２】
抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である、請求項１の方法。
【請求項３】
第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が重鎖である、請求項２の方法。
【請求項４】
第一の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が軽鎖である、請求項２の方法。
【請求項５】
融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに会合している、請求項２の方法。
【請求項６】
タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く、請求項２の方法。
【請求項７】
スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する、請求項２の方法。
【請求項８】
第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである、請求項７の方法。
【請求項９】
第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる、請求項８の方法。
【請求項１０】
細胞が抗体を分泌する、請求項９の方法。
【請求項１１】
細胞が、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている、請求項８の方法。
【請求項１２】
核酸が、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす、請求項１１の方法。
【請求項１３】
融合タンパク質がシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
実質的な均一状態まで抗体を精製することをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
細胞が糸状菌細胞である、請求項１の方法。
【請求項１９】
細胞が酵母細胞である、請求項１の方法。
【請求項２０】
細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項２１】
タンパク分解切断部位がＫｅｘ２ｐ部位である、請求項１０の方法。
【請求項２２】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する、請求項２１の方法。
【請求項２３】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲを有し、Ｘがｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ及びｔｙｒからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、又はａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ及びｔｈｒからなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する、請求項２４の方法。
【請求項２６】
四量体抗体がエフェクター機能を有する、請求項２の方法。
【請求項２７】
エフェクター機能が、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である、請求項１の方法。
【請求項２９】
抗体が、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される、請求項１の方法。
【請求項３０】
グリコシル化が、少なくとも位置Ａｓｎ２９７に位置する、請求項１の方法。
【請求項３１】
重鎖定常領域が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項１の方法。
【請求項３２】
重鎖定常領域が、ＣＨ４領域をさらに含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３４】
融合タンパク質が、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する、請求項１の方法。
【請求項３５】
Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンが重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如する融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３６】
制御配列に作用可能に連結された請求項３４の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３５の核酸で形質転換された細胞。
【請求項３８】
請求項１の方法によって作製された抗体の分子の複数を含み、前記複数の各々が糖型を有し、並びに主要な糖型が複合型であり、及びフコースを欠如する、抗体組成物。
【請求項３９】
主要なグリカン構造が、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モル％多いレベルで存在する、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
請求項１の方法によって作製されたモノクローナル抗体。
【請求項４１】
ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３又はＴＮＦ−αに特異的に結合する請求項４０のモノクローナル抗体。
【請求項４２】
抗体を作製する方法であり、
シグナル配列と、可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖と、第一及び第二のプロテアーゼ（同一又は別異であり得、何れも、融合タンパク質とは別個の分子である。）によって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することを含み、前記スペーサーペプチドが自己切断可能なタンパク分解部位を含まず；前記融合タンパク質が発現され、前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断されてシグナル配列が除去され、及び前記第一及び第二のプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記第一及び第二のタンパク分解部位において切断され；並びに、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される、前記方法。
【請求項４３】
抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が重鎖である、請求項４２の方法。
【請求項４５】
第一の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が軽鎖である、請求項４２の方法。
【請求項４６】
融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合する、請求項４２の方法。
【請求項４７】
タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く、請求項４２の方法。
【請求項４８】
スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼが融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位がペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する、請求項２の方法。
【請求項４９】
第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである、請求項４８の方法。
【請求項５０】
第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる、請求項４９の方法。
【請求項５１】
細胞が抗体を分泌する、請求項５０の方法。
【請求項５２】
細胞が、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている、請求項４９の方法。
【請求項５３】
核酸が、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす、請求項５２の方法。
【請求項５４】
融合タンパク質がシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む、請求項５２の方法。
【請求項５５】
細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む、請求項５２の方法。
【請求項５６】
実質的な均一状態まで抗体を精製することをさらに含む、請求項５５の方法。
【請求項５７】
医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む、請求項５６の方法。
【請求項５８】
