寒天分解酵素およびその利用
次の性質を有する寒天分解酵素が開示されている。（１）作用：アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。（２）基質特異性：少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。（３）温度の影響：５４℃以上で３０分間の熱処理を行っても活性が残存する。この酵素は、従来の寒天分解酵素に比べ、高い温度においても活性を有するので、寒天分解の速度を上げることができ、産業上有利に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は寒天分解酵素およびその利用に関し、更に詳細には従来の寒天分解酵素に比べ、酵素活性や耐熱性が高い新規な寒天分解酵素およびその利用に関する。
【背景技術】
寒天は、テングサ、オゴノリ等の紅藻類から得られる多糖類であり、その主成分はアガロースである。また、寒天中にはアガロースに硫酸、硫酸ピルビン酸等がエステル結合したアガロペクチンと総称される多糖も少量存在している。
アガロースを寒天分解酵素であるβ−アガラーゼにより加水分解することによりネオアガロオリゴ糖が得られるが、このものは、デンプン老化防止作用が強く、加熱処理により静菌作用を生じること、低カロリー性等の面から食品分野で高機能性食品の原料として有用である（例えば、河野敏明、「寒天オリゴ糖（ネオアガロオリゴ糖）」、食品包装、（１９９０）、２２（１）：１００−１０５参照）。また、海藻成分をβ−アガラーゼにより加水分解して得られるオリゴ糖には免疫機能活性化機能や（例えば、Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９５），５９（１０）：１９３３−１９３７参照）、肌への美白、保湿効果（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９７），６１（１）：１６２−１６３参照）が認められている。
一方、寒天分解酵素を用いて海藻類の強固な細胞組織を分解し、生理活性物質を抽出したり、あるいは該酵素を用いて作成したプロトプラスト（例えば、Ａｒａｋｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９８），６（３）：１９３−１９７参照）を利用して海藻の有用品種の開発をすることは未開発の海洋生物資源の新たな有効利用として期待されている。
しかしながら、従来知られている寒天分解酵素（例えば、特開平６−２８４８８８号公報参照）は、生産性が低く、高価であるために工業的利用が難しいという問題や、酵素活性や耐熱性等も十分でないという問題があり、産業界で広く利用されるという状態にはない。
従って、本発明は、従来知られている寒天分解酵素よりも寒天を分解する能力や耐熱性等に優れ、かつ大量生産可能な寒天分解酵素および遺伝子工学技術を利用した当該酵素の製造に利用可能なその遺伝子の提供をその課題とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、自然界から寒天分解酵素を産生する微生物について鋭意探索したところ、海底土壌から分離した新規マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物が極めて高い寒天を分解する能力を有し、耐熱性等にも優れた寒天分解酵素を産生することを見出した。また、この微生物の寒天分解酵素遺伝子をクローニングし、これを利用することで寒天分解酵素の遺伝子組換え技術による大量生産が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の第１の目的は、次の性質を有する寒天分解酵素を提供することである。
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
５４℃以上で３０分間の熱処理を行っても活性が残存する。
本発明の第２の目的は、マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来の上記寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第３の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２０のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）であり、５４℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上である上記寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第４の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２０％以上である前記の寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第５の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２１のマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｉｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の７％以上である前記の寒天分解酵素を提供するものである。
更に、本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号５または配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する前記の寒天分解酵素を提供するものである。
更にまた、本発明の他の別の目的は、上記配列番号１、配列番号５および配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
また更に、本発明の別の他の目的は、前記の形質転換された微生物を培養し、培養物より寒天分解酵素を採取することを特徴とする寒天分解酵素の製造方法、藻類に前記寒天分解酵素を作用させてネオアガロオリゴ糖やプロトプラストを製造する方法およびＤＮＡをアプライしたアガロースゲルに、前記寒天分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収するアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７の分類学的位置を示す図面である。
図２は、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３の分類学的位置を示す図面である。
図３は、マイクロブルビファー エスピー Ａ９４の分類学的位置を示す図面である。
図４は、ＲａｇａＡ７の加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図５は、ＲａｇａＡ７の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図６は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＡ７の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図７は、ＲａｇａＡ７の酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図８は、ＲａｇａＡ７およびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ７、○はＰＳＡ）。
図９は、ＲａｇａＡ７およびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ７、○はＰＳＡ）。
図１０は、ＲａｇａＡ３の加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図１１は、ＲａｇａＡ３の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１２は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＡ３の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１３は、ＲａｇａＡ３の酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図１４は、ＲａｇａＡ３およびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ３、○はＰＳＡ）。
図１５は、ＲａｇａＡ３およびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ３、○はＰＳＡ）。
図１６は、ＲａｇａＢの加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図１７は、ＲａｇａＢの酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１８は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＢの酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１９は、ＲａｇａＢの酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図２０は、ＲａｇａＢおよびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＢ、○はＰＳＡ）。
図２１は、ＲａｇａＢおよびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＢ、○はＰＳＡ）。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の寒天分解酵素（以下、「本発明酵素」という）は、従来の寒天分解酵素と比べ、寒天の分解能力や耐熱性が著しく高いものであり、好ましくはマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来のものである。なお、「マイクロブルビファー属微生物由来の」とは、本発明酵素の存在が、マイクロブルビファー属微生物において初めて見出されたということを意味するのみのものであり、マイクロブルビファー属微生物から取得した本発明酵素をコードするポリヌクレオチドを利用して他の微生物に産生させた本発明酵素や、他の属に属する微生物から得た同一の性質を有する寒天分解酵素も本発明酵素に含まれる。
本発明酵素の代表的なものの例としては、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）が産生するＲａｇａＡ７と名付けられた寒天分解酵素、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）が産生するＲａｇａＡ３と名付けられた寒天分解酵素およびマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）が産生するＲａｇａＢと名付けられた３つの酵素が挙げられる。以下、これらについて順次説明する。
（Ａ１）ＲａｇａＡ７の特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は１５〜７０℃であり、最適作用温度は４５〜５５℃である。５４℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の３５％以上、好ましくは４０％以上、７０℃で２５％以上、好ましくは３５％以上である。また、８０℃においても、２５％以上、好ましくは３５％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＳＤＳで阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
１．５％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合と同等の活性を維持する。
（６）比活性：
１００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは、２００Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。作用ｐＨ範囲は３〜１０であり、最適ｐＨは５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜４９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。１ＭのＮａＣｌ中で約８０％の活性を維持する。１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約６０％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．５〜４．５
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＡ７を産生する、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）は、次のような菌学的性質を有している。
（Ａ２）マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．５〜０．８μｍ×１．５〜５．０μｍ
運動性：有
鞭毛：有
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：１０〜４３℃で良好に生育
食塩濃度：０．５〜１０％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陰性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：無
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
（Ｂ１）ＲａｇａＡ３の特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は５〜７０℃であり、最適作用温度は５０〜６０℃である。６０℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の４０％以上、好ましくは５０％以上、８０℃においても、２０％以上、好ましくは３０％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００およびＴｗｅｅｎ ２０で阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
少なくとも１％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合の４０％の活性を維持する。
（６）比活性：
３００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは３５０Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ５〜１０の範囲で安定である。作用ｐＨ範囲は３．５〜９．５であり、最適ｐＨは６．５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜６６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｆｅ２＋によりやや阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。
１ＭのＮａＣｌ中で約９０％の活性を維持する。
１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約８０％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．５〜４．５
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＡ３を産生する、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３は、は次のような菌学的性質を有している。
（Ｂ２）マイクロブルビファーエスピー１３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．４〜０．６μｍ×４．０〜８．０μｍ
運動性：無
鞭毛：無
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：１５〜３５℃で良好に生育
食塩濃度：１〜５％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陽性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：有
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
（Ｃ１）ＲａｇａＢの特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は１０〜７０℃であり、最適作用温度は５０〜６０℃である。６０℃で３０分間の熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上、好ましくは３０％以上であり、８０℃においても７％以上、好ましくは１０％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＳＤＳで阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
２．０％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合と同等の活性を維持する。
０．４％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合の２倍の活性を有する。
（６）比活性：
４００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは、４５０Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ８〜９の範囲で安定であり、ｐＨ４〜１０の範囲で約５０％の活性が残存する。作用最適ｐＨは６．５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜４９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｆｅ２＋によりやや阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。１ＭのＮａＣｌ中で約９０％の活性を維持する。１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約７４％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．７〜５．２
