本発明は、そのいくつかの実施形態において、一般には材料科学に関連し、より具体的には、安定タンパク質１（ＳＰ１）の配列変化体に関連し、また、カーボンナノチューブの結合、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体に基づく複合ポリマーおよび複合ポリマー材料（例えば、布地など）の製造のためのその使用、ならびに、それらの使用、タイヤにおける導電性を高めるためのそれらの使用に関連する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、一般には材料科学に関連し、より具体的には、安定タンパク質１（ＳＰ１）の配列変化体、その使用、およびこれらのＳＰ１変化体に基づく新規で改良された複合材料に関連する。
【背景技術】
【０００２】
安定タンパク質１（ＳＰ１）は、中央に空洞を有するリング形状ドデカマー粒子を形成する、ヨーロッパヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ ａｓｐｅｎ）植物から単離されるホモオリゴマータンパク質である。ＳＰ１のオリゴマー形態は、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、Ｖ８およびプロテイナーゼＫなど）、高温、有機溶媒および高レベルのイオン性界面活性剤に対して抵抗性である並外れて安定な構造である。
【０００３】
国際公開ＷＯ２００２／０７０６４７、同ＷＯ２００４／０２２６９７、米国特許出願公開第２００３００９２６２４号、同第２００５００７４７６３号および同第２００６０１７２２９８号ならびに米国特許第７２５３３４１号は、シャペロン様活性を有する新規な、変性剤に安定な、プロテアーゼ抵抗性の、ホモオリゴマーの安定タンパク質（ＳＰ）変化体、ならびに、これらの新規なＳＰの製造方法および精製方法を教示する。これらの文書はまた、各種ＳＰをコードする核酸、各種ＳＰをコードする核酸を単離する方法、各種ＳＰを認識する抗体、また、巨大分子（例えば、タンパク質など）の安定化、リフォールディング、修復、凝集防止および解凝集のためのこれらのＳＰの使用、各種ＳＰを含む融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸構築物、ならびに、様々な方法および適用におけるそれらの使用を提供する。
【０００４】
国際公開ＷＯ２００７／００７３２５［ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００７９５］は、様々な物質との可逆的および共有結合性の分子会合を形成することができるＳＰ１および改変されたＳＰ１変化体ポリペプチド、それらを含む組成物、ならびに、それらの様々な使用を教示する。
【０００５】
複合材料の製造におけるタンパク質の使用は、例えば、ナノバイオテクノロジーおよびナノ工学ならびに生体材料応用の分野では注目が増している。しかしながら、タンパク質構造およびタンパク質機能の天然に存在する多様性には感嘆させられる一方で、生体材料の二次加工が、天然タンパク質プールの入手性、非柔軟性、低い安定性および非特異的な結合によって本質的に制限される。
【０００６】
タンパク質が界面に集まる。これは、実用的利点および欠点の両方であり得る性質である。ほとんどのタンパク質が大きい両親媒性分子であり、固有的に表面活性であるが、表面とのそれらの相互作用は推測することが困難である。タンパク質の吸着・脱着挙動を支配するパラメーターの予測および決定は、分子間力（例えば、クーロン力、ファンデルワールス力、ルイス酸・塩基の力、エントロピーに基づく影響（例えば、疎水性相互作用、立体配座エントロピーなど）および制限された運動性など）と、タンパク質の立体配座に影響を及ぼすタンパク質分子内の分子内力とが互いに影響し合うことによって複雑である。
【０００７】
操作されたタンパク質は、ある程度の合成的柔軟性を、特異的な結合ドメインを提供することによって可能にし得る。しかしながら、ただ１種類だけのペプチド機能的ドメインの挙動はそこそこの精度で予測され得る一方で、多数のドメインを含む操作されたタンパク質の挙動を予測することは、より高次の組織化、増大したサイズおよび複雑なトポロジーのためにはるかにより困難である。同様に、ファージディスプレーなどの技術は、無機分子と結合する多くの有用なペプチドを提供しているが、結合特異性および標的認識を支配する機構は十分には理解されていない。
【０００８】
カーボンナノチューブ強化複合材料
カーボンナノチューブはグラファイト炭素原子のナノスケールの中空円筒物である。カーボンナノチューブは、どの知られている材料の中でも最大のヤング率（剛性）、最大の熱伝導性、最大の電気伝導性および最大の電流密度をもたらし、一方で、低い密度を有する。カーボンナノチューブは、２つの形態で、すなわち、単層カーボンナノチューブおよび多層カーボンナノチューブとして入手できる。単層カーボンナノチューブは、より強い、より柔軟な、より透明な、かつ、より良好な電気導体である傾向があり、また、より透明であるが、大きい製造コストのために、多層カーボンナノチューブが複合材料においてより広範囲に使用される。
【０００９】
カーボンナノチューブがマトリックス材料に加えられるとき、複合材は、混合則のためにカーボンナノチューブの特性のいくつかを帯びることになる。しかしながら、カーボンナノチューブ複合材の理論的特性値は現時点では、完全に一体化した複合材を効率よく製造することができないために達成されない。
【００１０】
ナノチューブおよびマトリックス材料の境界を挟んだ不十分な接合のために、カーボンナノチューブが広範囲の様々な用途において使用され得る前には、マトリックスへのカーボンナノチューブの配置、配向、固定、グラフト化および結合を操作するための方法が現在、必要であり、特に、そのような固定、グラフト化および結合が、金属を用いることなく行われる場合には必要である。
【００１１】
したがって、非常に特異的な複合材料（例えば、カーボンナノチューブが一体化されたポリマーおよびポリマー布地など）の効果的な製造のために有用なカーボンナノチューブとの分子複合体を形成し得るＳＰ１変化体が必要であることが広く認識されており、また、そのようなＳＰ１変化体を有することは非常に好都合であると考えられる。
【００１２】
タイヤ：ゴムは、その引張り強さおよび耐摩耗性を改善するためにカーボンブラックと共に一般に配合される。タイヤトレッドのゴム組成物は多くの場合、タイヤの転がり抵抗および走行性能（例えば、湿潤時特性）を改善するために、カーボンブラックに代わる強化剤としてのシリカと共に配合される。しかしながら、シリカ配合タイヤでは、配合ゴムの不良な導電性のために、車輌に帯電した静電気が、問題となる制御不良な放電現象を生じさせ、その結果、ラジオ雑音、電子回路部品への悪影響、短絡生成などを生じさせる。
【００１３】
ゴムタイヤおよびタイヤトレッドの不良の導電性はまた、とりわけ使用期間中におけるタイヤの物理的特性および機能のパラメーターに関する詳細なリアルタイム情報を得ようとすることに対する障害でもある。熱伝導性は、タイヤ性能および安全性に対する非常に重要なパラメーターであり、これもまた、タイヤ製造において一般に使用される伝導性不良なゴム配合物およびフィラーによって制限される。
【００１４】
タイヤの電気伝導性および熱伝導性を高める方法が提案されている。米国特許出願公開第２０１００７８１０３号（Ｎａｋａｍｕｒａ）は、蓄積した静電気を道路表面に放電するための連続する導電性経路をもたらすように形成される導電性ゴム材料からのタイヤ・カーカス・プライを含む空気タイヤを開示する。カーボンブラック強化ゴムが導電性ゴム材料として想定される。
【００１５】
米国特許第７５２８１８６号（Ｈａｌａｓａ他）は、カーボンブラックおよびイオン伝導性化合物（例えば、テトラクロロアルミン酸塩；テトラフルオロホウ酸塩；チオシアン酸塩；チオサリチル酸塩、ホスホニウム、イミダゾリウム、ピロリジニウムおよびピリジニウムなど）を取り込む導電性ゴム材料から得られるタイヤトレッドを含む、導電性が強化された空気タイヤを開示する。
【００１６】
米国特許第７３３７８１５号（Ｓｐａｄｏｎｅ）は、使用期間中の熱伝導性および道路への熱移動を改善するために、様々なカーボンブラック含有量のゴム配合物から作られるトレッドを有する空気タイヤを開示する。
【００１７】
米国特許第７３１８４６４号（Ｈａｈｎ他）は、例えば、タイヤの状況に関する情報を伝えるために、タイヤ空洞の内側表面に接着剤接合される電気伝導性要素（例えば、ワイヤなど）を有する空気タイヤを開示する。
【００１８】
米国特許第７２８４５８３号（Ｄｈｅｕｒ他）は、タイヤマウントから道路接触面への最小電気抵抗の経路を提供するために、炭素繊維、金属フィラメントまたはそれらの組合せから作られ、ビードからトレッドにまで及ぶ電気伝導性コードを含む空気タイヤを開示する。
【００１９】
米国特許第７１３１４７４号（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ）は、タイヤからトレッド全体にわたって道路までへの電気伝導性経路を提供するカーボンブラック高含有トレッド域を有する空気タイヤを開示する。
【００２０】
米国特許第７５８１４３９号（Ｒｅｎｓｅｌ他）は、タイヤの状態および性能に関する情報を含有する無線シグナルを収集および送信するための、導電性ポリマーから作製され得るミクロスケールのセンサーまたはセンサー層を取り込む空気タイヤを開示する。
【００２１】
米国特許出願公開第２００７００２８９５８号（Ｒｅｔｔｉ）は、導電性ストリップ（例えば、導電性ポリマー）およびエネルギー発生成分（例えば、ピエゾセラミックまたは集熱材料など）がタイヤのトレッドおよび／またはサイドウォールに組み込まれる電気エネルギー発生タイヤを開示する。
【００２２】
米国特許出願公開第２００９０３１４４０４号（Ｒｏｄｇｅｒｓ他）は、タイヤの性能特性（例えば、転がり抵抗）を改変することができる少なくとも１つの活性な材料要素を有するタイヤを開示する。活性な材料が、作動化シグナルに応答して、剛性、弾性率、形状および／または大きさを変えることができる組成物として定義され、例えば、タイヤ構造様式において埋め込むために好適な形状記憶合金、電気活性ポリマー、ピエゾ電気材料、エレクトロレオロジーエラストマーなどである。
【００２３】
米国特許出願公開第２００６００６１０１１号（Ｋｉｋｕｃｈｉ他）は、強化された熱伝導性およびタイヤからの強化された熱消散のために、配向カーボンナノチューブを組み込む複合材料から作られる空気タイヤまたはソリッドタイヤを開示する。
【００２４】
しかしながら、強化された伝導性を有する要素（例えば、カーボンナノチューブなど）を組み込むそのような複合材料の製造方法およびタイヤ製造における使用は、本明細書中上記で述べられる欠点（マトリックスへのカーボンナノチューブの一体化、配置、配向、固定、グラフト化および結合における困難さ）に悩まされる。したがって、タイヤの電気伝導性および熱伝導性を高めるために、一体化されたカーボンナノチューブを含む改善された複合ポリマーおよび複合ポリマー布地を有することは好都合であると考えられる。
【発明の概要】
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＳＰ１ポリペプチドと、ＳＰ１ポリペプチドのＮ末端におけるカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号１に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチドが提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号１０〜配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブまたはグラファイト表面に非共有結合的に結合する示されるようなキメラポリペプチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態によれば、キメラポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示される通りであり得る。いくつかの実施形態によれば、キメラポリペプチドは、配列番号８に示される通りである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を形成するために、ポリマー、布地またはポリマー布地に結合する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む組成物であって、前記ＳＰ１ポリペプチドが、示されるようなキメラＳＰ１ポリペプチドである組成物が提供される。いくつかの実施形態によれば、キメラポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示される通りである。いくつかの実施形態によれば、組成物のキメラポリペプチドは、配列番号８に示される通りである。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブ−ＳＰ１ポリペプチド複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、ＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体化アラミド繊維を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブ−ＳＰ１ポリペプチド複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化アラミドの織布または不織布を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号８に示される通りである。いくつかの実施形態によれば、組成物はさらに、ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質は、配列番号８６に示される通りである。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、組成物はさらに、エラストマー物質を含む。いくつかの実施形態によれば、エラストマー物質はゴムである。
【００３５】
本発明のいくつかの局面によれば、示された組成物を含む成分を有する空気タイヤまたはセミ空気タイヤが提供される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記成分は、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地とともに形成される複合エラストマー物質である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、カーボンナノチューブ−ＳＰ１複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を有しないタイヤと比較した場合、改善された熱伝導性および電気伝導性を与える。
【００３８】
本発明のいくつかの局面によれば、本明細書中上記で示されるようなタイヤを有する車輌を高速化するための方法であって、電流を、少なくとも１つの、ＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地に与えて、その結果、タイヤの温度を所望される温度に変化させるようにすること、および、車輌を高速化することを含む方法が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの局面によれば、結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む布地基体材料を含む電気伝導性布地であって、電気伝導性布地の導電率が、前記結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を有しない布地基体材料の導電率よりも大きく、前記ＳＰ１ポリペプチドが、本明細書中上記で示されるようなキメラＳＰ１ポリペプチドである電気伝導性布地が提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、上記布地は、綿、ウール、絹、ナイロン、ポリエステル、アラミド、ポリプロピレンおよびエラステインからなる群から選択される織布または不織布である。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、電気伝導性のポリマー、布地またはポリマー布地を製造するための方法であって、布地基体材料を提供すること；ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物を調製すること、および、布地基体材料をＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物により処理すること、および、布地基体材料を洗浄して、導電性ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物の過剰量を除くこと、それにより、ポリマー、ポリマー布地または布地基体材料に導電性を与えることを含み、ＳＰ１ポリペプチドが、本明細書中上記で示されるようなキメラＳＰ１ポリペプチドである方法が提供される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＳＰ１ポリペプチドと、ＳＰ１ポリペプチドのＮ末端におけるカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドとを含むキメラポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号１に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。同様に提供されるものが、単離されたポリヌクレオチドを、その組換え発現を行わせるために少なくとも１つのプロモーターに転写的に連結されて含む核酸構築物である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、所与の物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチドを含むＳＰ１ドデカマーを含む組成物であって、改変アミノ酸配列が、ＳＰ１ドデカマーの中央の空洞領域に対応するＳＰ１ポリペプチドの領域に位置し、物質の結合がカオトロピック剤の存在下で高まり、組成物がさらに、カオトロピック剤を含み、かつ、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、
かつ、カオトロピック剤がグアニジニウム塩酸塩であるとき、改変アミノ酸配列はＮｉ結合Ｈｉｓタグを含まない、組成物が提供される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチドおよびセルロース結合性ドメインペプチドからなる群から選択される異種ペプチドを含むために改変される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号１０〜配列番号１３からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ケイ素結合性ペプチドは、配列番号５および配列番号１９からなる群から選択される。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチドはＮ末端欠失を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、カオトロピック剤は、グアニジニウム塩酸塩、尿素および過塩素酸リチウムからなる群から選択される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１４〜配列番号１８ならびに配列番号８６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＳＰ１ポリペプチドと、ＳＰ１ポリペプチドのＮ末端における配列番号５に示されるような異種のケイ素結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチドが提供される。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたキメラポリペプチドは、配列番号３または配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、所与の物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも第１および少なくとも第２の非同一ＳＰ１ポリペプチドモノマーを含むヘテロマー組成物であって、第１および第２のＳＰ１モノマーの改変アミノ酸配列が互いに非同一であり、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、非同一モノマーがそれらの無機物質結合配列において異なる、ヘテロマー組成物が提供される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチド、ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質およびシステイン置換体からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１および第２のＳＰ１モノマーの改変配列は非同一の物質と結合する。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヘテロマー組成物はドデカマーである。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第１の無機物質と、改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第２の無機物質とを含む組成物であって、第１の無機物質および第２の無機物質がＳＰ１ポリペプチドドデカマーの第１および第２の結合領域を介して複合体化され、かつ、ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、組成物が提供される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列は、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（配列番号４の６５〜７３）、「ＶＫＨ」（配列番号４の９〜１１）および「ＫＳＦ」（配列番号４の４４〜４６）からなる群から選択される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたキメラポリペプチドは、配列番号３または配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１または第２の無機物質のうちの少なくとも一方が非共有結合性の結合によって改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化する。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１または第２の無機物質のうちの少なくとも一方が共有結合性の結合によって前記改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化する。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、結合領域の少なくとも１つがカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、第２の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドではない。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の無機物質の結合領域の少なくとも１つがカーボンナノチューブまたはグラファイト表面であり、第２の無機物質が、ポリマー、布地またはポリマー布地である。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、第２の結合領域がケイ素結合性ペプチドである。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＳＰ１ポリペプチドドデカマーは、配列番号１〜配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を有するＳＰ１ポリペプチドを含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の無機物質がカーボンナノチューブまたはグラファイト表面である。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、物質を溶媒に分散させる方法であって、前記物質を、所定の様式で、本明細書中上記で示されるような組成物または単離されたキメラＳＰ１ポリペプチドと接触させて、前記物質と、前記組成物または単離されたキメラＳＰ１ポリペプチドとの間での複合体を形成させること、および
前記複合体を、溶液または懸濁物を形成するように溶媒と接触させること；
それにより、前記物質を前記溶媒に分散させること
を含む、方法が提供される。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、溶媒は水性溶媒または有機溶媒である。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、溶媒はエポキシである。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、物質はカーボンナノチューブである。
【００７０】
別途定義される場合を除き、本明細書中で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料が本発明の実施形態の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法および／または材料が下記において記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および例は例示にすぎず、必ずしも限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
本特許または特許出願は、カラーで表示される少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願のコピーは、必要な費用の支払いと要求により特許庁によって提供されるだろう。本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面および画像を参照して説明する。特に詳細に図面および画像を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面および画像について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００７２】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ−図１Ｂは、背景技術において記載されるようなＭ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）変異体およびＬ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）変異体のコンピューター生成表示であり、図１Ａは、タンパク質の内側のリングまたは細孔におけるチオール基（緑色）を示すＭ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）変異体を示し、図１Ｂは、タンパク質の外縁におけるチオール基（赤色）を示すＬ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）変異体を示す。
【００７３】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、Ｍ４３Ｃ ＳＰ１（配列番号１）変異体およびＬ８１Ｃ ＳＰ１（配列番号２）変異体の発現実験および安定性実験のために行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動の写真であり、図２Ａは、ＩＰＴＧ誘導前（レーン１）およびＩＰＴＧ誘導後（レーン２）の総細菌抽出物からのＭ４３Ｃ ＳＰ１（Ｍ４３Ｃ ＳＰ１モノマーのバンドが実線により囲まれる）；非煮沸の細菌可溶性画分（レーン３、ドデカマーのバンドが点線により囲まれる）、および、煮沸された細菌可溶性画分（レーン４、モノマーのバンドが実線により囲まれる）；細菌の封入体（レーン５）、８５℃で３０分間の熱処理の後での細菌可溶性画分で、非煮沸物および煮沸物（それぞれ、レーン６およびレーン７）；非煮沸および煮沸の精製タンパク質（それぞれ、レーン８およびレーン９）；８５℃、１００℃およびプロテイナーゼｋにさらされた安定性処理サンプル（それぞれ、レーン１０、レーン１１およびレーン１２）のＰＡＧＥでの分離を示し、図２Ｂは、図２Ａに示されるレーン１〜レーン５におけるサンプルと同じ条件にさらされたレーン１〜レーン５におけるサンプル；煮沸および非煮沸のリフォールディングされたタンパク質（それぞれ、レーン６およびレーン７）；図２Ａに示されるレーン８〜レーン１２におけるサンプルと同じ条件にさらされたレーン８〜レーン１２におけるサンプルによるＬ８１Ｃ ＳＰの分析を示す（ｋＤａ単位でのＭＷスケール）。
【００７４】
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、３つの超平坦な金表面の原子間力顕微鏡法フラッディングトポグラフィー画像であり、ただし、画像において、青色着色領域は露出金表面を示し、赤褐色領域はタンパク質被覆表面を示すが、金表面のそれぞれがＳＰ１の異なる変化体により処理された：すなわち、ほんの１．５％の表面被覆率を示すだけである野生型ＳＰ１（図３Ａ）、ほんの６０％の表面被覆率を示すだけであるＭ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）（図３Ｂ）、および、超平坦な金表面の９８％の完全かつ均質な被覆率を示すＬ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）（図３Ｃ）。
【００７５】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、シリカ結合性ペプチドをリング形状タンパク質の内側細孔から広がる金色リボンとして示す、ｍｔｂＳＰ変異体（配列番号３）のコンピューター生成グラフィック表示であり、図４Ａは、シリカに結合することができないタンパク質の閉じた立体配座を示し、図４Ｂは、シリカ表面に結合することができる、ＧｕＨＣｌの存在によって達成される開いた立体配座を示す。
