多重結合型酸化還元酵素
本発明は、多重結合型酸化還元酵素複合体に関係する。前記複合体はデヒドロゲナーセサブユニット及びチトクロームCサブユニットを有する。本発明はさらに多重結合型酸化還元酵素複合体及びそれらの使用方法にも関係する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された自然発生及び組換え多重結合型酸化還元酵素複合体に関係する。より具体的には、本発明は、パントエアシトレアから単離された多重結合型酸化還元酵素複合体の同定及び使用に関係する。この複合体は、チトクロームCサブユニット及びデヒドロゲナーセサブユニットを含む。
【背景技術】
【０００２】
L-アスコルビン酸(AsA、ビタミンC)の合成及び製造は、ビタミン及び抗酸化剤としての市場規模並びにそれらには高い価値があることから注目されている。グルコースからASAを生産する化学的合成経路は、レイヒシュテイン-グルスナー(Reichstein-Grussner)方法として知られており、1934年に最初に開示された(Reichstein T. et al., (1934) Helv. Chim. Acta., 17 : 311-328 and Reichstein T. et al. (1933) Helv. Chim. Acta. 16: 561,1019)。近年ASA中間を生産するための方法が開示された。参考文献はLazarus et al.(1989）, Vitamin C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach, GENETICS AND MOLECULARBIOLOGY OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS, American Society for Microbiology, Washington D. C. Edited by C. L. Hershberger)； Crawford et al., (1980) Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 37: 79-155 (1980); Anderson et al., (1985) Sci. 230: 144-149; 及びSugisawa et al. (1990) Agric. Biol. Chem. 54:1201-1209である。
【０００３】
AsAの典型的な製造工程を図15に示す。通常、該工程は微生物が利用する代謝物、(例えばD-グルコース)を用いる。D-グルコネートデヒドロゲナーセ及び2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーぜを含む酵素的転換により、D-グルコースは、2,5-ジケト-D-グルコネート(2,5-DKG)を生産するための連続的な酸化を受ける。さらに、2,5-DKGは、2-ケト-L-グルコン酸(2-KLG)に還元される。この工程は、グルコノバクター(Gluconobacter)、アセトバクター(Acetobacter)、エルウィニア(Erwinia) 又はパントエア(Pantoea)等の微生物内で行われる。参考文献は、U.S. Pat. Nos. 3,790,444、3,922,194、3,959,076、3,998,697、4,245,049及び5,008,193等の各種米国特許である。AsAの市場の観点から、AsA中間体自体は、経済的及び工業的に重要な物質となってきていることから、炭素基質をAsA中間体に酵素的に転換するための微生物における転換効率を上げることは、好ましいことである。
【０００４】
他の微生物と比較して、グラム陰性腸内細菌科(Enterobacteria)のパントエアシトレア(Pantoea citrea)は、グルコースを転換し、異なるアルド及びケト-糖誘導体の他の糖、特に、AsA中間体、2,5-DKG及び2-KLGに転換する能力が高い。この転換において、該微生物における糖の転換能力に寄与している特性を同定するためにパントエアシトレアのゲノムが解析された。このゲノムの解析により、パントエア（Pantoea）ゲノムはサルモネラ(Salmonella）、クレブシエラ(Klebsiella） 及び大腸菌(E. coli）等の他の腸内細菌科の系統にある面ではよく似ているけれども、付加的な糖代謝能力を提供するための多くの異なる遺伝子を含んでいることが分った。
【０００５】
本発明は、パントエアシトレア(Pantoea citrea)ゲノムが、膜結合型の3成分を含む酸化還元酵素複合体をコードする遺伝子のファミリーを含んでいるという発見に基づいてなされたものである。具体的には、パントエアシトレア(P. citrea)ゲノムは、膜結合型の3成分を有する酸化還元酵素複合体をコードする19オペロンを含み、これらの各複合体は、チトクロームC相同体サブユニット及びデヒドロゲナーゼ活性を有するということが発見された。このことは、バチルススブチルス(Bacillus subtilis)、大腸菌(E. coli)及びシュードモナスアエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)等の他の既知の微生物のゲノムとは対象的である。バチルススブチルス(B. subtilis)及び大腸菌(E. coli)はチトクロームC相同体を含む多重結合型酸化還元酵素複合体を含むことは知られていいない。これに対してパントエアシトレア(P. citrea)は、チトクロームC相同体を含む3成分からなる1の多重結合型複合体を含むことが知られている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
第一の側面において、該発明は、チトクロームC(CytC）タンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド及びそれらのポリヌクレオチドによりエンコードされるCytCタンパク質に関係する。好ましいCytCタンパク質は、図4Aから4B及び5Aから5Bに示されるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
第二の側面において、本発明は、デヒドロゲナーゼをエンコードする単離ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによりエンコードされるデヒドロゲナーゼタンパク質に関係する。好ましくは、デヒドロゲナーゼは、図2Aから2C及び図3Aから3Bに示されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
第三の側面において、本発明は、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドに関係する。該複合体は、CytCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含み、該多重結合型複合体は、前記ポリヌクレオチドによりエンコードされる。
【０００９】
第四の側面において、本発明は、3のサブユニットを含むオペロンを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドに関係する。前記サブユニットは、CytCサブユニット、デヒドロゲナーセサブユニット及びガンマサブユニットを意図する第三のサブユニットを含む。
【００１０】
第五の側面において、本発明は、酸化還元酵素複合体をエンコードする3のコード領域を含むオペロンに関係する。該コード領域は、図1A及び1Bに示す19オペロンにより示される領域である。本側面の一の態様において、該オペロンは、orf 3653、orf 3652 及びorf 3651のオープンリーディングフレーム(orfs）を含む。本側面の第二の態様において、該オペロンは、orf 2418、orf 2419 及びorf 2420のorfsを含む。本側面の第三の態様において、該オペロンは、orf 1840、 orf 1841 及びorf 1842のorfsを含む。本側面の第四の態様において、該オペロンは、orf 2035、 orf 2036及びorf 2037のorfsを含む。本側面の第五の態様において、該オペロンは、orf 3687、 orf 3688 及びorf 3689のorfsを含む。
【００１１】
第六の側面において、本発明は、本明明細書において定義されるチトクロームCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関係する。さらに本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞にも関係する。好ましい宿主細胞は、パントエア(Pantoea)、クレブシエラ(Klebsiella)及び大腸菌(E. coli)の細胞である。
【００１２】
第七の側面において、本発明は、変性宿主細胞を得るために、本明細書で定義されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞の中で炭素基質を効率的に酵素を用いて酸化する方法に関係する。この方法において、ポリヌクレオチドが発現している変性宿主細胞を適切な条件下で培養し、基質の酸化を行う。酸化は、対応する変性されていない宿主細胞と比較すると高められている。この側面の好ましい態様において、基質はポリオールである。
【００１３】
第八の側面において、本発明は、変性宿主細胞を得るために本明細書で定義されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて、形質転換する宿主細胞の中で炭素基質を効率的に酵素を用いて還元する方法に関係する。ここで、この方法において、ポリヌクレオチドが発現している変性宿主細胞を適切な条件下で培養し、基質の還元を行う。前記還元は、対応する変性されていない宿主細胞と比較すると高められている。この側面の好ましい態様において、基質はポリオールである。
【００１４】
第九の側面において、本発明は、宿主細胞の中のAsA中間体の生産を高める方法に関係する。本側面の一の態様において、変性された宿主細胞を得るために、本明細書で定義される少なくとも2のサブユニットを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含む。この方法において、発現されたポリヌクレオチドを有する宿主細胞を適切な条件下で培養することによりAsA中間体が生産される。本側面の第二の態様において、AsA中間体は、好ましくは、2-KDG又は2,5-KDGである。本側面の他の態様において、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドは、
a) 配列番号41、5及び23
b) 配列番号42、4及び22
c) 配列番号39、6及び24
d) 配列番号40、3及び29
e) 配列番号57、19及び38
f) 上記a)からe)の配列の各配列と少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する配列並びに
g) 上記a)からf)の配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の実施において、違った形で定義されない限り、当業者により用いられる遺伝子組み換え技術を含む、分子生物学、ミクロ生物学、細胞生物学、バイオテクノロジーの分野の通常の技術が用いられる。そのような技術は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2<nd> Ed. (Sambrook, J. et al., 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 and annual updates); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed., 1984); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION (Mullis et al., eds., 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 2<nd > Ed. (A. L. Demain et al., eds 1999); MANUAL OF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY (P. Gerhardt et al., eds) pp. 210-213, American Society for Microbiology, Washington D.C., and BIOTECHNOLOGY: A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2<nd> Ed. (T. D. Brock, 1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Maに記載されいている。
【００１６】
本明細書で開示される特定の方法論、手順及び試薬に本発明を限定することは意図しない。
【００１７】
本明細書で参照される特許及び刊行物並びにこれらの文献中に記載されている配列は、参照により本明細書に援用する。
【００１８】
本明細書で提供される標題は、本発明の各側面又は態様を制限するものではない。これらは、明細書全体の参照のために用いる。
【００１９】
A. 定義
違った形で定義されない限り、全ての技術的及び科学的用語は、本発明の技術分野において、当業者に、通常理解されている意味と同じ意味に用いる。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., JohnWiley and Sons, New York (1994) 及び Hale & Marham, THE HARPER DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, New York (1991)は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な辞書として用いる。
【００２０】
本明細書では以下の略語を用いる：グルコース (GL)、D-グルコネート (GA)、2-ケト-D-グルコネート(2-KDG)、2,5-ジケト-D-グルコネート(2,5-DKG)、2-ケト-L-グルコン酸 (2-KLG)、L-イドン酸 (IA)、5-ケト-D-グルコネート(5-KDG)、アスコルビン酸 (AsA)、グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)、グルコネートデヒドロゲナーゼ (GADH)、2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (2-KDGDH)及び2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ (DKGR)。
【００２１】
ここで用いる、「アスコルビン酸(ASA)中間体」の語は、酵素学的又は化学的手段により、生物化学的に、ASAに転換されうるものを意味し、GA、2-KDG、2,5-DKG、5-KDG IA及び2-KLGを含むがこれらに限定されない。
【００２２】
L-アスコルビン酸 (AsA)、ビタミンCの活性を有するD-アラボアスコルビン酸 (エリソルビン酸)、 L-アラボアスコルビン酸、及び、D-キシロアスコルビン酸の4の立体異性体もAsA中間体に含まれる。
【００２３】
本明細書で用いる「GDH」又は「GDH活性を有するタンパク質」の語は、グルコース(GL)立体異性体をGAへ転換することを触媒する能力を有するタンパク質を意味する。
【００２４】
本明細書で用いる「GADH」又は「GADH活性を有するタンパク質」の語は、GA立体異性体を2-KDGに転換することを触媒する能力のあるタンパク質を意味する。例えば、
a) orfs 1842、1841及び1840;
b) orfs 2037、2036及び2035;
c) orfs 3653、3652及び3651; 及び
d) orfs 3689、3688及び3687
の群から選択されるオペロンを含む多重結合型酸化権限酵素複合体は、GADH活性を有する。
【００２５】
「2-KDGDH」又は「2-KDGDH活性を有するタンパク質」の語は、2-KDG立体異性体を2,5-DKGに転換することを触媒する能力を有するタンパク質を言う。2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ(DKGR)は、2,5-DKG立体異性体から2-KLGへの転換を触媒する能力を有するタンパク質を言う。
【００２６】
本明細書で用いる「酸化還元酵素タンパク質」の語は、酸化-還元(redox)酵素又は電子供与体(還元剤又は還元されるもの)から電子受容体(酸化剤又は酸化されるもの)に電子を輸送する電子輸送タンパク質を意味する。
【００２７】
通常、酸化還元酵素は5つの異なる群に分類される：
a) ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotinamide adeninedinucleotide)(NAD) 又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(nicotine adeninedinucleotide phosphate)(NADP)を補酵素として必要とし、ドナーから補酵素へ、補酵素からNADH又はNADPHへの電子の可逆的輸送を触媒する、ピリジン結合デヒドロゲナーゼ
b) 補欠分子団としてフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD）又はフラビンモノヌクレオチド(FMN)を含むフラビン結合デヒドロゲナーゼ
c) 2から8の鉄原子及び同数の酸に不安定な硫黄原子を含む鉄・硫黄タンパク質、該鉄原子はFe(II)-Fe(III)への遷移を受ける
d) 鉄ポルフィリン補欠分子団を含むチトクローム、及び
e) 補酵素Q、脂質可溶性補酵素としても知られているユビキノン。
【００２８】
ピリジン結合型デヒドロゲナーゼシステムの例は、DNA結合型グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びエタノールデヒドロゲナーゼ、及びNADP結合型グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む。フラビン結合型デヒドロゲナーゼシステムの例は、FMNを含むNADHからの電子の輸送を触媒するNADHデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイル(dihydrolipoyl）デヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ及びアルデヒドオキシダーゼである。鉄硫黄タンパク質の例は、NADHデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びフェドキシンを含む。チトクロームの少なくとも5の異なるタイプは、吸光分光分析によるデータに基づき同定され、それらは、チトクロームa、a3、b、c及びc1を含む。
【００２９】
本明細書で用いる「多重結合型酸化還元酵素複合体」の語は、酸化還元活性を有するお互いに作動可能に結合した少なくとも2のポリペプチドサブユニットを意味する。一の態様において、該多重結合型酸化還元酵素複合体は、オペロンとして知られている単一の転写単位で構成される3のサブユニットを含む。本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体は、上で参照する5の酸化還元酵素のいずれか一の酸化還元酵素又はタンパク質を含む。
【００３０】
本明細書で用いる「サブユニット」の語は、所定の機能を有し、そして、タームドメイン（term domain）との相互作用的に用いられるアミノ酸配列の連続する各部分を意味する。
【００３１】
「チトクロームC(CytC）」又は「CytCタンパク質」の語は、1又は2、通常2でタンパク質に結合する1又は幾つかのヘムcグループを有し、それゆえ、システイン残基のスルフヒドリル基に含まれるように結合する酸化還元酵素を意味する。このヘム鉄リガンドは、通常ヒスチジン残基により提供される(Pettigrew et al. (1987) CYTOCHROMES C. BIOLOGICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin; Moore et al. (1990) CYTOCHROMES C: EVOLUTIONARY, STRUCTURAL AND PHYSIOCHEMICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin; and Ambler (1991), Biochim. Biophys. Acta 1058:42-47)。
【００３２】
「CytCサブユニット」の語は、上で参照される多重結合型酸化還元酵素の成分を意味する。この成分は上で定義されるCytCの構造及び機能を有している。
【００３３】
本明細書で用いる「デヒドロゲナーゼ」の語は、通常NAD、NADP及びFAD等の補酵素又は共因子と共に、一の基質から水素を除去し、他の分子に輸送することを含む酸化還元酵素反応を触媒する酵素を意味する。本明細書における好ましいデヒドロゲナーゼは、NADPを補酵素として必要とするピリジン結合型デヒドロゲナーゼの区分に属するものであって、NAD又はNADPのいずれかを形成するために、ドナーから補酵素への電子の可逆的輸送を触媒する。
【００３４】
「アルファサブユニット」と互換的に用いられる「デヒドロゲナーゼサブユニット」の語は、上で定義されるデヒドロゲナーゼの構造及び機能を有する、多重結合型酸化還元酵素の成分を意味する。
【００３５】
「核酸」の語はヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片または部分、及びセンスまたはアンチセンスストランドのいずれを表すかにかかわらず、2本鎖または1本鎖のゲノムまたは合成されたDNA、cDNA及びRNAをいう。
【００３６】
「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合により結合されているアミノ酸残基より成る化合物を言う。「アミノ酸」の語は、自然発生する全てのL-α-アミノ酸を言い、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含む。アミノ酸は1文字又は3文字記号のいずれかにより同定される。本明細書で用いられる「プロテイン」の語は「ポリペプチド」の語と同義であり、2以上のポリペプチドについても言う。従って、「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」の語は、互換的に使用される。遺伝コードの退縮の結果として所与のタンパク質をエンコードする核酸配列の多数が生産されることは当業者に理解されている。
【００３７】
他の配列に対して所定のパーセンテージの配列相同性(例えば80％、85％、90％、又は95％)を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、候補配列に対して整列させたときに、所定のパーゼンテージの候補配列中のヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基が参照される配列のヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基と同一であることを意味する。
【００３８】
本明細書で用いる「オペロン」の語は、共通のプロモーターから形成される単一の転写単位として転写される、2以上の構造遺伝子のクラスターを意味する。オペロン遺伝子は、関連する代謝機能を有するタンパク質をコードする。オペロンを含む遺伝子は隣接遺伝子である。
【００３９】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域(例えば、5’非翻訳(5’UTR)またはリーダー配列及び3’非翻訳(3’UTR)またはトレーラー配列)に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片(エクソン）間の介在配列(イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４０】
「オープンリーディングフレーム(orf）」の語は、タンパク質に対するコード配列を含む遺伝子の領域として定義される。
【００４１】
「ベクター」の語は、ある核酸を宿主細胞の中へ導入することを意図して作成された、ポリペプチド構築体である。「発現ベクター」の語は、異種核酸構築体を外来細胞中に取り込み及び発現させる能力を有するベクターを意味する。多くの真核及び原核発現ベクターは市販されている。適切な発現ベクターを選択することは当業者の知識の範囲内である。発現ベクターは、通常、宿主細胞の中で特定の核酸を転写させることのできる連続する特定の核酸要素で、組換え的に又は合成的に生成する。発現ベクターは、プラスミド、染色体、ンミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイルス又は核酸フラグメント内に取り込まれる。本明細書における「プラスミド」及び「ベクター」の語は、互換的に使用されることもある。通常、ベクターは、他の配列、転写される核酸配列及びプロモーターに混じって含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接機能する核酸配列を意味する。プロモーターは通常、所望の遺伝子を発現させる宿主細胞に適したものである。プロモーターと共に、他の転写及び転写調節核酸配列が所与の遺伝子の発現に必要である。通常、転写及び転写調節遺伝子はプロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始剤及び停止配列及びエンハンサー並びに活性因子配列を含むがこれらに限定されない。
【００４３】
「作動可能に結合する」の語は、複数の核酸配列がお互いに機能的な位置に置かれていることを言う。例えばあるコード配列がこの配列の転写に影響をするならば、プロモーターは作動可能に結合している。通常「作動可能」とは、結合されるDNA配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、結合されるDNAが隣接しておりかつ読みとり枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。結合は好適な制限酵素認識部位で連結することにより達成される。そのような部位が存在しない場合、当該技術分野においては合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【００４４】
「単離」または、「精製」の語は、本来関係のある、少なくとも１の成分を除去した、酵素、核酸、タンパク質、ペプチド、または、共因子を言う。
【００４５】
「染色体組み込み」の語は、導入された核酸が宿主細胞内に取り込まれる過程を言う。この工程は、好ましくは、相同組換えであることが好ましい。
【００４６】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」及び「細胞培養」は、ベクター又は本発明の構築物で形質転換する又は形質転換された、各細胞、細胞系統、細胞培養及び収穫された培養を意図して互換的に用いられる。これらの語は、該ベクター又は構築物により形質転換された細胞の子孫についても用いる。
【００４７】
本明細書で用いる「組換え体」の語は、例えば、宿主細胞の中には自然発生することがない核酸配列を付加した宿主細胞、又は、宿主細胞の中に自然発生する核酸を修飾することによってゲノムを修飾した宿主細胞を意味する。
【００４８】
「変性宿主細胞」は、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット、又は、本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードする1以上の導入ポリペプチドを含む宿主細胞を言う。
【００４９】
「対応する非変性宿主細胞」は、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードする導入ポリペプチドを含まない宿主細胞であり、通常、実質的に同じ培養条件下で成長させた変性宿主細胞との比較に利用される。
【００５０】
「高められた」の語は、対応する変性されてない宿主細胞と比較したときに変性された宿主細胞の中の酵素、基質又は生産物の活性、生産量又は蓄積のレベルを言う。
【００５１】
本明細書で用いる「ポリオール」の語は、多くの水酸基を有するアルコール分子を意味する。「ケト-ポリ誘導体」の語は、ポリオール分子の中に、1以上のケト基を有するポリオールを意味する。ポリオールは、グルコース、グルコネート、マンノース、イドース、キシロース、アラビノース、グリセロール、及びジヒドロキシアセトンのL型又はD型のいずれか一方を言い、又はグルコースとグルコネート等のこれらの組み合わせも意味し、及び、2-KLG、GA、イドン酸、6-リン酸グルコネート、2-KDG、5-ケト-D-グルコン酸、2,3-L-ジケトグルコン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸、及びマンノン酸を含むが、これ以外の6炭糖酸も意味する。
【００５２】
「ポリオールデヒドロゲナーゼ」は、酸化還元反応を触媒し、ポリオール基質を使用する酵素を意味する。
【００５３】
「炭素基質」の語は、グルコース、グロース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノース、グリセロース、及びジヒドロキシアセトンのD又はL型のいずれか、又は、グルコースとフルクトース等のこれらの組み合わせ、及び、2-KLG、GA、イドン酸、6-リン酸グルコネート、2-KDG、5-ケト-D-グルコニック酸、2,3-Ｌ-ジケトグルコン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸及びマンノン酸を意味するが、これら以外の6-炭糖並びに他の炭水化物も含む。幾つかの好ましい態様において、該炭素基質は、ヘキソース又はペントースである。ポリオール及び炭素基質の語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５４】
「所望の生産物」の語は、炭素基質から酵素的誘導により得られた化合物を意味する。特定の好ましい態様において、該所望の生産物は、有機酸(すなわち、グルコン酸及び他のAsA中間体、スクシニニル酸、クエン酸、酪酸)である。
【００５５】
本明細書で用いる。「腸内細菌科(Enterobacteriaceae)」は、グラム陰性の遺伝的特徴を有し、条件的嫌気性であるバクテリア系統を意味する。好ましい腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統は、D-グルコース溶液から2,5-ジケト-D-グルコン酸を生産することができるものである。
【００５６】
腸内細菌科(Enterobacteriaceae)のファミリーに含まれるものは、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エシェリキア(Escherichia)属及びパントエア(Pantoea)属である。
【００５７】
本発明において好ましい腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統は、パントエア(Pantoea)属である。パントエア(Pantoea)属には、パントエアアグロメランス(P. agglomerans)、パントエアディスペルサ(P. dispersa)、パントエアパンクタタ(P. punctata)、パントエアシトレア(P. citrea)、パントエアテレア(P. terrea)、パントエアアナナス(P. ananas)及びパントエアステワルティ(P. stewartii)を含む。例えば、パントエアシトレア(P. citrea)は、ATCC登録番号39140を有し、ATCC (マナッサ、バージニア州) から入手することができる。パントエアシトレア(P. citrea)は、エルウィニアシトレア(Erwinia citreus)又はアセトバクターセリヌス(Acetobacter cerinus)とも言われる。従って、パントエア(Pantoea)属は、エルウィニアシトレア(Erwinia citreus)又はアセトバクターセリヌス(Acetobacter cerinus)を含むがこれらに限定されない、再分類された種も含む。
【００５８】
他の態様において、好ましいバクテリア宿主細胞系統は、シュードモナス (Pseudomonadacea) 科のファミリーの系統を含む。これらのバクテリア系統は、グラム陰性で、通常胞子形成をしない。このファミリーに含まれるものは、パントエアアエルギソーナ(P. aeruginosa)、パントエアアルカリジーナス（P. alcaligenes）、パントエアフルオレセンス（P. fluorescens）、パントエアデニチリフィカンス（P. denitrificans）、パントエアプティーダ（P. putida）、パントエアスピーシーズ（P. species (sp)）、パントエアシリンゲア（P. syringae）、パントエアオレオオボランス（P. oleovorans）、パントエアメンドシーナ（P. mendocina）、パントエアプセウドアルカリジーン（P. pseudoalcaligenes）である。
【００５９】
他の好ましい細菌系統は、バチルス(Bacillus)細胞である。バチルス(Bacillus)には、当業者にバチルス(Bacillus)であると認識されている全てのメンバーを含み、バチルススブチルス（B. subtilis）、バチルスリケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルスレンタス（B. lentus）、バチルスブレビス（B. brevis）、バチルスステアロセレモフィリス（B. stearothermophilus）、バチルスアルカロフィルス（B. alcalophilus）バチルスアミロロケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルスクラウシ（B. clausii）、バチルスハロドランス（B. halodurnas）、バチルスメガテルム（B. megaterum）バチルスコアギュランス（B. coagulans）、バチルスサーキュランス（B. circulans）、バチルスロータス（B. lautus）及び バチルススリンギエンス（B. thuringiensis）を含むがこれらに限定されない。
【００６０】
本明細書で用いる「異種の」という語は、宿主細胞の中に自然発生しない核酸又はアミノ酸配列を言う。本明細書で用いる「内性」という語は、宿主細胞に自然発生する核酸を意味する。
【００６１】
本明細書で用いる「発現」の語は、ポリペプチド又はタンパク質が遺伝子の核酸配列に基づいて生産される工程を意味する。この工程は転写及び翻訳の両者を含む。「過剰発現」の語は、宿主細胞の中で同じ遺伝子生産部のコピーの数が増えることを意味する。
【００６２】
細胞に核酸配列を挿入する意味に用いる「導入」の語は、「形質転換」、「形質導入」又は「トランスフェクション」を意味し、核酸配列を原核生物の細胞内への核酸の取り込みを意味することを含む。核酸は、細胞のゲノム内へ取り込まれ(例えば、染色体、プラスミド、又は、ミトコンドリアDNA)、自律レプリコンに転換され、あるいは、過度に複製される(例えば形質転換されたmRNA又はDNA)。
【００６３】
「培養」の語は、培養管の中で所望の生産物を生産するために炭素基質を発酵転換することを意味する。特定の好ましい態様において、培養は所望の生産物の生産に適した環境下で微生物有機体を育成することを含む。
【００６４】
「酵素的転換」の語は、本発明に包含される酸化還元酵素複合体又はデヒドロゲナーゼ酵素と炭素基質とを接触させることにより、炭素基質を所望の生産物に修飾することを言う。幾つかの態様において、接触は、多重結合型酸化還元酵素複合体を発現している変性バクテリア宿主細胞に炭素源を曝すことを含む。いくつかの態様において、該炭素基質の酵素転換は、酸化であり、所望の生産物を生産する酸化経路の一部である。非限定的な例において、グルコネートが、グルコースの酵素転換の酸化生産物である。更なる非限定的な例において、グルコースから2-KDG及び2,5-DKGの酵素的転換は、1の酸化経路中に2又は3の酵素を含む。幾つかの態様において、炭素基質の酵素的転換は還元である。
【００６５】
グルコネート等の、本明細書で述べられる多くの成分は、培地の環境に依存してイオン形態で存在することは当業者に理解されている。例えば、グルコン酸分子を意図するグルコン酸のような文言は、同じ文言で参照される物質の全てのイオン状態を含む。したがって、「D-グルコン酸」及び「D-グルコネート」の語は、同じ有機化合物を意味し、特定のイオン状態又は化学式を有するものを意図するものではない。
【００６６】
本明細書で用いる「含む(comprise)」の語及びその同義語は、包含することを意味する。すなわち、「含む(including)」及びその同義語を意味する。「一の(A)」「一の(an)」及び「この(The)」はとくに違った形で示さない限り、複数も意味するものする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
B. 実施態様
