微小物体を空間的に操作するための方法および前記方法を実行するための装置
本発明は、微小物体２０、２３、３３を空間的に操作するための方法に関し、前記方法は、開口１９を持つ先端と内部を長手方向に延びる微小流路１５とを有し、微小流路が先端の開口に流体接続されて成るカンチレバー１２を用意するステップと、カンチレバーを保持しかつカンチレバーを予め定められた空間経路に沿って移動させるための懸吊手段を用意するステップと、カンチレバー内の微小流路に予め定められた圧力を加えるための加圧手段を用意するステップと、先端の開口が微小物体に隣接するように微小物体にカンチレバーの先端を移動させるステップと、カンチレバーの先端の外側の圧力に対して微小流路内の圧力を低減させることによって、カンチレバーにより微小物体をピックアップするステップと、カンチレバーを用いて微小物体を予め定められた空間経路に沿って移動させるステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、生体細胞、ニューロンのような微小物体、または、ウィルスもしくはナノ粒子のようなサブミクロン物体等の操作の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一細胞レベルの情報を得る能力は、多くの生物学的問題にとって中心的な重要性を持つようになりつつあり、主要な課題である。個々の細胞は、遺伝的には姉妹細胞と同一であるが、遺伝子（転写物）の異なる表現型および発現プロフィール、およびその結果として、異なるタンパク質および代謝物のレベルを示すという認識がますます高まっている。個々の細胞を取り扱うために新規な革新的技術が必要とされており、ここで「取り扱う」とは、変位、注入から分析までの範囲の広い意味を有する。以下では、単一細胞の制御された空間的変位に焦点を合わせる。
【０００３】
数年前に、Ａ．Ａｓｈｋｉｎと共同研究者らは他に先駆けて、生物学的物体を操作する手段として光ピンセットを開発した（例えば欧州特許出願公開第３０７９４０号明細書参照）。強力なコリメートされたレーザを介する放射圧による捕獲力を利用して、彼らは、ウィルス、細菌、細胞から細胞器官までを取り扱うことができることを示した。しかし、光ピンセットが捕獲された有機体をどの程度損傷するかについは、いまだに議論中である。
【０００４】
単一細胞を操作するための最も古い器具であるガラスマイクロピペットは、実際には変位実験に適しない。生物学的物体を吸引するために圧力制御装置と組み合わされたマイクロマニピュレータを用いて操作されるそれらの配置は、依然として、１μｍ程度の固有分解能によって制限される光学顕微鏡法によって追跡される。したがって、損傷の無い有機体への接近は運任せの手順であり、吸引に成功しても、基質表面の別の位置にそれを安全に再配置することは事実上不可能である。
【０００５】
原子間力顕微鏡ＡＦＭ（Ｇ．Ｂｉｎｎｉｇ、Ｃ．Ｆ．Ｑｕａｔｅ、およびＣ．Ｇｅｒｂｅｒ、Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ｌｅｔｔ ５６（９）、９３０（１９８６））は、ｐＮ範囲の所要力フィードバックを有する。有機体操作に関して、それはブライトスペクトルの接着実験に採用されているが、有機体はカンチレバーの下面に安定的に付着されており、基質の別の位置での有機体の解放を防止しているので、変位実験用には考えられていない。
【０００６】
カンチレバーに直接組み込まれた微小流路を介して、高精度ＡＦＭ力フィードバックをナノ流体と組み合わせた（欧州特許出願公開第１９９０６２６号明細書参照）、「ＦｌｕｉｄＦＭ」の開発（Ａ．Ｍｅｉｓｔｅｒ、Ｍ．Ｇａｂｉ、Ｐ．Ｂｅｈｒ、Ｐ．Ｓｔｕｄｅｒ、Ｊ．Ｖｏｒｏｓ、Ｐ．Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ、Ｊ．Ｂｉｔｔｅｒｌｉ、Ｊ．Ｐｏｌｅｓｅｌ‐Ｍａｒｉｓ、Ｍ．Ｌｉｌｅｙ、Ｈ．Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ、およびＴ．Ｚａｍｂｅｌｌｉ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ９（６）、２５０１（２００９））は、生物学的物体の空間的操作のための新規な戦略を切り開くものである。カンチレバー内の微小流路は、角錐状先端の頂点におけるサブミクロンのアパーチャで終端し、かつ他端はリザーバで終端する。流路は、ＡＦＭプローブホルダ内にも機械加工される。プローブホルダにチップを簡便に押止することによって、先端アパーチャを注射器または圧力制御装置と接続する連続流体管路が得られる。したがって、「ＦｌｕｉｄＦＭ」を液体環境内に浸漬することができる一方、溝内の溶液に圧力を加えることができる。
【０００７】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」の探査領域を図１に示す。図１の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）１０は、図示しないＡＦＭの顕微操作機構に取り付けられたプローブホルダ１１を備える。プローブホルダ１１には、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）技術によって製作された細長いカンチレバー１２が取り付けられる。カンチレバー１２には、カンチレバー１２の長手方向に延びる内部微小流路１５が設けられる。微小流路１５はその外端がカンチレバー１２の角錐状先端１３の開口１９と液圧接続する。微小流路１５の他端は、外部の制御可能な圧力源１７から配管１６を介して予め定められた流体圧力を受け取るように、プローブホルダ１１を貫通する供給路１４に接続される。図１はさらに、液体経路に接続されたインピーダンス測定手段３４を示す。このインピーダンス測定手段３４は周知の「ＦｌｕｉｄＦＭ」装置の一部ではなく、以下で詳細に説明する本発明に係る装置の新規な特徴である。
【０００８】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」は、生理学的条件下における単一生細胞の局所的液体分注および刺激に使用される。カンチレバー１２のナノ流体微小流路１５は、ＡＦＭ先端のサブミクロンのアパーチャまたは開口１９を介して可溶性分子を分注することを可能にする。レーザビーム１８によって達成される高感度ＡＦＭの力フィードバックは、液体環境内の表面を極めて局所的に変化させるために、先端を試料に制御された状態で接近させることを可能にする。それはまた、細胞膜との穏やかな接触やその穿孔の間の確実な区別をも可能にする。これら２つの手順を使用して、個々の生細胞に、かつこれらの細胞の選択された細胞下構造にさえ、色素が導入されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の主目的は、上述した「ＦｌｕｉｄＦＭ」の原理に基づく装置を使用することによって、微小物体を空間的に操作するための方法を確立することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法にしたがって微小物体を空間的に操作するための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る方法は、開口を持つ先端とカンチレバー内を長手方向に延びる微小流路とを有するカンチレバーであって、前記微小流路がカンチレバーの先端の開口と流体接続されて成るカンチレバーを用意するステップと、カンチレバーを保持しかつカンチレバーを予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段を用意するステップと、カンチレバー内の微小流路に予め定められた圧力を加えるための加圧手段を用意するステップと、先端の開口が微小物体に隣接するように、空間的に操作される微小物体にカンチレバーの先端を移動させるステップと、カンチレバーの先端の外側の圧力に対して微小流路内の圧力を低減させることによって、前記カンチレバーにより微小物体の一部分または微小物体全体をピックアップするステップと、カンチレバーを用いて微小物体の前記部分または前記微小物体全体を予め定められた空間経路に沿って移動させるステップとを含む。