【００７６】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ｍｔｂＳＰ（配列番号３）の発現、特徴づけおよびＳｉＯ_２結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真であり、図５Ａにおけるレーン１〜レーン２はＩＰＴＧ誘導前（レーン１）およびＩＰＴＧ誘導後（レーン２）の総細菌溶解物を含有し、図５Ａにおけるレーン３〜レーン４は煮沸（レーン３）および非煮沸（レーン４）の細菌可溶性画分を含有し、図５Ａにおけるレーン５は細菌の封入体溶解物を含有し、図５Ａにおけるレーン６〜レーン７は、熱処理（８５℃で３０分間）後の細菌可溶性画分で、煮沸物（レーン６）および非煮沸物（レーン７）を含有し、図５Ａにおけるレーン８〜レーン９はプロテイナーゼｋ添加（レーン８）およびプロテイナーゼｋ非添加（レーン９）の細菌可溶性画分を含有し、図５Ａにおけるレーン１０〜レーン１１はプロテイナーゼｋ添加（レーン１０）およびプロテイナーゼｋ非添加（レーン１１）の野生型ＳＰ１（配列番号４）を含有する。図５Ｂにおけるレーン１〜レーン２はＳｉＯ_２結合（レーン１）およびＳｉＯ_２非結合（レーン２）のｍｔｂＳＰ（配列番号３）を含有し、図５Ｂにおけるレーン３〜レーン４はＳｉＯ_２結合（レーン３）およびＳｉＯ_２非結合（レーン４）の野生型ＳＰ１（配列番号４）を含有し、図５Ｂにおけるレーン５〜レーン６は、ｍｔｂＳＰ（配列番号３）と、ＳｉＯ_２結合（レーン５）およびＳｉＯ_２非結合（レーン６）の野生型ＳＰ１（配列番号４）との混合物を含有し、図５Ｂにおけるレーン７〜レーン９は、結合したｍｔｂＳＰ（配列番号３）（レーン７）、野生型ＳＰ１（配列番号４）（レーン８）、および、それらの混合物（レーン９）を含有し、これらのすべてがＰＡＧＥでの分離の前に煮沸されなかった（ｋＤａ単位でのＭＷ）。
【００７７】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ＧｕＨＣｌの存在（白四角）またはＧｕＨＣｌの非存在（Ｘ）によるシリカ結合性ペプチドｍＴＢＰ（配列番号５）（図６Ａ）およびＳＰ１シリカ結合性ＳＰ変化体ｍｔｂＳＰ（配列番号３）タンパク質（図６Ｂ）のＳｉＯ_２結合の比較プロットを示す。
【００７８】
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ−７Ｃは、３ＭのＧｕＨＣｌの存在下においてＳｉＯ_２に結合するｍＴＢペプチド（配列番号５）およびＳＰ変化体ｍｔｂＳＰタンパク質（配列番号３）の解離定数分析（図７Ａ〜図７Ｂ）およびスキャッチャード分析（図７Ｃ）の比較プロットを示し、ｍｔｂＳＰが正の協同的結合を明らかにすること（図７Ａ）、および、ｍＴＢペプチド（配列番号５）が非協同的結合を明らかにすること（図７Ｂ）を示す。図７ＣはＳｉＯ_２結合のスキャッチャードであり、変化体タンパク質ｍｔｂＳＰ（配列番号３）についてはＫ_ｄ＝０．３μＭであること（白四角）、および、ｍＴＢペプチド（配列番号５）についてはＫ_ｄ＝８６μＭであること（黒菱形）を示す。
【００７９】
【図８Ａ−８Ｈ】図８Ａ−８Ｈは、シリカ表面に結合した種々のＳＰ１変異体の一連のＡＦＭフラッディングトポグラフィー画像であり、３ＭのＧｕＨＣｌの存在下および非存在下におけるＳｉＯ_２表面に対するそれらの様々な親和性を示す。青色領域はむき出しの表面領域を表し、褐色領域はシリカ結合タンパク質を表す。図８Ａ〜図８Ｄはそれぞれ、ＧｕＨＣｌの非存在による野生型ＳＰ１（配列番号４）、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）変化体、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）変化体およびｍｔｂＳＰ１（配列番号３）変化体であり、これらのすべてが、ＳｉＯ_２に対する低い非特異的結合（５％未満の表面被覆率）を示し、図８Ｅ〜図８Ｈはそれぞれ、３ＭのＧｕＨＣｌの存在下での野生型ＳＰ１（配列番号４）、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）変化体、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）変化体およびｍｔｂＳＰ１（配列番号３）変化体であり、ｍｔｂＳＰ変化体のみが、低下した非特異的結合とともにＳｉＯ_２表面の完全な被覆を示す。
【００８０】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ−９Ｂは、ＳＰ１変化体によるＣＮＴの分散を例示する写真である。図９Ａは、硬化させたＬＹ５０５２エポキシ（１）、分散させた複合体ＴｉＳＰ１（ｍｔｂＳＰ１、配列番号３）−ＣＮＴ（約１％）を伴うエポキシＬＹ５０５２（２）、および、非処理ＣＮＴ（１％）を伴うエポキシＬＹ５０５２（３）から作製されるモジュールの透明度を示す。２における暗いが、透明なサンプルには留意すること。図９Ｂは、分散された複合体ＴｉＳＰ１−ＣＮＴ（約１％）（ｍｔｂＳＰ１）を伴うエポキシＬＹ５０５２の薄い切片のＴＥＭ像を示し、ＣＮＴが、硬化した重合エポキシに完全に分散されていることを示す。
【００８１】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｂは、ＫＥＶＬＡＲ繊維へのＳＰ−１変化体およびＳＰ−１変化体−ＣＮＴ複合体の結合を例示する。図１０Ａは、ＫＥＶＬＡＲへのＬ３ＳＰ１（配列番号８）の結合を、洗浄された繊維のタンパク質アッセイによって検出されるような濃度の関数として明らかにするグラフである。図１０Ｂは、超音波処理を伴う３０ｍｇのＫＥＶＬＡＲ（商標）繊維とのＬ４−ＳＰ１（配列番号９）−ＣＮＴ複合体のインキュベーション（１８０μｇ／ｍｌのタンパク質、１０００μｇ／ｍｌのＣＮＴ；１０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ≒８）、大々的な洗浄および煮沸の後におけるＫＥＶＬＡＲ（商標）に結合するＳＰ１／ＣＮＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。２０ｕｌの総画分（レーン１）、非結合画分（レーン２）および抽出繊維画分（適用緩衝液（それぞれ４０ｕｌ）において煮沸される）（レーン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。タンパク質ならびにＣＮＴが明らかに繊維に結合することに留意すること。
【００８２】
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃは、アラミド繊維へのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の結合を例示する高分解能走査型電子顕微鏡法（ＨＲ−ＳＥＭ）像である。リン酸ナトリウム緩衝液に分散されるＳＰ１ポリペプチド（Ｌ３ＳＰ１、配列番号８）結合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）をアラミド布地（Ｋｅｖｌａｒスタイル１２０平織）とインキュベーションし、撹拌し、すすぎ、一晩風乾した。１グラムの布地あたりおよそ７ｍｇのＣＮＴの結合が認められた。高分解能二次電子顕微鏡像を、高分解能低電圧ＳＥＭ ＵＬＴＲＡ（ＨＲ−ＳＥＭ）を３ｋｅＶの加速電圧で使用して得た。ＨＲ−ＳＥＭ像についてのスケールが、パネル１１Ａ、パネル１１Ｂおよびパネル１１Ｃではそれぞれ、バー＝１０μｍ、１．０μｍおよび０．１μｍである。多量のＣＮＴが布地表面に結合したこと（図１１Ｃを参照のこと）、これにより、非常に増大した表面積、および、ＣＮＴ間の密な接触がもたらされたことに留意すること。
【００８３】
【図１２Ａ】図１２Ａは、炭素繊維材料へのＳＰ−１変化体およびＳＰ−１変化体／ＣＮＴ複合体の結合を例示する。Ｌ３−ＳＰ−１（配列番号８）を浴型超音波処理機において１．５時間、５０ｍｇの炭素繊維（Ｓｉｇｍａｔｅｘ）とインキュベーションし（１ｇの炭素繊維あたり０ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇおよび８ｍｇのタンパク質）、その後、大々的な緩衝液洗浄を行った。洗浄された布地へのＳＰ１結合をタンパク質アッセイによって求め（図１２Ａ）、５６２ｎｍでの光学濃度によって求めた。結合した布地のＳＰ１／布地（ｗ／ｗ）比が７ｍｇタンパク質／ｇ繊維（０．０７％）にまで達することに留意すること。
【図１２Ｂ−１２Ｃ】図１２Ｂ−１２Ｃは、炭素繊維材料へのＳＰ−１変化体およびＳＰ−１変化体／ＣＮＴ複合体の結合を例示する。図１２Ｂは、溶液中のＣＮＴの濃度に対してプロットされる（６００ｎｍにおける）透過率値の標準曲線である。図１２Ｃは、Ｌ３ＳＰ１／ＣＮＴ懸濁物における炭素繊維の超音波処理時間の増大による増大した透過率を示す（６００ｎｍにおける低下したＯＤ、１００倍希釈されたサンプル）。炭素繊維［Ｌ３ＳＰ１（配列番号８）により前処理された］を５時間、Ｌ３ＳＰ−１／ＣＮＴ複合体とともに超音波処理した。溶液からのＣＮＴの喪失（増大した透過率）は、Ｌ３−ＳＰ−１／ＣＮＴ溶液からのＣＮＴが炭素繊維布地に結合したことを示している。
【００８４】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ−１３Ｂは、ＭＷＣＮＴ結合炭素布地の高分解能走査型電子顕微鏡法（ＨＲ−ＳＥＭ）像であり、炭素繊維へのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の２段階結合を例示する。炭素繊維（Ｈｅｘｃｅｌ、平織スタイルＫ−７０−Ｐ３０００フィラメントヤーン）をＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質（配列番号８６）の溶液により処理し、大々的に洗浄し、ＳＰ１ポリペプチド（Ｌ３ＳＰ１、配列番号８）結合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）懸濁物とインキュベーションし、洗浄し、一晩風乾した。布地表面のＣＮＴ含有量が約６ｍｇ／ｇ布地であった。二次電子顕微鏡（ＨＲ−ＳＥＭ）像（これは上記のように得られた）は、凝集を全く伴わない、布地へのＳＰ１ポリペプチド結合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）の広範囲かつ均質な結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、一般には材料科学に関連し、より具体的には、安定タンパク質１（ＳＰ１）の配列変化体に関連し、また、カーボンナノチューブの結合、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体に基づく複合ポリマーおよび複合ポリマー材料（例えば、布地など）の製造のためのその使用、ならびに、それらの使用、例えば、タイヤにおける導電性を高めるためのそれらの使用に関連する。
【００８６】
具体的には、本発明は、無機物質と結合させ、無機物質を制御可能に露呈させるために、また、溶媒におけるそれらの分散を高めるために、また、無機物質を複合材料に取り込むための二機能性または多機能性の試薬として使用することができる。さらに、本発明のＳＰ１変化体ポリペプチドのホモオリゴマー複合体またはヘテロオリゴマー複合体は、例えば、カオトロピック剤にさらすことによって、無機物質への結合を選択的に改変するために操作することができる。そのうえさらに、本発明は、高まった熱伝導性および電気伝導性を有する、一体化されたカーボンナノチューブをＳＰ１変化体を介して取り込む複合ポリマー要素で、例えば、改善された転がり抵抗、静電気放電、熱消散、タイヤ状態のモニタリング、および、タイヤの物理的パラメーターの制御のために、タイヤに取り込むために使用することができる複合ポリマー要素に関する。
【００８７】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解することができる。
【００８８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、次の記載において示されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、ほかの実施態様も可能であるし、または様々な方法で実行または実施することができる。同様に、本明細書において用いられている表現および用語法は、説明を目的としており、限定的なものとみなすべきでないことも理解すべきである。
【００８９】
ＳＰ１ポリペプチドは、熱およびほとんどの化学的変性剤による変性に対して抵抗性があり、プロテアーゼ消化に対して抵抗性があり、また、分子相互作用を安定化させることができ、三次元構造体を形成することができるヘテロオリゴマーおよびホモオリゴマーを形成する並外れて安定なポリペプチドである（Ｄｇａｎｙ他、ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜２３；米国特許第７，２５３，３４１号（Ｗａｎｇ他））。
【００９０】
本発明者らは、結合性分子の結合特性を強化するために、また、融合された分子（例えば、酵素など）を安定化させるために、また、融合された分子の免疫学的性質を強化するか、または変化させるために、他のタンパク質分子または非タンパク質分子に融合されたＳＰ１タンパク質を以前に発見している（米国特許第７，２５３，３４１号（Ｗａｎｇ他））。ＳＰ１融合タンパク質は、米国特許第７，２５３，３４１号に開示されるように、遺伝子工学技術によって付加されたさらなるポリペプチド配列を有する組換えＳＰ１分子と、化学的手段（例えば、架橋など）によって付加されたさらなる非タンパク質成分を有するＳＰ１分子とを含む。本発明者らは、皮膚、毛髪、爪などを強化するためのＳＰ１タンパク質の治療的使用をさらに開示している。
【００９１】
ＰＣＴ ＩＬ２００６／０００７９５は、薬物の分子複合体化、および、複合体化されたリガンドの送達、同様にまた、その制御放出のために、小分子、ペプチド、核酸フラグメント、無機ナノ構造物および他のリガンドとの分子複合体を形成するＳＰ１およびＳＰ１変化体を開示する。
【００９２】
本発明は、ＳＰ１ポリペプチドと、異種の無機物質結合性ペプチドとを含むキメラポリペプチドが、様々な無機物質、分子および表面との非常に特異的かつ制御可能な複合体を形成し得るという発見に基づく。本発明のキメラＳＰ１分子の三次元立体配座は多数コピーの無機物質結合性ペプチドの提示を可能にし、これにより、それらの標的分子に対するそれらのアビディティーを高め、また、改変および改善された結合強さをもたらす。このことは、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドを、例えば、無機分子の分散および結合特性を高めるために、また、多機能性試薬として作用するために、また、複合材料の設計および製造のためにことのほか有用にする。
【００９３】
したがって、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドは、溶媒およびポリマーにおける溶解性不良な材料（例えば、カーボンナノチューブ）の分散、ならびに、複合体化されたキメラＳＰ１−無機物質の結合による、無機材料、ポリマーおよび表面の改変を高めるために使用することができる。本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドは、高まった物理的特徴、例えば、改善された貯蔵弾性率、増大した引張り強さ、衝撃抵抗性、電気伝導性、光学活性、熱伝導性、表面相互作用性、磁気特性および電磁放射線吸収スペクトルなどを有する複合材料を製造するために使用することができる。例えば、キメラなＳＰ１−カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドと複合体化されたカーボンナノチューブの、ポリマー（例えば、エポキシなど）における分散は、キメラＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体の優れた分散をもたらし、また、キメラなＳＰ１−カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドと複合体化されたカーボンナノチューブを制御された条件のもとでポリマー（例えば、アラミド（例えば、Ｋｅｖｌａｒ（登録商標）など）にさらすことにより、ポリマー表面へのキメラＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体の優れた制御可能な結合がもたらされ、これにより、電気伝導性および熱伝導性のポリマーおよびポリマー布地を製造することがもたらされる。
【００９４】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）には、本発明によれば、多層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、二重層カーボンナノチューブ（ＭＷＮＴ）、小直径カーボンナノチューブ（これは直径が約３．５ｎｍ未満である）、バッキーチューブ、フラーレンチューブ、カーボンフィブリルおよびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。そのようなカーボンナノチューブは様々な経路により合成することができ、また、様々な長さ、直径、キラリティー（らせん性）および純度のものが可能である。そのようなカーボンナノチューブは内包的にドープすることができる。さらに、ＣＮＴサンプルの集団は、長さ、直径、キラリティーおよび／または電子的タイプに関して実質的に均一または不均一であり得る。いくつかの実施形態において、様々な努力が、ナノチューブを精製し、かつ／または、ナノチューブをタイプ毎に分離するために取られている。例えば、Ｃｈｉａｎｇ他、Ｊ Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、２００１、１０５：８２９７〜８３０１；および、Ｄｙｋｅ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００５、１２７：４４９７〜４５０９をそれぞれ参照のこと。ＳＷＮＴタイプの議論については、Ｂａｃｈｉｌｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９８：２３６１〜２３６６；および、Ｗｅｉｓｍａｎ他、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２００３、３：１２３５〜１２３８を参照のこと。
【００９５】
本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドはまた、ケイ素系の化合物および材料（例えば、ガラスなど）を結合させるために、また、金属表面（例えば、金など）に結合させるために有用である。キメラＳＰ１ポリペプチドの二機能的および多機能的な結合特性は、表面への均一な被覆（例えば、顔料および難燃剤など）を固定するためのそれらの使用を可能にする。本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドはまた、繊維に結合することができ、無機繊維および布地（例えば、アラミド（Ｋｅｖｌａｒ（商標）およびＴｗａｒｏｎ（商標）など）、絹、ポリエステル、ガラス繊維、ポリアミド、綿および炭素繊維など）の物理的特性を改変するために使用することができる。特性のそのような変化を測定するためのアッセイの例が本明細書中下記に詳しく記載される。
【００９６】
ＳＰ１ポリペプチドは、表面活性成分を提示するためのタンパク質足場として使用することができる。万能的なタンパク質足場は一般に、多数のループ構造またはアミノ酸配列を局所的表面領域において露呈させることができる立体配座的に安定な折り畳み実体を構成しなければならない。ＳＰ１は、それらの結合能に協同的様式で寄与する様々な成分を露呈させるために操作することができる。そのうえ、ペプチド暴露を、非特異的結合を減らす溶媒条件のもとで操作することができる。
【００９７】
したがって、本発明の１つの局面によれば、ＳＰ１ポリペプチドと、異種の無機分子結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、ＳＰ１ポリペプチドが、ｉ）天然ＳＰ１（配列番号４）に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、ｉｉ）安定ダイマー形成能、および、ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチドが提供される。
【００９８】
本明細書に使用される語句「ＳＰ１ポリペプチド」は、少なくとも下記の特徴的な性質を有するタンパク質を示す配列番号４に対して少なくとも６５％の配列相同性を有する；安定なダイマーを形成することができ、１０．００のプルラリティー、４の閾値、１．００の平均加重、２．９１の平均マッチおよび−２．００の平均ミスマッチを使用してＧＣＧのＢｅｓｔ Ｆｉｔアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１）を使用して決定されたとき、少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域に有する。一部の実施形態では、ＳＰ１ポリペプチドは、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（６５〜７３、配列番号１）、「ＶＫＨ」（９〜１１、配列番号１）および「ＫＳＦ」（４４〜４６、配列番号１）の保存されたコンセンサス配列を有する。本発明の１つの実施形態によれば、「野生型」または「天然型」のＳＰ１は、Ｗａｎｇ他（ＰＣＴ ＩＬ０２／００１７４（２００２年３月５日出願）の一部継続出願である米国特許出願第１０／２３３４０９号（２００２年９月４日出願、２００７年８月７日に米国特許第７，２５３，３４１号発行）、これらはともに、全体が本明細書中に示されているものとして参考として組み込まれる）によって開示されるように、アスペンから得られるストレス関連のＳＰ１タンパク質（配列番号４）である。
【００９９】
１つの実施形態において、ＳＰ１タンパク質は、配列番号４に対して７０％相同的、７５％相同的、８０％相同的、８５％相同的、９０％相同的、９５％相同的、または、最大で１００％相同的である。ＳＰ１ホモログが、ヨーロッパヤマナラシ以外の植物種において同定されていること、および、これらのＳＰ１ホモログは、上記基準を満たすときには本発明との使用のために好適であり得ることが理解される。
【０１００】
ＳＰ１ポリペプチドが、変性剤に安定で、煮沸に安定で、また、界面活性剤に安定であり、かつ、シャペロン様活性を有するとして特徴づけられている。本明細書中で使用される場合、表現「変性剤に安定な」は、水溶液における変性処理の後における大きな（５０％を超える）構造的オリゴマー安定性を示す。変性処理には、煮沸、および、化学的変性剤（例えば、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、尿素またはグアニジニウム−ＨＣｌなど）への暴露が含まれ得る。
【０１０１】
本明細書において用いられているような「煮沸安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、実質的に１００℃で水溶液中で、少なくとも１０分間の処理後、大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【０１０２】
本明細書において用いられているような「界面活性剤安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、１／２，０００モル比（モノマー：ＳＤＳ）を含有する水溶液中の処理後のオリゴマータンパク質の大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【０１０３】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「プロテアーゼ耐性」という語句は、３７℃で少なくとも６０分間、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する水溶液中での処理後の大きい（５０％以上）安定性および物理的かつ機能的特性の保持のことを言う。
【０１０４】
本明細書において用いられているような「シャペロン様活性」という語句は、タンパク質のネイティブ折りたたみ、およびネイティブオリゴマー化を仲介し、不正確なタンパク質構造の形成を防ぎ、現存の不正確なタンパク質構造をもとの状態に戻し、部分的に変性されたタンパク質またはこれらのドメイン間に発生しうる不正確な相互作用を阻害することによって、ストレス関連損傷を制限する能力のことを言う。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または用語「実質的に純粋な」は、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドの改変体として使用されるとき、それらが人の介入によって製造され、また、それらの天然のインビボ細胞環境から分離されることを意味する。一般に、そのように分離されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが自然界では会合する他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まない。
【０１０６】
キメラ体のＳＰ１ポリペプチドは天然ＳＰ１（例えば、配列番号４）が可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するＳＰ１ポリペプチドが可能である。いくつかの実施形態において、改変されたＳＰ１ポリペプチドは、天然ＳＰ１ポリペプチドの上記活性、例えば、ｐＨ安定性で、熱安定性で、かつ、変性剤およびプロテアーゼに抵抗性であるオリゴマーおよび複合体を形成する能力などを保持する（例えば、実施例２および実施例３、図５を参照のこと）。
【０１０７】
本明細書中上記で述べられるように、ＳＰ１変化体ポリペプチドは、特定の特性をＳＰ１変化体に与えるために改変することができ、それにより、他の物質との分子複合体化および他の物質の放出をより効率的および制御可能にし、また、特定の条件に対して適合可能にする。Ｄｇａｎｙ他（ＪＢＣ、２００４、２７９：５１５１６〜５２３）はＳＰ１ポリペプチドにおける数多くの構造的に重要な領域を特定している。
【０１０８】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｏ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【０１０９】
一部の実施形態では、キメラなＳＰ１ポリペプチドには、側鎖に対する修飾、ペプチド合成時における非天然アミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、ならびに、立体配座の制約をペプチドまたはそのアナログに負わす架橋剤および他の方法の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明によって意図される側鎖修飾の例には、アミノ基の修飾、例えば、アルデヒドとの反応、それに続く、ＮａＢＨ_４を用いた還元による還元的アルキル化などによるアミノ基の修飾；メチルアセトイミダートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびに、ピリドキサール−５’−リン酸によるリシンのピリドキシル化、それに続く、ＮａＢＨ_４を用いた還元が含まれる。
【０１１１】
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬による複素環縮合生成物の形成によって修飾することができる。
【０１１２】
カルボキシル基を、Ｏ−アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化、それに続く、例えば、対応するアミドへのその後の誘導体化によって修飾することができる。
【０１１３】
スルフヒドリル基を、様々な方法によって、例えば、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロメルクリベンゾアート、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化などによって修飾することができる。
【０１１４】
トリプトファン残基を、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、あるいは、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハリドによるインドール環のアルキル化によって修飾することができる。他方で、チロシン残基を、３−ニトロチロシン誘導体を形成するためのテトラニトロメタンによるニトロ化によって変化させることができる。
【０１１５】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾を、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、または、ジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって達成することができる。
【０１１６】
ペプチド合成時に非天然アミノ酸および誘導体を取り込む例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプトン酸、２−チエニルアラニン、および／または、アミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ_２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ_２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１１８】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０１１９】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１２０】
上述のことに加えて、本発明のペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【０１２１】
用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【０１２２】
下記の表１および表２は、全ての天然に存在するアミノ酸（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）を列挙する。
【０１２３】

