反復オリゴヌクレオチド合成を使用する分子検出システム
本発明は、画定されたポリヌクレオチド配列上での反復的かつ酵素的なオリゴヌクレオチド合成を介して、複数の検出可能なオリゴヌクレオチドを作製することによって、標的分子の存在を検出するための方法を提供する。該方法は、一般に、ヌクレオシド、モノヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、またはその類似体を使用して、画定されたポリヌクレオチド配列上で標的部位に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド産物の合成を開始すること；場合により、オリゴヌクレオチド鎖エロンゲーターとしてヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用すること；チェーンターミネーターを使用して、重合反応を終止すること；ならびにポリメラーゼによって合成された複数のオリゴヌクレオチド産物を検出することを含む。１つの態様では、本発明は、不稔転写により複数の検出可能なＲＮＡオリゴリボヌクレオチドを作製することによって、標的タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成される、目的のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオシドもしくはヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、２５０を超えるヌクレオチド、ならびにヌクレオチド類似体よりなる群から選択される分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベート工程では、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドにイニシエーターをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、標的部位プローブ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１４】
前記標的部位プローブサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターミネーター、前記イニシエーター、および前記標的部位プローブよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記「ａ」における混合物は、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
標的ポリヌクレオチド中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって、
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾される工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２７】
標的遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｂ）標的部位プローブと前記一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、イニシエーター、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、または前記ターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣｐＧ部位に相補的である工程、
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２８】
前記標的部位プローブのサイズは、約５〜１９；約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
一本鎖標的ＤＮＡ配列の脱アミノ化は前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を重亜硫酸ナトリウムで処理することを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域、および前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
標的ＤＮＡ配列における変異の有無を検出する方法であって：
（ａ）一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに標的部位プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーターならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的変異部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから転写される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項４２】
前記標的部位プローブのサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記変異は、欠失、挿入、置換、染色体再編成、および一塩基多型よりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的変異部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的変異部位を含む一本鎖領域、および前記標的変異部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
標的ＤＮＡポリヌクレオチドにおける変異を検出する方法であって：
（ａ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドに前記捕捉プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項５５】
試験サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドと、
該一本鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項５６】
試験サンプル中の病原体の存在を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼおよびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の存在を決定する工程、を含む方法。
【請求項５７】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することをさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記一本鎖標的ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡのうちの１つである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記イニシエーターはＲＮＡのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２５〜５０ヌクレオチド、５０〜７５ヌクレオチド、７５〜１００ヌクレオチド、１００〜１２５ヌクレオチド、および１２５〜１５０ヌクレオチド、１５０〜１７５ヌクレオチド、１７５〜２００ヌクレオチド、２００〜２２５ヌクレオチド、ならびに２２５〜２５０ヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖バブルを形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記バブル領域のある領域が、前記ポリメラーゼによる転写によって検出され得る、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項７０】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的病原体ポリヌクレオチドの末端にハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
試験サンプル中の病原体を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記試験サンプル中の一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｅ）ＡＰＣの前記転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７２】
試験サンプル中のｍＲＮＡ発現を検出する方法であって：
（ａ）標的ｍＲＮＡ配列と、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ｍＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、ｍＲＮＡの有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７３】
（ａ）捕捉プローブを固定化する固定であって、前記プローブが標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする、工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと、前記標的ｍＲＮＡ配列を含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；および
（ｃ）補足された標的ｍＲＮＡ配列を洗浄して、前記試験サンプルの非ハイブリダイズ成分を除去する工程、をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