【００１２】
本発明の方法の実施形態は、さらなるステップにおいて、カンチレバーの先端の外側の圧力に対して微小流路内の圧力を増大させることによって、微小物体の前記部分または前記微小物体全体がカンチレバーから解放されることを特徴とする。
【００１３】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体の前記部分または前記微小物体全体をカンチレバーの内部に、特にカンチレバーの微小流路内に導入することによって、微小物体の前記部分または前記微小物体全体をピックアップする。
【００１４】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体の前記部分または前記微小物体全体が処理のために、処理手段の陥凹内または開口内に解放される。
【００１５】
本発明の方法の別の実施形態は、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びるアスペクト比の高い細長い先端を持つカンチレバーを使用して、幾つかの微小物体の集合体から１個の特定の微小物体をピックアップすることを特徴とする。
【００１６】
本発明の方法の別の実施形態は、カンチレバーの長手方向に対して垂直に延びる尖鋭先端を持つカンチレバーを使用して、微小物体の一部分を引きちぎることを特徴とする。
【００１７】
本発明の方法の別の実施形態は、加圧手段が、ポンプによってまたは毛細管によって浸透力または電気浸透力を発生させる圧力源を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明の方法の別の実施形態は、微小物体の接着を回避するように表面が特に親水性または疎水性のいずれかを持つことによって改造された、カンチレバーを使用することを特徴とする。
【００１９】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体のピックアップ中に、前記微小物体と前記微小物体を支持する表面との間に作用する接着力によるカンチレバーの対応する変位を使用して、前記接着力を計算する。
【００２０】
本発明の方法の別の実施形態では、開口を閉止する微小物体の密着性を特徴付けるために、ピックアップ中に、カンチレバーの開口を介するインピーダンスを測定する。
【００２１】
本発明の方法の別の実施形態では、前記カンチレバーによってピックアップされた後、前記微小流路内に捕集された微小物体の数および／または質量を決定するために、カンチレバーの微小流路を介するインピーダンスを測定する。
【００２２】
本発明の方法の全く別の実施形態は、カンチレバーによってピックアップされた後、前記微小流路内に捕集された微小物体の数および／または質量を決定するために、前記カンチレバーがレーザビームによって検知されることを特徴とする。レーザビームの代わりに、音叉もしくは圧電抵抗素子または別の適切な検知手段を使用することができる。
【００２３】
本発明に係る装置は、開口を持つ先端とカンチレバー内をその長手方向に延びる微小流路とを有するカンチレバーであって、前記微小流路がカンチレバーの先端の開口に流体接続されて成るカンチレバーと、カンチレバーを保持しかつカンチレバーを予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段と、カンチレバー内の微小流路に予め定められた圧力を加えるための加圧手段とを備え、それによって前記加圧手段が、カンチレバーの先端の外側の圧力より低い圧力を微小流路内に発生させるように構成され、かつそれによってカンチレバー内の液圧インピーダンスを測定するために液圧インピーダンス測定手段が設けられる。
【００２４】
本発明の装置の実施形態では、カンチレバーの開口は、カンチレバーの外面と面一である。
【００２５】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる、高いアスペクト比の細長い、特に円筒状の先端を有する。
【００２６】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端を有する。
【００２７】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる角錐状先端を有する。先端の他の幾何学的形状が可能であるが、カンチレバーに組み込むのはおそらく容易ではない。
【００２８】
本発明の装置の全く別の実施形態では、カンチレバーの微小流路は、前記微小物体の１つ以上を受容するように構成される。
【００２９】
次に本発明を図面に関連して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】「ＦｌｕｉｄＦＭ」設計に基づいており、かつ流路付きカンチレバー内の液圧インピーダンスを測定するための手段を備えた、本発明の実施形態に係る装置の探査領域を示す。
【図２】本発明に係る方法に従って、カンチレバー内部に負圧を加えることによって微小物体をピックアップする中空カンチレバーの拡大図を示す。
【図３】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの変位を利用して微小物体をピックアップし、それにより接着力を測定するカンチレバーを示す。
【図４】本発明に係る操作手順の種々のステップを示し、（ａ）はカンチレバーの力制御接近に関し、（ｂ）は負圧を加え微小物体をピックアップするステップに関し、（ｃ）はｘ‐ｙ面内の変位に関し、（ｄ）は所望の位置における力制御着地および過圧パルスによる微小物体の解放に関する。
【図５】本発明の実施形態に従って、凸凹のある表面の中空内に埋め込まれた微小物体をピックアップする、アスペクト比の高い例えば中空円筒状の先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図６】本発明の実施形態に従って、物体の集合体、例えば組織の中から単一の微小物体をピックアップする、アスペクト比の高い例えば中空円筒状の先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図７】本発明の実施形態に従って、負圧または押力を加えることによって物体の一部を切り取り（ａ）、かつ物体の内部にアクセスするため、または前記部分をさらなる分析に使用するために前記部分を除去する（ｂ）、尖鋭先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図８】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路内に微小物体を吸い込むプロセスを示す。
【図９】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路から解放された微小物体を、反応管として働く陥凹内に配置するプロセスを示す。
【図１０】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路から解放された微小物体を、分析装置の吸引ノズルの一部である開口内に配置するプロセスを示す。
【図１１】本発明の実施形態に係る、平坦／鈍先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１２】本発明の実施形態に係る、円アスペクト比の高い筒状先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１３】本発明の別の実施形態に係る、角錐状先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１４】空間的に操作される前の種々の酵母細胞（円で囲んだ部分）の写真を示す。
【図１５】本発明に係る方法を用いて１列に並べられた後の図１４の酵母細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