融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む、請求項４２の方法。
【請求項５９】
細胞が糸状菌細胞である、請求項４２の方法。
【請求項６０】
細胞が酵母細胞である、請求項４２の方法。
【請求項６１】
細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される、請求項４２の方法。
【請求項６２】
タンパク分解切断部位がＫｅｘ２ｐ部位である、請求項５１の方法。
【請求項６３】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する、請求項６２の方法。
【請求項６４】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲを有し、Ｘがｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ及びｔｙｒからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、又はａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒからなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項６２の方法。
【請求項６５】
スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する、請求項６４の方法。
【請求項６６】
抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する、請求項６５の方法。
【請求項６７】
四量体抗体がエフェクター機能を有する、請求項４３の方法。
【請求項６８】
エフェクター機能が、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である、請求項４２の方法。
【請求項７０】
抗体が、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される、請求項４２の方法。
【請求項７１】
グリコシル化が、少なくとも位置Ａｓｎ２９７に位置する、請求項４２の方法。
【請求項７２】
重鎖定常領域が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項４２の方法。
【請求項７３】
重鎖定常領域が、ＣＨ４領域をさらに含む、請求項７２の方法。
【請求項７４】
抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む、請求項４２の方法。
【請求項７５】
融合タンパク質が、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する、請求項４２の方法。
【請求項１】
抗体を作製する方法であり、Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された真菌細胞を培養することを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如し、；
前記融合タンパク質が発現され、前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断されてシグナル配列が除去され、及び前記プロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記タンパク分解部位において切断され；並びに、
分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される、前記方法。
【請求項２】
抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である、請求項１の方法。
【請求項３】
第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が重鎖である、請求項２の方法。
【請求項４】
第一の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が軽鎖である、請求項２の方法。
【請求項５】
融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに会合している、請求項２の方法。
【請求項６】
タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く、請求項２の方法。
【請求項７】
スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼは融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位はペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する、請求項２の方法。
【請求項８】
第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである、請求項７の方法。
【請求項９】
第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる、請求項８の方法。
【請求項１０】
細胞が抗体を分泌する、請求項９の方法。
【請求項１１】
細胞が、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている、請求項８の方法。
【請求項１２】
核酸が、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす、請求項１１の方法。
【請求項１３】
融合タンパク質がシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
実質的な均一状態まで抗体を精製することをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
細胞が糸状菌細胞である、請求項１の方法。
【請求項１９】
細胞が酵母細胞である、請求項１の方法。
【請求項２０】
細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項２１】
タンパク分解切断部位がＫｅｘ２ｐ部位である、請求項１０の方法。
【請求項２２】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する、請求項２１の方法。
【請求項２３】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲを有し、Ｘがｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ及びｔｙｒからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、又はａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ及びｔｈｒからなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する、請求項２４の方法。
【請求項２６】
四量体抗体がエフェクター機能を有する、請求項２の方法。
【請求項２７】
エフェクター機能が、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である、請求項１の方法。
【請求項２９】
抗体が、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される、請求項１の方法。
【請求項３０】
グリコシル化が、少なくとも位置Ａｓｎ２９７に位置する、請求項１の方法。
【請求項３１】
重鎖定常領域が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項１の方法。
【請求項３２】
重鎖定常領域が、ＣＨ４領域をさらに含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３４】
融合タンパク質が、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する、請求項１の方法。
【請求項３５】
Ｎ末端からＣ末端への順序で、（ａ）シグナル配列と、（ｂ）可変領域及び定常領域を含む第一の免疫グロブリン鎖と、（ｃ）融合タンパク質とは別個の分子であるプロテアーゼによって切断可能なタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに（ｄ）可変領域及び定常領域を含む第二の免疫グロブリン鎖とを含み；前記第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び前記第二の免疫グロブリンが重鎖であり、又はこの逆であり；前記融合タンパク質が前記スペーサーペプチドと前記第二の免疫グロブリン鎖との間に第二のシグナル配列を含まず；並びに前記スペーサーペプチドが自己プロセッシング切断部位を欠如する融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３６】
制御配列に作用可能に連結された請求項３４の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３５の核酸で形質転換された細胞。