修飾は、前記イニシエーター、前記ターミネーター、および前記ヌクレオチドの少なくとも１つに、独立に選択される標識部分を取り込む工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および修飾されたポリメラーゼ、ならびにプライマーゼのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つに由来するＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記イニシエーターはＲＮＡまたはＤＮＡのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的部位を含む一本鎖バブル領域を形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的ｍＲＮＡ配列のｐｏｌｙ−Ａ ｔａｉｌにハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８４】
前記チェーンターミネーターは、ヌクレオチド欠損およびヌクレオチド類似体のうちの１つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８５】
標的ＤＮＡ配列から合成されるオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）ＤＮＡプライマーと一本鎖標的ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド配列を反復的に合成するように、前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドによって前記ＤＮＡプライマーを伸長させる工程；および
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼによって合成される反復配列からなるオリゴヌクレオチドを検出する工程、を含む方法。
【請求項８６】
前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つを修飾して、反復配列からなる前記オリゴヌクレオチドの検出を可能にすることをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
修飾は、独立して選択される標識部分を、前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つに取り込むことをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、末端基転移酵素およびテロメラーゼよりなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＤＮＡプライマーは１〜約２５ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記オリゴヌクレオチド反復配列は約２〜約２６ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記検出は、反復配列を含む合成されるオリゴヌクレオチドに相補的な配列をハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記相補的配列は、独立して選択される標識部分を含むように修飾される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を固定化することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
固定化は、前記一本鎖標的ＤＮＡ配列の一部に、捕捉プローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項９９】
マイクロアレイを製造する方法であって：
（ａ）請求項１に記載の方法によって標的ＤＮＡ配列から複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を合成する工程；および
（ｂ）前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を固相担体に結合させて、前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製のマイクロアレイを製造する工程、を含む方法。
【請求項１００】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項４、１７、３１、４５、７５、８８、または９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出するための方法であって、
（ａ）イニシエーターおよびＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０２】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）イニシエーター、ＲＮＡポリメラーゼ、および標的部位プローブを含む混合物中で一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブと前記標的ポリヌクレオチドとがハイブリダイズし、標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０３】
標的遺伝子付近のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーター、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼおよび標的部位プローブを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートすること；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０４】
（ａ）標的遺伝子に関連するＣｐＧアイランド付近の配列に特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化する工程；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的ＤＮＡ配列を潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせる工程、をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標的部位プローブは癌特異的遺伝子に特異的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項１０６】
試験サンプル中の標的タンパク質を検出する方法であって：
（ａ）標的タンパク質を、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）に、反応性ＡＰＣリンカーにより共有結合させる工程であって、前記ＡＰＣは、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含むこと；
（ｂ）前記標的タンパク質を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、標的タンパク質の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１０７】
標的特異的プローブによって標的タンパク質を固定化することをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的特異的プローブは抗体である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＡＰＣリンカーは、チオール反応性またはアミン反応性タンパク質架橋剤の修飾によって、標的タンパク質に共有結合される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記タンパク質架橋剤は、マレアミド、ヨードアセトアミド、およびジスルフィドよりなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的タンパク質は精製されているか、または細胞溶解産物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）内にある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
癌を検出する方法であって：
（ａ）癌の検出が必要な患者からサンプルを入手する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基は改変しない条件下でＤＮＡを脱アミノ化する工程；
（ｃ）標的ポリヌクレオチドに対してイニシエーターをハイブリダイズさせる工程であって、前記イニシエーターはモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド（ｂｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、オリゴヌクレオチドまたはそれらの類似体である工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーターおよびＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、ここで、前記イニシエーター、ターミネーターのいずれか１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程；および、結果を、コントロールサンプルから同様に得られる結果と比較する工程、を含む方法。
【請求項１１３】
病原体を検出する方法であって：
（ａ）病原体の検出が必要なサンプルを入手する工程；
（ｂ）前記サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１１４】