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＢを産生する、マイクロブルビファー エスピーＡ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）は次のような菌学的性質を有している。
（Ｃ２）マイクロブルビファーエスピーＡ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．６〜０．８μｍ×３．０〜６．０μｍ
運動性：有
鞭毛：有
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：２０〜５２℃で良好に生育
食塩濃度：１〜５％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陰性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：有
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
上記の微生物を含む本発明酵素を生産する微生物は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次のようにして得ることができる。まず、採取した微生物群を寒天またはアガロースを含む平板培地上で培養し、寒天を分解する能力を有する微生物を選抜する。この培地は寒天を含む培地に、窒素源、無機化合物等の栄養成分を適当量含有するものであれば、天然培地、合成培地の何れも使用することができる。
上記したマイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４は、いずれも、本発明者らが相模湾や、駿河湾の海底の泥から得たマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の微生物である。
そして、上記各マイクロブルビファー属株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８１）を用いて分類学的位置を解析した。解析した結果をｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法に基づき記載した系統樹を図１、図２および図３に示すが、この結果から、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４はマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の新種であることが判明した。
なお、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４については、運動性等の点からマイクロブルビファー属以外の新属である可能性もあるが、便宜的に最も近縁となったマイクロブルビファー属の新種とした。
そこで本出願人らはこれを、それぞれ１３２５−Ａ７、１３２５−Ａ３およびＡ９４と命名し、各々２００３年３月６日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ国際寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９〜８３２１）。
上記のマイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、１３２５−Ａ３およびＡ９４を含む本発明酵素を産生する微生物から、本発明酵素を得るには、例えばこれを常法に従って培養し、次いで培養物中から本発明酵素を回収すればよい。
本発明酵素を得るための微生物の培養方法は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次の方法を用いることができる。培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。培養に用いる培地は、寒天またはアガロース、寒天分解物等を炭素源として含むことが望ましい。その他、培地中には、本菌株が資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことも可能である。寒天、アガロースは、市販のもの、あるいは加工、精製される前の紅藻類を単独、併用して用いることができる。その他の炭素源及び窒素源について特に制限はないが、窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源は寒天、アガロース以外の炭素源としても使用できる。更に、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いる。寒天、アガロース以外の前記成分を含んだマリンブロス２２１６（ディフコ社製）に、寒天またはアガロースを含む物質等を加えて用いることもできる。また、前記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母エキス、寒天またはアガロースを含む物質等を加えた培地を用いることもできる。寒天またはアガロースの濃度は、０．１〜１．５％が好ましく、この際、寒天またはアガロースの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能であるが、酵素生産を目的とする場合は、濃度０．１〜０．４％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは、濃度１．２〜１．５％の固体培養が好ましい。培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、培養温度は、１０〜４３℃、好ましくは２５〜３９℃、培養時間は、１５〜４８時間、好ましくは１８〜２４時間である。
かくして得られる培養物中の目的物質である寒天分解酵素の回収法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法等の菌体破砕法で得られた菌体破砕物、あるいは培養物を遠心、ろ過等の操作によって菌体と培養上清に分離することで得られた培養上清を、粗酵素液として用いることができる。
この粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて、例えば塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。
また、本発明酵素を得るための別の方法としては、本発明酵素を産生する微生物、例えば、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３、マイクロブルビファーエスピーＡ９４等から本発明酵素をコードする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明酵素のアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明酵素を産生させ、培養物より本発明酵素を採取すればよい。
以下に具体的な遺伝子工学技術を用いた本発明酵素の製造方法について説明する。
本発明酵素のうち、ＲａｇａＡ７は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ７に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては５６％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＡ７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ１）〜（ｄ１）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
同様、本発明酵素のうち、ＲａｇａＡ３は、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号５で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ３に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては５６％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＡ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ２）〜（ｄ２）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
更に、本発明酵素のうち、ＲａｇａＢは、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と６３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ３に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては６３％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＢのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ３）〜（ｄ３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
本発明酵素を生産する組換え微生物の作製は、公知の手段を組み合わせることにより行うことができる。すなわち、上記マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３またはマイクロブルビファーエスピーＡ９４からの本発明酵素をコードするヌクレオチド配列の取得やその増幅、ベクターへのヌクレオチド配列の挿入、当該遺伝子による宿主の形質転換等は、この分野の成書に記載された方法を適宜利用することにより行われる。
このうち、組換え微生物の製法の一例としては、以下に示す方法に特に限定はされないが、次に示す方法を用いることができる。寒天分解酵素の生産菌から、ショットガンクローニング、あるいは特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅等によって、寒天分解酵素遺伝子を取得する。本遺伝子を、ＥＫ系のＥ．ｃｏｌｉ等に代表されるグラム陰性菌、あるいはＢＳ系のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等に代表されるグラム陽性菌に導入して、組換え体を取得する。形質転換にはプラスミド等の核外遺伝子をベクターにして利用、あるいは宿主菌本来有しているＤＮＡ取り込み能力等を利用するする方法を用いることができる。
また、上記のようにして作製された組換え微生物の培養、培養物からの本発明酵素の取得、当該酵素の精製も、前記した方法や公知方法あるいはこれに準じた方法により行うことができる。
なお、本発明において酵素の活性は、０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、特に記述しない限り、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。従って、本発明において酵素の活性は、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）として表示する。
以上のようにして得られる本発明酵素は、従来の寒天分解酵素と同様に、例えば寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕物または抽出物を原料とした寒天由来オリゴ糖等の製造や、研究用試薬として、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法等に使用することができる。更にまた藻類、得に紅藻類からのプロトプラストの製造や有用物質の抽出等の用途に使用することができる。
具体的に、寒天由来オリゴ糖の製造は、以下に示す方法に特に限定はされないが、次に示す手順を用いることができる。アガロース、寒天等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結合した骨格を持つ多糖類または同様の骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕または抽出物に、本発明の寒天分解酵素を混ぜ、ｐＨ４〜１０、３０〜５５℃の範囲で保温することで寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖を生成できる。
かくして得られる寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖は、以下に示す用途に特に限定はされないが例えば、低カロリー性食品として、または加熱処理後に生じるある種の微生物に対する静菌作用やデンプン老化防止作用を有する飲食品改良剤、薬理作用、例えば免疫機能調節機能、血圧降下作用、抗腫瘍作用、腸のぜん動運動を活性化する機能を有する医薬品、または高機能性飲食品、保湿、美白作用を有する化粧品の成分等の用途に用いることができる。
一方、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次に示す方法を用いることができる。ＤＮＡを電気泳動で分画後、目的のＤＮＡ断片含むアガロースゲル断片に本発明酵素を加えて、溶解する。溶解後、必要であればＤＮＡ断片含む溶液を、例えばフェノール処理、エタノール沈澱、カラムや樹脂を使用した精製等の精製方法をを単独、あるいは併用して更に精製することも可能である。
また、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を持つ多糖類を細胞組織成分に有する藻類を原料としたプロトプラストの製造は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば以下の手順で行うことができる。供試海藻を０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でパパインを作用させる。その後０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、４０μｍのナイロンメッシュでろ過洗浄し、洗浄した葉体をナイフで数ミリ片に裁断する。裁断片を本発明酵素と市販のセルラーゼオノズカＲＳならびに、マイセロチームＲ−１０、それに０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で振とうすることによって、プロトプラストを得ることができる。
かくして得られるプロトプラストは、以下に示す用途に特に限定はされないが例えば、海藻中の生理活性物質等の有用物質の抽出、海藻組織培養、海藻細胞の生化学的、生理学的研究、細胞融合や遺伝子導入等を利用した海藻有用品種開発に用いることができる。
【実施例】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
なお、以下の実施例において、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡはそれぞれサイトウら（Ｓａｉｔｏ Ｈ，Ｍｉｕｒａ Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，７２：６１９−６２９，（１９６３））およびバーンボイムら（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＨＣ，Ｄｏｌｙ Ｊ．，Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５１３−１５２３，（１９７９））の方法に従って調製した。他の基本的遺伝子操作はサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２））の方法に基づいて行った。また、形質転換は、ハナハンら（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６６：５５７−５８０，（１９８３））の方法、バチルス．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換はチャンら（Ｃｈａｎｇ Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ ＳＮ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１−１１５，（１９７９））の方法で行った。
【実施例１】
寒天分解菌のスクリーニング：
海洋科学技術センターに保存されている海底土壌のサンプルをマリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）で適宜希釈し、マリンアガー平板培地に接種し、１５〜５５℃の様々な温度で１６〜４８時間培養した。コロニー周辺の寒天を分解し、用いた平板培地にくぼみを形成した菌を、更に別のマリンアガー平板培地に接種し、その菌に適した温度で培養した。続いて、同培地で画線培養を繰り返し寒天分解細菌を単離した。
上記スクリーニングで得られた寒天分解菌のうち、従来知られている寒天分解酵素よりも高活性の寒天分解酵素を産生する微生物として、１３２５−Ａ７株、１３２５−Ａ３株およびＡ９４株を取得した。この株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８１）を用いて分類学的位置を解析した結果、１３２５−Ａ７株、１３２５−Ａ３株およびＡ９４株は何れもマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の新種である可能性が強いと判断された。しかしながら、１３２５−Ａ７株およびＡ９４株については、運動性等の点からマイクロブルビファー属以外の新属である可能性もすてきれない。
【実施例２】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（１）
マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７株（以下、「１３２５−Ａ７株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＡ７を得た。