【０１２４】



【０１２５】
本発明のペプチドは線状形態で利用されることができるが、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態によれば、無機結合性ペプチドは、異種のケイ素結合性ペプチド、例えば、配列番号５に示されるようなＲＫＬＰＤＡＡ（ｍｔｂ）である。１つの例示的な実施形態において、ＳＰ１ポリペプチドおよび異種のケイ素結合性ペプチド（ｍｔｂ）を含む得られたキメラポリペプチドは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
別の実施形態において、結合性ペプチドは炭素繊維または炭素表面と結合する。したがって、キメラポリペプチドは、カーボンナノチューブおよび／またはグラファイト表面と結合するために使用することができる。したがって、本発明のさらなる局面によれば、ＳＰ１ポリペプチドと、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドとを含むキメラポリペプチドが提供される。本発明のキメラポリペプチドとの使用のために好適なカーボンナノチューブ結合性ペプチドはこの技術分野では広く知られており、例えば、米国特許第７３０４１２８号（Ｊａｇｏｄａ他）に開示されるペプチドである。いくつかの実施形態によれば、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳ（配列番号１０）、ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴ（配列番号１１）、ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦ（配列番号１２）またはＳＮＱＳ（配列番号１３）であり、キメラＳＰ１ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１４〜配列番号１８に示されるようなアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドはＳＰ１ポリペプチドのＮ末端に位置する。
【０１２８】
別の実施形態によれば、無機結合性ペプチドは、異種のチタン結合性ペプチド、例えば、ＲＫＬＰＤＡ（配列番号５）またはＲＡＬＰＤＡ（配列番号１９）などである。
【０１２９】
無機物質（特に固体）と結合するペプチドは、計算生物学ツールを使用して設計することができ、多くの研究の主題となっている。ＳＰ１キメラ体における使用のために好適な数多くの無機物質結合性ペプチドモチーフが解明されている（例えば、Ｓａｒｉｋａｙａ他、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ、２００４；３４：３７３〜４０８を参照のこと。これは、全体が本明細書中に示されるかのように参照によって組み込まれる）。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、様々な材料に非特異的に結合するペプチドを本発明とともに使用することができる。これらには、特異的なイガイタンパク質（ｍｆｐ１）に由来する反復したチロシンリッチモチーフ（この場合、チロシン残基はＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）に変換されることがある（Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ＆Ｗａｉｔｅ、Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ、８７（８）：７０１〜７０９、２００８）、例えば、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ（配列番号２０）、ＡＫＰＴＹＫ（配列番号２１）、ＰＫＩＳＹＰＰＴＹＫ（配列番号２２）、ＡＰＰＰＡＸＴＡＸＫ（配列番号２３）、ＡＴＰＫＰＸＴＡＸＫ（配列番号２４）、ＰＹＶＫ（配列番号２５）、ＡＫＰＳＰＹＶＰＴＧＹＫ（配列番号２６）、ＧＱＱＫＱＴＡＹＤＰＧＹＫ（配列番号２７）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
さらに別の実施形態において、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ）が非常に多いポリスチレン（ＰＳ）結合性ペプチドを本発明とともに使用することができる（Ａｄｅｙ他、Ｇｅｎｅ、１９９５；１４：２７〜３１；Ｐｈ．Ｄ．（商標）−Ｃ７Ｃ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂのウエブサイトを参照のこと）。
【０１３２】
ＳＰ１ポリペプチドの改変は、例えば、表面との相互作用におけるタンパク質の機能性を高めることができる。したがって、本発明のさらにさらなる局面によれば、配列番号 に示されるようなアミノ酸配列を含む、アミノ酸置換Ｍ４３Ｃを有する単離されたＳＰ１ポリペプチドが提供される。本明細書中で詳述されるように、ＳＰ１のアミノ酸座標４３におけるシステインの置換は、表面（例えば、平坦な金など）への高まった結合を有するＳＰ１オリゴマー複合体をもたらした。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、キメラ（な）ポリペプチドは、一般には自然界においてただ１つだけのアミノ酸配列に一緒に見出されない２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を示す。キメラＳＰ１ポリペプチドは、ＳＰ１ポリペプチドと、無機分子（例えば、金属および他のイオンなど）に対する結合親和性を有する非ＳＰ１オリゴペプチドまたは非ＳＰ１ポリペプチドとを含み、ＳＰ１ポリペプチドおよび非ＳＰ１成分がペプチド結合によりつながれるポリペプチドとして本明細書中では定義される。
【０１３４】
本発明のキメラなポリペプチドおよびその修飾は、従来公知の様々な方法によって作られることができる。本発明のポリペプチドは、ペプチドまたはタンパク質合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成することができる。固相ペプチド合成については、その多くの技術の要約が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９６３）に、また、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７３）に見出され得る。古典的な溶液合成については、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐｋｅ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９６５）を参照のこと。
【０１３５】
ＳＰ１ポリペプチドへの改変を、例えば、部位特異的（例えば、ＰＣＲに基づく）変異誘発またはランダム変異誘発（例えば、ＥＭＳ）によって、エキソヌクレアーゼ欠失によって、化学的修飾によって、あるいは、異種のドメインまたは結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の融合によって導入することができる。本明細書中で詳述されるように、キメラポリペプチドを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞など）において発現させ、発現したキメラポリペプチドを、典型的な生化学的方法を使用する精製（例えば、免疫親和性精製、ゲル精製、発現スクリーニングなど）によって精製することによって得ることができる。他の広く知られている方法が、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ他（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される。
【０１３６】
組換えポリペプチドの翻訳後修飾（例えば、グリコシル化など）のためのシグナルもまた、コード配列に導入することができる。
【０１３７】
したがって、本発明の別の局面によれば、上記キメラポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０１３８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または混成ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離および提供される一本鎖核酸配列または二本鎖核酸配列を示す。
【０１３９】
用語「単離（された）」は、自然環境から、例えば、植物細胞から少なくとも部分的に分離されることを示す。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または何らかの他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用するメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、したがって、ゲノムポリヌクレオチド配列は染色体の連続する一部分を表す。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合、表現「混成ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部が相補的であり、かつ、少なくとも一部がゲノム性である配列を示す。混成配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、同様にまた、それらの間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節要素を含むことができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ＳＰ１ポリヌクレオチド配列は、配列番号２８に対して７０％相同的、７５％相同的、８０％相同的、８５％相同的、９０％相同的、９５％相同的、または、最大で１００％相同的である。ＳＰ１ホモログ（配列番号２９〜配列番号５４）をコードするポリヌクレオチドが、上記基準を満たすときには本発明のＳＰ１ポリペプチドを製造するために好適であり得ることが理解される。
【０１４４】
具体的な実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を有する改変ＳＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【０１４５】
本発明のポリヌクレオチドは宿主生物における組換え発現のためにベクターに導入され得ることが理解される。本発明の別の局面によれば、本明細書中に記載される単離された核酸（例えば、上記キメラポリペプチドをコードする単離された核酸）を含む核酸構築物が提供される。
【０１４６】
好ましい実施形態によれば、本発明のこの局面による核酸構築物はさらに、ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、その下流側に存在する配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと結合するために働くので、転写のために要求されるシス作用の配列要素であることが知られている。
【０１４７】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは本発明の必須要素である一方で、種々の状況において使用することができる。本発明のポリヌクレオチドと併せて使用される好まれるプロモーターは二次的に重要であり、任意の好適なプロモーターを含む。しかしながら、転写開始部位がオープンリーディングフレームの上流に位置することを確かめることが必要であることが当業者によって理解される。本発明の好ましい実施形態において、選択されるプロモーターは、宿主細胞が細菌、酵母、あるいは、植物または動物の高等細胞であろうとも、目的とする特定の宿主細胞において活性である要素を含む。
【０１４８】
本発明による構築物は好ましくはさらに、適切な選択マーカーを含む。本発明によるより好ましい実施形態において、構築物はさらに、複製起点を含む。本発明による別の最も好ましい実施形態において、構築物はシャトルベクターであり、この場合、シャトルベクターは大腸菌においてともに増殖することができ（この場合、構築物は適切な選択マーカーおよび複製起点を含む）、かつ、選ばれた生物の細胞における増殖またはゲノムにおける組み込みのために適合可能であり得る。本発明のこの局面による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が可能である。
【０１４９】
本発明の構築物は、それによってコードされるポリペプチドを、細菌（例えば、大腸菌、酵母細胞など）から高等細胞（例えば、植物の細胞など）にまで及ぶ様々な生物種において発現させるために使用することができる。発現は、安定的または一過性で選択することができる。
【０１５０】
植物の形質転換を達成するために、キメラＳＰ１産生をコードする外因性ポリヌクレオチドが好ましくは、植物細胞または植物組織への外因性ポリヌクレオチドの導入および植物におけるキメラＳＰ１ポリペプチドの発現を容易にするために役立つ核酸構築物（１つまたは複数）に含まれる。
【０１５１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、異種の無機結合性ペプチド配列を有するキメラＳＰ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。配列番号５５は、ケイ素酸化物結合性ペプチド配列ＲＫＬＰＤＡＡを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号５６は、カーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号５７は、カーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号５８は、カーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号５９は、カーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号６０は、Ｒ２３Ｋ置換を有するカーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号６１は、Ｔ２２Ｃ置換を有するカーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号６２は、Ａ２４ＴおよびＡ２７Ｔの変異を改善されたコドン使用法のために有するカーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。配列番号６３は、Ａ２４ＴおよびＡ２７Ｔの変異を改善されたコドン使用法のために有し、かつ、Ｒ２３Ｋ置換を有するカーボンナノチューブ結合性ペプチド配列ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳを含むキメラＳＰ１ポリペプチドをコードする。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、用語「異種（の）」は、天然ＳＰ１ポリペプチド配列の一部ではないペプチド配列を示す。いくつかの実施形態において、異種の配列は、ＳＰ１タンパク質配列と関連がない合成配列であることができる。
【０１５３】
他の実施形態において、異種の配列は、ＳＰ１と関連がない「外来」ポリペプチドに由来することができる。具体的な実施形態において、異種の配列はセルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）ペプチドに由来する。例示的な、限定されないＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質の産生、クローニングおよび組換え発現が、国際公開ＷＯ２００４／０２２６９７に詳しく記載される（これは全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。驚くべきことに、ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質が、大きい親和性で、カーボンナノチューブに対するのと同様に、繊維、布地および布地基体と結合することが発見された。したがって、本発明の１つの局面によれば、カーボンナノチューブと複合体化されたＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドを含む組成物が提供される。
【０１５４】
カーボンナノチューブと複合体化されたＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドは、カーボンナノチューブを、編織物、ヤーンおよび布地などに結合するために使用することができる。したがって、１つの実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地がさらに提供される。１つの実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドは、クロストリジウム・セロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓ）の結合性タンパク質のセルロース結合性ドメインを含む。別の実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドは、配列番号８７に示されるようなＣＢＤドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドは、ＳＰ１ポリペプチドと、ＣＢＤアミノ酸配列との間に配置されるペプチドリンカーを含む。１つの例示的な、限定されないリンカーが、配列番号８９に示される通りである。さらに別の実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドは配列番号８６に示される通りである。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、電気伝導性のポリマー、布地またはポリマー布地を製造するための方法であって、布地基体材料を提供すること；ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物を調製すること、布地基体材料をＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物により処理すること、布地基体材料を洗浄して、導電性ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の前記組成物の過剰量を除き、それにより、ポリマー、ポリマー布地または布地基体材料に導電性を与えることを含み、ＳＰ１ポリペプチドが本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドである方法が提供される。いくつかの実施形態において、布地、ヤーンまたは編織物は、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドとの複合体を形成するようにＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドを含む組成物にさらされ、その後、前記ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチド複合体化ヤーン−布地または編織物をＣＮＴまたはＳＰ１−ＣＮＴ（例えば、ＳＰ１−Ｌ３−ＣＮＴなど）と接触させて、その結果、ＣＮＴまたはＳＰ１−ＣＮＴを伴うＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチド複合体化ヤーン−布地または編織物を形成させるようにされる。
【０１５６】
本発明者らは、キメラＳＰ１ポリペプチドで、アミノ酸残基４３におけるメチオニンからシステインへの置換およびＮ末端における６アミノ酸の欠失を有し（これはＭ４３ＣΔＮＳＰ１と名づけられる；配列番号１）、かつ、配列番号５の場合と同様にＮ末端のケイ素結合性タンパク質を有するもの（ｍＴＢペプチド）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲによって調製し、クローン化し、このポリヌクレオチドを細菌において発現させている。発現したキメラＳＰ１タンパク質を精製したとき、キメラＳＰ１−ケイ素結合性タンパク質（ｍｔｂＳＰ、配列番号３）は会合して、シリカおよび二酸化シリカと大きい親和性で結合するＳＰ１オリゴマーになることが発見された（実施例２、図７Ａ〜図７Ｃを参照のこと）。このキメラｍｔｂＳＰオリゴマーはリング形状のホモドデカマーであり、これは、６個がリングのそれぞれの側にある１２個のケイ素酸化物結合性ペプチドをその内側細孔に呈示する（図４を参照のこと）。キメラｍｔｂＳＰポリペプチドは、ガラス表面およびガラス繊維、ならびに、シリカ化合物（例えば、炭化ケイ素、二酸化ケイ素および二酸化チタンなど）を含有する他の材料に結合することができ、また、そのようなケイ素含有材料の性質を改変するために使用することができる。例えば、このキメラＳＰ１ポリペプチドは、シランにより被覆された炭素繊維に結合することができる。シランによる薄い被覆は、多くの適用のための一般的な慣例であり、例えば、シランが、炭素繊維、ガラス繊維およびポリアラミド繊維をポリマーマトリックスに接着するためのカップリング剤として使用され、また、キメラｍｔｂＳＰは、その表面でのシラン酸化およびケイ素酸化物形成の結果としてそのような表面に結合する。
【０１５７】
ケイ素含有表面および／またはケイ素含有粒子へのキメラｍｔｂＳＰ１ポリペプチドの結合を様々な条件で行うことができる。これは、ＳＰ１キメラ体が様々な過酷な条件（熱、極端なｐＨ、界面活性剤暴露およびプロテアーゼ暴露）における変性に対して非常に抵抗性であるからである。本発明の１つの実施形態によれば、この結合が、ＮａＣｌおよびカオトロピック剤（例えば、グアニジン塩酸塩または尿素）の存在下、中性または中性付近（ｐＨ６．５）のｐＨで行われる。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ケイ素含有表面へのキメラｍｔｂＳＰ１ポリペプチドの特異的な結合が３ＭのＧｕＨＣｌの存在によって促進される。
【０１５８】
本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドはまた、カーボンナノチューブおよび／またはグラファイト表面と結合するために使用することができる。
【０１５９】
本発明者らは、配列番号１０〜配列番号１３（ＣＮＴ結合性ペプチド）の場合のようにＮ末端のカーボンナノチューブ結合性タンパク質またはグラファイト表面結合性タンパク質を有するキメラＳＰ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがＰＣＲによって調製され、クローン化され、細菌において発現させられたことを示している。精製されたとき、組換えキメラＳＰ１−カーボンナノチューブ−グラファイト表面結合性タンパク質（Ｌ１−ＳＰ１ＣＮＴ、Ｌ２−ＳＰ１−ＣＮＴ、Ｌ３−ＳＰ１−ＣＮＴおよびＬ６−ＳＰ１−ＣＮＴ、それぞれ、配列番号６、配列番号１４、配列番号８および配列番号１５）が会合して、カーボンナノチューブおよびグラファイト表面と大きい親和性で結合するＳＰ１オリゴマーになることが発見された（実施例３および表２を参照のこと）。キメラＳＰ１−ＣＮＴポリペプチドを発現する形質転換された細菌の粗抽出物はまた、著しく効果的な、熱およびプロテアーゼに安定なＣＮＴ親和性を示した（表３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、キメラＳＰ１ポリペプチドが封入体として細菌において発現される。キメラＳＰ１−ＣＮＴポリペプチドまたはキメラＳＰ１−ＣＢＤ−ＣＮＴポリペプチドは、封入体として発現されるとき［Ｌ２（配列番号１４）、Ｌ３（配列番号８）およびＳＰ１−ＣＢＤ（配列番号８６）］、ＣＮＴ結合能を有するキメラＳＰ１ポリペプチドを得るために、６Ｍ尿素における封入体の溶解、および、低イオン強度の緩衝液を用いた尿素希釈によるタンパク質のリフォールディングによって再構成することができる。いくつかの実施形態において、リフォールディングされたポリペプチドはキメラＳＰ１モノマーである。さらに他の実施形態では、封入体が、Ｔｒｉｓｍａ塩基（２０ｍＭ）、ＮａＯＨ（８ｍＭ）に溶解され、その後、高速遠心分離により、破片が除かれ、上清が水で希釈され、ｐＨがｐＨ＝８．２に調節される。
【０１６０】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、カーボンナノチューブを、広範囲の様々な使用に適用され得る布地に織ることができることを提供する。種々の特徴を有するカーボンナノチューブは、他にない布地を作り出すために一緒に織ることができる。例えば、電気を絶縁するために役立つカーボンナノチューブを、着用者を電気ショックから遮蔽および保護する衣類を作り出すために、非常に電気伝導性のカーボンナノチューブと組み合わせることができ、または、非常に電気伝導性のカーボンナノチューブとの層状にすることができ、一方で、電気伝導性カーボンナノチューブを、静電気蓄積から保護するために布地において組み合わせることができる。同様に、熱伝導性カーボンナノチューブを、ヒートシンクまたは熱源につながれるときには使用者を厳しい熱環境から保護するために役立つ材料に編み込むことができる。
【０１６１】
一般に、布地の構造的配置により、カーボンナノチューブに関連する機械的特性、熱的特性、電気的特性、物理的特性および化学的特性が示され、また、ＳＰ１改変ＣＮＴは布地に取り込むことができる。本明細書中で使用される場合、ストランドまたは「繊維」は、ヤーンを規定するために一緒にまとめることができる。その後、これらのヤーンは、布地構造物配置を規定するために、互いに、および／または、随伴ヤーンと織り交ぜられる。他の実施形態によれば、繊維−ＣＮＴ複合材（これはＳＰ１変化体による媒介に起因して得られる）は、不織布およびシートを製造するために使用することができる。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、キメラＳＰ１−ＣＮＴポリペプチドは、多層カーボンナノチューブおよび単層カーボンナノチューブ、炭素繊維、ならびに、炭素表面またはグラファイト表面を含有する他の材料（例えば、炭素繊維など）に結合することができ、また、そのような炭素含有材料の性質を改変するために使用することができる。例えば、キメラＳＰ１ポリペプチドは、さらなる強度を提供するために、複合材料へのそれらの取り込みの前に炭素繊維に結合させることができ、あるいは、他にない化学的特性、電気的特性および熱的特性を有する繊維および布地を提供するために、カーボンナノチューブを均一な様式で合成または天然の布地および布地前駆体（例えば、アラミド（Ｋｅｖｌａｒ（商標）または綿など）に結合するために使用することができる。そのような布地および表面は、ある種のポリマー物質または樹脂と会合するカーボンナノチューブを含む層を含むことができる。
【０１６３】
ポリマー、布地またはポリマー布地の電気伝導性を増大させることは、ポリマー、布地またはポリマー布地の静電気特性を変化させ得ることが理解される。したがって、静電気が少ない、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を、ポリマー、布地およびポリマー布地における静電気相互作用および静電気蓄積がそのような材料の機能における重要な要素である場合には使用することができる。したがって、本明細書のいくつかの実施形態によれば、結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む布地基体材料を含む電気伝導性布地が提供され、ただし、この場合、前記電気伝導性布地の導電率は、前記結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を有しない前記布地基体材料の導電率よりも大きい。本発明のさらなる実施形態によれば、下記の工程を含む、導電性のポリマー、布地またはポリマー布地を製造するための方法が提供される：布地基体材料を提供する工程；ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物を調製する工程、および、前記布地基体材料をＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の前記組成物により処理し、前記布地基体材料を洗浄して、導電性ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の前記組成物の過剰量を除くことによって、導電性を、前記ポリマー、ポリマー布地または布地基体材料に与える工程。他の実施形態において、カーボンナノチューブを、布地、ヤーンまたはポリマーに結合するための本発明の方法のどれもが、布地、ヤーンまたはポリマーの導電性特性を高めるために使用することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、電気伝導性布地は、織布および不織布から選択される布地基体材料を含み、ただし、前記織布および不織布は、天然布地、合成布地、天然布地および合成布地の混合物、ならびに、無機材料布地から選択される。例示的な布地またはポリマーには、綿、ウールおよび絹が含まれるが、これらに限定されず、前記合成布地は、ナイロン、ポリエステル、アラミド、ポリプロピレンおよびエラステイン（Ｌｙｃｒａ（商標）−Ｓｐａｎｄｅｘ（商標））からなる群から選択される。本発明のＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を使用する製造のために好適な、カーボンナノチューブを含む布地およびヤーンから作製される衣類、ロープ品、縫製品、成形品および織物品の例には、パラシュート、衣料品、寝袋、自転車部品および機材、スキー板などが含まれるが、これらに限定されない（さらなる詳細な例については、米国特許第７３５４８７７号（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ他）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１６５】
本明細書中に提供される実施例７は、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー布地が機械的変形に対して応答性であること示す（表７を参照のこと）。したがって、本発明のＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地はまた、布地に加えられた機械的応力（圧力、張力、剪断、衝撃など）に対する応答においてそれらのコンダクタンスを変化させることができる布地または布地に基づく製造物を製造または作製するために使用することができる。そのような布地は、例えば、センサー、相互作用性衣類などを設計することにおいて有用であり得る。ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー布地が、さらなるパラメーター（例えば、水分（例えば、湿度）、温度など）に対して応答性であるように設計され得ることが理解される。
【０１６６】
１つの具体的な実施形態において、ＳＰ１およびキメラＳＰ１ポリペプチドは、カーボンナノチューブと結合させるために使用され、得られたＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体はその後、タイヤの物理的特性（例えば、電気伝導性および／または熱伝導性）および機能を高めるために、カーボンナノチューブをゴムタイヤへの取り込みのためにポリマー（例えば、アラミド（例えば、Ｋｅｖｌｅｒ（商標）など）に結合させるために使用される。
【０１６７】
本明細書中で使用される場合、表現「ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体」は、ＳＰ１ポリペプチドまたはキメラＳＰ１ポリペプチドを、例えば、実施例１および実施例３で詳しく記載されるように、少なくとも１つのカーボンナノチューブに結合して含む組成物を示す。本明細書中で使用される場合、表現「ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブポリマー複合体」は、ＳＰ１ポリペプチドまたはキメラＳＰ１ポリペプチドを、少なくとも１つのカーボンナノチューブに結合して、さらに、少なくとも１つのポリマー、ポリマー繊維またはポリマー布地に結合して含む組成物を示す。１つの実施形態において、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体は多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）を含む。別の実施形態において、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドが、ポリマー、ポリマー布地またはポリマー繊維に結合させられ、ＳＰ１−カーボンナノチューブが、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ−ポリマー複合体、ポリマー布地複合体またはポリマー繊維複合体を形成するために、ＳＰ１−ＣＢＤキメラポリペプチドを介してポリマー、ポリマー布地またはポリマー繊維に結合する。そのような複合体は他の物質（例えば、ヤーン、ウール、絹および綿など）から形成され得ることが理解される。
【０１６８】
したがって、特許請求されるような本発明の１つの局面によれば、少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を含む成分を有する空気タイヤまたはセミ空気タイヤが提供される。１つの実施形態において、タイヤ成分は、前記ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地とともに形成される複合エラストマー物質である。別の実施形態において、タイヤ成分は、例えば、トレッドの下側の強化ベルトにおけるように、複合エラストマー物質の層と、カーボンナノチューブ−ＳＰ１複合体化ポリマーの少なくとも１つの層とを含む。さらに別の実施形態において、タイヤ成分は、サイドウォール、キャップ／ベース構造様式のトレッドのトレッドベース、および、タイヤアペックスから選択される。
【０１６９】