これまで、微小物体を変位させるために使用することができるのは、物体に加えられる力を制御できないという不利点を持つプルドガラス（ｐｕｌｌｅｄ ｇｌａｓｓ）製のマイクロピペットまたは光ピンセットだけである。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づき、かつ機械的ピンセットを使用する、別の種類の試料操作装置は、米国特許出願公開第２００８／０３１４１３１号明細書に開示されている。
【００３２】
細胞の接着力は今日、手間のかかる工程によって測定されている。細胞または細菌をカンチレバー棒上で約３０分間成長させ、次いで表面と接触させる。そこで、カンチレバーを後退させることができ、かつ接着力を測定することができるようになる前に、細胞はさらに３０分間接着されなければならない。または逆に、細胞は最初に表面に付着される。これもこの方法の限界である。その理由は、カンチレバーへの細胞の付着が細胞の変化または表面特性の変化を誘発することがあるため、追加接着分子を導入しなければならないため、あるいは細胞がすでに他の生物学的プロセスを経験して細胞の接着性を変化させているためである。
【００３３】
本発明により、この測定全体を１分未満で実行することができる。図２に示す通り、中空カンチレバー１２はその先端開口１９が、細胞を損傷するリスクを冒すことなく力を制御して、表面２２に載っている微小物体または細胞２０に接近する。カンチレバー１２の流体環境に対して負圧（＜１バール）を加えることによって、物体または細胞２０は部分的に開口１９内に吸い込まれ、吸着カップの場合と同様にそこに維持される。物体２０と開口１９の内縁との間の密封の品質は、インピーダンス測定手段３４（図１参照）によりカンチレバー先端開口１９を介してインピーダンスを同時に測定することによって、制御かつ監視することができる。これを電気的に行なうために、電極３５をカンチレバー１２の内側および外側の適切な位置に配置することができる（図３参照）。
【００３４】
物体または細胞２０はここで、カンチレバー１２を後退させ、同時に（ばねによって象徴される）接着力２１を測定することによって、簡単に表面から引き離すことができる（図３）。接着力２１は、カンチレバー１２の変位によって測定される。
【００３５】
物体または細胞２０は次いで、カンチレバー１２をすぐに次の接着力測定に再使用することができるように、負圧を解除するかあるいは小さい過圧を加えることによって、先端から降ろすことができる。これは接着力の高速かつ全自動連続測定を可能にする。さらに、該システムは、細胞または他の微小物体２０を空間的に操作するために、簡単に使用することができる。
【００３６】
中空カンチレバー１２の開口１９は、単なる単純な穴（平坦／鈍先端、図１１参照）とするか、あるいは円筒状または角錐状先端構造の端部（図１２における２４および図１３における３２）に設けることができる。加えられた力は、偏向レーザビーム（図１の１８）またはカンチレバー１２に取り付けられた音叉もしくは圧電抵抗性材料により、カンチレバーの撓みを測定することによって検出される。
【００３７】
完全な一連の空間的操作ステップを図４に示す。第１ステップで、カンチレバー１２は操作対象の物体２３にｚ方向に接近する。このステップ中に、先端によって物体２０にかかる力は、レーザビーム１８（図４（ａ）における反射光線）を用いて監視される。物体２３がカンチレバー１２の微小流路１５内の負圧によって先端に接着すると、物体２３はｚ方向に持ち上げられて表面から離れる（図４（ｂ））。離昇後に、ＡＦＭのカンチレバー平行移動手段によりカンチレバー１２を移動させることによって、物体はそれに応じてｘ‐ｙ面内を移動することができる（図４（ｃ））。このステップ中に、微小流路１５内の負圧は維持される。最後に、物体２０は、表面にｚ方向に接近しかつ微小流路１５に正圧を加えることによって、他の場所に配置することができる（図４（ｄ））。再び、このステップ中に先端によって物体２０にかかる力は、反射レーザビーム１８を用いて監視される。
【００３８】
ピックアップ対象の微小物体２０が、凸凹のある表面２５の中空内に埋め込まれている場合（図５）、アスペクト比の高い例えば中空円筒の形の先端２４を備えたカンチレバー１２を使用することができる。同じカンチレバー構成を〜に使用することができる。
【００３９】
そのような先端は、物体の集合体２６（図６）、例えば組織の中から単一の物体をピックアップすることもできる。
【００４０】
上述したやり方で空間的に操作することのできる微小物体２０は、真核細胞、酵母菌、細菌、もしくは小胞のような生きた生体細胞、ウィルス、またはナノ粒子、結晶、繊維、もしくは高分子材料のような固体材料とすることができる。
【００４１】
同じ手順を適応して、適切な先端形状、穴の大きさを選択し、かつ物体を表面から引き離すときのカンチレバー１２の歪み、例えば物体‐表面相互作用または物体‐物体相互作用を測定することによって、任意物体の表面に対する接着力を測定することができる。
【００４２】
付着力が引張り力より強いときに、同じ手順を使用して、物体の一部を除去することができる。
【００４３】
尖鋭先端２７を持つカンチレバー１２がプローブホルダ１１（図７）に取り付けられたときに、該手順を使用して、負圧によって生じる力によって、またはカンチレバー１２を物体２０内に押し込むことによって、開口の鋭利な端縁を利用して、物体２０に切り込むことができる（図７（ａ））。切取り片２８は取り外して、切欠き部２９を介して物体２０の内部にアクセスするか、または前記切取り片２８をさらなる分析のために使用することができる（図７（ｂ））。
【００４４】
開口１９（および微小流路１５の断面）が物体２０より大きい場合、１つ以上の物体を中空カンチレバー１２の内部に捕集し、別の位置に分配することができる（図８、図９、および図１０）。例えば、物体２０は表面２２上であるいは陥凹または穴３０内に移動／分配することができる（図９）。特に、穴は、質量分析計、ＰＣＲ機械、またはＵＶ／ＶＩＳ ＩＲ分光計のような分析ツールに接続された呼吸穴またはノズル３１とすることができ、あるいは穴は、さらなる分析、例えばＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ用の反応管とすることができる（図１０）。
【００４５】
図１４および図１５は、単一生存細胞の例示的な空間的操作の写真（微分干渉コントラスト画像）を示す。図１４は、カンチレバー１２による空間的操作の前の不規則な構成における５つの酵母細胞３３を示す（円で囲んだ部分）。図１５では、これら５つの酵母細胞３３が、本発明に従って操作された後、一直線を形成している。
【００４６】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」技術は、ＡＦＭプローブホルダに固定された微小流路付きＡＦＭカンチレバーを使用する。外部被制御圧力源を中空カンチレバーの先端のアパーチャと接続する連続流体回路が達成される。このようにして、流体回路内部の液体に、過圧および負圧の両方を加えることができる。本発明は、力制御接近を加圧を組み合わせて、ガラススライド上で培養されている生きた有機体を把持し、単純かつ再現可能なやり方でそれらを微細精度で変位させる。このようにして、筋芽細胞、ニューロン、酵母菌、および細菌、または他の微小物体を高精度で操作することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１０ 原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）
１１ プローブホルダ
１２ カンチレバー
１３、２４、２７、３２ 先端
１４ 供給路
１５ 微小流路
１６ 配管
１７ 圧力源（被制御圧力源）
１８ レーザビーム
１９ 開口
２０、２３ 物体（微小物体）
２１ 接着力
２２、２５ 表面（基質）
２６ （物体の）集合体
２８ 切取り片
２９ 切欠き部
３０ 陥凹
３１ 吸引ノズル
３３ 酵母細胞
３４ インピーダンス測定手段
３５ 電極
３６ 変位