（ａ）前記標的病原体ポリヌクレオチドに特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的病原体ポリヌクレオチドを潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせること、をさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを合成する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成すること、を含む方法。
【請求項１１６】
前記ターミネーターおよび前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、オリゴヌクレオチドを合成することをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチドおよび約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記インキュベートでは、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２６】
前記インキュベートは、リボヌクレオチドの存在をさらに含む、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４、５５、５６、７１、７２、１０１、１０２、１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リボヌクレオチドは修飾される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記修飾は独立して選択される標識部分を取り込むことをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記サンプルは、動物、植物またはヒトの組織、血液、唾液、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄由来の液、粘膜分泌物、動物固体、糞、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、空気および水よりなる群から入手される、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１３１】
前記不稔プロモーターカセットは、バブル領域を形成する２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でバブル領域を形成する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写バブルを形成し得る１つの連続的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体よりなる群から選択される、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４〜５６、７１、７２、８５、１０１〜１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
脱アミノ化に先立って、一本鎖標的ＤＮＡ配列を標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程をさらに含む、請求項２６、２７、１０３または１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
標的ポリヌクレオチド中のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法であって、
（ａ）一本鎖標的ＤＮＡ配列を、標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｃ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１３８】
複数の標的部位プローブを使用することをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
目的のサンプル中のＣＧメチル化を決定する方法であって、
複数のＣＧ部位におけるメチル化の程度を決定するための、単一のサンプルに対する複数の標的特異的プローブと、特定のＣＧ部位でのメチル化の程度を決定するための個々の標的特異的プローブとを使用することを含む、方法。
【請求項１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成される、目的のポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオシドもしくはヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、２５０を超えるヌクレオチド、ならびにヌクレオチド類似体よりなる群から選択される分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベート工程では、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドにイニシエーターをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、標的部位プローブ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；ならびに
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１４】
前記標的部位プローブサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターミネーター、前記イニシエーター、および前記標的部位プローブよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記「ａ」における混合物は、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
標的ポリヌクレオチド中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって、
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾される工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２７】
標的遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｂ）標的部位プローブと前記一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、イニシエーター、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、または前記ターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣｐＧ部位に相補的である工程、
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターは、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項２８】
前記標的部位プローブのサイズは、約５〜１９；約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記イニシエーターはＲＮＡプライマーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
一本鎖標的ＤＮＡ配列の脱アミノ化は前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を重亜硫酸ナトリウムで処理することを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域、および前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
標的ＤＮＡ配列における変異の有無を検出する方法であって：
（ａ）一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドに標的部位プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよび標的部位プローブを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーターならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的変異部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから転写される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項４２】
前記標的部位プローブのサイズは、約２０〜約５０ヌクレオチド、約５１〜約７５ヌクレオチド、約７６〜約１００ヌクレオチドおよび１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記変異は、欠失、挿入、置換、染色体再編成、および一塩基多型よりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的変異部位の上流の第１の二本鎖領域、前記標的変異部位を含む一本鎖領域、および前記標的変異部位の下流の第２の二本鎖領域を含むバブル複合体を形成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
標的ＤＮＡポリヌクレオチドにおける変異を検出する方法であって：
（ａ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドに前記捕捉プローブをハイブリダイズさせる工程であって、前記ＤＮＡポリヌクレオチドが正常または野生型遺伝子に対する変異を含有しうる、工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドから、標的部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドから前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、変異の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項５５】