カーボンナノチューブ複合体化ポリマーを、タイヤの任意の部分（例えば、トレッド、サイドウォール、内部ベルト、ビード、アペックスなど）の基礎マトリックス（例えば、ゴム）に組み込むことができる。ポリマー−マトリックス複合材を種々の様式でタイヤに組み込むことができる−タイヤの全要素をカーボンナノチューブ複合体化ポリマーから作製することができ、あるいは、ポリマー−マトリックス複合材をタイヤの基礎マトリックスの内側または外側の層としてタイヤに組み込むことができる。ポリマー−マトリックス複合材の組成は、タイヤまたはタイヤの一部分の所望される物理的特性に適するように変化させることができる。例えば、より薄いサイドウォール（これは道路表面と接触していない）を、伝導性がより低い、カーボンナノチューブ−ポリマーが少ないマトリックスから作製することが好都合であり得る。一方、より厚いトレッド、および／または、下に位置する強化ベルトを、カーボンナノチューブ−ポリマーの含有量が多いマトリックス複合材から構築し、これにより、道路−タイヤ境界でのより大きい熱伝導性および電気伝導性を与えることができる。タイヤにおける使用のために好適なアラミド−ゴム複合材およびアラミド−ゴム−カーボンブラック複合材を製造するための例示的な例が、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７３２９５号（Ｚａｎｚｉｇ他）に記載されるように、この技術分野では広く知られている。
【０１７０】
本発明のＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ−ポリマー複合体をタイヤマトリックスに組み込むことからもたらされる改善された熱伝導性および電気伝導性を有するタイヤ、具体的には、自動車用および航空機用のタイヤは、例えば、適切な電流をタイヤの導電性要素に加えることによって、従来のタイヤよりも効率的に加熱および冷却することができる。
【０１７１】
したがって、特許請求されるような本発明の１つの局面によれば、自動車用タイヤの電荷を変化させる方法であって、少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を含むサイドウォール、キャップ／ベース構造様式のトレッドのトレッドベース、および、タイヤアペックスのうちの少なくとも１つを有するタイヤを得ること、そして、電流を前記少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地に加え、それにより、前記自動車用タイヤの電荷を変化させることを含む方法が提供される。１つの実施形態において、タイヤの電荷を変化させることにより、タイヤの温度が上がる。１つの実施形態において、タイヤはリムまたはホィールに取り付けられ、タイヤの電荷を変化させることが、タイヤが静止している間に達成される。別の実施形態において、タイヤはホィールまたはリムに取り付けられ、電荷を変化させることが、タイヤが回転している間に達成される。電流を回転中にタイヤまたはタイヤ成分に提供するための方法がこの技術分野では広く知られており、これらには、例えば、ホィールを介した電気的接続、および、タイヤに埋め込まれるブラシ接点などが含まれる。
【０１７２】
タイヤまたはタイヤ成分の温度を変化させるためのそのような方法は、静止しているタイヤを使用のために準備することにおいて、例えば、レース用車輌のタイヤを車輌の加速期間中および運転期間中の最適な性能のための所望される温度に暖めることにおいて有用であり得る。タイヤ温度は、例えば、自動車レースおよびオートバイレースでは特に重要なパラメーターである。そのうえさらに、タイヤ温度は、航空機においては、特に飛行機の着陸装置のタイヤにおいては、タイヤが着陸時のそれらの使用の直前まで極めて低い温度にさらされる場合、非常に重要である。着地前の着陸装置のタイヤの効率的な均一かつ迅速な加温は、本発明の方法によれば、タイヤ性能の改善および重量要件の緩和をもたらすことができるだけでなく、タイヤ不具合からのより大きな安全性をもたらすかもしれない。飛行機用タイヤにおける温度制御もまた、飛行機の離陸時および地上走行時における性能および安全性を改善することにおいて好都合であり得る。
【０１７３】
ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、冷却効果を、電流を加えたとき、ペルチエ効果に従って提供するために設計され得ることが理解される。したがって、さらに別の実施形態において、タイヤの温度を変化させることは、タイヤを冷却することであり得る。
【０１７４】
したがって、少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を含むタイヤを有する車輌を高速化するための方法であって、電流を、前記少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地に与えて、その結果、前記タイヤの温度を所望される温度に変化させるようにすること、および、前記所望される温度のタイヤを有する前記車輌を高速化することを含む方法が提供される。
【０１７５】
特許請求されるような本発明のさらにさらなる実施形態には、静電気電荷蓄積を放電するための導電性経路を形成する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー要素、複合体化布地要素または複合体化ポリマー布地要素を有するタイヤ（そのようなタイヤの構造様式の詳細については、例えば、米国特許出願公開第２０１００７８１０３号（Ｎａｋａｍｕｒａ）、米国特許第７５２８１８６号（Ｈａｌａｓａ）、米国特許第７２８４５８３号（Ｄｈｅｕｒ他）および米国特許第７１３１４７４（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ）を参照のこと）、改善された熱伝導性および使用期間中の道路への熱移動を有する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー要素、複合体化布地要素または複合体化ポリマー布地要素を有するタイヤ（そのようなタイヤの構造様式および使用の詳細については、例えば、米国特許第７３３７８１５号（Ｓｐａｄｏｎｅ）を参照のこと）、タイヤの状況および性能に関する情報（例えば、タイヤ圧、変形、トレッドおよびサイドウォールの摩耗および不具合、転がり抵抗など）を、使用期間中において、静止時および運転中に伝えることができる少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー要素、複合体化布地要素または複合体化ポリマー布地要素を有するタイヤ（そのようなタイヤの構造様式および使用の詳細については、例えば、米国特許第７３１８４６４号（Ｈａｈｎ他）および米国特許第７５８１４３９号（Ｒｅｎｓｅｌ他）を参照のこと）、ならびに、カーボンナノチューブ−ＳＰ１複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地の導電性ストリップと、タイヤのトレッドおよび／またはサイドウォールに組み込まれるエネルギー発生成分（例えば、ピエゾセラミックまたは集熱材料など）とを有する電気エネルギー発生タイヤ（そのようなタイヤの構造様式および使用の詳細については、例えば、米国特許出願公開第２００７００２８９５８号（Ｒｅｔｔｉ）および米国特許出願公開第２００９０３１４４０４号（Ｒｏｄｇｅｒｓ他）を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
いくつかの適用において、導電性ポリマーを組み込む材料が、異方性の特性、すなわち、不均一な導電性、例えば、特定の方向における低下する導電性の勾配などを示すことが望ましい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、キメラＳＰ１ポリペプチドは可逆的または共有結合性の結合または分子会合により標的無機物質または化学的環境と相互作用する。本明細書中で使用される場合、表現「結合」または表現「分子会合」は、分子レベルで起こる化学的会合または物理的会合または両方を示す。例えば、結合または会合は、共有結合性の結合、非共有結合性の結合、疎水性相互作用などであることができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、キメラＳＰ１ポリペプチドは可逆的または共有結合性の結合または分子会合により標的無機物質または化学的環境と相互作用する。本明細書中で使用される場合、表現「結合」または表現「分子会合」は、分子レベルで起こる化学的会合または物理的会合または両方を示す。例えば、結合または会合は、共有結合性の結合、非共有結合性の結合、疎水性相互作用などが可能である。
【０１７９】
「可逆的会合」または「可逆的結合」は、本明細書中で定義される場合、具体的な条件に依存して、成分が元の会合前状態に戻ることができ、また、再会合することができる会合である。好ましくは、そのような会合および再会合はペプチド結合の形成および切断を含まない。例えば、本発明の改変ＳＰ１キメラポリペプチド−無機物質複合体の成分の可逆的結合は解離することができ、それにより、元の認識できる無機物質成分およびＳＰ１キメラ成分に戻ることができる。
【０１８０】
本発明における使用のために好適である可逆的な分子会合または結合のタイプは、静電結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用またはドナー／アクセプター結合からなる群から選択される会合である。可逆的会合が、物質と、ＳＰ１ポリペプチドとの間における１つまたは複数の会合によって媒介され得る。例えば、可逆的会合は、複合体形成物質と、ＳＰ１ポリペプチドとの間における水素結合およびイオン結合の組合せを含むことができる。加えて、または、代替において、可逆的会合は、例えば、成分間、例えば、物質と、ＳＰ１ポリペプチドまたはＳＰ１キメラポリペプチドとの間などの共有結合性または他の非共有結合性の相互作用との組合せが可能である。
【０１８１】
キメラＳＰ１ポリペプチド、および、キメラＳＰ１ポリペプチドを含む組成物は、結合した無機物質の溶媒中の分散を高めることが示されている。例えば、通常的には非常に不溶性のカーボンナノチューブが、キメラなカーボンナノチューブ結合性Ｌ１ ＳＰ１と複合体化されるとき、水性環境および有機環境の両方において最大で１０００倍大きい濃度を伴って分散することが見出された（本明細書中下記の実施例３および実施例４を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「分散」は、溶媒および溶質を含む溶液または懸濁物を形成するために、溶質またはコロイドが溶媒に均等に分布および／または溶解され得ることを示す。すべての溶質が理論上、すべての溶媒に可溶性であることが理解される。しかしながら、溶解性が不良または無視できるほどの（非混和性の）溶質またはコロイドは、所与の溶媒に関して、何ら著しい濃度の溶液または懸濁物を形成しない。
【０１８２】
したがって、本明細書中で使用される場合、「分散を高める」は、溶媒との溶液または懸濁物における、溶質またはコロイドとして前記物質の濃度を増大させることを示す。好ましい実施形態において、物質は、疎水性物質、典型的には水に不溶性または溶解性不良な疎水性物質であり、溶媒は水性溶媒である。
【０１８３】
煮沸、プロテアーゼ消化および極端なｐＨに対するキメラＳＰ１ポリペプチドオリゴマー複合体の安定性が、本明細書中下記の実施例２、実施例３および実施例４ならびに図２Ａ〜図２Ｂおよび図５Ａ〜図５Ｂに示される。Ｌ１−ＳＰ１キメラ体が溶液中でカーボンナノチューブと一緒にされ、何らかの遊離のＬ１ ＳＰ１および非結合のカーボンナノチューブを除くために洗浄およびろ過され、乾燥され、水性溶媒において再構成されたとき、Ｌ１−ＳＰ１と、カーボンナノチューブとの間の分子会合および複合体形成は、熱および高いｐＨのもとでさえ、カーボンナノチューブを水において非常に分散可能にした（本明細書中下記の実施例３を参照のこと）。さらに、キメラＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体は熱のもとで容易に乾燥され、貯蔵され、様々な溶媒（例えば、重合前のモノマー溶液など）において再構成され得る（本明細書中下記の実施例４を参照のこと）。
【０１８４】
標的無機物質と複合体化されたキメラＳＰ−１ポリペプチドは様々な方法でポリマーに加えることができる。いくつかの実施形態において、キメラＳＰ１および標的物質の複合体（例えば、Ｌ１−ＳＰ１−カーボンナノチューブ複合体）は大々的な超音波処理によって調製され、洗浄およびろ過され、限外ろ過透析によって濃縮される。得られる濃縮された複合体は凍結乾燥によって脱水されて微細な粉末にされ、その後、この粉末はモノマー溶液（例えば、エポキシ）と激しく混合され、その後、超音波処理され、分散されなかったＳＰ１−標的物質複合体を除くために遠心分離される。代替において、キメラＳＰ１および標的物質（例えば、カーボンナノチューブ）の複合体が大々的な超音波処理によって調製され、溶液がＮａＯＨによりアルカリ性ｐＨ（およそｐＨ１２）に調節され、−２０℃での５０％エタノールにおけるキメラＳＰ１−標的物質の沈殿化、遠心分離およびモノマー溶液との混合が、記載されるように行われる。モノマー溶液における分散された無機物質の濃度を、無機物質の懸濁に起因する光学濃度（透過率または吸光度）における変化によって、または、場合によっては、（キメラＳＰ１複合体の添加に起因する）懸濁物におけるタンパク質濃度の測定によって測定することができる。機能的パラメーターもまた評価することができる。
【０１８５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、無機物質結合性ペプチド成分を有する本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドと、標的無機物質とを含む組成物が提供される。そのような組成物は、いくつかの実施形態において、例えば、カーボンナノチューブに結合するＬ１ＳＰ１キメラ体（配列番号６）、ケイ素表面または二酸化ケイ素ビーズに結合するｍｔｂＳＰ（配列番号３）、および、炭素繊維に結合するＬ１ＳＰ１（配列番号６）などを含むことができる。キメラＳＰ１オリゴマーの二機能的および多機能的な性質を考慮すると、本発明のいくつかの組成物はさらに、さらなる分子または物質（例えば、ポリマーなど）を含むことができる。したがって、例えば、いくつかの実施形態による組成物は、キメラＳＰ１ポリペプチドまたはＳＰ１オリゴマーを、カーボンナノチューブに結合して、例えば、エポキシポリマーに分散されて含むことができる（本明細書中下記の実施例４を参照のこと）。重合前のキメラＳＰ１によるカーボンナノチューブのエポキシ溶液における優れたより均一な分散は、不透明性を伴うことなく、均等に分散された、ＣＮＴ密度が大きいカーボンナノチューブ改変エポキシポリマーをもたらす。そのような液状エポキシ−キメラＳＰ１−カーボンナノチューブ組成物は重合によって硬化させることができ、また、表面を被覆し、表面の物理的特性（例えば、伝導性）を変えるために使用することができ、成形品にし、所望される形状に注型し、仕上げすることなどができる。
【０１８６】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、改変されたＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第１の無機物質と、この改変されたＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第２の無機物質とを含む組成物であって、第１および第２の無機物質がＳＰ１ドデカマーの第１および第２の結合領域を介して複合体化される組成物が提供される。いくつかの実施形態において、改変ＳＰ１ポリペプチドは、異種の無機物質結合性ペプチドを含むキメラＳＰ１ポリペプチド（例えば、ｍｔｂＳＰ１、Ｌ１−ＳＰ１、Ｌ６−ＳＰ１およびＬ３−ＳＰ１など）である。さらなる実施形態において、改変ＳＰ１は非共有結合性の結合によって第１および第２の無機物質と複合体化される。さらに他の実施形態において、第１および／または第２の無機物質は共有結合性の結合によって改変ＳＰ１と複合体化される。
【０１８７】
本発明の組成物は、非同一のＳＰ１モノマーを含むヘテロ複合体ＳＰ１オリゴマー、あるいは、同一の改変ＳＰ１またはＳＰ１キメラ体を含むホモ複合体ＳＰ１オリゴマーを含むことができる。本発明のいくつかの実施形態において、第１の無機物質がカーボンナノチューブであり、第２の無機物質がポリマー繊維である。他の実施形態において、第１の結合領域がカーボンナノチューブ結合性領域（例えば、配列番号１０〜配列番号１３のいずれか）であり、第２の結合領域がケイ素結合性領域（例えば、配列番号５）である。
【０１８８】
ケイ素を含有する表面および／または粒子へのキメラｍｔｂＳＰ１ポリペプチドの結合を様々な条件で行うことができる。これは、ＳＰ１キメラ体が様々な過酷な条件（熱、極端なｐＨ、界面活性剤暴露およびプロテアーゼ暴露）における変性に対して非常に抵抗性であるからである。本発明のいくつかの実施形態によれば、結合が、ＮａＣｌおよびカオトロピック剤（例えば、３Ｍグアニジン塩酸塩）の存在下、中性または中性付近（ｐＨ６．５）のｐＨで行われる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドの機能を溶媒条件によって変えることができる。カオトロピック剤（例えば、ＧｕＨＣｌなど）への暴露は、ＳＰ１オリゴマーにおける立体配座の変化を生じさせることができ、これにより、無機結合性ペプチド成分の、それらの標的分子に対する結合アビディティーを高めることができる。カオトロピック剤のそのような効果は、例えば、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドの複合体形成の優れた特異性および使用の柔軟性をもたらす。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、キメラｍｔｂＳＰ１ポリペプチドオリゴマーのケイ素含有表面への特異的な結合がＧｕＨＣｌの存在によって促進される。したがって、本発明のいくつかの局面によれば、ＳＰ１ドデカマーまたはＳＰ１オリゴマーへの物質の結合を高める方法であって、当該物質をカオトロピック剤の存在下でＳＰ１オリゴマーまたはＳＰ１ドデカマーと接触させることを含む方法が提供される。本発明の方法との使用のために好適なカオトロピック剤の非網羅的列挙には、グアニジニウム塩酸塩、過塩素酸リチウムおよび尿素が含まれる。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、「カオトロピック剤」は、巨大分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）における三次元構造を破壊し、巨大分子を変性させる物質として定義される。
【０１９１】
キメラＳＰ１ポリペプチドはカオトロピック剤と一緒に提供され得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、所与の物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチドを含むＳＰ１ドデカマーを含む組成物であって、前記改変アミノ酸配列が、ＳＰ１ドデカマーの中央の空洞領域に対応する前記ＳＰ１ポリペプチドの領域に存在し、前記物質の前記結合がカオトロピック剤の存在下で高まり、組成物がさらにカオトロピック剤を含む、組成物が提供される。本明細書中に記載されるように、カオトロピック剤は改変ＳＰ１ドデカマーの結合特性についての制御をもたらし、また、ＳＰ１ドデカマーをカオトロピック剤と一緒に提供することにより、例えば、標的無機分子に対する非常に選択的な結合がもたらされる。例えば、キメラポリペプチドｍｔｂＳＰ１のドデカマーを、下記で記載されるように、より大きいケイ素結合アビディティーのためにＧｕＨＣｌ（６Ｍ）と混合することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列改変はＮｉ結合性Ｈｉｓタグを含まない。他の実施形態において、アミノ酸配列改変は、カオトロピック剤がグアニジニウム塩酸塩であるとき、Ｎｉ結合性Ｈｉｓタグを含まない。さらにさらなる実施形態において、アミノ酸配列改変はＮｉ結合性ペプチドを含まない。なおさらにさらなる実施形態において、アミノ酸改変はＨｉｓタグを含まない。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドおよびキメラＳＰ１−無機物質複合体は、任意の標的無機化合物の表面被覆、ならびに／または、キメラＳＰ１オリゴマーとの分子の結合および複合体化、導電性分子または半導体標的物質を使用するナノ回路網などのために、例えば、分子リンカーとして有用であり得る。いくつかの実施形態において、本発明のキメラＳＰ１ポリペプチドまたはキメラＳＰ１−標的物質複合体は導電性デバイス（例えば、電子デバイスなど）の成分として組み込むことができる。
【０１９４】
したがって、本発明は、その実施形態のいくつかおよびそれらの組合せを通して、無機物質（例えば、カーボンナノチューブなど）の、他の物質（例えば、ポリマー樹脂など）における分散をもたらすことによって、また、一方または両方の物質が、複合材料を形成するために、化学反応を過酷な条件のもとでさえ受けることを可能にすることによって、新しい複合材料を形成し、また、知られている複合材料の製造を改善する可能性を提供する。ＳＰ１変化体は、依然として分散物質に結合したままでありながら、ほとんどの過酷な反応条件に耐えることができ、それにより、樹脂におけるその分散性を高め、一方で、樹脂は重合反応を受け、硬化して、繊維、ヤーン、ストリップまたはフィルムを形成する。
【０１９５】
例えば、分散用媒体（樹脂）は液体状態の熱硬化性ポリマーである。例示的な熱硬化性ポリマーには、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、芳香族ポリアミド（アラミド）樹脂（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標）など）、ビスマレイミド樹脂、トリアジン樹脂、ポリイミドおよびポリメタクリル酸メチルが含まれるが、これらに限定されない。他の試薬、硬化剤およびコポリマーが、脂肪族アミン、脂肪族環式アミン、芳香族アミン、ポリアミド、酸無水物、第三級アミンおよびそれらの組合せからなる群から選択され、それらは最終的には、液体状態の熱硬化性ポリマーを固化させるプロセスを加速させるために使用される。
【０１９６】
他の複合材料改変試薬には、ポリスルフィド系ゴム、ポリアミド樹脂、アクリロニトリルゴムおよびそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されず、それらは最終的には、液体状態の熱硬化性ポリマーの性質を改善するために使用される。
【０１９７】
複合材料の化学的特性および機械的特性を同様に改変する例示的な希釈剤には、ジグリシジルエーテル、ポリグリシジルエーテル、ブチルエポキシプロピルエーテル６６０、アリルフェノールおよびそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
フィラー試薬（これにより、機能性が複合材料に加えられる）が、アスベスト繊維、ガラス繊維、石英粉末、酸化アルミニウムおよびそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択され、それらは最終的には、例えば、液体状態の熱硬化性ポリマーの熱消散を改善するために使用される。
【０１９９】
複合材料を、ＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体を使用して調製する方法には、限定されないが、ＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体を、カーボンナノチューブ複合材を形成するために十分な条件のもとでポリマーと接触させることが含まれ、ただし、この場合、ポリマーがＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体上に堆積させられる。１つの実施形態において、ポリマーが、溶液を形成するために溶媒に溶解され、ＳＰ１変化体−カーボンナノチューブと結合した基体が、ポリマー被覆されたナノ複合材料を形成するために溶液に浸けられる。使用される溶媒は、水、一般的な有機溶媒またはそれらの混合物が可能である。限定されない例示的な有機溶媒には、極性があまりない炭化水素溶媒、例えば、ペンタン系溶媒、ヘキサン系溶媒、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエンなど；ならびに極性溶媒、例えば、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトンおよび四塩化炭素などが含まれる。別の実施形態において、ＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体はポリマーと機械的にブレンド混合される。さらに別の実施形態において、ＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体は溶融加工条件のもとでポリマーと混合される。様々な技術がナノ複合材料の形成のために好適である。これらには、射出成形、押出し、ブロー成形、熱成形、回転成形、注型およびカプセル封入およびカレンダー加工が含まれる。溶融加工において使用されるポリマーは好ましくは、熱可塑性ポリマーである。なおさらに別の実施形態において、複合材は、重合をＳＰ１変化体−カーボンナノチューブ複合体の存在下で行うことによって形成される。
【０２００】
天然に存在するポリマーと、合成ポリマーおよび／または合成コポリマーとはともに、カーボンナノチューブ複合材を調製するために使用することができる。天然に存在するポリマーには、天然ゴム、タンパク質、炭水化物、核酸が含まれるが、これらに限定されない。合成ポリマーには、縮合ポリマーおよび付加ポリマーが含まれ、これらは熱可塑性ポリマーまたは熱硬化ポリマーのどちらでも可能である。熱可塑性の縮合ポリマーには、ポリスルホン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリフェニレンオキシド、ポリスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド−イミド、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアリラートおよび液晶ポリエステルが含まれるが、これらに限定されない。限定されない例示的な熱可塑性ポリオレフィンには、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルエーテル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（フッ化ビニリデン）およびポリ（フッ化ビニル）が含まれる。
【０２０１】
キメラＳＰ１変化体は、一度に２つ以上の物質と、例えば、ケイ素およびＣＮＴ／グラファイト、または、金およびＣＮＴ／グラファイトなどと相互作用および結合するように設計されるので、これらの変化体は、結合した物質の一方または両方のタイプに由来する制御可能な導電性および半導電性を同様に有する複合材料を形成するための基礎として役立ち得る。そのような複合材料は、ミクロ電子工学分野における様々な適用のために使用することができる。
【０２０２】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連する改変されたＳＰ１タンパク質を含む組成物および方法並びにそれらの用途が開発されることが予想され、本発明の改変されたＳＰ１タンパク質の用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０２０３】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２０４】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０２０５】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０２０６】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２０７】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２０８】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２０９】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２１０】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２１１】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２１２】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２１３】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【０２１４】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２１５】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２１６】
一般的な実験概念
下記に示される研究では、ＳＰ１変化体の結合特性（すなわち、様々な基体に対するＳＰ１変化体の親和性およびアビディティー）を変化させ、また、様々な表面におけるＳＰ１の固定化を制御するための２つの戦略が明らかにされる。親和性およびアビディティーは、非共有結合性相互作用の強さ、すなわち、特定の原子または分子が凝集または結合しやすい現象を記述するためにタンパク質生化学において使用される２つの用語である。
【０２１７】
用語「親和性」は、ただ１つだけの結合の強さを記述するために使用され、一方、用語「アビディティー」は、多重結合相互作用の親和性の総合強さを記述するために使用される。解離定数（Ｋｄ）または平衡定数は親和性定数の逆数であり、複合体がその成分分子にばらばらになるとき、または、塩がその成分イオンに解離するときのように、より大きい物体がより小さい成分に可逆的に分離（解離）する傾向を見積もる。解離定数は通常、Ｋｄとして示され、親和性定数の逆数である。塩の特別な場合には、解離定数はまた、イオン化定数と呼ぶことができる。
【０２１８】
第１の戦略では、例えば、システイン残基に見出されるなどの固定用側鎖をドデカマータンパク質のリングの縁に配置し、得られる構築物の結合特性を、環形（リングの細孔または「穴」）の内側に配置される固定用側鎖を有するタンパク質構築物の結合特性と比較することを伴う。この戦略では、ＳＰ１の基本構造がその表面における特定の領域およびそれにおいて固定されるリガンドを表面暴露から保護できるかが明らかにされる。
【０２１９】
第２の戦略では、いくつかの結合性成分が遺伝子工学によってタンパク質の環形の内側細孔においてＳＰ１ドデカマータンパク質に取り付けられる。これらの特異的親和性ペプチドをタンパク質の推定的な保護された部分に融合することによって、これらの結合性成分が、タンパク質の細孔から排除される大きい実体との結合のためにはあまり利用されないことが予想される。この実験戦略は、タンパク質の媒体の条件を変化させることの影響を調べるために、また、ＳＰ１モノマーの構造、したがって、ドデカマー全体の構造に影響を与え得る媒体に対する因子を入れることにより、媒体への結合性成分の露出度が制御され得ることを示すために設計される。したがって、構造変化因子（例えば、変性剤など）を加えることの結果は、結合性成分が媒体中で大きい実体と相互作用し、また、結合する能力を増大させ得る。化学的因子の添加および除去によって非結合性実体から結合性実体に切り替わる能力は化学的スイッチを構成する。
【０２２０】
化学的スイッチの概念が、いくつかの特異的親和性ペプチド（例えば、ケイ素結合性ペプチドなど）を内側の細孔位置においてＳＰ１基本骨格のそれぞれに融合して、それにより、変性剤（例えば、グアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）など）の媒体中レベルに対して敏感であるケイ素結合性タンパク質スイッチを得ることによって明らかにされた。親和性ペプチドが、ペプチド−ファージ・ディスプレー・システムを使用して、Ｓａｎｏおよび共同研究者らによって単離された［Ｓａｎｏ，Ｋ．Ｉ．他、ＪＡＣＳ、１２５、１４２３４頁〜１４２３５頁、２００３；Ｓａｎｏ，Ｋ．Ｉ．他、ＪＡＣＳ、１２８、１７１７頁〜１７２２頁、２００６；およびＳａｎｏ，Ｋ．Ｉ．他、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、７、３２００頁〜３２０２頁、２００７］。この６アミノ酸ペプチド（これは本明細書中およびこの技術分野ではｍＴＢＰとして示される）は、Ｔｉ、ＡｇおよびＳｉの表面に結合するが、Ａｕ、Ｃｒ、Ｐｔ、Ｓｎ、Ｚｎ、ＣｕまたはＦｅには結合しないことがＳａｎｏおよび共同研究者らによって報告された。
【０２２１】
したがって、ＳＰ１足場が、１２コピーのｍＴＢＰヘキサペプチドを切換え可能な様式で呈示するように改変された。正の協同効果が、遊離ペプチドと比較した場合、ペプチドがＳＰ１ドデカマー上に呈示されるときに明らかにされ、これには、遊離ペプチドの非特異的結合と比較して、融合ペプチドの非特異的結合における著しい低下が付随している。
【０２２２】
様々な材料に対する大きい親和性を有するＳＰ１変化体の構築
国際公開ＷＯ２００７／００７３２５は、Ｓａｒｉｋａｙａ他［Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、２００４、３４、３７３〜４０８］から改編された、無機のイオン性物質との複合体を形成するペプチドの限定されない列挙を提供する。これらの比較的短いペプチドは、ＳＰ１ポリペプチドの改変の一部としてのＳＰ１タンパク質への融合のために好適である。種々の材料に対する大きい親和性を有するペプチドのさらに多くの例が文献には開示される。
【０２２３】
表３は、これに関連して使用されるＳＰ１変化体、それらの結合能、それらの構築、変異またはＮ末端での挿入のために使用されるプライマー、ＳＰ１テンプレート、参考文献および成長条件／誘導を示す。すべての変異型タンパク質が、熱安定性、プロテアーゼ抵抗性および複合体形成に関して野生型ＳＰ１と類似する特徴を明らかにした。変異の標準的命名法が使用される：すなわち、最初のメチオニン残基を含む野生型配列を使用するアミノ酸位置。
【０２２４】

