幹細胞及び前駆細胞を培養する方法
本願は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法であって、上記表面及び上記細胞に結合するリガンドを介して上記細胞を上記表面上に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００９年６月１１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／１８６，３１０号及び２０１０年４月１３日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７７９号（その内容全体が参照により援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞、前駆体、誘導多能性幹細胞又は他の非接着性細胞を培養するか又は増殖させる分野において存在する問題は、どのようにして後の意図された使用（移植又は下流の分化を含む）を妨げないように細胞を培養するかということである。プラスチック製の培養（growth）フラスコ内で培養することのできる、プラスチックに接着する大抵の細胞とは異なり、幹細胞は非接着性であり、したがって伝統的な（traditional）方法を用いて成長させることができない。しかしながら、幹細胞は線維芽細胞の層上で成長する。これらの「フィーダー細胞」層は、接着のための表面を提供し、幹細胞の成長及び生存に必要とされる、未だ特性化されていない成長因子の混合物を細胞に供給する。ごく最近になって、研究者らは、マトリゲル等の細胞外マトリックスに由来する成分に幹細胞を付着させることによって幹細胞を培養することが可能となった。幹細胞はこれらの表面様基質に接着するが、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と線維芽細胞フィーダー細胞から回収された分泌物との両方を含有する成長培地において培養しなくてはならない。これらの方法はどちらも細胞によって分泌された特性化されていない因子の環境を用いるため、どのようにして又はなぜこれらの方法が幹細胞の増殖を促進するかは完全には明らかになっていはいない。マトリゲル表面上で培養した場合に幹細胞がより急速に分化することが報告されている。いずれかの方法、すなわちフィーダー細胞又はマトリゲル＋フィーダー細胞に由来する馴化培地によって成長させた幹細胞は、自発的に分化する。分化幹細胞は、隣接細胞にも分化を開始させる因子を分泌する。したがって、技術者はおよそ７日毎に、未分化のように見えるこれらの幹細胞コロニー又はコロニー部分のみを手作業で解離させて、採取しなくてはならない。次いで、成長を継続するために採取した細胞を再プレーティングする。意図された目的に十分な未分化細胞を採取することができるまでこの手順を繰り返す。幹細胞を培養するこれらの方法は、本業界にとって現行の技術水準である。
【０００３】
実質的にいかなる種類の幹細胞又は誘導多能性幹細胞の大規模成長でも、これらの細胞のハイスループット採取を可能にする新たな方法の開発が必要とされている。
【０００４】
現行の方式は幹細胞を線維芽細胞フィーダー細胞上で成長させることであるが、そこからの唯一の採取方法は、顕微鏡下で手作業で解離して、「良質な」細胞を単離し、続いて再プレーティングすることによるものである。この手順は主観的であり、時間がかかるために不完全である。技術者の主観的基準ではなく分子認識に基づいて細胞が選択される、自動化可能な採取方法及び所望の細胞を混合プールから精製する自動化可能な方法が必要とされている。
【０００５】
幹細胞を培養する現行の技術水準の方法は、１）労働集約的であり、２）大規模な成長には本質的に不適合であり、３）馴化培地等の特性化されていない因子に依存し、４）幹細胞を培養フラスコに接着させるのに細胞又は細胞産物を必要とし、５）ヒト幹細胞を不可逆的に変化させる可能性のある非ヒト細胞及び細胞抽出物をしばしば使用するため不十分である。幹細胞の成長を可能にする個別の因子が特定されれば大幅な改善となる。必要かつ十分な成長因子を添加しさえすれば、自発的な分化が最小限に抑えられると考えられる。顕微鏡下で手作業での解離という現行の方法よりも、大規模な成長に適合した方法で細胞を安全に採取することができれば、更なる大幅な改善となる。現在は、マトリゲル上で成長させた幹細胞は、例えばトリプシンを用いた酵素的切断によって採取することができる。通常は、未分化のコロニー又はコロニー部分を手作業で解離させた後、トリプシン又はコラゲナーゼ等の酵素で消化する。しかしながら、トリプシンは重大な細胞死を引き起こし、マトリゲル上での幹細胞の連続継代が異常核型を生じることが報告されている。これは、トリプシンでの採取に起因するか、又はマトリゲルがマウス肉腫細胞に由来する細胞及び分泌物の混合物であることに起因するようである。非ヒトフィーダー細胞は、得られる幹細胞を完全にヒトではなくなるように変化させることが疑われている。例えば、グリコシル化パターン及び他の翻訳後修飾がフィーダー細胞種の特性に与えられ得ることが疑われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、幹細胞の成長を支持する無細胞方法を開発すれば、現行の技術水準と比べて大きな改善となる。完全に特性化された個別の作用物質（可能な限り多くが合成作用物質である）を使用して幹細胞を成長させて、採取することができれば更に大きな改善となる。ヒト療法に好適な細胞を産生させるには、確定可能な因子のみを含む細胞を培養する方法を開発すれば、現行の技術水準と比べて大きな改善となる。理想的には、確定された成分は非ヒト成分を含まないものとする。組換えタンパク質又は合成成分が好ましい。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、そのキメラ又は誘導体を含む抗体が、それらの産生に高度に再現性があり、それらが強固であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＧを用いた親和性枯渇（affinity depletion）によって、採取した細胞から容易に取り出すことができることから特に好ましい
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法であって、前記表面及び前記細胞に結合するリガンドを介して前記細胞を前記表面上に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法に関する。前記リガンドは直接的に又は媒介物を介して間接的に前記表面に結合し得る。前記媒介物は化学リンカー若しくは別のタンパク質、又はそれらの組み合わせであり得る。前記タンパク質はプロテインＡ又はプロテインＧであり得る。特に、前記リンカーは感光性又は化学物質感応性であり得る。また前記リガンド又は前記媒介物は、前記表面に非特異的に吸着し得るか、又はアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって前記表面に共有結合的に連結若しくは付着し得る。前記リガンドはポリマーに結び付き得る。特定の実施の形態では、前記リガンドは、前記幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で発現されたポリペプチドに特異的に結合し得る。前記細胞の表面上の前記ポリペプチドは、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０であり得る。前記リガンドが抗体又は成長因子であり得る。好ましくは、前記抗体がＰＳＭＧＦＲ又はＣ−１０ ＰＳＭＧＦＲに特異的に結合し得る。好ましくは、前記成長因子は野生型ＮＭ２３若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体、又はｂＦＧＦであり得る。
【０００８】
別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露する、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。これに関して、前記作用物質は抗体であり得るか、又は前記作用物質は野生型ＮＭ２３、若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体であり得る。
【０００９】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から分泌された作用物質を含有する培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。前記ＭＵＣ１＊陽性細胞はＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１であり得る。
【００１０】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。前記ＭＵＣ１＊陽性細胞は特に、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１であり得る。
【００１１】
一態様では、使用される表面はマトリゲルではないのが好ましく、線維芽細胞フィーダー細胞が存在すれば、細胞を取り出す際の手作業での解離プロセスもない。
【００１２】
別の態様では、本発明は、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記リガンド又は前記表面との結合から放出されるように、前記リガンドに結合する競合分子を添加することを含む、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法に関する。
【００１３】
更に別の態様では、本発明は、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記表面から放出されるように、前記細胞に直接的又は間接的に付着した前記表面に結合したリンカーを切断することを含む、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法に関する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、細胞の分化状態を特定する方法であって、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、細胞の分化状態を特定する方法に関する。この方法は、細胞を幹細胞及び幹様細胞又は誘導多能性幹細胞、並びに新たに分化する細胞の混合集団から分離することを更に含み得るが、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す。特に、この方法は、前記細胞を、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する抗体と接触させることを更に含み得るが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する正のシグナルが、多能性幹細胞状態の存在を示す。特に、前記細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体及び抗Ｔｒａ １−８１抗体、抗Ｔｒａ １−６０抗体、ＳＳＥＡ３抗体又はＳＳＥＡ４抗体と接触させることができる。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法であって、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが、がん幹細胞を示す、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法に関する。この方法は、前記細胞を幹細胞マーカーに対する抗体と反応させることを更に含み得るが、幹細胞マーカーに対する正のシグナルが、がん幹細胞の存在を示す。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法であって、前記細胞を前記表面に、直接的に又は前記細胞に結合するリガンドを介して間接的に付着させること、及び前記細胞をＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露することを含む、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法に関する。前記作用物質がＭＵＣ１＊を二量化して、成長を促進し、分化を阻害し得るか、又は前記作用物質がＭＵＣ１＊の二量化を阻害して、分化を促進し得る。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、細胞型を分離する方法であって、異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する様々なリガンドについて表面上の空間アドレスを作成すること、及び前記細胞を前記表面に添加することを含み、前記細胞が、前記細胞の結合するリガンドに応じて空間的に分離されている、細胞型を分離する方法に関する。前記表面が粒子又はナノ粒子であり得る。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は、宿主の体内に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を移植する方法に関する。前記宿主が患者であり得る。特に、前記リガンドが、前記宿主の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の成長因子であり得る。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は、宿主の体内に、表面及び細胞に結合するリガンドを介して付着した細胞を有する表面を移植する方法に関する。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法であって、宿主の体に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を投与することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法に関する。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、組成物であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面、及びＭＵＣ１＊二量化剤を含む、組成物に関する。前記親和性相互作用が前記表面とのＮＴＡ−Ｎｉの相互作用によるものであり得る。前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０であり得る。前記ＭＵＣ１＊二量化剤が、野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体であり得る。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面を、前記細胞を含有するサンプルと、及びＭＵＣ１＊二量化剤と相互作用させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】マトリゲルに付着したヒト胚性幹細胞（Ｈ９）が、標準的なｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地中で培養した場合のより少ない細胞数及びより大きな分化と比較して、最小培地中の抗ＭＵＣ１＊において培養した場合に本質的に１００％の多能性（ＯＣＴ４＋）をもって成長することを示す図である。ＤＡＰＩによって全ての細胞の核を染色する。点線はコロニーの未分化部分の境界を画定する。抗ＭＵＣ１＊で処理したウェルにおいては、未分化幹細胞がウェルの限界まで成長した。
【図２】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地単独におけるマトリゲル上でのヒト胚性幹細胞の１８回の継代の後、ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧの核型が変化しなかったことを示す図である。
【図３】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地単独においてマトリゲル上で培養したヒト胚性幹細胞が、３つの生殖系列へと分化することが可能であったことを示す図である：Ａ）ＯＣＴ４陰性であり、細胞が分化したことを意味する；Ｂ）αフェトプロテインに陽性であり、内胚葉生殖系列に沿った分化を意味する；Ｃ）ネスチンに陽性であり、外胚葉生殖系列への分化を意味する；及びＤ）平滑筋アクチンに陽性であり、中胚葉生殖系列への分化を意味する。
【図４】抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面が、最小幹細胞培地単独又はｂＦＧＦ＋線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地のいずれで培養するかに関わらず、幹細胞の成長を支持することを示す図である。異なる表面上にコーティングした無関連抗体は、幹細胞接着を引き起こさず、細胞は２４時間以内に死滅した。
【図５】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地を含有する培地中での複数回の継代後のマトリゲルに付着したヒト幹細胞の写真を示す。左側の写真は、全ての細胞の核のＤＡＰＩ染色を示し、右側のパネルはＯＣＴ４染色との１：１相関を示す。まとめると、これらは全ての細胞がＯＣＴ４＋（多能性を意味する）のままであることを示している。
【図６】抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で成長させたｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の写真を示す：Ａ）３日目（Ａ１）及び７日目（Ａ２）の最小培地単独において培養したもの；Ｂ）３日目（Ｂ１）及び７日目（Ｂ２）の最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊において培養したもの；Ｃ）３日目（Ｃ１）及び７日目（Ｃ２）の４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞に由来する５０％馴化培地において培養したもの；Ｄ１、Ｄ２）ウェルＡ及びウェルＢからの細胞を、細胞を表面から放出させる遊離ＰＳＭＧＦＲ（ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン）ペプチドを添加することによって採取したもの；細胞を新たな抗ＭＵＣ１＊抗体表面に再プレーティングし、そこで付着及び増殖させた。
【図７】抗ＭＵＣ１＊抗体又はβ−シクロデキストリンに連結した同じ抗体でコーティングした表面上での幹細胞成長のグラフである。このグラフは、抗体をデキストリンに連結した場合に細胞の接着及び成長の向上を示している。
【図８】ｈｕ ＥＳ細胞を、最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体において培養する場合に、幹細胞表面マーカータンパク質ＳＳＥＡ４及びＴｒａ １−８１に結合した抗体でコーティングした表面に付着させることによって培養することができることを示す図である。
【図９】マトリゲル上のｈｕ ＥＳ細胞が、最小培地＋ＮＭ２３において培養した場合に、少なくとも現行の技術水準と同様に成長することを示す図である。このグラフは、標準的な４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋線維芽細胞に由来するＨＳ２７馴化培地（対照）において培養した場合のマトリゲル上のｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の成長と、示される濃度での最小幹細胞培地＋ＮＭ２３における成長とを比較するものである。未分化の成長率を未分化のコロニー及び分化したコロニーの両方の盲目計数（blinded count）によって算出し、次いで百分率として算出した。完全に未分化の細胞のみを未分化であると評価した。
【図１０】抗ＭＵＣ１＊でコーティングした表面上で成長させたｈｕ ＥＳ細胞を、シクロデキストランに共有結合的に連結し、最小培地＋ＮＭ２３において示される濃度で分割することが可能な状態となるまで培養したことを示す図である。一組の細胞を初めに４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地（ＣＭ）において最初の２４時間培養した。このグラフは、ｂＦＧＦ及びＣＭが、適切な量のＮＭ２３を添加しても細胞の成長又は分化状態に利益をもたらさなかったことを示す。
【図１１】ＮＴＡ−Ｎｉでコーティングした表面上に幹細胞を接着させて、培養し、そこに初めにヒスチジンタグ付きリガンドＮＭ２３、ＲＧＤペプチド及びプロテインＧ、続いて抗ＳＳＥＡ４及びＴｒａ １−８１を結合したことを示す図である。続いてｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の成長及びコロニー形成が起こった。３日目に計数した未分化のコロニー及び分化したコロニーの数をプロットした。Ｂ〜Ｇは図１１Ａでプロットした代表的な幹細胞のコロニーの写真である。
【図１１−２】同上
【図１２】ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地（Ｃａ ＣＭ）が、標準的な線維芽細胞馴化培地（ＣＭ）よりもはるかに大幅にｈｕ ＥＳ細胞の成長を促進し、分化を阻害することを示す図である。さらに、ＮＭ２３はＣａ ＣＭに添加した場合に標準的なｂＦＧＦよりもはるかに良好に作用した。
【図１３】各々が異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンに由来する吸着上清上で成長させたｈｕ ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ ＥＳ細胞の写真を示す。幹細胞接着を最も良好に可能にするモノクローナル抗体をこのようにして同定する。
【図１４】ハイブリドーマ上清を、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかから１０個のアミノ酸が失われたＰＳＭＧＦＲペプチドの欠失変異体に結合するその能力について試験したＥＬＩＳＡアッセイのグラフである。それらの上清でコーティングした表面への幹細胞の付着を可能にしたハイブリドーマは、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチド（GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV）への結合も示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのより遠位の部分に結合した抗体が、表面への幹細胞の付着をより良好に可能にすると推論した。
【図１５】分化を開始する前後のＨ９ヒト胚性幹細胞のＩＣＣ染色の写真を示す。抗ＭＵＣ１＊は未分化のコロニーの細胞を全て染色し、最も基準となる（gold standard）多能性の指標であるＯＣＴ４と共局在化した（図１５Ａ、図１５Ｂ）。ＭＵＣ１完全長を特定するＶＵ４Ｈ５抗体は、いずれの未分化細胞も染色しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、細胞が分化すると、逆のＭＵＣ１パターンが検出された。ＭＵＣ１＊染色又はＯＣＴ４染色は観察されなかった（図１５Ｄ、図１５Ｅ）。しかし、全ての細胞が完全長ＭＵＣ１に陽性であると染色された（図１５Ｆ）。同様に、未分化幹細胞はＮＭ２３に陽性であると染色され、ＭＵＣ１＊のリガンド及びＮＭ２３は、ＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と正確に共局在化した（図１５Ｇ〜図１５Ｌ）。
【図１５−２】同上
【図１６】幹細胞成長培地に添加した抗ＭＵＣ１＊抗体が、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長を増大させることを示す図である（Ａ）。（Ｂ）ＦＡＣＳ分析から、造血幹細胞のままであった細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）の数が、抗ＭＵＣ１＊濃度の増大に伴って増加した。一方で、次の前駆体段階に進んだ細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）の数が抗ＭＵＣ１＊濃度の減少に伴って増加した。これらの結果から、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の刺激がＨＳＣの分化を阻害したことが示される。
【図１７】神経幹細胞（Ａ）及び胎児肝細胞（Ｂ）のＦＡＣＳスキャンを示す図である。細胞を業者から入手し、即座に蛍光標識抗ＭＵＣ１＊抗体及び完全長ＭＵＣ１の遠位部分を認識する標識抗体（ＨＰＭＶ）の両方で染色した。ＦＡＣＳスキャンによって、ＭＵＣ１の大半が両方のタイプの初期前駆体上でＭＵＣ１＊へと短縮される（clipped）ことが示される。続く実験から、抗ＭＵＣ１＊が両方のタイプの細胞の成長を濃度依存的に刺激することが示された。
【図１８】抗ＭＵＣ１＊濃度に応じた胎児肝細胞の成長のプロットであり、これはＭＵＣ１＊受容体を刺激することによってＭＵＣ１＊前駆細胞を単離し、展開させることができることを示している。
【図１９】ｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞を、１２ウェルプレート上にコーティングした抗ＭＵＣ１＊抗体又は抗ＳＳＥＡ４抗体のいずれかの上にプレーティングした後、８ｎＭ ＮＭ２３又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地のいずれかにおいて培養した後の幹細胞コロニーのプロットである。
【符号の説明】
【００２４】
図１
Anti-MUC1 抗ＭＵＣ１＊
Minimal StemCell Medium 最小幹細胞培地
ConditioinedMedium 馴化培地
図４
Growth of hESCells on Anti-MUC1* Antibody Coated Surfaces: in Minimal Media Aloneor + 30% Conditioned Media + bFGF 最小培地単独又は３０％馴化培地＋ｂＦＧＦにおける抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上でのｈＥＳ細胞の成長
(Calcein)FluorescenceUnits （カルセイン）蛍光単位
Concentrationof Anti-MUC1* Antibody Adsorbed onto Plate プレート上に吸着した抗ＭＵＣ１＊抗体の濃度
Anti-MUC1*on Plate w/Minimal Media 最小培地を有するプレート上の抗ＭＵＣ１＊
ControlAntibody on Plate w/Minimal Media 最小培地を有するプレート上の対照抗体
Anti-MUC1*Antibody on Plate 30% + Conditioned Media + bFGF ３０％＋馴化培地＋ｂＦＧＦを有するプレート上の抗ＭＵＣ１＊抗体
図７
Growth of hESCells on Anti-MUC1* Antibody Coated Surfaces: Antibody Alone orCoupled to Cyclodextrin 抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上でのｈＥＳ細胞の成長：抗体単独又はシクロデキストリンと連結した抗体
RelativeFluorescent Units 相対蛍光単位
ug/mlanti-MUC1* Ab 抗ＭＵＣ１＊Ａｂ（ｕｇ／ｍｌ）
AntibodyConjugated to Beta Cyclodextrin β−シクロデキストリンと結合した抗体
Antibodyalone 抗体単独
図８
hES Cells Canbe Grown on any Surface that Binds Cell Surface Marker Antigens if Fed withMinimal Media + Anti-MUC1* Antibody ｈＥＳ細胞は、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体を供給した場合に、細胞表面マーカー抗原を結合する任意の表面上で成長させることができる
Calcein-AMFluorescence カルセインＡＭ蛍光単位
ug/mlAntibody 抗体（ｕｇ／ｍｌ）
Anti-SSEA4 抗ＳＳＥＡ４
Anti-Tra-1-81 抗Ｔｒａ １−８１
図９
hu ES CellsGrowing on Matrigel Cultured in NM23 in Minimal Media 5 days 最小培地中のＮＭ２３において培養したマトリゲル上で５日間成長させたｈｕ ＥＳ細胞
%Undifferentiated hu ES cells 未分化ｈｕ ＥＳ細胞（％）
Concentrationof NM23 ＮＭ２３の濃度
CONTROL 対照
NM23 inMinimal Media 最小培地中のＮＭ２３
bFGF CM 24hrsthen NM23 ｂＦＧＦ ＣＭで２４時間、続いてＮＭ２３
図１０
hu ES CellsGrowing on Anti-MUC1* Coupled to Cyclodextran 5 days シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊上で５日間成長させたｈｕ ＥＳ細胞
%Undifferentiated hu ES cells 未分化ｈｕ ＥＳ細胞（％）
ConcentrationNM23 ＮＭ２３の濃度
NM23 inMinimal Media 最小培地中のＮＭ２３
bFGF CM 24hrs then NM23 Minimal Media ｂＦＧＦ ＣＭで２４時間、続いて最小培地中のＮＭ２３
図１１
NTA-NiSurfaces Capture His-Tagged Ligands that bind to Stem Cell Surface Proteins ＮＴＡ−Ｎｉは、幹細胞表面タンパク質に結合するＨｉｓタグ付きリガンドを捕捉する
Number ofColonies コロニーの数
undifferentiatedcolonies 未分化のコロニー
differentiatedcolonies 分化したコロニー
Surfaces 表面
hu ES H9sGrowing Attached to Histidine-Tagged Ligands that Bind to Stem Cell SurfaceProteins - Images Captured Day 3 Post Plating 幹細胞表面タンパク質に結合するヒスチジンタグ付きリガンドに付着させて成長させたｈｕ ＥＳ Ｈ９ − プレーティング後３日目に撮影した画像
NM23 ON SURFACE 表面上にＮＭ２３
undifferentiated 未分化
differentiated 分化
RGD PEPTIDEON SURFACE 表面上にＲＧＤペプチド
PROTEIN G,ANTI-SSEA4 ON SURFACE 表面上にプロテインＧ、抗ＳＳＥＡ４
PROTEIN G,ANTI-Tra 1-81 ON SURFACE 表面上にプロテインＧ、抗Ｔｒａ １−８１
図１２
hu ES H9Cells Attached to an NTA-Ni Coated Plate ＮＴＡ−Ｎｉコーティングプレートに付着させたｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞
Number ofcolonies コロニーの数
80-85%undifferentiated at day 5; NM23 + Ca CM had fully formed colonies ready for 1:2split ５日目に８０％〜８５％が未分化であった；ＮＭ２３＋Ｃａ ＣＭは２倍に分割することが可能な状態のコロニーを完全に形成した
図１３
day 9 ９日目
図１４
ELISA assayof Hybridoma Supernatants Binding to PSMGFR Deletion Peptides Lacking 10 AminoAcids from either the N- or C-Terminus １０個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端のいずれかから失われたＰＳＭＧＦＲ欠失ペプチドに結合するハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡアッセイ
corrected OD450 nm ４５０ｎｍでの補正ＯＤ
Clone ID クローンＩＤ
図１５
UNDIFFERENTIATED 未分化
DIFFERENTIATED 分化
図１６
minimal media 最小培地
Anti-MUC1* 抗ＭＵＣ１＊
MUC1*Stimulated Growth of Hematopoietic Cells from Cord Blood - 11 Days 臍帯血に由来する造血細胞のＭＵＣ１＊によって刺激される成長（１１日間）
Percent パーセント
Other cells 他の細胞
Progenitors 前駆体
図１７
Neural StemCells 神経幹細胞
RenCell CXcells(Millipore) ＲｅｎＣｅｌｌ ＣＸ細胞（Millipore）
Anti-MUC1*Rabbit polyclonal SRY 1a max 抗ＭＵＣ１＊ウサギポリクローナルＳＲＹ １ａ ｍａｘ
Pacific Blue パシフィックブルー
MUC1-full-length ＭＵＣ１完全長
CD34+FetalLiver Cells(ALLCELLS) ＣＤ３４＋胎児肝細胞（ALLCELLS）
図１８
CD34+ FetalLiver Normalized Growth 10 days ＣＤ３４＋胎児肝臓における正規化した１０日間の成長
% norm growth 正規化した成長（％）
ng/mlAnti-MUC1* LMP#1(SRY) antibody 抗ＭＵＣ１＊ ＬＭＰ＃１（ＳＲＹ）抗体（ｎｇ／ｍｌ）
optimalantibody concentration 最適抗体濃度
図１９
hu ES CellGrowth on Anti-MUC1* or Anti-SSEA4 Surfaces, Cultured in NM23 orbFGF + CM ＮＭ２３又はｂＦＧＦ＋ＣＭにおいて培養した、抗ＭＵＣ１＊又は抗ＳＳＥＡ４表面上でのｈｕ ＥＳ細胞の成長
Number ofcolonies コロニーの数
Anti-MUC1*Coated Surface 抗ＭＵＣ１＊をコーティングした表面
Anti-SSEA4Coated Surface 抗ＳＳＥＡ４をコーティングした表面
undifferentiatedcolonies 未分化のコロニー
differentiatedcolonies 分化したコロニー
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願において、「a」及び「an」は、単一及び複数の対象の両方を指すように使用される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体」（ＭＧＦＲ）は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用するＭＵＣ１受容体の部分を意味する機能定義である。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近い細胞外部分であり、下記に定義されるように、ＰＳＭＧＦＲの大部分又は全てによって規定される。ＭＧＦＲは、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体の一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）とは、場合によってはＭＧＦＲの大部分又は全て、並びにそのペプチド配列の機能的変異体及び断片を規定するペプチド配列を指す。ＰＳＭＧＦＲは、配列番号１、並びに２０個までの任意の整数値（すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、及び／又は２０個までの任意の整数値のアミノ酸付加若しくは欠失を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に有する、その全ての機能的変異体及び断片として定義される。上記の文脈における「機能的変異体又は断片」とは、配列番号（SEQ D NO:）１のペプチドに特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用するリガンドに特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用する能力を有するが、ペプチド分子が他の同一なペプチド分子と会合する（すなわち自己会合する）能力を有するほど、それら自身と同一な他のペプチド分子の同一な領域とは強く結合しない変異体又は断片を指す。配列番号（SEQ NO:）１のＰＳＭＧＦＲペプチドの機能的変異体であるＰＳＭＧＦＲの一例は配列番号２であり、-SRY-の代わりに-SPY-配列を含むことによって配列番号１とは異なる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊」とは、細胞外ドメインが本質的にＰＳＭＧＦＲ（配列番号１）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、表面に結合される細胞との関連において使用される「表面」は、固体基質又は多孔質基質又は他の非固体基質であり得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「最小培地」は、概して細胞に由来する馴化培地、又は生きた宿主に由来する血清等の不確定の作用物質の混合物が存在することなく、細胞培養が可能となる最小限の栄養素を含有する任意の培地であり得る。本明細書中で使用される場合、「最小幹細胞成長培地」は、幹細胞又は幹様細胞の培養が可能となる最小限の栄養素を含有する任意の培地であり得る。これは最小培地又はＭＭとも称される。以上のように、本発明で使用される最小培地は例示の最小培地に限定されず、確定された成分を有する多数のタイプの溶液を包含し得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「幹様」細胞は幹細胞の特性を幾つか有し得る。例えば、幹様細胞は自己再生する能力を幾らか有する。幹様細胞は、ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ、若しくはＫＬＦ４を発現する、若しくは発現するように誘導されるか、又はｂ）高レベルのＭＵＣ１＊をそれらの表面上で発現する。幹様細胞の例としては、前駆細胞、多分化能（multipotent）幹細胞、多能性を誘導するプロセスを受けている細胞、がん細胞、がん幹細胞、造血幹細胞、ｉＰＳ、及び幾つかの抗体産生ハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ」とは、非多能性細胞、通常は成体の体細胞から、或る特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって人為的に誘導された或るタイプの多能性幹細胞を指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊刺激因子」とは、ＭＵＣ１＊の二量化又はＭＵＣ１＊を形成するＭＵＣ１の切断等のＭＵＣ１＊の活性を活性化することが可能な任意の分子を指す。