試験サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法であって：
（ａ）一本鎖標的ポリヌクレオチドと、
該一本鎖標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項５６】
試験サンプル中の病原体の存在を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼおよびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の存在を決定する工程、を含む方法。
【請求項５７】
前記ターミネーター、および前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することをさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含み、該部分は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出または定量される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項６６】
前記一本鎖標的ポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡのうちの１つである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記イニシエーターはＲＮＡのうちの１つである、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２５〜５０ヌクレオチド、５０〜７５ヌクレオチド、７５〜１００ヌクレオチド、１００〜１２５ヌクレオチド、および１２５〜１５０ヌクレオチド、１５０〜１７５ヌクレオチド、１７５〜２００ヌクレオチド、２００〜２２５ヌクレオチド、ならびに２２５〜２５０ヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖バブルを形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記バブル領域のある領域が、前記ポリメラーゼによる転写によって検出され得る、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項７０】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的病原体ポリヌクレオチドの末端にハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
試験サンプル中の病原体を検出する方法であって：
（ａ）前記試験サンプル中の標的ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを固定化する工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと前記標的ＤＮＡポリヌクレオチドを含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記試験サンプル中の一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記標的ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｅ）ＡＰＣの前記転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７２】
試験サンプル中のｍＲＮＡ発現を検出する方法であって：
（ａ）標的ｍＲＮＡ配列と、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ｍＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される、前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、ｍＲＮＡの有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項７３】
（ａ）捕捉プローブを固定化する固定であって、前記プローブが標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする、工程；
（ｂ）前記捕捉プローブと、前記標的ｍＲＮＡ配列を含有する可能性のある試験サンプルとをハイブリダイズさせる工程；および
（ｃ）補足された標的ｍＲＮＡ配列を洗浄して、前記試験サンプルの非ハイブリダイズ成分を除去する工程、をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
修飾は、前記イニシエーター、前記ターミネーター、および前記ヌクレオチドの少なくとも１つに、独立に選択される標識部分を取り込む工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および修飾されたポリメラーゼ、ならびにプライマーゼのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つに由来するＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記イニシエーターはＲＮＡまたはＤＮＡのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチド、および約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、ならびに１００を超えるヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的部位を含む一本鎖バブル領域を形成する自己相補的オリゴヌクレオチドを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
前記不稔プロモーターカセットは、前記標的ｍＲＮＡ配列のｐｏｌｙ−Ａ ｔａｉｌにハイブリダイズするように適応されるＡＰＣリンカーを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８４】
前記チェーンターミネーターは、ヌクレオチド欠損およびヌクレオチド類似体のうちの１つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項８５】
標的ＤＮＡ配列から合成されるオリゴヌクレオチドを検出する方法であって：
（ａ）ＤＮＡプライマーと一本鎖標的ＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド配列を反復的に合成するように、前記ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドによって前記ＤＮＡプライマーを伸長させる工程；および
（ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼによって合成される反復配列からなるオリゴヌクレオチドを検出する工程、を含む方法。
【請求項８６】
前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つを修飾して、反復配列からなる前記オリゴヌクレオチドの検出を可能にすることをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
修飾は、独立して選択される標識部分を、前記ＤＮＡプライマーおよび前記ヌクレオチドの少なくとも１つに取り込むことをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
検出は、蛍光共鳴エネルギー移動によって検出することを含み、前記蛍光体部分は蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターのうちの１つを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、末端基転移酵素およびテロメラーゼよりなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＤＮＡプライマーは１〜約２５ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記オリゴヌクレオチド反復配列は約２〜約２６ヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記検出は、反復配列を含む合成されるオリゴヌクレオチドに相補的な配列をハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記相補的配列は、独立して選択される標識部分を含むように修飾される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記一本鎖標的ＤＮＡ配列を固定化することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
固定化は、前記一本鎖標的ＤＮＡ配列の一部に、捕捉プローブをハイブリダイズさせることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列は、前記標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項９９】
マイクロアレイを製造する方法であって：
（ａ）請求項１に記載の方法によって標的ＤＮＡ配列から複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を合成する工程；および
（ｂ）前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製を固相担体に結合させて、前記複数の不稔オリゴヌクレオチド複製のマイクロアレイを製造する工程、を含む方法。