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、生体細胞、ニューロンのような微小物体、または、ウィルスもしくはナノ粒子のようなサブミクロン物体等の操作の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一細胞レベルの情報を得る能力は、多くの生物学的問題にとって中心的な重要性を持つようになりつつあり、主要な課題である。個々の細胞は、遺伝的には姉妹細胞と同一であるが、遺伝子（転写物）の異なる表現型および発現プロフィール、およびその結果として、異なるタンパク質および代謝物のレベルを示すという認識がますます高まっている。個々の細胞を取り扱うために新規な革新的技術が必要とされており、ここで「取り扱う」とは、変位、注入から分析までの範囲の広い意味を有する。以下では、単一細胞の制御された空間的変位に焦点を合わせる。
【０００３】
数年前に、Ａ．Ａｓｈｋｉｎと共同研究者らは他に先駆けて、生物学的物体を操作する手段として光ピンセットを開発した（例えば欧州特許出願公開第３０７９４０号明細書参照）。強力なコリメートされたレーザを介する放射圧による捕獲力を利用して、彼らは、ウィルス、細菌、細胞から細胞器官までを取り扱うことができることを示した。しかし、光ピンセットが捕獲された有機体をどの程度損傷するかについは、いまだに議論中である。
【０００４】
単一細胞を操作するための最も古い器具であるガラスマイクロピペットは、実際には変位実験に適しない。生物学的物体を吸引するために圧力制御装置と組み合わされたマイクロマニピュレータを用いて操作されるそれらの配置は、依然として、１μｍ程度の固有分解能によって制限される光学顕微鏡法によって追跡される。したがって、損傷の無い有機体への接近は運任せの手順であり、吸引に成功しても、基質表面の別の位置にそれを安全に再配置することは事実上不可能である。
【０００５】
原子間力顕微鏡ＡＦＭ（Ｇ．Ｂｉｎｎｉｇ、Ｃ．Ｆ．Ｑｕａｔｅ、およびＣ．Ｇｅｒｂｅｒ、Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ｌｅｔｔ ５６（９）、９３０（１９８６））は、ｐＮ範囲の所要力フィードバックを有する。有機体操作に関して、それはブライトスペクトルの接着実験に採用されているが、有機体はカンチレバーの下面に安定的に付着されており、基質の別の位置での有機体の解放を防止しているので、変位実験用には考えられていない。
【０００６】
カンチレバーに直接組み込まれた微小流路を介して、高精度ＡＦＭ力フィードバックをナノ流体と組み合わせた（欧州特許出願公開第１９９０６２６号明細書参照）、「ＦｌｕｉｄＦＭ」の開発（Ａ．Ｍｅｉｓｔｅｒ、Ｍ．Ｇａｂｉ、Ｐ．Ｂｅｈｒ、Ｐ．Ｓｔｕｄｅｒ、Ｊ．Ｖｏｒｏｓ、Ｐ．Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ、Ｊ．Ｂｉｔｔｅｒｌｉ、Ｊ．Ｐｏｌｅｓｅｌ‐Ｍａｒｉｓ、Ｍ．Ｌｉｌｅｙ、Ｈ．Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎ、およびＴ．Ｚａｍｂｅｌｌｉ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ９（６）、２５０１（２００９））は、生物学的物体の空間的操作のための新規な戦略を切り開くものである。カンチレバー内の微小流路は、角錐状先端の頂点におけるサブミクロンのアパーチャで終端し、かつ他端はリザーバで終端する。流路は、ＡＦＭプローブホルダ内にも機械加工される。プローブホルダにチップを簡便に押止することによって、先端アパーチャを注射器または圧力制御装置と接続する連続流体管路が得られる。したがって、「ＦｌｕｉｄＦＭ」を液体環境内に浸漬することができる一方、溝内の溶液に圧力を加えることができる。
【０００７】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」の探査領域を図１に示す。図１の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）１０は、図示しないＡＦＭの顕微操作機構に取り付けられたプローブホルダ１１を備える。プローブホルダ１１には、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）技術によって製作された細長いカンチレバー１２が取り付けられる。カンチレバー１２には、カンチレバー１２の長手方向に延びる内部微小流路１５が設けられる。微小流路１５はその外端がカンチレバー１２の角錐状先端１３の開口１９と液圧接続する。微小流路１５の他端は、外部の制御可能な圧力源１７から配管１６を介して予め定められた流体圧力を受け取るように、プローブホルダ１１を貫通する供給路１４に接続される。図１はさらに、液体経路に接続されたインピーダンス測定手段３４を示す。このインピーダンス測定手段３４は周知の「ＦｌｕｉｄＦＭ」装置の一部ではなく、以下で詳細に説明する本発明に係る装置の新規な特徴である。
【０００８】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」は、生理学的条件下における単一生細胞の局所的液体分注および刺激に使用される。カンチレバー１２のナノ流体微小流路１５は、ＡＦＭ先端のサブミクロンのアパーチャまたは開口１９を介して可溶性分子を分注することを可能にする。レーザビーム１８によって達成される高感度ＡＦＭの力フィードバックは、液体環境内の表面を極めて局所的に変化させるために、先端を試料に制御された状態で接近させることを可能にする。それはまた、細胞膜との穏やかな接触やその穿孔の間の確実な区別をも可能にする。これら２つの手順を使用して、個々の生細胞に、かつこれらの細胞の選択された細胞下構造にさえ、色素が導入されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の主目的は、上述した「ＦｌｕｉｄＦＭ」の原理に基づく装置を使用することによって、微小物体を空間的に操作するための方法を確立することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法にしたがって微小物体を空間的に操作するための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る方法は、開口を持つ先端とカンチレバー内を長手方向に延びる微小流路とを有するカンチレバーであって、前記微小流路がカンチレバーの先端の開口と流体接続されて成るカンチレバーを用意するステップと、カンチレバーを保持しかつカンチレバーを予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段を用意するステップと、カンチレバー内の微小流路に予め定められた圧力を加えるための加圧手段を用意するステップと、先端の開口が微小物体に隣接するように、空間的に操作される微小物体にカンチレバーの先端を移動させるステップと、カンチレバーの先端の外側の圧力に対して微小流路内の圧力を低減させることによって、前記カンチレバーにより微小物体の一部分または微小物体全体をピックアップするステップと、カンチレバーを用いて微小物体の前記部分または前記微小物体全体を予め定められた空間経路に沿って移動させるステップとを含む。
【００１２】
本発明の方法の実施形態は、さらなるステップにおいて、カンチレバーの先端の外側の圧力に対して微小流路内の圧力を増大させることによって、微小物体の前記部分または前記微小物体全体がカンチレバーから解放されることを特徴とする。
【００１３】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体の前記部分または前記微小物体全体をカンチレバーの内部に、特にカンチレバーの微小流路内に導入することによって、微小物体の前記部分または前記微小物体全体をピックアップする。
【００１４】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体の前記部分または前記微小物体全体が処理のために、処理手段の陥凹内または開口内に解放される。