【０２２５】
Ｌ８１Ｃ ＳＰ１（配列番号２）変化体が封入体ＩＢとして発現される。ＩＢを最初にＩＢ洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ８）により１５分間洗浄し、次いで、１４０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを変性緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）、６Ｍ尿素、１０ｍＭジチオスレイトール）に再懸濁し、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。その後、変性させたタンパク質を、２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７）、１ｍＭ ＤＴＴに対する透析によって４日間リフォールディングした。
【０２２６】
金表面へのＳＰ１変化体の結合
システインアミノ酸を介するタンパク質の金標識化は、広く知られている技術である。そのＮ末端が欠失されたＳＰ１変化体を、Ｎ末端からの妨害を防止するために使用した（ΔＮＳＰ１、配列番号６４）。システイン残基を中央空洞または縁のどちらかでタンパク質に導入した（表１を参照のこと）（それぞれ、Ｍ４３ＣおよびＬ８１Ｃ）。超平坦な金表面に対するこれら２つの変異体の結合親和性を動的モードの原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）トポグラフィー画像化（Ｄｕｌｃｉｎｅａ顕微鏡、ＮａｎｏＴｅｃ、Ｍａｄｒｉｄ）によって求め、フラッディング画像分析技術を使用して、新しい変異体の表面被覆率を求めた。
【０２２７】
ケイ素酸化物表面へのＳＰ１変化体の結合
Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１のＮ末端へのケイ素結合性ペプチド（ＲＫＬＰＤＡＡ、配列番号５、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．、２００７、６、１５７９〜１５７９）の融合により、変化体ｍｔｂＳＰ１（配列番号３）がもたらされる（表１および表２を参照のこと）。ｍｔｂＳＰシリカ結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、本明細書中下記で議論されるが、ｍｔｂＳＰ１変化体がシリカビーズに結合し、一方、野生型ＳＰ１は結合しないことを示した。１２コピーのこれらのペプチドの、ＳＰ１のＮ末端への融合は、融合された結合性ペプチドが露出し、基体に接近可能であるならば、より大きい結合アビディティーの結果として、遊離ペプチドと比較した場合、より大きい結合能をもたらすことが予想された。ＧｕＨＣｌ、すなわち、カオトロピック剤（タンパク質変性剤）は、非常に安定なＳＰ１複合体のＮ末端への一定の柔軟性を可能にし、結果的には、ケイ素結合性ペプチドを露出させ、それにより、シリカへのその結合を容易にすることが示唆された。ｍｔｂＳＰおよび遊離ペプチドの両方についての見かけの解離定数を本明細書中下記で示されるように求めた。ｍｔｂＳＰ１変化体は、本明細書中下記で示されるように、遊離ペプチド（８６μＭ）よりもはるかに低いＫｄ値（０．３μＭ）を明らかにした。このことは、このペプチドがＳＰ１足場に呈示されるとき、シリカに対するその親和性が２桁〜３桁増大することを意味する。
【０２２８】
ＳＰ１変化体によるカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）分散
下記に示される実施例は、ＣＮＴに結合することができ、それにより、これらのタンパク質被覆ＣＮＴの水性分散を可能にするＣＮＴ結合性ペプチドに融合されるＳＰ１変化体を提供する。ＣＮＴ結合性ペプチドとしてファージ・ディスプレー・ライブラリーから単離された短いペプチドのいくつかの例が文献には開示される。例えば、Ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３、２、１９６；Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ．、２００６、６、４０〜４４；およびＬａｎｇｍｕｉｒ、２００４、２０、８９３９〜８９４１を参照のこと。
【０２２９】
ＣＮＴ分散実験のために使用された、Ｎ末端融合を有するＳＰ１変化体のプラスミド構築物、発現および産生が、上記の表１に記載される。
【０２３０】
下記の表４は、これらの変化体の末端配列、同様にまた、それらの精製方法および精製段階、アルカラーゼによる消化に対するＮ末端感受性、ならびに、ＣＮＴ分散のために要求されるＳＰ１変化体濃度を示す。すべての変異型タンパク質が、熱安定性、プロテアーゼ抵抗性および複合体形成に関して野生型ＳＰ１と類似する特徴を明らかにした。アルカラーゼで処理されなかったサンプルと比較して分子量における変化が、ＳＤＳゲル適用緩衝液における非煮沸サンプルおよび煮沸サンプルの両方において認められた（それぞれ、複合体およびモノマー）。すべての場合において、アルカラーゼ処理されたＳＰ１変化体の見かけ分子量が野生型の分子量よりも大きかった。このことは、付加アミノ酸のすべてではないが、その一部が除かれたこと、そして、それらは、発表された配列とは異なることを示している。
【０２３１】