【００３４】
配列表フリーテキスト
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用については、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（付録２、表１）に記載される規則に従うが、ここでは、ｋはｔ又はｇを表し、ｎはａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｒはａ又はｇを表し、ｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｙはｃ又はｔを表す。
【００３５】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）は、ＭＵＣ１の膜近位の（membrane proximal）細胞外領域をアミノ酸１１１０からアミノ酸１１５５まで表す（ＰＳＭＧＦＲ）。GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号２）は、ＭＵＣ１の膜近位の細胞外領域の変異体をアミノ酸１１１０からアミノ酸１１５５まで表す（ＰＳＭＧＦＲの変異体）。
【００３６】
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号３）は、Ｎ末端の１０個のアミノ酸が欠失したＰＳＭＧＦＲ配列（Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
【００３７】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（配列番号４）は、Ｃ末端の１０個のアミノ酸が欠失したＰＳＭＧＦＲ配列（Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
【００３８】
表面上の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞
本発明は、細胞表面タンパク質に対するリガンドを、成長培地を保持することができるか、又は成長培地に添加することのできる固体支持体に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞及び前駆体を培養するか又は展開させる方法を開示する。
【００３９】
本発明は、細胞を培養するための新たな方法及び表面を開示する。該方法は接着性でない細胞を成長させて、維持するのに特に有用である。これらの方法は幹細胞、幹様細胞及び前駆細胞を培養するのに特に有用である。
【００４０】
表面
本発明は、細胞を成長させるための新たな表面及び方法を開示する。これらの表面は非接着性の細胞、幹細胞及び幹様細胞（誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び幾つかの前駆細胞を含む）を培養するのに特に有用である。本明細書中に開示される方法によって、どのようにして細胞培養培地を交換しつつも有益な細胞を保持するかという問題が解決される。既存の細胞培養方法の多くは接着性細胞に有効であるが、これは接着性細胞がフラスコの表面に付着するためである。格納容器の表面に付着した細胞に支障を来たすことなく、古い液体培地を除去して、新たな培地で置き換えることができる。本発明の幾つかの方法は、より頻繁に置き換えることが必要とされるより安価な因子を交換しつつも、有益な成長因子の保持を可能にするという点でも有用である。本発明の他の方法は、比較的狭い空間及び少量の培養培地を使用しつつも、細胞付着のための表面積をより大きくし、それにより細胞の収量を増大させる。該方法は概して、リガンドを表面に直接的又は間接的に付着させることを含むが、この場合、リガンドは細胞表面上の分子に結合することが可能である。
【００４１】
これらの方法とともに使用するのに好適な表面は、本質的に膜であっても、又は多孔質であってもよい。本明細書中に記載の表面はポリマー、又はポリマー、シクロデキストリン若しくはシクロデキストランでコーティングした表面であり得る。表面は空間的にアドレス可能な表面、又はビーズ、粒子若しくはナノ粒子の表面であり得る。ビーズ、粒子又はナノ粒子は溶液中に遊離していても、又は介在分子によって固定されていてもよい。例えば膜は、ポリマー物質を含んでいても、細胞と表面との間の結合を促進するリガンドを担持するビーズ又は粒子が付着していてもよい。本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ成長へのこれらの表面の使用を含む。本発明の表面を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を培養することができる。代替的には、本発明の表面を宿主内に埋め込むことができる。表面は、療法として移植される幹細胞等の細胞を担持することができる。例えば、成長幹細胞が付着した又は付着していない本発明の表面を移植して、その表面によって生着の効率を増大させることができる。別の例では、移植した表面は、宿主自身の細胞又は幹細胞を或る領域に動員するため、又はその位置での標的細胞の成長を促進するためにリガンドを担持している。例えば、幹細胞の成長を誘起し（attract）、促進する表面を関節内に挿入し、軟骨の置換を助長することができる。本発明の表面は、細胞が最終的に３次元形態を形成するように足場上に成形するか、又は足場上にコーティングすることができる。例えば、材料を耳の形状にした後、最終的に足場の形状のより成熟した細胞又は組織へと発展する幹細胞又は幹様細胞の付着及び成長を可能にする、本明細書中に記載の表面の１つでコーティングすることができる。本発明の表面及び組成物を使用して、構造化された又は構造化されていない多孔質表面又は固体表面であり得る埋め込み型装置をコーティングすることができることが更に想定される。上記装置によって、組織又は細胞の修復又は再生を目的として幹細胞又は前駆細胞を或る領域に送達又は動員することができる。例えばステントを本発明の表面又は組成物のいずれかでコーティングして、血管を修復又は再生することができる。本発明の表面、例えばＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇでコーティングし、幹細胞又は前駆細胞を付着させたステントを宿主又は個体に埋め込んで、宿主自身の細胞を刺激する細胞又は成長因子を送達することができる。該方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
【００４２】
リガンド
表面への細胞の結合を促進するか、又は細胞増殖を刺激するリガンドを、表面に直接的に、又は例えば表面に付着したポリマーに間接的に付着させることができる。例えば、細胞表面受容体を認識する抗体を、表面上に付着又は吸着したシクロデキストリン又はシクロデキストラン等のポリマーに共有結合的に付着させることができる（実施例６、実施例１０〜実施例１２及び図７、図１０を参照されたい）。細胞表面上の分子に対して幾らかの親和性を有するリガンドを、任意でこれらの表面に付着させて、細胞の付着及び成長を促進する。リガンドは成長因子受容体等の細胞表面受容体上に特異的に結合し得る。リガンドはタンパク質、ペプチド、小分子、抗体、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、二重特異性抗体、一価抗体若しくは二価抗体、Ｆａｂ等の抗体誘導体、一本鎖抗体、遺伝子組換え誘導体、又は抗体の可変領域をその標的に特異的に結合することが可能なように別のタンパク質に挿入した誘導体であり得る。代替的には、リガンドは細胞表面分子に対して特異親和性を有する必要はない。例えば、表面に付着したリガンドは、非特異的相互作用を介して細胞を表面に接着させ得る。非特異的相互作用は本質的に化学的又は生物学的なものであり得る。ヒドロキシル等の親水性部分又はメチル基等の疎水性頭部基で誘導体化された表面は、疎水性相互作用によって細胞を非特異的に保持することができる。荷電した化学的実体又は生物学的実体を担持する表面は、イオン性相互作用によって細胞を吸着することができる。細胞は更に、細胞に対して幾らかの特異性を有する実体を担持する表面（ＲＧＤ配列含有ペプチド、ポリリシン、正又は負に荷電した表面、コラーゲン、ラミニン、並びにマトリゲル及びマトリゲル様物質を含む他の細胞外マトリックス成分が挙げられるが、これらに限定されない）によって捕捉されていてもよい。細胞は他のタイプの化学修飾表面によって捕捉されていてもよい。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ及び他の金属キレートでコーティングされた表面が細胞及び幹細胞に非特異的に結合する（実施例１５及び図１２を参照されたい）。
【００４３】
好ましい実施形態では、細胞表面上の分子に対して特異親和性を有する部分を表面に付着させて、幹細胞の付着を容易にする。例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４又はＴｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０等の幹細胞の特異的マーカーである細胞表面タンパク質に結合する抗体を表面に付着させる。幹細胞はそれらの細胞表面タンパク質と、培養プレート上のそれらの同種抗体との特異的相互作用によってこれらの表面に接着する。次いで、細胞を標準方法、又はＭＵＣ１＊を刺激する本発明の新規の方法によって培養することができる（実施例１〜実施例４、実施例８〜実施例１０、実施例１２及び図１〜図１０を参照されたい）。別の例では、表面に付着させるリガンドは、成長因子又は成長因子の一部分であり得る。別の例では、表面に付着させるリガンドは、細胞表面分子（成長因子受容体であり得る）を認識する抗体又は抗体の一部分であり得る。別の例では、リガンド複合体を表面上に付着又は固定化させるが、この場合、複合体の少なくとも１つの成員が細胞表面分子に対して親和性を有するか、又は細胞に細胞の成長若しくは分化を調整する作用物質を与える。例えば、プロテインＧは、ヒスチジンタグ−ＮＴＡ−Ｎｉ相互作用によって表面に吸着するか、又は特異的に付着することができ、幹細胞表面マーカーを認識する抗体がプロテインＧとのその相互作用によって表面に付着する（実施例１４、図１１を参照されたい）。
【００４４】
混合表面
場合によっては、リガンドと成分との混合物を提示する表面を有することが望ましい。これらは本質的に生物学的若しくは化学的なものであってもよく、又は生物学的成分と化学的成分との混合物であってもよい。例えば、表面を成長因子又は同等の活性化抗体＋細胞外マトリックスの成分（コラーゲン又はラミニン等）の混合物でコーティングすることができる。ラミニンと成長因子又は抗体との混合物でコーティングした表面も、幹細胞の付着及び成長を促進した。例えば、本発明者らは、コラーゲン又はラミニンと細胞表面マーカーに特異的な抗体とを含む表面コーティングが幹細胞及び幹様細胞の成長に有用であることを示した。
【００４５】
別の例では、ラミニン又はコラーゲンを細胞表面マーカーのリガンドと混合する。実験から、ラミニンと抗ＭＵＣ１＊とを混合することによって、幹細胞の付着及び細胞成長に必要とされる抗体の量が減少し、正常な幹細胞コロニーが発展することが示された。本発明の別の態様では、混合種を表面に付着させるが、この場合、１つ又は複数の成分が表面への細胞の付着を容易にするリガンドであり、他の成分（複数も可）が細胞の機能に影響を及ぼす作用物質を細胞に与える。表面に付着することのできる機能的作用物質の例としては、成長、分化を促進するか、又は多能性を誘導する作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
リガンド付着のための方法
細胞接着を促進するか、又は成長因子であるリガンドは、例えばＥＤＣ／ＮＨＳ又はマレイミドカップリング化学（coupling chemistries）を用いた共有結合カップリング（covalentcoupling）を含むが、これらに限定されない様々な方法で表面に付着させることができる。代替的には、本発明のリガンドは、非共有結合的相互作用又は親和性相互作用によって表面に付着させることができる。例えば、本発明のリガンドにヒスチジンタグを付けた後、ニトリロトリ酢酸−ニッケル（ＮＴＡ−Ｎｉ）部分を介して表面に付着させることができる。アフィニティータグ相互作用を用いて、細胞の培養に好適な成長表面を生成することができる。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ部分を細胞培養フラスコに付着させて、ヒスチジンタグ付きリガンドをＮＴＡ−Ｎｉによって捕捉させる。リガンドは細胞表面受容体に直接的又は間接的に結合して細胞を表面に接続する。リガンドが成長因子でもある場合、リガンドは細胞接着をもたらし、かつ増殖を促進する働きをする（実施例１４、図１１を参照されたい）。
【００４７】
一実施形態では、リガンドは、ＭＵＣ１＊又はＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）等の細胞表面受容体を認識する抗体が結合するプロテインＧ又はプロテインＡである。プロテインＧ又はプロテインＡは、表面上に非特異的に吸着し、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって共有結合的に連結又は付着する。例えば、細胞培養フラスコをＮＴＡ−Ｎｉ部分でコーティングすることができ、それによりヒスチジンタグ付きプロテインＧ又はプロテインＡを表面によって捕捉することができる。次いで、細胞表面受容体に対する抗体を添加すると、抗体は表面上に固定化されたプロテインＧ又はプロテインＡに結合する。
【００４８】
別の態様では、表面に付着するリガンド及び作用物質を、それらが表面から放出されて局所環境を変化させることができるように、又は細胞が作用物質を消費することができるようにして表面に付着させることができる。作用物質を、それが分解するにつれて表面から放出されるか、又は刺激に応答して放出されることができるように表面に付着させることができる。例えば、作用物質を、作用物質が光に応答して又は化学シグナルによって放出されることができるように、感光性又は化学物質感応性のリンカーを用いて表面に付着させることができる。幾つかのリンカーはｐＨの変化に応答して切断される。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４若しくはＮＭ２３等の多能性を誘導する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はｍｉＲ−１４５（マイクロＲＮＡ）等の分化を誘導する遺伝子若しくはその産物を培地に添加するか、又は表面に付着させることができる。これらは経時的な分解によって、又は付着結合を切断する特定の光の波長等の特異的シグナルに応答して表面から放出されることができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、表面に付着した又は表面上に固定化されたリガンドは、細胞表面上の成長因子受容体を認識する成長因子である。細胞表面上の成長因子受容体を活性化する抗体は、先に記載された方法のいずれか又はその組み合わせを用いて表面に付着させることができる。一例では、成長因子は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）又は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であり、リガンドが親和性を有する細胞表面上の分子は線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）である。代替的には、リガンドはＦＧＦＲを認識する抗体であってもよい。本発明の別の態様では、成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）であり、リガンドが親和性を有する細胞表面上の分子は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。別の態様では、親和性リガンドは幹細胞因子（ＳＣＦ）、又はｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ−Ｒを活性化する抗体を含む別の作用物質である。成長表面に付着したリガンドは、Ｆｌｔ ３リガンド、トロンボポエチン（thrombopoetin）（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−ｎ、又はその同種受容体に対するそれらの影響を模倣する抗体であってもよい。
【００５０】
ＭＵＣ１＊リガンド
より好ましい実施形態では、成長表面に付着したリガンドは、ＭＵＣ１細胞表面タンパク質に対して親和性を有する。更に好ましい実施形態では、リガンドはこのタンパク質のＰＳＭＧＦＲ部分（ＭＵＣ１＊）に対して親和性を有する。また、更により好ましい実施形態では、リガンドはＭＵＣ１＊の二量化を誘導する。一例では、リガンドは抗ＭＵＣ１＊抗体である（実施例１、実施例４、実施例７、実施例１０及び図１、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｄ、図８）。別の例では、リガンドはＮＭ２３、又はＳ１２０Ｇ等の変異体、又は二量体形成を優先させる（prefers）か、若しくは二量体として機能する他の任意の突然変異体若しくは誘導体である（実施例９、実施例１２、実施例１４、実施例１５、実施例２０並びに図９、図１０、図１１、図１２及び図１９を参照されたい）。表面はＮＭ２３が細胞に二量体として提示されるように構成されていてもよい。別の例では、成長表面に付着したリガンドは、ＭＵＣ１の細胞外ドメインに結合する抗体である。タンデムリピートドメインが切断され、細胞表面から脱落した後も細胞表面に付着したままであるＭＵＣ１の部分に結合する抗体が好ましい。例えば、ＭＵＣ１のＰＳＭＧＦＲ配列に結合する二価抗体は、切断されたＭＵＣ１の成長因子受容体機能を活性化し、細胞増殖を刺激する。ＰＳＭＧＦＲペプチドの少なくとも一部分での免疫化によって生成したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、表面に付着し、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の活性化によって表面への細胞の付着を促進し、かつ細胞の成長を刺激する。
【００５１】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれか、並びに天然及び非天然の抗体誘導体の両方が、全ＰＳＭＧＦＲ配列を用いて生成した、又はそれに対する親和性について選択された抗体よりも幹細胞接着に適しているように生成又は選択することができる。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの配列に対応するが、細胞表面に近接した１０個のアミノ酸が欠失したペプチド「Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ」でウサギを免疫化することによって生成したポリクローナル抗体は、完全ＰＳＭＧＦＲペプチド又は最も遠位の１０個のアミノ酸が欠失した「Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ」（QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA）（配列番号３）に対して生成した抗体よりも効率的に幹細胞接着を促進する抗体を生成した（実施例１６及び図１３、図１４を参照されたい）。幹細胞に結合する能力が改善された抗体は、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチド又は他のＮ末端断片を提示する表面上でそれらを親和性精製することによって完全ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体から単離することもできる。
【００５２】
Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合したが、Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドには結合しなかったモノクローナル抗体を分泌したハイブリドーマクローンは、表面への幹細胞の接着を容易にすることが示された（図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４を参照されたい）。対照的に、Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合したが、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合しなかったモノクローナル抗体は、幹細胞接着をほとんど可能にしなかった。両方のモノクローナル抗体型が、培養培地に添加した場合に細胞成長を刺激することが可能であった。
【００５３】
好ましい実施形態では、ＭＵＣ１＊成長因子受容体のリガンドであるＮＭ２３を提示する表面上で幹細胞を培養する。ＮＭ２３は表面に直接的又は間接的に付着させることができる。本発明の一態様では、二量化を優先させるＮＭ２３又はＳ１２０Ｇ突然変異体を、細胞成長のための表面上に非特異的に吸着させる（実施例１５、図１２を参照されたい）。本発明の別の態様では、表面を初めに、ヒスチジンタグ付きタンパク質又はペプチドに結合するＮＴＡ−Ｎｉ等のアフィニティータグ結合パートナーで誘導体化する。次いで、ヒスチジンタグ付きＮＭ２３をＮＴＡ−Ｎｉ表面に非共有結合的に連結させる。次いで、幹細胞及び幾つかの前駆体等のＭＵＣ１＊陽性細胞をＮＭ２３表面に添加すると、細胞が表面に接着して成長する。更により好ましい実施形態では、ＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ突然変異体をシクロデキストランに共有結合的に連結させる。
【００５４】
採取方法
本発明の別の態様では、本発明の表面から細胞を採取する新規の方法が記載される。本発明は、本発明の表面及び他の多くの細胞成長システムに有用なこれらの採取方法を含む。本発明は、本発明の新規の表面とともに手作業での解離及び酵素的切断等の標準的な採取方法を使用することも含む。細胞採取方法の幾つかは表面の成分の固有性に依存する。例えば、抗体表面に吸着することによって成長する細胞は、抗体エピトープと同じ配列を有するペプチドを過剰に添加することによって放出させることができる。例えば、抗体がＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを認識する場合、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの配列の幾つか又は全てを有するペプチドを過剰に添加することによって細胞を放出させることができる。遊離ペプチドは、表面に付着した抗体への結合について細胞上のＭＵＣ１＊受容体と競合する。抗体へのペプチドの結合は細胞を放出させる（実施例４、図６Ｄを参照されたい）。プロテインＧ又はプロテインＡに結合することによって表面に付着する抗体を提示する表面上で培養した細胞は、過剰のＦｃ部分又は過剰の無関連抗体を添加することによって表面から放出される。プロテインＧはＦｃドメインに結合するため、遊離Ｆｃは表面に付着したプロテインＧ又はプロテインＡへの結合について同種抗体と競合し、抗体と複合体形成した細胞を放出させる。リガンドがアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって付着した表面上で培養した細胞は、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用を妨げる作用物質を添加するか、又は結合パートナーと相互作用するアフィニティータグの部分を過剰に添加することによって放出される。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ表面に結合したヒスチジンタグ付きリガンド上で成長する細胞は、イミダゾール、無関連ヒスチジンペプチドを添加するか、又は表面に付着したリガンドの結合パートナーの少なくとも一部分を過剰に添加することによって放出される。ＮＭ２３表面の場合、細胞は、過剰のペプチドの添加が表面に付着したＮＭ２３への結合についてＭＵＣ１＊細胞表面受容体と競合し、それにより細胞が放出されるように、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの少なくとも一部分と本質的に同じ配列を有するペプチドを過剰に添加することによって放出させることができる。代替的には、ＮＭ２３は表面への付着を容易にするアフィニティータグを用いて作られる。アフィニティータグと表面との間の相互作用を妨げる戦略によって、ＮＭ２３及び付着した細胞が表面から放出される。同様に、Ｈｉｓタグ付きプロテインＧ（＋抗体）又はＨｉｓタグ付きＮＭ２３は、ａ）イミダゾール（０．５Ｍ）又はｂ）過剰の（Ｈｉｓ）６ペプチドを添加することによって表面から放出させることができる。
【００５５】
任意のアフィニティータグ、結合パートナー対を表面へのリガンドの付着に使用することができ、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用の遮断が幹細胞を表面から放出させる。好適なアフィニティータグ、結合パートナー対の例としては、ＮＴＡ−Ｎｉ／ヒスチジンタグ、グルタチオン／ＧＳＴ融合体、マルトース／マルトース結合タンパク質及びビオチン／ストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
成長培地
本明細書中に記載の表面及び採取方法は、標準的な幹細胞培養方法及び新規の方法と適合する。標準的な幹細胞培養培地は、これまでの幹細胞成長には、これらの細胞によって分泌された未同定の成長因子が必要とされていたため、外因性の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の添加及び線維芽細胞フィーダー細胞上での成長を必要とする。幹細胞は、ｂＦＧＦに加えて線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地（ＣＭ）を培地のおよそ３０％〜５０％添加する必要がある点を除けば、標準的なプロトコルによるマトリゲル上でも成長させることができる。不活性化ヒト包皮（ＨＳ２７）線維芽細胞フィーダー細胞は通常胚性幹細胞の成長に使用される。
【００５７】
標準的な成長培地が本発明の表面上での成長に適合することを実証した（実施例４、図６Ｃ及び実施例３、図４）。マトリゲル上での成長と同様、ｂＦＧＦ媒介成長には、本明細書中に記載の本発明の表面上での幹細胞成長を支持するために線維芽細胞馴化培地が必要とされる。ＭＵＣ１＊刺激因子又は二量化剤を含有する培養培地が好ましい。ＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗体、又はＮＭ２３の野生型若しくは突然変異体Ｓ１２０Ｇが好ましい成長因子であり、ｂＦＧＦ及び線維芽細胞馴化培地の代わりとすることができる（図６、図９、図１０、図１１及び図１２を参照されたい）。マトリゲル、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｒｔ（Invitrogen）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Invitrogen）又は本発明の表面のいずれかに付着したヒト胚性幹細胞の成長は、抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３−Ｓ１２０ＧのいずれかをｂＦＧＦ及びＨＳ２７馴化培地の代わりに最小幹細胞培地に添加した場合に、一貫してより良好であり、成長速度、コロニー形態及び分化の阻害は、ＭＵＣ１＊刺激因子でｂＦＧＦ＋馴化培地（ＣＭ）を置き換えた場合に一貫してより良好である。
【００５８】
成長ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地は、分化を阻害する一方で幹細胞成長及びコロニー形成を増大させる。マトリゲル、ＮＴＡ−Ｎｉ、抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３表面上で成長するヒト幹細胞を、最小幹細胞培地＋成長ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地中で培養した。ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞であるＴ４７Ｄ細胞に由来する馴化培地は、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、又は抗ＭＵＣ１＊抗体又はｂＦＧＦに添加した場合に幹細胞成長、コロニー形成及び分化の阻害を、ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地と比較して大きく改善した（実施例１４、実施例１５、及び図１１、図１２を参照されたい）。本明細書中に記載の表面及び採取方法は、幹細胞以外の細胞に対して使用することができる。
【００５９】
細胞選別のための抗ＭＵＣ１＊抗体
精製：
多能性幹細胞の純粋集団を細胞の混合集団から精製することができる。大量の幹細胞の成長によって、自発的に分化した幾つかの幹細胞を生成することができる。したがって、所望の多能性細胞を捕捉し、分化した細胞を捨てる（disgarding）ハイスループット（throughout）方法が必要とされる場合がある。ＭＵＣ１＊は、細胞が分化を開始する際にＯＣＴ４より前に失われる多能性の細胞表面マーカーである。多能性（ＭＵＣ１＊陽性）幹細胞の純粋集団は、抗ＭＵＣ１＊抗体で誘導体化されたカラム上にそれらを捕捉することによって混合集団から単離することができる。一方で、ＭＵＣ１＊アフィニティーカラムは、奇形腫形成のリスクを減らすために分化した細胞からＭＵＣ１＊陽性細胞を除去するよう移植の前に使用される。
【００６０】
多くの場合、幹細胞と前駆細胞とをそれらの分化段階に応じて分離することが望ましい。本発明者らは以前、多能性幹細胞が短縮ＭＵＣ１＊形態を提示するが、完全長ＭＵＣ１タンパク質を提示せず、分化が開始すると、ＭＵＣ１の切断が停止し、細胞がほとんどＭＵＣ１＊陰性で、完全長形態に陽性となることを示した。完全長ＭＵＣ１のタンデムリピート単位に結合する多くの抗体、例えば市販のＶＵ４Ｈ５抗体又はＨＭＰＶ抗体が利用可能である。ＭＵＣ１の成長因子受容体形態であるＭＵＣ１＊への切断は、これらの部分を細胞表面から放出させるため、タンデムリピートに対する抗体がＭＵＣ１＊を染色しなくなる。ＰＳＭＧＦＲ配列はＭＵＣ１及びその短縮形態（ＭＵＣ１＊）の両方に存在するが、ＰＳＭＧＦＲ配列に対する抗体は、エピトープが隠されているため完全長ＭＵＣ１に結合しない。図１５Ａ〜図１５Ｌは、分化を開始する前及び続いてその後のＨ９ヒト胚性幹細胞の免疫細胞化学的（ＩＣＣ）染色の写真を示す。完全ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体は、未分化のコロニーのほぼ全ての細胞を染色した。幹細胞の多能性の最も基準となる指標であるＯＣＴ４は、抗ＭＵＣ１＊（抗ＰＳＭＧＦＲとも呼ばれる）抗体染色と正確に共局在化した（図１５Ａ、図１５Ｂ）。ＭＵＣ１完全長の遠位タンデムリピートに結合するＶＵ４Ｈ５抗体は、未分化の細胞のいずれも染色しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、これらの同じ細胞を、１４日間ｂＦＧＦを控えて分化させると、逆のＭＵＣ１パターンが観察された。ＭＵＣ１＊染色又はＯＣＴ４染色は観察されなかったが（図１５Ｄ、図１５Ｅ）、全ての細胞が完全長ＭＵＣ１に陽性であると染色された（図１５Ｆ）。同様に、未分化の幹細胞がＮＭ２３に陽性であると染色され、ＭＵＣ１＊及びＮＭ２３のリガンドがＭＵＣ１＊（図１５Ｇ〜図１５Ｉ）及びＯＣＴ４（図１５Ｊ〜図１５Ｌ）と正確に共局在化した。切断酵素ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６及びＡＤＡＭ−１７はＭＵＣ１の切断に関与していた。これらはまた、未分化の幹細胞上でＭＵＣ１＊と共局在化する（Hikita et al, PLoS ONE, 2008）。
【００６１】
したがって、任意でＮＭ２３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６、ＡＤＡＭ−１７及びＯＣＴ４に対する抗体を含む他の抗体と組み合わせた抗ＭＵＣ１＊抗体を使用して、多能性幹細胞を混合プールから同定し、単離することができる。ＳＳＥＡ３／４又はＴｒａ １−８１／１−６０に対する抗体も、多能性幹細胞を同定するために抗ＭＵＣ１＊抗体とともに使用することができる。未分化の幹細胞及び分化した幹細胞のプールは、ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する抗体及び短縮される際に放出されるＭＵＣ１の部分に結合する抗体で染色することができる。次いで、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）等の標準的な細胞分離方法を用いて、ＭＵＣ１＊提示細胞をこのタンパク質の完全長形態を提示する細胞から分離することができる。場合によっては、分化したこれらの幹細胞を多能性のままである細胞から除去することが望ましい。他の場合では、多能性（ＭＵＣ１＊陽性）のままであるこれらの幹細胞を除去することが、これらが宿主に移植した場合に奇形腫形成のリスクを増大させる可能性があることから望ましい。抗ＭＵＣ１＊抗体、すなわち抗ＰＳＭＧＦＲ抗体とＮＭ２３抗体との組み合わせも、多能性幹細胞を同定し、更にＭＵＣ１＊刺激によって展開させることのできるこれらの前駆細胞を同定するために使用することができる。
【００６２】
がん幹細胞選別による枯渇
がん細胞は化学療法薬に対する耐性を獲得した場合にＭＵＣ１＊の発現を増大させるが、ＭＵＣ１完全長の発現は増大させない。化学療法に対する耐性を有するこれらの細胞は、がん幹細胞とも呼ばれる。したがって、任意でＮＭ２３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６、ＡＤＡＭ−１７及びＯＣＴ４に対する抗体を含む他の抗体と組み合わせた抗ＭＵＣ１＊抗体を使用してがん幹細胞を同定することができる。本発明の一実施形態では、抗ＭＵＣ１＊抗体及びこれらの他の抗体の組み合わせを使用して、患者、例えば患者の血液からがん幹細胞を枯渇させる。
【００６３】
ＦＡＣＳ及びヒト幹細胞の成長
本発明は、抗ＭＵＣ１＊抗体、又はＮＭ２３若しくはＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ又は二量化を優先させる他の突然変異体を使用して、ＭＵＣ１の短縮形態（ＭＵＣ１＊）を発現する前駆細胞の成長を刺激し、その分化を阻害することを更に開示する。ＭＵＣ１の切断は幹細胞が分化を開始すると停止するが、切断は後の段階で再開する。造血幹細胞（ＨＳＣ）は例えば、短縮形態であるＭＵＣ１＊を発現し、細胞をＭＵＣ１＊二量化剤に曝露することによって増殖させることができる。造血幹細胞は幹細胞であるとみなされる場合、ＣＤ３４陽性かつＣＤ３８陰性である。造血幹細胞は次の分化段階に進むと、ＣＤ３４陽性かつＣＤ３８陽性になる。臍帯血からヒトＨＳＣを得て、最小幹細胞培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において様々な濃度で培養した。細胞を１１日間、プレーティング後５日目に新たな抗体を添加して培養した。細胞を分析し、ＦＡＣＳによって選別した。図１６Ａ及び図１６Ｂ、実施例１８は、造血幹細胞のままであった細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）の数が、抗ＭＵＣ１＊濃度の増大に伴って増加したことを示している。一方で、次の前駆体段階へと進んだ細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）の数は、抗ＭＵＣ１＊濃度が減少するとともに増加した。これらの結果から、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の刺激がＨＳＣの分化を阻害したことが示される。
【００６４】
造血は胎児及び発達早期（early life）の肝臓において起こる。ヒト胎児肝細胞を、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのＰＳＭＧＦＲ配列に結合する抗体、及び完全長ＭＵＣ１のタンデムリピート単位に結合する市販の抗体であるＶＵ４Ｈ５を用いてＦＡＣＳ選別した。図１７ＢのＦＡＣＳスキャンは、胎児肝細胞の大半がＭＵＣ１＊陽性かつ完全長陰性であることを示している。ＭＵＣ１＊陽性胎児肝細胞を単離し、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において成長させることによって展開させた。図１８のグラフは、胎児肝細胞の成長が最適抗ＭＵＣ１＊抗体濃度で大きく増大することを示している。抗体が過剰になり、各々２つの受容体に１つの抗体が結合するのではなく、各々の受容体に１つの抗体が付着すると成長は低下する。同様に、未分化幹細胞を分化した細胞から、ＦＡＣＳ又は完全長ＭＵＣ１タンパク質のＰＳＭＧＦＲ領域若しくは遠位部分に結合する抗体等の結合剤を使用する他の分離技術によって分離することができる。
【００６５】
他のタイプの細胞がＭＵＣ１の短縮形態を提示することがあり、ＭＵＣ１タンパク質のＰＳＭＧＦＲ部分を認識する抗体が細胞に結合するか否かに基づいて細胞集団から単離するか、又は枯渇させることができる。
【００６６】
捕捉、成長、放出、選別の組み合わせ