この組換えプラスミドｐＵＡ７の挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＡ７の挿入断片のヌクレオチド配列を決定した結果（配列番号３）、挿入断片の大きさは２，７４７ｂｐ、Ｇ＋Ｃ含量は５５％であり、１，３２６ｂｐから成るオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を検出した。本ＯＲＦは４４１アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。また開始コドンの８ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、６４ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのシグマ７０タイプのプロモーターと推定される配列５’−ＴＴＣＡＡＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＡＣＣＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５０．９）が存在していた。終止コドンの３６ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＡ７」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株、ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（４４１アミノ酸）を通じてそれぞれ５５．３％、５４．３％、５２．６％、４７．５％、４１．２％、３７．５％、３４．５％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（１）
ＡｇａＡ７をコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＡ７ＡＧとした。ｐＡ７ＡＧを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＡ７ＡＧを用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清８２．５ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（６．３ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表１に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（２１７Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて３１０倍に上昇し、活性収率は５３．８％であった。得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において単一のバンドであることから酵素が純粋に精製されていることを確認した。
（３）精製アガラーゼの性質（１）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＡ７」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＡ７の反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図４）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
Ｒａｇａ７の基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ＞
ＲａｇａＡ７の作用最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ９．５の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ５〜７．５であった（図５）。また、ＲａｇａＡ７のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中で４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図６）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＡ７の見かけの分子量は約３９ｋＤａであった。この値はＡｇａＡ７遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４７ｋＤａより小さい。ＲａｇａＡ７は宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。ＲａｇａＡ７のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであった。この配列は、ＲａｇａＡ７の１８〜２７番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＡ７の熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定したところ、１５〜７０℃の温度で安定であり、作用最適温度は４５〜５５℃であった（図７）。また、５４．８℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の４３％、６２．３℃では４２．６％、７１．９℃では３７．９％、８０．０℃では３７．９％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図８）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＡ７を産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、ＲａｇａＡ７はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約８０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（１００〜１０８％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＡ７の活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害され（０〜２０％）、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋によりやや阻害された（５６〜８９％）。一方、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋によっては阻害されなかった（１０１〜１０８％）。また、このことより、ＲａｇａＡ７の活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理することにより、その酵素活性はＥＤＴＡ濃度に比例して阻害されたが、１００ｍＭ処理後でも約６０％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＡ７の活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＡ７の等電点をＭｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅおよびＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．５〜５．５であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＡ７の界面活性剤による影響を下記表Ａ２に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７に非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）およびＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％および１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＡ７のＳＤＳに対する安定性を調べたところ、１．５％のＳＤＳ中で４０℃で１時間処理した後でも未処理の場合と同等の活性を維持していた。また０．１％のＳＤＳで同様に処理すると活性はＳＤＳを加えない時の約１．５倍に上昇した。ＲａｇａＡ７のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図９）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＡ７の化学薬品に対する耐性を下記表Ａ３に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７は０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【実施例３】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（２）
マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３株（以下、「１３２５−Ａ３株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてＳｈｒｉｍｐ ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）で処理しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＡ３を得た。
この組換えプラスミドｐＵＡ３の挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＡ３の挿入断片の大きさは約３．９ｋｂであった。ｐＵＡ３の挿入断片の塩基配列を決定し、本遺伝子断片がコードしているアミノ酸配列と既知のタンパクのアミノ酸配列との相同性検索を行った。その結果、本遺伝子断片がコードしているアミノ酸配列の一部が他微生物由来のアガラーゼに相同性を示し、本遺伝子断片がアガラーゼの一部をコードしていることが示唆された。しかし、アガラーゼの一部をコードしていると推定される塩基配列には終止コドンが含まれておらず、アガラーゼのＣ末端部分が欠損していると考えられた。そこで本断片の下流域の塩基配列をインバースＰＣＲ法ならびにカセットライゲーションＰＣＲ法によって決定した。決定したｐＵＡ３の挿入断片及びその下流域の塩基配列を配列番号７に示した。その結果、１，８０９ｂｐから成るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が検出された。本ＯＲＦは６０２アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。また開始コドンの６ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、１３６ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのシグマ７０タイプのプロモーターと推定される配列５’−ＴＴＧＴＴＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＴＡＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５０．９）が存在していた。終止コドンの１５ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＡ３」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、 ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（６０２アミノ酸）を通じてそれぞれ５５．３％、５４．３％、４９．８％、３６．８％、４５．８％、３４．６％、３３．０％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（２）
ＡｇａＡ３をコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＡ３ＡＧとした。ｐＡ３ＡＧを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＡ３ＡＧを用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清８２．５ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（２．０ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表４に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（３６４Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて５３０倍に上昇し、活性収率は６４．９％であった。得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において非常に近い分子量を持ち、アガラーゼ活性のある３つのタンパク質を含んでいた。
（３）精製アガラーゼの性質（２）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＡ３」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＡ３の反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図１０）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
ＲａｇａＡ３の基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および最適ｐＨ＞
ＲａｇａＡ３の最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ９．５の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ６．５〜７．５であった（図１１）。また、ＲａｇａＡ３のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中、４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０．５の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図１２）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＡ３の見かけの分子量は約３４ｋＤａであった。この値はＡｇａＡ３遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４７ｋＤａより小さい。ＲａｇａＡ３は宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。ＲａｇａＡ３のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであった。この配列は、ＲａｇａＡ３の１７〜２６番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＡ３の熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定したところ、５０℃まで安定であり、作用最適温度は５０〜６０℃であった（図１３）。５０℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の９６．３％、６４℃では５２．３％、７４℃では３９．５％、８３℃では３２．６％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図１４）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＡ３を産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、ＲａｇａＡ３はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約９０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（１０７〜１２１％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＡ３の活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害され（０〜１３％の残存活性）、Ｆｅ２＋によりやや阻害された（５３％）。一方、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋によっては阻害されなかった（１００〜１１１％）。また、このことより、ＲａｇａＡ３の活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理しても、その酵素活性はほとんど阻害されず、１００ｍＭ処理後でも約８０％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＡ３の活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＡ３の等電点を、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ、及びＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．５〜４．５であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＡ７の界面活性剤による影響を下記表５に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７に非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）を０．１％および１％添加した場合ならびにＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。一方、ＳＤＳを１％添加した場合の残存活性は何も添加しない場合の約５０％であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＡ３のＳＤＳに対する安定性を調べたところ、少なくとも１％ＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後、未処理の場合に比べ４８％の活性を維持していた。ＲａｇａＡ３のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図１５）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＡ３の化学薬品に対する耐性を下記表６に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ３は０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【実施例４】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（３）