【００１５】
本発明の方法の別の実施形態は、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びるアスペクト比の高い細長い先端を持つカンチレバーを使用して、幾つかの微小物体の集合体から１個の特定の微小物体をピックアップすることを特徴とする。
【００１６】
本発明の方法の別の実施形態は、カンチレバーの長手方向に対して垂直に延びる尖鋭先端を持つカンチレバーを使用して、微小物体の一部分を引きちぎることを特徴とする。
【００１７】
本発明の方法の別の実施形態は、加圧手段が、ポンプによってまたは毛細管によって浸透力または電気浸透力を発生させる圧力源を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明の方法の別の実施形態は、微小物体の接着を回避するように表面が特に親水性または疎水性のいずれかを持つことによって改造された、カンチレバーを使用することを特徴とする。
【００１９】
本発明の方法の別の実施形態では、微小物体のピックアップ中に、前記微小物体と前記微小物体を支持する表面との間に作用する接着力によるカンチレバーの対応する変位を使用して、前記接着力を計算する。
【００２０】
本発明の方法の別の実施形態では、開口を閉止する微小物体の密着性を特徴付けるために、ピックアップ中に、カンチレバーの開口を介するインピーダンスを測定する。
【００２１】
本発明の方法の別の実施形態では、前記カンチレバーによってピックアップされた後、前記微小流路内に捕集された微小物体の数および／または質量を決定するために、カンチレバーの微小流路を介するインピーダンスを測定する。
【００２２】
本発明の方法の全く別の実施形態は、カンチレバーによってピックアップされた後、前記微小流路内に捕集された微小物体の数および／または質量を決定するために、前記カンチレバーがレーザビームによって検知されることを特徴とする。レーザビームの代わりに、音叉もしくは圧電抵抗素子または別の適切な検知手段を使用することができる。
【００２３】
本発明に係る装置は、開口を持つ先端とカンチレバー内をその長手方向に延びる微小流路とを有するカンチレバーであって、前記微小流路がカンチレバーの先端の開口に流体接続されて成るカンチレバーと、カンチレバーを保持しかつカンチレバーを予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段と、カンチレバー内の微小流路に予め定められた圧力を加えるための加圧手段とを備え、それによって前記加圧手段が、カンチレバーの先端の外側の圧力より低い圧力を微小流路内に発生させるように構成され、かつそれによってカンチレバー内の液圧インピーダンスを測定するために液圧インピーダンス測定手段が設けられる。
【００２４】
本発明の装置の実施形態では、カンチレバーの開口は、カンチレバーの外面と面一である。
【００２５】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる、高いアスペクト比の細長い、特に円筒状の先端を有する。
【００２６】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端を有する。
【００２７】
本発明の装置の別の実施形態では、カンチレバーは、カンチレバーの長手方向に対し垂直に延びる角錐状先端を有する。先端の他の幾何学的形状が可能であるが、カンチレバーに組み込むのはおそらく容易ではない。
【００２８】
本発明の装置の全く別の実施形態では、カンチレバーの微小流路は、前記微小物体の１つ以上を受容するように構成される。
【００２９】
次に本発明を図面に関連して詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】「ＦｌｕｉｄＦＭ」設計に基づいており、かつ流路付きカンチレバー内の液圧インピーダンスを測定するための手段を備えた、本発明の実施形態に係る装置の探査領域を示す。
【図２】本発明に係る方法に従って、カンチレバー内部に負圧を加えることによって微小物体をピックアップする中空カンチレバーの拡大図を示す。
【図３】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの変位を利用して微小物体をピックアップし、それにより接着力を測定するカンチレバーを示す。
【図４】本発明に係る操作手順の種々のステップを示し、（ａ）はカンチレバーの力制御接近に関し、（ｂ）は負圧を加え微小物体をピックアップするステップに関し、（ｃ）はｘ‐ｙ面内の変位に関し、（ｄ）は所望の位置における力制御着地および過圧パルスによる微小物体の解放に関する。
【図５】本発明の実施形態に従って、凸凹のある表面の中空内に埋め込まれた微小物体をピックアップする、アスペクト比の高い例えば中空円筒状の先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図６】本発明の実施形態に従って、物体の集合体、例えば組織の中から単一の微小物体をピックアップする、アスペクト比の高い例えば中空円筒状の先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図７】本発明の実施形態に従って、負圧または押力を加えることによって物体の一部を切り取り（ａ）、かつ物体の内部にアクセスするため、または前記部分をさらなる分析に使用するために前記部分を除去する（ｂ）、尖鋭先端を持つカンチレバーの使用を示す。
【図８】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路内に微小物体を吸い込むプロセスを示す。
【図９】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路から解放された微小物体を、反応管として働く陥凹内に配置するプロセスを示す。
【図１０】本発明の実施形態に従って、カンチレバーの微小流路から解放された微小物体を、分析装置の吸引ノズルの一部である開口内に配置するプロセスを示す。
【図１１】本発明の実施形態に係る、平坦／鈍先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１２】本発明の実施形態に係る、円アスペクト比の高い筒状先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１３】本発明の別の実施形態に係る、角錐状先端を持つカンチレバーの斜視図を示す。
【図１４】空間的に操作される前の種々の酵母細胞（円で囲んだ部分）の写真を示す。
【図１５】本発明に係る方法を用いて１列に並べられた後の図１４の酵母細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
これまで、微小物体を変位させるために使用することができるのは、物体に加えられる力を制御できないという不利点を持つプルドガラス（ｐｕｌｌｅｄ ｇｌａｓｓ）製のマイクロピペットまたは光ピンセットだけである。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に基づき、かつ機械的ピンセットを使用する、別の種類の試料操作装置は、米国特許出願公開第２００８／０３１４１３１号明細書に開示されている。
【００３２】
細胞の接着力は今日、手間のかかる工程によって測定されている。細胞または細菌をカンチレバー棒上で約３０分間成長させ、次いで表面と接触させる。そこで、カンチレバーを後退させることができ、かつ接着力を測定することができるようになる前に、細胞はさらに３０分間接着されなければならない。または逆に、細胞は最初に表面に付着される。これもこの方法の限界である。その理由は、カンチレバーへの細胞の付着が細胞の変化または表面特性の変化を誘発することがあるため、追加接着分子を導入しなければならないため、あるいは細胞がすでに他の生物学的プロセスを経験して細胞の接着性を変化させているためである。
【００３３】