場合によっては、成長期間前、成長期間中又は成長期間後に或る細胞型を別の細胞型から分離することが望ましいことがある。一方法では、表面の各々の空間アドレスが異なるリガンドを提示し、その各々が異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する。細胞を表面に添加し、親和性相互作用によって各々の細胞型の表面上のマーカーに応じて空間的に分離する。分離した細胞は、個々に採取して別個の位置で培養するか、又は混合物として培養した後、位置によっては後で採取することができる。一方法では、異なる様式の付着を用いて、異なるマーカーに特異的なリガンドを付着させる。例えば、或る位置で、多能性細胞のマーカーであるＭＵＣ１＊に対するリガンドをヒスチジンタグ／ＮＴＡ−Ｎｉ相互作用によって表面に付着させて、別の位置で、外胚葉系列に沿って分化する細胞のマーカーに対する抗体をプロテインＧによって表面に付着させる。このようにして、未分化の細胞をイミダゾール（imidzole）の添加によって放出させて、外胚葉細胞を過剰のＦｃの添加によって放出させる。別の方法では、各々が異なる親和性リガンドを提示する２つ以上の表面が別個の位置に収容される。２つ以上の表面はフローチャネルによって接続される。一実施形態では、細胞の混合物を、表面が提示するリガンドの同種分子を発現する細胞を捕捉する第１の表面に導入する。次いで、その上清又はフロースルーを、その表面への結合を容易にする同種細胞表面分子を提示する細胞を捕捉する第２の表面に導入する。次いで、その上清又はフロースルーを、所望の細胞型が空間的にアドレス可能な表面によって捕捉されるように第３の表面等に導入する。この方法を使用して、細胞をタイプによって分離するか、又は細胞を分離し、次いで成長させる。フローチャネル及びバルブを、細胞分離の期間中にフローを流すが、その後特定のタイプの細胞をその特定のタイプの細胞に最適な条件下で培養することができるように限定して使用することができる。
【００６７】
本発明の方法は、成長プロセス中に分化を受ける可能性のある細胞の分離に好適である。各々が特定の分化状態のマーカー又は細胞型に対する親和性リガンドを提示する混合表面を含むシステムを、分化状態に応じて子孫を選別する動的システムにおいて使用する。細胞を初めに、別の分化状態にある細胞又はその子孫によってもはや発現されない初期分化状態のマーカーであるそれらの細胞表面タンパク質の１つの相互作用によって第１の表面に付着させる。このようにして細胞は放出されるが、この場合、細胞はその新たな分化状態を規定する細胞表面マーカーに対して親和性を有するリガンドを提示する新たな位置に移動する。この選別は新たな表面への上清の導入、又は自己選別によって地理的に、例えばフローチャネル内の位置で行うことができるが、ここでは細胞が或る位置（粒子であり得る）から放出され、第２の位置（隣接する粒子であり得る）に移動し、そこで異なる細胞マーカーに対する親和性リガンドが固定化される。一実施形態では、異なる親和性リガンドを提示するビーズ又は粒子を混合するが、細胞は表面上に同種分子を提示するビーズ／粒子に付着する。この場合、ビーズ又は粒子は細胞付着後のそれらの選別を可能にする性質を有する。例えば、ＣＤ３４＋／３８−造血幹細胞に対して親和性を有するリガンド（複数も可）を提示する電磁ビーズを、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋前駆細胞に対して親和性を有するリガンド（複数も可）を提示する非電磁ビーズと混合する。細胞培養の後、ＣＤ３４＋／３８−細胞を担持するビーズを磁気的に単離して回収するが、残りのビーズはＣＤ３４＋／３８＋細胞の集団を含む。代替的には、空間的位置、ビーズ又は粒子には、精製のために他の表面によって捕捉され得る部分が付着していてもよい。一例としては、親和性リガンド及び精製リガンドを提示するビーズは、親和性リガンドと同種細胞表面受容体との間の相互作用によって所望の全ての細胞型を捕捉する。精製リガンドは、精製リガンドと第２の表面上の部分との結合によってビーズを特異的空間アドレスに付着させる。本発明は、この方法を使用して混合プールから様々な分化段階にある細胞を選別することを含む。本発明は、この方法を使用して、細胞が多能性であるように誘導され、或る特定の幹様の性質を有するこれらの細胞を多能性誘導プロセス中の様々な時点で選択して増幅することが望ましい細胞培養状況において細胞を選別することを含む。
【００６８】
代替的方法においては、細胞を異なる細胞型に特異的なリガンドを提示する粒子上への固定化によって分離する。細胞の混合物を粒子の混合物に導入する。細胞は、その細胞表面分子に対して親和性を有するリガンドを提示する粒子上で分離される。次いで、細胞を担持する粒子を分離した後に培養しても、又は全てをまとめて培養してから成長期間後に分離してもよい。細胞を担持する粒子は、粒子自体の性質又は粒子に付着したリガンドの性質に基づく様々な手段によって分離される。例えば、粒子はサイズ、電荷、密度、光学的性質、電磁的性質等に基づいて分離することができる。これらの性質は粒子自体の固有の性質であっても、又は付着したリガンドの性質であってもよい。例えば、粒子自体が蛍光性であっても、又は粒子に付着したリガンドが蛍光性であってもよい。粒子は磁気特性、帯電特性、蛍光特性又は電子特性を含むが、これらに限定されない性質によって容易に分離される。代替的には、第２の親和性リガンドを担持するリガンドを提示する粒子を使用することができる。この場合、粒子は細胞の付着を容易にするリガンドを担持することに加えて、細胞を担持する粒子の付着を容易にし、表面又は位置を分離する部分も担持し得る。
【００６９】
本発明の別の態様では、１つの表面が異なる機能性を有する２つ以上の異なるリガンドを提示する。場合によっては、２つ以上のリガンドは、特異的な細胞への付着について単一のリガンドよりも選択的である。別の例では、第１のリガンドが細胞の付着を媒介し、第２のリガンドが別の表面又は別の位置であってもよい特異的位置に細胞／表面複合体を標的化する。このようにして、特異的な細胞型を捕捉するリガンドを担持する物品又は粒子である表面は、第２の表面又は位置への付着によって非標的細胞から精製することができる。他の場合においては、成長期間前、成長期間後又は成長期間中に細胞をタイプに応じて分離する能力を更に有する２つ以上の異なる細胞型を捕捉することが望ましいこともある。これは、特異的細胞型の付着を容易にする第１のリガンド、及び表面を特異的位置に標的化する第２のリガンドを提示する表面又は粒子を使用することによって達成される。標的化リガンドは、実体に異なる位置で結合することによって粒子を標的化する化学的部分又は生物学的部分であり得る。代替的には、標的化リガンドは、粒子を他の粒子から分離可能とする或る特定の性質を粒子に付与する実体であり得る。例えば、リガンドは蛍光部分、色素、荷電部分、又は光学的性質若しくは電磁的性質を有する部分であり得る。本発明の別の態様では、標的化リガンドはリガンド自体ではなく、むしろ粒子の特異的性質である。
【００７０】
本発明の表面及び新規の成長因子は、ウェーブバッグ、ローラーボトルを含むが、これらに限定されない様々なフォーマットでの幹細胞、前駆細胞及び他のＭＵＣ１＊陽性細胞の成長、懸濁液中での成長に使用すること、並びに生きた宿主を含む任意のタイプの格納容器内で使用することが想定される。格納容器は容器への細胞の接着を防止するために運動が維持される。表面に固定化されたリガンドと細胞上のそれらの同種標的との間の相互作用により、細胞を喪失することなく培地の交換が可能になる。細胞を採取するか又は枯渇させることが所望される場合、粒子であり得る表面は、遠心分離、重力、電磁場又は電場によって単離することができる。作用物質を添加して細胞を表面から放出させてもよい。過剰の親和性リガンドを、それらが細胞表面上の受容体への結合について競合し、それにより細胞が粒子から放出されるように溶液中に遊離させて添加することができる。一実施形態では、親和性リガンドが抗体である場合、抗体を粒子から放出させる働きをする抗体のＦｃ部分が過剰に添加され、細胞＋活性化リガンドが溶液中で遊離する。別の実施形態では、リガンドはＮＭ２３又はその突然変異体である。
【００７１】
本発明は、四量体及び六量体の形成を優先させるＮＭ２３野生型又は突然変異体を使用して、幹細胞、前駆体又は幹様となるように誘導される細胞の分化を、核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はタンパク質の導入によって誘導することを更に開示する。
【００７２】
本発明は、幹細胞及び幹様細胞の分化を誘導する方法も含む。ＭＵＣ１＊とその二量化リガンドとの相互作用を遮断するリガンドが分化を誘導する。例えば、ＮＭ２３とＭＵＣ１＊細胞外ドメインとの相互作用を遮断するＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの配列を十分に含有するペプチドの添加は、分化を誘導する。同様に、低濃度の抗ＭＵＣ１＊抗体のＦａｂ（一価）の添加は、多能性を促進し、分化の開始をもたらす受容体二量化（dimeirization）を防止する。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド又はＭＵＣ１＊に結合する抗体のＦａｂを培養培地に添加するか、又は表面に付着させることができる。次いで、幹細胞を採取し、抗ＭＵＣ１＊ＦａｂのＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド等のリガンドを提示する表面上に再プレーティングして、分化を誘導することができる。マイクロＲＮＡ １４５（ｍｉＲ−１４５）は、ＭＵＣ１を抑制し、その際に分化を誘導する。ｍｉＲ−１４５を培養中の幹細胞及び前駆体に添加して、分化を促進することができる。対照的に、ｍｉＲ−１４５に特異的なｓｉＲＮＡ等のｍｉＲ−１４５の阻害剤を添加して、幹細胞及び幹様細胞を成長させて、それらの分化を阻害することができる。
【００７３】
リガンド−ポリマー成長表面：
ポリマー又はデキストリン若しくはシクロデキストラン等の高分子への本発明のリガンドの付着は、標的幹細胞及び前駆細胞を捕捉し成長させるそれらの能力を大きく改善する。得られる表面は溶液中のリガンドを模倣する。タンパク質及び抗体の両方のシクロデキストランへの共有結合的付着は、リガンドを表面上に直接的に吸着させた場合と比較して、細胞接着を増大させて、必要とされるリガンドの量を大きく減少させた。シクロデキストランに連結したＮＭ２３又は抗ＭＵＣ１＊等のリガンドは、培地中の更なる成長因子を必要とすることなく、最小培地中の胚性幹細胞の成長を支持した。抗体並びに抗ＭＵＣ１＊及びＮＭ２３等の同種タンパク質は、他のポリマー並びに多孔質膜及び足場を含む他の表面に付着することができる。本発明は、構造化された表面及び構造化されていない表面の両方を含む。例えばステント、耳等の人工構造を、幹細胞及び前駆細胞の付着を容易にする生物学的作用物質及び／又は化学的作用物質でコーティングすることができる。これらのリガンドは任意で、幹細胞又は前駆細胞に、それらの成長及び／又は分化に影響を与える栄養素又はシグナルを提供し得る。
【００７４】
合成抗体成長表面：
本発明は、細胞成長培地、更には細胞の付着を容易にする表面コーティングへの成長因子のような合成リガンドの使用も意図する。例えば、細胞表面タンパク質に結合する小分子は、標準的なスクリーニング方法を用いて容易に同定される。本発明者らは、ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン、特にＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する小分子を以前に開示した。これらの合成分子を続いて、非接着性細胞（幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＭＵＣ１＊を発現する造血幹細胞のような初期前駆体等）の吸着及び成長のために表面に非共有結合的又は共有結合的に付着させることができる。合成リガンドが二量化によって活性化される成長因子受容体に結合する場合、小分子の活性化二量体は２つの小分子を共有結合的に結び付いて二量体とすることによって作製することができる。好ましい実施形態では、小分子はＰＳＭＧＦＲペプチドに結合し、小分子はそれらが二量体となり、人工成長因子として機能するように成長因子受容体に結合する。本発明の別の態様では、小分子の単量体を、それらが二量体として振舞うのに十分なほど接近するように表面に付着させることができる。すなわち、表面は、小分子が受容体を活性化する確定された配置で細胞表面受容体に提示されるようにリンカーとして働く。これらの小分子二量体は、例えば、成長培地に添加する、表面に吸着又は共有結合的に付着させる等の天然の成長因子と同じ方法で使用することができる。合成表面はａ）より安価に製造され、ｂ）長期の保管が可能であり、及びｃ）分解に影響されない可能性がある。本発明者らは、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインに高い親和性をもって結合する小分子を以前に記載した。抗ＭＵＣ１＊抗体を模倣する小分子二量体（二価）は、小分子をリンカーに連結することによって合成される。合成抗体は、プレート表面に直接的に又はポリマーコーティングを介して固定化することができる。
【００７５】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される実施形態に加えて、本発明の様々な変更形態が、以上の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。以下の実施例は限定としてではなく、本発明の例示として与えられる。
【実施例】
【００７６】
実施例１．マトリゲルに付着させて、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した多能性幹細胞は、ｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地を添加した場合の成長よりも分化せずにより速く増殖する
Ｈ９ ｈＥＳＣ（WiCell）又はＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）を、６ウェルプレート（BD Falcon）においてマイトマイシンＣ不活性化Ｈｓ２７ヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ）上、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。ｈＥＳＣ培養培地は、２０％ノックアウト血清代替物、１％非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（全てInvitrogen製）及び４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Peprotech）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉからなるものであった。細胞を５日〜７日毎に１：３の比率で手作業で解離することによって継代し、培地を４８時間毎に交換した。幾つかの実験においては、ｈＥＳＣを、３０％Ｈｓ２７馴化培地及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したｈＥＳＣ培養培地を有するマトリゲル（BD Biosciences）上で成長させた。抗ＭＵＣ１＊を添加した他の実験においては、馴化培地及びｂＦＧＦは除外した。これを「最小培地」（ＭＭと略される）と称する。
【００７７】
図１は、抗ＭＵＣ１＊で処理したヒト幹細胞コロニーのＯＣＴ４免疫蛍光を示す。Ｈ９細胞をトリプシン解離し、マトリゲルでプレコーティングした８ウェルチャンバースライドに４×１０４細胞／ウェルで播種した。５週間１日おきに培地を交換し、抗体を二価抗ＭＵＣ１＊について１μｇ／ｍｌという最終濃度で添加した。細胞をＯＣＴ４特異的抗体（Santa Cruz、クローンＨ−１３４及びクローンＣ−１０）及びＤＡＰＩで染色した。
【００７８】
図１は、５週間の成長の後、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した場合にヒト胚性Ｈ９幹細胞が１００％の多能性をもって（pluripotently）成長したことを示している。最小培地＋ｂＦＧＦ及びフィーダー細胞に由来する３０％馴化培地を供給したこと以外は同様に成長させた細胞は、増殖がより小さく、より分化していた。核のＤＡＰＩ染色と多能性細胞を特定するＯＣＴ４染色とを比較されたい。点線は未分化の部分の境界を示している。
【００７９】
実施例２．マトリゲル上で抗ＭＵＣ１＊において培養した多能性幹細胞は、安定な核型を維持し、正常に分化する
ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ ｈｕ ＥＳ細胞（Invitrogen）をマトリゲル上にプレーティングし、最小培地（実施例１を参照されたい）＋ウサギポリクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体（ＳＲＹ ２ａ）において、８０ｎｇ／ｍｌで６ヶ月間にわたって１８継代の間培養した。細胞をペレット化し（pelleted）、ＤＮＡ抽出し、核型分析を外注した。図２は、１８回の継代の終了時の核型が変化しなかったことを示している。この幹細胞株は三染色体（tri-somal）異常を有するが、核型が安定であり、抗ＭＵＣ１＊において他の成長因子の非存在下で培養することによって変化しなかったことは妥当であることに留意されたい。
【００８０】
複数回継代したＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ細胞のこの同じバッチから、未分化の幹細胞をコラゲナーゼで処理することによって採取した後、最小培地中に懸濁し１４日間置いた。この期間中、分化を促進するために抗ＭＵＣ１＊抗体を取り除くことに留意されたい。これによって細胞が胚様体（embroid bodies）を形成するが、これをゼラチン上にプレーティングし７日間置いた後、３つの生殖系列のマーカーを認識する抗体で染色した：図３Ａ）細胞はＯＣＴ４陰性であり、分化したことが示された；図３Ｂ）内胚葉のマーカーであるαフェトプロテインに陽性であった；図３Ｃ）外胚葉のマーカーであるネスチンに陽性であった；及び図３Ｄ）中胚葉生殖系列のマーカーである平滑筋アクチンに陽性であった。
【００８１】
実施例３．多能性幹細胞の成長を促進する表面
ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインに結合し、それを二量化するリガンドを提示する表面は、プレート表面に接着する方法を多能性幹細胞に提供し、更にＭＵＣ１＊の成長因子受容体機能を活性化する。細胞培養フラスコ、ペトリ皿又はマルチウェルプレートを、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの配列：GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体でコーティングした。直前に与えられた配列に結合する抗体は、本明細書中では抗ＭＵＣ１＊抗体又は抗ＰＳＭＧＦＲ抗体と称される。組織培養処理した及び裸のプラスチックプレート及びポリスチレンプレートを使用した。
【００８２】
一例においては、抗ＭＵＣ１＊抗体（Zymed: custom antibody service）を、９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）のウェルに３０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ又は３００ｕｇ／ｍｌ添加し、４℃で一晩吸着させた。未分化のＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）幹細胞を最小培地中に懸濁した。最小培地は４００ｍｌのＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（Invitrogen＃１０５６５−０１８、１００ｍｌのノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃１０８２８−０２８）、及び５ｍｌの１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃１１１４０−０５０）、及び０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）のβ−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃２１９８５−０２３）である。ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ幹細胞を、抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上に１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。細胞を２４時間付着させた。次いで、細胞を最小培地単独において培地を４８時間毎に交換しながら５日間培養した。
【００８３】
比較のために、対照ウェル中の細胞を、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞に由来する３０％馴化培地を添加した培地中で培養した。図４は、生細胞からの蛍光をこれらの細胞を成長させた表面上での抗ＭＵＣ１＊抗体密度に応じて測定する、カルセインＡＭ（分子プローブ）染色によるグラフを示す。図４のグラフは、抗ＭＵＣ１＊表面上で成長させた細胞が他の任意の成長因子の非存在下で増殖することを示している。成長はｂＦＧＦ及びフィーダー細胞から分泌された特性化されていない因子の添加によって緩やかにしか向上しない。陰性対照として、無関連抗体を表面上にプレーティングした。これらの表面上にプレーティングした幹細胞は接着せず、浮遊しているか又は２４時間の付着期間の終了時までに死滅していた。
【００８４】
並行して、得られた幹細胞をＤＡＰＩ（核染色剤）及び抗ＯＣＴ４で二重染色した。ＯＣＴ４陽性とＤＡＰＩ染色との１：１の相関から、得られる細胞が多能性であったことが確認される（図５を参照されたい）。
【００８５】
実施例４．ヒト多能性幹細胞は、ＭＵＣ１＊刺激因子を溶液中に添加した又は添加していない抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で増殖する
ヒト胚性幹細胞株を、組織培養処理プレート、ポリスチレンプレート又はチャンバースライドプレートのいずれかに吸着させた抗ＭＵＣ１＊抗体上で成長するその能力について試験した。１００ｕｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊をプレート上に吸着させて、４℃で一晩吸着させた。未分化のヒトＨ９胚性幹細胞を９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００００細胞若しくは４００００細胞、又は８ウェルプレートの１ウェル当たり２５０００細胞でプレーティングした。いずれの場合においても、未分化の幹細胞を抗ＭＵＣ１＊表面上で付着及び増殖させて、最小培地単独において又は最小幹細胞成長培地に抗ＭＵＣ１＊を添加して培養した。次いで、未分化のＨ９幹細胞をＡ）最小培地、Ｂ）最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又はＣ）最小培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地において培養した。実験は３連で行った。未分化の幹細胞が抗ＭＵＣ１＊表面に接着した。未分化のコロニーは、抗ＭＵＣ１＊抗体を最小培地に更に添加した場合に最も速く成長した。しかしながら、同様の形態及び品質の未分化幹細胞コロニーが、最小培地単独において培養したウェル内に一両日中に展開した。未分化の（undiffereniated）幹細胞コロニーの増殖量及び品質は、細胞を最小培地、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊、又は最小培地＋ｂＦＧＦ及び線維芽細胞に由来する馴化培地のいずれで培養したかに関わらず同程度であった。多能性幹細胞が得られ、５日目〜７日目に分割することができたが、これは標準的なフィーダー細胞、ｂＦＧＦプロトコルに従って成長させた幹細胞に典型的である。図６は、異なる培地：６Ａ）最小培地、６Ｂ）最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又は６Ｃ）最小培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地において培養した場合の成長させたウェルの写真を示す。１と付されたパネル（例えばＡ１、Ｂ１、Ｃ１）は、３日間の成長後に撮影した写真であり、Ａ２、Ｂ２及びＢ３は７日目に撮影した同じウェルの写真である。
【００８６】
実施例５．幹細胞を採取する方法
上記実施例４で成長させた幹細胞は、７日目に採取及び分割することが可能な状態であった。細胞は抗ＭＵＣ１＊表面上に固定化されているため、プレート表面上の抗ＭＵＣ１＊抗体への結合について細胞表面受容体と競合するペプチドを添加することによって放出させることができると推論した。配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するペプチドは、ＭＵＣ１＊受容体の細胞外ドメインに相当し、抗ＭＵＣ１＊抗体が産生されるペプチドでもあったが、本明細書中ではＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド又はＰＳＭＧＦＲペプチドと称される。ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドを成長幹細胞に１０ｕＭの濃度で添加し、３０分間インキュベートした。その時点で、幹細胞が表面から放出されていることが観察された。上清中の幹細胞を回収し、すすいで、新たな抗ＭＵＣ１＊表面上に再プレーティングし、そこで細胞を接着させ増殖を続けた。この手順は、ヒト胚性幹（ｈｕＥＳ）細胞株ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）、続いてｈｕＥＳ Ｈ９を使用しても首尾よく行われた。図６Ｄは、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で成長させて、単一細胞から培養し、次いで競合ペプチドを用いた放出によって採取し、新たな抗ＭＵＣ１＊表面上に再プレーティングし、そこで増殖を続けたＨ９幹細胞を示す。
【００８７】
実施例６．β−シクロデキストリンに連結した抗ＭＵＣ１＊抗体は、ＭＵＣ１＊成長因子と細胞表面受容体との溶液相互作用を刺激する
抗ＭＵＣ１＊抗体を、標準的な連結プロトコル（Fraschini, C.; Vignon, M.R. Selective oxidation of primary alcoholgroups of β-cyclodextrin mediated by 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxylradical (TEMPO). Carbohydrate Research 2000. 328(4):585-589）に従ってカルボキシ−β−シクロデキストリン（Ｃβ−ＣＤ）に共有結合的に連結した。９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）を、β−シクロデキストリンに連結した抗ＭＵＣ１＊によって０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ、３００ｕｇ／ｍｌ又は１０００ｕｇ／ｍｌの最終抗体濃度でコーティングした。各々のウェル内のβ−シクロデキストリン濃度は一定に維持し、抗体濃度のみを変化させた。対照として、抗ＭＵＣ１＊抗体をシクロデキストリンなしにプレート上に直接吸着させた。ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ幹細胞の単一細胞懸濁液を作製し、細胞を１００００細胞／ウェルの密度で最小培地中にプレーティングした。幹細胞は抗体表面とシクロデキストリン表面に連結した抗体との両方に付着し、その上で増殖した。他の成長因子は添加しなかった。プレーティングの２日後、生細胞をカルセインＡＭ試薬によってアッセイした。図７のグラフは、最小培地における幹細胞成長がβ−シクロデキストリン上に提示される抗ＭＵＣ１＊抗体によって支持され、おそらくは成長細胞への抗体の３次元提示のために、必要とされる抗体量が培養プレート上に吸着した裸の（naked：ネイキッド）抗体より少ないことを示している。
【００８８】
実施例７．任意の細胞表面抗原に対する抗体は幹細胞を表面に付着させて、従来の手段によって又は抗ＭＵＣ１＊抗体を最小培地に添加することによって培養した場合に増殖する
ＳＳＥＡ４抗体、Ｔｒａ １−６０抗体及びＴｒａ １−８１抗体は、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した場合に多能性幹細胞の成長を促進する。９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）を、抗ＳＳＥＡ４抗体（Santa Cruz）、抗Ｔｒａ １−６０抗体（Santa Cruz）又は抗Ｔｒａ １−８１抗体（Santa Cruz）を用いて、滅菌ＰＢＳ中０ｕｇ／ｍｌ、３ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌの最終濃度、４℃で、別個に３連でコーティングした。翌日、細胞をＰＢＳですすいだ。マトリゲル上で成長させて、最小幹細胞成長培地＋線維芽細胞に由来する３０％馴化培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにおいて培養したＢＧ０１ｖ／ｈＯＧヒト胚性幹細胞（Invitrogen）を使用して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞を各々のウェルの最小培地中に１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。翌日、培地をウェルから除去し、最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体に置き換えた。培地を１日おきに交換し、細胞をカルセインＡＭ試薬によってアッセイした。図８は、幹細胞が表面に細胞表面タンパク質及びその同種抗体との相互作用によって付着することができ、次いで最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において、又は任意の標準的な幹細胞成長培地を用いて培養することができることを示している。
【００８９】
同様に、未分化のＨ９幹細胞を、抗ＳＳＥＡ４抗体を予め吸着させた（１００ｕｇ／ｍｌ）９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。幹細胞を最小幹細胞成長培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体において８日間培養した。未分化の幹細胞コロニーが展開及び増殖した。
【００９０】
実験を並行して行ったが、それによりＨ９ヒト胚性幹細胞が、９６ウェルプレート及び１２ウェルプレートの表面上に吸着した抗ＳＳＥＡ４及び抗Ｔｒａ １−８１に結合したことが示された。次いで、細胞を、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地を含有する標準的な幹細胞成長培地、又は最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又は最小培地＋８ｎＭの組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて培養した。いずれの場合においても、標準的な方法によって成長させた形態学的に同一な幹細胞コロニーである未分化の幹細胞コロニーが形成された。無関連抗体で抗ＭＵＣ１＊抗体を置き換えるか、又は細胞を最小培地単独において培養した場合、幹細胞は約１日以内に死滅した。
【００９１】
実施例８．ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドの添加は分化を誘導する
フィーダー細胞、マトリゲル又は成長表面上で成長する未分化のヒト幹細胞は、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドを添加することによって迅速に分化を誘導することができる。このペプチドは、ＭＵＣ１＊成長因子受容体への結合について天然リガンドと競合する。天然リガンドとＭＵＣ１＊との相互作用は多能性細胞の成長を促進する。この相互作用を遮断することで、多能性幹細胞の成長が阻害され、細胞の分化が誘導される。マトリゲル上で成長するＨ９幹細胞は、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドによる処理後に約３倍速く分化した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを使用して、ＭＵＣ１＊のリガンドをコーティングした表面から幹細胞を採取することができる。分化速度の増大は、採取した細胞を抗ＭＵＣ１＊と共にインキュベートし、競合させてペプチドを取り除き、続いてすすいで再プレーティングすることによって阻止された。
【００９２】
実施例９．最小培地中のＮＭ２３は、ヒト幹細胞の培養について、現行の技術水準のｂＦＧＦ＋ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地と同等である
未分化のＨ９ヒト胚性幹細胞を手作業での解離によって採取した。１辺がおよそ０．１ｃｍのコロニー片を最小培地中に混合し、製造業者の指示に従って幹細胞品質のマトリゲルでコーティングした２４ウェルプレート上に均一に分散させた。未分化のコロニー片を、６ウェルプレートの３つのウェルから２４ウェルプレートに移した。最小培地（ＭＭ）中４ｎＭ又は８ｎＭの濃度の組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（優先的に二量体を形成する突然変異体）を、現在は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）＋不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地（ＣＭ）である現行の技術水準と比較した。新たにプレーティングした細胞をｂＦＧＦ／ＣＭで最初の２４時間、続いてＭＭ中のＮＭ２３に替えて処理することの影響も試験した。４日間の培養の後、分化したコロニーに対する未分化のコロニーの数を計数した。結果を図９中にグラフ化する。対照と付されたバーは、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％ＣＭにおけるマトリゲル上での標準的な培養方法を指す。グラフは、１）ＮＭ２３＋ＭＭ中で成長する細胞がｂＦＧＦ＋ＣＭよりも速く成長したこと、２）ＮＭ２３＋ＭＭが現行の技術水準よりも分化が少なかったこと、３）最初の２４時間のｂＦＧＦ＋ＣＭの添加が、ＮＭ２３＋ＭＭ中で直接培養したものよりわずかに悪かったこと、及び４）この傾向が最高濃度のＮＭ２３（８ｎＭ）で最も良好であったと示されるように思われることを示している。
【００９３】
細胞を５日目に分割して、マトリゲル上に再プレーティングした。次の５日間、細胞を４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ又は６４ｎＭで培養した。結果から、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの濃度の増大がより良好に作用したことが示される。１６ｎＭ及び３２ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇによって、ｂＦＧＦ＋ＣＭ対照とほぼ同じ数及び品質の未分化のコロニーが産生された。１６ｎＭでは、各々のウェルは４つ又は５つのコロニーを生じ、そのうち１つのみが分化していた。３２ｎＭのウェルは各々合計して３つのコロニーを生じ、１つが部分的に分化していた。ｂＦＧＦ＋ＣＭ対照は２つの未分化のコロニーを産生し、一方のウェルでは１つが部分的に分化しており、他方のウェルでは１つが未分化で、２つが完全に分化していた。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇによって、ｂＦＧＦ／ＣＭよりもはるかに大きなコロニーが産生された。
【００９４】
実施例１０．シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊＋抗ＭＵＣ１＊又はシクロデキストランに連結したｂＦＧＦ−抗ＭＵＣ１＊抗体は、伝統的な培地又は最小培地＋ＭＵＣ１＊刺激因子において幹細胞の付着及び成長を促進する
標準的な方法によってＨＳ２７線維芽細胞、続いてマトリゲル上で２継代の間成長させたヒト胚性Ｈ９幹細胞を、実施例９に記載されるように手作業で解離させて、採取した。６ウェルプレートの２つのウェルからの未分化コロニー片を、シクロデキストランに共有結合的に連結した抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングした２４ウェルプレートのウェル上で継代した。次いで、細胞を１６０ｎｇ／ｍｌという最終濃度の最小培地中の抗ＭＵＣ１＊抗体、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び５０％ＨＳ２７馴化培地（ＣＭ）において培養した。数時間内に付着した細胞は、成長速度の加速を除いて、フィーダー細胞又はマトリゲル上での成長で期待されるように成長した。細胞はプレーティング後５日目〜６日目に分割することが可能な状態であった。未分化のコロニー片を手作業で採取し、新たなシクロデキストラン−抗ＭＵＣ１＊コーティングプレート上に再プレーティングし、そこで増殖及び未分化コロニーの形成を続けた。細胞数、コロニー形態及び分化の阻害は、抗ＭＵＣ１＊及びｂＦＧＦ＋ＨＳ２７ ＣＭにおいて培養したウェル間で同程度であった。
【００９５】
実施例１１．リガンドをシクロデキストランに連結する方法
デキストランカルボキシル化：
材料：
デキストラン５００（平均分子量５００ｋＤ、Aldrichカタログ＃３１３９２、ロイコノストック種から単離、Sigma-Aldrich、St. Louis、Missouri）、ブロモ酢酸及びＮａＯＨ（Sigma-Aldrich）、Ｉ型Ｈ２Ｏ（RiccaChemical Company、Arlington、Texas）、２００００ＭＷＣＯ透析チューブ又はスライド（Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts）。
【００９６】
手順：
ＮａＯＨの２Ｎ溶液を、Ｉ型Ｈ２Ｏを用いて調製した。清浄な乾燥２０ｍＬ容シンチレーションバイアルに６ｍＬの上記溶液を添加した。これに８３４ｍｇのブロモ酢酸を添加し、溶解させると溶液は濁った。次いで、１．００ｇのデキストラン５００をバイアルに添加し、溶液をボルテックスし、光超音波処理すると、５分以内に完全な溶解が得られた。次いで、この溶液を室温で２４時間攪拌した。次いで、溶液を水道水を流して８時間透析し、その後０．１Ｎ ＨＣｌで１８時間透析し、その後蒸留水で１２時間透析した。次いで、溶液を凍結乾燥して、アルゴン下、−２０℃で保存した。
【００９７】
デキストラン−タンパク質／抗体連結：
材料：
社内で調製したカルボキシル化デキストラン５００、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Sigma-Aldrich）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Sigma-Aldrich）、連結させるタンパク質又は抗体、Ｉ型Ｈ２Ｏ（Ricca Chemical Company）、エタノールアミン（Sigma-Aldrich）。