【請求項１００】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項４、１７、３１、４５、７５、８８、または９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出するための方法であって、
（ａ）イニシエーターおよびＲＮＡポリメラーゼを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターはヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０２】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）イニシエーター、ＲＮＡポリメラーゼ、および標的部位プローブを含む混合物中で一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブと前記標的ポリヌクレオチドとがハイブリダイズし、標的部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的部位を含む一本鎖領域と、前記標的部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチドを合成する工程；および
（ｃ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０３】
標的遺伝子付近のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出する方法であって：
（ａ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件で、一本鎖標的ＤＮＡ配列を脱アミノ化する工程；
（ｂ）イニシエーター、ターミネーター、ＲＮＡポリメラーゼおよび標的部位プローブを含む混合物中で、一本鎖標的ポリヌクレオチドをインキュベートすること；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターがヌクレオチド欠損により終止するまで伸長され、それによって、複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチドを検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１０４】
（ａ）標的遺伝子に関連するＣｐＧアイランド付近の配列に特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化する工程；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的ＤＮＡ配列を潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせる工程、をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標的部位プローブは癌特異的遺伝子に特異的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項１０６】
試験サンプル中の標的タンパク質を検出する方法であって：
（ａ）標的タンパク質を、不稔プロモーターカセット（ＡＰＣ）に、反応性ＡＰＣリンカーにより共有結合させる工程であって、前記ＡＰＣは、ポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含むこと；
（ｂ）前記標的タンパク質を、ＲＮＡポリメラーゼ、イニシエーター、およびターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）ＡＰＣの転写開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｄ）前記試験サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、標的タンパク質の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１０７】
標的特異的プローブによって標的タンパク質を固定化することをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的特異的プローブは抗体である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＡＰＣリンカーは、チオール反応性またはアミン反応性タンパク質架橋剤の修飾によって、標的タンパク質に共有結合される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記タンパク質架橋剤は、マレアミド、ヨードアセトアミド、およびジスルフィドよりなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的タンパク質は精製されているか、または細胞溶解産物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）内にある、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
癌を検出する方法であって：
（ａ）癌の検出が必要な患者からサンプルを入手する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基は改変しない条件下でＤＮＡを脱アミノ化する工程；
（ｃ）標的ポリヌクレオチドに対してイニシエーターをハイブリダイズさせる工程であって、前記イニシエーターはモノヌクレオシド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド（ｂｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、オリゴヌクレオチドまたはそれらの類似体である工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーターおよびＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、ここで、前記イニシエーター、ターミネーターのいずれか１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程；および、結果を、コントロールサンプルから同様に得られる結果と比較する工程、を含む方法。
【請求項１１３】
病原体を検出する方法であって：
（ａ）病原体の検出が必要なサンプルを入手する工程；
（ｂ）前記サンプル中の一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドと、
一本鎖標的病原体ポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列およびポリメラーゼによる転写によって検出され得る領域を含む不稔プロモーターカセットと、をハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｄ）ＡＰＣの開始部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の不稔反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｅ）前記サンプルから合成される前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量することによって、病原体の有無を決定する工程、を含む方法。
【請求項１１４】
（ａ）前記標的病原体ポリヌクレオチドに特異的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを固定化すること；および
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド補足プローブと、前記標的病原体ポリヌクレオチドを潜在的に含有する変性ＤＮＡサンプルとをハイブリダイズさせること、をさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドから、複数の反復されたオリゴヌクレオチドを合成する方法であって：
（ａ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドおよびイニシエーターを、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにターミネーターと共にインキュベートする工程；
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドから、複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチドに取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチドを合成すること、を含む方法。
【請求項１１６】
前記ターミネーターおよび前記イニシエーターよりなる群から選択されるメンバーの少なくとも１つにおけるヌクレオチドを修飾することによって、オリゴヌクレオチドを合成することをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記修飾は標識部分を取り込むことを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記蛍光体部分は、蛍光エネルギードナーおよび蛍光エネルギーアクセプターを含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび修飾されたＲＮＡポリメラーゼ、ならびにプライマーゼよりなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリメラーゼは、大腸菌、大腸菌バクテリオファージＴ７、大腸菌バクテリオファージＴ３、およびネズミチフス菌バクテリオファージＳＰ６のうちの１つから誘導されるＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記イニシエーターは、１〜２５ヌクレオチド、２６〜５０ヌクレオチド、５１〜７５ヌクレオチド、７６〜１００ヌクレオチド、１０１〜１２５ヌクレオチド、および１２６〜１５０ヌクレオチド、１５１〜１７５ヌクレオチド、１７６〜２００ヌクレオチド、２０１〜２２５ヌクレオチド、２２６〜２５０ヌクレオチド、ならびに２５０を超えるヌクレオチドよりなる群から選択されるヌクレオチドを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２３】