マイクロブルビファー エスピー Ａ９４株（以下、「Ａ９４株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＰｓｔＩで消化した後ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ製）で処理しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＢを得た。
この組換えプラスミドｐＵＢの挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＢの挿入断片のヌクレオチド配列を決定した結果（配列番号１１）、挿入断片の大きさは３，９１０ｂｐ、Ｇ＋Ｃ含量は５１％であり、１，３０２ｂｐから成るオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を検出した。本ＯＲＦは４３３アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。またＡＴＧ配列の９ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、開始コドンの４２ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのプロモーターコンセンサス配列５’−ＴＴＧＡＣＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’（−１０領域）に相同性のある領域５’−ＴＴＧＴＡＧ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＧＧＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５６．２）が存在していた。終止コドンの４８ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＢ」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株、ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（４３３アミノ酸）を通じてそれぞれ６１．８％、５４．３％、５２．１％、５５．０％、４４．６％、３６．５％、３７．５％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（３）
ＡｇａＢをコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＢＡＧ１とした。ｐＢＡＧ１を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＢＡＧ１を用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清６６９ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（０．６ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表７に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（４５９Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて２１９倍に上昇し、活性収率は９．０％であった。また、得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において、単一のバンドであることから、純粋に精製されていることを確認した。
（３）精製アガラーゼの性質（３）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＢ」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＢの反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図１６）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
ＲａｇａＢの基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および最適ｐＨ＞
ＲａｇａＢの最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ６．５〜７．５であった（図１７）。また、ＲａｇａＡ３のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中で４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図１８）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＢの見かけの分子量は約３２ｋＤａであった。この値はＡｇａＢ遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４６ｋＤａより小さい。ＲａｇａＢは宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。組換え酵素ＲａｇａＢのＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであった。この配列は、ＲａｇａＢの１９〜２８番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＢの熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定した。５０℃以下の温度で安定であり、作用最適温度は５０〜６０℃であった（図１９）。また、５０℃で３０分間の熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の８８．０％、６４℃では１７．６％、７４℃では１５．１％、８３℃では１１．３％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図２０）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＢを産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、この組換え酵素はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約９０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（９６〜１１４％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＢの活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害された（０〜３５％）。一方、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋によっては阻害されなかった（１０１〜１１８％）。また、このことより、ＲａｇａＢの活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理することにより、その酵素活性はＥＤＴＡ濃度に比例して阻害されたが、１００ｍＭ処理後でも約７４％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＢの活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＢの等電点をＭｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ、及びＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．７〜５．２であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＢの界面活性剤による影響を下記表８に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＢに非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）およびＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％および１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＢのＳＤＳに対する耐性を調べたところ、２．０％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理した後でも未処理の場合と同等の活性を維持していた。また０．４％のＳＤＳで同様に処理すると活性はＳＤＳを加えない時の約２．０倍に上昇した。本発明酵素のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図２１）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＢの化学薬品に対する耐性を下記表９に示す種類と濃度について調べた。ＲａｇａＢは０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、耐熱性を有する新規寒天分解酵素およびこの寒天分解酵素をコードするヌクレオチド配列が提供される。
そして、この酵素を用いることにより、医薬品、化粧品、飲食品の分野で有用な寒天由来オリゴ糖を工業的に大量生産する方法を提供することが可能となった。
また、この酵素を海藻等に作用させることにより、海藻中の生理活性物質等の有用物質の抽出や、藻類の有用品種開発に利用することができる。
更に、上記ヌクレオチド配列を遺伝子工学的に利用することにより、本発明寒天分解酵素を、簡便かつ生産性良く製造することが可能となる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【技術分野】
本発明は寒天分解酵素およびその利用に関し、更に詳細には従来の寒天分解酵素に比べ、酵素活性や耐熱性が高い新規な寒天分解酵素およびその利用に関する。
【背景技術】
寒天は、テングサ、オゴノリ等の紅藻類から得られる多糖類であり、その主成分はアガロースである。また、寒天中にはアガロースに硫酸、硫酸ピルビン酸等がエステル結合したアガロペクチンと総称される多糖も少量存在している。
アガロースを寒天分解酵素であるβ−アガラーゼにより加水分解することによりネオアガロオリゴ糖が得られるが、このものは、デンプン老化防止作用が強く、加熱処理により静菌作用を生じること、低カロリー性等の面から食品分野で高機能性食品の原料として有用である（例えば、河野敏明、「寒天オリゴ糖（ネオアガロオリゴ糖）」、食品包装、（１９９０）、２２（１）：１００−１０５参照）。また、海藻成分をβ−アガラーゼにより加水分解して得られるオリゴ糖には免疫機能活性化機能や（例えば、Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９５），５９（１０）：１９３３−１９３７参照）、肌への美白、保湿効果（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９７），６１（１）：１６２−１６３参照）が認められている。
一方、寒天分解酵素を用いて海藻類の強固な細胞組織を分解し、生理活性物質を抽出したり、あるいは該酵素を用いて作成したプロトプラスト（例えば、Ａｒａｋｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９８），６（３）：１９３−１９７参照）を利用して海藻の有用品種の開発をすることは未開発の海洋生物資源の新たな有効利用として期待されている。
しかしながら、従来知られている寒天分解酵素（例えば、特開平６−２８４８８８号公報参照）は、生産性が低く、高価であるために工業的利用が難しいという問題や、酵素活性や耐熱性等も十分でないという問題があり、産業界で広く利用されるという状態にはない。
従って、本発明は、従来知られている寒天分解酵素よりも寒天を分解する能力や耐熱性等に優れ、かつ大量生産可能な寒天分解酵素および遺伝子工学技術を利用した当該酵素の製造に利用可能なその遺伝子の提供をその課題とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、自然界から寒天分解酵素を産生する微生物について鋭意探索したところ、海底土壌から分離した新規マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物が極めて高い寒天を分解する能力を有し、耐熱性等にも優れた寒天分解酵素を産生することを見出した。また、この微生物の寒天分解酵素遺伝子をクローニングし、これを利用することで寒天分解酵素の遺伝子組換え技術による大量生産が可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の第１の目的は、次の性質を有する寒天分解酵素を提供することである。
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
５４℃以上で３０分間の熱処理を行っても活性が残存する。
本発明の第２の目的は、マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来の上記寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第３の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２０のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）であり、５４℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上である上記寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第４の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２０％以上である前記の寒天分解酵素を提供するものである。
本発明の第５の目的は、マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２１のマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｉｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の７％以上である前記の寒天分解酵素を提供するものである。
更に、本発明の他の目的は、配列番号１、配列番号５または配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する前記の寒天分解酵素を提供するものである。
更にまた、本発明の他の別の目的は、上記配列番号１、配列番号５および配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
また更に、本発明の別の他の目的は、前記の形質転換された微生物を培養し、培養物より寒天分解酵素を採取することを特徴とする寒天分解酵素の製造方法、藻類に前記寒天分解酵素を作用させてネオアガロオリゴ糖やプロトプラストを製造する方法およびＤＮＡをアプライしたアガロースゲルに、前記寒天分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収するアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７の分類学的位置を示す図面である。
図２は、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３の分類学的位置を示す図面である。
図３は、マイクロブルビファー エスピー Ａ９４の分類学的位置を示す図面である。
図４は、ＲａｇａＡ７の加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図５は、ＲａｇａＡ７の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図６は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＡ７の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図７は、ＲａｇａＡ７の酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図８は、ＲａｇａＡ７およびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ７、○はＰＳＡ）。
図９は、ＲａｇａＡ７およびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ７、○はＰＳＡ）。
図１０は、ＲａｇａＡ３の加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図１１は、ＲａｇａＡ３の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１２は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＡ３の酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１３は、ＲａｇａＡ３の酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図１４は、ＲａｇａＡ３およびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ３、○はＰＳＡ）。
図１５は、ＲａｇａＡ３およびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＡ３、○はＰＳＡ）。
図１６は、ＲａｇａＢの加水分解生成物のＴＬＣ分析の結果を示す図面である（ＰはＰ．ａｔｌａｎｔｉｃａ由来の酵素で調製されたネオアガロオリゴ糖のレーン、ＧはＤ−ガラクトースのレーン、ＮＡ４はネオアガロテトラオースを示し、ＮＡ６はネオアガロヘキサオースを示す）。
図１７は、ＲａｇａＢの酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１８は、４０℃で３０分間保温後のＲａｇａＢの酵素活性とｐＨの関係を示す図面である。
図１９は、ＲａｇａＢの酵素活性と温度の関係を示す図面である。
図２０は、ＲａｇａＢおよびＰＳＡの温度安定性を示す図面である（●はＲａｇａＢ、○はＰＳＡ）。