【００９８】
手順：
０．５ｍｇ／ｍＬのカルボキシル化デキストラン５００のＩ型Ｈ２Ｏ溶液を調製した。１００ｍＭ ＥＤＣ／１００ｍＭ ＮＨＳのＩ型Ｈ２Ｏ溶液を調製した。１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブにおいて、１ｍＬアリコートのデキストラン溶液を１２μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液に添加した。混合物をボルテックスし、室温で１５分間振動させて、カルボン酸残渣を活性化した。一方で、６．６７ｎｍｏｌのタンパク質又は抗体（適切な緩衝液に溶解した）を別個のチューブに等分した。１５分間の活性化の後、１１０μＬの活性化デキストラン溶液を、連結させるタンパク質又は抗体を含有するチューブにピペットで取った。溶液を穏やかにボルテックスして混合した後、チューブを室温で２時間軽く振動させた。５μＬのエタノールアミンをチューブに添加し、室温で更に１５分間振動させた。チューブの内容物をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で４℃で少なくとも１８時間透析した。溶液をそのまま（fresh）使用しても、又は凍結乾燥し、−２０℃で保存した後、使用前に再構成してもよい。
【００９９】
カルボキシル化の最適量及び連結させるタンパク質の濃度は、幹細胞の成長をカルボキシル化及びタンパク質濃度を体系的に変化させた２４個の表面上で試験することによって経験的に決定したことに留意されたい。
【０１００】
実施例１２．Ｈ９幹細胞をシクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊に付着させて、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ又はＨＳ２７馴化培地中のｂＦＧＦにおいて培養した
２４ウェルプレートを、実施例１１に記載されるように、シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊でコーティングした。Ｈ９細胞を実施例９に記載されるようにこれらの表面上で継代し、最小培地中の組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ又は８ｎＭという最終濃度で培養した。別の条件では、細胞を４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び５０％ＨＳ２７馴化培地（ＣＭ）で２４時間処理した後、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇに交換した。実験は２連で行った。４日間の成長の後、分化したコロニーに対する未分化のコロニーの数を計数し、コロニーの合計数に対する未分化のコロニーの割合としてグラフ化した。１００％未分化であったコロニーのみを未分化として計数した。図１０は、ｂＦＧＦ＋ＣＭがＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの濃度が不十分である場合にのみ有用であったことを示している。さらに、結果は、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇが、コロニー形態、数及び分化の阻害の観点からｂＦＧＦ＋線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地と同様又はより良好に機能したことを示した。
【０１０１】
実施例１３．培養フラスコをＮＴＡ−Ｎｉでコーティングする手順
材料：
２４ウェルカルボン酸提示表面細胞培養プレート（BD Biosciences Ｐｕｒｅｃｏａｔ：＃３５６７７５）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物、Ｉ型Ｈ２Ｏ、滅菌シリンジ（２０ｍＬ容）、０．４５μｍ ＰＶＤＦ(登録商標)膜シリンジフィルター。
【０１０２】
手順：
誘導体化される１つのプレート当たり７５ｍＬの１０ｍＭ ＥＤＣ／１０ｍＭ ＮＨＳ溶液を調製した。滅菌シリンジ及びシリンジフィルターを用いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を各々のウェルに濾過して、ウェルを約８０％満たした。プレートに蓋をし、プレートシェーカーで、室温で１５分間穏やかに振盪した。プレートを振盪している間、１つのプレート当たり約４０ｍＬの１０ｍＭ Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物を調製した。１５分間のプレートの活性化の後、プレートを空にし、Ｉ型水で３回すすいだ。新たな滅菌シリンジ及びシリンジフィルターを用いて、Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物の溶液を各々のウェルに濾過し、ウェルを半分位まで満たした。プレートに蓋をして、室温で３時間穏やかに振盪した。３時間後、プレートを空にし、Ｉ型水で５回すすいだ。残存する活性化ＮＨＳエステルを、この時点で１％エタノールアミンの滅菌溶液を添加し、室温で１５分間インキュベートした後、１０％炭酸ナトリウムの滅菌溶液を添加し、室温で３０分間インキュベートすることによってクエンチした。これは、プレートを滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏ中に４℃で少なくとも４８時間〜７２時間入れておくことによっても達成することができる。残留ＮＨＳエステルをクエンチするか、又は加水分解してカルボン酸に戻した後、ウェルを滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏで満たし、続いてパラフィルムで包み、蓋をし、スズ箔で包み、４℃で保存しなくてはならない。プレートを使用直前に再度滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏですすぐ必要がある。使用前に１％硫酸ニッケル溶液をプレートに添加した後、ＰＢＳですすいだ。
【０１０３】
エタノールアミン溶液の使用によって、残留ＮＨＳエステルがヒドロキシル頭部基を提示するアミドに変換されることに留意されたい。これによって表面の化学的性質が変化する。このことが望ましくない場合、炭酸塩溶液浸漬又は長期の水溶液浸漬（aqueous soak）によって、残り全てのＮＨＳエステルを加水分解して元のカルボン酸に戻す。
【０１０４】
実施例１４．Ｈ９幹細胞は、ヒスチジンタグを担持するリガンドでコーティングしたＮＴＡ−Ｎｉプレートに付着した
１２ウェルプレートを、実施例１３に記載されるようにＮＴＡ−Ｎｉによって誘導体化した。ヒスチジンタグ付きＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、配列HHHHHHSSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS（配列番号５）の合成ペプチド（ＲＧＤペプチド）、及びヒスチジンタグ付き組み換えプロテインＧ（Minerva）を、ＮＴＡ−Ｎｉコーティングウェルに２００ｎＭという最終濃度で別個に添加し、１５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中ですすいだ。プロテインＧウェルに対し、抗ＳＳＥＡ４及び抗Ｔｒａ １−８１を２００ｎＭで添加し、１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。実施例９に記載されるように、マトリゲル上で２継代の間成長させたＨ９細胞の６ウェルプレートの３つのウェルからコロニー片を採取し、ウェル上にプレーティングした。幹細胞を最小培地中の８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋ＨＳ２７ＣＭ、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋Ｔ４７Ｄ ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した５０％馴化培地（「Ｃａ ＣＭ」）、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養した。細胞は２４時間以内にプレートに付着し、未分化幹細胞の増殖が観察された。プレーティング後３日目に、未分化のコロニー及び分化したコロニーを計数し、プロットした（図１１Ａを参照されたい）。以下のものの代表的な写真（４０倍）を撮影した：図１１Ｂ）ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ表面、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｃ）ＲＧＤペプチド表面、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｄ）ＲＧＤペプチド表面、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７ ＣＭにおいて培養、図１１Ｅ）プロテインＧ表面、抗ＳＳＥＡ４、次いで８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｆ）プロテインＧ表面、抗Ｔｒａ １−８１、次いで８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｇ）ＲＧＤペプチド表面、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養。この実験の最良の条件は、ＮＴＡ−Ｎｉ表面に付着させ、次いで抗ＳＳＥＡ４又はＴｒａ １−８１に親和性付着させ、次いでＭＭ又はＣａＣＭ中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて培養したＨｉｓタグ付きプロテインＧから得られた。
【０１０５】
同様の実験において、他のＭＵＣ１＊陽性がん細胞（ＺＲ−７５−１及びＺＲ−７５−３０）に由来する馴化培地を使用したが、同じ結果が得られた。
【０１０６】
実施例１５．ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地は、線維芽細胞に由来する馴化培地よりも良好に幹細胞の成長を促進し、分化を阻害する
ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）を、標準的な方法に従って６ウェルプレートにおいてマトリゲル上で成長させた後、手作業での解離によって採取した。６ウェルプレートの３つのウェルからのコロニー片を、２４ウェルＮＴＡ−Ｎｉコーティングプレートのウェル上に分散させた。細胞表面上のタンパク質又は培地中のタンパク質が、プレート表面に付着した金属キレートに接着するか否かを調べることに興味を持った。プレーティングしたコロニー片に添加した培地は以下のいずれかであった：ａ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋ＨＳ２７（線維芽細胞）馴化培地（ＣＭ）、ｂ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋Ｔ４７Ｄ（ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞株、これらの細胞に由来するＣＭは本明細書中では「Ｃａ ＣＭ」と称される）に由来するＣＭ、ｃ）最小培地（「ＭＭ」）中の４ｎＭ ＮＭ２３、ｄ）ＭＭ中の８ｎＭ ＮＭ２３、ｅ）Ｃａ ＣＭ中の４ｎＭ ＮＭ２３、又はｆ）Ｃａ ＣＭ中の８ｎＭ ＮＭ２３。２４時間後、最小培地又はＣＭ又はＣａ ＣＭ中の細胞が表面に付着していたことが観察されたが、使用したＮＭ２３が、ＮＴＡ−Ｎｉプレートによって容易に捕捉され得るヒスチジンタグ付き組換えタンパク質であったことを考えると、なぜｂＦＧＦ/ＣＭ又はｂＦＧＦ Ｃａ ＣＭ中の細胞が付着するかについての明白な理由はなかった。がん細胞馴化培地（Ｃａ ＣＭ）中で成長させた細胞が他の条件よりもはるかに良好に成長していたことが観察された。培地を４８時間毎に交換して６日間培養した後、プレートを幹細胞コロニーの形態、コロニーの数及び分化の程度について分析した。４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋がん細胞馴化培地において培養した幹細胞は、対照のｂＦＧＦ＋ＨＳ２７よりも多くのコロニーを形成し、はるかに少ない（全くない）分化を有していた。ＮＭ２３単独において培養した細胞は成長し、コロニーを形成したが、ＮＭ２３＋がん細胞馴化培地において培養した細胞は、他のどの条件よりも多くのコロニーを形成し、コロニーは約８０％〜８５％が未分化であり、完全に形成され、分割することが可能な状態であった。一方、フィーダー細胞又はマトリゲル上での現行の技術水準の方法では、平均して３０％〜４０％が分化しているが、同じ段階に到達するには９日間かかる。図１２は、９日目のコロニー数のグラフを示す、ＮＭ２３＋がん細胞馴化培地（Ｃａ ＣＭ）について２０個のコロニーでグラフ化したが、細胞は完全にウェル全体を覆っており、実際に計数することができなかった。９日目には、対照ｂＦＧＦ＋ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地（ＨＳ２７ＣＭ）の割合にほぼ等しい未分化の部分が未だ存在していたが、ＮＭ２３で刺激したウェルにおいては、細胞ははるかに速く増殖した。
【０１０７】
実施例１６．細胞表面より遠位のペプチド領域に結合する抗体が細胞接着に好ましい
細胞表面より遠位のＭＵＣ１＊細胞外ドメインの部分に結合する抗体は、幹細胞接着を容易にすることについて細胞表面に近い領域に結合する抗体よりも良好である。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインは、約４５アミノ酸長である。この４５アミノ酸ペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、本明細書及び先願においては配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するＰＳＭＧＦＲと称され、それが付着した表面への幹細胞の接着を容易にした。モノクローナル抗体のスクリーニングによって、細胞表面に近いＭＵＣ１＊細胞外ドメインの部分を認識する抗体は、これらの同じモノクローナル抗体が培地に添加した場合に幹細胞の成長を刺激したにもかかわらず、表面への幹細胞の接着を促進しなかったことが示された。ＭＵＣ１＊受容体の遠位部分に結合する抗体を産生したハイブリドーマを同定するために、ハイブリドーマ上清を９６ウェルプレートのウェルに吸着させた後、マトリゲル上で成長させたＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ細胞から採取した未分化のコロニー片をプレーティングした。３つのクローンに由来する上清は幹細胞の接着を可能にした。最小培地を４８時間毎に交換し、増殖する未分化幹細胞コロニーをプレーティング後９日目に撮影した（図１３を参照されたい）。
【０１０８】
追跡実験においては、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、これらのハイブリドーマによって分泌された抗体が実際にＭＵＣ１＊細胞外ドメインの遠位部分に結合したか否かを決定した（図１４を参照されたい）。以下の２つの欠失ペプチドを合成した：配列QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号３）を有する、１０個のＮ末端アミノ酸が失われたペプチド（Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）、及び配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（配列番号４）を有する、Ｃ末端の１０個のアミノ酸が失われたペプチド（Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）。９６ウェルプレートのウェルへの幹細胞の接着をもたらしたハイブリドーマ上清は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、細胞表面に近接した１０個のアミノ酸が失われたペプチドに結合するが、遠位の１０個のアミノ酸が失われたペプチドには結合しないことが示された。ハイブリドーマ上清上にプレーティングした幹細胞は、完全に形成されたコロニーに成長し、これは最小培地単独において数日間培養した後も未分化であった。
【０１０９】
実施例１７．ＭＵＣ１＊抗体を使用して、多能性幹細胞を分化細胞から同定する
ＭＵＣ１＊リガンドであるＮＭ２３は、未分化のｈＥＳＣ上でＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と共局在化するが、３つ全てのタンパク質の免疫反応性が分化を開始したコロニーの部分において失われる。未分化のＨ９ ｈＥＳＣコロニーがＮＭ２３、ＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４に陽性であると染色された。新しく分化したコロニーは、３つのタンパク質のいずれに対する抗体とも反応しなかった。ＮＭ２３とＯＣＴ４及びＭＵＣ１＊との同時発現は、分化を開始したコロニーにおいて最も良く見られる。点線はコロニーの未分化部分と分化部分との間の境界を示す。三重染色実験を以下のものを使用して行った：図１５Ｇ）抗ＮＭ２３（緑色）、図１５Ｈ）抗ＭＵＣ１＊（赤色）、図１５Ｉ）抗ＮＭ２３（緑色）、抗ＭＵＣ１＊（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）。同様のコロニーを以下のもので染色した：図１５Ｊ）抗ＮＭ２３（緑色）、Ｋ）抗ＯＣＴ４（赤色）、図１５Ｌ）抗ＮＭ２３（緑色）、抗ＯＣＴ４（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）。スケールバー＝１００μｍ。抗ＮＭ２３はSanta Cruz（クローンＮＭ３０１）及びBD Biosciences（クローン５６）から購入した。抗ＭＵＣ１＊は、ZymedによってMinervaのＰＳＭＧＦＲペプチドから特別に作製されたものであった。
【０１１０】
多能性幹細胞は、生細胞を抗ＭＵＣ１＊及び完全長ＭＵＣ１に結合するＶＵ４Ｈ５等の抗体で標識した後、ＦＡＣＳ、電磁細胞分離又は同様の技術によって選別することで未分化の幹細胞及び分化した幹細胞の混合プールから単離することができる。ＭＵＣ１＊陽性は多能性幹細胞を意味する。生細胞に結合した二価抗ＭＵＣ１＊は、成長因子として機能するために続く成長を妨げず、細胞分離に理想的である。
【０１１１】
実施例１８．ＭＵＣ１＊抗体を使用して、ＭＵＣ１＊初期前駆体を後期前駆体である造血幹細胞から単離する
ヒト臍帯血（ALLCELLS）から得られるＣＤ３４陽性造血幹細胞（ＨＳＣ）を得た（obtaineded）。細胞は、真のＨＳＣであると報告されているＣＤ３４＋／ＣＤ３８−の混合物を含有していたが、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋（次の前駆体段階）も含有していた。細胞を解凍し、ペレット化し、StemSpan製のＳＦＥＭ（無血清展開培地）中で洗浄し、成長因子を添加しないＳＦＥＭで再懸濁した。およそ４０００個の細胞を９６ウェルプレートのウェルにプレーティングし、接着を防止するためにポリＨＥＭＡで被覆した。ＰＳＭＧＦＲペプチドで免疫化することによって生成したウサギポリクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体を、５つのウェルの各々に０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ及び２０００ｎｇ／ｍｌという最終濃度で添加した。細胞を３日目に撮影した（図１６Ａ）。プレーティング後５日目に、抗体を細胞に再添加した。
【０１１２】
プレーティングの１１日後に細胞を目視で検査したところ、大半がプレーティングした時点と同じ直径のままであったが、これは細胞が依然として造血幹細胞であり、次の前駆体段階へ進んでいないことの指標となる。同一ウェルから細胞をプールし、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ５で染色した。細胞を分析し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって選別した。図１６Ｂは、ＭＵＣ１＊抗体の濃度が増大するにつれ、真の造血幹細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）のままである細胞の割合が増加することを示している。その逆もまた真であった。次の前駆体段階（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）に進んだ細胞の割合は、ＭＵＣ１＊抗体の濃度が最低であるときに最高であった。代表的なウェルの統計から、ＭＵＣ１＊抗体による刺激によって、非刺激の細胞よりも多くのＣＤ３４＋／３８−細胞（ＨＳＣ）及び少ないＣＤ３４＋／３８＋（前駆体）細胞が生じることが示される。
【０１１３】
実施例１９．胎児肝細胞のＦＡＣＳ選別及び続くＭＵＣ１＊刺激による成長
完全長ＭＵＣ１を認識する抗体（ＶＵ４Ｈ５、Santa Cruz Biotechnology、又はＨＭＰＶ、BDBiosciences）又は抗ＭＵＣ１＊（ＰＳＭＧＦＲの免疫化によるウサギポリクローナル抗体、Minerva）を用いたＦＡＣＳ分析を多数の異なる前駆細胞に対して行い、どれがＭＵＣ１＊を発現したかを決定したが、それによりこれらの細胞を単離して、ＭＵＣ１＊受容体を刺激することによって展開させることができた。図１７Ａは、神経幹細胞（ＲｅｎＣｅｌｌ ＣＸ、Millipore）がＭＵＣ１＊を発現することを示している。少数の細胞が切断されたＭＵＣ１及び切断されていないＭＵＣ１の両方を発現する。それらの成長は、抗ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊を二量化するＮＭ２３のような他の作用物質と共に培養することによって刺激される。胎児肝細胞（ALLCELLS）は、ほぼ例外なくＭＵＣ１＊を発現する（図１７Ｂ）。
【０１１４】
胎児肝細胞を、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において図１８に示される濃度で培養した。示された成長曲線は、これらのＭＵＣ１＊前駆体の成長がＭＵＣ１＊成長因子受容体の二量化によって刺激されることを示している。最適抗体濃度では、１つの抗体が２つのＭＵＣ１＊受容体を二量化し、抗体が過剰になると、１つの受容体につき１つの抗体が存在し、成長が阻害される。これらの結果から、造血幹細胞及びＭＵＣ１＊を発現する他の前駆細胞を、ＭＵＣ１＊受容体を二量化する作用物質を添加することによって展開させることができることが示される。
【０１１５】
実施例２０．ｈｕ ＥＳ細胞は、任意の細胞表面マーカータンパク質に対する抗体でコーティングした表面に接着し、標準的な幹細胞培地又はＭＵＣ１＊刺激因子を含有する培地において培養することができる
１２ウェルプレートを、０．５ｍｌの抗ＭＵＣ１＊又は抗ＳＳＥＡ４抗体を用いて１００ｕｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、滅菌ＰＢＳ中ですすいだ。マトリゲル上で成長するｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞に由来する未分化のコロニー片を手作業で解離させて、再懸濁した後、表面上にプレーティングした。最終濃度８ｎＭの組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（Minerva）、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地を含有する培地を添加した。プレーティング後５日目に未分化のコロニーを手作業で採取し、分割して、同様にコーティングした表面上に再プレーティングした。図１９のグラフは、幹細胞が最小培地（ＭＭ）中のＮＭ２３又はｂＦＧＦ＋ＨＳ２７馴化培地において培養した場合に抗体表面上で成長することを示している。ＮＭ２３で処理したウェルにおける細胞が、ｂＦＧＦで処理したウェルにおけるものよりも著しく速く成長することが分かった。
【０１１６】
実施例２１．幹細胞の成長を促進し、分化を阻害するがん細胞馴化培地中の作用物質の同定
ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地は、ヒト幹細胞の成長を促進する一方で、それらの分化を阻害する。幹細胞の成長に影響を及ぼすがん馴化培地中の個別の作用物質を同定することは、２つの理由から望ましいといえる。第１に、これらの作用物質を合成又は組み換えによって作製し、個別の作用物質として成長培地又は表面コーティングに添加して、幹細胞及び或る特定の初期前駆体の成長を促進することができる。第２に、これらの作用物質の同定によって、がんの治療のためにそれらを抑制する戦略が可能となり得る。
【０１１７】
がん細胞馴化培地Ｃａ ＣＭ中のタンパク質を同定するために、Ｃａ ＣＭをＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収し、その個々の成分を、例えばイオン交換、サイズ排除等のカラム分離によって分離することができる。様々な画分を別個に又は組み合わせて、未分化幹細胞の成長を刺激するそれらの能力について試験することができる。次いで、影響を及ぼした画分（複数も可）をマイクロシークエンシング又は質量分析によって分析し、成分の固有性を決定することができる。
【０１１８】
より直接的なアプローチは、未処理のＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来するＣａ ＣＭと、ｍｉＲ−１４５で処理した細胞から回収したＣａ ＣＭとを比較することである。ｍｉＲ−１４５は、未分化から分化への幹細胞の移行が起こった場合にその発現が上方制御される制御性マイクロＲＮＡである。この移行中にＭＵＣ１の切断が中断され、ＭＵＣ１の発現が下方制御されることを想起されたい。最近になって、ｍｉＲ−１４５がＭＵＣ１をサイレンシングする（silences）ことが示された。がん細胞をｍｉＲ−１４５で処理することによって、がん細胞の成長及び未分化幹細胞の成長の両方に特徴的な幹様成長ではなく、分化に特徴的な成長の制御へのシフトが引き起こされる。未感作がん細胞及びｍｉＲ−１４５で処理した細胞によって分泌された因子の比較から、幹細胞及びがん細胞の成長の促進に関与するこれらの作用物質が同定され得る。それらは未処理のＣａ ＣＭ中に存在し、処理したＣａ ＣＭ中には存在しない。同定は、同種のタンパク質の分離、続くシークエンシング又は質量分析によって達成することができる。成分はゲル上で分離することができ、未処理のＣａ ＣＭに特有のタンパク質バンドをゲルから切り出した後、マイクロシークエンシング又は質量分析によって分析する。
【０１１９】
並行して、未分化の幹細胞に由来する馴化培地を、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド等の分化を開始する作用物質で処理した幹細胞から回収した馴化培地と比較する。この場合、未処理の幹細胞によって独自に又は優先的に分泌された成分は、幹細胞の成長を促進するか又は多能性を誘導する作用物質として望ましいものであり得る。これらの作用物質を抑制する分子は、がんの治療薬として使用され得る。これに対して、分化幹細胞から独自に又は優先的に分泌されたこれらの成分は、がんを治療する作用物質として望ましいものであり得る。同様に、これらの作用物質を抑制する分子は、幹細胞の成長を促進するか又は多能性を誘導するために使用され得る。
【０１２０】
幹様成長、すなわち幹細胞又はがん細胞の成長を促進又は抑制するマイクロＲＮＡ等の制御性核酸は、細胞からの分泌物を分析するのではなく、核酸を抽出し、分析すること以外は上記のように同定され得る。例えば、ディープシーケンシング（Deep Sequencing）及び全トランスクリプトーム解析として知られる技法を行って、幹様成長を抑制した場合に上方制御又は下方制御されるこれらの制御性ＲＮＡを同定することができる。幹細胞が分化する際に上方制御されるｍｉＲ−１４５等の制御性ＲＮＡは、抗がん治療に使用することができる。同様に、これらのマイクロＲＮＡを抑制するｓｉＲＮＡを含む分子は、多能性を促進又は誘導するために使用することができる。未分化幹細胞の成長及びがん細胞の成長において上方制御される制御性核酸は、がんの治療におけるサイレンシング若しくは抑制のため、又は幹細胞の分化の開始を同期させるための標的であり得る。
【０１２１】
当業者であれば、日常実験のみを用いて、本明細書中で具体的に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識する、又は確認することができる。かかる均等物は特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００９年６月１１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／１８６，３１０号及び２０１０年４月１３日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７７９号（その内容全体が参照により援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞、前駆体、誘導多能性幹細胞又は他の非接着性細胞を培養するか又は増殖させる分野において存在する問題は、どのようにして後の意図された使用（移植又は下流の分化を含む）を妨げないように細胞を培養するかということである。プラスチック製の培養（growth）フラスコ内で培養することのできる、プラスチックに接着する大抵の細胞とは異なり、幹細胞は非接着性であり、したがって伝統的な（traditional）方法を用いて成長させることができない。しかしながら、幹細胞は線維芽細胞の層上で成長する。これらの「フィーダー細胞」層は、接着のための表面を提供し、幹細胞の成長及び生存に必要とされる、未だ特性化されていない成長因子の混合物を細胞に供給する。ごく最近になって、研究者らは、マトリゲル等の細胞外マトリックスに由来する成分に幹細胞を付着させることによって幹細胞を培養することが可能となった。幹細胞はこれらの表面様基質に接着するが、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と線維芽細胞フィーダー細胞から回収された分泌物との両方を含有する成長培地において培養しなくてはならない。これらの方法はどちらも細胞によって分泌された特性化されていない因子の環境を用いるため、どのようにして又はなぜこれらの方法が幹細胞の増殖を促進するかは完全には明らかになっていはいない。マトリゲル表面上で培養した場合に幹細胞がより急速に分化することが報告されている。いずれかの方法、すなわちフィーダー細胞又はマトリゲル＋フィーダー細胞に由来する馴化培地によって成長させた幹細胞は、自発的に分化する。分化幹細胞は、隣接細胞にも分化を開始させる因子を分泌する。したがって、技術者はおよそ７日毎に、未分化のように見えるこれらの幹細胞コロニー又はコロニー部分のみを手作業で解離させて、採取しなくてはならない。次いで、成長を継続するために採取した細胞を再プレーティングする。意図された目的に十分な未分化細胞を採取することができるまでこの手順を繰り返す。幹細胞を培養するこれらの方法は、本業界にとって現行の技術水準である。
【０００３】
実質的にいかなる種類の幹細胞又は誘導多能性幹細胞の大規模成長でも、これらの細胞のハイスループット採取を可能にする新たな方法の開発が必要とされている。
【０００４】
現行の方式は幹細胞を線維芽細胞フィーダー細胞上で成長させることであるが、そこからの唯一の採取方法は、顕微鏡下で手作業で解離して、「良質な」細胞を単離し、続いて再プレーティングすることによるものである。この手順は主観的であり、時間がかかるために不完全である。技術者の主観的基準ではなく分子認識に基づいて細胞が選択される、自動化可能な採取方法及び所望の細胞を混合プールから精製する自動化可能な方法が必要とされている。
【０００５】
幹細胞を培養する現行の技術水準の方法は、１）労働集約的であり、２）大規模な成長には本質的に不適合であり、３）馴化培地等の特性化されていない因子に依存し、４）幹細胞を培養フラスコに接着させるのに細胞又は細胞産物を必要とし、５）ヒト幹細胞を不可逆的に変化させる可能性のある非ヒト細胞及び細胞抽出物をしばしば使用するため不十分である。幹細胞の成長を可能にする個別の因子が特定されれば大幅な改善となる。必要かつ十分な成長因子を添加しさえすれば、自発的な分化が最小限に抑えられると考えられる。顕微鏡下で手作業での解離という現行の方法よりも、大規模な成長に適合した方法で細胞を安全に採取することができれば、更なる大幅な改善となる。現在は、マトリゲル上で成長させた幹細胞は、例えばトリプシンを用いた酵素的切断によって採取することができる。通常は、未分化のコロニー又はコロニー部分を手作業で解離させた後、トリプシン又はコラゲナーゼ等の酵素で消化する。しかしながら、トリプシンは重大な細胞死を引き起こし、マトリゲル上での幹細胞の連続継代が異常核型を生じることが報告されている。これは、トリプシンでの採取に起因するか、又はマトリゲルがマウス肉腫細胞に由来する細胞及び分泌物の混合物であることに起因するようである。非ヒトフィーダー細胞は、得られる幹細胞を完全にヒトではなくなるように変化させることが疑われている。例えば、グリコシル化パターン及び他の翻訳後修飾がフィーダー細胞種の特性に与えられ得ることが疑われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、幹細胞の成長を支持する無細胞方法を開発すれば、現行の技術水準と比べて大きな改善となる。完全に特性化された個別の作用物質（可能な限り多くが合成作用物質である）を使用して幹細胞を成長させて、採取することができれば更に大きな改善となる。ヒト療法に好適な細胞を産生させるには、確定可能な因子のみを含む細胞を培養する方法を開発すれば、現行の技術水準と比べて大きな改善となる。理想的には、確定された成分は非ヒト成分を含まないものとする。組換えタンパク質又は合成成分が好ましい。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、そのキメラ又は誘導体を含む抗体が、それらの産生に高度に再現性があり、それらが強固であり、例えばプロテインＡ又はプロテインＧを用いた親和性枯渇（affinity depletion）によって、採取した細胞から容易に取り出すことができることから特に好ましい
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法であって、前記表面及び前記細胞に結合するリガンドを介して前記細胞を前記表面上に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法に関する。前記リガンドは直接的に又は媒介物を介して間接的に前記表面に結合し得る。前記媒介物は化学リンカー若しくは別のタンパク質、又はそれらの組み合わせであり得る。前記タンパク質はプロテインＡ又はプロテインＧであり得る。特に、前記リンカーは感光性又は化学物質感応性であり得る。また前記リガンド又は前記媒介物は、前記表面に非特異的に吸着し得るか、又はアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって前記表面に共有結合的に連結若しくは付着し得る。前記リガンドはポリマーに結び付き得る。特定の実施の形態では、前記リガンドは、前記幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で発現されたポリペプチドに特異的に結合し得る。前記細胞の表面上の前記ポリペプチドは、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０であり得る。前記リガンドが抗体又は成長因子であり得る。好ましくは、前記抗体がＰＳＭＧＦＲ又はＣ−１０ ＰＳＭＧＦＲに特異的に結合し得る。好ましくは、前記成長因子は野生型ＮＭ２３若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体、又はｂＦＧＦであり得る。
【０００８】
別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露する、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。これに関して、前記作用物質は抗体であり得るか、又は前記作用物質は野生型ＮＭ２３、若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体であり得る。
【０００９】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から分泌された作用物質を含有する培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。前記ＭＵＣ１＊陽性細胞はＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１であり得る。
【００１０】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法に関する。前記ＭＵＣ１＊陽性細胞は特に、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１であり得る。
【００１１】
一態様では、使用される表面はマトリゲルではないのが好ましく、線維芽細胞フィーダー細胞が存在すれば、細胞を取り出す際の手作業での解離プロセスもない。
【００１２】
別の態様では、本発明は、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記リガンド又は前記表面との結合から放出されるように、前記リガンドに結合する競合分子を添加することを含む、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法に関する。
【００１３】