【０２３２】
驚くべきことに、アルカラーゼによる処理およびＮ末端の部分的消化はそのＣＮＴ分散能を低下させない。これは恐らくは、それぞれの複合体において、すべてのＮ末端が消化されるとは限らず、また、Ｌ１変化体（配列番号６）複合体が二重のバンドとして現れるためである。例えば、アルカラーゼ処理されたＬ１−ＳＰ１のＮ末端配列決定およびＭＡＬＤＹ−ＴＯＦ分析では、８アミノ酸がプロテアーゼによって消化されたこと、および、Ｎ末端がＳＮＱＳであったが、消化はそのＣＮＴ分散能を低下させていないことが明らかにされた。この結論と一致して、ＳＰ１のＮ末端へのＳＮＱＳペプチドの挿入により、より低いＣＮＴ分散活性を有する、すなわち、Ｌ１（配列番号６）よりも低いＣＮＴ分散活性を有する変化体Ｌ６（配列番号１５）がもたらされる（それぞれ、５０〜１００μｇ／ｍｌ対４μｇ／ｍｌ）。
【０２３３】
ＳＰ１変化体、ＣＮＴおよびアラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））またはエポキシ樹脂の三元複合体
ＣＮＴを他の媒体（例えば、エポキシ樹脂など）に分散し、先進材料（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標）など）に結合する本発明の実施形態のＳＰ１変化体の能力が、本明細書中下記で詳しく示されるように研究され、明らかにされた。
【０２３４】
ＳＰ１変化体を、Ｎ末端を介してＣＮＴと結合して、ＳＰ１／ＣＮＴ複合体を形成することができ、その結果として、このＳＰ１／ＣＮＴ複合体は、露出した第一級アミンを介してエポキシ樹脂に結合することができる多機能性試薬としてのその能力について調べた。そのような試薬は、エポキシ樹脂における分散を含めて、ＣＮＴとの水界面を伴う多くの実用的適用において非常に有用であり得る。水および他の媒介溶媒は限外ろ過および凍結乾燥の組合せによって除くことができる一方で、これらのプロセスはエネルギー消費型であり、制御することが困難である。本明細書中に示されるプロセスは、ＳＰ１が、−２０℃での２時間のインキュベーションの後、７０％〜８０％のエタノールの存在下で沈殿すること、また、ＣＮＴタンパク質複合体もまた同様に沈殿するという事実を利用する。沈殿したＳＰ１／ＣＮＴ複合体は水に容易に分散させることができる。凍結乾燥された沈殿ＳＰ１／ＣＮＴ複合体は、下記で明らかにされるように、エポキシ樹脂に分散させることができる（実施例４を参照のこと）。
【０２３５】
加えて、ＣＮＴおよびアラミド（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標）、ＤｕＰｏｎｔによって開発され、防弾チョッキ、タイヤおよび光ファイバーケーブルなどにおいて使用される強靱な耐熱性アラミド繊維の商品名）が同様な様式でＳＰ１変化体に結合するならば、タンパク質が、結合性部位を環形の両側に示すＳＰ１の両側のドーナッツ形状に基づいて、これら２つの成分の相互接着を促進させるための接着性メディエーターとして働くかもしれないことが仮定された。
【０２３６】
材料および方法
細菌株および培養条件：
大腸菌株ＤＨ５αをクローニングのために使用し、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現のために使用した。細胞の成長を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ΔＮＳＰ１、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１およびＬ８１ＣΔＮＳＰ１）、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（Ｌ１−ＳＰ１、Ｌ２−ＳＰ１、Ｌ３−ＳＰ１、Ｌ６−ＳＰ１）、あるいは、交換可能であるが、ＬｕｒｉａブロスまたはＴｅｒｒｉｆｃブロスのどちらか（天然ＳＰ１、ｍｔｂＳＰ１）のいずれかにおいて３７℃で行った（２８℃で成長したＬ１−ＳＰ１を除く）。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導（天然ＳＰ１、ｍｔｂＳＰ１、ΔＮＳＰ１、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１、Ｌ１−ＳＰ１およびＬ６−ＳＰ１については１ｍＭ、Ｌ３−ＳＰ１については０．５ｍＭ、Ｌ２−ＳＰ１については０．１ｍＭ）の後、細菌をさらに４時間成長させ、その後、１４０００Ｘｇでの１５分間の遠心分離によって集めた。
【０２３７】
ベクター構築：
Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１変異体およびＬ８１ＣΔＮＳＰ１変異体の両方を、ΔＮＳＰ１コード配列（配列番号７）テンプレート（これはＭｅｄａｌｓｙ他［Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ．、８、４７３〜４７７、２００８］によって以前に記載された）に対する部位特異的変異誘発を使用して構築した。この部位特異的変異誘発は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤｅｅｐ−ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）プロトコルに従って行われた。
【０２３８】
部位特異的変異誘発のために使用されるプライマーは、Ｍ４３ＣについてはＣ４３（５’ＣＴＧＣＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＡＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＧＧＣＡＣＧ３’）（配列番号６５）であり、Ｌ８１ＣについてはＣ８１（５’ＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧ３’）（配列番号６６）であった。
【０２３９】
ｍｔｂＳＰ１変異体（配列番号３）を、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１のコード配列（配列番号６９）をテンプレートとして、下記の２つのプライマーを使用して構築した：ｍＴＢフォワードプライマー（５’ＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＧ−３’）（配列番号６７）およびＳＰ１リバースプライマー（５’−ＡＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＡＡＣ−３’）（配列番号６８）。
【０２４０】
Ｌ１−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号６）を、天然ＳＰ１のコード配列（配列番号２８）をテンプレートとして、下記のプライマーを使用して構築した：フォワードプライマー（５’ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧ３’）（配列番号７０）およびリバースプライマー（５’ＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＧＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴ３’）（配列番号７１）。
【０２４１】
Ｌ２−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１４）を、天然ＳＰ１のコード配列（配列番号２８）をテンプレートとして、下記のプライマーを使用して構築した：フォワードプライマー（５’ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣ３’）（配列番号７２）およびリバースプライマー（５’ＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴ３’）（配列番号７３）。
【０２４２】
Ｌ３−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１２）を、天然ＳＰ１のコード配列（配列番号２８）をテンプレートとして、下記のプライマーを使用して構築した：フォワードプライマー（５’ＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣ３’）（配列番号７４）およびリバースプライマー（５’ＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴ３’）（配列番号７５）。
【０２４３】
Ｌ６−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１５）を、天然ＳＰ１のコード配列（配列番号２８）をテンプレートとして、下記のプライマーを使用して構築した：フォワードプライマー（５’ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣ３’）（配列番号７６）およびリバースプライマー（５’ＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴ３’）（配列番号７７）。
【０２４４】
Ｌ７−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１６）は、コドン使用法を改善するために、５Ｉｌｅにおいてａｔａからａｔｔへの、また、６Ａｒｇにおいてｃｇａからｃｇｔへの、挿入ペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異を除いて、Ｌ１−ＳＰ１ＣＮＴ配列と同一である。この変異型ポリペプチドを、“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の“ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”を使用して、下記のプライマーを使用して構築した：Ａ２４Ｔ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号７８）およびリバースプライマー（５’−ＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号７９）。Ａ２７Ｔ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣ−３’）（配列番号８０）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣ−３’）（配列番号８１）。
【０２４５】
Ｌ４−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号９）は、挿入ペプチドのＲ２３Ｋの変異を除いて、Ｌ１−ＳＰ１ＣＮＴ配列と同一である。この変異型ポリペプチドを、“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の“ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”を使用して、下記のプライマーを使用して構築した：Ｒ２３Ｋ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＴＧＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＣＡ−３’）（配列番号８２）およびリバースプライマー（５’−ＴＧＴＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＣＡ−３’）（配列番号８３）。
【０２４６】
Ｌ５−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１７）は、挿入ペプチドのＴ２２Ｃの変異を除いて、Ｌ１−ＳＰ１ＣＮＴ配列と同一である。この変異型ポリペプチドを、“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の“ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”を使用して、下記のプライマーを使用して構築した：Ｔ２２Ｃ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴＡＣ−３’）（配列番号８４）およびリバースプライマー（５’−ＧＴＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴ−３’）（配列番号８５）。
【０２４７】
Ｌ８−ＳＰ１ＣＮＴ変異体（配列番号１８）は、コドン使用法を改善するために、５Ｉｌｅにおいてａｔａからａｔｔへの、また、６Ａｒｇにおいてｃｇａからｃｇｔへの、挿入ペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異を除いて、Ｌ４−ＳＰ１ＣＮＴ配列と同一である。この変異型ポリペプチドを、“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ”（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の“ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”を使用して、下記のプライマーを使用して構築した：Ａ２４Ｔ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号７８）およびリバースプライマー（５’−ＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号７９）。Ａ２７Ｔ変異体について、フォワードプライマー（５’−ＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣ−３’）（配列番号８０）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣ−３’）（配列番号８１）。
【０２４８】
野生型ＳＰ１をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した（５’−ＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号７８）およびリバースプライマー（５’−ＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号７９）、また、天然ＳＰ１のコード配列（配列番号２８）をテンプレートとした。
【０２４９】
すべての構築物がｐＥＴ２９ａ発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）に挿入された。
【０２５０】
タンパク質の精製およびリフォールディング：
遠心分離後、細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＬ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８）に再懸濁し、パルス的バーストにより数分間、氷上で超音波処理した。変化体が可溶性タンパク質として発現され［ｍｔｂＳＰ（配列番号３）、Ｌ１−ＳＰ１（配列番号６）、Ｌ６−ＳＰ１（配列番号１５）］、または、封入体に凝集された［Ｌ２ ＳＰ１（配列番号１４）およびＬ３−ＳＰ１（配列番号８）］。
【０２５１】
不溶性ペレットを１４０００Ｘｇでの１５分間の遠心分離によって分離した。その後、可溶性の変異タンパク質（Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１およびｍｔｂＳＰ１；Ｌ１−ＳＰ１；Ｌ２−ＳＰ１；Ｌ３−ＳＰ１；Ｌ６−ＳＰ１）を８５℃で３０分間熱処理し、プロテアーゼによって処理した（アルカラーゼ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ、１０^６倍希釈：３０分、４０℃）。
【０２５２】
Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）変異体の封入体を最初、ＩＢ洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣＬ、２ｍＭ尿素、ｐＨ８）により１５分間洗浄し、その後、１４０００Ｘｇで１５分間遠心分離した。ペレットを変性緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、６Ｍ尿素、１０ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ８）に再懸濁し、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。その後、変性させたタンパク質をフォールディング緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７）に対する透析によって４日間リフォールディングした。
【０２５３】
イオン交換ＦＰＬＣ：
Ｈｉｔｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬカラム（１ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）を使用して、タンパク質を精製した。サンプルを、２０ｍＭピペラジン（ｐＨ６．３）緩衝液を３ｍｌ／分の流速を使用してカラムに負荷した。溶出を、同じ緩衝液における１Ｍ ＮａＣｌのグラジエントにより行い、２７％〜３３％の塩において特定した。
【０２５４】
ｍＴＢＰ付属体ペプチド：
ｍＴＢＰペプチド（配列番号５）がＢｉｏＳｉｇｈｔ ｌｔｄ．（Ｋａｒｍｉｅｌ、イスラエル）によって合成的に製造された。
【０２５５】
変異タンパク質の安定性特徴づけ：
３つの異なる安定性分析を野生型ＳＰ１（配列番号４）およびそれぞれの変異タンパク質に対して行った。
１．熱処理（Ｈ．Ｔ）、８０℃で３０分間；
２．煮沸処理（Ｂ．Ｔ．）、１００℃で３０分間；および
３．プロテイナーゼＫ（ＰＫ）によるタンパク質分解に対する抵抗性、酵素の５０ｕｇ／ｍｌの濃度において３７℃で１時間。ＰＫが５分間のＢ．Ｔ．によって除かれた。
【０２５６】
代替において、アルカラーゼが、安定性を求めるために使用された：アルカラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ、１：１０００の希釈）を４０℃で３０分間加えた。反応を、アルカラーゼを８０℃で３０分間阻害することによって停止させた。
【０２５７】
すべての処理物は、処理後、１４０００Ｘｇで１５分間遠心分離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０２５８】
シリカ結合：
ｍｔｂＳＰ１（配列番号３）を、３ＭのＧｕＨＣｌとともに、または、伴うことなく、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌにおいて１０ｍｇのシリカゲル（製造物番号：２８８６０−８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）と混合した。その後、溶液を室温において回転式振とう機で１時間インキュベーションした。その後、シリカを、ＧｕＨＣｌを含まない同じ緩衝液により３回洗浄した。結合したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるか、または、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、米国）を使用してタンパク質濃度を測定することによるかのどちらかによって分析した。
【０２５９】
表面の調製および結合：
ケイ素表面（０．５ｃｍ^２）を７５℃の加熱イソプロパノールとともに２０分間超音波処理し、３回蒸留水により洗浄し、乾燥窒素により乾燥した。処理された表面を３分間プラズマ清浄化し（Ｆｅｍｔｏ Ｉｎｃ．、Ｊｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）、その後、サンプルを置いた。３ＭのＧｕＨＣｌを伴うか、または伴わない、６．５のｐＨのＭＥＳ緩衝液における約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質の最終濃度における５μｌのタンパク質サンプルを表面に２０秒間置き、その後、３回蒸留水により静かに洗浄し、乾燥窒素により乾燥した。
【０２６０】
平坦の金表面の調製手順：金を蒸発させて、１００ｎｍの層を劈開雲母の上に０．５Å／秒の速度で形成させ、その後、５ｎｍのチタンを、５ｅ−７ｔｏｒｒを超える真空度において２Å／秒の速度で堆積させる。蒸着サンプルをホットプレートの上で１０分間〜１５分間加熱し、１５μｌのエポキシ接着剤（３０１−２Ｅｐｏｔｅｃｈ、Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ、米国）を使用して、蒸着させた金をガラス表面に接着し、その後、８５℃で３．５時間加熱し、続いて、一晩冷却する。使用前に、エポキシ層を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（９９％純度、Ｆｒｕｔａｒｏｍ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）を使用して裂き、これにより、清浄な平坦な金表面を残す。６．５のｐＨでのＭＥＳ緩衝液における約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質の最終濃度における５μｌのサンプルを平坦な金表面に２０秒間置き、３回蒸留水により静かに洗浄し、窒素乾燥する。
【０２６１】
ＳＰ１／ＣＮＴ結合：
アラミドへのＳＰ１／ＣＮＴ結合を、３つの方法を使用して評価した：
１．布地へのその結合の前後における溶液（懸濁物）中のＣＮＴ含有量の差の測定。懸濁物のＣＮＴ含有量が、ＳＰ１／ＣＮＴを、（洗浄溶液と組み合わされる）布地とのそのインキュベーションの前後において、グアニジニウム塩酸塩（１００ｍＭ）またはＨＣｌ（０．３％）を使用して懸濁物のサンプルから沈殿させ、ペレット化されたＣＮＴを乾燥し、重量測定することによって求められる；
２．分光法：ＣＮＴ含有量を、分光学的方法を使用して、すなわち、走査型電子顕微鏡下での高分解能（ＨＲ−ＳＥＭ）における、ＣＮＴによって被覆される布地または表面の可視化による光透過率を使用して評価することができる；および
３．表面抵抗率−被覆された布地または表面のＣＮＴ含有量を、電流の流れに対する表面抵抗率を測定することによって評価することができる（この方法は、非処理布地が絶縁体または非常に不良な導体である場合にだけ関連性がある）。
【０２６２】
実施例１
ＳＰ１変異体の金標識化
タンパク質の金標識化を、システイン側鎖を介して達成することができる。しかしながら、野生型ＳＰ１（天然ＳＰ１）（配列番号４）はシステインアミノ酸をそのペプチド配列に有しておらず、したがって、平坦な金表面へのシステイン置換ＳＰ１タンパク質の結合を試験することによって、折り畳まれたオリゴマータンパク質構造における特定の領域の重要性を調べることができ、また、それらの利用可能性を決定することができる。その目的のために、２つの異なるＳＰ１変異体を、標準的な部位特異的変異誘発技術を使用して構築した。第１の変異体において、タンパク質の内側のリング（細孔）に位置するメチオニン４３をシステインにより置換した（変異体名：Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１、配列番号１）。第２の変異体において、タンパク質の外縁に位置するロイシン８１をシステインにより置換した（変異体名：Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１、配列番号２）。
【０２６３】
図１Ａ〜図１Ｂは、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１変異体（配列番号１）およびＬ８１ＣΔＮＳＰ１変異体（配列番号２）のコンピューター生成表示であり、図１Ａは、タンパク質の内側のリングまたは細孔におけるチオール基を示すＭ４３ＣΔＮＳＰ１変異体を示し、図１Ｂは、タンパク質の外縁におけるチオール基を示すＬ８１ＣΔＮＳＰ１変異体を示す。
【０２６４】
図１Ａ〜図１Ｂにおいて認められ得るように、Ｍ４３Ｃ変異体におけるシステイン残基（矢印）は内側の細孔に向き、一方、Ｌ８１Ｃ変異体におけるシステイン残基（矢印）はリング構造の縁から外の方を指す。
【０２６５】
これら２つの変異体を大腸菌から発現および精製した。これら２つの変異体は、熱安定性、プロテアーゼ抵抗性および複合体形成に関して天然ＳＰ１と類似する特徴を明らかにした（表１）。
【０２６６】
図２Ａ〜図２Ｂは、Ｍ４３Ｃ ＳＰ１変異体およびＬ８１Ｃ ＳＰ１変異体の発現実験および安定性実験のために行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動の写真である。図２Ａは、Ｍ４３Ｃ ＳＰ１画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で、ＩＰＴＧ誘導前およびＩＰＴＧ誘導後の総細菌タンパク質からのもの（図２Ａ、それぞれ、レーン１〜２、ＳＰ１モノマーのバンドが実線により囲まれる）、煮沸を伴わない細菌可溶性画分からのもの（図２Ａ、レーン３、オリゴマードデカマーのバンドが点線により囲まれる）および煮沸後の細菌可溶性画分からのもの（図２Ａ、レーン４、モノマーのバンドが実線により囲まれる）を示す。図２Ａ、レーン５は、細菌の封入体から得られるタンパク質を示す。図２Ａ、レーン６およびレーン７は、８５℃で３０分間の熱処理の後での細菌可溶性画分から得られるタンパク質で、煮沸されたタンパク質（レーン７）および煮沸されないタンパク質（レーン６）を示す。図２Ａ、レーン８〜レーン１２は、精製タンパク質で、煮沸されたタンパク質（レーン９）および煮沸されないタンパク質（レーン８）、ならびに、安定性アッセイ：８５℃（レーン１０）、１００℃（レーン１１）およびプロテイナーゼｋ（レーン１２）にさらされたサンプルを示す。図２ＢはＬ８１Ｃ ＳＰの分析を示す：レーン１〜レーン５におけるサンプルは、図２Ａに示されるレーン１〜レーン５におけるサンプルと同じ条件にさらされた；煮沸および非煮沸のリフォールディングされたタンパク質（それぞれ、レーン６およびレーン７）；レーン８〜レーン１２におけるサンプルは、図２Ａに示されるレーン８〜レーン１２におけるサンプルと同じ条件にさらされた（ｋＤａ単位でのＭＷ）。
【０２６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図２Ａおよび図２Ｂ）における移動度から認められ得るように、変異型ＳＰ１タンパク質は、熱暴露およびプロテアーゼ消化に耐える能力が無傷のドデカマータンパク質と同じであることを示す。
【０２６８】
システイン単置換の位置効果を、本明細書中上記のように調製される超平坦な金表面に対するこれら２つの変異体の親和性を調べることによって分析した。動的モードの原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）トポグラフィー画像化（Ｄｕｌｃｉｎｅａ顕微鏡、ＮａｎｏＴｅｃ、Ｍａｄｒｉｄ）を、これら２つのタンパク質による表面被覆率を求めるために使用して、同一条件（サンプル濃度、表面処理および堆積時間）のもとでの天然ＳＰ１と比較した。フラッディング画像分析技術［Ｈｏｒｃａｓ，Ｉ．Ｒ．他、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．、２００７、７８、ｐ０１３７０５］を使用して、新しい変異体の表面被覆率を求めた。結果が図３に示される。
【０２６９】
図３Ａ〜図３Ｃは、３つの超平坦な金表面の原子間力顕微鏡法フラッディングトポグラフィー画像であり、ただし、画像において、青色着色領域は露出金表面を示し、赤褐色領域はタンパク質被覆表面を示すが、金表面のそれぞれがＳＰ１の異なる変化体により処理された。天然ＳＰ１（配列番号４）（図３Ａ）は不良な結合を明らかにし、ほんの１．５％の表面被覆率を達成しただけであり、一方、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）（図３Ｂ）は、ほんの６０％の表面被覆率を達成しただけであった。Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１（配列番号２）（図３Ｃ）は、超平坦な金表面の９８％の完全かつ均質な被覆を達成した。このことは、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１のチオールが実際、周囲に露出し、表面に結合できることを示している。これらの結果は、タンパク質構造における種々の位置が結合のための特定の残基または配列の利用可能性に影響し、これにより、リガンド（例えば、金表面）へのＳＰ１タンパク質結合を予測可能かつ制御可能な様式で改変できることをもたらすことを示す。
【０２７０】
実施例２
シリカ表面へのＳＰ１変異体の結合
ＳＰ１の残基または配列に対するリガンドの結合が、ＳＰ１オリゴマーの三次元立体配座に影響を及ぼすことによって制御され得るかどうかを評価するために、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１（配列番号１）を、ケイ素結合性ペプチドをその内側細孔に呈示するようにさらに操作した。ケイ素結合性ヘキサペプチドｍＴＢＰ（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドを、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１遺伝子のＮ末端コード部分に読み枠を合わせて遺伝子融合し、得られるポリペプチドを大腸菌において発現させた。得られたタンパク質（ｍｔｂＳＰ１、配列番号３）はリング形状のホモドデカマーであり、これは、６個がリングのそれぞれの側に存在する１２個のケイ素酸化物結合性ペプチドをその内側細孔に呈示する（図４を参照のこと）。
【０２７１】
リガンドに対する変異型ＳＰ１の親和性が、タンパク質の化学的環境を変化させることによって改変され得る（切換えられ得る）か？図４Ａ〜図４Ｂは、リング形状タンパク質の内側細孔から広がる金色リボンとしてシリカ結合性ペプチドを示すｍｔｂＳＰ変異体のコンピューター生成グラフィック表示である。図４Ａは、シリカに結合することができないタンパク質の閉じた立体配座を示し、図４Ｂは、シリカ表面に結合することができる開いた立体配座を示す。開いた立体配座から、閉じた立体配座への「切換え」を、例えば、シリカ結合について、カオトロピック剤を使用して、または、いくつかの場合には、（Ｅｌｍａ Ｔｒａｎｓｓｏｎｉｃ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを使用する）超音波処理を使用して試みた。
【０２７２】
ｍｔｂＳＰ変異体（配列番号３）を細菌の可溶性画分に発現させた。得られた変異型タンパク質を熱安定性およびプロテアーゼ抵抗性について天然ＳＰ１と比較した（表１）。
【０２７３】
図５Ａ〜図５Ｂは、ｍｔｂＳＰ（配列番号３）の発現、特徴づけおよびＳｉＯ_２結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。ｍｔｂＳＰの発現の誘導（高分子量のバンド）がＩＰＴＧ誘導前およびＩＰＴＧ誘導後の総細菌溶解物から明らかである（図５Ａ、それぞれ、レーン１およびレーン２）。細菌溶解物の可溶性画分を煮沸することにより（図５Ａ、レーン３）、煮沸されていない可溶性画分において優勢な高分子量のオリゴマー形態（図５Ａ、レーン４）と比較した場合、ｍｔｂＳＰモノマーの増大した提示がもたらされる。
【０２７４】
ｍｔｂＳＰを発現する細菌は非常に多くの封入体を有し、これは主にｍｔｂＳＰモノマーを含有した（図５Ａ、レーン５）。
【０２７５】
ｍｔｂＳＰの細菌可溶性画分の熱処理（８５℃、３０分間）はオリゴマー形成を損なわない（図５Ａ、レーン６、熱処理＋煮沸、レーン７、煮沸を伴わない熱処理）。ｍｔｂＳＰの細菌可溶性画分はまた、プロテイナーゼ抵抗性であった：図５Ａ、レーン８およびレーン９は、ｍｔｂＳＰの細菌可溶性画分で、プロテイナーゼｋ処理されたものおよびプロテイナーゼｋ処理されなかったものをそれぞれ示し、天然ＳＰ１のプロテアーゼ抵抗性と類似していることを示す［図５Ａ、レーン１０＝＋プロテアーゼｋ、レーン１１＝プロテアーゼ非存在］。
【０２７６】
変異型ｍｔｂＳＰ１におけるｍＴＢＰヘキサペプチド（配列番号５）の存在により、シリカ結合能がもたらされる。図５Ｂ、すなわち、シリカビーズとのインキュベーションの後におけるｍｔｂＳＰおよび天然ＳＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において認められ得るように、ｍｔｂＳＰタンパク質はシリカビーズに結合し、一方、天然ＳＰ１は結合しない。図５Ｂにおいて認められ得るように、ｍｔｂＳＰはシリカビーズと一緒に留まり（図５Ｂ、レーン１）、ｍｔｂＳＰが非結合画分からほとんど回収されず（図５Ｂ、レーン２）、一方、天然ＳＰ１はシリカビーズにおいて検出されず（図５Ｂ、レーン３）、主に非結合画分に留まっていた（図５Ｂ、レーン４）。混合されたｍｔｂＳＰタンパク質および天然ＳＰ１タンパク質の調製物の結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、シリカビーズから放出される結合画分における、移動度がより小さい（上側バンド）ｍｔｂＳＰを示しただけであった（図５Ａ、レーン５、レーン６（非結合画分）と比較して）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前の煮沸によって解離しないとき、結合ｍｔｂＳＰ（図５Ｂ、レーン７）、天然ＳＰ１（図５Ｂ、レーン８）、および、ｍｔｂＳＰと、天然ＳＰ１との混合物（図５Ｂ、レーン９）はともに、主に高分子量のオリゴマー複合体として現れる。したがって、ｍｔｂＳＰはシリカビーズと結合し、一方、天然ＳＰ１はシリカビーズと結合することができない。
【０２７７】
シリカとのｍｔｂＳＰ１相互作用を特徴づけるために、また、化学的環境（溶媒）の変化がＳＰ１のリガンド結合に影響を与えるかどうかを試験するために、ｍｔｂＳＰ１（配列番号３）の結合を遊離ｍＴＢＰシリカ結合性ペプチド（配列番号５）の結合と比較した。図６Ａおよび図６Ｂは、カオトロピック剤（３Ｍ ＧｕＨＣｌ）の存在下（白四角）または非存在下（Ｘ）における、シリカビーズに対するｍｔｂＳＰの結合（図６Ｂ）および遊離ｍＴＢＰヘキサペプチドの結合（図６Ａ）を示す。シリカに対する遊離ｍＴＢＰペプチドの結合はＧｕＨＣｌによって本質的に影響されなかった（図６Ａ）が、ＧｕＨＣｌはＳＰ１結合ｍｔｂＳＰ１のシリカ結合を大きく改善する（図６Ｂ）。ＧｕＨＣｌに対する類似する応答が、金ナノ粒子へのＭ４３Ｃ−ＳＰのシステイン媒介結合に関して認められている［Ｍｅｄａｌｓｙ，Ｉ．他、Ｎａｎｏ ｌｅｔｔ．、２００８、８、４７３〜４７７、これは全体が本明細書中に組み込まれる］。
【０２７８】
ただ１つだけの仮説に固執するつもりはないが、１つの可能性が、ＧｕＨＣｌ（これはほとんどの場合においてタンパク質を変性させる）は、非常に安定なＳＰ１複合体のＮ末端に対する一定の立体的柔軟性を可能にし、その結果、結合しているケイ素結合性ヘキサペプチドを周囲の環境に露出させ、これにより、シリカへのその結合を容易にするということである（図４Ｂを参照のこと）。そのような機構についてのさらなる証拠が、超音波処理がシリカ結合についてＧｕＨＣｌに取って代わり得ることを示すことによってもたらされた（データは示されず）。
【０２７９】
ｍｔｂＳＰおよび遊離ｍＴＢヘキサペプチドの解離定数をスキャッチャード分析で比較したとき、驚くべきことに、変異型ｍｔｂＳＰ（配列番号３）（図７Ｃ、黒塗り菱形）が遊離ｍＴＢヘキサペプチド（図７Ｃ、白四角）の解離定数よりも数桁低い解離定数を有することが発見された。曲線のスキャッチャード分析（図７Ａおよび図７Ｂ）は、タンパク質ｍｔｂＳＰについては０．３μＭのＫ_ｄを示し、遊離ｍＴＢペプチドについては８６μＭのＫ_ｄを示し、また、ｍｔｂＳＰの正の協同的シリカ結合を示す。
【０２８０】
図７Ａ〜図７Ｃにおいて認められ得るように、ｍｔｂＳＰについての０．３μＭのＫ_ｄは、ペプチドについての８６μＭのＫ_ｄと比較した場合、ｍＴＢヘキサペプチドがＳＰ１足場に呈示されるとき、シリカに対するその親和性が２桁〜３桁大きくなることを示している。このことが、正の協同効果を、遊離ペプチドではなく、ｍｔｂＳＰについて明らかにするスキャッチャード分析によって裏付けられる。
【０２８１】
遊離型の合成ｍＴＢＰの観測された解離定数（８６μＭ）は、ｍＴＢＰはＴＢＰ−１の最も必要なアミノ酸のみを露呈させることを考慮すると、元のＴＢＰ−１ペプチドのＫｄ（Ｓａｎｏ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．、２００５、２１、３０９０〜３０９５）と良好に一致している。アビディティーが、ｍＴＢＰをＳＰ１ドデカマー表面に露呈させることによってほぼ３桁増大した。
【０２８２】
シリカ表面へのｍｔｂＳＰドデカマーの結合に対するカオトロピック剤ＧｕＨＣｌの影響（「切換え」）をさらに評価するために、ＳｉＯ_２表面の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像化を行った。
【０２８３】
図８Ａ〜図８Ｈは、シリカ表面に結合した種々のＳＰ１変化体の一連のＡＦＭフラッディングトポグラフィー画像であり、３ＭのＧｕＨＣｌの存在下または非存在下、あるいは、ＧｕＨＣｌを伴わない、ＳｉＯ_２表面に対する変わりやすい様々な結合を示す。ＡＦＭ像において、青色領域はむき出しのシリカ表面を表し、褐色領域はタンパク質結合シリカ表面を表す。図８Ａ〜図８Ｄはそれぞれ、天然ＳＰ１（配列番号４）、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１変化体（配列番号２）、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１変化体（配列番号１）およびｍｔｂＳＰ（配列番号３）である。ＧｕＨＣｌの非存在下では、すべてがＳｉＯ_２表面の低い非特異的な結合（５％未満の表面被覆率）を示す。図８Ｅ〜図８Ｈもまた、それぞれ、３ＭのＧｕＨＣｌの存在下における天然ＳＰ１（配列番号４）、Ｌ８１ＣΔＮＳＰ１変化体（配列番号２）、Ｍ４３ＣΔＮＳＰ１変化体（配列番号１）およびｍｔｂＳＰ（配列番号３）である。ＧｕＨＣｌの存在下では、ＡＦＭ像は、ｍｔｂＳＰのみが、低下した非特異的結合を伴うＳｉＯ_２表面の完全な被覆を示すことを明瞭に示す。
【０２８４】
図８Ａ〜図８Ｆにおいて認められ得るように、すべての変異体が、著しい差を何ら伴うことなく、１％〜７％の範囲での表面被覆率を示し、一方、ＧｕＨＣｌは、ｍｔｂＳＰ単層によるシリカの完全な表面被覆を可能にする。ＳＰ１足場の大きい安定性は、ＳＰ１足場により、隠れているペプチドが、ほとんどのタンパク質を変性させるであろう溶媒条件においてだけ露出させられることを可能にする。そのうえ、カオトロピック剤（例えば、ＧｕＨＣｌなど）の使用は、図８Ａ〜図８Ｂにおいて認められ得るように、表面への非特異的な結合を著しく低下させる。
【０２８５】
実施例３
ＳＰ１変化体によるカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）分散
材料および方法：
多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）を、Ａｒｋｅｍａ Ｉｎｃ．（フランス；ＧＲＡＰＨＩＳＴＲＥＮＧＴＨ（商標）Ｃ１００）またはＢａｙｅｒ ＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅ ＡＧ（ドイツ；Ｂａｙｔｕｂｅｓ Ｃ１５０Ｐ）のどちらかから得た。単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）をＴｅｉｊｉｎ，Ｌｔｄ（ヤマグチ、日本）から得た。
【０２８６】
小規模製造のために、１．０ｍｇ〜１．３ｍｇの間のＭＷＮＴを１ｍｌのスクリューキャップ・ガラスチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、カタログ番号：０３−３３８ＡＡ、サイズ：１２ｘ３５ｍｍ、１／２ＤＲ）に計り取った。ＮａＰｉ緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ８．０）における１ｍｌのタンパク質溶液を、事前に重量測定されたＭＷＮＴを含有するスクリューキャップ・ガラスチューブに加えた。得られた混合物を、Ｅｌｍａ Ｔｒａｎｓｓｏｎｉｃ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを使用して、８０℃で２時間、超音波処理した。超音波処理サンプルを最初、２００００Ｘｇで２０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離チューブで遠心分離した。上部上清の９０パーセントを、底における沈降物を取ることを避けながら、ピペットを使用して分離し、別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離チューブに移した。分離された上清サンプルを１０倍希釈した。Ｌ２−ＳＰ１（配列番号１４）によるＣＮＴ分散もまた、尿素を伴うか、または伴わないＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ８．０）において試験した。
【０２８７】
大規模製造のために、４００ｍｇのＭＷＣＮＴをガラスフラスコに計り取り、タンパク質溶液（ＮａＰｉ緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ８．０）において４００ｍｌ）を加え、混合物を、ブースターホーム、１インチの平チップおよび温度制御ユニットを伴うＭｉｓｏｎｉｘ４０００Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、または、Ｈｉｅｌｃｈｅｒ超音波処理機（ＵＩＰ１０００ｈｄ）を使用して、５０℃未満の最大温度を維持しながら、２６０Ｗの出力設定で４時間超音波処理した。サンプルの完全な分散を得るために、超音波処理サンプルを、ほんの少量のペレットが形成されるまで２００００Ｘｇで２０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離チューブで遠心分離した。未分散物をペレット化した後、上清は、同じ緩衝液で１００倍希釈した後でさえ、ＣＮＴにより非常に暗かった。最後の工程が、Ｓｏｒｖａｌ ＳＬＡ３０００遠心分離器を使用する７０００ｒｐｍでの６０分間の上清の遠心分離であった。
【０２８８】
結果：
本明細書中上記の表２はＣＮＴ分散実験の結果を示す。表２に記載されるＳＰ１変化体は熱に安定であり、また、一般にプロテアーゼ抵抗性である。しかしながら、アルカラーゼ（１０００倍希釈）とのインキュベーションは、アルカラーゼにより処理されていないサンプルと比較して、分子量における変化を引き起こす。すべての場合において、アルカラーゼ処理されたＳＰ１変化体の見かけ分子量は依然として、天然ＳＰ１の見かけ分子量よりも大きく、このことは、ＣＮＴ結合性ペプチドに由来するアミノ酸のすべてではないが、その一部が除かれたことを示している。
【０２８９】
表２において認められ得るように、複数コピーのこれらのＣＮＴ結合性ペプチドをＳＰ１のＮ末端に融合することにより、多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）を溶媒に分散するＳＰ１の能力が改善され、一方、天然ＳＰ１タンパク質はＭＷＣＮＴの分散を高ＳＰタンパク質濃度（およそ１ｍｇ／ｍｌ）においてのみもたらすだけである。表２においてさらに認められ得るように、融合タンパク質は、はるかにより大きいＣＮＴ結合活性を有する。最大のＣＮＴ分散能が、Ｌ１（配列番号６）、すなわち、ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳペプチド（配列番号１０）がＮ末端に融合されるＳＰ１ポリペプチドに関して認められ、これは比較的低い濃度（０．００４ｍｇ／ｍｌ）でのＭＷＣＮＴ分散を可能にした。ＳＰ１と、それ以外のＣＮＴ特異的ペプチドとの融合であるＬ２（配列番号１４）およびＬ３（配列番号８）［それぞれ、ＨＳＳＹＷＹＡＦＮＮＫＴペプチド（配列番号１１）およびＤＹＦＳＳＰＹＹＥＱＬＦペプチド（配列番号１２）］もまた、天然ＳＰ１よりも大きいＣＮＴ分散活性をもたらした。Ｌ３−ＳＰ１、Ｈｉｅｌｃｈｅｒ超音波処理機を使用した場合、最大ＣＮＴ濃度が、４０ｍｇ ＣＮＴ／ｇｒ布地、すなわち、４％であった。ＳＰ１の溶解性が１５０ｍｇ／ｍｌもの高さであるならば、理論的には、最大ＣＮＴ濃度は３０％もの高さが可能である。
【０２９０】
変化体のＬ２−ＳＰ１（配列番号１４）およびＬ３−ＳＰ１（配列番号８）は、封入体（ＩＢ）に見出される可溶性タンパク質および不溶性タンパク質の両方を形成するという点で、他のＳＰ１変化体とは異なる。ＩＢに見出されるタンパク質は尿素の存在下で溶解することができ、尿素希釈のときにリフォールディングする。適正に折り畳まれたＬ２−ＳＰ１は複合体を形成し、プロテアーゼ抵抗性であったが、ＩＢからの溶解されたＬ２−ＳＰ１は複合体を形成せず、プロテアーゼ感受性であった。封入体から得られるＬ２−ＳＰ１およびＬ３−ＳＰ１はＣＮＴを分散させることができるが、効率が可溶性タンパク質よりもはるかに低い（表２）。
【０２９１】
本明細書中上記の表２において認められ得るように、ＣＮＴ分散のために要求される最小ＳＰ１濃度は、Ｎ末端に融合されるペプチドの配列に依存する。
【０２９２】
Ｌ１−ＳＰ１（配列番号６）の場合において、イオン交換精製されたタンパク質をアルカラーゼにより処理し、タンパク質は、ＭＯＬＤＹ−ＴＯＦを使用するＮ末端配列決定および分子量決定を受けた。結果は、８個のアミノ酸がそのＮ末端からアルカラーゼによって消化され、これにより、タンパク質のＮ末端に融合されたＳＮＱＳペプチドが残っていることを示した。Ｎ末端におけるＳＮＱＳペプチドの挿入を有するＳＰ１変化体（Ｌ６−ＳＰ１、配列番号１５）が、アルカラーゼ処理されたＬ１−ＳＰ１と比較された場合、類似した特徴、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度およびＣＮＴ分散能を示したことは本明細書中では特筆される。
【０２９３】
これらのＣＮＴ特異的ペプチドに加えて、ケイ素／チタン酸化物結合性ペプチド（ＲＫＬＰＤＡＡ）（配列番号５）の融合（これはＳＰ１変化体のｍｔｂＳＰ１（配列番号３）をもたらす）は、天然ＳＰ１よりも低い濃度でＣＮＴ分散を促進させることが見出された。
【０２９４】
工業的適用のためには、タンパク質製造コストをできる限り低く保つこと、および、組換えタンパク質を発現する形質転換された細胞の粗抽出物に存在し得る他のペプチドが変化体ＳＰ１のＣＮＴ分散能を妨害しないことを確実にすることが好ましい。この面を検証するために、Ｌ１−ＳＰ１を発現させるために形質転換された細菌から得られる粗抽出物を熱処理およびプロテアーゼ処理の組合せにさらし、その後、表５に示されるように、ＣＮＴ分散活性の保持または喪失について評価した。
【０２９５】