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書で提供されるのは新規なタンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸である。本明細書では、前記タンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸の使用も提供する。さらに、本明細書では前記タンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸を宿主細胞の中で生産する方法も提供する。さらに本発明の一態様において、多重結合型複合体は酸化還元酵素のファミリーの中に属すると同定されており、チトクロームCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット及びガンマサブユニットの3のサブユニットを含む。前記ガンマサブユニットの機能は同定されていない。
【００６８】
CytCは多くのタンパク質に含まれるものであり、異なる数多くの還元反応において機能する(Pettigrew et al., CYTOCHROMES C. BIOLOGICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1987))。本発明を任意の方法に限定するわけではないが、CytCの役割は基質を特異的に還元することである。本明細書に記載されるCytCの幾つかのタイプは以下の用である：
0から+500mVの還元電位を伴う1-2ヘム基を有するクラス1
0から+150mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスIIa
0から+500mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスIIb
-400から0mVの還元電位を伴う3から16ヘム基を有するクラスIII
-80から+400mVの還元電位を伴う4ヘム基を有するクラスIV
+200から+290mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスc1
-276から+47mVの還元電位を伴う1及び2のへ無機を有する各種サブグループを有するクラスｃ554。
【００６９】
さらにCytCファミリーに属するタンパク質はCys-X-X-Cys-Hisのヘムコンセンサス配列を含む。この配列においてHis残基はヘム鉄の2のアキシアルリガンドの1つでありXは任意のアミノ酸残基を示す(Mathews, F. S. (1985) Prog. Biophys. Mol. Biol. 45:1-56)。参考資料はタンパク質ファミリー及びドメインのPROSITEデータベースにより作成されている。本発明の好適な態様においてCytCは1から4の間の数のヘム基を有することが好ましい。すなわち、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4のヘム基を有していることが好ましい。本発明における好適なCytCは、3のヘム基を有している。図16A及び図16B参考のこと。これらの図において、各CytC orfに対応する3のヘムコンセンサス配列が示されている。
【００７０】
一の態様において、単離CytCは図4Aから4B及び5Aから5B(配列番号20-38)で示すアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列に対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列のいずれか一つを含む。
【００７１】
一の好ましい態様において、単離CytCは配列番号20-29(図4Aから4B)及びこれらの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか一つを含む。一の好ましい態様において、単離されたCytCは配列番号22のアミノ酸配列及び少なくともこの配列と90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む。第二の態様において、単離CytCは、配列番号23のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。第三の態様において、単離CytCは、配列番号24のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。第四の態様において、単離CytCは、配列番号29のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。
【００７２】
他の好ましい態様において、単離CytCは、配列番号30-38(図5A-5B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか一を含む。さらに好ましくは、単離CytCは、配列番号38のアミノ酸配列及びこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のいずれか一つを含む。
【００７３】
本発明の更なる好ましい態様は、本発明のCytCをエンコードするポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、図11A-11H及び12A-12H(配列番号78-96)で示される核酸配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか一つを含む。
【００７４】
一の態様において、CytCをエンコードする核酸配列は、配列番号78-87で示される配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のうちのいずれか一つを含む。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号80及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号81で示される配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。
【００７５】
好ましくは、CytCをエンコードする核酸配列は、配列番号82及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。好ましくは、このCytCをエンコードしている核酸配列は配列番号87及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するものである。
【００７６】
他の態様において、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号88-96で示される配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のうちのいずれか一つである。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は配列番号96で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。
【００７７】
更なる態様において、本発明は、配列番号20-38のうちのいずれか一つのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCをエンコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
上で定義されたCytC配列は、本明細書で概説するCytC配列に対して実質的に相同な核酸及び/又はアミノ酸配列により同定される。このような相同性は、核酸又はアミノ酸配列全体を基にすることができ、相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれか一方を用いた、以下で概説する手順を用いて検出することができる。本発明で用いる相同性の語は、配列の同一性を意味する。相同性は、Smith & Waterman の局所相同アルゴリズム（the local homology algorithm of Smith & Waterman, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482）、Needleman & Wunsch のホモロジーアラインメントアルゴリズム（the homology alignment algorithm of Needleman & Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443）、Pearson & Lipman の類似法の検索（the search for similarity method of Pearson & Lipman,(1988) PNAS USA 85:2444-2448）及びこれらのアルゴリズムをコンピュータによる実行（computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)）及びDevereux によるベストフィット配列プログラム（the Best Fit sequence program described by Devereux, et al. (1984), Nucl. Acid Res. 12:387-395）を含むがこれらに限定されない本発明の技術分野における標準的方法を用いて検出することができる。多重配列アルゴリズム（the multiple sequence alignment program） CLUSTRAL W (Thompson et al. (1994) Nuclei
c Acid Research 22: 4673-4680)も参照のこと。
【００７９】
有用なアルゴリズムの一は、PILEUPである。PILEUPは、連続的な対合アラインメントを用いた関連する配列のグループから多重配列アラインメントを作り出す。PILEUPはアラインメントを作り出すためのクラステリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。PILEUPは、Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360の連続的アラインメント方法の簡略形を用いる。この方法は、Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153に記載されている方法と似ている。有用なPILEUPパラメータは3.00のデフォルトギャップウエイト、0.10のデフォルトギャップ長ウエイト及びウエイトエンドギャップを含む。
【００８０】
好ましい態様において、多重配列解析はDNASTARの レーザジーンプログラム（the Lasergene program）を用いて行う。DNASTARはメガリンプログラム（Megalign program）version 3.12におけるクラスターアルゴリズム（Clustal alugorithm）を用いる。デフォルト多重配列アラインメントパラメータは10のギャップペナルティー及び10のギャップ長ペナルティーを含む。対合アラインメントのデフォルトパラメータは、1のKtuple、3のギャップペナルティー、5のウインド及び5の保存されたダイアゴナル（diagonals）を含む。
【００８１】
他の有用なアルゴリズムの例は、Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403-410 and Karlin, et al. (1993), PNAS USA 90:5873-5787に記載されているBLAST algorithmである。特に有用なBLASTアルゴリズムは、Altschul, et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)から得られるWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は幾つかのサーチパラメータを用いる。これらのパラメータはほとんど規定値として設定されている。
【００８２】
調節可能パラメータは以下のように設定されている: オーバーラップスパン（overlap span）=1、オーバーラップフラクション（overlap fraction）=0.125、ワードスレッシュホールド（word threshold(T)）=11。HSP S 及びHSP S2 パラメータは、変動値であり、検索される所望の配列に対する、所定の配列の組成及び特定のデータベースの組成をもとに、プログラムを用いて確立される。しかしながら、この値は、感度を高くするために調節されることがある。A%のアミノ酸配列相同性の値は、整列された領域におけるより長い配列の残基の総数により分配されている整合する同じ残基の数により決定される。この「より長い」配列は、整列領域内における実質的な残基を有するものである（アラインメントを最大化するためのWU-Blast-2により導入されるギャップは無視する。）
アップデートされたBALSTアルゴリズムは、Altschul, et al. (1997), Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402に記載されている。特定の有用なBLASTプログラムは、Basic BLASTである。好ましいパラメーターは、Lambda K H 0.318、0.135、0.401 及びgapped Lambda K H 0.27、0.0470、0.23、マトリックス: BLOSUM62、ギャップペナルティー: エグジステンス（existence） 11、エクステンション（extension） 1である。
【００８３】
一の態様において、配列番号78-96のうちのいずれか一つで示す核酸と、少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するCytCをエンコードする核酸配列はハイブリダーゼーション試験を通じて検出される。一の態様は、図11又は図12で同定される配列又はこれと相補的な配列に高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を含む。
【００８４】
高ストリンジェンシー条件は、本発明の技術分野で知られており、例えば、Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d Edition (1989) 及び SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed Ausubel et alに記載されている。ストリンジェント条件は、配列に依存しており、環境において異なる。より長い配列は、より高い温度でハイブリダイズする。核酸配列のハイブリダイゼーションの更なるガイドは、Tijssen, TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays (1993)である。通常、ストリンジェンシー条件は、特定のイオン強度及びpHにおける特定の配列に対する融解温度(Tm)より約5-10℃低い温度から選択される。このTmは所定環境の(所定のイオン強度、pH及び核酸の濃度における)平衡条件下で、標的に相補的なプローブの50％がハイブリダイズする温度である。ストリンジェント条件は、pH7.0から8.3において、塩濃度が約1.0M未満、通常約0.01から1.0Mのナトリウムイオン濃度(又は他の塩)及び、短いプローブ(例えば10から50ヌクレオチド)に対しては少なくとも30℃、及び長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド)に対しては少なくとも約60℃である。ストリンジェント条件はホルムアミド等の不安定剤(destabilizimg agent)の添加により達成することができる。
【００８５】
他の態様において、当該技術分野で知られているように、より低いストリンジェント条件が使用される。例えば、中又は低いストリンジェント条件が用いられる。Maniatis及びAusubel、上記、及びTijssen上記を参照のこと。
【００８６】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)も相同配列の検出に使用することができる。参考文献は、Chen et al., (1995) Biotechniques 18(4):609-612である。
【００８７】
本発明は、微生物の中で他のCytC又はデヒドロゲナーゼタンパク質を検出するためのプローブとして使用する、本明細書で定義されるCytC又はデヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードするポリヌクレオチドを使用する方法も提供する。一の態様において、配列番号59-77(デヒドロゲナーゼタンパク質に対して)又は配列番号78-96(CytCタンパク質に対して)のうちのいずれか1由来の、少なくとも10、15、20、25、30、40、50又はそれ以上の連続する塩基がプローブとして使用される。更に、本発明に有用なオリゴヌクレオチドプローブは配列番号1-19(デヒドロゲナーゼタンパク質に対して)のうちのいずれか一つ及び配列番号20-38(CytCタンパク質に対して)のうちのいずれか一つの配列の中に、少なくとも5、10、15、20、25、30又はそれ以上の連続したアミノ残基を有するポリペプチドをエンコードする配列を含む。上に記載するハイブリダイーゼション試験は、各微生物内及び特にパントエア(Pantoea)属の微生物の中のCytC及びデヒドロゲナーゼタンパク質を同定するために使用される。
【００８８】
他の態様において、発明は、図2A-2C及び3A-3B(配列番号1-19)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む単離されたデヒドロゲナーゼを含む。一の態様において、このデヒドロゲナーゼは、フラビン結合したデヒドロゲナーゼ及び他の態様においてこのデヒドロゲナーゼは、ピリジン結合したデヒドロゲナーゼである。更なる態様において、このデヒドロゲナーゼは、ポリオールデヒドロゲナーゼ(PDH)活性を有する。参考文献は、Nordling et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4267-4276である。このデヒドロゲナーゼのPDHファミリーはソルビトールデヒドロゲナーゼを含む(Saito et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:454-460)。
【００８９】
他の態様において、単離されたデヒドロゲナーゼは、配列番号1-10(図2A-2C)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
好ましくはこの単離されたデヒドロゲナーゼは、
a) 配列番号3のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
b) 配列番号4のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
c) 配列番号5のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び
d) 配列番号6のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
を含む。
【００９１】
他の好ましい態様において、本発明の単離デヒドロゲナーゼは、配列番号11-19(図3A-3B)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。好ましくは、単離デヒドロゲナーゼは、配列番号19のアミノ酸配列を含む。一の好ましい態様において、このデヒドロゲナーゼはフラビン結合しているデヒドロゲナーゼである。
【００９２】
本発明の更なる態様は、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする単離ポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、図9A-9J及び10A-10H(配列番号59-77)で示す核酸配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか1を含む。
【００９３】
1の態様において、デヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号59-68(図9A-9J)で示される配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか一つである。デヒドロゲナーゼをエンコードする好ましい核酸配列は、
a) 配列番号61で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列
b) 配列番号62で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列
c) 配列番号63で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％98％及び99％の相同性を有する配列及び
d) 配列番号64で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列、である。
【００９４】
他の態様において、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号69-77(図10A-10H)で示す配列及びこれと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する核酸配列のうちのいずれか1つである。一の好ましい態様において、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号77で示す配列を有する核酸配列を含む。
【００９５】
更なる態様において、発明は、配列番号1-19又はこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９６】
配列相同は、上で概説するCytC配列の場合と同様に、相同性プログラムあるいはハイブリダイゼーション条件のいずれかにより検出される。
【００９７】
デヒドロゲナーゼアッセイは良く知られており、2-KDGとともに懸濁されたMGT上の成長を利用してBouvet et al. (1989) Int. J. Syst. Bacteriol. 39:61-67に記載されているように検出することができる。参考文献は、Shinagawa and Ameyama (1982) Meth. Enzymol. 89:194-198である。
【００９８】
酸化還元酵素複合体
本発明の一の態様において、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、少なくとも2のサブユニットを含み、該複合体は、少なくとも2の遺伝子を含むオペロンによりコードされている。このサブユニットは、本明細書で定義されるCytCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含む。他の態様においてこの多重結合型酸化還元酵素複合体は、少なくとも3の遺伝子を含むオペロンによってコードされる異なる分子量の3のサブユニットを含む。このサブユニットは、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット及び配列番号39-57(図6A-6B及び7)又はこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか1のアミノ酸配列をエンコードする核酸であると同定される第三のサブユニットを含む。
【００９９】
好ましい単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、(a)配列番号20-38(図4A-4B及び5A-5B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCサブユニット及び(b) 配列番号1-19(図2A-2C及び3A-3B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼサブユニットを含む。一の好ましい態様において、多重結合型酸化還元酵素複合体サブユニットは、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号38及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％、及び99％の相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体のデヒドロゲナーゼサブユニットは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号19及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
他の態様において、単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、さらに、配列番号39-57(図6A-6B及び7)及び、これらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか1のアミノ酸配列を有する第三のサブユニットを含む。一の態様において、この第三のサブユニットは、配列番号39-48及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。この態様に関して、第三のサブユニットは、約220-265アミノ酸残基、約225-255アミノ酸残基及び約235-250アミノ酸残基を含む。一の好ましい態様において、この第三のサブユニットは、配列番号49-57及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1からのアミノ酸配列を含む。この態様において、第三のサブユニットは約155-215アミノ酸残基、約165-205アミノ酸残基及び約170-200アミノ酸残基を含む。好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体の第三のサブユニットは、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号57及びこれらの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
本発明の他の態様において、単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、a)配列番号20-38及びこれらに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれかを有するサブユニットをコードする第一ポリヌクレオチド、及びb)配列番号1-19及びこれらに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれかを有するデヒドロゲナーゼサブユニットをコードする第二ポリヌクレオチドによりエンコードされる。この単離多重結合型酸化還元酵素は、さらに、配列番号39-57及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸のいずれかを有するアミノ酸をコードする第三のポリヌクレオチドによりエンコードされる。一の好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、配列番号24、配列番号38のアミノ酸配列又はこれらと少なくとも98％の相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCサブユニットをエンコードする。一の好ましい態様において、第二のポリヌクレオチドは配列番号6、配列番号19のアミノ酸配列又は、これと少なくとも98％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードする。
【０１０２】
更なる態様において、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、a)CytCサブユニットをエンコードしている第1ポリヌクレオチド(前期ポリヌクレオチドは、配列番号28-96で定義される核酸配列及び少なくともこれらに対して90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する)及びb) デヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードしている第2ポリヌクレオチド(前期ポリヌクレオチドは、配列番号59-77で定義される核酸配列及び少なくともこれらに対して90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する)によりエンコードされる。更に、多重結合型酸化還元酵素複合体は、c)第三のサブユニットをエンコードする第三のポリヌクレオチドによりエンコードされる。前記第三のポリヌクレオチドは、配列番号97-115(図13A-13E及び14A-14C)及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する。
【０１０３】
一の態様において、このCytCサブユニットは、多重結合型酸化還元酵素複合体オペロン中のラスト遺伝子を表す。他の態様において、デヒドロゲナーゼサブユニットは多重結合型酸化還元酵素複合体の中の最も大きい分子量を有するサブユニットによって表されている。
【０１０４】
他の好ましい単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、図1A及びBで定義される19オペロンのいずれか一を含む。より具体的には、
(1) 配列番号46、1及び20；
(2) 配列番号48、8及び27；
(3) 配列番号41、5及び23；
(4) 配列番号44、7及び28；
(5) 配列番号42、4及び22；
(6) 配列番号45、9及び26；
(7) 配列番号43、2及び21；
(8) 配列番号47、10及び25；
(9) 配列番号39、6及び24；
(10) 配列番号40、3及び29；
(11) 配列番号52、18及び34；
(12) 配列番号55、14及び35；
(13) 配列番号53、31及び16；
(14) 配列番号57、19及び38；
(15) 配列番号12、50及び32；
(16) 配列番号54、13及び37；
(17) 配列番号58、56、15及び36；
(18) 配列番号51、17及び33；
(19) 配列番号30、49及び11、並びに
(20) 配列番号(1)-(19)のオペロンのサブユニットに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するサブユニットを有するオペロン、である。
【０１０５】
一の好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体サブユニットは、2-KDGDH活性及び、配列番号57、配列番号19及び配列番号83のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(14)(図1)を有する。
【０１０６】
他の好ましい態様において、この多重結合型酵素複合体は、GADH活性を含み、
a) 配列番号41、5及び23のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(3)
b) 配列番号42、4及び22のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(5)
c) 配列番号39、6及び24のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(9)
d) 配列番号40、3及び29のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(10)及び
e) オペロン(3)、(5)、(9)又は(10)のサブユニットのそれぞれに対して少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するサブユニットを有するオペロン
から成る群より選択されるオペロンを含む。
【０１０７】
多重結合型酸化還元酵素複合体の更なる好ましい態様において、オペロン(3)、オペロン(5)、オペロン(9)及びオペロン(10)のオペロンを含むサブユニットは他のオペロンに結合される。例えば、オペロン(9)のデヒドロゲナーゼサブユニットを表す配列番号6は、a)オペロン(3)のCytCサブユニットを示す配列番号23、b)オペロン(5)のCytCサブユニットを表す配列番号22、又はc)オペロン(10)のCytCサブユニットを示す配列番号29と結合させることができる。
【０１０８】
上で述べる単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、好ましくは、以下で定義される核酸配列を有するポリヌクレオチドによりエンコードされる。
【０１０９】
(1) 配列番号 104、59 及び 78；
(2) 配列番号 106、66 及び 85；
(3) 配列番号 99、63 及び 81；
(4) 配列番号 102、95 及び 86；
(5) 配列番号 100、62 及び80；
(6) 配列番号 103、67 及び 84；
(7) 配列番号 101、60 及び79；
(8) 配列番号 105、68 及び 83；
(9) 配列番号 97、64 及び82；
(10) 配列番号 98、61 及び 87；
(11) 配列番号 110、76 及び92；
(12) 配列番号 113、72 及び93；
(13) 配列番号 111、89 及び74；
(14) 配列番号 115、77 及び96；
(15) 配列番号 70、108 及び90；
(16) 配列番号112、71 及び95；
(17) 配列番号 114、73 及び94；
(18) 配列番号 109、75 及び 91；
(19) 配列番号 88、107 及び69: 及び
(1)-(19)の配列と少なくとも90%、93%、95%、96%、97%、98%、及び 99%の配列相同性を有する配列。
【０１１０】
好ましい多重結合型酸化還元酵素複合体は、GADHと同定されているものであるか、あるいは、これに似た活性を有する複合体(Matsushita, et al. (1982) METHODS IN ENZYMOLOGY 89: 187-193; Yum et al. J. of Bacteriol. (1997) 179:6566-6572; Matsushita et al. (1979), J. Biochem. 85:1173; and Kulbe et al. (1987), Ann. N.Y. Acad. Sci 506:552)及び2-KDGHDHと同定されているもの、あるいは、これに似た活性を有する複合体(Shinagawa et al. (1982) Methods in Enzymology 89: 194-198; Pujol et al. (2000) J. Bacteriol. 182:2230-2237 and Stroshane (1977) Biotechnol. BioEng 19:459)を含む。
【０１１１】
図1A及び1Bに挙げるオペロンの各種orfは、in vitroで組換えられる。この遺伝子フラグメントは、例えば、改善された酵素活性、安定性、又は修飾された基質特異性を有する新しい酸化還元酵素複合体タンパク質を生成する手段として利用される。In vitroでの組換えは、DNAシャッフリングのような良く知られた技術及びその他の変法により行うことができる(Stemmer W. P. (1994) PNAS USA 91:10747-10751; Stemmer W. P. (1994) Nature 370:389-391; Zhao et al., (1999) Protein Eng. 12: 47-53; Zhao et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26: 681-683 and Arnold et al. (1997) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol 58: 1-14)。DNAシャッフリングは、複数の対合する配列由来の遺伝子フラグメントをPCRにより再構築させる相同組換えに関係する。配列交叉は高い相同性配列のポイントで生じる。
【０１１２】
他のin vitro組換え技術は、Wells et al., (1985) Gene 34: 315-323 及び Wang and Malcom (1999) Biotechniques 26: 680-682に記載のものを含む。当業者は、新しい遺伝子変異体を生成するための非相同ランダム組換えも用いることができる。参考文献はBittker et al., (2002) Nat. Biotech. 20:1024-1029)である。
【０１１３】
ベクター
本発明は、本明細書で述べるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主細胞に関係する。微生物有機体の中にベクターとして使用することができるプラスミドは、良く知られており、参考文献は、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. (1989); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (1989) and Bron, S. Chapter 3, Plasmids in MOLECULAR BIOLOGY METHODS FOR BACILLUS, Eds. Harwood and Cutting (1990) John Wily & Sons Ltdである。
【０１１４】
腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統へ非自然発生タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを導入するための好ましいプラスミドの一つは、グラム陰性及びグラム陽性バクテリアを含む幅広いバクテリア宿主細胞内で複製する能力を有し、可動性ではあるが自己複製プラスミドではないRSF1010である(Frey et al., (1989), The Molecular Biology of IncQ Plasmids, In: Thomas (Ed.) PROMISCUOUS PLASMIDS OF GRAM NEGATIVE BACTERIA, Academic Press, London pp.79-94 and Frey et al. (1992) Gene 113:101-106)。
【０１１５】
本明細書で開示されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット、多重結合型酸化還元酵素複合体又はオペロンをエンコードするポリヌクレオチドに有用なプロモータは、オペロン本来のプロモータも含む。しかしながら、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも使用することができる。一の有用なハイブリッドプロモーターは、trp及びlacプロモーターのハイブリッドであるtacプロモーターである。プロモーターは当該技術分野においてよく知られいており、参考文献は、Sommer et al. (2000) Microbiol. 146:2643-2653; Brosius et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:3539; Russell and Bennett (1982) Gene 20: 231; Mulligan et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 3529; Deuschle et al., (1986) EMBO J. 5:2987-2994; Amann et al. (1983) Gene 5: 167-178 and Amore et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotech. 30:351-357である。機能しているプロモーター配列に加えて、形質転換されたバクテリア系統の選択をするために、発現ベクターは好適なボゾーム結合部位及び選択遺伝子を含むこことができる。適切な選択遺伝子はアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びテトラマイシンの様な薬物耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーはヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン合成経路の中の生物合成遺伝子を含む。
【０１１６】
遺伝子導入
バクテリア細胞に対する遺伝子導入技術は、良く知られており、これらの技術は、形質転換、形質導入、接合及びプロトプラスト融合を含む。遺伝子導入は、ポリヌクレオチド、遺伝子又は遺伝子を細胞に輸送する過程であり、外来遺伝子はバクテリアに取り込まれる。一般的な形質転換手順は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Vol. 1 Ausubel et al. Eds., John Wiley and Sons, Inc. 1987, Chapter 9)に記載されている。これらの技術は、塩化カルシウム法、DEAE-デキストラン法及びエレクトロポレーションを用いた形質転換を含む。参考文献はU.S. Pat. No. 5,032,514; Potter, H. (1988) Anal. Biochem. 174:361-373; Sambrook, supra and Ferrari et al., Genetics pgs 57-72 in BACILLUS, Harwood et al., Eds. Plenum Publishing Corpである。宿主細胞の形質転換は、選択遺伝子発現の有無により検出することができる。
【０１１７】
宿主細胞
バクテリア細胞は本発明の好ましい宿主細胞であり、特に好ましいバクテリア宿主細胞は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)細胞である。特にエルウィニア(Erwinia)、エンテロバクター(Enterobacter) 、 グルコノバクター(Gluconobacter) 、クレブシエラ(Klebsiella) 、エシェリキア(Escherichia)及び パントエア(Pantoea) であり、最も好ましいのはパントエア属(Pantoea sp.)、クレブシエラ(Klebsiella sp.)属及び大腸菌(E. coli)細胞である。特に好ましいパントエア(Pntoea)細胞は、パントエアシトレア(P. citrea)及びパントエアアグロメランス(P. agglomerans)であり、参考文献は、U.S. Pat. No. 5,032,514; Truesdell et al., (1991) J. Bacteriol. 173:6651-6656 及び ATCC 登録番号 39140である。他の好ましいバクテリア宿主細胞系統はシュードモナス科(Pseudomonadaceae)の系統である。バチルス(Bacillus)系統は、宿主細胞として提供される。
【０１１８】
一の態様において、宿主細胞は、図1A及び1Bに示す19オペロンのいずれか1を含むベクターで形質転換される。好ましくは、宿主細胞は、
a) 配列番号 3 及び配列番号 29;
b) 配列番号 4 及び配列番号 22;
c) 配列番号 5 及び配列番号 23;
d) 配列番号 6 及び 配列番号 24 並びに
e) a)-d)の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%及び99%の配列相同性を有する配列で定義される配列をエンコードするポリヌクレオチドで形質転換される。
【０１１９】
宿主細胞は、配列番号19及び配列番号38で定義される配列ならびに配列番号19又は配列番号38に対して少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する配列をエンコードするポリヌクレオチドで形質転換される。
【０１２０】
他の態様において、バクテリア宿主細胞は、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを含むアミノ酸配列を有する多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドで形質転換される。アルファサブユニットは、デヒドロゲナーゼ活性を有しており、配列番号1-19の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。ガンマサブユニットは、配列番号39-57の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。チトクロームCサブユニットは配列番号20-38の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。
【０１２１】
上で述べたように、バクテリア宿主細胞は、組換え宿主細胞でもよい。宿主細胞の修飾は、本発明に関係するCytC、デヒドロゲナーゼ又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを導入するのと同時に、あるいは、その後に、従来技術を用いて行うことができる。組換え宿主細胞は内性染色体遺伝子の欠失、阻害等の染色体の不活性化、内性染色体遺伝子の発現を増加させる修飾、及び外来遺伝子の導入を含む。他の態様において、該宿主細胞グルコース又は他の代謝物を2-KDG又は2-KLGに転換するのに有効な既知の酵素をエンコードする遺伝子を含むように修飾される。一般的代謝物を2-KDG又は2-KLGに転換するのに有効な酵素の非限定的な例は、D-グルコースデヒドロゲナーゼ (Adachi, O. et al., (1980) Agric. Biol. Chem., 44:301-308; Ameyama, M. et al., (1981) Agric. Biol. Chem. 45:851-861; Smith et al. (1989) Biochem. J. 261:973; and Neijssel et al., (1989) Antonie Van Leauvenhoek 56(1):51-61); D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (McIntire, W. et al., (1985) Biochem. J., 231:651-654; Shinagawa, E. et al., (1976) Agric. Biol. Chem. 40:475-483; Shinagawa, E. et al., (1978) Agric. Biol. Chem. 42:1055-1057; and Matsushita et al. (1979), J. Biochem. 85:1173); 5-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (Shinagawa, E. et al., (1981) Agric. Biol. Chem., 45:1079-1085 and Stroshane (1977) Biotechnol. BioEng. 19(4) 459); 及び 2,5-ジケト-D-グルコン酸リダクターゼ (U.S. Pat. Nos.: 5,795,761; 5,376,5
44; 5,583,025; 4,757,012; 4,758,514; 5,008,193; 5,004,690; and 5,032,514)である。
【０１２２】
酸化還元生成物の回収及び検出
酸化還元反応物の検出に有効な方法は、陰イオン交換を用いた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)(J. Chrom. 1980, 196:163)、電子酸化還元法(electro-redox procedures)(Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364)、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー及び質量分析を含む。当業者は、これらの検出方法を適用するための適切な制御方法を知っている。AsA中間体及びAsA立体異性体の検出に対する方法は、2,6 ジクロロインドフェノール (Burton et al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17:105) 又は他の適切な試薬を用いた酸化還元滴定を含む。
【０１２３】
この酸化還元酵素反応生成物及び特に、AsA中間体等のケトポリオール誘導体が生産されると、凍結乾燥、結晶化、噴霧乾燥及び電気透析方法等の本技術分野で既知の方法を用いて、回収及び/又は精製を行う。
【０１２４】
細胞培養及び発酵
バクテリア細胞の維持および成長に適した方法はよく知られており、参考文献は、the MANUAL OF METHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY, Eds. P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC (1981)及びT. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2nd ed. (1989) Sinauer Associates, Sunderland, MA.である。
【０１２５】
細胞の前培養 - 通常、細胞の培養は、25から32℃、好ましくは、28から29℃において、適した培地の中で行われる。本発明に有用な成長培地の例は、広く商業的に調製されている培地であって、例えば、LB (Luria Bertani)培養液、サブローデキストロース(SD)培養液、又は酵母培地(YM)等である。これらは、例えば、ギブコ(GIBCO/BRL) (ゲイザーズバーグ、 メリーランド州)から入手することができる。用いられる他の所定の培地または合成培地および特定のバクテリア微生物の成長に適した培地は、微生物学または醗酵化学の分野ではよく知られている。発酵に適したpHの幅は、pH5からpH8である。種フラスコ(seed flask)についてはpH7からpH7.5であり、及び、反応容器についてはpH5からpH6である。本発明の方法の実施について説明するうえで、発酵微生物の分野の当業者は、アスコルビン酸中間体の生産量を最大にするために、発酵工程に影響する多くの因子を最適化する必要があることを理解している。これらの因子の多く(例えば、pH、炭素源の濃度、及び溶存酸素量など)は、アスコルビン酸中間体の生産に用いられる細胞タイプに応じて酵素工程に影響を与え得る。
【０１２６】
ASA中間体の生産は、醗酵環境すなわち、in vivo環境、あるいは、非醗酵環境すなわち、in vitro環境、あるいは、in vivo環境とin vitro環境を組み合わせて実施することができる。醗酵または生物反応は、バッチ法、フェドバッチ法、または連続法で行われる。
【０１２７】
インビボ生体触媒環境
本発明の修飾宿主細胞の培養による生体触媒反応は、適切な炭素源を用いた環境で、通常、腸内細菌または他の細菌系統を用いる。適切な炭素源は、例えば、六炭糖(例えばグルコース等)、又は六炭糖酸、或いは、六炭糖及び／又は六炭糖酸の組合せを含む。その他の炭素源には、ガラクトース、ラクトース、フルクトース、又はそれらの酵素誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
加えて、醗酵培地は、適切な炭素源、グルコース等の単糖類、ラクトースやスクロース等のオリゴ糖、澱粉やセルロース等の多糖類、及び、再生可能な供給原料(例えば、乳清透過物、コーンスティップリカー、甜菜の糖蜜、及び大麦の麦芽)に由来する未精製混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、当該炭素源には、炭素等の一炭素基質も含まれ得る。本発明に用いられる炭素源は、種々の炭素含有基質を包含することができ、それは微生物の選択によってのみ制限されることを考慮すると、好ましい炭素基質にはグルコース及び/又はフルクトース、及びそれらの混合物が含まれる。本明細書に記載の修飾ゲノムと組合せてグルコースとフルクトースの混合物を用い、さらに、異化経路を酸化経路と切り離すことによって、宿主細胞の代謝の要求を満たすためにフルクトースを用いつつも、所望のアスコルビン酸中間体の収率及び転化率の向上のためにグルコースを用いることができる。適切な炭素源に加えて、発酵培地は、アスコルビン酸中間体を生産するために必須な酵素経路を触媒し、宿主細胞の成長又は培養に適した、適切なミネラル、塩類、ビタミン類、補因子、及びバッファーを含有する必要がある。
【０１２９】
バッチ、フェドバッチ、および連続培養
本発明は、バッチ醗酵法、フェドバッチ法といわれる変性バッチ法、または、連続醗酵法を用いる。
【０１３０】
古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更は受けない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、pHや酸素濃度等の因子を制御することは頻繁になされる。バッチ法では、当該方法における代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで定常的に変化する。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に緩和され、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。培養液が未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
【０１３１】
標準的なバッチ法における変法の１つは、フェドバッチ法である。フェドバッチ発酵方法も本発明に適しており、基質が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的なバッチ法と同様である。フェドバッチ法は、異化の抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培養液における基質の量を制限するのが望ましい場合に有用である。フェドバッチ法において基質濃度を実測することは困難であり、それゆえ、例えば、pH、溶存酸素量、及び廃ガス(例えば、CO2)分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて基質濃度を推定する。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において広く周知であり、その例はBrockの文献(T. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland,MA)に記載されている。
【０１３２】
一の態様において、供給溶液中の炭素基質の濃度は、重量/重量ベースで約55％から約75％である。他の態様において、この濃度は、重量/重量ベースで約60％から約70％である。
【０１３３】
連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、同量のならし培養液(conditioned media)が発酵工程から除去される。一般に、連続発酵では、培地は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期成長にある。連続発酵により、細胞の成長又は最終生成物の濃度に影響を与える１又はそれ以上の因子の調節が可能となる。例えば、１の方法は、栄養分(例えば、炭素源)又は一定の割合で提供される窒素量を制限し、その他全ての因子を緩和する方法である。別の方式では、培養液の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつも、成長に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続法は定常状態の成長条件を維持することから、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞成長速度と等しくなる必要がある。連続発酵工程における栄養分及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知であり、種々の方法が前記Brockの文献に記載されている。
【０１３４】
一の態様において、本発明は、適切な条件下でポリオール又は炭素基質を有するバクテリア宿主細胞内でポリオール又は炭素基質の酵素転換を高める方法に関係する。該バクテリア宿主細胞は、本発明により包含される多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチド並びにデヒドロゲナーゼサブユニット又はチトクロームCサブユニットをエンコードするポリヌクレオチドを誘発するように修飾されたバクテリア細胞を含む。該ポリヌクレオチドは修飾された宿主細胞の中でポリオール又は炭素基質を所望の生産物に転換させる。前記ポリオール又は炭素基質の酵素転換は実質的に同じ培養条件下で発現させた非修飾バクテリア宿主細胞と比較すると高められている。幾つかの好ましい態様において、ポリオール又は炭素基質の該酵素転換はグルコースから有機酸又は糖酸又はケト誘導体への酸化転換である。糖酸の例は、アルドン酸及びウロン酸を含む。より具体的には、ソルビトール、グルコン酸、グルカル酸、及び2-KDG、5-KDG及び2,5-DKGも含む。他の態様において、ポリオール又は他の炭素基質の酵素的転換は還元転換である。
【０１３５】
さらに他の態様において、本発明は、適切な培養条件下で修飾宿主細胞をポリオール又は炭素基質(例えば、グルコース又はフルクトース)と接触させること及びポリオール又は炭素基質の酵素的転換から所望の生成物の生産することを含む、前記糖酸のような所望の生産物を生産する方法を含む。ここで修飾されたバクテリア細胞は、本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体、デヒドロゲナーゼ、チトクロームCタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換することにより得られる。
【０１３６】
本発明を実施する手順及び方法は以下の実施例を参照することより当業者に容易に理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の範囲及びこれに関する請求項の範囲を限定するものではない。本明細書中に参照される全ての参考文献、特許及び刊行物は参照により本明細書に援用する。
【０１３７】
実施例
【実施例１】
【０１３８】
実施例1パントエア(Pantoea citrea)ゲノムの配列決定
パントエア(P. citrea)ゲノムの約95％は、Birren B. et al., (1999) GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL., Vol. 3 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されているような標準的な手順を用いた典型的なライブラリーを構築することにより配列決定されている。簡単に述べると、パントエアシトレア(P. citrea)ゲノムDNAは0.6から1.0キロベースの平均サイズを有するランダムフラグメントを生産するために超音波処理することにより物理的に剪断される。このDNAフラグメントは、鈍化末端を有し、pUC18内でクローンされる(New England BioLabs, Beverly, Mass)。ライブラリーの量が、ランダムにピックアップされた50-100コロニーの配列決定から解析されると、このライブラリーからのコロニーをランダムに採取し、PCR(Dunham et al. (1999) Bacterial Cloning Systems, pages 41-57 in GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL. Vol. 3 Birren B. et al., (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press NY)により増幅させ、PCRによる反応物を、配列決定に用いる。配列決定は、Applied Biosystems 3700 DNA sequencers (Perkin-Elmer, Foster City, Calif.)を用いて行う。各クローンは、前向き及び後ろ向きpUC18プライマーを用いて両末端から配列決定される。平均400-500塩基対が各鋳型より得られた。このアプローチによって、68,389読み取りを行い、合計で、34,788,222ベースペア(bp)を読み取った。これらの配列から合計で4,439,491bpを産出した224の隣接した配列を構築することができた。TBLASTプログラムを、所与のDNAをOrfに翻訳するために使用し、3のOrfを含む少なくとも19オペロンに、Saito et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:454-460により報告されているソルビトールデヒドロゲナーゼ配列との類似性に基づいて初めに注釈(タグ)をつけた。
【０１３９】
ガンマサブユニットのOrfのサイズを利用して、19オペロンを2のグループに分ける。ファミリー1は約238から249のアミノ酸残基のガンマサブユニットを有する10のメンバーを含む。図1Aを参照のこと。ファミリー2は、約174から195アミノ酸のガンマサブユニットを有する9のメンバーを有する。図1Bを参照のこと。19のオペロンのそれぞれがorfを含んでいるという観察は、自然環境下に存在するパントエアシトレア（P.citrea）において、これらすべての遺伝子が必然的に機能を保持していることを示唆する。上流遺伝子のDNA配列の付加的な解析の結果は、すべての遺伝子は適切なリボゾーム結合部に先行することを示している(データ非表示)。
【実施例２】
【０１４０】
実施例2-オペロンの失活による、配列番号57、配列番号19及び配列番号38を有する2-KDGDHオペロンをエンコードするorf2418-2420(配列番号115、配列番号77及び配列番号96に対応)の検出
2-KDGHDHオペロンのクローニング
139-2a/Ps-系統は、2-KDGDHオペロンのクローニングに使用された。この系統は、ATCC登録番号39140を有する139-2a系統の誘導体である。クリプティック(cryptic)プラスミド(pS)は、WO98/59054に記載の方法により除去された。参考文献はTruesdell et al., (1991) J. Bacteriol. 173:6651-6656である。
【０１４１】
KDGF1及びKDGR1の2のPCRプライマーを用いてパントエアシトレア(P. citra)139-2a/Ps-系統の染色体由来の2-KDGDHオペロンを包含する2.8-kbDNAフラグメントを標準的な手法を用いて増幅した(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Ed.)。
【０１４２】
KDGF1 5' AGTTAGCCGCTCATTTCCTG 3' (配列番号116)
KDGR1 5' AGCCGCCTGGTTTTTAC 3' (配列番号117)
【０１４３】
DNAフラグメントは、大腸菌(E.coli)TOP10細胞を宿主細胞として用いたlacプロモーター(lacP)(Invitrogen, Carlsbad Calif.)を有するpZeroBluntベクター内でクローンされた。このことによりプラスミドpKDG2(6.32kb)が得られる。LA+Kan50 プレート(1.5% アガー及び50 ppm カナマイシンを含む)Lb培地上で 3の KanR形質転換体が得られた。適切な制限酵素(EcoRI、Scal+、Spel、Sal1+Spel)を用いた消化により確認すると、この3全ての形質転換体は挿入部分を有し、転写方向は、lacPの伸長方向とは反対であることがわかった。
【０１４４】
パントエアシトレア(P. citrea)染色体由来の2-KDGHオペロンの欠失に用いるノックアウトプラスミドの構築
通常のプラスミドを利用した相同組換えによる遺伝子の失活に使用する手法は前に説明されている。参考文献は、Miller et al., (1988) J. Bacteriol. 170:2575-2583である。この一般的な手法を、2-KDGDHオペロンの失活に用いた。
【０１４５】
上に実施例に従って得られたpKDG2プラスミドは、アルファサブユニットの中央からC末端の0.993-kb領域を除くためにHpal+Scal酵素で消化された。このプラスミドはその後2のloxp site(Palmeros et al., (2000) Gene 247:255-264)で挟むように、catカセット(1.080-kb)に挿入し、pKDGCat(6.4-kb；catは2-KDGDHオペロンに対して反対方向に伸長する)を得た。このプラスミドを、Nal、Sacl、及びXbal酵素の消化により確認した。ColE1 Ori 領域を含む1.5-kbのAatll+Spelフラグメントを、プラスミドpKDGatlから除去し、その後、複製(ori)領域の最小R6K起源を含む502-bpのAstll+Spel ori DNAをプラスミドpGP704(Miller et al., (1988) J. Bacteriol. 170:2575-2583)をPCR基質とするプライマーを用いたPCRにより得た。このことにより最終的なノックアウトプラスミドpKDGCatR6(5.37-kb)が得られた。大腸菌（E. coli） PIR1系統(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)はSambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Edに記載の手順を用いて形質転換された。最終的なノックアウト構築物における960-bp及び840-bpの相同領域は、パントエアシトレア(P. citrea)染色体の中の相同組換えをさせるための2-KDGDHオペロンの5’末端及び3’末端に利用可能である。
【０１４６】
パントエアシトレア(P. citrea)系統の形質転換
最終的なノックアウトプラスミドpKDGcatR6(5.3kb)をHindIIIの消化により確認した後、このプラスミドをエレクトロポレーション(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Ed.)によりパントエアシトレア(P. citrea)139-2a/Ps-(pKD46)細胞に導入し、既知の方法を用いて、LA+Cm10プレート(LAは10ppmのCmを有するLB含有アガーである)上でクロラムフェニコール(CmR)耐性形質転換体を選択した。一重交叉組換えイベントと二重交叉組換えイベントを区別するために、LA+Kan3プレート上でCmR形質転換体のカナマイシンに対する感受性(KanS)を確認した。13のクロラムフェニコール耐性遺伝子のうちの9がKanSであった。このことは、この9の形質転換体が2-KDGDHオペロンを失活する二重交叉組換えイベントを有することを示す。4つの形質転換体、Nos. 4、5、8、及び9を、上で述べた内部及び外部プライマーを用いてPCRでチェックした。
【０１４７】
ノックアウト系統のPCR検証
2-KDGDHオペロンの欠失を検証するために用いる2の外部プライマーは、機能的なKDGDHオペロンを含む野生型及び2-KDGDHオペロンが欠失している成熟型変異体(変性系統)の両方において同じサイズのバンドに増幅される(参考文献は上に記載されている。ここにおいて、0.993-kbを1.08-kbcat-lolP DNAに換えて行う。)。
【０１４８】
1のcat遺伝特異プライマーを用いた1の外部プライマーを、成熟変異体の組換え結合部位の検証に用いた。Cat3+KDGR2プライマーを用いて4つ全ての形質転換体は、予想されたように1.4-kbのバンドを増幅した。これに対して、非変性系統は増幅を示さなかった。KDGF2+cat4プライマーを用いたときには形質転換体は予想されたように1.17-kbのバンドを増幅した。この結果は、4の形質転換体が、予想されたようにKDGの位置において、二重交差組換えイベントを受けていることをしめしており、それゆえ、このオペロンが失活しているということを示している。
【０１４９】
KDGF2 5' GCGTCTCTGCCATTGCGTAGTTTC 3' (配列番号 118)
KDGR2 5' GGGTGCGGATCGGTGTGGTTT 3' (配列番号 119)
CAT3 5' AAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCG 3' (配列番号 120)
CAT4 5' CAACAGTACTGCGATGAGTGGCAG 3' (配列番号 121)
【０１５０】
PKD46プラスミドの除去
変性系統はpKD46プラスミド(Datsenko and Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645)を含むことから、このプラスミドを以下のように処置した。細胞をカルベニシリン(Carb)を含まない液体培地中で30℃、3日間育成する。その後、平板培養し、単一のコロニーを単離した。LA+Carb200プレート上でCarb感受性を試験したときに全ての単一のコロニーは、pKD46プラスミドがないことが確認された(Datsenko and Wanner, 上記 及びPalmeros et al. (2000) Gene 247:255-264)。更に、上に記載したSambrook et al.に記載の標準的な手順を用いてプラスミドDNAを単離したときに、単離された単一のコロニーの中にはプラスミドは検出されなかった。PKD46プラスミドを処置したパントエア(Pantoea)が得られ、WKFDG4と称された。
【０１５１】
パントエアシトレア(P. citrea)を用いた発酵実験
バクテリア細胞の育成に使用する全ての試薬及び材料は特に示さない限り、Diffco Laboratories (Detroit, Mich.), Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.) or Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) から入手した。
【０１５２】
シードトレイン(seed train)：液体窒素中に保存した表示系統WKDG4を含む培養バイアルを空気中で解凍し、500 mlの種培地を含有する2リットルの無菌三角フラスコへ0.75 mlを添加した。このフラスコを29℃、250 rpmで12時間培養した。移転の指標は、2.5より大きなOD550である。
【０１５３】
種フラスコ培養液：培養液の組成は、KH2PO4(12.0 g/L)、K2HPO4(4.0 g/L)、MgSO4・7H2O(2.0 g/L)、ディフコソイトン(Difco Soytone)(2.0 g/L)、クエン酸ナトリウム(0.1 g/L)、フルクトース(5.0 g/L)、(NH4)2SO4(1.0 g/L)、ニコチン酸(0.02 g/L)、FeCl3・6H2O(5 mL/L(0.4 g/L保存溶液))、微量塩(5mL/Ｌ(0.58g/LのZnSO4・7H2O、0.34g/LのMnSO4・H2O、0.48g/LのNa2MoO4・2H2O)である。
【０１５４】
当該培養液のpHを、20％NaOHを用いて7.0±0.1に調節した。20 mg/L(10 g/Lの保存溶液の2 mL/L)の最終濃度まで、テトラサイクリンHClを添加した。その後、得られた培養液を、0.2μのフィルターでろ過滅菌した。無菌培地をオートクレーブ処理したフラスコに添加した。
【０１５５】
生産発酵槽‐無菌化前における反応容器への添加物は、KH2PO4(3.5 g/L)、MgSO4・7H2O(1.0 g/L)、(NH4)2SO4(0.92 g/L)、グルタミン酸ナトリウム(15.0 g/L)、ZnSO4・7H2O(5.79 mg/L)、MnSO4・H2O(3.44 mg/L)、Na2MoO4・2H2O(4.70 mg/L)、FeCl3・6H2O(2.20 mg/L)、及び、塩化コリン(0.112 g/L)、Mazu DF-204(0.167 g/L)及び消泡剤である。
【０１５６】
上記構成要素の培養液を121℃で45分間無菌化した。タンクの無菌化の後、ニコチン酸(16.8 mg/L)、パントテン酸Ca(3.36 mg/L)、グルコース(25 g/L)及びフルクトース(25 g/L)を発酵槽に添加した。
【０１５７】
無菌化及び無菌化後成分の添加の後の最終的な容量は、6.0Lであった。このように調製した槽と培養液を前述した種フラスコの全容量に接種し、最終容量が6.5Lとなった。
【０１５８】
成長条件は、29℃及びpH6.0であった。攪拌速度、背圧、及び風量は、溶存酸素が0より大きくなるように調節した。最初にバッチに添加された糖が使い果たされたとき、本明細書で用いるフェドバッチ方法を用いた。WKDG4(2-KDG含有量ｇ/L=300)系統で30時間培養した後に得られた2-KDGの生産は、139-2a/PS(2-KDG含有ｇ/L=0)と比較して有意な差があった。139-2a/Ps系統のみが更に2,5-DKGに転換される2-KDGを作る。
【実施例３】
【０１５９】
実施例3 2-KDGの形成に含まれる3651-3653 orfの検出
GADHオペロンのクローニング
2のPCRプライマー、GADHF1及びGADHR2はパントエアシトレア(P. citrea)の139-2a/Ps-系統の染色体からGADHオペロンを増幅するために用いた。
【０１６０】
GADHF1 (5'-P-CGGTACTGAGGCAATGTCATG 3') 配列番号 122
GADHR1 (5'-P-aCGGAGAGCCGGATATTACAT, 3') 配列番号 123
この配列においてPはリン酸であり、配列番号122のATGはGADHガンマサブユニットのorfの開始剤コドンである。
【０１６１】
増幅が正しく行われたかどうかを確認するためにこのDNAフラグメントを制限酵素(HindIII、Pstl及びSall)で消化した。このフラグメントはlacプロモーター(lacP)を含むpCL1920ベクターの少ないコピー数のHindII部位にクローンされた(Lerner et al., (1990) Nucleic Acid Res. 18:4631)。LA+Spec50+X-gal+IPTGプレート(LBプレートは、50ppmのスペクチノマイシン及び40μg/ml Xゲル及び50μM IPTG及び1.5％のアガーで固化する)上の16の白いコロニーの中で、2のコロニー(Nos.7及び11)のみが挿入を含んでいた。適切な制限酵素(HindII、Pstl、Spel+Clal；及びXbal+Bglll)で確認した結果、両プラスミド内の挿入の転写方向はもともとのlacPプラスミドと同じであった。これらのプラスミドの1をpCLE2-7（8.5-kb）と称し、GADHオペロンの発現プラスミドとして使用し、以下で述べるノックアウトプラスミドの構築に使用した。
【０１６２】
ノックアウトプラスミドの構築