更に別の態様では、本発明は、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記表面から放出されるように、前記細胞に直接的又は間接的に付着した前記表面に結合したリンカーを切断することを含む、上記の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法に関する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は、細胞の分化状態を特定する方法であって、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、細胞の分化状態を特定する方法に関する。この方法は、細胞を幹細胞及び幹様細胞又は誘導多能性幹細胞、並びに新たに分化する細胞の混合集団から分離することを更に含み得るが、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す。特に、この方法は、前記細胞を、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する抗体と接触させることを更に含み得るが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する正のシグナルが、多能性幹細胞状態の存在を示す。特に、前記細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体及び抗Ｔｒａ １−８１抗体、抗Ｔｒａ １−６０抗体、ＳＳＥＡ３抗体又はＳＳＥＡ４抗体と接触させることができる。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法であって、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが、がん幹細胞を示す、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法に関する。この方法は、前記細胞を幹細胞マーカーに対する抗体と反応させることを更に含み得るが、幹細胞マーカーに対する正のシグナルが、がん幹細胞の存在を示す。
【００１６】
更に別の態様では、本発明は、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法であって、前記細胞を前記表面に、直接的に又は前記細胞に結合するリガンドを介して間接的に付着させること、及び前記細胞をＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露することを含む、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法に関する。前記作用物質がＭＵＣ１＊を二量化して、成長を促進し、分化を阻害し得るか、又は前記作用物質がＭＵＣ１＊の二量化を阻害して、分化を促進し得る。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、細胞型を分離する方法であって、異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する様々なリガンドについて表面上の空間アドレスを作成すること、及び前記細胞を前記表面に添加することを含み、前記細胞が、前記細胞の結合するリガンドに応じて空間的に分離されている、細胞型を分離する方法に関する。前記表面が粒子又はナノ粒子であり得る。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は、宿主の体内に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を移植する方法に関する。前記宿主が患者であり得る。特に、前記リガンドが、前記宿主の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の成長因子であり得る。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は、宿主の体内に、表面及び細胞に結合するリガンドを介して付着した細胞を有する表面を移植する方法に関する。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法であって、宿主の体に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を投与することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法に関する。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は、組成物であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面、及びＭＵＣ１＊二量化剤を含む、組成物に関する。前記親和性相互作用が前記表面とのＮＴＡ−Ｎｉの相互作用によるものであり得る。前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０であり得る。前記ＭＵＣ１＊二量化剤が、野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体であり得る。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面を、前記細胞を含有するサンプルと、及びＭＵＣ１＊二量化剤と相互作用させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】マトリゲルに付着したヒト胚性幹細胞（Ｈ９）が、標準的なｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地中で培養した場合のより少ない細胞数及びより大きな分化と比較して、最小培地中の抗ＭＵＣ１＊において培養した場合に本質的に１００％の多能性（ＯＣＴ４＋）をもって成長することを示す図である。ＤＡＰＩによって全ての細胞の核を染色する。点線はコロニーの未分化部分の境界を画定する。抗ＭＵＣ１＊で処理したウェルにおいては、未分化幹細胞がウェルの限界まで成長した。
【図２】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地単独におけるマトリゲル上でのヒト胚性幹細胞の１８回の継代の後、ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧの核型が変化しなかったことを示す図である。
【図３】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地単独においてマトリゲル上で培養したヒト胚性幹細胞が、３つの生殖系列へと分化することが可能であったことを示す図である：Ａ）ＯＣＴ４陰性であり、細胞が分化したことを意味する；Ｂ）αフェトプロテインに陽性であり、内胚葉生殖系列に沿った分化を意味する；Ｃ）ネスチンに陽性であり、外胚葉生殖系列への分化を意味する；及びＤ）平滑筋アクチンに陽性であり、中胚葉生殖系列への分化を意味する。
【図４】抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面が、最小幹細胞培地単独又はｂＦＧＦ＋線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地のいずれで培養するかに関わらず、幹細胞の成長を支持することを示す図である。異なる表面上にコーティングした無関連抗体は、幹細胞接着を引き起こさず、細胞は２４時間以内に死滅した。
【図５】抗ＭＵＣ１＊及び最小培地を含有する培地中での複数回の継代後のマトリゲルに付着したヒト幹細胞の写真を示す。左側の写真は、全ての細胞の核のＤＡＰＩ染色を示し、右側のパネルはＯＣＴ４染色との１：１相関を示す。まとめると、これらは全ての細胞がＯＣＴ４＋（多能性を意味する）のままであることを示している。
【図６】抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で成長させたｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の写真を示す：Ａ）３日目（Ａ１）及び７日目（Ａ２）の最小培地単独において培養したもの；Ｂ）３日目（Ｂ１）及び７日目（Ｂ２）の最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊において培養したもの；Ｃ）３日目（Ｃ１）及び７日目（Ｃ２）の４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞に由来する５０％馴化培地において培養したもの；Ｄ１、Ｄ２）ウェルＡ及びウェルＢからの細胞を、細胞を表面から放出させる遊離ＰＳＭＧＦＲ（ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン）ペプチドを添加することによって採取したもの；細胞を新たな抗ＭＵＣ１＊抗体表面に再プレーティングし、そこで付着及び増殖させた。
【図７】抗ＭＵＣ１＊抗体又はβ−シクロデキストリンに連結した同じ抗体でコーティングした表面上での幹細胞成長のグラフである。このグラフは、抗体をデキストリンに連結した場合に細胞の接着及び成長の向上を示している。
【図８】ｈｕ ＥＳ細胞を、最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体において培養する場合に、幹細胞表面マーカータンパク質ＳＳＥＡ４及びＴｒａ １−８１に結合した抗体でコーティングした表面に付着させることによって培養することができることを示す図である。
【図９】マトリゲル上のｈｕ ＥＳ細胞が、最小培地＋ＮＭ２３において培養した場合に、少なくとも現行の技術水準と同様に成長することを示す図である。このグラフは、標準的な４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋線維芽細胞に由来するＨＳ２７馴化培地（対照）において培養した場合のマトリゲル上のｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の成長と、示される濃度での最小幹細胞培地＋ＮＭ２３における成長とを比較するものである。未分化の成長率を未分化のコロニー及び分化したコロニーの両方の盲目計数（blinded count）によって算出し、次いで百分率として算出した。完全に未分化の細胞のみを未分化であると評価した。
【図１０】抗ＭＵＣ１＊でコーティングした表面上で成長させたｈｕ ＥＳ細胞を、シクロデキストランに共有結合的に連結し、最小培地＋ＮＭ２３において示される濃度で分割することが可能な状態となるまで培養したことを示す図である。一組の細胞を初めに４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地（ＣＭ）において最初の２４時間培養した。このグラフは、ｂＦＧＦ及びＣＭが、適切な量のＮＭ２３を添加しても細胞の成長又は分化状態に利益をもたらさなかったことを示す。
【図１１】ＮＴＡ−Ｎｉでコーティングした表面上に幹細胞を接着させて、培養し、そこに初めにヒスチジンタグ付きリガンドＮＭ２３、ＲＧＤペプチド及びプロテインＧ、続いて抗ＳＳＥＡ４及びＴｒａ １−８１を結合したことを示す図である。続いてｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞の成長及びコロニー形成が起こった。３日目に計数した未分化のコロニー及び分化したコロニーの数をプロットした。Ｂ〜Ｇは図１１Ａでプロットした代表的な幹細胞のコロニーの写真である。
【図１１−２】同上
【図１２】ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地（Ｃａ ＣＭ）が、標準的な線維芽細胞馴化培地（ＣＭ）よりもはるかに大幅にｈｕ ＥＳ細胞の成長を促進し、分化を阻害することを示す図である。さらに、ＮＭ２３はＣａ ＣＭに添加した場合に標準的なｂＦＧＦよりもはるかに良好に作用した。
【図１３】各々が異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンに由来する吸着上清上で成長させたｈｕ ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ ＥＳ細胞の写真を示す。幹細胞接着を最も良好に可能にするモノクローナル抗体をこのようにして同定する。
【図１４】ハイブリドーマ上清を、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかから１０個のアミノ酸が失われたＰＳＭＧＦＲペプチドの欠失変異体に結合するその能力について試験したＥＬＩＳＡアッセイのグラフである。それらの上清でコーティングした表面への幹細胞の付着を可能にしたハイブリドーマは、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチド（GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV）への結合も示した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのより遠位の部分に結合した抗体が、表面への幹細胞の付着をより良好に可能にすると推論した。
【図１５】分化を開始する前後のＨ９ヒト胚性幹細胞のＩＣＣ染色の写真を示す。抗ＭＵＣ１＊は未分化のコロニーの細胞を全て染色し、最も基準となる（gold standard）多能性の指標であるＯＣＴ４と共局在化した（図１５Ａ、図１５Ｂ）。ＭＵＣ１完全長を特定するＶＵ４Ｈ５抗体は、いずれの未分化細胞も染色しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、細胞が分化すると、逆のＭＵＣ１パターンが検出された。ＭＵＣ１＊染色又はＯＣＴ４染色は観察されなかった（図１５Ｄ、図１５Ｅ）。しかし、全ての細胞が完全長ＭＵＣ１に陽性であると染色された（図１５Ｆ）。同様に、未分化幹細胞はＮＭ２３に陽性であると染色され、ＭＵＣ１＊のリガンド及びＮＭ２３は、ＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と正確に共局在化した（図１５Ｇ〜図１５Ｌ）。
【図１５−２】同上
【図１６】幹細胞成長培地に添加した抗ＭＵＣ１＊抗体が、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長を増大させることを示す図である（Ａ）。（Ｂ）ＦＡＣＳ分析から、造血幹細胞のままであった細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）の数が、抗ＭＵＣ１＊濃度の増大に伴って増加した。一方で、次の前駆体段階に進んだ細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）の数が抗ＭＵＣ１＊濃度の減少に伴って増加した。これらの結果から、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の刺激がＨＳＣの分化を阻害したことが示される。
【図１７】神経幹細胞（Ａ）及び胎児肝細胞（Ｂ）のＦＡＣＳスキャンを示す図である。細胞を業者から入手し、即座に蛍光標識抗ＭＵＣ１＊抗体及び完全長ＭＵＣ１の遠位部分を認識する標識抗体（ＨＰＭＶ）の両方で染色した。ＦＡＣＳスキャンによって、ＭＵＣ１の大半が両方のタイプの初期前駆体上でＭＵＣ１＊へと短縮される（clipped）ことが示される。続く実験から、抗ＭＵＣ１＊が両方のタイプの細胞の成長を濃度依存的に刺激することが示された。
【図１８】抗ＭＵＣ１＊濃度に応じた胎児肝細胞の成長のプロットであり、これはＭＵＣ１＊受容体を刺激することによってＭＵＣ１＊前駆細胞を単離し、展開させることができることを示している。
【図１９】ｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞を、１２ウェルプレート上にコーティングした抗ＭＵＣ１＊抗体又は抗ＳＳＥＡ４抗体のいずれかの上にプレーティングした後、８ｎＭ ＮＭ２３又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地のいずれかにおいて培養した後の幹細胞コロニーのプロットである。
【符号の説明】
【００２４】
図１
Anti-MUC1 抗ＭＵＣ１＊
Minimal StemCell Medium 最小幹細胞培地
ConditioinedMedium 馴化培地
図４
Growth of hESCells on Anti-MUC1* Antibody Coated Surfaces: in Minimal Media Aloneor + 30% Conditioned Media + bFGF 最小培地単独又は３０％馴化培地＋ｂＦＧＦにおける抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上でのｈＥＳ細胞の成長
(Calcein)FluorescenceUnits （カルセイン）蛍光単位
Concentrationof Anti-MUC1* Antibody Adsorbed onto Plate プレート上に吸着した抗ＭＵＣ１＊抗体の濃度
Anti-MUC1*on Plate w/Minimal Media 最小培地を有するプレート上の抗ＭＵＣ１＊
ControlAntibody on Plate w/Minimal Media 最小培地を有するプレート上の対照抗体
Anti-MUC1*Antibody on Plate 30% + Conditioned Media + bFGF ３０％＋馴化培地＋ｂＦＧＦを有するプレート上の抗ＭＵＣ１＊抗体
図７
Growth of hESCells on Anti-MUC1* Antibody Coated Surfaces: Antibody Alone orCoupled to Cyclodextrin 抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上でのｈＥＳ細胞の成長：抗体単独又はシクロデキストリンと連結した抗体
RelativeFluorescent Units 相対蛍光単位
ug/mlanti-MUC1* Ab 抗ＭＵＣ１＊Ａｂ（ｕｇ／ｍｌ）
AntibodyConjugated to Beta Cyclodextrin β−シクロデキストリンと結合した抗体
Antibodyalone 抗体単独
図８
hES Cells Canbe Grown on any Surface that Binds Cell Surface Marker Antigens if Fed withMinimal Media + Anti-MUC1* Antibody ｈＥＳ細胞は、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体を供給した場合に、細胞表面マーカー抗原を結合する任意の表面上で成長させることができる
Calcein-AMFluorescence カルセインＡＭ蛍光単位
ug/mlAntibody 抗体（ｕｇ／ｍｌ）
Anti-SSEA4 抗ＳＳＥＡ４
Anti-Tra-1-81 抗Ｔｒａ １−８１
図９
hu ES CellsGrowing on Matrigel Cultured in NM23 in Minimal Media 5 days 最小培地中のＮＭ２３において培養したマトリゲル上で５日間成長させたｈｕ ＥＳ細胞
%Undifferentiated hu ES cells 未分化ｈｕ ＥＳ細胞（％）
Concentrationof NM23 ＮＭ２３の濃度
CONTROL 対照
NM23 inMinimal Media 最小培地中のＮＭ２３
bFGF CM 24hrsthen NM23 ｂＦＧＦ ＣＭで２４時間、続いてＮＭ２３
図１０
hu ES CellsGrowing on Anti-MUC1* Coupled to Cyclodextran 5 days シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊上で５日間成長させたｈｕ ＥＳ細胞
%Undifferentiated hu ES cells 未分化ｈｕ ＥＳ細胞（％）
ConcentrationNM23 ＮＭ２３の濃度
NM23 inMinimal Media 最小培地中のＮＭ２３
bFGF CM 24hrs then NM23 Minimal Media ｂＦＧＦ ＣＭで２４時間、続いて最小培地中のＮＭ２３
図１１
NTA-NiSurfaces Capture His-Tagged Ligands that bind to Stem Cell Surface Proteins ＮＴＡ−Ｎｉは、幹細胞表面タンパク質に結合するＨｉｓタグ付きリガンドを捕捉する
Number ofColonies コロニーの数
undifferentiatedcolonies 未分化のコロニー
differentiatedcolonies 分化したコロニー
Surfaces 表面
hu ES H9sGrowing Attached to Histidine-Tagged Ligands that Bind to Stem Cell SurfaceProteins - Images Captured Day 3 Post Plating 幹細胞表面タンパク質に結合するヒスチジンタグ付きリガンドに付着させて成長させたｈｕ ＥＳ Ｈ９ − プレーティング後３日目に撮影した画像
NM23 ON SURFACE 表面上にＮＭ２３
undifferentiated 未分化
differentiated 分化
RGD PEPTIDEON SURFACE 表面上にＲＧＤペプチド
PROTEIN G,ANTI-SSEA4 ON SURFACE 表面上にプロテインＧ、抗ＳＳＥＡ４
PROTEIN G,ANTI-Tra 1-81 ON SURFACE 表面上にプロテインＧ、抗Ｔｒａ １−８１
図１２
hu ES H9Cells Attached to an NTA-Ni Coated Plate ＮＴＡ−Ｎｉコーティングプレートに付着させたｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞
Number ofcolonies コロニーの数
80-85%undifferentiated at day 5; NM23 + Ca CM had fully formed colonies ready for 1:2split ５日目に８０％〜８５％が未分化であった；ＮＭ２３＋Ｃａ ＣＭは２倍に分割することが可能な状態のコロニーを完全に形成した
図１３
day 9 ９日目
図１４
ELISA assayof Hybridoma Supernatants Binding to PSMGFR Deletion Peptides Lacking 10 AminoAcids from either the N- or C-Terminus １０個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端のいずれかから失われたＰＳＭＧＦＲ欠失ペプチドに結合するハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡアッセイ
corrected OD450 nm ４５０ｎｍでの補正ＯＤ
Clone ID クローンＩＤ
図１５
UNDIFFERENTIATED 未分化
DIFFERENTIATED 分化
図１６
minimal media 最小培地
Anti-MUC1* 抗ＭＵＣ１＊
MUC1*Stimulated Growth of Hematopoietic Cells from Cord Blood - 11 Days 臍帯血に由来する造血細胞のＭＵＣ１＊によって刺激される成長（１１日間）
Percent パーセント
Other cells 他の細胞
Progenitors 前駆体
図１７
Neural StemCells 神経幹細胞
RenCell CXcells(Millipore) ＲｅｎＣｅｌｌ ＣＸ細胞（Millipore）
Anti-MUC1*Rabbit polyclonal SRY 1a max 抗ＭＵＣ１＊ウサギポリクローナルＳＲＹ １ａ ｍａｘ
Pacific Blue パシフィックブルー
MUC1-full-length ＭＵＣ１完全長
CD34+FetalLiver Cells(ALLCELLS) ＣＤ３４＋胎児肝細胞（ALLCELLS）
図１８
CD34+ FetalLiver Normalized Growth 10 days ＣＤ３４＋胎児肝臓における正規化した１０日間の成長
% norm growth 正規化した成長（％）
ng/mlAnti-MUC1* LMP#1(SRY) antibody 抗ＭＵＣ１＊ ＬＭＰ＃１（ＳＲＹ）抗体（ｎｇ／ｍｌ）
optimalantibody concentration 最適抗体濃度
図１９
hu ES CellGrowth on Anti-MUC1* or Anti-SSEA4 Surfaces, Cultured in NM23 orbFGF + CM ＮＭ２３又はｂＦＧＦ＋ＣＭにおいて培養した、抗ＭＵＣ１＊又は抗ＳＳＥＡ４表面上でのｈｕ ＥＳ細胞の成長
Number ofcolonies コロニーの数
Anti-MUC1*Coated Surface 抗ＭＵＣ１＊をコーティングした表面
Anti-SSEA4Coated Surface 抗ＳＳＥＡ４をコーティングした表面
undifferentiatedcolonies 未分化のコロニー
differentiatedcolonies 分化したコロニー
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本願において、「a」及び「an」は、単一及び複数の対象の両方を指すように使用される。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体」（ＭＧＦＲ）は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用するＭＵＣ１受容体の部分を意味する機能定義である。ＭＵＣ１のＭＧＦＲ領域は、細胞表面に最も近い細胞外部分であり、下記に定義されるように、ＰＳＭＧＦＲの大部分又は全てによって規定される。ＭＧＦＲは、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１成長因子受容体の一次配列」（ＰＳＭＧＦＲ）とは、場合によってはＭＧＦＲの大部分又は全て、並びにそのペプチド配列の機能的変異体及び断片を規定するペプチド配列を指す。ＰＳＭＧＦＲは、配列番号１、並びに２０個までの任意の整数値（すなわち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）のアミノ酸置換、及び／又は２０個までの任意の整数値のアミノ酸付加若しくは欠失を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に有する、その全ての機能的変異体及び断片として定義される。上記の文脈における「機能的変異体又は断片」とは、配列番号（SEQ D NO:）１のペプチドに特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用するリガンドに特異的に結合するか、又は別の形で特異的に相互作用する能力を有するが、ペプチド分子が他の同一なペプチド分子と会合する（すなわち自己会合する）能力を有するほど、それら自身と同一な他のペプチド分子の同一な領域とは強く結合しない変異体又は断片を指す。配列番号（SEQ NO:）１のＰＳＭＧＦＲペプチドの機能的変異体であるＰＳＭＧＦＲの一例は配列番号２であり、-SRY-の代わりに-SPY-配列を含むことによって配列番号１とは異なる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊」とは、細胞外ドメインが本質的にＰＳＭＧＦＲ（配列番号１）を含むようにＮ末端が切断されたＭＵＣ１タンパク質を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、表面に結合される細胞との関連において使用される「表面」は、固体基質又は多孔質基質又は他の非固体基質であり得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「最小培地」は、概して細胞に由来する馴化培地、又は生きた宿主に由来する血清等の不確定の作用物質の混合物が存在することなく、細胞培養が可能となる最小限の栄養素を含有する任意の培地であり得る。本明細書中で使用される場合、「最小幹細胞成長培地」は、幹細胞又は幹様細胞の培養が可能となる最小限の栄養素を含有する任意の培地であり得る。これは最小培地又はＭＭとも称される。以上のように、本発明で使用される最小培地は例示の最小培地に限定されず、確定された成分を有する多数のタイプの溶液を包含し得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「幹様」細胞は幹細胞の特性を幾つか有し得る。例えば、幹様細胞は自己再生する能力を幾らか有する。幹様細胞は、ａ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ、若しくはＫＬＦ４を発現する、若しくは発現するように誘導されるか、又はｂ）高レベルのＭＵＣ１＊をそれらの表面上で発現する。幹様細胞の例としては、前駆細胞、多分化能（multipotent）幹細胞、多能性を誘導するプロセスを受けている細胞、がん細胞、がん幹細胞、造血幹細胞、ｉＰＳ、及び幾つかの抗体産生ハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ」とは、非多能性細胞、通常は成体の体細胞から、或る特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって人為的に誘導された或るタイプの多能性幹細胞を指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ＭＵＣ１＊刺激因子」とは、ＭＵＣ１＊の二量化又はＭＵＣ１＊を形成するＭＵＣ１の切断等のＭＵＣ１＊の活性を活性化することが可能な任意の分子を指す。
【００３４】
配列表フリーテキスト
ａ、ｇ、ｃ、ｔ以外のヌクレオチド記号の使用については、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（付録２、表１）に記載される規則に従うが、ここでは、ｋはｔ又はｇを表し、ｎはａ、ｃ、ｔ又はｇを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｒはａ又はｇを表し、ｓはｃ又はｇを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｙはｃ又はｔを表す。
【００３５】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）は、ＭＵＣ１の膜近位の（membrane proximal）細胞外領域をアミノ酸１１１０からアミノ酸１１５５まで表す（ＰＳＭＧＦＲ）。GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号２）は、ＭＵＣ１の膜近位の細胞外領域の変異体をアミノ酸１１１０からアミノ酸１１５５まで表す（ＰＳＭＧＦＲの変異体）。
【００３６】
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号３）は、Ｎ末端の１０個のアミノ酸が欠失したＰＳＭＧＦＲ配列（Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
【００３７】
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（配列番号４）は、Ｃ末端の１０個のアミノ酸が欠失したＰＳＭＧＦＲ配列（Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）を表す。
【００３８】
表面上の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞
本発明は、細胞表面タンパク質に対するリガンドを、成長培地を保持することができるか、又は成長培地に添加することのできる固体支持体に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞及び前駆体を培養するか又は展開させる方法を開示する。
【００３９】
本発明は、細胞を培養するための新たな方法及び表面を開示する。該方法は接着性でない細胞を成長させて、維持するのに特に有用である。これらの方法は幹細胞、幹様細胞及び前駆細胞を培養するのに特に有用である。
【００４０】
表面
本発明は、細胞を成長させるための新たな表面及び方法を開示する。これらの表面は非接着性の細胞、幹細胞及び幹様細胞（誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び幾つかの前駆細胞を含む）を培養するのに特に有用である。本明細書中に開示される方法によって、どのようにして細胞培養培地を交換しつつも有益な細胞を保持するかという問題が解決される。既存の細胞培養方法の多くは接着性細胞に有効であるが、これは接着性細胞がフラスコの表面に付着するためである。格納容器の表面に付着した細胞に支障を来たすことなく、古い液体培地を除去して、新たな培地で置き換えることができる。本発明の幾つかの方法は、より頻繁に置き換えることが必要とされるより安価な因子を交換しつつも、有益な成長因子の保持を可能にするという点でも有用である。本発明の他の方法は、比較的狭い空間及び少量の培養培地を使用しつつも、細胞付着のための表面積をより大きくし、それにより細胞の収量を増大させる。該方法は概して、リガンドを表面に直接的又は間接的に付着させることを含むが、この場合、リガンドは細胞表面上の分子に結合することが可能である。
【００４１】
これらの方法とともに使用するのに好適な表面は、本質的に膜であっても、又は多孔質であってもよい。本明細書中に記載の表面はポリマー、又はポリマー、シクロデキストリン若しくはシクロデキストランでコーティングした表面であり得る。表面は空間的にアドレス可能な表面、又はビーズ、粒子若しくはナノ粒子の表面であり得る。ビーズ、粒子又はナノ粒子は溶液中に遊離していても、又は介在分子によって固定されていてもよい。例えば膜は、ポリマー物質を含んでいても、細胞と表面との間の結合を促進するリガンドを担持するビーズ又は粒子が付着していてもよい。本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ成長へのこれらの表面の使用を含む。本発明の表面を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を培養することができる。代替的には、本発明の表面を宿主内に埋め込むことができる。表面は、療法として移植される幹細胞等の細胞を担持することができる。例えば、成長幹細胞が付着した又は付着していない本発明の表面を移植して、その表面によって生着の効率を増大させることができる。別の例では、移植した表面は、宿主自身の細胞又は幹細胞を或る領域に動員するため、又はその位置での標的細胞の成長を促進するためにリガンドを担持している。例えば、幹細胞の成長を誘起し（attract）、促進する表面を関節内に挿入し、軟骨の置換を助長することができる。本発明の表面は、細胞が最終的に３次元形態を形成するように足場上に成形するか、又は足場上にコーティングすることができる。例えば、材料を耳の形状にした後、最終的に足場の形状のより成熟した細胞又は組織へと発展する幹細胞又は幹様細胞の付着及び成長を可能にする、本明細書中に記載の表面の１つでコーティングすることができる。本発明の表面及び組成物を使用して、構造化された又は構造化されていない多孔質表面又は固体表面であり得る埋め込み型装置をコーティングすることができることが更に想定される。上記装置によって、組織又は細胞の修復又は再生を目的として幹細胞又は前駆細胞を或る領域に送達又は動員することができる。例えばステントを本発明の表面又は組成物のいずれかでコーティングして、血管を修復又は再生することができる。本発明の表面、例えばＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇでコーティングし、幹細胞又は前駆細胞を付着させたステントを宿主又は個体に埋め込んで、宿主自身の細胞を刺激する細胞又は成長因子を送達することができる。該方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
【００４２】
リガンド
表面への細胞の結合を促進するか、又は細胞増殖を刺激するリガンドを、表面に直接的に、又は例えば表面に付着したポリマーに間接的に付着させることができる。例えば、細胞表面受容体を認識する抗体を、表面上に付着又は吸着したシクロデキストリン又はシクロデキストラン等のポリマーに共有結合的に付着させることができる（実施例６、実施例１０〜実施例１２及び図７、図１０を参照されたい）。細胞表面上の分子に対して幾らかの親和性を有するリガンドを、任意でこれらの表面に付着させて、細胞の付着及び成長を促進する。リガンドは成長因子受容体等の細胞表面受容体上に特異的に結合し得る。リガンドはタンパク質、ペプチド、小分子、抗体、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、二重特異性抗体、一価抗体若しくは二価抗体、Ｆａｂ等の抗体誘導体、一本鎖抗体、遺伝子組換え誘導体、又は抗体の可変領域をその標的に特異的に結合することが可能なように別のタンパク質に挿入した誘導体であり得る。代替的には、リガンドは細胞表面分子に対して特異親和性を有する必要はない。例えば、表面に付着したリガンドは、非特異的相互作用を介して細胞を表面に接着させ得る。非特異的相互作用は本質的に化学的又は生物学的なものであり得る。ヒドロキシル等の親水性部分又はメチル基等の疎水性頭部基で誘導体化された表面は、疎水性相互作用によって細胞を非特異的に保持することができる。荷電した化学的実体又は生物学的実体を担持する表面は、イオン性相互作用によって細胞を吸着することができる。細胞は更に、細胞に対して幾らかの特異性を有する実体を担持する表面（ＲＧＤ配列含有ペプチド、ポリリシン、正又は負に荷電した表面、コラーゲン、ラミニン、並びにマトリゲル及びマトリゲル様物質を含む他の細胞外マトリックス成分が挙げられるが、これらに限定されない）によって捕捉されていてもよい。細胞は他のタイプの化学修飾表面によって捕捉されていてもよい。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ及び他の金属キレートでコーティングされた表面が細胞及び幹細胞に非特異的に結合する（実施例１５及び図１２を参照されたい）。
【００４３】
好ましい実施形態では、細胞表面上の分子に対して特異親和性を有する部分を表面に付着させて、幹細胞の付着を容易にする。例えば、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４又はＴｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０等の幹細胞の特異的マーカーである細胞表面タンパク質に結合する抗体を表面に付着させる。幹細胞はそれらの細胞表面タンパク質と、培養プレート上のそれらの同種抗体との特異的相互作用によってこれらの表面に接着する。次いで、細胞を標準方法、又はＭＵＣ１＊を刺激する本発明の新規の方法によって培養することができる（実施例１〜実施例４、実施例８〜実施例１０、実施例１２及び図１〜図１０を参照されたい）。別の例では、表面に付着させるリガンドは、成長因子又は成長因子の一部分であり得る。別の例では、表面に付着させるリガンドは、細胞表面分子（成長因子受容体であり得る）を認識する抗体又は抗体の一部分であり得る。別の例では、リガンド複合体を表面上に付着又は固定化させるが、この場合、複合体の少なくとも１つの成員が細胞表面分子に対して親和性を有するか、又は細胞に細胞の成長若しくは分化を調整する作用物質を与える。例えば、プロテインＧは、ヒスチジンタグ−ＮＴＡ−Ｎｉ相互作用によって表面に吸着するか、又は特異的に付着することができ、幹細胞表面マーカーを認識する抗体がプロテインＧとのその相互作用によって表面に付着する（実施例１４、図１１を参照されたい）。