図２１は、ＲａｇａＢおよびＰＳＡのＳＤＳに対する安定性を示す図面である（●はＲａｇａＢ、○はＰＳＡ）。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の寒天分解酵素（以下、「本発明酵素」という）は、従来の寒天分解酵素と比べ、寒天の分解能力や耐熱性が著しく高いものであり、好ましくはマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来のものである。なお、「マイクロブルビファー属微生物由来の」とは、本発明酵素の存在が、マイクロブルビファー属微生物において初めて見出されたということを意味するのみのものであり、マイクロブルビファー属微生物から取得した本発明酵素をコードするポリヌクレオチドを利用して他の微生物に産生させた本発明酵素や、他の属に属する微生物から得た同一の性質を有する寒天分解酵素も本発明酵素に含まれる。
本発明酵素の代表的なものの例としては、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）が産生するＲａｇａＡ７と名付けられた寒天分解酵素、マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）が産生するＲａｇａＡ３と名付けられた寒天分解酵素およびマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）が産生するＲａｇａＢと名付けられた３つの酵素が挙げられる。以下、これらについて順次説明する。
（Ａ１）ＲａｇａＡ７の特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は１５〜７０℃であり、最適作用温度は４５〜５５℃である。５４℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の３５％以上、好ましくは４０％以上、７０℃で２５％以上、好ましくは３５％以上である。また、８０℃においても、２５％以上、好ましくは３５％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＳＤＳで阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
１．５％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合と同等の活性を維持する。
（６）比活性：
１００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは、２００Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。作用ｐＨ範囲は３〜１０であり、最適ｐＨは５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜４９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。１ＭのＮａＣｌ中で約８０％の活性を維持する。１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約６０％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．５〜４．５
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＡ７を産生する、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）は、次のような菌学的性質を有している。
（Ａ２）マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．５〜０．８μｍ×１．５〜５．０μｍ
運動性：有
鞭毛：有
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：１０〜４３℃で良好に生育
食塩濃度：０．５〜１０％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陰性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：無
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
（Ｂ１）ＲａｇａＡ３の特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は５〜７０℃であり、最適作用温度は５０〜６０℃である。６０℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の４０％以上、好ましくは５０％以上、８０℃においても、２０％以上、好ましくは３０％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００およびＴｗｅｅｎ ２０で阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
少なくとも１％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合の４０％の活性を維持する。
（６）比活性：
３００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは３５０Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ５〜１０の範囲で安定である。作用ｐＨ範囲は３．５〜９．５であり、最適ｐＨは６．５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜６６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｆｅ２＋によりやや阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。
１ＭのＮａＣｌ中で約９０％の活性を維持する。
１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約８０％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．５〜４．５
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＡ３を産生する、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３は、は次のような菌学的性質を有している。
（Ｂ２）マイクロブルビファーエスピー１３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．４〜０．６μｍ×４．０〜８．０μｍ
運動性：無
鞭毛：無
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：１５〜３５℃で良好に生育
食塩濃度：１〜５％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陽性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：有
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
（Ｃ１）ＲａｇａＢの特性
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
作用温度は１０〜７０℃であり、最適作用温度は５０〜６０℃である。６０℃で３０分間の熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上、好ましくは３０％以上であり、８０℃においても７％以上、好ましくは１０％以上である。
（４）界面活性剤の影響：
１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ ２０およびＳＤＳで阻害されない。
（５）ＳＤＳに対する安定性：
２．０％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合と同等の活性を維持する。
０．４％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後は未処理の場合の２倍の活性を有する。
（６）比活性：
４００Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは、４５０Ｕ／ｍｇ以上である。
（７）ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ：
ｐＨ８〜９の範囲で安定であり、ｐＨ４〜１０の範囲で約５０％の活性が残存する。作用最適ｐＨは６．５〜７．５である。
（８）分子量：
３０〜４９ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定）
（９）金属塩等の影響：
Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ３＋、Ｚｎ２＋により強く阻害される。Ｆｅ２＋によりやや阻害される。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋により阻害されない。１ＭのＮａＣｌ中で約９０％の活性を維持する。１００ｍＭのＥＤＴＡ中、４０℃で１時間処理後は約７４％の活性を維持する。
（１０）等電点：
３．７〜５．２
（１１）化学薬品に対する耐性：
０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミドで阻害される。０．５ｍＭのヨードアセトアミドおよびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、１０ｍＭのジチオトレイトールおよび２−メルカプトエタノールで阻害されない。
上記のＲａｇａＢを産生する、マイクロブルビファー エスピーＡ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）は次のような菌学的性質を有している。
（Ｃ２）マイクロブルビファーエスピーＡ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）の菌学的性質：
＜形態＞
マリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）に生育した細胞についての形態。
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：０．６〜０．８μｍ×３．０〜６．０μｍ
運動性：有
鞭毛：有
グラム染色性：陰性
胞子形成：無
＜生育状態＞
液体培養における生育状態。
最適温度：２０〜５２℃で良好に生育
食塩濃度：１〜５％で良好に生育
＜生理学的性質＞
Ｏ−Ｆテスト：Ｆ
カタラーゼテスト：陽性
オキシダーゼテスト：陽性
ゼラチン分解能：有
デンプン分解能：有
ＯＮＰＧテスト：陰性
ウレアーゼ生産：無
硫化水素生産：無
インドール生産：無
硝酸還元能：有
資化性（Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース）：有
上記の微生物を含む本発明酵素を生産する微生物は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次のようにして得ることができる。まず、採取した微生物群を寒天またはアガロースを含む平板培地上で培養し、寒天を分解する能力を有する微生物を選抜する。この培地は寒天を含む培地に、窒素源、無機化合物等の栄養成分を適当量含有するものであれば、天然培地、合成培地の何れも使用することができる。
上記したマイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４は、いずれも、本発明者らが相模湾や、駿河湾の海底の泥から得たマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の微生物である。
そして、上記各マイクロブルビファー属株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８１）を用いて分類学的位置を解析した。解析した結果をｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法に基づき記載した系統樹を図１、図２および図３に示すが、この結果から、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４はマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の新種であることが判明した。
なお、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７およびマイクロブルビファーエスピーＡ９４については、運動性等の点からマイクロブルビファー属以外の新属である可能性もあるが、便宜的に最も近縁となったマイクロブルビファー属の新種とした。
そこで本出願人らはこれを、それぞれ１３２５−Ａ７、１３２５−Ａ３およびＡ９４と命名し、各々２００３年３月６日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）へ国際寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９〜８３２１）。
上記のマイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、１３２５−Ａ３およびＡ９４を含む本発明酵素を産生する微生物から、本発明酵素を得るには、例えばこれを常法に従って培養し、次いで培養物中から本発明酵素を回収すればよい。
本発明酵素を得るための微生物の培養方法は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次の方法を用いることができる。培地に菌株を接種し、常法に従って培養すればよい。培養に用いる培地は、寒天またはアガロース、寒天分解物等を炭素源として含むことが望ましい。その他、培地中には、本菌株が資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことも可能である。寒天、アガロースは、市販のもの、あるいは加工、精製される前の紅藻類を単独、併用して用いることができる。その他の炭素源及び窒素源について特に制限はないが、窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源は寒天、アガロース以外の炭素源としても使用できる。更に、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いる。寒天、アガロース以外の前記成分を含んだマリンブロス２２１６（ディフコ社製）に、寒天またはアガロースを含む物質等を加えて用いることもできる。また、前記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプトン、酵母エキス、寒天またはアガロースを含む物質等を加えた培地を用いることもできる。寒天またはアガロースの濃度は、０．１〜１．５％が好ましく、この際、寒天またはアガロースの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能であるが、酵素生産を目的とする場合は、濃度０．１〜０．４％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは、濃度１．２〜１．５％の固体培養が好ましい。培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、培養温度は、１０〜４３℃、好ましくは２５〜３９℃、培養時間は、１５〜４８時間、好ましくは１８〜２４時間である。
かくして得られる培養物中の目的物質である寒天分解酵素の回収法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法等の菌体破砕法で得られた菌体破砕物、あるいは培養物を遠心、ろ過等の操作によって菌体と培養上清に分離することで得られた培養上清を、粗酵素液として用いることができる。
この粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要に応じて、例えば塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。
また、本発明酵素を得るための別の方法としては、本発明酵素を産生する微生物、例えば、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３、マイクロブルビファーエスピーＡ９４等から本発明酵素をコードする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明酵素のアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明酵素を産生させ、培養物より本発明酵素を採取すればよい。
以下に具体的な遺伝子工学技術を用いた本発明酵素の製造方法について説明する。
本発明酵素のうち、ＲａｇａＡ７は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ７に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては５６％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＡ７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ１）〜（ｄ１）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
同様、本発明酵素のうち、ＲａｇａＡ３は、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号５で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ３に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては５６％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＡ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ２）〜（ｄ２）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
更に、本発明酵素のうち、ＲａｇａＢは、配列表の配列番号９で示されるアミノ酸配列、当該配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列または当該配列と６３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