デヒドロゲナーゼサブユニットの中央の領域を除去するためにpCELE2-7プラスミドをBsu361+Clal制限酵素で消化した。その後、catカセット(1080-bp)が2のloxPサイト(Palmeros et al. (2000) Gene 247: 255-264)に挟まれるように挿入され、プラスミドpCELECat1(8.62-kb；cat遺伝子は、GADHオペロンに対して反対方向に伸長する)が得られた。この4065-bp GADH-cat-loxP遺伝子クラスターは上記のGADHF1及びGADHR1プライマーを用いたプラスミドからPCRにより増幅され、その後、最終的なノックアウトプラスミドpE2CatR6-1(4.58-Kb)を生産するために、プラスミドpGP704由来の505-bp HindII+EcoRV R6K複製の最小オリジンに結合し、Sambrook(上記)に記載の手順を用いてE.coli PIR1系統(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)の中で形質転換する。最終構築物において、相同な1160-bp及び1825-bp領域は、パントエアシトレア(P. citea)染色体で相同組換えをさせるためのGADHオペロンの5’末端及び3’末端に利用可能である。
【０１６３】
パントエアシトレア(P.citrea)系統の形質転換及びGADH失活の検証
最終的なノックアウトプラスミドを適切な制限酵素(Aatll+Accl及びBgll+SnaBl)で消化した後、該プラスミドを上で述べた様にパントエアシトレア（P.citrea）139-2a/Ps-の中で形質転換した。そして、該形質転換体をLA+Cm12プレート上で選択した。数百のCmRコロニーが出現した。4のコロニーについてPCRでGADHオペロンの欠失をチェックした。
【０１６４】
2の外部プライマーは野生型及び成熟変異体において、同じサイズのバンドを増幅する(上記参照、910-bpコード領域は、1080-bp cat loxP DNAに換えて行う)。従って、1のcat遺伝子特異プライマーを有する1の外部プライマーが成熟変異体の検証に使用される。No.2の形質転換体のみが予想された2.46-kbバンドをcat3+E2R1プライマーで増幅した。
【０１６５】
Primer E2R1 5'-GCAGCCGCTACGCAGATAAAA-3' 配列番号 124
しかしながら、他の3の変異体(Nos. 1、3及び4)は、E2F1+cat4プライマーで予想された1.64-kbのバンドを増幅した。
【０１６６】
Primer E2F1 5'-CTCGGCGAAAAAGAACCAGACAAG-3' 配列番号 125
【０１６７】
この結果は、No.2の形質転換体のみが、GADHオペロンの3’末端で一重交叉組換えイベントが起こっていることを示し、他の形質転換体(Nos. 1、3及び4)はGADHオペロンの5’末端で一重交叉組換えイベントが起こっていることを示す。一重交叉組換えイベントはGADHオペロンを失活させないことから、上で説明したように我々はNo.2の形質転換体から二重交叉組換え体を単離した。
【０１６８】
No.2形質転換体は、液体培地中でサブ培養（sub-cultured）され、単一のコロニーを単離した。5の単一コロニーのうちの5つが、サブ培養（sub-culturing）後に、GADHオペロンの5’末端で第二交叉を生じていた。このことにより、139-2a/Ps-バックグラウンドを有する本当のGADH失活系統が得られた。
【０１６９】
さらに確認するために、上で述べた単一コロニー由来のPCR生産物を、適切な制限酵素で消化した。E2F1+cat4プライマーにより得られた1.6-kb生産物をXbal酵素で消化した。cat3+E2R1プライマーで得られた2.46-kb生産物は、Pstl酵素で消化された。両消化物は、予想されたように同じパターンを示した。従って、GADH欠失系統は、さらにこの方法により確認された。上から単離された単一コロニーはWTE2-1と称され保存された。
【０１７０】
発酵実験
WTE2-1(GADH欠失系統)及び139-2a/Ps-(野生型対照系統)は2-KDGDHについて上で概説したように育成され、グルコネートの蓄積を測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ】図1Aは、同定された19オペロンの配置図及び本発明の配列を示す。各オペロンは通常、ガンマサブユニット(塗りつぶしカラム）、アルファサブユニット(ブランクカラム）、オペロンチトクロームC(CytC)サブユニット(点描カラム）といわれる、少なくとも3のオープンリーディングフレームにより特徴づけられる。アルファサブユニットはデハイドロゲナーセ活性を有する。図1Aにおいて、ガンマ、アルファ、及びCytCサブユニットはオペロンの中に表されており、この10のオペロンのグループはファミリー1と称される。太矢印は、各オープンリーディングフレーム(orf)の同じ領域内のフランキング遺伝子を示す。Orf 764 は配列番号46のアミノ酸配列に対応する。Orf 765 は配列番号1のアミノ酸配列に対応する。Orf 766 は配列番号20のアミノ酸配列に対応する。Orf 1748 は配列番号48のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1749 は配列番号8のアミノ酸配列に対応する。Orf 1750 は配列番号27のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1842 は配列番号41のアミノ酸配列に対応する。Orf 1841 は配列番号5のアミノ酸配列に対応する。Orf 1840 は配列番号23のアミノ酸配列に対応する。Orf 1951 は配列番号44のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1952 は配列番号7のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1953 は配列番号28のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2037 は配列番号42のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2036 は配列番号4のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2035 は配列番号22のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2634 は配列番号45のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2633 は配列番号9のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2632 は配列番号26のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2910 は配列番号43のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2909 は配列番号2のアミノ酸配列に対応する。Orf 2908 は配列番号21のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3051 は配列番号47のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3052 は配列番号10のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3053 は配列番号25のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3653 は配列番号39のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3652 は配列番号6のアミノ酸配列に対応する。Orf 3651 は配列番号24のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3689 は配列番号40のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3688 は配列番号3のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3687 は配列番号29のアミノ酸配列に対応する。
【図１Ｂ】図1Bは、同定された19オペロンの配置図及び本発明の配列を示す。各オペロンは通常、ガンマサブユニット(塗りつぶしカラム）、アルファサブユニット(ブランクカラム）、オペロンチトクロームC(CytC)サブユニット(点描カラム）といわれる、少なくとも3のオープンリーディングフレームにより特徴づけられる。アルファサブユニットはデハイドロゲナーセ活性を有する。図1Bにおいて、ガンマ、アルファ、及びCytCサブユニットは通常保存されておらず、このオペロンのグループを本明細書では、ファミリー2と言う。太矢印は、各オープンリーディングフレーム(orf)の同じ領域内のフランキング遺伝子を示す。Orf 1219 は配列番号52のアミノ酸配列に対応する。Orf 1220 は配列番号18のアミノ酸配列に対応する。Orf 1221 は配列番号34のアミノ酸配列に対応する。Orf 1982 は配列番号55のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1983 は配列番号14のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1984 は配列番号35のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1957 は配列番号53のアミノ酸配列に対応する。Orf 1956 は配列番号31のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1955 は配列番号16のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2418 は配列番号57のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2419 は配列番号19のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2420 は配列番号38のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2448 は配列番号12のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2447 は配列番号50のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2446 は配列番号32のアミノ酸配列に対応する。Orf 3043 は配列番号54のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3042 は配列番号13のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3041 は配列番号37のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3397 は配列番号58のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3398 は配列番号56のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3399 は配列番号15のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3400 は配列番号36のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3676 は配列番号51のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3675 は配列番号17のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3674 は配列番号33のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3820 は配列番号30のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3819 は配列番号49のアミノ酸配列に対応する。Orf 3818 は配列番号11のアミノ酸配列に対応する。
【図２Ａ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図3Aから図3Bは、配列番号11-19を含むファミリー2オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図3Aから図3Bは、配列番号11-19を含むファミリー2オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図4Aから図4Bは、配列番号20-29を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】図4Aから図4Bは、配列番号20-29を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】図5Aから図5Bは、配列番号30-38を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】図5Aから図5Bは、配列番号30-38を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図６Ａ】図6Aから図6Bは、配列番号39-48を含むファミリー1オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図6Aから図6Bは、配列番号39-48を含むファミリー1オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図７】図7は、配列番号49-57を含むファミリー2オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図８】図8は配列番号58に対応するOrf3397のアミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｂ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｃ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｄ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｅ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｆ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｇ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｈ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｉ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｊ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図１０Ａ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｂ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｃ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｄ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｅ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｆ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｇ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｈ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１１Ａ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｂ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｃ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｄ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｅ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｆ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｇ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｈ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１２Ａ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｂ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｃ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｄ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｅ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｆ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｇ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｈ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１３Ａ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｂ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｃ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｄ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｅ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１４Ａ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１４Ｂ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１４Ｃ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１５】図15は、AsA中間体の経路を現したものである。この図において、グルコース(GL)をグルコネート(GA)に転換する酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)である。GAを2-KDGに転換する酸化酵素は、グルコネートデヒドロゲナーゼ(GADH）である。2KDGから2,5-DKGに転換する酸化酵素は2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ(KDGDH）である。2,5-DKGを2-KLGに転換する還元酵素は、2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ(DKGR)である。この2-KLGを回収し、化学転換によりL-アスコルビン酸(AsA)に転換する。
【図１６Ａ】図16A及び図16Bは、図4及び5に示すCytCタンパク質の中に見られ、Orfs 766、1840、1953、2035、2632、2908、3053、3651、3687、1750、3820、1956、1984、2420、2446、3041、3400、3674 及び1221に対応する3のヘム結合部位を示す。
【図１６Ｂ】図16A及び図16Bは、図4及び5に示すCytCタンパク質の中に見られ、Orfs 766、1840、1953、2035、2632、2908、3053、3651、3687、1750、3820、1956、1984、2420、2446、3041、3400、3674 及び1221に対応する3のヘム結合部位を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された自然発生及び組換え多重結合型酸化還元酵素複合体に関係する。より具体的には、本発明は、パントエアシトレアから単離された多重結合型酸化還元酵素複合体の同定及び使用に関係する。この複合体は、チトクロームCサブユニット及びデヒドロゲナーセサブユニットを含む。
【背景技術】
【０００２】
L-アスコルビン酸(AsA、ビタミンC)の合成及び製造は、ビタミン及び抗酸化剤としての市場規模並びにそれらには高い価値があることから注目されている。グルコースからASAを生産する化学的合成経路は、レイヒシュテイン-グルスナー(Reichstein-Grussner)方法として知られており、1934年に最初に開示された(Reichstein T. et al., (1934) Helv. Chim. Acta., 17 : 311-328 and Reichstein T. et al. (1933) Helv. Chim. Acta. 16: 561,1019)。近年ASA中間を生産するための方法が開示された。参考文献はLazarus et al.(1989）, Vitamin C: Bioconversion via a Recombinant DNA Approach, GENETICS AND MOLECULARBIOLOGY OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS, American Society for Microbiology, Washington D. C. Edited by C. L. Hershberger)； Crawford et al., (1980) Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 37: 79-155 (1980); Anderson et al., (1985) Sci. 230: 144-149; 及びSugisawa et al. (1990) Agric. Biol. Chem. 54:1201-1209である。
【０００３】
AsAの典型的な製造工程を図15に示す。通常、該工程は微生物が利用する代謝物、(例えばD-グルコース)を用いる。D-グルコネートデヒドロゲナーセ及び2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーぜを含む酵素的転換により、D-グルコースは、2,5-ジケト-D-グルコネート(2,5-DKG)を生産するための連続的な酸化を受ける。さらに、2,5-DKGは、2-ケト-L-グルコン酸(2-KLG)に還元される。この工程は、グルコノバクター(Gluconobacter)、アセトバクター(Acetobacter)、エルウィニア(Erwinia) 又はパントエア(Pantoea)等の微生物内で行われる。参考文献は、U.S. Pat. Nos. 3,790,444、3,922,194、3,959,076、3,998,697、4,245,049及び5,008,193等の各種米国特許である。AsAの市場の観点から、AsA中間体自体は、経済的及び工業的に重要な物質となってきていることから、炭素基質をAsA中間体に酵素的に転換するための微生物における転換効率を上げることは、好ましいことである。
【０００４】
他の微生物と比較して、グラム陰性腸内細菌科(Enterobacteria)のパントエアシトレア(Pantoea citrea)は、グルコースを転換し、異なるアルド及びケト-糖誘導体の他の糖、特に、AsA中間体、2,5-DKG及び2-KLGに転換する能力が高い。この転換において、該微生物における糖の転換能力に寄与している特性を同定するためにパントエアシトレアのゲノムが解析された。このゲノムの解析により、パントエア（Pantoea）ゲノムはサルモネラ(Salmonella）、クレブシエラ(Klebsiella） 及び大腸菌(E. coli）等の他の腸内細菌科の系統にある面ではよく似ているけれども、付加的な糖代謝能力を提供するための多くの異なる遺伝子を含んでいることが分った。
【０００５】
本発明は、パントエアシトレア(Pantoea citrea)ゲノムが、膜結合型の3成分を含む酸化還元酵素複合体をコードする遺伝子のファミリーを含んでいるという発見に基づいてなされたものである。具体的には、パントエアシトレア(P. citrea)ゲノムは、膜結合型の3成分を有する酸化還元酵素複合体をコードする19オペロンを含み、これらの各複合体は、チトクロームC相同体サブユニット及びデヒドロゲナーゼ活性を有するということが発見された。このことは、バチルススブチルス(Bacillus subtilis)、大腸菌(E. coli)及びシュードモナスアエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)等の他の既知の微生物のゲノムとは対象的である。バチルススブチルス(B. subtilis)及び大腸菌(E. coli)はチトクロームC相同体を含む多重結合型酸化還元酵素複合体を含むことは知られていいない。これに対してパントエアシトレア(P. citrea)は、チトクロームC相同体を含む3成分からなる1の多重結合型複合体を含むことが知られている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
第一の側面において、該発明は、チトクロームC(CytC）タンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド及びそれらのポリヌクレオチドによりエンコードされるCytCタンパク質に関係する。好ましいCytCタンパク質は、図4Aから4B及び5Aから5Bに示されるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
第二の側面において、本発明は、デヒドロゲナーゼをエンコードする単離ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによりエンコードされるデヒドロゲナーゼタンパク質に関係する。好ましくは、デヒドロゲナーゼは、図2Aから2C及び図3Aから3Bに示されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
第三の側面において、本発明は、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドに関係する。該複合体は、CytCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含み、該多重結合型複合体は、前記ポリヌクレオチドによりエンコードされる。
【０００９】
第四の側面において、本発明は、3のサブユニットを含むオペロンを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドに関係する。前記サブユニットは、CytCサブユニット、デヒドロゲナーセサブユニット及びガンマサブユニットを意図する第三のサブユニットを含む。
【００１０】
第五の側面において、本発明は、酸化還元酵素複合体をエンコードする3のコード領域を含むオペロンに関係する。該コード領域は、図1A及び1Bに示す19オペロンにより示される領域である。本側面の一の態様において、該オペロンは、orf 3653、orf 3652 及びorf 3651のオープンリーディングフレーム(orfs）を含む。本側面の第二の態様において、該オペロンは、orf 2418、orf 2419 及びorf 2420のorfsを含む。本側面の第三の態様において、該オペロンは、orf 1840、 orf 1841 及びorf 1842のorfsを含む。本側面の第四の態様において、該オペロンは、orf 2035、 orf 2036及びorf 2037のorfsを含む。本側面の第五の態様において、該オペロンは、orf 3687、 orf 3688 及びorf 3689のorfsを含む。
【００１１】
第六の側面において、本発明は、本明明細書において定義されるチトクロームCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関係する。さらに本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞にも関係する。好ましい宿主細胞は、パントエア(Pantoea)、クレブシエラ(Klebsiella)及び大腸菌(E. coli)の細胞である。
【００１２】
第七の側面において、本発明は、変性宿主細胞を得るために、本明細書で定義されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞の中で炭素基質を効率的に酵素を用いて酸化する方法に関係する。この方法において、ポリヌクレオチドが発現している変性宿主細胞を適切な条件下で培養し、基質の酸化を行う。酸化は、対応する変性されていない宿主細胞と比較すると高められている。この側面の好ましい態様において、基質はポリオールである。
【００１３】
第八の側面において、本発明は、変性宿主細胞を得るために本明細書で定義されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを用いて、形質転換する宿主細胞の中で炭素基質を効率的に酵素を用いて還元する方法に関係する。ここで、この方法において、ポリヌクレオチドが発現している変性宿主細胞を適切な条件下で培養し、基質の還元を行う。前記還元は、対応する変性されていない宿主細胞と比較すると高められている。この側面の好ましい態様において、基質はポリオールである。
【００１４】
第九の側面において、本発明は、宿主細胞の中のAsA中間体の生産を高める方法に関係する。本側面の一の態様において、変性された宿主細胞を得るために、本明細書で定義される少なくとも2のサブユニットを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを含む。この方法において、発現されたポリヌクレオチドを有する宿主細胞を適切な条件下で培養することによりAsA中間体が生産される。本側面の第二の態様において、AsA中間体は、好ましくは、2-KDG又は2,5-KDGである。本側面の他の態様において、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドは、
a) 配列番号41、5及び23
b) 配列番号42、4及び22
c) 配列番号39、6及び24
d) 配列番号40、3及び29
e) 配列番号57、19及び38
f) 上記a)からe)の配列の各配列と少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する配列並びに
g) 上記a)からf)の配列の組み合わせから成る群より選択される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の実施において、違った形で定義されない限り、当業者により用いられる遺伝子組み換え技術を含む、分子生物学、ミクロ生物学、細胞生物学、バイオテクノロジーの分野の通常の技術が用いられる。そのような技術は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2<nd> Ed. (Sambrook, J. et al., 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 and annual updates); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed., 1984); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION (Mullis et al., eds., 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 2<nd > Ed. (A. L. Demain et al., eds 1999); MANUAL OF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY (P. Gerhardt et al., eds) pp. 210-213, American Society for Microbiology, Washington D.C., and BIOTECHNOLOGY: A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2<nd> Ed. (T. D. Brock, 1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Maに記載されいている。
【００１６】
本明細書で開示される特定の方法論、手順及び試薬に本発明を限定することは意図しない。
【００１７】
本明細書で参照される特許及び刊行物並びにこれらの文献中に記載されている配列は、参照により本明細書に援用する。
【００１８】
本明細書で提供される標題は、本発明の各側面又は態様を制限するものではない。これらは、明細書全体の参照のために用いる。
【００１９】
A. 定義
違った形で定義されない限り、全ての技術的及び科学的用語は、本発明の技術分野において、当業者に、通常理解されている意味と同じ意味に用いる。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., JohnWiley and Sons, New York (1994) 及び Hale & Marham, THE HARPER DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, New York (1991)は、本発明で用いられる多くの用語の一般的な辞書として用いる。
【００２０】
本明細書では以下の略語を用いる：グルコース (GL)、D-グルコネート (GA)、2-ケト-D-グルコネート(2-KDG)、2,5-ジケト-D-グルコネート(2,5-DKG)、2-ケト-L-グルコン酸 (2-KLG)、L-イドン酸 (IA)、5-ケト-D-グルコネート(5-KDG)、アスコルビン酸 (AsA)、グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)、グルコネートデヒドロゲナーゼ (GADH)、2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (2-KDGDH)及び2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ (DKGR)。
【００２１】
ここで用いる、「アスコルビン酸(ASA)中間体」の語は、酵素学的又は化学的手段により、生物化学的に、ASAに転換されうるものを意味し、GA、2-KDG、2,5-DKG、5-KDG IA及び2-KLGを含むがこれらに限定されない。
【００２２】
L-アスコルビン酸 (AsA)、ビタミンCの活性を有するD-アラボアスコルビン酸 (エリソルビン酸)、 L-アラボアスコルビン酸、及び、D-キシロアスコルビン酸の4の立体異性体もAsA中間体に含まれる。
【００２３】
本明細書で用いる「GDH」又は「GDH活性を有するタンパク質」の語は、グルコース(GL)立体異性体をGAへ転換することを触媒する能力を有するタンパク質を意味する。
【００２４】
本明細書で用いる「GADH」又は「GADH活性を有するタンパク質」の語は、GA立体異性体を2-KDGに転換することを触媒する能力のあるタンパク質を意味する。例えば、
a) orfs 1842、1841及び1840;
b) orfs 2037、2036及び2035;
c) orfs 3653、3652及び3651; 及び
d) orfs 3689、3688及び3687
の群から選択されるオペロンを含む多重結合型酸化権限酵素複合体は、GADH活性を有する。
【００２５】
「2-KDGDH」又は「2-KDGDH活性を有するタンパク質」の語は、2-KDG立体異性体を2,5-DKGに転換することを触媒する能力を有するタンパク質を言う。2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ(DKGR)は、2,5-DKG立体異性体から2-KLGへの転換を触媒する能力を有するタンパク質を言う。
【００２６】
本明細書で用いる「酸化還元酵素タンパク質」の語は、酸化-還元(redox)酵素又は電子供与体(還元剤又は還元されるもの)から電子受容体(酸化剤又は酸化されるもの)に電子を輸送する電子輸送タンパク質を意味する。
【００２７】
通常、酸化還元酵素は5つの異なる群に分類される：
a) ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotinamide adeninedinucleotide)(NAD) 又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(nicotine adeninedinucleotide phosphate)(NADP)を補酵素として必要とし、ドナーから補酵素へ、補酵素からNADH又はNADPHへの電子の可逆的輸送を触媒する、ピリジン結合デヒドロゲナーゼ
b) 補欠分子団としてフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD）又はフラビンモノヌクレオチド(FMN)を含むフラビン結合デヒドロゲナーゼ
c) 2から8の鉄原子及び同数の酸に不安定な硫黄原子を含む鉄・硫黄タンパク質、該鉄原子はFe(II)-Fe(III)への遷移を受ける
d) 鉄ポルフィリン補欠分子団を含むチトクローム、及び
e) 補酵素Q、脂質可溶性補酵素としても知られているユビキノン。
【００２８】
ピリジン結合型デヒドロゲナーゼシステムの例は、DNA結合型グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びエタノールデヒドロゲナーゼ、及びNADP結合型グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含む。フラビン結合型デヒドロゲナーゼシステムの例は、FMNを含むNADHからの電子の輸送を触媒するNADHデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイル(dihydrolipoyl）デヒドロゲナーゼ、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ及びアルデヒドオキシダーゼである。鉄硫黄タンパク質の例は、NADHデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びフェドキシンを含む。チトクロームの少なくとも5の異なるタイプは、吸光分光分析によるデータに基づき同定され、それらは、チトクロームa、a3、b、c及びc1を含む。
【００２９】
本明細書で用いる「多重結合型酸化還元酵素複合体」の語は、酸化還元活性を有するお互いに作動可能に結合した少なくとも2のポリペプチドサブユニットを意味する。一の態様において、該多重結合型酸化還元酵素複合体は、オペロンとして知られている単一の転写単位で構成される3のサブユニットを含む。本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体は、上で参照する5の酸化還元酵素のいずれか一の酸化還元酵素又はタンパク質を含む。
【００３０】
本明細書で用いる「サブユニット」の語は、所定の機能を有し、そして、タームドメイン（term domain）との相互作用的に用いられるアミノ酸配列の連続する各部分を意味する。
【００３１】
「チトクロームC(CytC）」又は「CytCタンパク質」の語は、1又は2、通常2でタンパク質に結合する1又は幾つかのヘムcグループを有し、それゆえ、システイン残基のスルフヒドリル基に含まれるように結合する酸化還元酵素を意味する。このヘム鉄リガンドは、通常ヒスチジン残基により提供される(Pettigrew et al. (1987) CYTOCHROMES C. BIOLOGICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin; Moore et al. (1990) CYTOCHROMES C: EVOLUTIONARY, STRUCTURAL AND PHYSIOCHEMICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin; and Ambler (1991), Biochim. Biophys. Acta 1058:42-47)。
【００３２】
「CytCサブユニット」の語は、上で参照される多重結合型酸化還元酵素の成分を意味する。この成分は上で定義されるCytCの構造及び機能を有している。
【００３３】
本明細書で用いる「デヒドロゲナーゼ」の語は、通常NAD、NADP及びFAD等の補酵素又は共因子と共に、一の基質から水素を除去し、他の分子に輸送することを含む酸化還元酵素反応を触媒する酵素を意味する。本明細書における好ましいデヒドロゲナーゼは、NADPを補酵素として必要とするピリジン結合型デヒドロゲナーゼの区分に属するものであって、NAD又はNADPのいずれかを形成するために、ドナーから補酵素への電子の可逆的輸送を触媒する。
【００３４】
「アルファサブユニット」と互換的に用いられる「デヒドロゲナーゼサブユニット」の語は、上で定義されるデヒドロゲナーゼの構造及び機能を有する、多重結合型酸化還元酵素の成分を意味する。
【００３５】
「核酸」の語はヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片または部分、及びセンスまたはアンチセンスストランドのいずれを表すかにかかわらず、2本鎖または1本鎖のゲノムまたは合成されたDNA、cDNA及びRNAをいう。
【００３６】
「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合により結合されているアミノ酸残基より成る化合物を言う。「アミノ酸」の語は、自然発生する全てのL-α-アミノ酸を言い、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含む。アミノ酸は1文字又は3文字記号のいずれかにより同定される。本明細書で用いられる「プロテイン」の語は「ポリペプチド」の語と同義であり、2以上のポリペプチドについても言う。従って、「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」の語は、互換的に使用される。遺伝コードの退縮の結果として所与のタンパク質をエンコードする核酸配列の多数が生産されることは当業者に理解されている。
【００３７】
他の配列に対して所定のパーセンテージの配列相同性(例えば80％、85％、90％、又は95％)を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、候補配列に対して整列させたときに、所定のパーゼンテージの候補配列中のヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基が参照される配列のヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基と同一であることを意味する。
【００３８】
本明細書で用いる「オペロン」の語は、共通のプロモーターから形成される単一の転写単位として転写される、2以上の構造遺伝子のクラスターを意味する。オペロン遺伝子は、関連する代謝機能を有するタンパク質をコードする。オペロンを含む遺伝子は隣接遺伝子である。
【００３９】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域(例えば、5’非翻訳(5’UTR)またはリーダー配列及び3’非翻訳(3’UTR)またはトレーラー配列)に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片(エクソン）間の介在配列(イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００４０】
「オープンリーディングフレーム(orf）」の語は、タンパク質に対するコード配列を含む遺伝子の領域として定義される。
【００４１】
「ベクター」の語は、ある核酸を宿主細胞の中へ導入することを意図して作成された、ポリペプチド構築体である。「発現ベクター」の語は、異種核酸構築体を外来細胞中に取り込み及び発現させる能力を有するベクターを意味する。多くの真核及び原核発現ベクターは市販されている。適切な発現ベクターを選択することは当業者の知識の範囲内である。発現ベクターは、通常、宿主細胞の中で特定の核酸を転写させることのできる連続する特定の核酸要素で、組換え的に又は合成的に生成する。発現ベクターは、プラスミド、染色体、ンミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイルス又は核酸フラグメント内に取り込まれる。本明細書における「プラスミド」及び「ベクター」の語は、互換的に使用されることもある。通常、ベクターは、他の配列、転写される核酸配列及びプロモーターに混じって含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接機能する核酸配列を意味する。プロモーターは通常、所望の遺伝子を発現させる宿主細胞に適したものである。プロモーターと共に、他の転写及び転写調節核酸配列が所与の遺伝子の発現に必要である。通常、転写及び転写調節遺伝子はプロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始剤及び停止配列及びエンハンサー並びに活性因子配列を含むがこれらに限定されない。
【００４３】
「作動可能に結合する」の語は、複数の核酸配列がお互いに機能的な位置に置かれていることを言う。例えばあるコード配列がこの配列の転写に影響をするならば、プロモーターは作動可能に結合している。通常「作動可能」とは、結合されるDNA配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、結合されるDNAが隣接しておりかつ読みとり枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。結合は好適な制限酵素認識部位で連結することにより達成される。そのような部位が存在しない場合、当該技術分野においては合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【００４４】
「単離」または、「精製」の語は、本来関係のある、少なくとも１の成分を除去した、酵素、核酸、タンパク質、ペプチド、または、共因子を言う。
【００４５】
「染色体組み込み」の語は、導入された核酸が宿主細胞内に取り込まれる過程を言う。この工程は、好ましくは、相同組換えであることが好ましい。
【００４６】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」及び「細胞培養」は、ベクター又は本発明の構築物で形質転換する又は形質転換された、各細胞、細胞系統、細胞培養及び収穫された培養を意図して互換的に用いられる。これらの語は、該ベクター又は構築物により形質転換された細胞の子孫についても用いる。
【００４７】
本明細書で用いる「組換え体」の語は、例えば、宿主細胞の中には自然発生することがない核酸配列を付加した宿主細胞、又は、宿主細胞の中に自然発生する核酸を修飾することによってゲノムを修飾した宿主細胞を意味する。
【００４８】
「変性宿主細胞」は、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット、又は、本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードする1以上の導入ポリペプチドを含む宿主細胞を言う。
【００４９】
「対応する非変性宿主細胞」は、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードする導入ポリペプチドを含まない宿主細胞であり、通常、実質的に同じ培養条件下で成長させた変性宿主細胞との比較に利用される。
【００５０】
「高められた」の語は、対応する変性されてない宿主細胞と比較したときに変性された宿主細胞の中の酵素、基質又は生産物の活性、生産量又は蓄積のレベルを言う。
【００５１】
本明細書で用いる「ポリオール」の語は、多くの水酸基を有するアルコール分子を意味する。「ケト-ポリ誘導体」の語は、ポリオール分子の中に、1以上のケト基を有するポリオールを意味する。ポリオールは、グルコース、グルコネート、マンノース、イドース、キシロース、アラビノース、グリセロール、及びジヒドロキシアセトンのL型又はD型のいずれか一方を言い、又はグルコースとグルコネート等のこれらの組み合わせも意味し、及び、2-KLG、GA、イドン酸、6-リン酸グルコネート、2-KDG、5-ケト-D-グルコン酸、2,3-L-ジケトグルコン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸、及びマンノン酸を含むが、これ以外の6炭糖酸も意味する。
【００５２】
「ポリオールデヒドロゲナーゼ」は、酸化還元反応を触媒し、ポリオール基質を使用する酵素を意味する。
【００５３】
「炭素基質」の語は、グルコース、グロース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノース、グリセロース、及びジヒドロキシアセトンのD又はL型のいずれか、又は、グルコースとフルクトース等のこれらの組み合わせ、及び、2-KLG、GA、イドン酸、6-リン酸グルコネート、2-KDG、5-ケト-D-グルコニック酸、2,3-Ｌ-ジケトグルコン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸及びマンノン酸を意味するが、これら以外の6-炭糖並びに他の炭水化物も含む。幾つかの好ましい態様において、該炭素基質は、ヘキソース又はペントースである。ポリオール及び炭素基質の語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５４】
「所望の生産物」の語は、炭素基質から酵素的誘導により得られた化合物を意味する。特定の好ましい態様において、該所望の生産物は、有機酸(すなわち、グルコン酸及び他のAsA中間体、スクシニニル酸、クエン酸、酪酸)である。
【００５５】
本明細書で用いる。「腸内細菌科(Enterobacteriaceae)」は、グラム陰性の遺伝的特徴を有し、条件的嫌気性であるバクテリア系統を意味する。好ましい腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統は、D-グルコース溶液から2,5-ジケト-D-グルコン酸を生産することができるものである。
【００５６】
腸内細菌科(Enterobacteriaceae)のファミリーに含まれるものは、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エシェリキア(Escherichia)属及びパントエア(Pantoea)属である。
【００５７】
本発明において好ましい腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統は、パントエア(Pantoea)属である。パントエア(Pantoea)属には、パントエアアグロメランス(P. agglomerans)、パントエアディスペルサ(P. dispersa)、パントエアパンクタタ(P. punctata)、パントエアシトレア(P. citrea)、パントエアテレア(P. terrea)、パントエアアナナス(P. ananas)及びパントエアステワルティ(P. stewartii)を含む。例えば、パントエアシトレア(P. citrea)は、ATCC登録番号39140を有し、ATCC (マナッサ、バージニア州) から入手することができる。パントエアシトレア(P. citrea)は、エルウィニアシトレア(Erwinia citreus)又はアセトバクターセリヌス(Acetobacter cerinus)とも言われる。従って、パントエア(Pantoea)属は、エルウィニアシトレア(Erwinia citreus)又はアセトバクターセリヌス(Acetobacter cerinus)を含むがこれらに限定されない、再分類された種も含む。
【００５８】
他の態様において、好ましいバクテリア宿主細胞系統は、シュードモナス (Pseudomonadacea) 科のファミリーの系統を含む。これらのバクテリア系統は、グラム陰性で、通常胞子形成をしない。このファミリーに含まれるものは、パントエアアエルギソーナ(P. aeruginosa)、パントエアアルカリジーナス（P. alcaligenes）、パントエアフルオレセンス（P. fluorescens）、パントエアデニチリフィカンス（P. denitrificans）、パントエアプティーダ（P. putida）、パントエアスピーシーズ（P. species (sp)）、パントエアシリンゲア（P. syringae）、パントエアオレオオボランス（P. oleovorans）、パントエアメンドシーナ（P. mendocina）、パントエアプセウドアルカリジーン（P. pseudoalcaligenes）である。
【００５９】
他の好ましい細菌系統は、バチルス(Bacillus)細胞である。バチルス(Bacillus)には、当業者にバチルス(Bacillus)であると認識されている全てのメンバーを含み、バチルススブチルス（B. subtilis）、バチルスリケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルスレンタス（B. lentus）、バチルスブレビス（B. brevis）、バチルスステアロセレモフィリス（B. stearothermophilus）、バチルスアルカロフィルス（B. alcalophilus）バチルスアミロロケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルスクラウシ（B. clausii）、バチルスハロドランス（B. halodurnas）、バチルスメガテルム（B. megaterum）バチルスコアギュランス（B. coagulans）、バチルスサーキュランス（B. circulans）、バチルスロータス（B. lautus）及び バチルススリンギエンス（B. thuringiensis）を含むがこれらに限定されない。
【００６０】
本明細書で用いる「異種の」という語は、宿主細胞の中に自然発生しない核酸又はアミノ酸配列を言う。本明細書で用いる「内性」という語は、宿主細胞に自然発生する核酸を意味する。
【００６１】
本明細書で用いる「発現」の語は、ポリペプチド又はタンパク質が遺伝子の核酸配列に基づいて生産される工程を意味する。この工程は転写及び翻訳の両者を含む。「過剰発現」の語は、宿主細胞の中で同じ遺伝子生産部のコピーの数が増えることを意味する。
【００６２】
細胞に核酸配列を挿入する意味に用いる「導入」の語は、「形質転換」、「形質導入」又は「トランスフェクション」を意味し、核酸配列を原核生物の細胞内への核酸の取り込みを意味することを含む。核酸は、細胞のゲノム内へ取り込まれ(例えば、染色体、プラスミド、又は、ミトコンドリアDNA)、自律レプリコンに転換され、あるいは、過度に複製される(例えば形質転換されたmRNA又はDNA)。
【００６３】
「培養」の語は、培養管の中で所望の生産物を生産するために炭素基質を発酵転換することを意味する。特定の好ましい態様において、培養は所望の生産物の生産に適した環境下で微生物有機体を育成することを含む。
【００６４】
「酵素的転換」の語は、本発明に包含される酸化還元酵素複合体又はデヒドロゲナーゼ酵素と炭素基質とを接触させることにより、炭素基質を所望の生産物に修飾することを言う。幾つかの態様において、接触は、多重結合型酸化還元酵素複合体を発現している変性バクテリア宿主細胞に炭素源を曝すことを含む。いくつかの態様において、該炭素基質の酵素転換は、酸化であり、所望の生産物を生産する酸化経路の一部である。非限定的な例において、グルコネートが、グルコースの酵素転換の酸化生産物である。更なる非限定的な例において、グルコースから2-KDG及び2,5-DKGの酵素的転換は、1の酸化経路中に2又は3の酵素を含む。幾つかの態様において、炭素基質の酵素的転換は還元である。
【００６５】
グルコネート等の、本明細書で述べられる多くの成分は、培地の環境に依存してイオン形態で存在することは当業者に理解されている。例えば、グルコン酸分子を意図するグルコン酸のような文言は、同じ文言で参照される物質の全てのイオン状態を含む。したがって、「D-グルコン酸」及び「D-グルコネート」の語は、同じ有機化合物を意味し、特定のイオン状態又は化学式を有するものを意図するものではない。
【００６６】
本明細書で用いる「含む(comprise)」の語及びその同義語は、包含することを意味する。すなわち、「含む(including)」及びその同義語を意味する。「一の(A)」「一の(an)」及び「この(The)」はとくに違った形で示さない限り、複数も意味するものする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
B. 実施態様
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書で提供されるのは新規なタンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸である。本明細書では、前記タンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸の使用も提供する。さらに、本明細書では前記タンパク質、多重結合型酸化還元酵素複合体及び核酸を宿主細胞の中で生産する方法も提供する。さらに本発明の一態様において、多重結合型複合体は酸化還元酵素のファミリーの中に属すると同定されており、チトクロームCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット及びガンマサブユニットの3のサブユニットを含む。前記ガンマサブユニットの機能は同定されていない。
【００６８】
CytCは多くのタンパク質に含まれるものであり、異なる数多くの還元反応において機能する(Pettigrew et al., CYTOCHROMES C. BIOLOGICAL ASPECTS, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1987))。本発明を任意の方法に限定するわけではないが、CytCの役割は基質を特異的に還元することである。本明細書に記載されるCytCの幾つかのタイプは以下の用である：
0から+500mVの還元電位を伴う1-2ヘム基を有するクラス1
0から+150mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスIIa
0から+500mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスIIb
-400から0mVの還元電位を伴う3から16ヘム基を有するクラスIII
-80から+400mVの還元電位を伴う4ヘム基を有するクラスIV
+200から+290mVの還元電位を伴う1ヘム基を有するクラスc1
-276から+47mVの還元電位を伴う1及び2のへ無機を有する各種サブグループを有するクラスｃ554。
【００６９】
さらにCytCファミリーに属するタンパク質はCys-X-X-Cys-Hisのヘムコンセンサス配列を含む。この配列においてHis残基はヘム鉄の2のアキシアルリガンドの1つでありXは任意のアミノ酸残基を示す(Mathews, F. S. (1985) Prog. Biophys. Mol. Biol. 45:1-56)。参考資料はタンパク質ファミリー及びドメインのPROSITEデータベースにより作成されている。本発明の好適な態様においてCytCは1から4の間の数のヘム基を有することが好ましい。すなわち、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4のヘム基を有していることが好ましい。本発明における好適なCytCは、3のヘム基を有している。図16A及び図16B参考のこと。これらの図において、各CytC orfに対応する3のヘムコンセンサス配列が示されている。
【００７０】
一の態様において、単離CytCは図4Aから4B及び5Aから5B(配列番号20-38)で示すアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列に対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列のいずれか一つを含む。
【００７１】
一の好ましい態様において、単離CytCは配列番号20-29(図4Aから4B)及びこれらの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか一つを含む。一の好ましい態様において、単離されたCytCは配列番号22のアミノ酸配列及び少なくともこの配列と90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む。第二の態様において、単離CytCは、配列番号23のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。第三の態様において、単離CytCは、配列番号24のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。第四の態様において、単離CytCは、配列番号29のアミノ酸配列又はこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列を含む。
【００７２】
他の好ましい態様において、単離CytCは、配列番号30-38(図5A-5B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか一を含む。さらに好ましくは、単離CytCは、配列番号38のアミノ酸配列及びこの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のいずれか一つを含む。
【００７３】
本発明の更なる好ましい態様は、本発明のCytCをエンコードするポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、図11A-11H及び12A-12H(配列番号78-96)で示される核酸配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか一つを含む。
【００７４】
一の態様において、CytCをエンコードする核酸配列は、配列番号78-87で示される配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のうちのいずれか一つを含む。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号80及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号81で示される配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。
【００７５】
好ましくは、CytCをエンコードする核酸配列は、配列番号82及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。好ましくは、このCytCをエンコードしている核酸配列は配列番号87及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するものである。
【００７６】
他の態様において、このCytCをエンコードする核酸配列は、配列番号88-96で示される配列及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列のうちのいずれか一つである。好ましくは、このCytCをエンコードする核酸配列は配列番号96で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列である。
【００７７】
更なる態様において、本発明は、配列番号20-38のうちのいずれか一つのアミノ酸配列又はこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCをエンコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
上で定義されたCytC配列は、本明細書で概説するCytC配列に対して実質的に相同な核酸及び/又はアミノ酸配列により同定される。このような相同性は、核酸又はアミノ酸配列全体を基にすることができ、相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれか一方を用いた、以下で概説する手順を用いて検出することができる。本発明で用いる相同性の語は、配列の同一性を意味する。相同性は、Smith & Waterman の局所相同アルゴリズム（the local homology algorithm of Smith & Waterman, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482）、Needleman & Wunsch のホモロジーアラインメントアルゴリズム（the homology alignment algorithm of Needleman & Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443）、Pearson & Lipman の類似法の検索（the search for similarity method of Pearson & Lipman,(1988) PNAS USA 85:2444-2448）及びこれらのアルゴリズムをコンピュータによる実行（computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)）及びDevereux によるベストフィット配列プログラム（the Best Fit sequence program described by Devereux, et al. (1984), Nucl. Acid Res. 12:387-395）を含むがこれらに限定されない本発明の技術分野における標準的方法を用いて検出することができる。多重配列アルゴリズム（the multiple sequence alignment program） CLUSTRAL W (Thompson et al. (1994) Nuclei
c Acid Research 22: 4673-4680)も参照のこと。
【００７９】
有用なアルゴリズムの一は、PILEUPである。PILEUPは、連続的な対合アラインメントを用いた関連する配列のグループから多重配列アラインメントを作り出す。PILEUPはアラインメントを作り出すためのクラステリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。PILEUPは、Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360の連続的アラインメント方法の簡略形を用いる。この方法は、Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153に記載されている方法と似ている。有用なPILEUPパラメータは3.00のデフォルトギャップウエイト、0.10のデフォルトギャップ長ウエイト及びウエイトエンドギャップを含む。
【００８０】
好ましい態様において、多重配列解析はDNASTARの レーザジーンプログラム（the Lasergene program）を用いて行う。DNASTARはメガリンプログラム（Megalign program）version 3.12におけるクラスターアルゴリズム（Clustal alugorithm）を用いる。デフォルト多重配列アラインメントパラメータは10のギャップペナルティー及び10のギャップ長ペナルティーを含む。対合アラインメントのデフォルトパラメータは、1のKtuple、3のギャップペナルティー、5のウインド及び5の保存されたダイアゴナル（diagonals）を含む。
【００８１】
他の有用なアルゴリズムの例は、Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403-410 and Karlin, et al. (1993), PNAS USA 90:5873-5787に記載されているBLAST algorithmである。特に有用なBLASTアルゴリズムは、Altschul, et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)から得られるWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は幾つかのサーチパラメータを用いる。これらのパラメータはほとんど規定値として設定されている。
【００８２】
調節可能パラメータは以下のように設定されている: オーバーラップスパン（overlap span）=1、オーバーラップフラクション（overlap fraction）=0.125、ワードスレッシュホールド（word threshold(T)）=11。HSP S 及びHSP S2 パラメータは、変動値であり、検索される所望の配列に対する、所定の配列の組成及び特定のデータベースの組成をもとに、プログラムを用いて確立される。しかしながら、この値は、感度を高くするために調節されることがある。A%のアミノ酸配列相同性の値は、整列された領域におけるより長い配列の残基の総数により分配されている整合する同じ残基の数により決定される。この「より長い」配列は、整列領域内における実質的な残基を有するものである（アラインメントを最大化するためのWU-Blast-2により導入されるギャップは無視する。）
アップデートされたBALSTアルゴリズムは、Altschul, et al. (1997), Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402に記載されている。特定の有用なBLASTプログラムは、Basic BLASTである。好ましいパラメーターは、Lambda K H 0.318、0.135、0.401 及びgapped Lambda K H 0.27、0.0470、0.23、マトリックス: BLOSUM62、ギャップペナルティー: エグジステンス（existence） 11、エクステンション（extension） 1である。
【００８３】
一の態様において、配列番号78-96のうちのいずれか一つで示す核酸と、少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するCytCをエンコードする核酸配列はハイブリダーゼーション試験を通じて検出される。一の態様は、図11又は図12で同定される配列又はこれと相補的な配列に高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を含む。
【００８４】
高ストリンジェンシー条件は、本発明の技術分野で知られており、例えば、Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d Edition (1989) 及び SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed Ausubel et alに記載されている。ストリンジェント条件は、配列に依存しており、環境において異なる。より長い配列は、より高い温度でハイブリダイズする。核酸配列のハイブリダイゼーションの更なるガイドは、Tijssen, TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays (1993)である。通常、ストリンジェンシー条件は、特定のイオン強度及びpHにおける特定の配列に対する融解温度(Tm)より約5-10℃低い温度から選択される。このTmは所定環境の(所定のイオン強度、pH及び核酸の濃度における)平衡条件下で、標的に相補的なプローブの50％がハイブリダイズする温度である。ストリンジェント条件は、pH7.0から8.3において、塩濃度が約1.0M未満、通常約0.01から1.0Mのナトリウムイオン濃度(又は他の塩)及び、短いプローブ(例えば10から50ヌクレオチド)に対しては少なくとも30℃、及び長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド)に対しては少なくとも約60℃である。ストリンジェント条件はホルムアミド等の不安定剤(destabilizimg agent)の添加により達成することができる。
【００８５】
他の態様において、当該技術分野で知られているように、より低いストリンジェント条件が使用される。例えば、中又は低いストリンジェント条件が用いられる。Maniatis及びAusubel、上記、及びTijssen上記を参照のこと。
【００８６】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)も相同配列の検出に使用することができる。参考文献は、Chen et al., (1995) Biotechniques 18(4):609-612である。
【００８７】
本発明は、微生物の中で他のCytC又はデヒドロゲナーゼタンパク質を検出するためのプローブとして使用する、本明細書で定義されるCytC又はデヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードするポリヌクレオチドを使用する方法も提供する。一の態様において、配列番号59-77(デヒドロゲナーゼタンパク質に対して)又は配列番号78-96(CytCタンパク質に対して)のうちのいずれか1由来の、少なくとも10、15、20、25、30、40、50又はそれ以上の連続する塩基がプローブとして使用される。更に、本発明に有用なオリゴヌクレオチドプローブは配列番号1-19(デヒドロゲナーゼタンパク質に対して)のうちのいずれか一つ及び配列番号20-38(CytCタンパク質に対して)のうちのいずれか一つの配列の中に、少なくとも5、10、15、20、25、30又はそれ以上の連続したアミノ残基を有するポリペプチドをエンコードする配列を含む。上に記載するハイブリダイーゼション試験は、各微生物内及び特にパントエア(Pantoea)属の微生物の中のCytC及びデヒドロゲナーゼタンパク質を同定するために使用される。