合成される前記不稔オリゴヌクレオチドの長さは、約２〜約２６ヌクレオチド、約２６〜約５０ヌクレオチドおよび約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドよりなる群から選択される長さのうちの１つである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記インキュベートでは、前記一本鎖標的ポリヌクレオチド上の領域に特異的な標的部位プローブをさらに含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２５】
前記チェーンターミネーターはヌクレオチド類似体を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２６】
前記インキュベートは、リボヌクレオチドの存在をさらに含む、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４、５５、５６、７１、７２、１０１、１０２、１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リボヌクレオチドは修飾される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記修飾は独立して選択される標識部分を取り込むことをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記標識部分は蛍光体部分を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記サンプルは、動物、植物またはヒトの組織、血液、唾液、精液、尿、血清、脳脊髄液または髄液、胸膜液、リンパ、痰、乳管洗浄由来の液、粘膜分泌物、動物固体、糞、微生物の培養物、液体および固体の食物ならびに食品、廃棄物、化粧品、空気および水よりなる群から入手される、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１３１】
前記不稔プロモーターカセットは、バブル領域を形成する２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でバブル領域を形成する２つの相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記不稔プロモーターカセットは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写バブルを形成し得る１つの連続的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５、５６、７１、７２、１０６、または１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記蛍光体部分は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニルフェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アミノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリン、および誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）、シアニン色素；シアノシン；４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイト・グリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ）イソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン・ブチレート、スクシンイミジル１ピレン；ブチレート・クォンタム・ドット；リアクティブ・レッド４；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢ、塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサス・レッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；ラ・ホーヤ・ブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；およびナフタロシアニンよりなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記イニシエーターは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体よりなる群から選択される、請求項１、１３、２６、２７、４１、５４〜５６、７１、７２、８５、１０１〜１０３、１０６、１１２、１１３、または１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
脱アミノ化に先立って、一本鎖標的ＤＮＡ配列を標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程をさらに含む、請求項２６、２７、１０３または１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
標的ポリヌクレオチド中のＣＧ部位におけるメチル化シトシン残基を検出するための方法であって、
（ａ）一本鎖標的ＤＮＡ配列を、標的部位プローブと共にインキュベートする工程であって、前記標的部位プローブおよび前記標的ＤＮＡ配列が、前記標的ＣｐＧ部位の上流の第１の二本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位を含む一本鎖領域と、前記標的ＣｐＧ部位の下流の第２の二本鎖領域とを含むバブル複合体を形成する工程；
（ｂ）非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するが、メチル化シトシン残基はウラシルに変換しない条件下で、一本鎖標的ＤＮＡポリヌクレオチドを脱アミノ化する工程；
（ｃ）イニシエーターと一本鎖標的ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記脱アミノ化標的ポリヌクレオチドおよび前記イニシエーターを、ターミネーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする工程であって、前記イニシエーター、またはターミネーターのうちの少なくとも１つは、ＣＧ部位の検出を可能にするように修飾されている工程；
（ｅ）前記標的ポリヌクレオチドから、前記ＣＧ部位に相補的であるオリゴヌクレオチド転写物を合成する工程であって、前記イニシエーターが、前記ターミネーターが前記オリゴヌクレオチド転写物に取り込まれるまで伸長され、それによって複数の反復オリゴヌクレオチド転写物を合成する工程；および
（ｆ）前記反復的に合成されるオリゴヌクレオチド転写物を検出または定量する工程、を含む方法。
【請求項１３８】
複数の標的部位プローブを使用することをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
目的のサンプル中のＣＧメチル化を決定する方法であって、
複数のＣＧ部位におけるメチル化の程度を決定するための、単一のサンプルに対する複数の標的特異的プローブと、特定のＣＧ部位でのメチル化の程度を決定するための個々の標的特異的プローブとを使用することを含む、方法。
【図４】
【図７】
【図３０】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３１】
【図３２】
【図３３ａ】
【図３３ｂ】
【図３３ｃ】
【図３４ａ】
【図３４ｂ】
【図３５】
【図３６】
【図３７ａ】
【図３７ｂ】
【図７】
【図３０】
【図１】
【図２】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図２９Ｃ】
【図３１】
【図３２】
【図３３ａ】
【図３３ｂ】
【図３３ｃ】
【図３４ａ】
【図３４ｂ】
【図３５】
【図３６】
【図３７ａ】
【図３７ｂ】
【公表番号】特表２００６−５０７７９２（Ｐ２００６−５０７７９２Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５４０３０７（Ｐ２００３−５４０３０７）
【出願日】平成１４年１０月２９日（２００２．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３４４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０３８０４２
【国際公開日】平成１５年５月８日（２００３．５．８）
【出願人】（５０４１６４５３８）リボメド バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１０月２９日（２００２．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３４４１９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０３８０４２
【国際公開日】平成１５年５月８日（２００３．５．８）
【出願人】（５０４１６４５３８）リボメド バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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