本発明により、この測定全体を１分未満で実行することができる。図２に示す通り、中空カンチレバー１２はその先端開口１９が、細胞を損傷するリスクを冒すことなく力を制御して、表面２２に載っている微小物体または細胞２０に接近する。カンチレバー１２の流体環境に対して負圧（＜１バール）を加えることによって、物体または細胞２０は部分的に開口１９内に吸い込まれ、吸着カップの場合と同様にそこに維持される。物体２０と開口１９の内縁との間の密封の品質は、インピーダンス測定手段３４（図１参照）によりカンチレバー先端開口１９を介してインピーダンスを同時に測定することによって、制御かつ監視することができる。これを電気的に行なうために、電極３５をカンチレバー１２の内側および外側の適切な位置に配置することができる（図３参照）。
【００３４】
物体または細胞２０はここで、カンチレバー１２を後退させ、同時に（ばねによって象徴される）接着力２１を測定することによって、簡単に表面から引き離すことができる（図３）。接着力２１は、カンチレバー１２の変位によって測定される。
【００３５】
物体または細胞２０は次いで、カンチレバー１２をすぐに次の接着力測定に再使用することができるように、負圧を解除するかあるいは小さい過圧を加えることによって、先端から降ろすことができる。これは接着力の高速かつ全自動連続測定を可能にする。さらに、該システムは、細胞または他の微小物体２０を空間的に操作するために、簡単に使用することができる。
【００３６】
中空カンチレバー１２の開口１９は、単なる単純な穴（平坦／鈍先端、図１１参照）とするか、あるいは円筒状または角錐状先端構造の端部（図１２における２４および図１３における３２）に設けることができる。加えられた力は、偏向レーザビーム（図１の１８）またはカンチレバー１２に取り付けられた音叉もしくは圧電抵抗性材料により、カンチレバーの撓みを測定することによって検出される。
【００３７】
完全な一連の空間的操作ステップを図４に示す。第１ステップで、カンチレバー１２は操作対象の物体２３にｚ方向に接近する。このステップ中に、先端によって物体２０にかかる力は、レーザビーム１８（図４（ａ）における反射光線）を用いて監視される。物体２３がカンチレバー１２の微小流路１５内の負圧によって先端に接着すると、物体２３はｚ方向に持ち上げられて表面から離れる（図４（ｂ））。離昇後に、ＡＦＭのカンチレバー平行移動手段によりカンチレバー１２を移動させることによって、物体はそれに応じてｘ‐ｙ面内を移動することができる（図４（ｃ））。このステップ中に、微小流路１５内の負圧は維持される。最後に、物体２０は、表面にｚ方向に接近しかつ微小流路１５に正圧を加えることによって、他の場所に配置することができる（図４（ｄ））。再び、このステップ中に先端によって物体２０にかかる力は、反射レーザビーム１８を用いて監視される。
【００３８】
ピックアップ対象の微小物体２０が、凸凹のある表面２５の中空内に埋め込まれている場合（図５）、アスペクト比の高い例えば中空円筒の形の先端２４を備えたカンチレバー１２を使用することができる。同じカンチレバー構成を〜に使用することができる。
【００３９】
そのような先端は、物体の集合体２６（図６）、例えば組織の中から単一の物体をピックアップすることもできる。
【００４０】
上述したやり方で空間的に操作することのできる微小物体２０は、真核細胞、酵母菌、細菌、もしくは小胞のような生きた生体細胞、ウィルス、またはナノ粒子、結晶、繊維、もしくは高分子材料のような固体材料とすることができる。
【００４１】
同じ手順を適応して、適切な先端形状、穴の大きさを選択し、かつ物体を表面から引き離すときのカンチレバー１２の歪み、例えば物体‐表面相互作用または物体‐物体相互作用を測定することによって、任意物体の表面に対する接着力を測定することができる。
【００４２】
付着力が引張り力より強いときに、同じ手順を使用して、物体の一部を除去することができる。
【００４３】
尖鋭先端２７を持つカンチレバー１２がプローブホルダ１１（図７）に取り付けられたときに、該手順を使用して、負圧によって生じる力によって、またはカンチレバー１２を物体２０内に押し込むことによって、開口の鋭利な端縁を利用して、物体２０に切り込むことができる（図７（ａ））。切取り片２８は取り外して、切欠き部２９を介して物体２０の内部にアクセスするか、または前記切取り片２８をさらなる分析のために使用することができる（図７（ｂ））。
【００４４】
開口１９（および微小流路１５の断面）が物体２０より大きい場合、１つ以上の物体を中空カンチレバー１２の内部に捕集し、別の位置に分配することができる（図８、図９、および図１０）。例えば、物体２０は表面２２上であるいは陥凹または穴３０内に移動／分配することができる（図９）。特に、穴は、質量分析計、ＰＣＲ機械、またはＵＶ／ＶＩＳ ＩＲ分光計のような分析ツールに接続された呼吸穴またはノズル３１とすることができ、あるいは穴は、さらなる分析、例えばＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ用の反応管とすることができる（図１０）。
【００４５】
図１４および図１５は、単一生存細胞の例示的な空間的操作の写真（微分干渉コントラスト画像）を示す。図１４は、カンチレバー１２による空間的操作の前の不規則な構成における５つの酵母細胞３３を示す（円で囲んだ部分）。図１５では、これら５つの酵母細胞３３が、本発明に従って操作された後、一直線を形成している。
【００４６】
「ＦｌｕｉｄＦＭ」技術は、ＡＦＭプローブホルダに固定された微小流路付きＡＦＭカンチレバーを使用する。外部被制御圧力源を中空カンチレバーの先端のアパーチャと接続する連続流体回路が達成される。このようにして、流体回路内部の液体に、過圧および負圧の両方を加えることができる。本発明は、力制御接近を加圧を組み合わせて、ガラススライド上で培養されている生きた有機体を把持し、単純かつ再現可能なやり方でそれらを微細精度で変位させる。このようにして、筋芽細胞、ニューロン、酵母菌、および細菌、または他の微小物体を高精度で操作することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１０ 原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）
１１ プローブホルダ
１２ カンチレバー
１３、２４、２７、３２ 先端
１４ 供給路
１５ 微小流路
１６ 配管
１７ 圧力源（被制御圧力源）
１８ レーザビーム
１９ 開口
２０、２３ 物体（微小物体）
２１ 接着力
２２、２５ 表面（基質）
２６ （物体の）集合体
２８ 切取り片
２９ 切欠き部
３０ 陥凹
３１ 吸引ノズル
３３ 酵母細胞
３４ インピーダンス測定手段
３５ 電極
３６ 変位
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小物体（２０、２３、３３）を空間的に操作するための方法であって、
開口（１９）を持つ先端（１３、２４、２７、３２）と、内部を長手方向に延びる微小流路（１５）とを有するカンチレバー（１２）であって、前記微小流路（１５）が前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）と流体接続して成る、カンチレバー（１２）を用意するステップと、
前記カンチレバー（１２）を保持しかつ前記カンチレバー（１２）を予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段（１１）を用意するステップと、
予め定められた圧力を前記カンチレバー内の前記微小流路（１５）に加えるための加圧手段（１４、１６、１７）を用意するステップと、
前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）が前記微小物体（２０、２３、３３）に隣接するように、空間的に操作される前記微小物体（２０、２３、３３）に前記カンチレバー（１２）の先端（１３、２４、２７、３２）を移動させるステップと、