従って、遺伝子工学技術を用いてＲａｇａＡ３に対応する本発明酵素を製造するには、これに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。なお、上記相同性としては６３％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
ＲａｇａＢのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、具体的に、下記（ａ３）〜（ｄ３）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
本発明酵素を生産する組換え微生物の作製は、公知の手段を組み合わせることにより行うことができる。すなわち、上記マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ７、マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３またはマイクロブルビファーエスピーＡ９４からの本発明酵素をコードするヌクレオチド配列の取得やその増幅、ベクターへのヌクレオチド配列の挿入、当該遺伝子による宿主の形質転換等は、この分野の成書に記載された方法を適宜利用することにより行われる。
このうち、組換え微生物の製法の一例としては、以下に示す方法に特に限定はされないが、次に示す方法を用いることができる。寒天分解酵素の生産菌から、ショットガンクローニング、あるいは特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅等によって、寒天分解酵素遺伝子を取得する。本遺伝子を、ＥＫ系のＥ．ｃｏｌｉ等に代表されるグラム陰性菌、あるいはＢＳ系のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等に代表されるグラム陽性菌に導入して、組換え体を取得する。形質転換にはプラスミド等の核外遺伝子をベクターにして利用、あるいは宿主菌本来有しているＤＮＡ取り込み能力等を利用するする方法を用いることができる。
また、上記のようにして作製された組換え微生物の培養、培養物からの本発明酵素の取得、当該酵素の精製も、前記した方法や公知方法あるいはこれに準じた方法により行うことができる。
なお、本発明において酵素の活性は、０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、特に記述しない限り、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。従って、本発明において酵素の活性は、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）として表示する。
以上のようにして得られる本発明酵素は、従来の寒天分解酵素と同様に、例えば寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕物または抽出物を原料とした寒天由来オリゴ糖等の製造や、研究用試薬として、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法等に使用することができる。更にまた藻類、得に紅藻類からのプロトプラストの製造や有用物質の抽出等の用途に使用することができる。
具体的に、寒天由来オリゴ糖の製造は、以下に示す方法に特に限定はされないが、次に示す手順を用いることができる。アガロース、寒天等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結合した骨格を持つ多糖類または同様の骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕または抽出物に、本発明の寒天分解酵素を混ぜ、ｐＨ４〜１０、３０〜５５℃の範囲で保温することで寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖を生成できる。
かくして得られる寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖は、以下に示す用途に特に限定はされないが例えば、低カロリー性食品として、または加熱処理後に生じるある種の微生物に対する静菌作用やデンプン老化防止作用を有する飲食品改良剤、薬理作用、例えば免疫機能調節機能、血圧降下作用、抗腫瘍作用、腸のぜん動運動を活性化する機能を有する医薬品、または高機能性飲食品、保湿、美白作用を有する化粧品の成分等の用途に用いることができる。
一方、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば次に示す方法を用いることができる。ＤＮＡを電気泳動で分画後、目的のＤＮＡ断片含むアガロースゲル断片に本発明酵素を加えて、溶解する。溶解後、必要であればＤＮＡ断片含む溶液を、例えばフェノール処理、エタノール沈澱、カラムや樹脂を使用した精製等の精製方法をを単独、あるいは併用して更に精製することも可能である。
また、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を持つ多糖類を細胞組織成分に有する藻類を原料としたプロトプラストの製造は、以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば以下の手順で行うことができる。供試海藻を０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でパパインを作用させる。その後０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、４０μｍのナイロンメッシュでろ過洗浄し、洗浄した葉体をナイフで数ミリ片に裁断する。裁断片を本発明酵素と市販のセルラーゼオノズカＲＳならびに、マイセロチームＲ−１０、それに０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で振とうすることによって、プロトプラストを得ることができる。
かくして得られるプロトプラストは、以下に示す用途に特に限定はされないが例えば、海藻中の生理活性物質等の有用物質の抽出、海藻組織培養、海藻細胞の生化学的、生理学的研究、細胞融合や遺伝子導入等を利用した海藻有用品種開発に用いることができる。
【実施例】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
なお、以下の実施例において、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡはそれぞれサイトウら（Ｓａｉｔｏ Ｈ，Ｍｉｕｒａ Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，７２：６１９−６２９，（１９６３））およびバーンボイムら（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＨＣ，Ｄｏｌｙ Ｊ．，Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５１３−１５２３，（１９７９））の方法に従って調製した。他の基本的遺伝子操作はサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８２））の方法に基づいて行った。また、形質転換は、ハナハンら（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６６：５５７−５８０，（１９８３））の方法、バチルス．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換はチャンら（Ｃｈａｎｇ Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ ＳＮ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１−１１５，（１９７９））の方法で行った。
【実施例１】
寒天分解菌のスクリーニング：
海洋科学技術センターに保存されている海底土壌のサンプルをマリンブロス２２１６培地（ディフコ社製）で適宜希釈し、マリンアガー平板培地に接種し、１５〜５５℃の様々な温度で１６〜４８時間培養した。コロニー周辺の寒天を分解し、用いた平板培地にくぼみを形成した菌を、更に別のマリンアガー平板培地に接種し、その菌に適した温度で培養した。続いて、同培地で画線培養を繰り返し寒天分解細菌を単離した。
上記スクリーニングで得られた寒天分解菌のうち、従来知られている寒天分解酵素よりも高活性の寒天分解酵素を産生する微生物として、１３２５−Ａ７株、１３２５−Ａ３株およびＡ９４株を取得した。この株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．８１）を用いて分類学的位置を解析した結果、１３２５−Ａ７株、１３２５−Ａ３株およびＡ９４株は何れもマイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属の新種である可能性が強いと判断された。しかしながら、１３２５−Ａ７株およびＡ９４株については、運動性等の点からマイクロブルビファー属以外の新属である可能性もすてきれない。
【実施例２】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（１）
マイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７株（以下、「１３２５−Ａ７株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＡ７を得た。
この組換えプラスミドｐＵＡ７の挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＡ７の挿入断片のヌクレオチド配列を決定した結果（配列番号３）、挿入断片の大きさは２，７４７ｂｐ、Ｇ＋Ｃ含量は５５％であり、１，３２６ｂｐから成るオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を検出した。本ＯＲＦは４４１アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。また開始コドンの８ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、６４ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのシグマ７０タイプのプロモーターと推定される配列５’−ＴＴＣＡＡＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＡＣＣＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５０．９）が存在していた。終止コドンの３６ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＡ７」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株、ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（４４１アミノ酸）を通じてそれぞれ５５．３％、５４．３％、５２．６％、４７．５％、４１．２％、３７．５％、３４．５％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（１）
ＡｇａＡ７をコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＡ７ＡＧとした。ｐＡ７ＡＧを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＡ７ＡＧを用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清８２．５ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（６．３ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表１に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（２１７Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて３１０倍に上昇し、活性収率は５３．８％であった。得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において単一のバンドであることから酵素が純粋に精製されていることを確認した。
（３）精製アガラーゼの性質（１）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＡ７」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＡ７の反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図４）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
Ｒａｇａ７の基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および作用最適ｐＨ＞
ＲａｇａＡ７の作用最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ９．５の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ５〜７．５であった（図５）。また、ＲａｇａＡ７のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中で４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図６）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＡ７の見かけの分子量は約３９ｋＤａであった。この値はＡｇａＡ７遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４７ｋＤａより小さい。ＲａｇａＡ７は宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。ＲａｇａＡ７のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであった。この配列は、ＲａｇａＡ７の１８〜２７番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＡ７の熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定したところ、１５〜７０℃の温度で安定であり、作用最適温度は４５〜５５℃であった（図７）。また、５４．８℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の４３％、６２．３℃では４２．６％、７１．９℃では３７．９％、８０．０℃では３７．９％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図８）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＡ７を産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、ＲａｇａＡ７はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約８０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（１００〜１０８％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＡ７の活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害され（０〜２０％）、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋によりやや阻害された（５６〜８９％）。一方、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋によっては阻害されなかった（１０１〜１０８％）。また、このことより、ＲａｇａＡ７の活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理することにより、その酵素活性はＥＤＴＡ濃度に比例して阻害されたが、１００ｍＭ処理後でも約６０％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＡ７の活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＡ７の等電点をＭｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅおよびＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．５〜５．５であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＡ７の界面活性剤による影響を下記表Ａ２に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７に非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）およびＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％および１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＡ７のＳＤＳに対する安定性を調べたところ、１．５％のＳＤＳ中で４０℃で１時間処理した後でも未処理の場合と同等の活性を維持していた。また０．１％のＳＤＳで同様に処理すると活性はＳＤＳを加えない時の約１．５倍に上昇した。ＲａｇａＡ７のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図９）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＡ７の化学薬品に対する耐性を下記表Ａ３に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７は０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【実施例３】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（２）