【００８８】
他の態様において、発明は、図2A-2C及び3A-3B(配列番号1-19)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む単離されたデヒドロゲナーゼを含む。一の態様において、このデヒドロゲナーゼは、フラビン結合したデヒドロゲナーゼ及び他の態様においてこのデヒドロゲナーゼは、ピリジン結合したデヒドロゲナーゼである。更なる態様において、このデヒドロゲナーゼは、ポリオールデヒドロゲナーゼ(PDH)活性を有する。参考文献は、Nordling et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:4267-4276である。このデヒドロゲナーゼのPDHファミリーはソルビトールデヒドロゲナーゼを含む(Saito et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:454-460)。
【００８９】
他の態様において、単離されたデヒドロゲナーゼは、配列番号1-10(図2A-2C)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
好ましくはこの単離されたデヒドロゲナーゼは、
a) 配列番号3のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
b) 配列番号4のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
c) 配列番号5のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列、及び
d) 配列番号6のアミノ酸配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列
を含む。
【００９１】
他の好ましい態様において、本発明の単離デヒドロゲナーゼは、配列番号11-19(図3A-3B)及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。好ましくは、単離デヒドロゲナーゼは、配列番号19のアミノ酸配列を含む。一の好ましい態様において、このデヒドロゲナーゼはフラビン結合しているデヒドロゲナーゼである。
【００９２】
本発明の更なる態様は、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする単離ポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドは、図9A-9J及び10A-10H(配列番号59-77)で示す核酸配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか1を含む。
【００９３】
1の態様において、デヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号59-68(図9A-9J)で示される配列及びこれらと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のうちのいずれか一つである。デヒドロゲナーゼをエンコードする好ましい核酸配列は、
a) 配列番号61で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列
b) 配列番号62で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列
c) 配列番号63で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％98％及び99％の相同性を有する配列及び
d) 配列番号64で示す配列及びこれと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する配列、である。
【００９４】
他の態様において、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号69-77(図10A-10H)で示す配列及びこれと少なくとも85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有する核酸配列のうちのいずれか1つである。一の好ましい態様において、本発明のデヒドロゲナーゼをエンコードする核酸配列は、配列番号77で示す配列を有する核酸配列を含む。
【００９５】
更なる態様において、発明は、配列番号1-19又はこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをエンコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９６】
配列相同は、上で概説するCytC配列の場合と同様に、相同性プログラムあるいはハイブリダイゼーション条件のいずれかにより検出される。
【００９７】
デヒドロゲナーゼアッセイは良く知られており、2-KDGとともに懸濁されたMGT上の成長を利用してBouvet et al. (1989) Int. J. Syst. Bacteriol. 39:61-67に記載されているように検出することができる。参考文献は、Shinagawa and Ameyama (1982) Meth. Enzymol. 89:194-198である。
【００９８】
酸化還元酵素複合体
本発明の一の態様において、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、少なくとも2のサブユニットを含み、該複合体は、少なくとも2の遺伝子を含むオペロンによりコードされている。このサブユニットは、本明細書で定義されるCytCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含む。他の態様においてこの多重結合型酸化還元酵素複合体は、少なくとも3の遺伝子を含むオペロンによってコードされる異なる分子量の3のサブユニットを含む。このサブユニットは、CytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット及び配列番号39-57(図6A-6B及び7)又はこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか1のアミノ酸配列をエンコードする核酸であると同定される第三のサブユニットを含む。
【００９９】
好ましい単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、(a)配列番号20-38(図4A-4B及び5A-5B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCサブユニット及び(b) 配列番号1-19(図2A-2C及び3A-3B)のいずれか1のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼサブユニットを含む。一の好ましい態様において、多重結合型酸化還元酵素複合体サブユニットは、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号38及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％、及び99％の相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体のデヒドロゲナーゼサブユニットは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号19及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
他の態様において、単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、さらに、配列番号39-57(図6A-6B及び7)及び、これらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれか1のアミノ酸配列を有する第三のサブユニットを含む。一の態様において、この第三のサブユニットは、配列番号39-48及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1のアミノ酸配列を含む。この態様に関して、第三のサブユニットは、約220-265アミノ酸残基、約225-255アミノ酸残基及び約235-250アミノ酸残基を含む。一の好ましい態様において、この第三のサブユニットは、配列番号49-57及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のいずれか1からのアミノ酸配列を含む。この態様において、第三のサブユニットは約155-215アミノ酸残基、約165-205アミノ酸残基及び約170-200アミノ酸残基を含む。好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体の第三のサブユニットは、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号57及びこれらの配列と少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
本発明の他の態様において、単離多重結合型酸化還元酵素複合体は、a)配列番号20-38及びこれらに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれかを有するサブユニットをコードする第一ポリヌクレオチド、及びb)配列番号1-19及びこれらに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列のうちのいずれかを有するデヒドロゲナーゼサブユニットをコードする第二ポリヌクレオチドによりエンコードされる。この単離多重結合型酸化還元酵素は、さらに、配列番号39-57及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸のいずれかを有するアミノ酸をコードする第三のポリヌクレオチドによりエンコードされる。一の好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、配列番号24、配列番号38のアミノ酸配列又はこれらと少なくとも98％の相同性を有するアミノ酸配列を有するCytCサブユニットをエンコードする。一の好ましい態様において、第二のポリヌクレオチドは配列番号6、配列番号19のアミノ酸配列又は、これと少なくとも98％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードする。
【０１０２】
更なる態様において、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、a)CytCサブユニットをエンコードしている第1ポリヌクレオチド(前期ポリヌクレオチドは、配列番号28-96で定義される核酸配列及び少なくともこれらに対して90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する)及びb) デヒドロゲナーゼサブユニットをエンコードしている第2ポリヌクレオチド(前期ポリヌクレオチドは、配列番号59-77で定義される核酸配列及び少なくともこれらに対して90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する)によりエンコードされる。更に、多重結合型酸化還元酵素複合体は、c)第三のサブユニットをエンコードする第三のポリヌクレオチドによりエンコードされる。前記第三のポリヌクレオチドは、配列番号97-115(図13A-13E及び14A-14C)及びこれらと少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する核酸配列のいずれか1で定義される核酸配列を有する。
【０１０３】
一の態様において、このCytCサブユニットは、多重結合型酸化還元酵素複合体オペロン中のラスト遺伝子を表す。他の態様において、デヒドロゲナーゼサブユニットは多重結合型酸化還元酵素複合体の中の最も大きい分子量を有するサブユニットによって表されている。
【０１０４】
他の好ましい単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、図1A及びBで定義される19オペロンのいずれか一を含む。より具体的には、
(1) 配列番号46、1及び20；
(2) 配列番号48、8及び27；
(3) 配列番号41、5及び23；
(4) 配列番号44、7及び28；
(5) 配列番号42、4及び22；
(6) 配列番号45、9及び26；
(7) 配列番号43、2及び21；
(8) 配列番号47、10及び25；
(9) 配列番号39、6及び24；
(10) 配列番号40、3及び29；
(11) 配列番号52、18及び34；
(12) 配列番号55、14及び35；
(13) 配列番号53、31及び16；
(14) 配列番号57、19及び38；
(15) 配列番号12、50及び32；
(16) 配列番号54、13及び37；
(17) 配列番号58、56、15及び36；
(18) 配列番号51、17及び33；
(19) 配列番号30、49及び11、並びに
(20) 配列番号(1)-(19)のオペロンのサブユニットに対して少なくとも90％、93％、95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するサブユニットを有するオペロン、である。
【０１０５】
一の好ましい態様において、この多重結合型酸化還元酵素複合体サブユニットは、2-KDGDH活性及び、配列番号57、配列番号19及び配列番号83のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(14)(図1)を有する。
【０１０６】
他の好ましい態様において、この多重結合型酵素複合体は、GADH活性を含み、
a) 配列番号41、5及び23のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(3)
b) 配列番号42、4及び22のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(5)
c) 配列番号39、6及び24のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(9)
d) 配列番号40、3及び29のアミノ酸配列を有するサブユニットを含むオペロン(10)及び
e) オペロン(3)、(5)、(9)又は(10)のサブユニットのそれぞれに対して少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有するサブユニットを有するオペロン
から成る群より選択されるオペロンを含む。
【０１０７】
多重結合型酸化還元酵素複合体の更なる好ましい態様において、オペロン(3)、オペロン(5)、オペロン(9)及びオペロン(10)のオペロンを含むサブユニットは他のオペロンに結合される。例えば、オペロン(9)のデヒドロゲナーゼサブユニットを表す配列番号6は、a)オペロン(3)のCytCサブユニットを示す配列番号23、b)オペロン(5)のCytCサブユニットを表す配列番号22、又はc)オペロン(10)のCytCサブユニットを示す配列番号29と結合させることができる。
【０１０８】
上で述べる単離された多重結合型酸化還元酵素複合体は、好ましくは、以下で定義される核酸配列を有するポリヌクレオチドによりエンコードされる。
【０１０９】
(1) 配列番号 104、59 及び 78；
(2) 配列番号 106、66 及び 85；
(3) 配列番号 99、63 及び 81；
(4) 配列番号 102、95 及び 86；
(5) 配列番号 100、62 及び80；
(6) 配列番号 103、67 及び 84；
(7) 配列番号 101、60 及び79；
(8) 配列番号 105、68 及び 83；
(9) 配列番号 97、64 及び82；
(10) 配列番号 98、61 及び 87；
(11) 配列番号 110、76 及び92；
(12) 配列番号 113、72 及び93；
(13) 配列番号 111、89 及び74；
(14) 配列番号 115、77 及び96；
(15) 配列番号 70、108 及び90；
(16) 配列番号112、71 及び95；
(17) 配列番号 114、73 及び94；
(18) 配列番号 109、75 及び 91；
(19) 配列番号 88、107 及び69: 及び
(1)-(19)の配列と少なくとも90%、93%、95%、96%、97%、98%、及び 99%の配列相同性を有する配列。
【０１１０】
好ましい多重結合型酸化還元酵素複合体は、GADHと同定されているものであるか、あるいは、これに似た活性を有する複合体(Matsushita, et al. (1982) METHODS IN ENZYMOLOGY 89: 187-193; Yum et al. J. of Bacteriol. (1997) 179:6566-6572; Matsushita et al. (1979), J. Biochem. 85:1173; and Kulbe et al. (1987), Ann. N.Y. Acad. Sci 506:552)及び2-KDGHDHと同定されているもの、あるいは、これに似た活性を有する複合体(Shinagawa et al. (1982) Methods in Enzymology 89: 194-198; Pujol et al. (2000) J. Bacteriol. 182:2230-2237 and Stroshane (1977) Biotechnol. BioEng 19:459)を含む。
【０１１１】
図1A及び1Bに挙げるオペロンの各種orfは、in vitroで組換えられる。この遺伝子フラグメントは、例えば、改善された酵素活性、安定性、又は修飾された基質特異性を有する新しい酸化還元酵素複合体タンパク質を生成する手段として利用される。In vitroでの組換えは、DNAシャッフリングのような良く知られた技術及びその他の変法により行うことができる(Stemmer W. P. (1994) PNAS USA 91:10747-10751; Stemmer W. P. (1994) Nature 370:389-391; Zhao et al., (1999) Protein Eng. 12: 47-53; Zhao et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26: 681-683 and Arnold et al. (1997) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol 58: 1-14)。DNAシャッフリングは、複数の対合する配列由来の遺伝子フラグメントをPCRにより再構築させる相同組換えに関係する。配列交叉は高い相同性配列のポイントで生じる。
【０１１２】
他のin vitro組換え技術は、Wells et al., (1985) Gene 34: 315-323 及び Wang and Malcom (1999) Biotechniques 26: 680-682に記載のものを含む。当業者は、新しい遺伝子変異体を生成するための非相同ランダム組換えも用いることができる。参考文献はBittker et al., (2002) Nat. Biotech. 20:1024-1029)である。
【０１１３】
ベクター
本発明は、本明細書で述べるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主細胞に関係する。微生物有機体の中にベクターとして使用することができるプラスミドは、良く知られており、参考文献は、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. (1989); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (1989) and Bron, S. Chapter 3, Plasmids in MOLECULAR BIOLOGY METHODS FOR BACILLUS, Eds. Harwood and Cutting (1990) John Wily & Sons Ltdである。
【０１１４】
腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統へ非自然発生タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを導入するための好ましいプラスミドの一つは、グラム陰性及びグラム陽性バクテリアを含む幅広いバクテリア宿主細胞内で複製する能力を有し、可動性ではあるが自己複製プラスミドではないRSF1010である(Frey et al., (1989), The Molecular Biology of IncQ Plasmids, In: Thomas (Ed.) PROMISCUOUS PLASMIDS OF GRAM NEGATIVE BACTERIA, Academic Press, London pp.79-94 and Frey et al. (1992) Gene 113:101-106)。
【０１１５】
本明細書で開示されるCytCサブユニット、デヒドロゲナーゼサブユニット、多重結合型酸化還元酵素複合体又はオペロンをエンコードするポリヌクレオチドに有用なプロモータは、オペロン本来のプロモータも含む。しかしながら、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも使用することができる。一の有用なハイブリッドプロモーターは、trp及びlacプロモーターのハイブリッドであるtacプロモーターである。プロモーターは当該技術分野においてよく知られいており、参考文献は、Sommer et al. (2000) Microbiol. 146:2643-2653; Brosius et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:3539; Russell and Bennett (1982) Gene 20: 231; Mulligan et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 3529; Deuschle et al., (1986) EMBO J. 5:2987-2994; Amann et al. (1983) Gene 5: 167-178 and Amore et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotech. 30:351-357である。機能しているプロモーター配列に加えて、形質転換されたバクテリア系統の選択をするために、発現ベクターは好適なボゾーム結合部位及び選択遺伝子を含むこことができる。適切な選択遺伝子はアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びテトラマイシンの様な薬物耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーはヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン合成経路の中の生物合成遺伝子を含む。
【０１１６】
遺伝子導入
バクテリア細胞に対する遺伝子導入技術は、良く知られており、これらの技術は、形質転換、形質導入、接合及びプロトプラスト融合を含む。遺伝子導入は、ポリヌクレオチド、遺伝子又は遺伝子を細胞に輸送する過程であり、外来遺伝子はバクテリアに取り込まれる。一般的な形質転換手順は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Vol. 1 Ausubel et al. Eds., John Wiley and Sons, Inc. 1987, Chapter 9)に記載されている。これらの技術は、塩化カルシウム法、DEAE-デキストラン法及びエレクトロポレーションを用いた形質転換を含む。参考文献はU.S. Pat. No. 5,032,514; Potter, H. (1988) Anal. Biochem. 174:361-373; Sambrook, supra and Ferrari et al., Genetics pgs 57-72 in BACILLUS, Harwood et al., Eds. Plenum Publishing Corpである。宿主細胞の形質転換は、選択遺伝子発現の有無により検出することができる。
【０１１７】
宿主細胞
バクテリア細胞は本発明の好ましい宿主細胞であり、特に好ましいバクテリア宿主細胞は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)細胞である。特にエルウィニア(Erwinia)、エンテロバクター(Enterobacter) 、 グルコノバクター(Gluconobacter) 、クレブシエラ(Klebsiella) 、エシェリキア(Escherichia)及び パントエア(Pantoea) であり、最も好ましいのはパントエア属(Pantoea sp.)、クレブシエラ(Klebsiella sp.)属及び大腸菌(E. coli)細胞である。特に好ましいパントエア(Pntoea)細胞は、パントエアシトレア(P. citrea)及びパントエアアグロメランス(P. agglomerans)であり、参考文献は、U.S. Pat. No. 5,032,514; Truesdell et al., (1991) J. Bacteriol. 173:6651-6656 及び ATCC 登録番号 39140である。他の好ましいバクテリア宿主細胞系統はシュードモナス科(Pseudomonadaceae)の系統である。バチルス(Bacillus)系統は、宿主細胞として提供される。
【０１１８】
一の態様において、宿主細胞は、図1A及び1Bに示す19オペロンのいずれか1を含むベクターで形質転換される。好ましくは、宿主細胞は、
a) 配列番号 3 及び配列番号 29;
b) 配列番号 4 及び配列番号 22;
c) 配列番号 5 及び配列番号 23;
d) 配列番号 6 及び 配列番号 24 並びに
e) a)-d)の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%及び99%の配列相同性を有する配列で定義される配列をエンコードするポリヌクレオチドで形質転換される。
【０１１９】
宿主細胞は、配列番号19及び配列番号38で定義される配列ならびに配列番号19又は配列番号38に対して少なくとも95％、96％、97％、98％及び99％の配列相同性を有する配列をエンコードするポリヌクレオチドで形質転換される。
【０１２０】
他の態様において、バクテリア宿主細胞は、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを含むアミノ酸配列を有する多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドで形質転換される。アルファサブユニットは、デヒドロゲナーゼ活性を有しており、配列番号1-19の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。ガンマサブユニットは、配列番号39-57の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。チトクロームCサブユニットは配列番号20-38の配列及び少なくともこれらと95％、96％、97％、98％、及び99％の配列相同性を有する配列から選択される。
【０１２１】
上で述べたように、バクテリア宿主細胞は、組換え宿主細胞でもよい。宿主細胞の修飾は、本発明に関係するCytC、デヒドロゲナーゼ又は多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドを導入するのと同時に、あるいは、その後に、従来技術を用いて行うことができる。組換え宿主細胞は内性染色体遺伝子の欠失、阻害等の染色体の不活性化、内性染色体遺伝子の発現を増加させる修飾、及び外来遺伝子の導入を含む。他の態様において、該宿主細胞グルコース又は他の代謝物を2-KDG又は2-KLGに転換するのに有効な既知の酵素をエンコードする遺伝子を含むように修飾される。一般的代謝物を2-KDG又は2-KLGに転換するのに有効な酵素の非限定的な例は、D-グルコースデヒドロゲナーゼ (Adachi, O. et al., (1980) Agric. Biol. Chem., 44:301-308; Ameyama, M. et al., (1981) Agric. Biol. Chem. 45:851-861; Smith et al. (1989) Biochem. J. 261:973; and Neijssel et al., (1989) Antonie Van Leauvenhoek 56(1):51-61); D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (McIntire, W. et al., (1985) Biochem. J., 231:651-654; Shinagawa, E. et al., (1976) Agric. Biol. Chem. 40:475-483; Shinagawa, E. et al., (1978) Agric. Biol. Chem. 42:1055-1057; and Matsushita et al. (1979), J. Biochem. 85:1173); 5-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ (Shinagawa, E. et al., (1981) Agric. Biol. Chem., 45:1079-1085 and Stroshane (1977) Biotechnol. BioEng. 19(4) 459); 及び 2,5-ジケト-D-グルコン酸リダクターゼ (U.S. Pat. Nos.: 5,795,761; 5,376,5
44; 5,583,025; 4,757,012; 4,758,514; 5,008,193; 5,004,690; and 5,032,514)である。
【０１２２】
酸化還元生成物の回収及び検出
酸化還元反応物の検出に有効な方法は、陰イオン交換を用いた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)(J. Chrom. 1980, 196:163)、電子酸化還元法(electro-redox procedures)(Pachia, 1976, Anal. Chem. 48:364)、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー及び質量分析を含む。当業者は、これらの検出方法を適用するための適切な制御方法を知っている。AsA中間体及びAsA立体異性体の検出に対する方法は、2,6 ジクロロインドフェノール (Burton et al. 1979, J. Assoc. Pub. Analysts 17:105) 又は他の適切な試薬を用いた酸化還元滴定を含む。
【０１２３】
この酸化還元酵素反応生成物及び特に、AsA中間体等のケトポリオール誘導体が生産されると、凍結乾燥、結晶化、噴霧乾燥及び電気透析方法等の本技術分野で既知の方法を用いて、回収及び/又は精製を行う。
【０１２４】
細胞培養及び発酵
バクテリア細胞の維持および成長に適した方法はよく知られており、参考文献は、the MANUAL OF METHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY, Eds. P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC (1981)及びT. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2nd ed. (1989) Sinauer Associates, Sunderland, MA.である。
【０１２５】
細胞の前培養 - 通常、細胞の培養は、25から32℃、好ましくは、28から29℃において、適した培地の中で行われる。本発明に有用な成長培地の例は、広く商業的に調製されている培地であって、例えば、LB (Luria Bertani)培養液、サブローデキストロース(SD)培養液、又は酵母培地(YM)等である。これらは、例えば、ギブコ(GIBCO/BRL) (ゲイザーズバーグ、 メリーランド州)から入手することができる。用いられる他の所定の培地または合成培地および特定のバクテリア微生物の成長に適した培地は、微生物学または醗酵化学の分野ではよく知られている。発酵に適したpHの幅は、pH5からpH8である。種フラスコ(seed flask)についてはpH7からpH7.5であり、及び、反応容器についてはpH5からpH6である。本発明の方法の実施について説明するうえで、発酵微生物の分野の当業者は、アスコルビン酸中間体の生産量を最大にするために、発酵工程に影響する多くの因子を最適化する必要があることを理解している。これらの因子の多く(例えば、pH、炭素源の濃度、及び溶存酸素量など)は、アスコルビン酸中間体の生産に用いられる細胞タイプに応じて酵素工程に影響を与え得る。
【０１２６】
ASA中間体の生産は、醗酵環境すなわち、in vivo環境、あるいは、非醗酵環境すなわち、in vitro環境、あるいは、in vivo環境とin vitro環境を組み合わせて実施することができる。醗酵または生物反応は、バッチ法、フェドバッチ法、または連続法で行われる。
【０１２７】
インビボ生体触媒環境
本発明の修飾宿主細胞の培養による生体触媒反応は、適切な炭素源を用いた環境で、通常、腸内細菌または他の細菌系統を用いる。適切な炭素源は、例えば、六炭糖(例えばグルコース等)、又は六炭糖酸、或いは、六炭糖及び／又は六炭糖酸の組合せを含む。その他の炭素源には、ガラクトース、ラクトース、フルクトース、又はそれらの酵素誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
加えて、醗酵培地は、適切な炭素源、グルコース等の単糖類、ラクトースやスクロース等のオリゴ糖、澱粉やセルロース等の多糖類、及び、再生可能な供給原料(例えば、乳清透過物、コーンスティップリカー、甜菜の糖蜜、及び大麦の麦芽)に由来する未精製混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、当該炭素源には、炭素等の一炭素基質も含まれ得る。本発明に用いられる炭素源は、種々の炭素含有基質を包含することができ、それは微生物の選択によってのみ制限されることを考慮すると、好ましい炭素基質にはグルコース及び/又はフルクトース、及びそれらの混合物が含まれる。本明細書に記載の修飾ゲノムと組合せてグルコースとフルクトースの混合物を用い、さらに、異化経路を酸化経路と切り離すことによって、宿主細胞の代謝の要求を満たすためにフルクトースを用いつつも、所望のアスコルビン酸中間体の収率及び転化率の向上のためにグルコースを用いることができる。適切な炭素源に加えて、発酵培地は、アスコルビン酸中間体を生産するために必須な酵素経路を触媒し、宿主細胞の成長又は培養に適した、適切なミネラル、塩類、ビタミン類、補因子、及びバッファーを含有する必要がある。
【０１２９】
バッチ、フェドバッチ、および連続培養
本発明は、バッチ醗酵法、フェドバッチ法といわれる変性バッチ法、または、連続醗酵法を用いる。
【０１３０】
古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更は受けない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、pHや酸素濃度等の因子を制御することは頻繁になされる。バッチ法では、当該方法における代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで定常的に変化する。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に緩和され、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。培養液が未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
【０１３１】
標準的なバッチ法における変法の１つは、フェドバッチ法である。フェドバッチ発酵方法も本発明に適しており、基質が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的なバッチ法と同様である。フェドバッチ法は、異化の抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培養液における基質の量を制限するのが望ましい場合に有用である。フェドバッチ法において基質濃度を実測することは困難であり、それゆえ、例えば、pH、溶存酸素量、及び廃ガス(例えば、CO2)分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて基質濃度を推定する。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において広く周知であり、その例はBrockの文献(T. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland,MA)に記載されている。
【０１３２】