【請求項３８】
請求項１の方法によって作製された抗体の分子の複数を含み、前記複数の各々が糖型を有し、並びに主要な糖型が複合型であり、及びフコースを欠如する、抗体組成物。
【請求項３９】
主要なグリカン構造が、抗体組成物の次に主要なグリカン構造より少なくとも約１０〜２５モル％多いレベルで存在する、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
請求項１の方法によって作製されたモノクローナル抗体。
【請求項４１】
ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３３又はＴＮＦ−αに特異的に結合する請求項４０のモノクローナル抗体。
【請求項４２】
抗体を作製する方法であり、
シグナル配列と、可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖と、第一及び第二のプロテアーゼ（同一又は別異であり得、何れも、融合タンパク質とは別個の分子である。）によって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含むスペーサーペプチドと、並びに可変領域及び定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された細胞を培養することを含み、前記スペーサーペプチドが自己切断可能なタンパク分解部位を含まず；前記融合タンパク質が発現され、前記シグナル配列のＣ末端終末部で切断されてシグナル配列が除去され、及び前記第一及び第二のプロテアーゼによって、前記スペーサーペプチド中の前記第一及び第二のタンパク分解部位において切断され；並びに、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の対を含む抗体が作製される、前記方法。
【請求項４３】
抗体が、分子間会合された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の２つの対を含む四量体抗体である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
第一の免疫グロブリン鎖が軽鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が重鎖である、請求項４２の方法。
【請求項４５】
第一の免疫グロブリン鎖が重鎖であり、及び第二の免疫グロブリン鎖が軽鎖である、請求項４２の方法。
【請求項４６】
融合タンパク質の軽鎖及び重鎖が、分子内結合によって互いに会合しており、並びに融合タンパク質の２つのコピーが、タンパク分解部位での切断が起こる前に、それらの各重鎖定常領域の分子間結合によって互いに結合する、請求項４２の方法。
【請求項４７】
タンパク分解部位における切断後に、分子間会合された重鎖及び軽鎖の対を形成するための免疫グロブリン重鎖と軽鎖の分子間会合と、並びに四量体抗体を形成するための分子間会合された重鎖と軽鎖の２つの対間での分子間会合とが続く、請求項４２の方法。
【請求項４８】
スペーサーペプチドが、第一及び第二のプロテアーゼによって切断可能な第一及び第二のタンパク分解切断部位を含み、両プロテアーゼが融合タンパク質融合タンパク質とは別個の分子であり、第一及び第二のタンパク分解切断部位がペプチドリンカーによって隔てられており、並びに第一及び第二のプロテアーゼによるタンパク分解切断部位の切断が融合タンパク質からペプチドリンカーを除去する、請求項２の方法。
【請求項４９】
第一及び第二のプロテアーゼが同一のプロテアーゼである、請求項４８の方法。
【請求項５０】
第一及び第二のタンパク分解部位の切断が細胞中で起こる、請求項４９の方法。
【請求項５１】
細胞が抗体を分泌する、請求項５０の方法。
【請求項５２】
細胞が、第一及び第二のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼをコードする核酸で形質転換されている、請求項４９の方法。
【請求項５３】
核酸が、プロテアーゼに融合された第二のシグナル配列を含む第二の融合タンパク質をコードし、前記第二のシグナル配列がプロテアーゼの小胞体中への取り込みを引き起こす、請求項５２の方法。
【請求項５４】
融合タンパク質がシグナル配列なしに細胞から分泌され、及び前記方法が、分泌された融合タンパク質を、スペーサーペプチド中のタンパク分解部位を切断するプロテアーゼで処理することをさらに含む、請求項５２の方法。
【請求項５５】
細胞から、又はその中で細胞が培養されている培地から抗体を回収することをさらに含む、請求項５２の方法。
【請求項５６】
実質的な均一状態まで抗体を精製することをさらに含む、請求項５５の方法。
【請求項５７】
医薬組成物中において、抗体を医薬担体と組み合わせることをさらに含む、請求項５６の方法。
【請求項５８】
融合タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入することをさらに含む、請求項４２の方法。
【請求項５９】
細胞が糸状菌細胞である、請求項４２の方法。
【請求項６０】
細胞が酵母細胞である、請求項４２の方法。
【請求項６１】
細胞が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルキューム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）から得られる細胞からなる群から選択される、請求項４２の方法。
【請求項６２】
タンパク分解切断部位がＫｅｘ２ｐ部位である、請求項５１の方法。
【請求項６３】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲ（Ｘは、任意のアミノ酸である。）を有する、請求項６２の方法。
【請求項６４】
タンパク分解切断部位がアミノ酸配列ＸＸＫＲを有し、Ｘがｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｃｙｓ、ｐｈｅ、ｐｒｏ、ｔｒｐ及びｔｙｒからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、又はａｒｇ、ａｓｎ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒからなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項６２の方法。
【請求項６５】
スペーサーペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＫＲを有するＮ末端タンパク分解切断部位及びアミノ酸配列ＲＬＶＫＲを有するＣ末端タンパク分解切断部位を有する、請求項６４の方法。
【請求項６６】
抗体がスペーサーペプチドの全ての残基を欠如する、請求項６５の方法。
【請求項６７】
四量体抗体がエフェクター機能を有する、請求項４３の方法。
【請求項６８】
エフェクター機能が、補体固定又は抗体依存性細胞毒性である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が、ヒト化された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖である、請求項４２の方法。
【請求項７０】
抗体が、少なくとも５０ｍｇ／リットル培地の収量で作製される、請求項４２の方法。
【請求項７１】
グリコシル化が、少なくとも位置Ａｓｎ２９７に位置する、請求項４２の方法。
【請求項７２】
重鎖定常領域が、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項４２の方法。
【請求項７３】
重鎖定常領域が、ＣＨ４領域をさらに含む、請求項７２の方法。
【請求項７４】
抗体を精製すること及び診断キット中に抗体を組み込むことをさらに含む、請求項４２の方法。
【請求項７５】
融合タンパク質が、シグナル配列と第一の免疫グロブリン鎖の間に、又はペプチドスペーサーと第二の免疫グロブリン鎖の間に、宿主タンパク質からのペプチドセグメントを欠如する、請求項４２の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３８９２６（Ｐ２００８−５３８９２６Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０９１５３（Ｐ２００８−５０９１５３）
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６１６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６６５７
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６１６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１６６５７
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ， インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】
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