【０２９６】
表５において認められ得るように、８０℃で１２０分までのＬ１−ＳＰ１の粗抽出物の熱処理、および、この変異体の調製期間中に使用されたタンパク質分解は、ＣＮＴ分散能を消失させなかった。
【０２９７】
Ｌ１−ＳＰ１がＣＮＴに結合し、複合体を形成することの直接的な実証が、ＣＮＴを伴うＬ１−ＳＰ１（配列番号６）のサンプル（Ｌ１−ＳＰ１／ＣＮＴ）の懸濁物、ＣＮＴを伴わないタンパク質のサンプル（Ｌ１−ＳＰ１）、および、これらの２つのサンプルのろ液（０．２２ミクロンのフィルター）を煮沸の前後で比較することによって得られた。煮沸サンプルおよび非煮沸サンプルの両方をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２９８】
煮沸されたＬ１−ＳＰ１はモノマー形態のバンドおよびトリマー形態のバンドとして検出された。一方、煮沸されないＬ１−ＳＰ１は高分子量の複合体としてのみ現れる。
【０２９９】
ＣＮＴの大きい画分がろ過によって除かれ、したがって、この画分は０．２２ミクロンよりも長い。ＣＮＴの非存在下におけるＳＰ１トリマーのバンドの割合は、ろ液および非ろ過サンプルの両方において、ＣＮＴの存在下で検出される割合よりも低かった。明らかにすべてのタンパク質が、ＳＤＳ Ｔｒｉｃｉｎｅサンプル緩衝液との混合およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ適用のときに解離したわけではなかった。
【０３００】
Ｌ１−ＳＰ１（配列番号６）がＣＮＴに結合するという別の目安が、ｍｔｂＳＰ−ＳＰ１／ＣＮＴ懸濁物および精密ろ過（０．２ミクロン）素通りの両方のタンパク質測定アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ）からもたらされ、これは、ＣＮＴ複合体化後のタンパク質の約５０％が０．２ミクロンの細孔サイズよりも大きく、フィルターによって保持されることを明らかにする（データは示されず）。
【０３０１】
ＳＰ１−ＣＮＴ複合体の形成についてのさらにさらなる証拠がエタノール沈殿の結果において認められる（表３）：複合体化されていないタンパク質は５０％エタノールにより沈殿しないが、ＳＰ１−ＣＮＴは５０％エタノールにより沈殿する。ＣＮＴがＧｕＨＣｌ（１００ｍＭ）により同様に沈殿し、また、（ＨＣｌまたは酢酸を加えることによる）酸性ｐＨで沈殿する。しかしながら、一方で、ＧｕＨＣｌは非複合体化タンパク質の沈殿化を誘導するのではなく、酸性ｐＨが非複合体化タンパク質の沈殿化を誘導する（実施例６〜実施例８を参照のこと）。
【０３０２】
Ｌ１−ＳＰ１−ＣＮＴ複合体の熱安定性、プロテアーゼ抵抗性およびアルカリ抵抗性：複合体の安定性を評価するために、Ｌ１−ＳＰ１／ＣＮＴを、ｐＨ８．０およびｐＨ１１の両方における熱処理（１００℃；１０分または８０℃；３０分）、または、ｐＨ８．０におけるタンパク質分解に供した。種々のｐＨにおけるＬ１ＳＰ１／ＣＮＴサンプルのインキュベーションの後、高速遠心分離（２０分；２００００Ｘｇ）および上清の１０倍希釈を行った。熱アッセイおよびプロテイナーゼアッセイの結果は、ＳＰ１／ＣＮＴ複合体が熱に安定であり、かつ、プロテアーゼ抵抗性であり、これにより、重要なポリマー化合物（例えば、エポキシなど）におけるその分散に先立つ複合体の経済的に望ましい加熱乾燥および加熱粉末化を可能にすることを明らかにする。
【０３０３】
ＳＰ１／ＣＮＴ複合体の大きい耐久性は、水に容易に再分散させることができるＳＰ１／ＣＮＴ複合体の乾燥ペレットを得るための簡便な方法の開発を可能にした。このプロセスは、４％のＣＮＴの最初の分散、その後、エタノールにおける３段階の洗浄および１：５希釈による沈殿化（最後は９９％エタノール）、ならびに、真空ポンプを使用する脱水を含む。
【０３０４】
実施例４
エポキシ樹脂におけるＳＰ１／ＭＷＣＮＴ複合体の分散
タンパク質−エポキシ相互作用についての十分に研究されているモデルが、生物活性タンパク質（例えば、酵素など）の固定化のために使用されるエポキシ活性化ポリマー担体である。しかしながら、可溶性タンパク質は、中性ｐＨ値ではエポキシ基との反応性がほとんどない。エポキシにおけるＳＰ１−ＣＮＴ溶解性能力はｐＨ依存性である：ＳＰ１−ＣＮＴは、ｐＨ８．０で乾燥されるときには沈殿し、また、１０．５を超えるｐＨで乾燥されるときには、安定で、透明な、しかし、暗い溶液を形成する。
【０３０５】
ＳＰ１変化体、カーボンナノチューブおよびエポキシ樹脂の三元複合体を形成するための２つの例示的な一般的手順が本明細書中に記載される。
一般的プロトコル「Ａ」：エポキシとのＳＰ１／ＣＮＴ相互作用を評価するために、
１．ＳＰ１／ＣＮＴ（０．１％〜０．５％のＣＮＴ）を、本明細書中上記のような超音波処理を使用して水に分散させた；
２．高濃度のＳＰ１／ＣＮＴ懸濁物を、透析を使用して、限外ろ過（３０ｋＤａのカットオフ）およびｐＨを増大させるための緩衝液交換（ＮａＰｉ（１０ｍＭ；ｐＨ８．０）からＮａ_２ＣＯ_３（１０ｍＭ；ｐＨ≒１１）への）を使用して調製した。
３．脱水：乾燥した微細なＳＰ１／ＣＮＴペレットを得るために、冷凍乾燥（凍結乾燥）をサンプルの脱水のために使用した。
４．ＳＰ１／ＣＮＴペレットを、１％（ｗ／ｗ）の濃度を得るために、１０分間、エポキシ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＬＹ５０５２）に激しく混合し、その後、２６０Ｗおよび７０℃の最大温度での３時間の浴での超音波処理を行った。
５．遠心分離：その後、黒色混合物を遠心分離して（７０００ｒｐｍで６０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＬＡ３０００ローターを使用する）、分散されていないＣＮＴ／ＳＰ１を沈殿させる；および
６．ＣＮＴ懸濁物の濃度を６００ｎｍでの透過の測定によって評価した。
【０３０６】
一般的プロトコル「Ｂ」は下記の工程を含む：
１．ＳＰ１／ＣＮＴ（０．１％〜０．５％のＣＮＴ）を、本明細書中上記のような超音波処理を使用して水に分散させた；
２．ＮａＯＨ（０．０２Ｍの最終濃度）の添加によるｐＨ調節；
３．エタノール沈殿：５０％〜８０％のエタノールに調節し、−２０℃で２時間インキュベーションし、その後、７０００ｒｐｍでの６０分間の遠心分離を行う（Ｓｏｒｖａｌ遠心分離器でのＳｏｒｖａｌローターＳＬＡ３０００）；
４．脱水：乾燥した微細なＳＰ１／ＣＮＴペレットを得るために、冷凍乾燥（凍結乾燥）をサンプルの脱水のために使用した。
４．ＳＰ１／ＣＮＴペレットを、１％（ｗ／ｗ）の濃度を得るために、１０分間、エポキシ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ、ＬＹ５０５２）と激しく混合し、その後、２６０Ｗおよび７０℃の最大温度での３時間の浴での超音波処理を行った。
５．遠心分離：その後、黒色混合物を遠心分離して（７０００ｒｐｍで６０分間、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＬＡ３０００ローターを使用する）、分散されていないＣＮＴ／ＳＰ１を沈殿させる；および
６．ＣＮＴ懸濁物の濃度を６００ｎｍでの透過の測定によって評価した。
【０３０７】
その後、透明なエポキシを硬化剤添加のために重量測定し、７分間〜１０分間混合し、真空デシケーターで脱気し、８０℃での一晩（８時間超）の硬化のためにケイ素鋳型に注いだ。図９Ａは、分散させた複合体ＴｉＳＰ１−ＣＮＴを伴うエポキシＬＹ５０５２（サンプル２）（約１％）（ｍｔｂＳＰ１、配列番号３）、および、非処理ＣＮＴを伴うエポキシＬＹ５０５２（サンプル３）（１％）と比較される硬化させたＬＹ５０５２エポキシ（サンプル１）から製造されるモジュールの写真を示す。写真は、ＳＰ１タンパク質によるＣＮＴ分散が、暗いが、透明なサンプルをもたらすことを示し、このことは、エポキシにおける良好な分散を示している。
【０３０８】
図９Ｂはまた、分散された複合体ＴｉＳＰ１−ＣＮＴを伴うエポキシＬＹ５０５２（約１％）（ｍｔｂＳＰ１、配列番号３）の薄い切片のＴＥＭ像を示し、硬化させた重合エポキシにおける完全に分散されたＣＮＴを明瞭に示す。
【０３０９】
実施例５
アラミド（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標））に対するＳＰ１変化体の結合
材料科学者および材料技術者は、カーボンナノチューブを使用して超強靱かつ高性能なポリマー複合材料を作出する可能性によって興奮する。現在、ＣＮＴ−ポリマー複合材を二次加工するすべての既存の方法は、複雑で、費用がかかる、時間を要求する加工技術、例えば、溶液注型、融解、成形、押出しおよびインサイチュー重合などを伴い、これらは、ナノチューブが、最終製造物（例えば、ヤーン、リボンまたはフィルム）の形成の前に、ポリマー溶液、溶融ポリマーに取り込まれるか、または、最初のモノマーと混合されることを余儀なくする。このことは、不溶性または温度感受性のポリマーには適していない。このようなポリマーは、融解することなく分解するからである。
【０３１０】
アラミドポリマー（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標））は、様々な重要な適用（例えば、空気タイヤのトレッドおよびサイドウォール、防弾チョッキおよび車用装甲板など）を有する広く知られている高強度ポリマーである。しかしながら、アラミド（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標））はどのような一般的な溶媒においても可溶性でなく、また、融点を有しないので、４００℃を超えると分解する。結果として、アラミド（例えば、ＫＥＶＬＡＲ（商標））繊維は硫酸溶液からの湿式紡糸によって製造されなければならない。アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））へのＳＰ１／ＣＮＴ複合体の結合を、既に形成されたポリマー製造物（例えば、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標）ヤーンなど）へのカーボンナノチューブの効果的な加工後取り込みについて評価した。
【０３１１】
タンパク質を介する布地へのＣＮＴ結合は、その表面積を増大させ、これにより、繊維とのより良好な相互作用を可能にし、また、繊維間の架橋を誘導する。加えて、自身による繊維へのタンパク質結合は、タンパク質表面の反応基を介するポリマーとの相互作用を改善するかもしれない。ＣＮＴと結合するいくつかのＳＰ１変化体がまた、構造用繊維に結合することが明らかにされる。
【０３１２】
材料および方法
種々の濃度（１０ｍＭ ＮａＰ_ｉ（ｐＨ≒８）における２２μｇ／ｍｌ、４４μｇ／ｍｌおよび８８μｇ／ｍｌのサンプル）でのＬ３ＳＰ１溶液（配列番号８）を、回転式振とう機において２５℃で１６時間、１００ｍｇのアラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））布地とインキュベーションし、その後、溶液が無色になるまで（これはＣＮＴの非存在を示す）、かつ、タンパク質が洗浄液において全く検出されなくなるまで、同じ緩衝液により大々的に洗浄して、微量の非結合のタンパク質およびＣＮＴを除いた。アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））へのＣＮＴ結合をアラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））繊維の暗色化によって評価した。洗浄されたアラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））へのＳＰ１結合を、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））を２ｍｌのＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２７）と３７℃で３０分間反応し、５６２ｎｍでの光学濃度を測定することによって求めた。結合したタンパク質の量を計算し、プロットした。結果が図１０Ａに示される。
【０３１３】
アラミドへのＳＰ１／ＣＮＴ結合を、上記で詳述されるように、沈殿化、光透過率（分光法、目視検査）および表面抵抗率によって評価した。
【０３１４】
結果
Ｌ３ＳＰ１／ＣＮＴ複合体とのインキュベーションの後における結合繊維および非結合繊維の比較は、徹底した洗浄の後でさえ、ＣＮＴの多大な結合を示した（示されず）。ＢＣＡタンパク質アッセイもまた、ＳＰ１／布地（ｗ／ｗ）の比率がおよそ２ｍｇタンパク質／ｇ繊維（２／１０００）であることを示した。並行した実験では、Ｌ−１−ＳＰ１（配列番号６）およびＬ−４ ＳＰ１（配列番号９）もまた、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））に結合することが明らかにされた。Ｌ３−ＳＰ１／ＣＮＴとのインキュベーションの後、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））繊維は色が濃くなった。このことは、大々的な洗浄の後でさえ、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））繊維へのＣＮＴの結合を示している。図１０Ｂは、アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））に結合するＳＰ１／ＣＮＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、ＣＮＴおよびタンパク質が繊維に結合することを明らかにする。３０ｍｇのアラミドを１８０／１０００（ｗ／ｗ）のＬ４−ＳＰ１−ＣＮＴ分散物とインキュベーションし、その後、浴での超音波処理（９０分、３０℃〜７０℃の間に及ぶ温度）、繊維除去、（緩衝液を使用する）大々的な洗浄、および、煮沸（６０ｕｌにおいて１０分）を行って、結合したタンパク質およびＣＮＴを抽出することにより、結合したＣＮＴだけでなく、結合したタンパク質を有する暗色化した繊維がもたらされた（図１０Ｂ、レーン１〜レーン３）。
【０３１５】
アラミド（ＫＥＶＬＡＲ（商標））結合ＣＮＴの量の定量的測定を得るために、結合後の溶液に残留する非結合ＳＰ１／ＣＮＴの量を直接に評価することができる（下記の実施例６を参照のこと）。
【０３１６】
図１１Ａ〜図１１ＣはＭＷＣＮＴ結合アラミド繊維の高分解能走査型電子顕微鏡観察像である。スケールバーは、１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃにおいてそれぞれ、１μｍ、１．０μｍおよび０．１μｍである。
【０３１７】
ＣＮＴ分散物（０．１％ＣＮＴ（Ａｒｋｅｍａ、コードＣ１００）、Ｌ３ＳＰ１（配列番号８）を使用する）を撹拌（１ｈ；２５℃；１５０ｒｐｍ）によってアラミド布地（ＫＥＶＬＡＲスタイル１２０平織 １９５デニール、５８ｇ／ｍ平方；１ｇの布地あたり２２ｍｌの懸濁物）とインキュベーションし、その後、同じ緩衝液における大々的な洗浄、および、開放空気での一晩の乾燥を行った。布地上のＣＮＴ含有量が約９ｍｇ／ｇ布地であった。結合ＣＮＴは表面積を劇的に増大させること、および、ＣＮＴは互いに密に接触しており、これにより、改善された電気伝導特性をもたらしていることに留意すること。図１１Ｂおよび図１１Ｃは、凝集を何ら示すことなく、アラミド繊維への均質な結合を示す。
【０３１８】
ＳＰ１−ＣＮＴ−ポリマー繊維表面の電気抵抗率：ＳＰ１ポリペプチド−ＣＮＴ複合体化アラミド布地の表面の抵抗率の測定は、驚くべきことに、非処理アラミド繊維の表面抵抗率が、ＳＰ１ポリペプチド結合ＣＮＴと複合体化されたとき、１０^６オーム／平方よりも大きいが、抵抗率が１０^４オーム／平方未満に低下することを示した。結合ＣＮＴ濃度を変えることにより、ＳＰ１ポリペプチド−ＣＮＴ複合体化アラミド布地の表面の抵抗率における対応する変化がもたらされた。すなわち、表面抵抗率が、ＣＮＴ濃度における増大および溶解されたＬ３ＳＰ１封入体（ＩＢ）の使用のときにはともに、一層大きく低下する（下記の実施例６を参照のこと）。
【０３１９】
実施例６
カーボン布地へのＳＰ１変化体の結合
カーボン布地は、航空宇宙分野および自動車分野において、同様にまた、帆船およびスポーツ設備において様々な重要な適用を有する広く知られている高強度材料であり、これらにおいては、その大きい強度対重量比が重要である。連続する炭素繊維／エポキシ複合材が、それらの優れた機械的特性に起因して構造的適用のために広範囲に使用されている。ポリマーはほとんどの場合、エポキシであり、しかし、他のポリマー、例えば、ポリエステル、ビニルエステルまたはナイロンなどもまた使用される。しかしながら、それらのマトリックス支配的特性（例えば、面内および層間の剪断特性など）はそれらの繊維支配的特性よりもはるかに弱く、したがって、これらの従来的複合材の利益を制限している。加えて、複合材が、引張り強さよりも低い長さ方向の圧縮強さ（マトリックス支配的特性）を示すことが知られている。
【０３２０】
タンパク質を介する布地へのＣＮＴ結合はその表面積を増大させ、このことは、繊維とのより良好な相互作用を可能にし、また、繊維間の架橋を誘導する。加えて、自身による繊維へのタンパク質結合は、タンパク質表面の反応基を介するポリマーとの相互作用を改善するかもしれない。ＣＮＴと結合するいくつかのＳＰ１変化体がまた、構造用繊維に結合することが明らかにされる。
【０３２１】
材料および方法
ＳＰ１−ＣＢＤの溶解された封入体の製造：
ＳＰ１−ＣＢＤが、米国特許第７２５３３４１号（Ｗａｎｇ他）に記載されるように、不溶性の封入体（ＩＢ）として細菌宿主において発現させられる。簡単に記載すると、１０８アミノ酸のＳＰ１アミノ酸配列（配列番号８８）をコードするＳＰ１のｃＤＮＡを、クロストリジウム・セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）のセルロース結合性タンパク質Ａの１６３アミノ酸のＣＢＤドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号８７）を有する発現ベクターにクローン化した。得られた核酸構築物は、ペプチドリンカー（配列番号８９）を含むＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質をコードした。クローニング後、得られたプラスミドを使用して、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。組換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質の合成を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド）を細菌培養物の中期対数期に１ｍＭの最終濃度に加え、その後、３７℃でのさらに５時間のインキュベーションを行うことによってＢＬ２１（ＤＥ３）において誘導した。組換えＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号８６）が封入体（ＩＢ）において検出され、封入体を単離および精製した。簡単に記載すると、ＳＰ１−ＣＢＤを含有するＩＢを、Ｔｒｉｓｍａ塩基（２０ｍＭ）、ＮａＯＨ（８ｍＭ）に溶解し（氷上で３０分、１：２００の比率（ｗ／ｖ））、その後、高速遠心分離（１３０００ｒｐｍ、３０分間）を行った。上清を水に１：１０で希釈し、ｐＨを（ＮａＰｉ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝６．８）を使用して）ｐＨ＝８．２に調節した。
【０３２２】
炭素繊維へのＳＰ１ポリペプチド−ＣＮＴ複合体の結合
分析目的のために、５０ｍｇの炭素繊維（Ｓｉｇｍａｔｅｘ）を１ｍｌのスクリューキャップ・ガラスチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、カタログ番号：０３−３３８ＡＡ、サイズ：１２ｘ３５ｍｍ、１／２ＤＲ）に計り取った。Ｌ３ＳＰ１溶液（配列番号８）（１０ｍＭ ＮａＰ_ｉ（ｐＨ≒８）における０、１、２、４および８（ｍｇ ＳＰ１／ｇＣＦ）に対応する０、５０、１００、２００および４００（ｕｇ／ｍｌ））を、（Ｅｌｍａ Ｔｒａｎｓｓｏｎｉｃ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを使用して１．５時間）浴型超音波処理装置においてインキュベーションし（浴型超音波処理装置を運転している間、温度が２０℃から６０℃に上がった）、その後、同じ緩衝液による大々的な洗浄を行って、微量の非結合Ｌ３−ＳＰ１タンパク質を除いた。洗浄された布地へのＳＰ１結合を、布地を２ｍｌのＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２７）と３７℃で３０分間反応し、５６２ｎｍでの光学濃度を測定することによって求めた。結合したタンパク質の量を計算し、プロットした。結果が図１２Ａに示される。図１２ＡはＢＣＡタンパク質アッセイを示し、また、ＳＰ１／布地（ｗ／ｗ）の比率が７ｍｇタンパク質／ｇ繊維（０．０７％）にまで達することを示す。
【０３２３】
布地へのＳＰ１／ＣＮＴ複合体の結合のために、カーボン布地（Ｓｉｇｍａｔｅｘ、２００ｇ／平方メートル、１９ｇ）を、１時間、（Ｅｌｍａ Ｔｒａｎｓｓｏｎｉｃ Ｓｏｎｉｆｉｅｒを使用して）浴型超音波処理装置においてＬ３ＳＰ１溶液（配列番号８）｛０．０２５（ｕｇ／ｍｌ）；１（ｍｇ ＳＰ１／ｇＣＦ）、１０ｍＭ ＮａＰ_ｉ（ｐＨ≒８）の０．８ｌに希釈されて｝により前処理し、その後、前処理された布地を、５時間、浴型超音波処理装置においてＬ３−ＳＰ１／ＣＮＴ溶液｛１０ｍＭ ＮａＰ_ｉ（ｐＨ≒８）の０．８ｌにおける０．１％ＣＮＴ Ｌ３−ＳＰ１／ＣＮＴ（ｗ／ｗ）比率＝０．０５｝により処理した。
【０３２４】
布地へのＣＮＴの結合を、２つの方法を使用して評価した：
１．超音波処理の継続期間にわたる６００ｎｍでのＬ３−ＳＰ１／ＣＮＴ懸濁物の透過率を測定する。この場合、透過率は溶液中のＣＮＴ濃度における低下を示し、したがって、布地へのその結合を示す。透過率の値はＬ３−ＳＰ１／ＣＮＴ標準曲線に従ってＣＮＴ濃度と相関した（図１４Ｂ）。図１２Ｃは、超音波処理時間（０〜５時間）にわたる（６００ｎｍでの増大する透過率によって測定されるように、溶液からのＣＮＴの）低下を示す。このことは、Ｌ３ＳＰ１−ＣＮＴ複合体が布地に結合することを示している。この「減算」法によって測定されるときの最大ＣＮＴ結合が４ｍｇ ＣＮＴ／ｇｒ布地（０．４％）であった。
２．布地へのＣＮＴ結合を評価するためのより直接的な方法が、溶液を（冷凍乾燥を使用して）脱水した後における乾燥物重量測定である。結合前および結合後の乾燥物重量の差が計算された。これは、この方法によって測定されるときの最大ＣＮＴ結合が、類似する３．６ｍｇ／ｇｒ布地（０．３６％）であり、上記の「減算」法により測定して得られる結果と類似していたことを示している。
【０３２５】
上記で記載されるように、ＳＰ１およびＳＰ１／ＣＮＴ複合体は、超音波処理されない場合、限られた効率で炭素繊維と結合する。より大きい結合効率を、材料結合部位ドメインが露出する溶解されたＳＰ１−ＣＢＤ封入体を使用して達成することができる。炭素繊維をＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体への結合のために調製するために、炭素繊維（Ｈｅｘｃｅｌ、平織スタイルＫ−７０−Ｐ３０００フィラメントヤーン；１９３ｇ／ｍ平方；１ｇの布地あたり２２ｍｌの懸濁物）を、溶液（最終的なタンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍｌであった）撹拌（１ｈ；２５℃；１５０ｒｐｍ）において、溶解されたＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質にさらし、その後、大々的に洗浄して、非結合の融合タンパク質を除いた。その後、ＳＰ１−ＣＢＤ結合炭素繊維を撹拌（１ｈ；２５℃；１５０ｒｐｍ）によってＳＰ１ポリペプチド−ＣＮＴ複合体の懸濁物（０．１％ＣＮＴ（Ａｒｋｅｍａ、コードＣ１００）、Ｌ３ＳＰ１（配列番号８）の存在下）とインキュベーションし、その後、大々的な緩衝液洗浄および一晩の開放空気での乾燥を行った。布地に結合したＣＮＴ含有量が約６ｍｇ／ｇ布地であった。
【０３２６】
実施例７
電気伝導性の編織物
従来の編織物（天然物および合成物の両方）はほとんど常に絶縁体（電気の不良な導体）である。絶縁体を導体に変換することにおける関心が、静電気遮蔽衣類または電磁遮蔽衣類を得るための必要性から、あるいは、画期的な電子的「スマート」編織物の製造のために生じている。
【０３２７】
「電子的／スマート編織物」はますます注目を集め続けている；それらは、センサー、アクチュエーターおよび制御ユニットを含有するが、依然として、快適な衣料品のために必要な特徴を保持する。それらは、受動的（すなわち、周囲の状態を感知することができる）または能動的（すなわち、特定の入力に応答／適合するためのセンサーおよびアクチュエーターの両方を含有する）のどちらであってもよい。本発明の方法に従った導電性編織物の製造のために好適な編織物のいくつかの限定されない例が、綿、ウールおよびアマのような天然材料、ならびに、エラステイン（ポリウレタン／ポリウレアコポリマー、例えば、ＳＰＡＮＤＥＸ、ＬＹＣＲＡ）およびアラミド（ＫＥＶＬＡＲ）のような合成繊維であり、これらは、ＰＰＹ（ポリピロール）またはＰＡＮｉ（ポリアニリン）のようなＩＣＰ（固有的導電性ポリマー）およびＣＮＴ（カーボンナノチューブ）の添加を伴う。
【０３２８】
方法
カーボンナノチューブを２工程の手順で布地／編織物に結合させた。簡単に記載すると、Ｌ３ＳＰ１（配列番号８）およびＳＰ１−ＣＢＤ（配列番号８６）を可溶性複合体および不溶性封入体（ＩＢ）の両方として発現させる。Ｌ３ＳＰ１のＩＢをＴｒｉｓｍａ塩基（２０ｍＭ）、ＮａＯＨ（８ｍＭ）に溶解し（氷上で３０分、１：２００の比率（ｗ／ｖ））、その後、高速遠心分離（１３０００ｒｐｍ、３０分間）を行った。上清を水に１：１０で希釈し、ｐＨを（ＮａＰｉ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝６．８）を使用して）ｐＨ＝８．２に調節した。
【０３２９】
表６に示されるように、２工程の結合が、ＣＮＴを布地（例えば、アラミド（サイジングが行われない）、綿、ポリエステル、ポリアミドおよびエラステインなど）に結合させることにおいて効果的である。他の繊維、例えば、アラミド（ＫＥＶＬＡＲスタイル１２０平織、１９５デニール、５８ｇ／ｍ平方）（これは航空機適用のために使用される）は、０．１％のＬ３−ＳＰ１／ＣＮＴ溶液に浸けることによってＣＮＴと結合する。そのようなＣＮＴ結合布地は非処理の布地よりも低い電気抵抗率を示し（表６）、これは、ＣＮＴの存在または非存在に明瞭に相関している（例えば、ポリアミドおよび綿を参照のこと）。布地を、ＳＰ１Ｌ３−ＩＢ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を伴って、または伴うことなく、記載されるように調製した。
【０３３０】