前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側に対して前記微小流路（１５）内の圧力を低減させることによって、前記カンチレバー（１２）で、前記微小物体（２０、２３、３３）の一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体をピックアップするステップと、
前記カンチレバー（１２）を用いて前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体を予め定められた空間経路に沿って移動させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
さらなるステップで、前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側の圧力に対して前記微小流路（１５）内の圧力を増大させることによって、前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体が前記カンチレバー（１２）から解放されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体を前記カンチレバー（１２）の内部に、特に前記カンチレバー（１２）の前記微小流路（１５）内に導入することによって、前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体がピックアップされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体が、処理対象の処理手段の陥凹（３０）内または開口（３１）内に解放されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる、アスペクト比の高い細長い先端（２４）を持つ前記カンチレバー（１２）が、幾つかの微小物体（２０）の凝集体（２６）から１つの特定の微小物体（２０）をピックアップするために使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端（２７）を持つ前記カンチレバー（１２）が、微小物体（２０、２３、３３）の一部分（２８）を引きちぎるために使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記加圧手段（１４、１６、１７）が、ポンプによってまたは毛細管によって浸透力または電気浸透力を発生させる圧力源（１７）を備えることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
特に親水性または疎水性のいずれかを有することによって前記微小物体（２０、２３、３３）の接着を回避するように改造された表面を持つカンチレバー（１２）を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
微小物体（２０、２３、３３）をピックアップ中に、前記微小物体（２０、２３、３３）と前記微小物体（２０、２３、３３）を支持する前記表面（２２）との間に作用する接着力（２１）による前記カンチレバー（１２）の対応する変位（ｄ）を使用して前記接着力（２１）を計算することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ピックアップ中に、前記開口（１９）を閉止する前記微小物体（２０、２３、３３）の密着性を特徴付けるために、前記カンチレバーの前記開口（１９）を介するインピーダンスを測定することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カンチレバー（１２）によってピックアップされた後、前記微小流路（１５）内に捕集された微小物体（２０、２３、３３）の個数および／または質量を決定するために、前記カンチレバーの前記微小流路（１５）を介するインピーダンスを測定することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カンチレバー（１２）によってピックアップされた後、前記微小流路（１５）に捕集された微小物体（２０、２３、３３）の個数および／または質量を決定するために、前記カンチレバー（１２）がレーザビーム（１８）によって検知されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
開口（１９）を持つ先端（１３、２４、２７、３２）と、内部をその長手方向に延びる微小流路（１５）とを有するカンチレバー（１２）であって、前記微小流路（１５）が前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）に流体接続されて成る、カンチレバー（１２）と、
前記カンチレバー（１２）を保持しかつ前記カンチレバー（１２）を予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段（１１）と、
前記カンチレバー内の前記微小流路（１５）に予め定められた圧力を加えるための加圧手段（１４、１６、１７）と
を備えた、請求項１〜９のいずれか一項に従って微小物体（２０、２３、３３）を空間的に操作するための装置において、
前記加圧手段（１４、１６、１７）が、前記微小流路（１５）内に前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側の圧力より低い圧力を発生させるように構成され、かつ前記カンチレバー（１２）内の液圧インピーダンスを測定するためのインピーダンス測定手段（３４、３５）が設けられることを特徴とする装置。
【請求項１４】
前記カンチレバー（１２）の前記開口（１９）が前記カンチレバー（１２）の外面と面一であることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる、高アスペクト比の細長い、特に円筒状の先端（２４）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端（２７）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる角錐状先端（３２）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
前記カンチレバー（１２）の前記微小流路（１５）が前記微小物体（２０、２３、３３）の１つ以上を受容するように構成されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の装置。
【請求項１】
微小物体（２０、２３、３３）を空間的に操作するための方法であって、
開口（１９）を持つ先端（１３、２４、２７、３２）と、内部を長手方向に延びる微小流路（１５）とを有するカンチレバー（１２）であって、前記微小流路（１５）が前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）と流体接続して成る、カンチレバー（１２）を用意するステップと、
前記カンチレバー（１２）を保持しかつ前記カンチレバー（１２）を予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段（１１）を用意するステップと、
予め定められた圧力を前記カンチレバー内の前記微小流路（１５）に加えるための加圧手段（１４、１６、１７）を用意するステップと、
前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）が前記微小物体（２０、２３、３３）に隣接するように、空間的に操作される前記微小物体（２０、２３、３３）に前記カンチレバー（１２）の先端（１３、２４、２７、３２）を移動させるステップと、
前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側に対して前記微小流路（１５）内の圧力を低減させることによって、前記カンチレバー（１２）で、前記微小物体（２０、２３、３３）の一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体をピックアップするステップと、