マイクロブルビファー エスピー１３２５−Ａ３株（以下、「１３２５−Ａ３株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いてＳｈｒｉｍｐ ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）で処理しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＡ３を得た。
この組換えプラスミドｐＵＡ３の挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＡ３の挿入断片の大きさは約３．９ｋｂであった。ｐＵＡ３の挿入断片の塩基配列を決定し、本遺伝子断片がコードしているアミノ酸配列と既知のタンパクのアミノ酸配列との相同性検索を行った。その結果、本遺伝子断片がコードしているアミノ酸配列の一部が他微生物由来のアガラーゼに相同性を示し、本遺伝子断片がアガラーゼの一部をコードしていることが示唆された。しかし、アガラーゼの一部をコードしていると推定される塩基配列には終止コドンが含まれておらず、アガラーゼのＣ末端部分が欠損していると考えられた。そこで本断片の下流域の塩基配列をインバースＰＣＲ法ならびにカセットライゲーションＰＣＲ法によって決定した。決定したｐＵＡ３の挿入断片及びその下流域の塩基配列を配列番号７に示した。その結果、１，８０９ｂｐから成るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が検出された。本ＯＲＦは６０２アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。また開始コドンの６ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、１３６ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのシグマ７０タイプのプロモーターと推定される配列５’−ＴＴＧＴＴＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＴＡＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５０．９）が存在していた。終止コドンの１５ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＡ３」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、 ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（６０２アミノ酸）を通じてそれぞれ５５．３％、５４．３％、４９．８％、３６．８％、４５．８％、３４．６％、３３．０％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（２）
ＡｇａＡ３をコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＡ３ＡＧとした。ｐＡ３ＡＧを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＡ３ＡＧを用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清８２．５ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（２．０ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表４に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（３６４Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて５３０倍に上昇し、活性収率は６４．９％であった。得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において非常に近い分子量を持ち、アガラーゼ活性のある３つのタンパク質を含んでいた。
（３）精製アガラーゼの性質（２）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＡ３」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＡ３の反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図１０）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
ＲａｇａＡ３の基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および最適ｐＨ＞
ＲａｇａＡ３の最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ９．５の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ６．５〜７．５であった（図１１）。また、ＲａｇａＡ３のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中、４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０．５の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図１２）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＡ３の見かけの分子量は約３４ｋＤａであった。この値はＡｇａＡ３遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４７ｋＤａより小さい。ＲａｇａＡ３は宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。ＲａｇａＡ３のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであった。この配列は、ＲａｇａＡ３の１７〜２６番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＡ３の熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定したところ、５０℃まで安定であり、作用最適温度は５０〜６０℃であった（図１３）。５０℃で３０分間熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の９６．３％、６４℃では５２．３％、７４℃では３９．５％、８３℃では３２．６％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図１４）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＡ３を産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、ＲａｇａＡ３はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約９０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（１０７〜１２１％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＡ３の活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害され（０〜１３％の残存活性）、Ｆｅ２＋によりやや阻害された（５３％）。一方、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋によっては阻害されなかった（１００〜１１１％）。また、このことより、ＲａｇａＡ３の活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理しても、その酵素活性はほとんど阻害されず、１００ｍＭ処理後でも約８０％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＡ３の活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＡ３の等電点を、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ、及びＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．５〜４．５であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＡ７の界面活性剤による影響を下記表５に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ７に非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）を０．１％および１％添加した場合ならびにＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。一方、ＳＤＳを１％添加した場合の残存活性は何も添加しない場合の約５０％であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＡ３のＳＤＳに対する安定性を調べたところ、少なくとも１％ＳＤＳ中、４０℃で１時間処理後、未処理の場合に比べ４８％の活性を維持していた。ＲａｇａＡ３のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図１５）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＡ３の化学薬品に対する耐性を下記表６に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＡ３は０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【実施例４】
（１）アガラーゼ遺伝子の解析（３）
マイクロブルビファー エスピー Ａ９４株（以下、「Ａ９４株」と省略する）の染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化してＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて精製し、精製ＤＮＡ断片とした。この精製ＤＮＡ断片と予めＰｓｔＩで消化した後ｓｈｒｉｍｐ ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ製）で処理しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２．０（ＴａＫａＲａ社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション混合液を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（Ｆ’ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を形質転換して形質転換体を作製した。
上記で作製した形質転換体を寒天培地に接種し、寒天培地にくぼみをつくるコロニーを寒天分解活性のあるクローンとして検出した。検出した寒天分解活性のあるクローンをＬＢ寒天培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍｌあるいはアンピシリン５０μｇ／ｍｌ）上において３７℃で一晩、画線培養した。その後、ヨウ素溶液で培地を染色し、菌体の周囲が、寒天由来の還元糖が生成されたためと考えられる、透明なハローとなったものを目的クローンとして得た。かくして得られたクローンをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地培養し、得られた細胞より、プラスミドＤＮＡを調製することによって、組換えプラスミドｐＵＢを得た。
この組換えプラスミドｐＵＢの挿入断片のヌクレオチド配列を、ｐＵＣ１８のマルチクローニング部位の上流および下流の配列に相応する下記のプライマーを用いて解析を行った。
この組換えプラスミドｐＵＢの挿入断片のヌクレオチド配列を決定した結果（配列番号１１）、挿入断片の大きさは３，９１０ｂｐ、Ｇ＋Ｃ含量は５１％であり、１，３０２ｂｐから成るオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を検出した。本ＯＲＦは４３３アミノ酸からなるタンパクをコードしていた。またＡＴＧ配列の９ｂｐ上流には、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と推定される配列５’−ＡＡＧＧＡＧ−３’が存在し、開始コドンの４２ｂｐ上流にはＥ．ｃｏｌｉのプロモーターコンセンサス配列５’−ＴＴＧＡＣＡ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’（−１０領域）に相同性のある領域５’−ＴＴＧＴＡＧ−３’（−３５領域）と５’−ＴＡＴＧＧＴ−３’（−１０領域）（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１プロモーター検索で、スコア５６．２）が存在していた。終止コドンの４８ｂｐ下流にはインバーティッドリピート配列が存在し、転写ターミネーターの役割をしていると予想される。
また、上記ＯＲＦ（以下、これを「ＡｇａＢ」という）がコードしているアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った結果、シュードモナス エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＤ１３７株、アエロモナス エスピー（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ９株、シュードアルテロモナス アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）、ゾベリア ガラクタニノボランス（Ｚｏｂｅｌｌｉａ ｇａｌａｃｔａｎｉｎｏｖｏｒａｎｓ）Ｄｓｉｊ株（２種）、マイクロシーラ エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）ＰＲＥ１株、ストレプトミセス セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）株由来のβ−アガラーゼと全アミノ酸（４３３アミノ酸）を通じてそれぞれ６１．８％、５４．３％、５２．１％、５５．０％、４４．６％、３６．５％、３７．５％一致した。
（２）アガラーゼの発現と精製（３）
ＡｇａＢをコードするＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｎ，Ｏｚａｋｉ Ｋ，Ｈｉｔｏｍｉ Ｊ．Ｋａｗａｍｉｎａｍｉ Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．Ｋａｗａｉ Ｓ，Ｉｔｏ Ｓ．（１９９５）．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，２１７２−２１７５）に導入し、得られた組換えプラスミドをｐＢＡＧ１とした。ｐＢＡＧ１を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ寒天培地上で一晩培養後、寒天上のくぼみから、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１における組換え体のアガラーゼ活性を確認した。
なお、組換えアガラーゼの高発現はグラム陽性菌であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８ ｍｅｔＢ５ ｈｓｒＭ１）を宿主として行った。ｐＢＡＧ１を用いてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４を形質転換し、得られた形質転換体をＣＳＬ培地（コーンスティープリカー１０％、魚肉エキス０．５％、酵母エキス０．０５％、リン酸二水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０２％、塩化カルシウム０．０５％、マルトース６％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）で７２時間培養し、その培養上清６６９ｍｌを得た。
上記の培養上清の精製は４℃以下で行った。まず、培養上清を６，５００×ｇで１０分間の遠心により、菌体と培養上清とを分離した。得られた培養上清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように徐々に添加した。生じた塩析物を８，０００×ｇで２５分間の遠心によって回収し、沈澱物を少量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、前述の緩衝液に対して一晩透析を行った。８，０００×ｇで１５分間の遠心で不溶残査を取り除いた後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー社製、２．５×１５ｃｍ）に吸着させた。５０ｍＭのＮａＣｌを含む前述の緩衝液２００ｍｌでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線濃度勾配法（総溶出量５００ｍｌ）を用いて酵素の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を合わせ、限外ろ過膜ＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮、さらに２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によって緩衝液交換を行い、５ｍｌの酵素溶液とした。この酵素溶液を２．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（日本ケミカル社製、２．５×１５ｃｍ）に供したところ活性のほとんどが素通り画分に検出された。続いて限外ろ過膜ＰＭ−１０を用いて同活性画分を濃縮した。得られた濃縮液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析し、酵素液（０．６ｍｌ）を得た。
アガラーゼ活性の測定は０．２％精製寒天（ナカライ社製）を基質として、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中で行った。酵素反応によって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。１分間あたり、１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する量の還元糖を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、タンパク濃度の定量はＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いてＢＳＡを標準品として定量を行った。