【０３３１】

【０３３２】
まとめると、本明細書中に示される結果は、具体的に設計されたＳＰ１変化体は広範囲の様々な無機分子との分子複合体を形成することができ、これにより、これらの分子の物理化学的特徴（例えば、溶媒における分散など）を高めることを示し、この場合、そのような分子複合体は、例えば、非常に特異的な複合材料（例えば、ＳＰ１ポリペプチド−ＣＮＴ−アラミドの複合体布地、複合体ヤーンおよび複合体ポリマー布地など）およびＣＮＴ−ナノ構造物の製造において有用であり得る。
【０３３３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０３３４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０３３５】

【配列表フリーテキスト】
【０３３６】
配列番号１は、Ｓｐ１改変体変異体：アミノ酸２〜６欠失、Ｍ４３Ｃ改変である。
配列番号２は、Ｓｐ１改変体変異体：アミノ酸２〜６欠失、Ｌ８１Ｃ改変である。
配列番号３は、Ｓｐ１（２〜６欠失、Ｍ４３Ｃ改変）のＮ′に融合されるｍＴＢペプチドである。
配列番号５は、ｍＴＢペプチドである。
配列番号６は、Ｌ１−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号７は、デルタＮ′ Ｓｐ１コード配列である。
配列番号８は、Ｌ３−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号９は、Ｌ４−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１０は、Ｌ１ペプチドである。
配列番号１１は、Ｌ２ペプチドである。
配列番号１２は、Ｌ３ペプチドである。
配列番号１３は、Ｌ６ペプチドである。
配列番号１４は、Ｌ２−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１５は、Ｌ６−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１６は、Ｌ７−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１７は、Ｌ５−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１８は、Ｌ８−Ｓｐ１融合ポリペプチドである。
配列番号１９は、例示的異種チタン結合ペプチドである。
配列番号２０〜２７は、無機物質に結合する例示的ペプチドである。
配列番号５５は、ｍｔｂＳＰコード配列である。
配列番号５６は、Ｌ１−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号５７は、Ｌ２−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号５８は、Ｌ３−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号５９は、Ｌ６−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号６０は、Ｌ４−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号６１は、Ｌ５−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号６２は、Ｌ７−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号６３は、Ｌ８−Ｓｐ１コード配列である。
配列番号６４は、Ｓｐ１改変体変異体：アミノ酸２〜６欠失である。
配列番号６５〜６８，７０〜８５は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
配列番号６９は、Ｍ４３ＣデルタＮ′ Ｓｐ１コード配列である。
配列番号８６は、Ｓｐ１−ＣＢＤキメラポリペプチドである。
配列番号８７は、ＣＢＤドメインである。
配列番号８８は、Ｓｐ１ポリペプチドである。
配列番号８９は、Ｓｐ１−ＣＢＤ融合タンパク質ペプチドリンカーである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰ１ポリペプチドと、前記ＳＰ１ポリペプチドのＮ末端におけるカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、前記ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号１に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列は、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（配列番号４の６５〜７３）、「ＶＫＨ」（配列番号４の９〜１１）、および「ＫＳＦ」（配列番号４の４４〜４６）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号１０〜配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドを、その組換え発現を行わせるために少なくとも１つのプロモータに転写的に連結されて含む核酸構築物。
【請求項７】
カーボンナノチューブまたはグラファイト表面に非共有結合的に結合する、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む組成物。
【請求項８】
前記キメラポリペプチドは、配列番号８に示される通りである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を形成するために、ポリマー、布地またはポリマー布地に結合する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む組成物であって、前記ＳＰ１ポリペプチドが、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラＳＰ１ポリペプチドである、組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体は、請求項７に記載の組成物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化アラミド繊維を含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化アラミドの織布または不織布を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＳＰ１−ポリペプチドは、配列番号８に示される通りである、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質は、配列番号８６に示される通りである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
エラストマー物質をさらに含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記エラストマー物質はゴムである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれかに記載の組成物を含む成分を有する空気タイヤまたはセミ空気タイヤ。
【請求項１９】
前記成分は、前記ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地とともに形成される複合エラストマー物質である、請求項１８に記載のタイヤ。
【請求項２０】
前記ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地は、前記ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地を有しないタイヤと比較した場合、改善された熱伝導性および電気伝導性を与える、請求項１８または１９に記載のタイヤ。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかに記載のタイヤを有する車輌を高速化するための方法であって、電流を、前記少なくとも１つの、ＳＰ１−ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体化ポリマー、複合体化布地または複合体化ポリマー布地に与えて、その結果、前記タイヤの温度を所望される温度に変化させるようにすること、および、前記車輌を高速化することを含む方法。
【請求項２２】
結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を含む布地基体材料を含む電気伝導性布地であって、前記電気伝導性布地の導電率が、前記結合したＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体を有しない同じ布地基体材料の導電率よりも大きく、前記ＳＰ１ポリペプチドが、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラＳＰ１ポリペプチドである、電気伝導性布地。
【請求項２３】
前記布地は、綿、ウール、絹、ナイロン、ポリエステル、アラミド、ポリプロピレンおよびエラステインからなる群から選択される織布または不織布である、請求項２２に記載の電気伝導性布地。
【請求項２４】
電気伝導性のポリマー、布地またはポリマー布地を製造するための方法であって、布地基体材料を提供すること、ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物を調製すること、および、前記布地基体材料を前記ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物により処理すること、および、前記布地基体材料を洗浄して、電気伝導性ＳＰ１ポリペプチド−カーボンナノチューブ複合体の組成物の過剰量を除くこと、それにより、前記ポリマー、ポリマー布地または布地基体材料に電気伝導性を与えることを含み、前記ＳＰ１ポリペプチドが、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラＳＰ１ポリペプチドである、方法。
【請求項２５】
ＳＰ１ポリペプチドと、前記ＳＰ１ポリペプチドのＮ末端における配列番号５に示される異種のケイ素結合性ペプチドとを含む単離されたキメラポリペプチドであって、前記ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、単離されたキメラポリペプチド。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列は、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（配列番号４の６５〜７３）、「ＶＫＨ」（配列番号４の９〜１１）、および「ＫＳＦ」（配列番号４の４４〜４６）からなる群から選択される、請求項２５に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＳＰ１ポリペプチドを含む単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも１つのＳＰ１ポリペプチドを含むＳＰ１ドデカマーを含む組成物であって、前記改変アミノ酸配列が、ＳＰ１ドデカマーの中央の空洞領域に対応する前記ＳＰ１ポリペプチドの領域に位置し、前記物質の前記結合がカオトロピック剤の存在下で高まり、組成物がさらに、前記カオトロピック剤を含み、かつ、前記ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、
かつ、前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩酸塩であるとき、前記改変アミノ酸配列はＮｉ結合Ｈｉｓタグを含まない、組成物。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列は、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（配列番号４の６５〜７３）、「ＶＫＨ」（配列番号４の９〜１１）、および「ＫＳＦ」（配列番号４の４４〜４６）からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチドおよびセルロース結合性ドメインペプチドからなる群から選択される異種ペプチドを含むために改変される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドは、配列番号１０〜配列番号１３からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ケイ素結合性ペプチドは、配列番号５および配列番号１９からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＳＰ１ポリペプチドはＮ末端欠失を含む、請求項２９〜３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
前記カオトロピック剤は、グアニジニウム塩酸塩、尿素および過塩素酸リチウムからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＳＰ１ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号９および配列番号１４〜配列番号１８ならびに配列番号８６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３７】
物質と結合することができる改変アミノ酸配列を有する少なくとも第１および少なくとも第２の非同一ＳＰ１ポリペプチドモノマーを含むヘテロマー組成物であって、前記第１および第２のＳＰ１モノマーの前記改変アミノ酸配列が互いに非同一であり、前記ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられ、前記非同一モノマーがそれらの無機物質結合配列において異なる、ヘテロマー組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列は、「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（配列番号４の６５〜７３）、「ＶＫＨ」（配列番号４の９〜１１）、および「ＫＳＦ」（配列番号４の４４〜４６）からなる群から選択される、請求項３７に記載のヘテロマー組成物。
【請求項３９】
前記改変アミノ酸配列は、カーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチド、ケイ素結合性ペプチド、ＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質およびシステイン置換体からなる群から選択される、請求項３７に記載のヘテロマー組成物。
【請求項４０】
前記第１および第２のＳＰ１モノマーの前記改変配列は非同一の物質と結合する、請求項３７に記載のヘテロマー組成物。
【請求項４１】
ドデカマーである、請求項３７〜４０のいずれかに記載のヘテロマー組成物。
【請求項４２】
改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第１の無機物質と、前記改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化された第２の無機物質とを含む組成物であって、前記第１の無機物質および第２の無機物質が前記ＳＰ１ポリペプチドドデカマーの第１および第２の結合領域を介して複合体化され、かつ、前記ＳＰ１ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４に対する少なくとも６５％のアミノ酸相同性、
ｉｉ）安定ダイマー形成能、および
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９〜１１、アミノ酸４４〜４６および／またはアミノ酸６５〜７３に対応する少なくとも１つの領域における少なくとも１つの保存されたアミノ酸配列
によって特徴づけられる、組成物。
【請求項４３】
前記第１または第２の無機物質のうちの少なくとも一方が非共有結合性の結合によって前記改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記第１または第２の無機物質のうちの少なくとも一方が共有結合性の結合によって前記改変ＳＰ１ポリペプチドドデカマーと複合体化される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記結合領域の少なくとも１つがカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、前記第２の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドではない、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記第１の無機物質がカーボンナノチューブまたはグラファイト表面であり、前記第２の無機物質が、ポリマー、布地またはポリマー布地である、請求項４２〜４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
前記第１の結合領域がカーボンナノチューブ結合性ペプチドまたはグラファイト表面結合性ペプチドであり、第２の結合領域がケイ素結合性ペプチドである、請求項４２〜４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＳＰ１ポリペプチドドデカマーは、配列番号１〜配列番号３、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１４〜配列番号１８および配列番号８６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＳＰ１ポリペプチドを含む、請求項４２〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記第１の無機物質がカーボンナノチューブまたはグラファイト表面である、請求項４２〜４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
物質を溶媒に分散させる方法であって、前記物質を、請求項１〜４，７，８，２５，２９および３７のいずれかに記載の組成物または単離されたキメラＳＰ１ポリペプチドと接触させて、前記物質と、前記組成物または前記単離されたキメラＳＰ１ポリペプチドとの間での複合体を形成させること、および
前記複合体を、溶液または懸濁物を形成するように溶媒と接触させること；
それにより、前記物質を前記溶媒に分散させること
を含む、方法。
【請求項５１】
前記溶媒は水性溶媒または有機溶媒である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記溶媒はエポキシである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記物質はカーボンナノチューブである、請求項５０に記載の方法。

【図６Ａ−６Ｂ】

【図７Ａ−７Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ−１２Ｃ】

【図１Ａ−１Ｂ】

【図２Ａ−２Ｂ】

【図３Ａ−３Ｃ】

【図４Ａ−４Ｂ】

【図５Ａ−５Ｂ】

【図８Ａ−８Ｈ】

【図９Ａ−９Ｂ】

【図１０Ａ−１０Ｂ】

【図１１Ａ−１１Ｃ】

【図１３Ａ−１３Ｂ】

【公表番号】特表２０１３−５０３６２５（Ｐ２０１３−５０３６２５Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７４４６（Ｐ２０１２−５２７４４６）
【出願日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００７０５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２７３４２
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５１２０５５８９１）フルクルム　エス．ピー．　マテリアルズ　リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】