【００４４】
混合表面
場合によっては、リガンドと成分との混合物を提示する表面を有することが望ましい。これらは本質的に生物学的若しくは化学的なものであってもよく、又は生物学的成分と化学的成分との混合物であってもよい。例えば、表面を成長因子又は同等の活性化抗体＋細胞外マトリックスの成分（コラーゲン又はラミニン等）の混合物でコーティングすることができる。ラミニンと成長因子又は抗体との混合物でコーティングした表面も、幹細胞の付着及び成長を促進した。例えば、本発明者らは、コラーゲン又はラミニンと細胞表面マーカーに特異的な抗体とを含む表面コーティングが幹細胞及び幹様細胞の成長に有用であることを示した。
【００４５】
別の例では、ラミニン又はコラーゲンを細胞表面マーカーのリガンドと混合する。実験から、ラミニンと抗ＭＵＣ１＊とを混合することによって、幹細胞の付着及び細胞成長に必要とされる抗体の量が減少し、正常な幹細胞コロニーが発展することが示された。本発明の別の態様では、混合種を表面に付着させるが、この場合、１つ又は複数の成分が表面への細胞の付着を容易にするリガンドであり、他の成分（複数も可）が細胞の機能に影響を及ぼす作用物質を細胞に与える。表面に付着することのできる機能的作用物質の例としては、成長、分化を促進するか、又は多能性を誘導する作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
リガンド付着のための方法
細胞接着を促進するか、又は成長因子であるリガンドは、例えばＥＤＣ／ＮＨＳ又はマレイミドカップリング化学（coupling chemistries）を用いた共有結合カップリング（covalentcoupling）を含むが、これらに限定されない様々な方法で表面に付着させることができる。代替的には、本発明のリガンドは、非共有結合的相互作用又は親和性相互作用によって表面に付着させることができる。例えば、本発明のリガンドにヒスチジンタグを付けた後、ニトリロトリ酢酸−ニッケル（ＮＴＡ−Ｎｉ）部分を介して表面に付着させることができる。アフィニティータグ相互作用を用いて、細胞の培養に好適な成長表面を生成することができる。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ部分を細胞培養フラスコに付着させて、ヒスチジンタグ付きリガンドをＮＴＡ−Ｎｉによって捕捉させる。リガンドは細胞表面受容体に直接的又は間接的に結合して細胞を表面に接続する。リガンドが成長因子でもある場合、リガンドは細胞接着をもたらし、かつ増殖を促進する働きをする（実施例１４、図１１を参照されたい）。
【００４７】
一実施形態では、リガンドは、ＭＵＣ１＊又はＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）等の細胞表面受容体を認識する抗体が結合するプロテインＧ又はプロテインＡである。プロテインＧ又はプロテインＡは、表面上に非特異的に吸着し、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって共有結合的に連結又は付着する。例えば、細胞培養フラスコをＮＴＡ−Ｎｉ部分でコーティングすることができ、それによりヒスチジンタグ付きプロテインＧ又はプロテインＡを表面によって捕捉することができる。次いで、細胞表面受容体に対する抗体を添加すると、抗体は表面上に固定化されたプロテインＧ又はプロテインＡに結合する。
【００４８】
別の態様では、表面に付着するリガンド及び作用物質を、それらが表面から放出されて局所環境を変化させることができるように、又は細胞が作用物質を消費することができるようにして表面に付着させることができる。作用物質を、それが分解するにつれて表面から放出されるか、又は刺激に応答して放出されることができるように表面に付着させることができる。例えば、作用物質を、作用物質が光に応答して又は化学シグナルによって放出されることができるように、感光性又は化学物質感応性のリンカーを用いて表面に付着させることができる。幾つかのリンカーはｐＨの変化に応答して切断される。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４若しくはＮＭ２３等の多能性を誘導する遺伝子若しくは遺伝子産物、又はｍｉＲ−１４５（マイクロＲＮＡ）等の分化を誘導する遺伝子若しくはその産物を培地に添加するか、又は表面に付着させることができる。これらは経時的な分解によって、又は付着結合を切断する特定の光の波長等の特異的シグナルに応答して表面から放出されることができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、表面に付着した又は表面上に固定化されたリガンドは、細胞表面上の成長因子受容体を認識する成長因子である。細胞表面上の成長因子受容体を活性化する抗体は、先に記載された方法のいずれか又はその組み合わせを用いて表面に付着させることができる。一例では、成長因子は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）又は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であり、リガンドが親和性を有する細胞表面上の分子は線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）である。代替的には、リガンドはＦＧＦＲを認識する抗体であってもよい。本発明の別の態様では、成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）であり、リガンドが親和性を有する細胞表面上の分子は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。別の態様では、親和性リガンドは幹細胞因子（ＳＣＦ）、又はｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ−Ｒを活性化する抗体を含む別の作用物質である。成長表面に付着したリガンドは、Ｆｌｔ ３リガンド、トロンボポエチン（thrombopoetin）（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−ｎ、又はその同種受容体に対するそれらの影響を模倣する抗体であってもよい。
【００５０】
ＭＵＣ１＊リガンド
より好ましい実施形態では、成長表面に付着したリガンドは、ＭＵＣ１細胞表面タンパク質に対して親和性を有する。更に好ましい実施形態では、リガンドはこのタンパク質のＰＳＭＧＦＲ部分（ＭＵＣ１＊）に対して親和性を有する。また、更により好ましい実施形態では、リガンドはＭＵＣ１＊の二量化を誘導する。一例では、リガンドは抗ＭＵＣ１＊抗体である（実施例１、実施例４、実施例７、実施例１０及び図１、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｄ、図８）。別の例では、リガンドはＮＭ２３、又はＳ１２０Ｇ等の変異体、又は二量体形成を優先させる（prefers）か、若しくは二量体として機能する他の任意の突然変異体若しくは誘導体である（実施例９、実施例１２、実施例１４、実施例１５、実施例２０並びに図９、図１０、図１１、図１２及び図１９を参照されたい）。表面はＮＭ２３が細胞に二量体として提示されるように構成されていてもよい。別の例では、成長表面に付着したリガンドは、ＭＵＣ１の細胞外ドメインに結合する抗体である。タンデムリピートドメインが切断され、細胞表面から脱落した後も細胞表面に付着したままであるＭＵＣ１の部分に結合する抗体が好ましい。例えば、ＭＵＣ１のＰＳＭＧＦＲ配列に結合する二価抗体は、切断されたＭＵＣ１の成長因子受容体機能を活性化し、細胞増殖を刺激する。ＰＳＭＧＦＲペプチドの少なくとも一部分での免疫化によって生成したポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、表面に付着し、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の活性化によって表面への細胞の付着を促進し、かつ細胞の成長を刺激する。
【００５１】
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれか、並びに天然及び非天然の抗体誘導体の両方が、全ＰＳＭＧＦＲ配列を用いて生成した、又はそれに対する親和性について選択された抗体よりも幹細胞接着に適しているように生成又は選択することができる。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの配列に対応するが、細胞表面に近接した１０個のアミノ酸が欠失したペプチド「Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ」でウサギを免疫化することによって生成したポリクローナル抗体は、完全ＰＳＭＧＦＲペプチド又は最も遠位の１０個のアミノ酸が欠失した「Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ」（QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA）（配列番号３）に対して生成した抗体よりも効率的に幹細胞接着を促進する抗体を生成した（実施例１６及び図１３、図１４を参照されたい）。幹細胞に結合する能力が改善された抗体は、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチド又は他のＮ末端断片を提示する表面上でそれらを親和性精製することによって完全ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体から単離することもできる。
【００５２】
Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合したが、Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドには結合しなかったモノクローナル抗体を分泌したハイブリドーマクローンは、表面への幹細胞の接着を容易にすることが示された（図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４を参照されたい）。対照的に、Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合したが、Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合しなかったモノクローナル抗体は、幹細胞接着をほとんど可能にしなかった。両方のモノクローナル抗体型が、培養培地に添加した場合に細胞成長を刺激することが可能であった。
【００５３】
好ましい実施形態では、ＭＵＣ１＊成長因子受容体のリガンドであるＮＭ２３を提示する表面上で幹細胞を培養する。ＮＭ２３は表面に直接的又は間接的に付着させることができる。本発明の一態様では、二量化を優先させるＮＭ２３又はＳ１２０Ｇ突然変異体を、細胞成長のための表面上に非特異的に吸着させる（実施例１５、図１２を参照されたい）。本発明の別の態様では、表面を初めに、ヒスチジンタグ付きタンパク質又はペプチドに結合するＮＴＡ−Ｎｉ等のアフィニティータグ結合パートナーで誘導体化する。次いで、ヒスチジンタグ付きＮＭ２３をＮＴＡ−Ｎｉ表面に非共有結合的に連結させる。次いで、幹細胞及び幾つかの前駆体等のＭＵＣ１＊陽性細胞をＮＭ２３表面に添加すると、細胞が表面に接着して成長する。更により好ましい実施形態では、ＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ突然変異体をシクロデキストランに共有結合的に連結させる。
【００５４】
採取方法
本発明の別の態様では、本発明の表面から細胞を採取する新規の方法が記載される。本発明は、本発明の表面及び他の多くの細胞成長システムに有用なこれらの採取方法を含む。本発明は、本発明の新規の表面とともに手作業での解離及び酵素的切断等の標準的な採取方法を使用することも含む。細胞採取方法の幾つかは表面の成分の固有性に依存する。例えば、抗体表面に吸着することによって成長する細胞は、抗体エピトープと同じ配列を有するペプチドを過剰に添加することによって放出させることができる。例えば、抗体がＭＵＣ１＊の細胞外ドメインを認識する場合、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの配列の幾つか又は全てを有するペプチドを過剰に添加することによって細胞を放出させることができる。遊離ペプチドは、表面に付着した抗体への結合について細胞上のＭＵＣ１＊受容体と競合する。抗体へのペプチドの結合は細胞を放出させる（実施例４、図６Ｄを参照されたい）。プロテインＧ又はプロテインＡに結合することによって表面に付着する抗体を提示する表面上で培養した細胞は、過剰のＦｃ部分又は過剰の無関連抗体を添加することによって表面から放出される。プロテインＧはＦｃドメインに結合するため、遊離Ｆｃは表面に付着したプロテインＧ又はプロテインＡへの結合について同種抗体と競合し、抗体と複合体形成した細胞を放出させる。リガンドがアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって付着した表面上で培養した細胞は、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用を妨げる作用物質を添加するか、又は結合パートナーと相互作用するアフィニティータグの部分を過剰に添加することによって放出される。例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ表面に結合したヒスチジンタグ付きリガンド上で成長する細胞は、イミダゾール、無関連ヒスチジンペプチドを添加するか、又は表面に付着したリガンドの結合パートナーの少なくとも一部分を過剰に添加することによって放出される。ＮＭ２３表面の場合、細胞は、過剰のペプチドの添加が表面に付着したＮＭ２３への結合についてＭＵＣ１＊細胞表面受容体と競合し、それにより細胞が放出されるように、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの少なくとも一部分と本質的に同じ配列を有するペプチドを過剰に添加することによって放出させることができる。代替的には、ＮＭ２３は表面への付着を容易にするアフィニティータグを用いて作られる。アフィニティータグと表面との間の相互作用を妨げる戦略によって、ＮＭ２３及び付着した細胞が表面から放出される。同様に、Ｈｉｓタグ付きプロテインＧ（＋抗体）又はＨｉｓタグ付きＮＭ２３は、ａ）イミダゾール（０．５Ｍ）又はｂ）過剰の（Ｈｉｓ）６ペプチドを添加することによって表面から放出させることができる。
【００５５】
任意のアフィニティータグ、結合パートナー対を表面へのリガンドの付着に使用することができ、アフィニティータグ−結合パートナー相互作用の遮断が幹細胞を表面から放出させる。好適なアフィニティータグ、結合パートナー対の例としては、ＮＴＡ−Ｎｉ／ヒスチジンタグ、グルタチオン／ＧＳＴ融合体、マルトース／マルトース結合タンパク質及びビオチン／ストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
成長培地
本明細書中に記載の表面及び採取方法は、標準的な幹細胞培養方法及び新規の方法と適合する。標準的な幹細胞培養培地は、これまでの幹細胞成長には、これらの細胞によって分泌された未同定の成長因子が必要とされていたため、外因性の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の添加及び線維芽細胞フィーダー細胞上での成長を必要とする。幹細胞は、ｂＦＧＦに加えて線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地（ＣＭ）を培地のおよそ３０％〜５０％添加する必要がある点を除けば、標準的なプロトコルによるマトリゲル上でも成長させることができる。不活性化ヒト包皮（ＨＳ２７）線維芽細胞フィーダー細胞は通常胚性幹細胞の成長に使用される。
【００５７】
標準的な成長培地が本発明の表面上での成長に適合することを実証した（実施例４、図６Ｃ及び実施例３、図４）。マトリゲル上での成長と同様、ｂＦＧＦ媒介成長には、本明細書中に記載の本発明の表面上での幹細胞成長を支持するために線維芽細胞馴化培地が必要とされる。ＭＵＣ１＊刺激因子又は二量化剤を含有する培養培地が好ましい。ＰＳＭＧＦＲペプチドを認識する抗体、又はＮＭ２３の野生型若しくは突然変異体Ｓ１２０Ｇが好ましい成長因子であり、ｂＦＧＦ及び線維芽細胞馴化培地の代わりとすることができる（図６、図９、図１０、図１１及び図１２を参照されたい）。マトリゲル、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｒｔ（Invitrogen）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Invitrogen）又は本発明の表面のいずれかに付着したヒト胚性幹細胞の成長は、抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３−Ｓ１２０ＧのいずれかをｂＦＧＦ及びＨＳ２７馴化培地の代わりに最小幹細胞培地に添加した場合に、一貫してより良好であり、成長速度、コロニー形態及び分化の阻害は、ＭＵＣ１＊刺激因子でｂＦＧＦ＋馴化培地（ＣＭ）を置き換えた場合に一貫してより良好である。
【００５８】
成長ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地は、分化を阻害する一方で幹細胞成長及びコロニー形成を増大させる。マトリゲル、ＮＴＡ−Ｎｉ、抗ＭＵＣ１＊抗体又はＮＭ２３表面上で成長するヒト幹細胞を、最小幹細胞培地＋成長ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地中で培養した。ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞であるＴ４７Ｄ細胞に由来する馴化培地は、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、又は抗ＭＵＣ１＊抗体又はｂＦＧＦに添加した場合に幹細胞成長、コロニー形成及び分化の阻害を、ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地と比較して大きく改善した（実施例１４、実施例１５、及び図１１、図１２を参照されたい）。本明細書中に記載の表面及び採取方法は、幹細胞以外の細胞に対して使用することができる。
【００５９】
細胞選別のための抗ＭＵＣ１＊抗体
精製：
多能性幹細胞の純粋集団を細胞の混合集団から精製することができる。大量の幹細胞の成長によって、自発的に分化した幾つかの幹細胞を生成することができる。したがって、所望の多能性細胞を捕捉し、分化した細胞を捨てる（disgarding）ハイスループット（throughout）方法が必要とされる場合がある。ＭＵＣ１＊は、細胞が分化を開始する際にＯＣＴ４より前に失われる多能性の細胞表面マーカーである。多能性（ＭＵＣ１＊陽性）幹細胞の純粋集団は、抗ＭＵＣ１＊抗体で誘導体化されたカラム上にそれらを捕捉することによって混合集団から単離することができる。一方で、ＭＵＣ１＊アフィニティーカラムは、奇形腫形成のリスクを減らすために分化した細胞からＭＵＣ１＊陽性細胞を除去するよう移植の前に使用される。
【００６０】
多くの場合、幹細胞と前駆細胞とをそれらの分化段階に応じて分離することが望ましい。本発明者らは以前、多能性幹細胞が短縮ＭＵＣ１＊形態を提示するが、完全長ＭＵＣ１タンパク質を提示せず、分化が開始すると、ＭＵＣ１の切断が停止し、細胞がほとんどＭＵＣ１＊陰性で、完全長形態に陽性となることを示した。完全長ＭＵＣ１のタンデムリピート単位に結合する多くの抗体、例えば市販のＶＵ４Ｈ５抗体又はＨＭＰＶ抗体が利用可能である。ＭＵＣ１の成長因子受容体形態であるＭＵＣ１＊への切断は、これらの部分を細胞表面から放出させるため、タンデムリピートに対する抗体がＭＵＣ１＊を染色しなくなる。ＰＳＭＧＦＲ配列はＭＵＣ１及びその短縮形態（ＭＵＣ１＊）の両方に存在するが、ＰＳＭＧＦＲ配列に対する抗体は、エピトープが隠されているため完全長ＭＵＣ１に結合しない。図１５Ａ〜図１５Ｌは、分化を開始する前及び続いてその後のＨ９ヒト胚性幹細胞の免疫細胞化学的（ＩＣＣ）染色の写真を示す。完全ＰＳＭＧＦＲペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体は、未分化のコロニーのほぼ全ての細胞を染色した。幹細胞の多能性の最も基準となる指標であるＯＣＴ４は、抗ＭＵＣ１＊（抗ＰＳＭＧＦＲとも呼ばれる）抗体染色と正確に共局在化した（図１５Ａ、図１５Ｂ）。ＭＵＣ１完全長の遠位タンデムリピートに結合するＶＵ４Ｈ５抗体は、未分化の細胞のいずれも染色しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、これらの同じ細胞を、１４日間ｂＦＧＦを控えて分化させると、逆のＭＵＣ１パターンが観察された。ＭＵＣ１＊染色又はＯＣＴ４染色は観察されなかったが（図１５Ｄ、図１５Ｅ）、全ての細胞が完全長ＭＵＣ１に陽性であると染色された（図１５Ｆ）。同様に、未分化の幹細胞がＮＭ２３に陽性であると染色され、ＭＵＣ１＊及びＮＭ２３のリガンドがＭＵＣ１＊（図１５Ｇ〜図１５Ｉ）及びＯＣＴ４（図１５Ｊ〜図１５Ｌ）と正確に共局在化した。切断酵素ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６及びＡＤＡＭ−１７はＭＵＣ１の切断に関与していた。これらはまた、未分化の幹細胞上でＭＵＣ１＊と共局在化する（Hikita et al, PLoS ONE, 2008）。
【００６１】
したがって、任意でＮＭ２３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６、ＡＤＡＭ−１７及びＯＣＴ４に対する抗体を含む他の抗体と組み合わせた抗ＭＵＣ１＊抗体を使用して、多能性幹細胞を混合プールから同定し、単離することができる。ＳＳＥＡ３／４又はＴｒａ １−８１／１−６０に対する抗体も、多能性幹細胞を同定するために抗ＭＵＣ１＊抗体とともに使用することができる。未分化の幹細胞及び分化した幹細胞のプールは、ＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する抗体及び短縮される際に放出されるＭＵＣ１の部分に結合する抗体で染色することができる。次いで、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）等の標準的な細胞分離方法を用いて、ＭＵＣ１＊提示細胞をこのタンパク質の完全長形態を提示する細胞から分離することができる。場合によっては、分化したこれらの幹細胞を多能性のままである細胞から除去することが望ましい。他の場合では、多能性（ＭＵＣ１＊陽性）のままであるこれらの幹細胞を除去することが、これらが宿主に移植した場合に奇形腫形成のリスクを増大させる可能性があることから望ましい。抗ＭＵＣ１＊抗体、すなわち抗ＰＳＭＧＦＲ抗体とＮＭ２３抗体との組み合わせも、多能性幹細胞を同定し、更にＭＵＣ１＊刺激によって展開させることのできるこれらの前駆細胞を同定するために使用することができる。
【００６２】
がん幹細胞選別による枯渇
がん細胞は化学療法薬に対する耐性を獲得した場合にＭＵＣ１＊の発現を増大させるが、ＭＵＣ１完全長の発現は増大させない。化学療法に対する耐性を有するこれらの細胞は、がん幹細胞とも呼ばれる。したがって、任意でＮＭ２３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１６、ＡＤＡＭ−１７及びＯＣＴ４に対する抗体を含む他の抗体と組み合わせた抗ＭＵＣ１＊抗体を使用してがん幹細胞を同定することができる。本発明の一実施形態では、抗ＭＵＣ１＊抗体及びこれらの他の抗体の組み合わせを使用して、患者、例えば患者の血液からがん幹細胞を枯渇させる。
【００６３】
ＦＡＣＳ及びヒト幹細胞の成長
本発明は、抗ＭＵＣ１＊抗体、又はＮＭ２３若しくはＮＭ２３ Ｓ１２０Ｇ又は二量化を優先させる他の突然変異体を使用して、ＭＵＣ１の短縮形態（ＭＵＣ１＊）を発現する前駆細胞の成長を刺激し、その分化を阻害することを更に開示する。ＭＵＣ１の切断は幹細胞が分化を開始すると停止するが、切断は後の段階で再開する。造血幹細胞（ＨＳＣ）は例えば、短縮形態であるＭＵＣ１＊を発現し、細胞をＭＵＣ１＊二量化剤に曝露することによって増殖させることができる。造血幹細胞は幹細胞であるとみなされる場合、ＣＤ３４陽性かつＣＤ３８陰性である。造血幹細胞は次の分化段階に進むと、ＣＤ３４陽性かつＣＤ３８陽性になる。臍帯血からヒトＨＳＣを得て、最小幹細胞培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において様々な濃度で培養した。細胞を１１日間、プレーティング後５日目に新たな抗体を添加して培養した。細胞を分析し、ＦＡＣＳによって選別した。図１６Ａ及び図１６Ｂ、実施例１８は、造血幹細胞のままであった細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）の数が、抗ＭＵＣ１＊濃度の増大に伴って増加したことを示している。一方で、次の前駆体段階へと進んだ細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）の数は、抗ＭＵＣ１＊濃度が減少するとともに増加した。これらの結果から、ＭＵＣ１＊成長因子受容体の刺激がＨＳＣの分化を阻害したことが示される。
【００６４】
造血は胎児及び発達早期（early life）の肝臓において起こる。ヒト胎児肝細胞を、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインのＰＳＭＧＦＲ配列に結合する抗体、及び完全長ＭＵＣ１のタンデムリピート単位に結合する市販の抗体であるＶＵ４Ｈ５を用いてＦＡＣＳ選別した。図１７ＢのＦＡＣＳスキャンは、胎児肝細胞の大半がＭＵＣ１＊陽性かつ完全長陰性であることを示している。ＭＵＣ１＊陽性胎児肝細胞を単離し、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において成長させることによって展開させた。図１８のグラフは、胎児肝細胞の成長が最適抗ＭＵＣ１＊抗体濃度で大きく増大することを示している。抗体が過剰になり、各々２つの受容体に１つの抗体が結合するのではなく、各々の受容体に１つの抗体が付着すると成長は低下する。同様に、未分化幹細胞を分化した細胞から、ＦＡＣＳ又は完全長ＭＵＣ１タンパク質のＰＳＭＧＦＲ領域若しくは遠位部分に結合する抗体等の結合剤を使用する他の分離技術によって分離することができる。
【００６５】
他のタイプの細胞がＭＵＣ１の短縮形態を提示することがあり、ＭＵＣ１タンパク質のＰＳＭＧＦＲ部分を認識する抗体が細胞に結合するか否かに基づいて細胞集団から単離するか、又は枯渇させることができる。
【００６６】
捕捉、成長、放出、選別の組み合わせ
場合によっては、成長期間前、成長期間中又は成長期間後に或る細胞型を別の細胞型から分離することが望ましいことがある。一方法では、表面の各々の空間アドレスが異なるリガンドを提示し、その各々が異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する。細胞を表面に添加し、親和性相互作用によって各々の細胞型の表面上のマーカーに応じて空間的に分離する。分離した細胞は、個々に採取して別個の位置で培養するか、又は混合物として培養した後、位置によっては後で採取することができる。一方法では、異なる様式の付着を用いて、異なるマーカーに特異的なリガンドを付着させる。例えば、或る位置で、多能性細胞のマーカーであるＭＵＣ１＊に対するリガンドをヒスチジンタグ／ＮＴＡ−Ｎｉ相互作用によって表面に付着させて、別の位置で、外胚葉系列に沿って分化する細胞のマーカーに対する抗体をプロテインＧによって表面に付着させる。このようにして、未分化の細胞をイミダゾール（imidzole）の添加によって放出させて、外胚葉細胞を過剰のＦｃの添加によって放出させる。別の方法では、各々が異なる親和性リガンドを提示する２つ以上の表面が別個の位置に収容される。２つ以上の表面はフローチャネルによって接続される。一実施形態では、細胞の混合物を、表面が提示するリガンドの同種分子を発現する細胞を捕捉する第１の表面に導入する。次いで、その上清又はフロースルーを、その表面への結合を容易にする同種細胞表面分子を提示する細胞を捕捉する第２の表面に導入する。次いで、その上清又はフロースルーを、所望の細胞型が空間的にアドレス可能な表面によって捕捉されるように第３の表面等に導入する。この方法を使用して、細胞をタイプによって分離するか、又は細胞を分離し、次いで成長させる。フローチャネル及びバルブを、細胞分離の期間中にフローを流すが、その後特定のタイプの細胞をその特定のタイプの細胞に最適な条件下で培養することができるように限定して使用することができる。
【００６７】
本発明の方法は、成長プロセス中に分化を受ける可能性のある細胞の分離に好適である。各々が特定の分化状態のマーカー又は細胞型に対する親和性リガンドを提示する混合表面を含むシステムを、分化状態に応じて子孫を選別する動的システムにおいて使用する。細胞を初めに、別の分化状態にある細胞又はその子孫によってもはや発現されない初期分化状態のマーカーであるそれらの細胞表面タンパク質の１つの相互作用によって第１の表面に付着させる。このようにして細胞は放出されるが、この場合、細胞はその新たな分化状態を規定する細胞表面マーカーに対して親和性を有するリガンドを提示する新たな位置に移動する。この選別は新たな表面への上清の導入、又は自己選別によって地理的に、例えばフローチャネル内の位置で行うことができるが、ここでは細胞が或る位置（粒子であり得る）から放出され、第２の位置（隣接する粒子であり得る）に移動し、そこで異なる細胞マーカーに対する親和性リガンドが固定化される。一実施形態では、異なる親和性リガンドを提示するビーズ又は粒子を混合するが、細胞は表面上に同種分子を提示するビーズ／粒子に付着する。この場合、ビーズ又は粒子は細胞付着後のそれらの選別を可能にする性質を有する。例えば、ＣＤ３４＋／３８−造血幹細胞に対して親和性を有するリガンド（複数も可）を提示する電磁ビーズを、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋前駆細胞に対して親和性を有するリガンド（複数も可）を提示する非電磁ビーズと混合する。細胞培養の後、ＣＤ３４＋／３８−細胞を担持するビーズを磁気的に単離して回収するが、残りのビーズはＣＤ３４＋／３８＋細胞の集団を含む。代替的には、空間的位置、ビーズ又は粒子には、精製のために他の表面によって捕捉され得る部分が付着していてもよい。一例としては、親和性リガンド及び精製リガンドを提示するビーズは、親和性リガンドと同種細胞表面受容体との間の相互作用によって所望の全ての細胞型を捕捉する。精製リガンドは、精製リガンドと第２の表面上の部分との結合によってビーズを特異的空間アドレスに付着させる。本発明は、この方法を使用して混合プールから様々な分化段階にある細胞を選別することを含む。本発明は、この方法を使用して、細胞が多能性であるように誘導され、或る特定の幹様の性質を有するこれらの細胞を多能性誘導プロセス中の様々な時点で選択して増幅することが望ましい細胞培養状況において細胞を選別することを含む。
【００６８】
代替的方法においては、細胞を異なる細胞型に特異的なリガンドを提示する粒子上への固定化によって分離する。細胞の混合物を粒子の混合物に導入する。細胞は、その細胞表面分子に対して親和性を有するリガンドを提示する粒子上で分離される。次いで、細胞を担持する粒子を分離した後に培養しても、又は全てをまとめて培養してから成長期間後に分離してもよい。細胞を担持する粒子は、粒子自体の性質又は粒子に付着したリガンドの性質に基づく様々な手段によって分離される。例えば、粒子はサイズ、電荷、密度、光学的性質、電磁的性質等に基づいて分離することができる。これらの性質は粒子自体の固有の性質であっても、又は付着したリガンドの性質であってもよい。例えば、粒子自体が蛍光性であっても、又は粒子に付着したリガンドが蛍光性であってもよい。粒子は磁気特性、帯電特性、蛍光特性又は電子特性を含むが、これらに限定されない性質によって容易に分離される。代替的には、第２の親和性リガンドを担持するリガンドを提示する粒子を使用することができる。この場合、粒子は細胞の付着を容易にするリガンドを担持することに加えて、細胞を担持する粒子の付着を容易にし、表面又は位置を分離する部分も担持し得る。
【００６９】
本発明の別の態様では、１つの表面が異なる機能性を有する２つ以上の異なるリガンドを提示する。場合によっては、２つ以上のリガンドは、特異的な細胞への付着について単一のリガンドよりも選択的である。別の例では、第１のリガンドが細胞の付着を媒介し、第２のリガンドが別の表面又は別の位置であってもよい特異的位置に細胞／表面複合体を標的化する。このようにして、特異的な細胞型を捕捉するリガンドを担持する物品又は粒子である表面は、第２の表面又は位置への付着によって非標的細胞から精製することができる。他の場合においては、成長期間前、成長期間後又は成長期間中に細胞をタイプに応じて分離する能力を更に有する２つ以上の異なる細胞型を捕捉することが望ましいこともある。これは、特異的細胞型の付着を容易にする第１のリガンド、及び表面を特異的位置に標的化する第２のリガンドを提示する表面又は粒子を使用することによって達成される。標的化リガンドは、実体に異なる位置で結合することによって粒子を標的化する化学的部分又は生物学的部分であり得る。代替的には、標的化リガンドは、粒子を他の粒子から分離可能とする或る特定の性質を粒子に付与する実体であり得る。例えば、リガンドは蛍光部分、色素、荷電部分、又は光学的性質若しくは電磁的性質を有する部分であり得る。本発明の別の態様では、標的化リガンドはリガンド自体ではなく、むしろ粒子の特異的性質である。
【００７０】
本発明の表面及び新規の成長因子は、ウェーブバッグ、ローラーボトルを含むが、これらに限定されない様々なフォーマットでの幹細胞、前駆細胞及び他のＭＵＣ１＊陽性細胞の成長、懸濁液中での成長に使用すること、並びに生きた宿主を含む任意のタイプの格納容器内で使用することが想定される。格納容器は容器への細胞の接着を防止するために運動が維持される。表面に固定化されたリガンドと細胞上のそれらの同種標的との間の相互作用により、細胞を喪失することなく培地の交換が可能になる。細胞を採取するか又は枯渇させることが所望される場合、粒子であり得る表面は、遠心分離、重力、電磁場又は電場によって単離することができる。作用物質を添加して細胞を表面から放出させてもよい。過剰の親和性リガンドを、それらが細胞表面上の受容体への結合について競合し、それにより細胞が粒子から放出されるように溶液中に遊離させて添加することができる。一実施形態では、親和性リガンドが抗体である場合、抗体を粒子から放出させる働きをする抗体のＦｃ部分が過剰に添加され、細胞＋活性化リガンドが溶液中で遊離する。別の実施形態では、リガンドはＮＭ２３又はその突然変異体である。
【００７１】
本発明は、四量体及び六量体の形成を優先させるＮＭ２３野生型又は突然変異体を使用して、幹細胞、前駆体又は幹様となるように誘導される細胞の分化を、核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はタンパク質の導入によって誘導することを更に開示する。
【００７２】
本発明は、幹細胞及び幹様細胞の分化を誘導する方法も含む。ＭＵＣ１＊とその二量化リガンドとの相互作用を遮断するリガンドが分化を誘導する。例えば、ＮＭ２３とＭＵＣ１＊細胞外ドメインとの相互作用を遮断するＭＵＣ１＊の細胞外ドメインの配列を十分に含有するペプチドの添加は、分化を誘導する。同様に、低濃度の抗ＭＵＣ１＊抗体のＦａｂ（一価）の添加は、多能性を促進し、分化の開始をもたらす受容体二量化（dimeirization）を防止する。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド又はＭＵＣ１＊に結合する抗体のＦａｂを培養培地に添加するか、又は表面に付着させることができる。次いで、幹細胞を採取し、抗ＭＵＣ１＊ＦａｂのＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド等のリガンドを提示する表面上に再プレーティングして、分化を誘導することができる。マイクロＲＮＡ １４５（ｍｉＲ−１４５）は、ＭＵＣ１を抑制し、その際に分化を誘導する。ｍｉＲ−１４５を培養中の幹細胞及び前駆体に添加して、分化を促進することができる。対照的に、ｍｉＲ−１４５に特異的なｓｉＲＮＡ等のｍｉＲ−１４５の阻害剤を添加して、幹細胞及び幹様細胞を成長させて、それらの分化を阻害することができる。
【００７３】
リガンド−ポリマー成長表面：
ポリマー又はデキストリン若しくはシクロデキストラン等の高分子への本発明のリガンドの付着は、標的幹細胞及び前駆細胞を捕捉し成長させるそれらの能力を大きく改善する。得られる表面は溶液中のリガンドを模倣する。タンパク質及び抗体の両方のシクロデキストランへの共有結合的付着は、リガンドを表面上に直接的に吸着させた場合と比較して、細胞接着を増大させて、必要とされるリガンドの量を大きく減少させた。シクロデキストランに連結したＮＭ２３又は抗ＭＵＣ１＊等のリガンドは、培地中の更なる成長因子を必要とすることなく、最小培地中の胚性幹細胞の成長を支持した。抗体並びに抗ＭＵＣ１＊及びＮＭ２３等の同種タンパク質は、他のポリマー並びに多孔質膜及び足場を含む他の表面に付着することができる。本発明は、構造化された表面及び構造化されていない表面の両方を含む。例えばステント、耳等の人工構造を、幹細胞及び前駆細胞の付着を容易にする生物学的作用物質及び／又は化学的作用物質でコーティングすることができる。これらのリガンドは任意で、幹細胞又は前駆細胞に、それらの成長及び／又は分化に影響を与える栄養素又はシグナルを提供し得る。
【００７４】
合成抗体成長表面：
本発明は、細胞成長培地、更には細胞の付着を容易にする表面コーティングへの成長因子のような合成リガンドの使用も意図する。例えば、細胞表面タンパク質に結合する小分子は、標準的なスクリーニング方法を用いて容易に同定される。本発明者らは、ＭＵＣ１＊細胞外ドメイン、特にＰＳＭＧＦＲペプチドに結合する小分子を以前に開示した。これらの合成分子を続いて、非接着性細胞（幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＭＵＣ１＊を発現する造血幹細胞のような初期前駆体等）の吸着及び成長のために表面に非共有結合的又は共有結合的に付着させることができる。合成リガンドが二量化によって活性化される成長因子受容体に結合する場合、小分子の活性化二量体は２つの小分子を共有結合的に結び付いて二量体とすることによって作製することができる。好ましい実施形態では、小分子はＰＳＭＧＦＲペプチドに結合し、小分子はそれらが二量体となり、人工成長因子として機能するように成長因子受容体に結合する。本発明の別の態様では、小分子の単量体を、それらが二量体として振舞うのに十分なほど接近するように表面に付着させることができる。すなわち、表面は、小分子が受容体を活性化する確定された配置で細胞表面受容体に提示されるようにリンカーとして働く。これらの小分子二量体は、例えば、成長培地に添加する、表面に吸着又は共有結合的に付着させる等の天然の成長因子と同じ方法で使用することができる。合成表面はａ）より安価に製造され、ｂ）長期の保管が可能であり、及びｃ）分解に影響されない可能性がある。本発明者らは、ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインに高い親和性をもって結合する小分子を以前に記載した。抗ＭＵＣ１＊抗体を模倣する小分子二量体（二価）は、小分子をリンカーに連結することによって合成される。合成抗体は、プレート表面に直接的に又はポリマーコーティングを介して固定化することができる。