下記表７に示されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の活性画分の酵素比活性（４５９Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、培養上清の比活性に比べて２１９倍に上昇し、活性収率は９．０％であった。また、得られた酵素溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥと活性染色において、単一のバンドであることから、純粋に精製されていることを確認した。
（３）精製アガラーゼの性質（３）
上記のようにして精製されたアガラーゼ（以下、「ＲａｇａＢ」という）の下記の性質について調べた。なお、特に基質が記載されていない場合には、寒天を基質として使用した。
＜作用＞
汎用性アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ ０３：ＴａＫａＲａ社製）を基質とした時のＲａｇａＢの反応生成物の経時変化をＴＬＣにより分析した（図１６）。その結果、本発明酵素はアガロースのβ−１，４結合をエンド型に分解する反応を触媒するβ−アガラーゼであることが判明した。
＜基質特異性＞
ＲａｇａＢの基質特異性を調べたところ、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖等を生成するが、アガロースと共通の２糖の繰り返し単位を持つが、その糖の一部が硫酸基で置換された多糖類であるι、κ、λ−カラギーナンを分解しなかった。
＜ｐＨ安定性および最適ｐＨ＞
ＲａｇａＢの最適ｐＨを、ｐＨ３〜ｐＨ１１の間で５０ｍＭのブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液を用いて測定したところ、中性のｐＨ領域で活性を持ち、その最適ｐＨはｐＨ６．５〜７．５であった（図１７）。また、ＲａｇａＡ３のｐＨ安定性を、ｐＨ３〜ｐＨ１２の間でブライトン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）広域緩衝液中で４０℃で３０分間それぞれ保温した後の残存活性を測定したところ、ｐＨ４〜１０の間で最大活性の５０％以上の活性を保持していた（図１８）。
＜分子量＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＲａｇａＢの見かけの分子量は約３２ｋＤａであった。この値はＡｇａＢ遺伝子がコードする成熟タンパクの推定分子量４６ｋＤａより小さい。ＲａｇａＢは宿主であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４の分泌するプロテアーゼによって分解を受け、低分子化されていることが予想された。組換え酵素ＲａｇａＢのＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであった。この配列は、ＲａｇａＢの１９〜２８番のアミノ酸配列に相当する。
＜温度の影響＞
ＲａｇａＢの熱安定性を調べるために、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中（ｐＨ７．０）でいろいろな温度で保温した後の残存活性を測定した。５０℃以下の温度で安定であり、作用最適温度は５０〜６０℃であった（図１９）。また、５０℃で３０分間の熱処理後の残存活性は、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の８８．０％、６４℃では１７．６％、７４℃では１５．１％、８３℃では１１．３％であった。この酵素の耐熱性はＰＳＡに比べて高かった（図２０）。
＜金属塩等の影響＞
ＲａｇａＢを産生する微生物は海洋から単離された微生物であるので、海水中に含まれる様々なイオンの濃度が酵素活性に影響を与える可能性があると考え、これらのイオンに対する活性特性を調べた。まず本発明酵素活性に対するＮａＣｌの影響を調べた結果、この組換え酵素はその寒天分解活性にＮａＣｌを必ずしも必要とせず、ＮａＣｌ濃度に依存した活性の変化はほとんど認められなかった。更に高濃度のＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した場合でも約９０％の活性を維持していた。
また、海水中の主要な金属イオンＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（５ｍＭおよび１００ｍＭ）の添加による活性の変化もほとんど認められなかった（９６〜１１４％）。その他、海水中に含まれていると考えられる微量金属イオンのＲａｇａＢの活性に与える影響を調べたところ、１ｍＭ濃度で、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｚｎ２＋によって強く阻害された（０〜３５％）。一方、Ａｌ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｓ＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋によっては阻害されなかった（１０１〜１１８％）。また、このことより、ＲａｇａＢの活性にはＳＨ基、ＣＯ基、ＮＨ基の関与する酵素タンパクの構造維持が必要であることが考えられた。
更に、ＥＤＴＡによる酵素活性阻害実験を行った結果、４０℃で１時間処理することにより、その酵素活性はＥＤＴＡ濃度に比例して阻害されたが、１００ｍＭ処理後でも約７４％の活性を維持していた。この結果より、２価金属イオンはＲａｇａＢの活性中心に関わるのではなく、一部の２価金属イオンがその構造維持に必要であることが考えられた。
＜等電点＞
ＲａｇａＢの等電点をＭｕｌｔｉｐｈｏｒｅ ＩＩ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐｌａｔｅ、及びＢｒｏａｄ ｐｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた等電点電気泳動法によって測定した結果、３．７〜５．２であった。
＜界面活性剤の影響＞
ＲａｇａＢの界面活性剤による影響を下記表８に示す種類と濃度で調べた。ＲａｇａＢに非イオン性界面活性剤であるＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ナカライテスク社製）およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ナカライテスク社製）ならびに陰イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社製）およびＳＤＳ（バイオラッド社製）を０．１％および１％添加した場合の残存活性は、何も添加しない場合の１００％以上であった。
＜ＳＤＳに対する安定性＞
ＲａｇａＢのＳＤＳに対する耐性を調べたところ、２．０％のＳＤＳ中、４０℃で１時間処理した後でも未処理の場合と同等の活性を維持していた。また０．４％のＳＤＳで同様に処理すると活性はＳＤＳを加えない時の約２．０倍に上昇した。本発明酵素のＳＤＳに対する耐性はＰＳＡよりも高かった（図２１）。
＜化学薬品に対する耐性＞
ＲａｇａＢの化学薬品に対する耐性を下記表９に示す種類と濃度について調べた。ＲａｇａＢは０．１ｍＭのＮ−ブロモスクシンイミド（シグマ社製）では阻害されたが、０．５ｍＭのヨードアセトアミド（関東化学社製）およびｐ−（クロロメルクリ）安息香酸（ナカライテスク社製）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（和光純薬工業社製）、１０ｍＭのジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）で阻害されなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明により、耐熱性を有する新規寒天分解酵素およびこの寒天分解酵素をコードするヌクレオチド配列が提供される。
そして、この酵素を用いることにより、医薬品、化粧品、飲食品の分野で有用な寒天由来オリゴ糖を工業的に大量生産する方法を提供することが可能となった。
また、この酵素を海藻等に作用させることにより、海藻中の生理活性物質等の有用物質の抽出や、藻類の有用品種開発に利用することができる。
更に、上記ヌクレオチド配列を遺伝子工学的に利用することにより、本発明寒天分解酵素を、簡便かつ生産性良く製造することが可能となる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質を有する寒天分解酵素。
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
５４℃以上で３０分間の熱処理を行っても活性が残存する。
【請求項２】
マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来のものである請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項３】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２０のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）であり、５４℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項４】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２０％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項５】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２１のマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の７％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項８】
配列番号５で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項９】
配列番号５で示されるアミノ酸配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１０】
配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１１】
配列番号９で示されるアミノ酸配列と６３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１２】
下記（ａ１）〜（ｄ１）からなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
下記（ａ２）〜（ｄ２）からなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
下記（ａ３）〜（ｄ３）よりなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項第１２項ないし第１４項の何れかの項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項１６】
請求項第１５項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１７】
請求項第１６項記載の微生物を培養し、培養物より寒天分解酵素を採取することを特徴とする寒天分解酵素の製造方法。
【請求項１８】
藻類に、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてネオアガロオリゴ糖を得ることを特徴とするネオアガロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１９】
藻類に、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてプロトプラストを得ることを特徴とする藻類のプロトプラストの製造方法。
【請求項２０】
ＤＮＡをアプライしたアガロースゲルに、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを特徴とするアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法。
【請求項１】
次の性質を有する寒天分解酵素。
（１）作用：
アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する。
（２）基質特異性：
少なくとも寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。
（３）温度の影響：
５４℃以上で３０分間の熱処理を行っても活性が残存する。
【請求項２】
マイクロブルビファー（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ）属微生物由来のものである請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項３】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２０のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ７）であり、５４℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２５％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項４】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３１９のマイクロブルビファー エスピー １３２５−Ａ３（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．１３２５−Ａ３）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の２０％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項５】
マイクロブルビファー属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２１のマイクロブルビファー エスピー Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ．Ａ９４）であり、６０℃以上で３０分間の熱処理後の残存活性が、熱処理をしない（０℃、３０分間）場合の７％以上である請求項第２項記載の寒天分解酵素。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項８】
配列番号５で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項９】
配列番号５で示されるアミノ酸配列と５６％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１０】
配列番号９で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１１】
配列番号９で示されるアミノ酸配列と６３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項第１項記載の寒天分解酵素。
【請求項１２】
下記（ａ１）〜（ｄ１）からなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ１）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ１）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
下記（ａ２）〜（ｄ２）からなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ２）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ２）配列表の配列番号６に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
下記（ａ３）〜（ｄ３）よりなる群から選ばれ、請求項第１項記載の寒天分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（ａ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ３）配列表の配列番号１０に示すヌクレオチド配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドより選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項第１２項ないし第１４項の何れかの項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項１６】
請求項第１５項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１７】
請求項第１６項記載の微生物を培養し、培養物より寒天分解酵素を採取することを特徴とする寒天分解酵素の製造方法。
【請求項１８】
藻類に、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてネオアガロオリゴ糖を得ることを特徴とするネオアガロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１９】
藻類に、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてプロトプラストを得ることを特徴とする藻類のプロトプラストの製造方法。
【請求項２０】
ＤＮＡをアプライしたアガロースゲルに、請求項第１項ないし第１１項の何れかの項記載の寒天分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを特徴とするアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１２７
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５１９４（Ｐ２００５−５０５１９４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１２８
【国際出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１２８
【国際出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]