一の態様において、供給溶液中の炭素基質の濃度は、重量/重量ベースで約55％から約75％である。他の態様において、この濃度は、重量/重量ベースで約60％から約70％である。
【０１３３】
連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、同量のならし培養液(conditioned media)が発酵工程から除去される。一般に、連続発酵では、培地は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期成長にある。連続発酵により、細胞の成長又は最終生成物の濃度に影響を与える１又はそれ以上の因子の調節が可能となる。例えば、１の方法は、栄養分(例えば、炭素源)又は一定の割合で提供される窒素量を制限し、その他全ての因子を緩和する方法である。別の方式では、培養液の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつも、成長に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続法は定常状態の成長条件を維持することから、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞成長速度と等しくなる必要がある。連続発酵工程における栄養分及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知であり、種々の方法が前記Brockの文献に記載されている。
【０１３４】
一の態様において、本発明は、適切な条件下でポリオール又は炭素基質を有するバクテリア宿主細胞内でポリオール又は炭素基質の酵素転換を高める方法に関係する。該バクテリア宿主細胞は、本発明により包含される多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチド並びにデヒドロゲナーゼサブユニット又はチトクロームCサブユニットをエンコードするポリヌクレオチドを誘発するように修飾されたバクテリア細胞を含む。該ポリヌクレオチドは修飾された宿主細胞の中でポリオール又は炭素基質を所望の生産物に転換させる。前記ポリオール又は炭素基質の酵素転換は実質的に同じ培養条件下で発現させた非修飾バクテリア宿主細胞と比較すると高められている。幾つかの好ましい態様において、ポリオール又は炭素基質の該酵素転換はグルコースから有機酸又は糖酸又はケト誘導体への酸化転換である。糖酸の例は、アルドン酸及びウロン酸を含む。より具体的には、ソルビトール、グルコン酸、グルカル酸、及び2-KDG、5-KDG及び2,5-DKGも含む。他の態様において、ポリオール又は他の炭素基質の酵素的転換は還元転換である。
【０１３５】
さらに他の態様において、本発明は、適切な培養条件下で修飾宿主細胞をポリオール又は炭素基質(例えば、グルコース又はフルクトース)と接触させること及びポリオール又は炭素基質の酵素的転換から所望の生成物の生産することを含む、前記糖酸のような所望の生産物を生産する方法を含む。ここで修飾されたバクテリア細胞は、本発明の多重結合型酸化還元酵素複合体、デヒドロゲナーゼ、チトクロームCタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換することにより得られる。
【０１３６】
本発明を実施する手順及び方法は以下の実施例を参照することより当業者に容易に理解されるであろう。これらの実施例は、本発明の範囲及びこれに関する請求項の範囲を限定するものではない。本明細書中に参照される全ての参考文献、特許及び刊行物は参照により本明細書に援用する。
【０１３７】
実施例
【実施例１】
【０１３８】
実施例1パントエア(Pantoea citrea)ゲノムの配列決定
パントエア(P. citrea)ゲノムの約95％は、Birren B. et al., (1999) GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL., Vol. 3 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されているような標準的な手順を用いた典型的なライブラリーを構築することにより配列決定されている。簡単に述べると、パントエアシトレア(P. citrea)ゲノムDNAは0.6から1.0キロベースの平均サイズを有するランダムフラグメントを生産するために超音波処理することにより物理的に剪断される。このDNAフラグメントは、鈍化末端を有し、pUC18内でクローンされる(New England BioLabs, Beverly, Mass)。ライブラリーの量が、ランダムにピックアップされた50-100コロニーの配列決定から解析されると、このライブラリーからのコロニーをランダムに採取し、PCR(Dunham et al. (1999) Bacterial Cloning Systems, pages 41-57 in GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL. Vol. 3 Birren B. et al., (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press NY)により増幅させ、PCRによる反応物を、配列決定に用いる。配列決定は、Applied Biosystems 3700 DNA sequencers (Perkin-Elmer, Foster City, Calif.)を用いて行う。各クローンは、前向き及び後ろ向きpUC18プライマーを用いて両末端から配列決定される。平均400-500塩基対が各鋳型より得られた。このアプローチによって、68,389読み取りを行い、合計で、34,788,222ベースペア(bp)を読み取った。これらの配列から合計で4,439,491bpを産出した224の隣接した配列を構築することができた。TBLASTプログラムを、所与のDNAをOrfに翻訳するために使用し、3のOrfを含む少なくとも19オペロンに、Saito et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:454-460により報告されているソルビトールデヒドロゲナーゼ配列との類似性に基づいて初めに注釈(タグ)をつけた。
【０１３９】
ガンマサブユニットのOrfのサイズを利用して、19オペロンを2のグループに分ける。ファミリー1は約238から249のアミノ酸残基のガンマサブユニットを有する10のメンバーを含む。図1Aを参照のこと。ファミリー2は、約174から195アミノ酸のガンマサブユニットを有する9のメンバーを有する。図1Bを参照のこと。19のオペロンのそれぞれがorfを含んでいるという観察は、自然環境下に存在するパントエアシトレア（P.citrea）において、これらすべての遺伝子が必然的に機能を保持していることを示唆する。上流遺伝子のDNA配列の付加的な解析の結果は、すべての遺伝子は適切なリボゾーム結合部に先行することを示している(データ非表示)。
【実施例２】
【０１４０】
実施例2-オペロンの失活による、配列番号57、配列番号19及び配列番号38を有する2-KDGDHオペロンをエンコードするorf2418-2420(配列番号115、配列番号77及び配列番号96に対応)の検出
2-KDGHDHオペロンのクローニング
139-2a/Ps-系統は、2-KDGDHオペロンのクローニングに使用された。この系統は、ATCC登録番号39140を有する139-2a系統の誘導体である。クリプティック(cryptic)プラスミド(pS)は、WO98/59054に記載の方法により除去された。参考文献はTruesdell et al., (1991) J. Bacteriol. 173:6651-6656である。
【０１４１】
KDGF1及びKDGR1の2のPCRプライマーを用いてパントエアシトレア(P. citra)139-2a/Ps-系統の染色体由来の2-KDGDHオペロンを包含する2.8-kbDNAフラグメントを標準的な手法を用いて増幅した(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Ed.)。
【０１４２】
KDGF1 5' AGTTAGCCGCTCATTTCCTG 3' (配列番号116)
KDGR1 5' AGCCGCCTGGTTTTTAC 3' (配列番号117)
【０１４３】
DNAフラグメントは、大腸菌(E.coli)TOP10細胞を宿主細胞として用いたlacプロモーター(lacP)(Invitrogen, Carlsbad Calif.)を有するpZeroBluntベクター内でクローンされた。このことによりプラスミドpKDG2(6.32kb)が得られる。LA+Kan50 プレート(1.5% アガー及び50 ppm カナマイシンを含む)Lb培地上で 3の KanR形質転換体が得られた。適切な制限酵素(EcoRI、Scal+、Spel、Sal1+Spel)を用いた消化により確認すると、この3全ての形質転換体は挿入部分を有し、転写方向は、lacPの伸長方向とは反対であることがわかった。
【０１４４】
パントエアシトレア(P. citrea)染色体由来の2-KDGHオペロンの欠失に用いるノックアウトプラスミドの構築
通常のプラスミドを利用した相同組換えによる遺伝子の失活に使用する手法は前に説明されている。参考文献は、Miller et al., (1988) J. Bacteriol. 170:2575-2583である。この一般的な手法を、2-KDGDHオペロンの失活に用いた。
【０１４５】
上に実施例に従って得られたpKDG2プラスミドは、アルファサブユニットの中央からC末端の0.993-kb領域を除くためにHpal+Scal酵素で消化された。このプラスミドはその後2のloxp site(Palmeros et al., (2000) Gene 247:255-264)で挟むように、catカセット(1.080-kb)に挿入し、pKDGCat(6.4-kb；catは2-KDGDHオペロンに対して反対方向に伸長する)を得た。このプラスミドを、Nal、Sacl、及びXbal酵素の消化により確認した。ColE1 Ori 領域を含む1.5-kbのAatll+Spelフラグメントを、プラスミドpKDGatlから除去し、その後、複製(ori)領域の最小R6K起源を含む502-bpのAstll+Spel ori DNAをプラスミドpGP704(Miller et al., (1988) J. Bacteriol. 170:2575-2583)をPCR基質とするプライマーを用いたPCRにより得た。このことにより最終的なノックアウトプラスミドpKDGCatR6(5.37-kb)が得られた。大腸菌（E. coli） PIR1系統(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)はSambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Edに記載の手順を用いて形質転換された。最終的なノックアウト構築物における960-bp及び840-bpの相同領域は、パントエアシトレア(P. citrea)染色体の中の相同組換えをさせるための2-KDGDHオペロンの5’末端及び3’末端に利用可能である。
【０１４６】
パントエアシトレア(P. citrea)系統の形質転換
最終的なノックアウトプラスミドpKDGcatR6(5.3kb)をHindIIIの消化により確認した後、このプラスミドをエレクトロポレーション(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 2nd Ed.)によりパントエアシトレア(P. citrea)139-2a/Ps-(pKD46)細胞に導入し、既知の方法を用いて、LA+Cm10プレート(LAは10ppmのCmを有するLB含有アガーである)上でクロラムフェニコール(CmR)耐性形質転換体を選択した。一重交叉組換えイベントと二重交叉組換えイベントを区別するために、LA+Kan3プレート上でCmR形質転換体のカナマイシンに対する感受性(KanS)を確認した。13のクロラムフェニコール耐性遺伝子のうちの9がKanSであった。このことは、この9の形質転換体が2-KDGDHオペロンを失活する二重交叉組換えイベントを有することを示す。4つの形質転換体、Nos. 4、5、8、及び9を、上で述べた内部及び外部プライマーを用いてPCRでチェックした。
【０１４７】
ノックアウト系統のPCR検証
2-KDGDHオペロンの欠失を検証するために用いる2の外部プライマーは、機能的なKDGDHオペロンを含む野生型及び2-KDGDHオペロンが欠失している成熟型変異体(変性系統)の両方において同じサイズのバンドに増幅される(参考文献は上に記載されている。ここにおいて、0.993-kbを1.08-kbcat-lolP DNAに換えて行う。)。
【０１４８】
1のcat遺伝特異プライマーを用いた1の外部プライマーを、成熟変異体の組換え結合部位の検証に用いた。Cat3+KDGR2プライマーを用いて4つ全ての形質転換体は、予想されたように1.4-kbのバンドを増幅した。これに対して、非変性系統は増幅を示さなかった。KDGF2+cat4プライマーを用いたときには形質転換体は予想されたように1.17-kbのバンドを増幅した。この結果は、4の形質転換体が、予想されたようにKDGの位置において、二重交差組換えイベントを受けていることをしめしており、それゆえ、このオペロンが失活しているということを示している。
【０１４９】
KDGF2 5' GCGTCTCTGCCATTGCGTAGTTTC 3' (配列番号 118)
KDGR2 5' GGGTGCGGATCGGTGTGGTTT 3' (配列番号 119)
CAT3 5' AAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCG 3' (配列番号 120)
CAT4 5' CAACAGTACTGCGATGAGTGGCAG 3' (配列番号 121)
【０１５０】
PKD46プラスミドの除去
変性系統はpKD46プラスミド(Datsenko and Wanner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645)を含むことから、このプラスミドを以下のように処置した。細胞をカルベニシリン(Carb)を含まない液体培地中で30℃、3日間育成する。その後、平板培養し、単一のコロニーを単離した。LA+Carb200プレート上でCarb感受性を試験したときに全ての単一のコロニーは、pKD46プラスミドがないことが確認された(Datsenko and Wanner, 上記 及びPalmeros et al. (2000) Gene 247:255-264)。更に、上に記載したSambrook et al.に記載の標準的な手順を用いてプラスミドDNAを単離したときに、単離された単一のコロニーの中にはプラスミドは検出されなかった。PKD46プラスミドを処置したパントエア(Pantoea)が得られ、WKFDG4と称された。
【０１５１】
パントエアシトレア(P. citrea)を用いた発酵実験
バクテリア細胞の育成に使用する全ての試薬及び材料は特に示さない限り、Diffco Laboratories (Detroit, Mich.), Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.) or Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) から入手した。
【０１５２】
シードトレイン(seed train)：液体窒素中に保存した表示系統WKDG4を含む培養バイアルを空気中で解凍し、500 mlの種培地を含有する2リットルの無菌三角フラスコへ0.75 mlを添加した。このフラスコを29℃、250 rpmで12時間培養した。移転の指標は、2.5より大きなOD550である。
【０１５３】
種フラスコ培養液：培養液の組成は、KH2PO4(12.0 g/L)、K2HPO4(4.0 g/L)、MgSO4・7H2O(2.0 g/L)、ディフコソイトン(Difco Soytone)(2.0 g/L)、クエン酸ナトリウム(0.1 g/L)、フルクトース(5.0 g/L)、(NH4)2SO4(1.0 g/L)、ニコチン酸(0.02 g/L)、FeCl3・6H2O(5 mL/L(0.4 g/L保存溶液))、微量塩(5mL/Ｌ(0.58g/LのZnSO4・7H2O、0.34g/LのMnSO4・H2O、0.48g/LのNa2MoO4・2H2O)である。
【０１５４】
当該培養液のpHを、20％NaOHを用いて7.0±0.1に調節した。20 mg/L(10 g/Lの保存溶液の2 mL/L)の最終濃度まで、テトラサイクリンHClを添加した。その後、得られた培養液を、0.2μのフィルターでろ過滅菌した。無菌培地をオートクレーブ処理したフラスコに添加した。
【０１５５】
生産発酵槽‐無菌化前における反応容器への添加物は、KH2PO4(3.5 g/L)、MgSO4・7H2O(1.0 g/L)、(NH4)2SO4(0.92 g/L)、グルタミン酸ナトリウム(15.0 g/L)、ZnSO4・7H2O(5.79 mg/L)、MnSO4・H2O(3.44 mg/L)、Na2MoO4・2H2O(4.70 mg/L)、FeCl3・6H2O(2.20 mg/L)、及び、塩化コリン(0.112 g/L)、Mazu DF-204(0.167 g/L)及び消泡剤である。
【０１５６】
上記構成要素の培養液を121℃で45分間無菌化した。タンクの無菌化の後、ニコチン酸(16.8 mg/L)、パントテン酸Ca(3.36 mg/L)、グルコース(25 g/L)及びフルクトース(25 g/L)を発酵槽に添加した。
【０１５７】
無菌化及び無菌化後成分の添加の後の最終的な容量は、6.0Lであった。このように調製した槽と培養液を前述した種フラスコの全容量に接種し、最終容量が6.5Lとなった。
【０１５８】
成長条件は、29℃及びpH6.0であった。攪拌速度、背圧、及び風量は、溶存酸素が0より大きくなるように調節した。最初にバッチに添加された糖が使い果たされたとき、本明細書で用いるフェドバッチ方法を用いた。WKDG4(2-KDG含有量ｇ/L=300)系統で30時間培養した後に得られた2-KDGの生産は、139-2a/PS(2-KDG含有ｇ/L=0)と比較して有意な差があった。139-2a/Ps系統のみが更に2,5-DKGに転換される2-KDGを作る。
【実施例３】
【０１５９】
実施例3 2-KDGの形成に含まれる3651-3653 orfの検出
GADHオペロンのクローニング
2のPCRプライマー、GADHF1及びGADHR2はパントエアシトレア(P. citrea)の139-2a/Ps-系統の染色体からGADHオペロンを増幅するために用いた。
【０１６０】
GADHF1 (5'-P-CGGTACTGAGGCAATGTCATG 3') 配列番号 122
GADHR1 (5'-P-aCGGAGAGCCGGATATTACAT, 3') 配列番号 123
この配列においてPはリン酸であり、配列番号122のATGはGADHガンマサブユニットのorfの開始剤コドンである。
【０１６１】
増幅が正しく行われたかどうかを確認するためにこのDNAフラグメントを制限酵素(HindIII、Pstl及びSall)で消化した。このフラグメントはlacプロモーター(lacP)を含むpCL1920ベクターの少ないコピー数のHindII部位にクローンされた(Lerner et al., (1990) Nucleic Acid Res. 18:4631)。LA+Spec50+X-gal+IPTGプレート(LBプレートは、50ppmのスペクチノマイシン及び40μg/ml Xゲル及び50μM IPTG及び1.5％のアガーで固化する)上の16の白いコロニーの中で、2のコロニー(Nos.7及び11)のみが挿入を含んでいた。適切な制限酵素(HindII、Pstl、Spel+Clal；及びXbal+Bglll)で確認した結果、両プラスミド内の挿入の転写方向はもともとのlacPプラスミドと同じであった。これらのプラスミドの1をpCLE2-7（8.5-kb）と称し、GADHオペロンの発現プラスミドとして使用し、以下で述べるノックアウトプラスミドの構築に使用した。
【０１６２】
ノックアウトプラスミドの構築
デヒドロゲナーゼサブユニットの中央の領域を除去するためにpCELE2-7プラスミドをBsu361+Clal制限酵素で消化した。その後、catカセット(1080-bp)が2のloxPサイト(Palmeros et al. (2000) Gene 247: 255-264)に挟まれるように挿入され、プラスミドpCELECat1(8.62-kb；cat遺伝子は、GADHオペロンに対して反対方向に伸長する)が得られた。この4065-bp GADH-cat-loxP遺伝子クラスターは上記のGADHF1及びGADHR1プライマーを用いたプラスミドからPCRにより増幅され、その後、最終的なノックアウトプラスミドpE2CatR6-1(4.58-Kb)を生産するために、プラスミドpGP704由来の505-bp HindII+EcoRV R6K複製の最小オリジンに結合し、Sambrook(上記)に記載の手順を用いてE.coli PIR1系統(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)の中で形質転換する。最終構築物において、相同な1160-bp及び1825-bp領域は、パントエアシトレア(P. citea)染色体で相同組換えをさせるためのGADHオペロンの5’末端及び3’末端に利用可能である。
【０１６３】
パントエアシトレア(P.citrea)系統の形質転換及びGADH失活の検証
最終的なノックアウトプラスミドを適切な制限酵素(Aatll+Accl及びBgll+SnaBl)で消化した後、該プラスミドを上で述べた様にパントエアシトレア（P.citrea）139-2a/Ps-の中で形質転換した。そして、該形質転換体をLA+Cm12プレート上で選択した。数百のCmRコロニーが出現した。4のコロニーについてPCRでGADHオペロンの欠失をチェックした。
【０１６４】
2の外部プライマーは野生型及び成熟変異体において、同じサイズのバンドを増幅する(上記参照、910-bpコード領域は、1080-bp cat loxP DNAに換えて行う)。従って、1のcat遺伝子特異プライマーを有する1の外部プライマーが成熟変異体の検証に使用される。No.2の形質転換体のみが予想された2.46-kbバンドをcat3+E2R1プライマーで増幅した。
【０１６５】
Primer E2R1 5'-GCAGCCGCTACGCAGATAAAA-3' 配列番号 124
しかしながら、他の3の変異体(Nos. 1、3及び4)は、E2F1+cat4プライマーで予想された1.64-kbのバンドを増幅した。
【０１６６】
Primer E2F1 5'-CTCGGCGAAAAAGAACCAGACAAG-3' 配列番号 125
【０１６７】
この結果は、No.2の形質転換体のみが、GADHオペロンの3’末端で一重交叉組換えイベントが起こっていることを示し、他の形質転換体(Nos. 1、3及び4)はGADHオペロンの5’末端で一重交叉組換えイベントが起こっていることを示す。一重交叉組換えイベントはGADHオペロンを失活させないことから、上で説明したように我々はNo.2の形質転換体から二重交叉組換え体を単離した。
【０１６８】
No.2形質転換体は、液体培地中でサブ培養（sub-cultured）され、単一のコロニーを単離した。5の単一コロニーのうちの5つが、サブ培養（sub-culturing）後に、GADHオペロンの5’末端で第二交叉を生じていた。このことにより、139-2a/Ps-バックグラウンドを有する本当のGADH失活系統が得られた。
【０１６９】
さらに確認するために、上で述べた単一コロニー由来のPCR生産物を、適切な制限酵素で消化した。E2F1+cat4プライマーにより得られた1.6-kb生産物をXbal酵素で消化した。cat3+E2R1プライマーで得られた2.46-kb生産物は、Pstl酵素で消化された。両消化物は、予想されたように同じパターンを示した。従って、GADH欠失系統は、さらにこの方法により確認された。上から単離された単一コロニーはWTE2-1と称され保存された。
【０１７０】
発酵実験
WTE2-1(GADH欠失系統)及び139-2a/Ps-(野生型対照系統)は2-KDGDHについて上で概説したように育成され、グルコネートの蓄積を測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ】図1Aは、同定された19オペロンの配置図及び本発明の配列を示す。各オペロンは通常、ガンマサブユニット(塗りつぶしカラム）、アルファサブユニット(ブランクカラム）、オペロンチトクロームC(CytC)サブユニット(点描カラム）といわれる、少なくとも3のオープンリーディングフレームにより特徴づけられる。アルファサブユニットはデハイドロゲナーセ活性を有する。図1Aにおいて、ガンマ、アルファ、及びCytCサブユニットはオペロンの中に表されており、この10のオペロンのグループはファミリー1と称される。太矢印は、各オープンリーディングフレーム(orf)の同じ領域内のフランキング遺伝子を示す。Orf 764 は配列番号46のアミノ酸配列に対応する。Orf 765 は配列番号1のアミノ酸配列に対応する。Orf 766 は配列番号20のアミノ酸配列に対応する。Orf 1748 は配列番号48のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1749 は配列番号8のアミノ酸配列に対応する。Orf 1750 は配列番号27のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1842 は配列番号41のアミノ酸配列に対応する。Orf 1841 は配列番号5のアミノ酸配列に対応する。Orf 1840 は配列番号23のアミノ酸配列に対応する。Orf 1951 は配列番号44のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1952 は配列番号7のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1953 は配列番号28のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2037 は配列番号42のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2036 は配列番号4のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2035 は配列番号22のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2634 は配列番号45のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2633 は配列番号9のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2632 は配列番号26のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2910 は配列番号43のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2909 は配列番号2のアミノ酸配列に対応する。Orf 2908 は配列番号21のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3051 は配列番号47のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3052 は配列番号10のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3053 は配列番号25のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3653 は配列番号39のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3652 は配列番号6のアミノ酸配列に対応する。Orf 3651 は配列番号24のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3689 は配列番号40のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3688 は配列番号3のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3687 は配列番号29のアミノ酸配列に対応する。
【図１Ｂ】図1Bは、同定された19オペロンの配置図及び本発明の配列を示す。各オペロンは通常、ガンマサブユニット(塗りつぶしカラム）、アルファサブユニット(ブランクカラム）、オペロンチトクロームC(CytC)サブユニット(点描カラム）といわれる、少なくとも3のオープンリーディングフレームにより特徴づけられる。アルファサブユニットはデハイドロゲナーセ活性を有する。図1Bにおいて、ガンマ、アルファ、及びCytCサブユニットは通常保存されておらず、このオペロンのグループを本明細書では、ファミリー2と言う。太矢印は、各オープンリーディングフレーム(orf)の同じ領域内のフランキング遺伝子を示す。Orf 1219 は配列番号52のアミノ酸配列に対応する。Orf 1220 は配列番号18のアミノ酸配列に対応する。Orf 1221 は配列番号34のアミノ酸配列に対応する。Orf 1982 は配列番号55のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1983 は配列番号14のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1984 は配列番号35のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1957 は配列番号53のアミノ酸配列に対応する。Orf 1956 は配列番号31のアミノ酸配列に対応する。 Orf 1955 は配列番号16のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2418 は配列番号57のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2419 は配列番号19のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2420 は配列番号38のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2448 は配列番号12のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2447 は配列番号50のアミノ酸配列に対応する。 Orf 2446 は配列番号32のアミノ酸配列に対応する。Orf 3043 は配列番号54のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3042 は配列番号13のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3041 は配列番号37のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3397 は配列番号58のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3398 は配列番号56のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3399 は配列番号15のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3400 は配列番号36のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3676 は配列番号51のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3675 は配列番号17のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3674 は配列番号33のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3820 は配列番号30のアミノ酸配列に対応する。 Orf 3819 は配列番号49のアミノ酸配列に対応する。Orf 3818 は配列番号11のアミノ酸配列に対応する。
【図２Ａ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図２Ｃ】図2Aから図2Cは配列番号1-10を含むファミリー１オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】図3Aから図3Bは、配列番号11-19を含むファミリー2オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図3Aから図3Bは、配列番号11-19を含むファミリー2オペロンに対応するアルファサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図4Aから図4Bは、配列番号20-29を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】図4Aから図4Bは、配列番号20-29を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図５Ａ】図5Aから図5Bは、配列番号30-38を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】図5Aから図5Bは、配列番号30-38を含むファミリー2オペロンに対応するCytCサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図６Ａ】図6Aから図6Bは、配列番号39-48を含むファミリー1オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図6Aから図6Bは、配列番号39-48を含むファミリー1オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図７】図7は、配列番号49-57を含むファミリー2オペロンに対応するガンマサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【図８】図8は配列番号58に対応するOrf3397のアミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｂ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｃ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｄ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｅ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｆ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｇ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｈ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｉ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図９Ｊ】図9Aから図9Jは、図2Aから2Cに示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号59-68)。
【図１０Ａ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｂ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｃ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｄ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｅ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｆ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｇ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１０Ｈ】図10Aから10Hは、図3Aから3Bに示すファミリー2アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号69-77)。
【図１１Ａ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｂ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｃ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｄ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｅ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｆ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｇ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１１Ｈ】図11Aから11Hは、図4Aから4Bに示すファミリー1CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号78-87)。