【００７５】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される実施形態に加えて、本発明の様々な変更形態が、以上の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。以下の実施例は限定としてではなく、本発明の例示として与えられる。
【実施例】
【００７６】
実施例１．マトリゲルに付着させて、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した多能性幹細胞は、ｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地を添加した場合の成長よりも分化せずにより速く増殖する
Ｈ９ ｈＥＳＣ（WiCell）又はＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）を、６ウェルプレート（BD Falcon）においてマイトマイシンＣ不活性化Ｈｓ２７ヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ）上、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。ｈＥＳＣ培養培地は、２０％ノックアウト血清代替物、１％非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（全てInvitrogen製）及び４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Peprotech）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉからなるものであった。細胞を５日〜７日毎に１：３の比率で手作業で解離することによって継代し、培地を４８時間毎に交換した。幾つかの実験においては、ｈＥＳＣを、３０％Ｈｓ２７馴化培地及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したｈＥＳＣ培養培地を有するマトリゲル（BD Biosciences）上で成長させた。抗ＭＵＣ１＊を添加した他の実験においては、馴化培地及びｂＦＧＦは除外した。これを「最小培地」（ＭＭと略される）と称する。
【００７７】
図１は、抗ＭＵＣ１＊で処理したヒト幹細胞コロニーのＯＣＴ４免疫蛍光を示す。Ｈ９細胞をトリプシン解離し、マトリゲルでプレコーティングした８ウェルチャンバースライドに４×１０４細胞／ウェルで播種した。５週間１日おきに培地を交換し、抗体を二価抗ＭＵＣ１＊について１μｇ／ｍｌという最終濃度で添加した。細胞をＯＣＴ４特異的抗体（Santa Cruz、クローンＨ−１３４及びクローンＣ−１０）及びＤＡＰＩで染色した。
【００７８】
図１は、５週間の成長の後、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した場合にヒト胚性Ｈ９幹細胞が１００％の多能性をもって（pluripotently）成長したことを示している。最小培地＋ｂＦＧＦ及びフィーダー細胞に由来する３０％馴化培地を供給したこと以外は同様に成長させた細胞は、増殖がより小さく、より分化していた。核のＤＡＰＩ染色と多能性細胞を特定するＯＣＴ４染色とを比較されたい。点線は未分化の部分の境界を示している。
【００７９】
実施例２．マトリゲル上で抗ＭＵＣ１＊において培養した多能性幹細胞は、安定な核型を維持し、正常に分化する
ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ ｈｕ ＥＳ細胞（Invitrogen）をマトリゲル上にプレーティングし、最小培地（実施例１を参照されたい）＋ウサギポリクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体（ＳＲＹ ２ａ）において、８０ｎｇ／ｍｌで６ヶ月間にわたって１８継代の間培養した。細胞をペレット化し（pelleted）、ＤＮＡ抽出し、核型分析を外注した。図２は、１８回の継代の終了時の核型が変化しなかったことを示している。この幹細胞株は三染色体（tri-somal）異常を有するが、核型が安定であり、抗ＭＵＣ１＊において他の成長因子の非存在下で培養することによって変化しなかったことは妥当であることに留意されたい。
【００８０】
複数回継代したＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ細胞のこの同じバッチから、未分化の幹細胞をコラゲナーゼで処理することによって採取した後、最小培地中に懸濁し１４日間置いた。この期間中、分化を促進するために抗ＭＵＣ１＊抗体を取り除くことに留意されたい。これによって細胞が胚様体（embroid bodies）を形成するが、これをゼラチン上にプレーティングし７日間置いた後、３つの生殖系列のマーカーを認識する抗体で染色した：図３Ａ）細胞はＯＣＴ４陰性であり、分化したことが示された；図３Ｂ）内胚葉のマーカーであるαフェトプロテインに陽性であった；図３Ｃ）外胚葉のマーカーであるネスチンに陽性であった；及び図３Ｄ）中胚葉生殖系列のマーカーである平滑筋アクチンに陽性であった。
【００８１】
実施例３．多能性幹細胞の成長を促進する表面
ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインに結合し、それを二量化するリガンドを提示する表面は、プレート表面に接着する方法を多能性幹細胞に提供し、更にＭＵＣ１＊の成長因子受容体機能を活性化する。細胞培養フラスコ、ペトリ皿又はマルチウェルプレートを、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインの配列：GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗体でコーティングした。直前に与えられた配列に結合する抗体は、本明細書中では抗ＭＵＣ１＊抗体又は抗ＰＳＭＧＦＲ抗体と称される。組織培養処理した及び裸のプラスチックプレート及びポリスチレンプレートを使用した。
【００８２】
一例においては、抗ＭＵＣ１＊抗体（Zymed: custom antibody service）を、９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）のウェルに３０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ又は３００ｕｇ／ｍｌ添加し、４℃で一晩吸着させた。未分化のＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）幹細胞を最小培地中に懸濁した。最小培地は４００ｍｌのＤＭＥ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（Invitrogen＃１０５６５−０１８、１００ｍｌのノックアウト血清代替物（ＫＯ−ＳＲ、Invitrogen＃１０８２８−０２８）、及び５ｍｌの１００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Invitrogen＃１１１４０−０５０）、及び０．９ｍｌ（０．１ｍＭ）のβ−メルカプトエタノール（５５ｍＭストック、Invitrogen＃２１９８５−０２３）である。ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ幹細胞を、抗ＭＵＣ１＊抗体をコーティングした表面上に１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。細胞を２４時間付着させた。次いで、細胞を最小培地単独において培地を４８時間毎に交換しながら５日間培養した。
【００８３】
比較のために、対照ウェル中の細胞を、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞に由来する３０％馴化培地を添加した培地中で培養した。図４は、生細胞からの蛍光をこれらの細胞を成長させた表面上での抗ＭＵＣ１＊抗体密度に応じて測定する、カルセインＡＭ（分子プローブ）染色によるグラフを示す。図４のグラフは、抗ＭＵＣ１＊表面上で成長させた細胞が他の任意の成長因子の非存在下で増殖することを示している。成長はｂＦＧＦ及びフィーダー細胞から分泌された特性化されていない因子の添加によって緩やかにしか向上しない。陰性対照として、無関連抗体を表面上にプレーティングした。これらの表面上にプレーティングした幹細胞は接着せず、浮遊しているか又は２４時間の付着期間の終了時までに死滅していた。
【００８４】
並行して、得られた幹細胞をＤＡＰＩ（核染色剤）及び抗ＯＣＴ４で二重染色した。ＯＣＴ４陽性とＤＡＰＩ染色との１：１の相関から、得られる細胞が多能性であったことが確認される（図５を参照されたい）。
【００８５】
実施例４．ヒト多能性幹細胞は、ＭＵＣ１＊刺激因子を溶液中に添加した又は添加していない抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で増殖する
ヒト胚性幹細胞株を、組織培養処理プレート、ポリスチレンプレート又はチャンバースライドプレートのいずれかに吸着させた抗ＭＵＣ１＊抗体上で成長するその能力について試験した。１００ｕｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊をプレート上に吸着させて、４℃で一晩吸着させた。未分化のヒトＨ９胚性幹細胞を９６ウェルプレートの１ウェル当たり１００００細胞若しくは４００００細胞、又は８ウェルプレートの１ウェル当たり２５０００細胞でプレーティングした。いずれの場合においても、未分化の幹細胞を抗ＭＵＣ１＊表面上で付着及び増殖させて、最小培地単独において又は最小幹細胞成長培地に抗ＭＵＣ１＊を添加して培養した。次いで、未分化のＨ９幹細胞をＡ）最小培地、Ｂ）最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又はＣ）最小培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地において培養した。実験は３連で行った。未分化の幹細胞が抗ＭＵＣ１＊表面に接着した。未分化のコロニーは、抗ＭＵＣ１＊抗体を最小培地に更に添加した場合に最も速く成長した。しかしながら、同様の形態及び品質の未分化幹細胞コロニーが、最小培地単独において培養したウェル内に一両日中に展開した。未分化の（undiffereniated）幹細胞コロニーの増殖量及び品質は、細胞を最小培地、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊、又は最小培地＋ｂＦＧＦ及び線維芽細胞に由来する馴化培地のいずれで培養したかに関わらず同程度であった。多能性幹細胞が得られ、５日目〜７日目に分割することができたが、これは標準的なフィーダー細胞、ｂＦＧＦプロトコルに従って成長させた幹細胞に典型的である。図６は、異なる培地：６Ａ）最小培地、６Ｂ）最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又は６Ｃ）最小培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地において培養した場合の成長させたウェルの写真を示す。１と付されたパネル（例えばＡ１、Ｂ１、Ｃ１）は、３日間の成長後に撮影した写真であり、Ａ２、Ｂ２及びＢ３は７日目に撮影した同じウェルの写真である。
【００８６】
実施例５．幹細胞を採取する方法
上記実施例４で成長させた幹細胞は、７日目に採取及び分割することが可能な状態であった。細胞は抗ＭＵＣ１＊表面上に固定化されているため、プレート表面上の抗ＭＵＣ１＊抗体への結合について細胞表面受容体と競合するペプチドを添加することによって放出させることができると推論した。配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するペプチドは、ＭＵＣ１＊受容体の細胞外ドメインに相当し、抗ＭＵＣ１＊抗体が産生されるペプチドでもあったが、本明細書中ではＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチド又はＰＳＭＧＦＲペプチドと称される。ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドを成長幹細胞に１０ｕＭの濃度で添加し、３０分間インキュベートした。その時点で、幹細胞が表面から放出されていることが観察された。上清中の幹細胞を回収し、すすいで、新たな抗ＭＵＣ１＊表面上に再プレーティングし、そこで細胞を接着させ増殖を続けた。この手順は、ヒト胚性幹（ｈｕＥＳ）細胞株ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ（Invitrogen）、続いてｈｕＥＳ Ｈ９を使用しても首尾よく行われた。図６Ｄは、抗ＭＵＣ１＊抗体表面上で成長させて、単一細胞から培養し、次いで競合ペプチドを用いた放出によって採取し、新たな抗ＭＵＣ１＊表面上に再プレーティングし、そこで増殖を続けたＨ９幹細胞を示す。
【００８７】
実施例６．β−シクロデキストリンに連結した抗ＭＵＣ１＊抗体は、ＭＵＣ１＊成長因子と細胞表面受容体との溶液相互作用を刺激する
抗ＭＵＣ１＊抗体を、標準的な連結プロトコル（Fraschini, C.; Vignon, M.R. Selective oxidation of primary alcoholgroups of β-cyclodextrin mediated by 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxylradical (TEMPO). Carbohydrate Research 2000. 328(4):585-589）に従ってカルボキシ−β−シクロデキストリン（Ｃβ−ＣＤ）に共有結合的に連結した。９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）を、β−シクロデキストリンに連結した抗ＭＵＣ１＊によって０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ、３００ｕｇ／ｍｌ又は１０００ｕｇ／ｍｌの最終抗体濃度でコーティングした。各々のウェル内のβ−シクロデキストリン濃度は一定に維持し、抗体濃度のみを変化させた。対照として、抗ＭＵＣ１＊抗体をシクロデキストリンなしにプレート上に直接吸着させた。ＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ幹細胞の単一細胞懸濁液を作製し、細胞を１００００細胞／ウェルの密度で最小培地中にプレーティングした。幹細胞は抗体表面とシクロデキストリン表面に連結した抗体との両方に付着し、その上で増殖した。他の成長因子は添加しなかった。プレーティングの２日後、生細胞をカルセインＡＭ試薬によってアッセイした。図７のグラフは、最小培地における幹細胞成長がβ−シクロデキストリン上に提示される抗ＭＵＣ１＊抗体によって支持され、おそらくは成長細胞への抗体の３次元提示のために、必要とされる抗体量が培養プレート上に吸着した裸の（naked：ネイキッド）抗体より少ないことを示している。
【００８８】
実施例７．任意の細胞表面抗原に対する抗体は幹細胞を表面に付着させて、従来の手段によって又は抗ＭＵＣ１＊抗体を最小培地に添加することによって培養した場合に増殖する
ＳＳＥＡ４抗体、Ｔｒａ １−６０抗体及びＴｒａ １−８１抗体は、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において培養した場合に多能性幹細胞の成長を促進する。９６ウェル細胞培養処理プレート（組織培養試験プレート９６Ｆ ＴＰＰ ＃９２０９６）を、抗ＳＳＥＡ４抗体（Santa Cruz）、抗Ｔｒａ １−６０抗体（Santa Cruz）又は抗Ｔｒａ １−８１抗体（Santa Cruz）を用いて、滅菌ＰＢＳ中０ｕｇ／ｍｌ、３ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌの最終濃度、４℃で、別個に３連でコーティングした。翌日、細胞をＰＢＳですすいだ。マトリゲル上で成長させて、最小幹細胞成長培地＋線維芽細胞に由来する３０％馴化培地＋４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦにおいて培養したＢＧ０１ｖ／ｈＯＧヒト胚性幹細胞（Invitrogen）を使用して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞を各々のウェルの最小培地中に１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。翌日、培地をウェルから除去し、最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体に置き換えた。培地を１日おきに交換し、細胞をカルセインＡＭ試薬によってアッセイした。図８は、幹細胞が表面に細胞表面タンパク質及びその同種抗体との相互作用によって付着することができ、次いで最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において、又は任意の標準的な幹細胞成長培地を用いて培養することができることを示している。
【００８９】
同様に、未分化のＨ９幹細胞を、抗ＳＳＥＡ４抗体を予め吸着させた（１００ｕｇ／ｍｌ）９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００００細胞の密度でプレーティングした。幹細胞を最小幹細胞成長培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体において８日間培養した。未分化の幹細胞コロニーが展開及び増殖した。
【００９０】
実験を並行して行ったが、それによりＨ９ヒト胚性幹細胞が、９６ウェルプレート及び１２ウェルプレートの表面上に吸着した抗ＳＳＥＡ４及び抗Ｔｒａ １−８１に結合したことが示された。次いで、細胞を、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及びＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地を含有する標準的な幹細胞成長培地、又は最小培地＋８０ｎｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ１＊抗体、又は最小培地＋８ｎＭの組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて培養した。いずれの場合においても、標準的な方法によって成長させた形態学的に同一な幹細胞コロニーである未分化の幹細胞コロニーが形成された。無関連抗体で抗ＭＵＣ１＊抗体を置き換えるか、又は細胞を最小培地単独において培養した場合、幹細胞は約１日以内に死滅した。
【００９１】
実施例８．ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドの添加は分化を誘導する
フィーダー細胞、マトリゲル又は成長表面上で成長する未分化のヒト幹細胞は、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドを添加することによって迅速に分化を誘導することができる。このペプチドは、ＭＵＣ１＊成長因子受容体への結合について天然リガンドと競合する。天然リガンドとＭＵＣ１＊との相互作用は多能性細胞の成長を促進する。この相互作用を遮断することで、多能性幹細胞の成長が阻害され、細胞の分化が誘導される。マトリゲル上で成長するＨ９幹細胞は、ＭＵＣ１＊ｅｃｄペプチドによる処理後に約３倍速く分化した。ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチドを使用して、ＭＵＣ１＊のリガンドをコーティングした表面から幹細胞を採取することができる。分化速度の増大は、採取した細胞を抗ＭＵＣ１＊と共にインキュベートし、競合させてペプチドを取り除き、続いてすすいで再プレーティングすることによって阻止された。
【００９２】
実施例９．最小培地中のＮＭ２３は、ヒト幹細胞の培養について、現行の技術水準のｂＦＧＦ＋ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する馴化培地と同等である
未分化のＨ９ヒト胚性幹細胞を手作業での解離によって採取した。１辺がおよそ０．１ｃｍのコロニー片を最小培地中に混合し、製造業者の指示に従って幹細胞品質のマトリゲルでコーティングした２４ウェルプレート上に均一に分散させた。未分化のコロニー片を、６ウェルプレートの３つのウェルから２４ウェルプレートに移した。最小培地（ＭＭ）中４ｎＭ又は８ｎＭの濃度の組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（優先的に二量体を形成する突然変異体）を、現在は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）＋不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％馴化培地（ＣＭ）である現行の技術水準と比較した。新たにプレーティングした細胞をｂＦＧＦ／ＣＭで最初の２４時間、続いてＭＭ中のＮＭ２３に替えて処理することの影響も試験した。４日間の培養の後、分化したコロニーに対する未分化のコロニーの数を計数した。結果を図９中にグラフ化する。対照と付されたバーは、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び不活性化ＨＳ２７線維芽細胞フィーダー細胞に由来する５０％ＣＭにおけるマトリゲル上での標準的な培養方法を指す。グラフは、１）ＮＭ２３＋ＭＭ中で成長する細胞がｂＦＧＦ＋ＣＭよりも速く成長したこと、２）ＮＭ２３＋ＭＭが現行の技術水準よりも分化が少なかったこと、３）最初の２４時間のｂＦＧＦ＋ＣＭの添加が、ＮＭ２３＋ＭＭ中で直接培養したものよりわずかに悪かったこと、及び４）この傾向が最高濃度のＮＭ２３（８ｎＭ）で最も良好であったと示されるように思われることを示している。
【００９３】
細胞を５日目に分割して、マトリゲル上に再プレーティングした。次の５日間、細胞を４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ又は６４ｎＭで培養した。結果から、ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの濃度の増大がより良好に作用したことが示される。１６ｎＭ及び３２ｎＭのＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇによって、ｂＦＧＦ＋ＣＭ対照とほぼ同じ数及び品質の未分化のコロニーが産生された。１６ｎＭでは、各々のウェルは４つ又は５つのコロニーを生じ、そのうち１つのみが分化していた。３２ｎＭのウェルは各々合計して３つのコロニーを生じ、１つが部分的に分化していた。ｂＦＧＦ＋ＣＭ対照は２つの未分化のコロニーを産生し、一方のウェルでは１つが部分的に分化しており、他方のウェルでは１つが未分化で、２つが完全に分化していた。ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇによって、ｂＦＧＦ／ＣＭよりもはるかに大きなコロニーが産生された。
【００９４】
実施例１０．シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊＋抗ＭＵＣ１＊又はシクロデキストランに連結したｂＦＧＦ−抗ＭＵＣ１＊抗体は、伝統的な培地又は最小培地＋ＭＵＣ１＊刺激因子において幹細胞の付着及び成長を促進する
標準的な方法によってＨＳ２７線維芽細胞、続いてマトリゲル上で２継代の間成長させたヒト胚性Ｈ９幹細胞を、実施例９に記載されるように手作業で解離させて、採取した。６ウェルプレートの２つのウェルからの未分化コロニー片を、シクロデキストランに共有結合的に連結した抗ＭＵＣ１＊抗体でコーティングした２４ウェルプレートのウェル上で継代した。次いで、細胞を１６０ｎｇ／ｍｌという最終濃度の最小培地中の抗ＭＵＣ１＊抗体、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び５０％ＨＳ２７馴化培地（ＣＭ）において培養した。数時間内に付着した細胞は、成長速度の加速を除いて、フィーダー細胞又はマトリゲル上での成長で期待されるように成長した。細胞はプレーティング後５日目〜６日目に分割することが可能な状態であった。未分化のコロニー片を手作業で採取し、新たなシクロデキストラン−抗ＭＵＣ１＊コーティングプレート上に再プレーティングし、そこで増殖及び未分化コロニーの形成を続けた。細胞数、コロニー形態及び分化の阻害は、抗ＭＵＣ１＊及びｂＦＧＦ＋ＨＳ２７ ＣＭにおいて培養したウェル間で同程度であった。
【００９５】
実施例１１．リガンドをシクロデキストランに連結する方法
デキストランカルボキシル化：
材料：
デキストラン５００（平均分子量５００ｋＤ、Aldrichカタログ＃３１３９２、ロイコノストック種から単離、Sigma-Aldrich、St. Louis、Missouri）、ブロモ酢酸及びＮａＯＨ（Sigma-Aldrich）、Ｉ型Ｈ２Ｏ（RiccaChemical Company、Arlington、Texas）、２００００ＭＷＣＯ透析チューブ又はスライド（Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts）。
【００９６】
手順：
ＮａＯＨの２Ｎ溶液を、Ｉ型Ｈ２Ｏを用いて調製した。清浄な乾燥２０ｍＬ容シンチレーションバイアルに６ｍＬの上記溶液を添加した。これに８３４ｍｇのブロモ酢酸を添加し、溶解させると溶液は濁った。次いで、１．００ｇのデキストラン５００をバイアルに添加し、溶液をボルテックスし、光超音波処理すると、５分以内に完全な溶解が得られた。次いで、この溶液を室温で２４時間攪拌した。次いで、溶液を水道水を流して８時間透析し、その後０．１Ｎ ＨＣｌで１８時間透析し、その後蒸留水で１２時間透析した。次いで、溶液を凍結乾燥して、アルゴン下、−２０℃で保存した。
【００９７】
デキストラン−タンパク質／抗体連結：
材料：
社内で調製したカルボキシル化デキストラン５００、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Sigma-Aldrich）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Sigma-Aldrich）、連結させるタンパク質又は抗体、Ｉ型Ｈ２Ｏ（Ricca Chemical Company）、エタノールアミン（Sigma-Aldrich）。
【００９８】
手順：
０．５ｍｇ／ｍＬのカルボキシル化デキストラン５００のＩ型Ｈ２Ｏ溶液を調製した。１００ｍＭ ＥＤＣ／１００ｍＭ ＮＨＳのＩ型Ｈ２Ｏ溶液を調製した。１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブにおいて、１ｍＬアリコートのデキストラン溶液を１２μＬのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液に添加した。混合物をボルテックスし、室温で１５分間振動させて、カルボン酸残渣を活性化した。一方で、６．６７ｎｍｏｌのタンパク質又は抗体（適切な緩衝液に溶解した）を別個のチューブに等分した。１５分間の活性化の後、１１０μＬの活性化デキストラン溶液を、連結させるタンパク質又は抗体を含有するチューブにピペットで取った。溶液を穏やかにボルテックスして混合した後、チューブを室温で２時間軽く振動させた。５μＬのエタノールアミンをチューブに添加し、室温で更に１５分間振動させた。チューブの内容物をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で４℃で少なくとも１８時間透析した。溶液をそのまま（fresh）使用しても、又は凍結乾燥し、−２０℃で保存した後、使用前に再構成してもよい。
【００９９】
カルボキシル化の最適量及び連結させるタンパク質の濃度は、幹細胞の成長をカルボキシル化及びタンパク質濃度を体系的に変化させた２４個の表面上で試験することによって経験的に決定したことに留意されたい。
【０１００】
実施例１２．Ｈ９幹細胞をシクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊に付着させて、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ又はＨＳ２７馴化培地中のｂＦＧＦにおいて培養した
２４ウェルプレートを、実施例１１に記載されるように、シクロデキストランに連結した抗ＭＵＣ１＊でコーティングした。Ｈ９細胞を実施例９に記載されるようにこれらの表面上で継代し、最小培地中の組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ又は８ｎＭという最終濃度で培養した。別の条件では、細胞を４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び５０％ＨＳ２７馴化培地（ＣＭ）で２４時間処理した後、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇに交換した。実験は２連で行った。４日間の成長の後、分化したコロニーに対する未分化のコロニーの数を計数し、コロニーの合計数に対する未分化のコロニーの割合としてグラフ化した。１００％未分化であったコロニーのみを未分化として計数した。図１０は、ｂＦＧＦ＋ＣＭがＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇの濃度が不十分である場合にのみ有用であったことを示している。さらに、結果は、最小培地中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇが、コロニー形態、数及び分化の阻害の観点からｂＦＧＦ＋線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地と同様又はより良好に機能したことを示した。
【０１０１】
実施例１３．培養フラスコをＮＴＡ−Ｎｉでコーティングする手順
材料：
２４ウェルカルボン酸提示表面細胞培養プレート（BD Biosciences Ｐｕｒｅｃｏａｔ：＃３５６７７５）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物、Ｉ型Ｈ２Ｏ、滅菌シリンジ（２０ｍＬ容）、０．４５μｍ ＰＶＤＦ(登録商標)膜シリンジフィルター。
【０１０２】
手順：
誘導体化される１つのプレート当たり７５ｍＬの１０ｍＭ ＥＤＣ／１０ｍＭ ＮＨＳ溶液を調製した。滅菌シリンジ及びシリンジフィルターを用いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を各々のウェルに濾過して、ウェルを約８０％満たした。プレートに蓋をし、プレートシェーカーで、室温で１５分間穏やかに振盪した。プレートを振盪している間、１つのプレート当たり約４０ｍＬの１０ｍＭ Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物を調製した。１５分間のプレートの活性化の後、プレートを空にし、Ｉ型水で３回すすいだ。新たな滅菌シリンジ及びシリンジフィルターを用いて、Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン水和物の溶液を各々のウェルに濾過し、ウェルを半分位まで満たした。プレートに蓋をして、室温で３時間穏やかに振盪した。３時間後、プレートを空にし、Ｉ型水で５回すすいだ。残存する活性化ＮＨＳエステルを、この時点で１％エタノールアミンの滅菌溶液を添加し、室温で１５分間インキュベートした後、１０％炭酸ナトリウムの滅菌溶液を添加し、室温で３０分間インキュベートすることによってクエンチした。これは、プレートを滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏ中に４℃で少なくとも４８時間〜７２時間入れておくことによっても達成することができる。残留ＮＨＳエステルをクエンチするか、又は加水分解してカルボン酸に戻した後、ウェルを滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏで満たし、続いてパラフィルムで包み、蓋をし、スズ箔で包み、４℃で保存しなくてはならない。プレートを使用直前に再度滅菌Ｉ型Ｈ２Ｏですすぐ必要がある。使用前に１％硫酸ニッケル溶液をプレートに添加した後、ＰＢＳですすいだ。
【０１０３】
エタノールアミン溶液の使用によって、残留ＮＨＳエステルがヒドロキシル頭部基を提示するアミドに変換されることに留意されたい。これによって表面の化学的性質が変化する。このことが望ましくない場合、炭酸塩溶液浸漬又は長期の水溶液浸漬（aqueous soak）によって、残り全てのＮＨＳエステルを加水分解して元のカルボン酸に戻す。
【０１０４】
実施例１４．Ｈ９幹細胞は、ヒスチジンタグを担持するリガンドでコーティングしたＮＴＡ−Ｎｉプレートに付着した
１２ウェルプレートを、実施例１３に記載されるようにＮＴＡ−Ｎｉによって誘導体化した。ヒスチジンタグ付きＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、配列HHHHHHSSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS（配列番号５）の合成ペプチド（ＲＧＤペプチド）、及びヒスチジンタグ付き組み換えプロテインＧ（Minerva）を、ＮＴＡ−Ｎｉコーティングウェルに２００ｎＭという最終濃度で別個に添加し、１５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中ですすいだ。プロテインＧウェルに対し、抗ＳＳＥＡ４及び抗Ｔｒａ １−８１を２００ｎＭで添加し、１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。実施例９に記載されるように、マトリゲル上で２継代の間成長させたＨ９細胞の６ウェルプレートの３つのウェルからコロニー片を採取し、ウェル上にプレーティングした。幹細胞を最小培地中の８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋ＨＳ２７ＣＭ、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋Ｔ４７Ｄ ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した５０％馴化培地（「Ｃａ ＣＭ」）、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養した。細胞は２４時間以内にプレートに付着し、未分化幹細胞の増殖が観察された。プレーティング後３日目に、未分化のコロニー及び分化したコロニーを計数し、プロットした（図１１Ａを参照されたい）。以下のものの代表的な写真（４０倍）を撮影した：図１１Ｂ）ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ表面、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｃ）ＲＧＤペプチド表面、８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｄ）ＲＧＤペプチド表面、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７ ＣＭにおいて培養、図１１Ｅ）プロテインＧ表面、抗ＳＳＥＡ４、次いで８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｆ）プロテインＧ表面、抗Ｔｒａ １−８１、次いで８ｎＭ ＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養、図１１Ｇ）ＲＧＤペプチド表面、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％Ｃａ ＣＭにおいて培養。この実験の最良の条件は、ＮＴＡ−Ｎｉ表面に付着させ、次いで抗ＳＳＥＡ４又はＴｒａ １−８１に親和性付着させ、次いでＭＭ又はＣａＣＭ中のＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇにおいて培養したＨｉｓタグ付きプロテインＧから得られた。
【０１０５】
同様の実験において、他のＭＵＣ１＊陽性がん細胞（ＺＲ−７５−１及びＺＲ−７５−３０）に由来する馴化培地を使用したが、同じ結果が得られた。
【０１０６】
実施例１５．ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収した馴化培地は、線維芽細胞に由来する馴化培地よりも良好に幹細胞の成長を促進し、分化を阻害する
ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）を、標準的な方法に従って６ウェルプレートにおいてマトリゲル上で成長させた後、手作業での解離によって採取した。６ウェルプレートの３つのウェルからのコロニー片を、２４ウェルＮＴＡ−Ｎｉコーティングプレートのウェル上に分散させた。細胞表面上のタンパク質又は培地中のタンパク質が、プレート表面に付着した金属キレートに接着するか否かを調べることに興味を持った。プレーティングしたコロニー片に添加した培地は以下のいずれかであった：ａ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋ＨＳ２７（線維芽細胞）馴化培地（ＣＭ）、ｂ）４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋Ｔ４７Ｄ（ＭＵＣ１＊陽性乳がん細胞株、これらの細胞に由来するＣＭは本明細書中では「Ｃａ ＣＭ」と称される）に由来するＣＭ、ｃ）最小培地（「ＭＭ」）中の４ｎＭ ＮＭ２３、ｄ）ＭＭ中の８ｎＭ ＮＭ２３、ｅ）Ｃａ ＣＭ中の４ｎＭ ＮＭ２３、又はｆ）Ｃａ ＣＭ中の８ｎＭ ＮＭ２３。２４時間後、最小培地又はＣＭ又はＣａ ＣＭ中の細胞が表面に付着していたことが観察されたが、使用したＮＭ２３が、ＮＴＡ−Ｎｉプレートによって容易に捕捉され得るヒスチジンタグ付き組換えタンパク質であったことを考えると、なぜｂＦＧＦ/ＣＭ又はｂＦＧＦ Ｃａ ＣＭ中の細胞が付着するかについての明白な理由はなかった。がん細胞馴化培地（Ｃａ ＣＭ）中で成長させた細胞が他の条件よりもはるかに良好に成長していたことが観察された。培地を４８時間毎に交換して６日間培養した後、プレートを幹細胞コロニーの形態、コロニーの数及び分化の程度について分析した。４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋がん細胞馴化培地において培養した幹細胞は、対照のｂＦＧＦ＋ＨＳ２７よりも多くのコロニーを形成し、はるかに少ない（全くない）分化を有していた。ＮＭ２３単独において培養した細胞は成長し、コロニーを形成したが、ＮＭ２３＋がん細胞馴化培地において培養した細胞は、他のどの条件よりも多くのコロニーを形成し、コロニーは約８０％〜８５％が未分化であり、完全に形成され、分割することが可能な状態であった。一方、フィーダー細胞又はマトリゲル上での現行の技術水準の方法では、平均して３０％〜４０％が分化しているが、同じ段階に到達するには９日間かかる。図１２は、９日目のコロニー数のグラフを示す、ＮＭ２３＋がん細胞馴化培地（Ｃａ ＣＭ）について２０個のコロニーでグラフ化したが、細胞は完全にウェル全体を覆っており、実際に計数することができなかった。９日目には、対照ｂＦＧＦ＋ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地（ＨＳ２７ＣＭ）の割合にほぼ等しい未分化の部分が未だ存在していたが、ＮＭ２３で刺激したウェルにおいては、細胞ははるかに速く増殖した。
【０１０７】
実施例１６．細胞表面より遠位のペプチド領域に結合する抗体が細胞接着に好ましい
細胞表面より遠位のＭＵＣ１＊細胞外ドメインの部分に結合する抗体は、幹細胞接着を容易にすることについて細胞表面に近い領域に結合する抗体よりも良好である。ＭＵＣ１＊の細胞外ドメインは、約４５アミノ酸長である。この４５アミノ酸ペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、本明細書及び先願においては配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号１）を有するＰＳＭＧＦＲと称され、それが付着した表面への幹細胞の接着を容易にした。モノクローナル抗体のスクリーニングによって、細胞表面に近いＭＵＣ１＊細胞外ドメインの部分を認識する抗体は、これらの同じモノクローナル抗体が培地に添加した場合に幹細胞の成長を刺激したにもかかわらず、表面への幹細胞の接着を促進しなかったことが示された。ＭＵＣ１＊受容体の遠位部分に結合する抗体を産生したハイブリドーマを同定するために、ハイブリドーマ上清を９６ウェルプレートのウェルに吸着させた後、マトリゲル上で成長させたＢＧ０１ｖ／ｈＯＧ細胞から採取した未分化のコロニー片をプレーティングした。３つのクローンに由来する上清は幹細胞の接着を可能にした。最小培地を４８時間毎に交換し、増殖する未分化幹細胞コロニーをプレーティング後９日目に撮影した（図１３を参照されたい）。
【０１０８】
追跡実験においては、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、これらのハイブリドーマによって分泌された抗体が実際にＭＵＣ１＊細胞外ドメインの遠位部分に結合したか否かを決定した（図１４を参照されたい）。以下の２つの欠失ペプチドを合成した：配列QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（配列番号３）を有する、１０個のＮ末端アミノ酸が失われたペプチド（Ｎ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）、及び配列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（配列番号４）を有する、Ｃ末端の１０個のアミノ酸が失われたペプチド（Ｃ−１０ ＰＳＭＧＦＲ）。９６ウェルプレートのウェルへの幹細胞の接着をもたらしたハイブリドーマ上清は、ＥＬＩＳＡアッセイによって、細胞表面に近接した１０個のアミノ酸が失われたペプチドに結合するが、遠位の１０個のアミノ酸が失われたペプチドには結合しないことが示された。ハイブリドーマ上清上にプレーティングした幹細胞は、完全に形成されたコロニーに成長し、これは最小培地単独において数日間培養した後も未分化であった。
【０１０９】
実施例１７．ＭＵＣ１＊抗体を使用して、多能性幹細胞を分化細胞から同定する
ＭＵＣ１＊リガンドであるＮＭ２３は、未分化のｈＥＳＣ上でＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４と共局在化するが、３つ全てのタンパク質の免疫反応性が分化を開始したコロニーの部分において失われる。未分化のＨ９ ｈＥＳＣコロニーがＮＭ２３、ＭＵＣ１＊及びＯＣＴ４に陽性であると染色された。新しく分化したコロニーは、３つのタンパク質のいずれに対する抗体とも反応しなかった。ＮＭ２３とＯＣＴ４及びＭＵＣ１＊との同時発現は、分化を開始したコロニーにおいて最も良く見られる。点線はコロニーの未分化部分と分化部分との間の境界を示す。三重染色実験を以下のものを使用して行った：図１５Ｇ）抗ＮＭ２３（緑色）、図１５Ｈ）抗ＭＵＣ１＊（赤色）、図１５Ｉ）抗ＮＭ２３（緑色）、抗ＭＵＣ１＊（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）。同様のコロニーを以下のもので染色した：図１５Ｊ）抗ＮＭ２３（緑色）、Ｋ）抗ＯＣＴ４（赤色）、図１５Ｌ）抗ＮＭ２３（緑色）、抗ＯＣＴ４（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）。スケールバー＝１００μｍ。抗ＮＭ２３はSanta Cruz（クローンＮＭ３０１）及びBD Biosciences（クローン５６）から購入した。抗ＭＵＣ１＊は、ZymedによってMinervaのＰＳＭＧＦＲペプチドから特別に作製されたものであった。
【０１１０】
多能性幹細胞は、生細胞を抗ＭＵＣ１＊及び完全長ＭＵＣ１に結合するＶＵ４Ｈ５等の抗体で標識した後、ＦＡＣＳ、電磁細胞分離又は同様の技術によって選別することで未分化の幹細胞及び分化した幹細胞の混合プールから単離することができる。ＭＵＣ１＊陽性は多能性幹細胞を意味する。生細胞に結合した二価抗ＭＵＣ１＊は、成長因子として機能するために続く成長を妨げず、細胞分離に理想的である。
【０１１１】
実施例１８．ＭＵＣ１＊抗体を使用して、ＭＵＣ１＊初期前駆体を後期前駆体である造血幹細胞から単離する
ヒト臍帯血（ALLCELLS）から得られるＣＤ３４陽性造血幹細胞（ＨＳＣ）を得た（obtaineded）。細胞は、真のＨＳＣであると報告されているＣＤ３４＋／ＣＤ３８−の混合物を含有していたが、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋（次の前駆体段階）も含有していた。細胞を解凍し、ペレット化し、StemSpan製のＳＦＥＭ（無血清展開培地）中で洗浄し、成長因子を添加しないＳＦＥＭで再懸濁した。およそ４０００個の細胞を９６ウェルプレートのウェルにプレーティングし、接着を防止するためにポリＨＥＭＡで被覆した。ＰＳＭＧＦＲペプチドで免疫化することによって生成したウサギポリクローナル抗ＭＵＣ１＊抗体を、５つのウェルの各々に０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ及び２０００ｎｇ／ｍｌという最終濃度で添加した。細胞を３日目に撮影した（図１６Ａ）。プレーティング後５日目に、抗体を細胞に再添加した。
【０１１２】
プレーティングの１１日後に細胞を目視で検査したところ、大半がプレーティングした時点と同じ直径のままであったが、これは細胞が依然として造血幹細胞であり、次の前駆体段階へ進んでいないことの指標となる。同一ウェルから細胞をプールし、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ３８−ＰＥ−Ｃｙ５で染色した。細胞を分析し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって選別した。図１６Ｂは、ＭＵＣ１＊抗体の濃度が増大するにつれ、真の造血幹細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−）のままである細胞の割合が増加することを示している。その逆もまた真であった。次の前駆体段階（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋）に進んだ細胞の割合は、ＭＵＣ１＊抗体の濃度が最低であるときに最高であった。代表的なウェルの統計から、ＭＵＣ１＊抗体による刺激によって、非刺激の細胞よりも多くのＣＤ３４＋／３８−細胞（ＨＳＣ）及び少ないＣＤ３４＋／３８＋（前駆体）細胞が生じることが示される。
【０１１３】
実施例１９．胎児肝細胞のＦＡＣＳ選別及び続くＭＵＣ１＊刺激による成長
完全長ＭＵＣ１を認識する抗体（ＶＵ４Ｈ５、Santa Cruz Biotechnology、又はＨＭＰＶ、BDBiosciences）又は抗ＭＵＣ１＊（ＰＳＭＧＦＲの免疫化によるウサギポリクローナル抗体、Minerva）を用いたＦＡＣＳ分析を多数の異なる前駆細胞に対して行い、どれがＭＵＣ１＊を発現したかを決定したが、それによりこれらの細胞を単離して、ＭＵＣ１＊受容体を刺激することによって展開させることができた。図１７Ａは、神経幹細胞（ＲｅｎＣｅｌｌ ＣＸ、Millipore）がＭＵＣ１＊を発現することを示している。少数の細胞が切断されたＭＵＣ１及び切断されていないＭＵＣ１の両方を発現する。それらの成長は、抗ＭＵＣ１＊又はＭＵＣ１＊を二量化するＮＭ２３のような他の作用物質と共に培養することによって刺激される。胎児肝細胞（ALLCELLS）は、ほぼ例外なくＭＵＣ１＊を発現する（図１７Ｂ）。
【０１１４】
胎児肝細胞を、最小培地＋抗ＭＵＣ１＊抗体において図１８に示される濃度で培養した。示された成長曲線は、これらのＭＵＣ１＊前駆体の成長がＭＵＣ１＊成長因子受容体の二量化によって刺激されることを示している。最適抗体濃度では、１つの抗体が２つのＭＵＣ１＊受容体を二量化し、抗体が過剰になると、１つの受容体につき１つの抗体が存在し、成長が阻害される。これらの結果から、造血幹細胞及びＭＵＣ１＊を発現する他の前駆細胞を、ＭＵＣ１＊受容体を二量化する作用物質を添加することによって展開させることができることが示される。
【０１１５】
実施例２０．ｈｕ ＥＳ細胞は、任意の細胞表面マーカータンパク質に対する抗体でコーティングした表面に接着し、標準的な幹細胞培地又はＭＵＣ１＊刺激因子を含有する培地において培養することができる
１２ウェルプレートを、０．５ｍｌの抗ＭＵＣ１＊又は抗ＳＳＥＡ４抗体を用いて１００ｕｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、滅菌ＰＢＳ中ですすいだ。マトリゲル上で成長するｈｕ ＥＳ Ｈ９細胞に由来する未分化のコロニー片を手作業で解離させて、再懸濁した後、表面上にプレーティングした。最終濃度８ｎＭの組換えＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ（Minerva）、又は４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋５０％ＨＳ２７線維芽細胞馴化培地を含有する培地を添加した。プレーティング後５日目に未分化のコロニーを手作業で採取し、分割して、同様にコーティングした表面上に再プレーティングした。図１９のグラフは、幹細胞が最小培地（ＭＭ）中のＮＭ２３又はｂＦＧＦ＋ＨＳ２７馴化培地において培養した場合に抗体表面上で成長することを示している。ＮＭ２３で処理したウェルにおける細胞が、ｂＦＧＦで処理したウェルにおけるものよりも著しく速く成長することが分かった。
【０１１６】
実施例２１．幹細胞の成長を促進し、分化を阻害するがん細胞馴化培地中の作用物質の同定
ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地は、ヒト幹細胞の成長を促進する一方で、それらの分化を阻害する。幹細胞の成長に影響を及ぼすがん馴化培地中の個別の作用物質を同定することは、２つの理由から望ましいといえる。第１に、これらの作用物質を合成又は組み換えによって作製し、個別の作用物質として成長培地又は表面コーティングに添加して、幹細胞及び或る特定の初期前駆体の成長を促進することができる。第２に、これらの作用物質の同定によって、がんの治療のためにそれらを抑制する戦略が可能となり得る。
【０１１７】
がん細胞馴化培地Ｃａ ＣＭ中のタンパク質を同定するために、Ｃａ ＣＭをＭＵＣ１＊陽性がん細胞から回収し、その個々の成分を、例えばイオン交換、サイズ排除等のカラム分離によって分離することができる。様々な画分を別個に又は組み合わせて、未分化幹細胞の成長を刺激するそれらの能力について試験することができる。次いで、影響を及ぼした画分（複数も可）をマイクロシークエンシング又は質量分析によって分析し、成分の固有性を決定することができる。
【０１１８】
より直接的なアプローチは、未処理のＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来するＣａ ＣＭと、ｍｉＲ−１４５で処理した細胞から回収したＣａ ＣＭとを比較することである。ｍｉＲ−１４５は、未分化から分化への幹細胞の移行が起こった場合にその発現が上方制御される制御性マイクロＲＮＡである。この移行中にＭＵＣ１の切断が中断され、ＭＵＣ１の発現が下方制御されることを想起されたい。最近になって、ｍｉＲ−１４５がＭＵＣ１をサイレンシングする（silences）ことが示された。がん細胞をｍｉＲ−１４５で処理することによって、がん細胞の成長及び未分化幹細胞の成長の両方に特徴的な幹様成長ではなく、分化に特徴的な成長の制御へのシフトが引き起こされる。未感作がん細胞及びｍｉＲ−１４５で処理した細胞によって分泌された因子の比較から、幹細胞及びがん細胞の成長の促進に関与するこれらの作用物質が同定され得る。それらは未処理のＣａ ＣＭ中に存在し、処理したＣａ ＣＭ中には存在しない。同定は、同種のタンパク質の分離、続くシークエンシング又は質量分析によって達成することができる。成分はゲル上で分離することができ、未処理のＣａ ＣＭに特有のタンパク質バンドをゲルから切り出した後、マイクロシークエンシング又は質量分析によって分析する。
【０１１９】
並行して、未分化の幹細胞に由来する馴化培地を、ＭＵＣ１＊細胞外ドメインペプチド等の分化を開始する作用物質で処理した幹細胞から回収した馴化培地と比較する。この場合、未処理の幹細胞によって独自に又は優先的に分泌された成分は、幹細胞の成長を促進するか又は多能性を誘導する作用物質として望ましいものであり得る。これらの作用物質を抑制する分子は、がんの治療薬として使用され得る。これに対して、分化幹細胞から独自に又は優先的に分泌されたこれらの成分は、がんを治療する作用物質として望ましいものであり得る。同様に、これらの作用物質を抑制する分子は、幹細胞の成長を促進するか又は多能性を誘導するために使用され得る。
【０１２０】
幹様成長、すなわち幹細胞又はがん細胞の成長を促進又は抑制するマイクロＲＮＡ等の制御性核酸は、細胞からの分泌物を分析するのではなく、核酸を抽出し、分析すること以外は上記のように同定され得る。例えば、ディープシーケンシング（Deep Sequencing）及び全トランスクリプトーム解析として知られる技法を行って、幹様成長を抑制した場合に上方制御又は下方制御されるこれらの制御性ＲＮＡを同定することができる。幹細胞が分化する際に上方制御されるｍｉＲ−１４５等の制御性ＲＮＡは、抗がん治療に使用することができる。同様に、これらのマイクロＲＮＡを抑制するｓｉＲＮＡを含む分子は、多能性を促進又は誘導するために使用することができる。未分化幹細胞の成長及びがん細胞の成長において上方制御される制御性核酸は、がんの治療におけるサイレンシング若しくは抑制のため、又は幹細胞の分化の開始を同期させるための標的であり得る。
【０１２１】
当業者であれば、日常実験のみを用いて、本明細書中で具体的に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識する、又は確認することができる。かかる均等物は特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法であって、前記表面及び前記細胞に結合するリガンドを介して前記細胞を前記表面上に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法。
【請求項２】
前記リガンドが直接的に又は媒介物を介して間接的に前記表面に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記媒介物が化学リンカー又は別のタンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がプロテインＡ又はプロテインＧである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リンカーが感光性又は化学物質感応性である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンド又は前記媒介物が、前記表面に非特異的に吸着しているか、又はアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって前記表面に共有結合的に連結若しくは付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドがポリマーに結び付いている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、前記幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で発現されたポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが抗体又は成長因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の表面上の前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の表面上の前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１＊である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がＰＳＭＧＦＲ又はＣ−１０ ＰＳＭＧＦＲに特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記成長因子が野生型ＮＭ２３若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体、又はｂＦＧＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露する、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項１５】
前記作用物質が抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質が野生型ＮＭ２３、又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から分泌された作用物質を含有する培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項１８】
前記ＭＵＣ１＊陽性細胞がＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項２０】
前記ＭＵＣ１＊陽性細胞がＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面がマトリゲルではない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を線維芽細胞フィーダー細胞なしに培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を手作業で解離させることなく前記表面から取り出す、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記リガンド又は前記表面との結合から放出されるように、前記リガンドに結合する競合分子を添加することを含む、請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記表面から放出されるように、前記細胞に直接的又は間接的に付着した前記表面に結合したリンカーを切断することを含む、請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法。
【請求項２６】
細胞の分化状態を特定する方法であって、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性（puripotent）細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、細胞の分化状態を特定する方法。
【請求項２７】
細胞を幹細胞及び幹様細胞又は誘導多能性幹細胞、並びに新たに分化する細胞の混合集団から分離することを含み、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞を、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する抗体と接触させることを更に含み、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する正のシグナルが、多能性幹細胞状態の存在を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体及び抗Ｔｒａ １−８１抗体、抗Ｔｒａ １−６０抗体、ＳＳＥＡ３抗体又はＳＳＥＡ４抗体と接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法であって、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが、がん幹細胞を示す、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法。
【請求項３１】
前記細胞を幹細胞マーカーに対する抗体と反応させることを含み、幹細胞マーカーに対する正のシグナルが、がん幹細胞の存在を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法であって、前記細胞を前記表面に、直接的に又は前記細胞に結合するリガンドを介して間接的に付着させること、及び前記細胞をＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露することを含む、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法。
【請求項３３】
前記作用物質がＭＵＣ１＊を二量化して、成長を促進し、分化を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用物質がＭＵＣ１＊の二量化を阻害して、分化を促進する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞型を分離する方法であって、
異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する様々なリガンドについて表面上の空間アドレスを作成すること、及び
前記細胞を前記表面に添加すること
を含み、前記細胞が、前記細胞の結合するリガンドに応じて空間的に分離されている、細胞型を分離する方法。
【請求項３６】
前記表面が粒子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記粒子がナノ粒子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
宿主の体内に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を移植する方法。
【請求項３９】
前記宿主が患者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リガンドが、前記宿主の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の成長因子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
宿主の体内に、表面及び細胞に結合するリガンドを介して前記細胞が付着した前記表面を移植する方法。
【請求項４２】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法であって、宿主の体に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を投与することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法。
【請求項４３】
組成物であって、
プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面、及び
ＭＵＣ１＊二量化剤
を含む、組成物。
【請求項４４】
前記親和性相互作用が前記表面とのＮＴＡ−Ｎｉの相互作用によるものである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＭＵＣ１＊二量化剤が、野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面を、ＭＵＣ１＊二量化剤とともに前記細胞を含有するサンプルと相互作用させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法。
【請求項４８】
前記培地が最小培地である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法であって、前記表面及び前記細胞に結合するリガンドを介して前記細胞を前記表面上に付着させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を表面上で培養する、展開させる又は成長させる方法。
【請求項２】
前記リガンドが直接的に又は媒介物を介して間接的に前記表面に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記媒介物が化学リンカー又は別のタンパク質又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質がプロテインＡ又はプロテインＧである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リンカーが感光性又は化学物質感応性である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンド又は前記媒介物が、前記表面に非特異的に吸着しているか、又はアフィニティータグ−結合パートナー相互作用によって前記表面に共有結合的に連結若しくは付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドがポリマーに結び付いている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、前記幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で発現されたポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが抗体又は成長因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の表面上の前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の表面上の前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１＊である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がＰＳＭＧＦＲ又はＣ−１０ ＰＳＭＧＦＲに特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記成長因子が野生型ＮＭ２３若しくはＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体、又はｂＦＧＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露する、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項１５】
前記作用物質が抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質が野生型ＮＭ２３、又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞から分泌された作用物質を含有する培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項１８】
前記ＭＵＣ１＊陽性細胞がＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ＭＵＣ１＊陽性がん細胞に由来する馴化培地に曝露することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を培養する方法。
【請求項２０】
前記ＭＵＣ１＊陽性細胞がＴ４７Ｄ、ＺＲ−７５−３０又はＺＲ−７５−１から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面がマトリゲルではない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を線維芽細胞フィーダー細胞なしに培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を手作業で解離させることなく前記表面から取り出す、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記リガンド又は前記表面との結合から放出されるように、前記リガンドに結合する競合分子を添加することを含む、請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法であって、前記細胞が前記表面から放出されるように、前記細胞に直接的又は間接的に付着した前記表面に結合したリンカーを切断することを含む、請求項１に記載の方法によって成長させた細胞から細胞を採取する方法。
【請求項２６】
細胞の分化状態を特定する方法であって、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性（puripotent）細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、細胞の分化状態を特定する方法。
【請求項２７】
細胞を幹細胞及び幹様細胞又は誘導多能性幹細胞、並びに新たに分化する細胞の混合集団から分離することを含み、前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を使用することを含み、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが多能性細胞状態を示し、非短縮型ＭＵＣ１への結合を示す細胞が分化細胞状態を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞を、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する抗体と接触させることを更に含み、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のマーカーに対する正のシグナルが、多能性幹細胞状態の存在を示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞を抗ＭＵＣ１＊抗体及び抗Ｔｒａ １−８１抗体、抗Ｔｒａ １−６０抗体、ＳＳＥＡ３抗体又はＳＳＥＡ４抗体と接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法であって、抗ＭＵＣ１＊抗体に対する正のシグナルが、がん幹細胞を示す、がん幹細胞を前記細胞に結合する抗ＭＵＣ１＊抗体を用いて検出する方法。
【請求項３１】
前記細胞を幹細胞マーカーに対する抗体と反応させることを含み、幹細胞マーカーに対する正のシグナルが、がん幹細胞の存在を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法であって、前記細胞を前記表面に、直接的に又は前記細胞に結合するリガンドを介して間接的に付着させること、及び前記細胞をＰＳＭＧＦＲの配列を有するペプチドに結合する作用物質を含有する培地に曝露することを含む、表面上での幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の培養、展開又は成長を調節し、その分化を阻害する方法。
【請求項３３】
前記作用物質がＭＵＣ１＊を二量化して、成長を促進し、分化を阻害する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記作用物質がＭＵＣ１＊の二量化を阻害して、分化を促進する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞型を分離する方法であって、
異なる細胞型、又は細胞段階若しくは細胞型を特定する特異的マーカーに対して親和性を有する様々なリガンドについて表面上の空間アドレスを作成すること、及び
前記細胞を前記表面に添加すること
を含み、前記細胞が、前記細胞の結合するリガンドに応じて空間的に分離されている、細胞型を分離する方法。
【請求項３６】
前記表面が粒子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記粒子がナノ粒子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
宿主の体内に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を移植する方法。
【請求項３９】
前記宿主が患者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リガンドが、前記宿主の幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞の成長因子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
宿主の体内に、表面及び細胞に結合するリガンドを介して前記細胞が付着した前記表面を移植する方法。
【請求項４２】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法であって、宿主の体に、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞のリガンドが付着した表面を投与することを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させる方法。
【請求項４３】
組成物であって、
プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面、及び
ＭＵＣ１＊二量化剤
を含む、組成物。
【請求項４４】
前記親和性相互作用が前記表面とのＮＴＡ−Ｎｉの相互作用によるものである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、ＭＵＣ１若しくはＭＵＣ１＊、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ １−８１又はＴｒａ １−６０である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＭＵＣ１＊二量化剤が、野生型ＮＭ２３又はＮＭ２３−Ｓ１２０Ｇ突然変異体である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法であって、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面であって、前記プロテインＡ又は前記プロテインＧが、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞上で特異的に発現されるポリペプチドに特異的な抗体に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧが親和性相互作用によって結合した表面を、ＭＵＣ１＊二量化剤とともに前記細胞を含有するサンプルと相互作用させることを含む、幹細胞若しくは幹様細胞又は誘導多能性幹細胞を増殖させる方法。
【請求項４８】
前記培地が最小培地である、請求項１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１５−２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１１−２】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１５−２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２０１２−５２９８９０（Ｐ２０１２−５２９８９０Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５２０５（Ｐ２０１２−５１５２０５）
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８４３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４８８７
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５０７０８１０９４）ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション (4)
【出願人】（３１１０１７９３５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８４３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４８８７
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５０７０８１０９４）ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション (4)
【出願人】（３１１０１７９３５）
【Ｆターム（参考）】
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