前記カンチレバー（１２）を用いて前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体を予め定められた空間経路に沿って移動させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
さらなるステップで、前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側の圧力に対して前記微小流路（１５）内の圧力を増大させることによって、前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体が前記カンチレバー（１２）から解放されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体を前記カンチレバー（１２）の内部に、特に前記カンチレバー（１２）の前記微小流路（１５）内に導入することによって、前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体がピックアップされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微小物体（２０、２３、３３）の前記一部分（２８）または前記微小物体（２０、２３、３３）全体が、処理対象の処理手段の陥凹（３０）内または開口（３１）内に解放されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる、アスペクト比の高い細長い先端（２４）を持つ前記カンチレバー（１２）が、幾つかの微小物体（２０）の凝集体（２６）から１つの特定の微小物体（２０）をピックアップするために使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端（２７）を持つ前記カンチレバー（１２）が、微小物体（２０、２３、３３）の一部分（２８）を引きちぎるために使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記加圧手段（１４、１６、１７）が、ポンプによってまたは毛細管によって浸透力または電気浸透力を発生させる圧力源（１７）を備えることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
特に親水性または疎水性のいずれかを有することによって前記微小物体（２０、２３、３３）の接着を回避するように改造された表面を持つカンチレバー（１２）を使用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
微小物体（２０、２３、３３）をピックアップ中に、前記微小物体（２０、２３、３３）と前記微小物体（２０、２３、３３）を支持する前記表面（２２）との間に作用する接着力（２１）による前記カンチレバー（１２）の対応する変位（ｄ）を使用して前記接着力（２１）を計算することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ピックアップ中に、前記開口（１９）を閉止する前記微小物体（２０、２３、３３）の密着性を特徴付けるために、前記カンチレバーの前記開口（１９）を介するインピーダンスを測定することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カンチレバー（１２）によってピックアップされた後、前記微小流路（１５）内に捕集された微小物体（２０、２３、３３）の個数および／または質量を決定するために、前記カンチレバーの前記微小流路（１５）を介するインピーダンスを測定することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カンチレバー（１２）によってピックアップされた後、前記微小流路（１５）に捕集された微小物体（２０、２３、３３）の個数および／または質量を決定するために、前記カンチレバー（１２）がレーザビーム（１８）によって検知されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
開口（１９）を持つ先端（１３、２４、２７、３２）と、内部をその長手方向に延びる微小流路（１５）とを有するカンチレバー（１２）であって、前記微小流路（１５）が前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の前記開口（１９）に流体接続されて成る、カンチレバー（１２）と、
前記カンチレバー（１２）を保持しかつ前記カンチレバー（１２）を予め定められた空間経路に沿って空間的に移動させるための懸吊手段（１１）と、
前記カンチレバー内の前記微小流路（１５）に予め定められた圧力を加えるための加圧手段（１４、１６、１７）と
を備えた、請求項１〜９のいずれか一項に従って微小物体（２０、２３、３３）を空間的に操作するための装置において、
前記加圧手段（１４、１６、１７）が、前記微小流路（１５）内に前記カンチレバー（１２）の前記先端（１３、２４、２７、３２）の外側の圧力より低い圧力を発生させるように構成され、かつ前記カンチレバー（１２）内の液圧インピーダンスを測定するためのインピーダンス測定手段（３４、３５）が設けられることを特徴とする装置。
【請求項１４】
前記カンチレバー（１２）の前記開口（１９）が前記カンチレバー（１２）の外面と面一であることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる、高アスペクト比の細長い、特に円筒状の先端（２４）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる尖鋭先端（２７）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
前記カンチレバー（１２）が、前記カンチレバー（１２）の長手方向に対し垂直に延びる角錐状先端（３２）を有することを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
前記カンチレバー（１２）の前記微小流路（１５）が前記微小物体（２０、２３、３３）の１つ以上を受容するように構成されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【図６】
【図７ａ）】
【図７ｂ）】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５】
【図６】
【図７ａ）】
【図７ｂ）】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１３−５２０６５９（Ｐ２０１３−５２０６５９Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４１８３（Ｐ２０１２−５５４１８３）
【出願日】平成２３年２月７日（２０１１．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２０１１／００００２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３６９１
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０６１１０６３４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月７日（２０１１．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２０１１／００００２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３６９１
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０６１１０６３４）
【Ｆターム（参考）】
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