【図１２Ａ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｂ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｃ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｄ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｅ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｆ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｇ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１２Ｈ】図12Aから12Hは、図5Aから5Bに示すファミリー2CytCサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号88-96)。
【図１３Ａ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｂ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｃ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｄ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１３Ｅ】図13Aから13Eは、図6Aから6Bに示すファミリー1ガンマサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号97-106)。
【図１４Ａ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１４Ｂ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１４Ｃ】図14Aから14Cは、図7に示すファミリー1アルファサブユニットのアミノ酸配列をエンコードする核酸配列を示す(配列番号107-115)。
【図１５】図15は、AsA中間体の経路を現したものである。この図において、グルコース(GL)をグルコネート(GA)に転換する酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)である。GAを2-KDGに転換する酸化酵素は、グルコネートデヒドロゲナーゼ(GADH）である。2KDGから2,5-DKGに転換する酸化酵素は2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ(KDGDH）である。2,5-DKGを2-KLGに転換する還元酵素は、2,5-ジケト-D-グルコネートリダクターゼ(DKGR)である。この2-KLGを回収し、化学転換によりL-アスコルビン酸(AsA)に転換する。
【図１６Ａ】図16A及び図16Bは、図4及び5に示すCytCタンパク質の中に見られ、Orfs 766、1840、1953、2035、2632、2908、3053、3651、3687、1750、3820、1956、1984、2420、2446、3041、3400、3674 及び1221に対応する3のヘム結合部位を示す。
【図１６Ｂ】図16A及び図16Bは、図4及び5に示すCytCタンパク質の中に見られ、Orfs 766、1840、1953、2035、2632、2908、3053、3651、3687、1750、3820、1956、1984、2420、2446、3041、3400、3674 及び1221に対応する3のヘム結合部位を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元活性を有し、かつ、チトクロームCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該複合体が、
a)配列番号1及び配列番号20
b)配列番号8及び配列番号27
c)配列番号5及び配列番号23
d)配列番号7及び配列番号28
e)配列番号4及び配列番号22
f)配列番号9及び配列番号26
g)配列番号2及び配列番号21
h)配列番号10及び配列番号25
i)配列番号6及び配列番号24
j)配列番号3及び配列番号29
k)配列番号18及び配列番号34
l)配列番号14及び配列番号35
m)配列番号16及び配列番号31
n)配列番号19及び配列番号38
o)配列番号12及び配列番号32
p)配列番号13及び配列番号37
q)配列番号15及び配列番号36
r)配列番号17及び配列番号33
s)配列番号11及び配列番号30の各サブグループ、並びに、
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループの中に示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループt)から選択されることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1の単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
配列番号5及び配列番号23を含むc)
配列番号4及び配列番号22を含むe)
配列番号6及び配列番号24を含むi)
配列番号3及び配列番号29を含むj)
配列番号19及び配列番号38を含むn)の各サブグループ、並びに、
c)、e)、i)、j)及びn)のうちのいずれか1のサブグループの中に示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループから選択される多重結合型酸化還元酵素複合体をコードすることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項2の単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
サブグループc)を有する場合には配列番号41を含み、
サブグループe)を有する場合には配列番号42を含み、
サブグループi)を有する場合には配列番号39を含み、
サブグループj)を有する場合には配列番号40を含み、
サブグループn)を有する場合には配列番号57を含み、あるいは、
これらの配列に対して少なくとも95％相同な配列を含んでいる多重結合型酸化還元複合体をコードするための第三のコード領域を含むことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
多重結合型酸化還元酵素複合体であって、
酸化還元活性及び、
a) 配列番号1及び配列番号20
b) 配列番号8及び配列番号27
c) 配列番号5及び配列番号23
d) 配列番号7及び配列番号28
e) 配列番号4及び配列番号22
f) 配列番号9及び配列番号26
g) 配列番号2及び配列番号21
h) 配列番号10及び配列番号25
i) 配列番号6及び配列番号24
j) 配列番号3及び配列番号29
k) 配列番号18及び配列番号34
l) 配列番号14及び配列番号35
m) 配列番号16及び配列番号31
n) 配列番号19及び配列番号38
o) 配列番号12及び配列番号32
p) 配列番号13及び配列番号37
q) 配列番号15及び配列番号36
r) 配列番号17及び配列番号33
s) 配列番号11及び配列番号30、の各サブグループ、並びに
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループに示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループt)から選択される配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項５】
請求項4の多重結合型酸化還元酵素複合体であって、前記複合体が、
配列番号5及び配列番号23を含むc)
配列番号4及び配列番号22を含むe)
配列番号6及び配列番号24を含むi)
配列番号3及び配列番号29を含むj)
配列番号19及び配列番号38を含むn)の各サブグループ、及び
c)、e)、i、j)又はn)のうちのいずれか1のサブグループに示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループから選択されることを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項６】
請求項4の多重結合型酸化還元酵素複合体であって、前記複合体が、グルコネートデヒドロゲナーゼ活性又は2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ活性を有することを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項７】
炭素源を所望の生産物に酵素転換する機能を有する多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記複合体が、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを含むアミノ酸配を列有し、
アルファサブユニットはデヒドロゲナーゼ活性を有しており、かつ、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
ガンマサブユニットが、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
チトクロームCサブユニットが配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列からなる群より選択される、ことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
酸化還元活性を有し、かつ、グルコースを所望の生産物への転換することができる多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記複合体が、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを有し、
アルファサブユニットが、デヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
ガンマサブユニットが、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、及び、これらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
チトクロームCサブユニットが配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列からなる群より選択される、ことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、アルファサブユニットをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号59-68から成る群より選択される配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCサブユニットをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号78-87から成る群より選択される配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、所望の生産物が、アスコルビン酸中間体であることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号1から配列番号19のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項12の単離ポリヌクレオチドであって、デヒドロゲナーゼが配列番号1から配列番号10から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12の単離ポリヌクレオチドであって、デヒドロゲナーゼが、配列番号11から配列番号19から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号20から配列番号38アミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むチトクロームCタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項15の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCタンパク質が、配列番号20から配列番号29から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項15の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCタンパク質が、配列番号30から配列番号38から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号39から配列番号57よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記タンパク質が、多重結合型酸化還元酵素複合体の中の1のサブユニットを含むことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
3つのコード領域を含むオペロンによりエンコードされる単離された多重結合型酸化還元酵素複合体であって、
前記オペロンが
a) 配列番号104、配列番号59及び配列番号78
b) 配列番号106、配列番号66及び配列番号85
c) 配列番号99、配列番号63及び配列番号81
d) 配列番号102、配列番号65及び配列番号86
e) 配列番号100、配列番号62及び配列番号80
f) 配列番号103、配列番号67及び配列番号84
g) 配列番号101、配列番号60及び配列番号79
h) 配列番号105、配列番号68及び配列番号83
i) 配列番号97、配列番号64及び配列番号82
j) 配列番号98、配列番号61及び配列番号87
k) 配列番号110、配列番号76及び配列番号92
l) 配列番号113、配列番号72及び配列番号93
m) 配列番号111、配列番号89及び配列番号74
n) 配列番号115、配列番号77及び配列番号96
o) 配列番号70、配列番号108及び配列番号90
p) 配列番号112、配列番号71及び配列番号95
q) 配列番号114、配列番号73及び配列番号94
r) 配列番号109、配列番号75及び配列番号91
s) 配列番号88、配列番号107、及び配列番号69の各サブグループ、並びに
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループに示す配列と少なくとも97％相同な配列から成るサブグループt)から選択されることを特徴とする単離された多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項２０】
請求項19の単離された多重結合型酸化還元酵素複合体であって、該オペロンが、
c) 配列番号99、配列番号63及び配列番号81
e) 配列番号100、配列番号62及び配列番号80
i) 配列番号97、配列番号64及び配列番号82
j) 配列番号98、配列番号61及び配列番号87
n) 配列番号115、配列番号77及び配列番号96の各サブグループ、及び、前記各サブグループに示す配列のいずれか一と少なくとも97％相同な配列から成るサブグループから選択される3のコード領域を含むことを特徴とする、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項２１】
請求項1、7又は8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項12、15又は18に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項19の多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするオペロンを含むベクター。
【請求項２４】
請求項21、22又は23の請求項に記載のベクターで形質転換されたバクテリア宿主細胞。
【請求項２５】
請求項24のバクテリア宿主細胞であって、バクテリア宿主細胞が腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統の細胞であることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２６】
請求項25のバクテリア宿主細胞であって、該系統がパントエア(Pantoea)、クレブシエラ(Klebsiella)、エルウィニア(Erwinia)又は大腸菌(E. coli)から選択されることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２７】
請求項24のバクテリア宿主細胞であって、前記バクテリア宿主細胞が、シュードモナス(Pseudomonadacea）系統であることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２８】
バクテリア宿主細胞の中でポリオール基質の酵素転換を高める方法であって、
変性バクテリア宿主細胞を適切な条件下でポリオール基質と接触させる工程であって、前記変性バクテリア宿主細胞は、請求項21のベクターで形質転換することにより得られたバクテリア宿主細胞であり、前記ポリヌクレオチドが変性バクテリア宿主細胞の中で発現することを特徴とする工程と、
ポリオール基質を所望の生産物に酵素転換させる工程であって、前記ポリオール基質の酵素的転換が対応する非変性バクテリア宿主細胞を用いたポリオール基質の酵素転換と比較して高められていることを特徴とする工程を含む方法。
【請求項２９】
請求項28の方法であって、ポリオール基質の酵素転換が酸化転換であることを特徴とする法。
【請求項３０】
請求項28の方法であって、該ポリオールの酵素転換が還元転換であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
所望の生産物を生産する方法であって、
変性バクテリア宿主細胞を適切な培養条件下でポリオール基質と接触させる工程であって、該変性バクテリア宿主細胞は請求項21のベクターで形質転換した宿主細胞であり、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドが変性バクテリア宿主細胞の中で発現することを特徴とする工程と、
前記所望の生産物を生産するために、多重結合型酸化還元酵素複合体でポリオール基質を酵素的に転換することにより所望の生産物を得る工程を含む方法。
【請求項３２】
請求項31の方法であって、該ポリオール基質がグルコース、ソルビトール又はグリセロールであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項31の方法であって、所望の生産物がアスコルビン酸(AsA)中間体であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項33の方法であって、アスコルビン酸(AsA）中間体が2-ケト-D-グルコネート又は2,5-ジケト-D-グルコネートであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項31の方法であって、所望の生産物が有機酸であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項31の方法であって、宿主細胞が、大腸菌(E. coli)、パントエア(Pantoea)クレブシエラ(Klebsiella)及びエルウィニア(Erwinia)であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項31の方法であって、さらに所望の生産物を回収する工程を含む方法。
【請求項１】
酸化還元活性を有し、かつ、チトクロームCサブユニット及びデヒドロゲナーゼサブユニットを含む多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該複合体が、
a)配列番号1及び配列番号20
b)配列番号8及び配列番号27
c)配列番号5及び配列番号23
d)配列番号7及び配列番号28
e)配列番号4及び配列番号22
f)配列番号9及び配列番号26
g)配列番号2及び配列番号21
h)配列番号10及び配列番号25
i)配列番号6及び配列番号24
j)配列番号3及び配列番号29
k)配列番号18及び配列番号34
l)配列番号14及び配列番号35
m)配列番号16及び配列番号31
n)配列番号19及び配列番号38
o)配列番号12及び配列番号32
p)配列番号13及び配列番号37
q)配列番号15及び配列番号36
r)配列番号17及び配列番号33
s)配列番号11及び配列番号30の各サブグループ、並びに、
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループの中に示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループt)から選択されることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1の単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
配列番号5及び配列番号23を含むc)
配列番号4及び配列番号22を含むe)
配列番号6及び配列番号24を含むi)
配列番号3及び配列番号29を含むj)
配列番号19及び配列番号38を含むn)の各サブグループ、並びに、
c)、e)、i)、j)及びn)のうちのいずれか1のサブグループの中に示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループから選択される多重結合型酸化還元酵素複合体をコードすることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項2の単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
サブグループc)を有する場合には配列番号41を含み、
サブグループe)を有する場合には配列番号42を含み、
サブグループi)を有する場合には配列番号39を含み、
サブグループj)を有する場合には配列番号40を含み、
サブグループn)を有する場合には配列番号57を含み、あるいは、
これらの配列に対して少なくとも95％相同な配列を含んでいる多重結合型酸化還元複合体をコードするための第三のコード領域を含むことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
多重結合型酸化還元酵素複合体であって、
酸化還元活性及び、
a) 配列番号1及び配列番号20
b) 配列番号8及び配列番号27
c) 配列番号5及び配列番号23
d) 配列番号7及び配列番号28
e) 配列番号4及び配列番号22
f) 配列番号9及び配列番号26
g) 配列番号2及び配列番号21
h) 配列番号10及び配列番号25
i) 配列番号6及び配列番号24
j) 配列番号3及び配列番号29
k) 配列番号18及び配列番号34
l) 配列番号14及び配列番号35
m) 配列番号16及び配列番号31
n) 配列番号19及び配列番号38
o) 配列番号12及び配列番号32
p) 配列番号13及び配列番号37
q) 配列番号15及び配列番号36
r) 配列番号17及び配列番号33
s) 配列番号11及び配列番号30、の各サブグループ、並びに
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループに示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループt)から選択される配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項５】
請求項4の多重結合型酸化還元酵素複合体であって、前記複合体が、
配列番号5及び配列番号23を含むc)
配列番号4及び配列番号22を含むe)
配列番号6及び配列番号24を含むi)
配列番号3及び配列番号29を含むj)
配列番号19及び配列番号38を含むn)の各サブグループ、及び
c)、e)、i、j)又はn)のうちのいずれか1のサブグループに示す配列と少なくとも95％相同な配列から成るサブグループから選択されることを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項６】
請求項4の多重結合型酸化還元酵素複合体であって、前記複合体が、グルコネートデヒドロゲナーゼ活性又は2-ケト-D-グルコネートデヒドロゲナーゼ活性を有することを特徴とする多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項７】
炭素源を所望の生産物に酵素転換する機能を有する多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記複合体が、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを含むアミノ酸配を列有し、
アルファサブユニットはデヒドロゲナーゼ活性を有しており、かつ、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
ガンマサブユニットが、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
チトクロームCサブユニットが配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列からなる群より選択される、ことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
酸化還元活性を有し、かつ、グルコースを所望の生産物への転換することができる多重結合型酸化還元酵素複合体をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記複合体が、アルファサブユニット、ガンマサブユニット及びチトクロームCサブユニットを有し、
アルファサブユニットが、デヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
ガンマサブユニットが、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、及び、これらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列から選択され、
チトクロームCサブユニットが配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、及びこれらと少なくとも95％の配列相同性を有する配列からなる群より選択される、ことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、アルファサブユニットをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号59-68から成る群より選択される配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCサブユニットをコードしているポリヌクレオチドが、配列番号78-87から成る群より選択される配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項8の単離ポリヌクレオチドであって、所望の生産物が、アスコルビン酸中間体であることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号1から配列番号19のアミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％の相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むデヒドロゲナーゼタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項12の単離ポリヌクレオチドであって、デヒドロゲナーゼが配列番号1から配列番号10から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12の単離ポリヌクレオチドであって、デヒドロゲナーゼが、配列番号11から配列番号19から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号20から配列番号38アミノ酸配列及びこれらと少なくとも90％の配列相同性を有するアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むチトクロームCタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項15の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCタンパク質が、配列番号20から配列番号29から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項15の単離ポリヌクレオチドであって、チトクロームCタンパク質が、配列番号30から配列番号38から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号39から配列番号57よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記タンパク質が、多重結合型酸化還元酵素複合体の中の1のサブユニットを含むことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
3つのコード領域を含むオペロンによりエンコードされる単離された多重結合型酸化還元酵素複合体であって、
前記オペロンが
a) 配列番号104、配列番号59及び配列番号78
b) 配列番号106、配列番号66及び配列番号85
c) 配列番号99、配列番号63及び配列番号81
d) 配列番号102、配列番号65及び配列番号86
e) 配列番号100、配列番号62及び配列番号80
f) 配列番号103、配列番号67及び配列番号84
g) 配列番号101、配列番号60及び配列番号79
h) 配列番号105、配列番号68及び配列番号83
i) 配列番号97、配列番号64及び配列番号82
j) 配列番号98、配列番号61及び配列番号87
k) 配列番号110、配列番号76及び配列番号92
l) 配列番号113、配列番号72及び配列番号93
m) 配列番号111、配列番号89及び配列番号74
n) 配列番号115、配列番号77及び配列番号96
o) 配列番号70、配列番号108及び配列番号90
p) 配列番号112、配列番号71及び配列番号95
q) 配列番号114、配列番号73及び配列番号94
r) 配列番号109、配列番号75及び配列番号91
s) 配列番号88、配列番号107、及び配列番号69の各サブグループ、並びに
a)からs)のうちのいずれか一のサブグループに示す配列と少なくとも97％相同な配列から成るサブグループt)から選択されることを特徴とする単離された多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項２０】
請求項19の単離された多重結合型酸化還元酵素複合体であって、該オペロンが、
c) 配列番号99、配列番号63及び配列番号81
e) 配列番号100、配列番号62及び配列番号80
i) 配列番号97、配列番号64及び配列番号82
j) 配列番号98、配列番号61及び配列番号87
n) 配列番号115、配列番号77及び配列番号96の各サブグループ、及び、前記各サブグループに示す配列のいずれか一と少なくとも97％相同な配列から成るサブグループから選択される3のコード領域を含むことを特徴とする、単離された多重結合型酸化還元酵素複合体。
【請求項２１】
請求項1、7又は8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項12、15又は18に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項19の多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするオペロンを含むベクター。
【請求項２４】
請求項21、22又は23の請求項に記載のベクターで形質転換されたバクテリア宿主細胞。
【請求項２５】
請求項24のバクテリア宿主細胞であって、バクテリア宿主細胞が腸内細菌科(Enterobacteriaceae)系統の細胞であることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２６】
請求項25のバクテリア宿主細胞であって、該系統がパントエア(Pantoea)、クレブシエラ(Klebsiella)、エルウィニア(Erwinia)又は大腸菌(E. coli)から選択されることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２７】
請求項24のバクテリア宿主細胞であって、前記バクテリア宿主細胞が、シュードモナス(Pseudomonadacea）系統であることを特徴とするバクテリア宿主細胞。
【請求項２８】
バクテリア宿主細胞の中でポリオール基質の酵素転換を高める方法であって、
変性バクテリア宿主細胞を適切な条件下でポリオール基質と接触させる工程であって、前記変性バクテリア宿主細胞は、請求項21のベクターで形質転換することにより得られたバクテリア宿主細胞であり、前記ポリヌクレオチドが変性バクテリア宿主細胞の中で発現することを特徴とする工程と、
ポリオール基質を所望の生産物に酵素転換させる工程であって、前記ポリオール基質の酵素的転換が対応する非変性バクテリア宿主細胞を用いたポリオール基質の酵素転換と比較して高められていることを特徴とする工程を含む方法。
【請求項２９】
請求項28の方法であって、ポリオール基質の酵素転換が酸化転換であることを特徴とする法。
【請求項３０】
請求項28の方法であって、該ポリオールの酵素転換が還元転換であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
所望の生産物を生産する方法であって、
変性バクテリア宿主細胞を適切な培養条件下でポリオール基質と接触させる工程であって、該変性バクテリア宿主細胞は請求項21のベクターで形質転換した宿主細胞であり、多重結合型酸化還元酵素複合体をエンコードするポリヌクレオチドが変性バクテリア宿主細胞の中で発現することを特徴とする工程と、
前記所望の生産物を生産するために、多重結合型酸化還元酵素複合体でポリオール基質を酵素的に転換することにより所望の生産物を得る工程を含む方法。
【請求項３２】
請求項31の方法であって、該ポリオール基質がグルコース、ソルビトール又はグリセロールであることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項31の方法であって、所望の生産物がアスコルビン酸(AsA)中間体であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項33の方法であって、アスコルビン酸(AsA）中間体が2-ケト-D-グルコネート又は2,5-ジケト-D-グルコネートであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項31の方法であって、所望の生産物が有機酸であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項31の方法であって、宿主細胞が、大腸菌(E. coli)、パントエア(Pantoea)クレブシエラ(Klebsiella)及びエルウィニア(Erwinia)であることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項31の方法であって、さらに所望の生産物を回収する工程を含む方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図９Ｉ】
【図９Ｊ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図９Ｉ】
【図９Ｊ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５２３６２３（Ｐ２００７−５２３６２３Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２００６（Ｐ２００６−５２２００６）
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４２０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１２５４７
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２７日（２００４．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２４２０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１２５４７
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]