微粒子検出装置
【課題】各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出する微粒子検出装置を提供すること。
【解決手段】微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に照射する励起光発光器２と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器５とを備えるとともに、励起光発光器２と蛍光検出器５を含む光学系又は微細管６の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管６内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器５の画像信号から検出する。
【解決手段】微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に照射する励起光発光器２と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器５とを備えるとともに、励起光発光器２と蛍光検出器５を含む光学系又は微細管６の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管６内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器５の画像信号から検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料中に細胞等の各種微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を迅速に調べるための分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してその時発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、微細管等電点電気泳動技術により微生物等の微粒子細胞をそれが持つ等電点のｐＨ領域に濃縮する技術に関する論文はあるが、その具体的検出手段の詳細は記述されていない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きいため、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するために、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効であることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤として用いられるアルギン酸塩は、すべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
【０００６】
環境水や食品汚染及び感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その汚染源や感染源を迅速に突きとめ対処したりするためには、汚染源や感染源となり得る微生物の迅速でかつ特異的な検出方法が要請されている。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【非特許文献１】微細管電気泳動法による微生物の分離検出法（月刊フードケミカル２００５−２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、微生物等の各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器の検出信号から検出するようにしたことを特徴とする。
【０００９】
この場合において、蛍光検出器により検出した信号を画像信号として記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えることができる。
【００１０】
また、微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることができる。
【００１１】
また、表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えることができる。
【００１２】
また、印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵することができる。
【００１３】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器の検出信号から検出することから、特殊な技術を必要とすることなく、試料中に種々含まれる微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離するとともに、目的の微粒子を予め蛍光染色することにより、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出し、一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができ、さらに、試料中に混在する微粒子の検出器としてＣＣＤ画像センサ等を用いることにより、単に信号検出できるだけでなく、得られた画像信号から定量的に検出することができる。
【００１５】
また、蛍光検出器により検出した画像信号を記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えることにより、その画像処理結果、又は微粒子検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。
【００１６】
また、微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。
【００１７】
また、表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えることにより、微粒子検出の自動制御を集約して行うことができる。
【００１８】
また、印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵することにより、時間経過とともに長くなる波形記録を見やすい画面で表示することができる。
【００１９】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
【００２１】
本発明の微粒子検出装置は、泳動液を用いた微細管電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離する。
また、この微細管電気泳動法において、検出手段として蛍光検出器を利用することにより、目的の微粒子を予め蛍光染色することによって、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、また、これによりさらに一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子が検出することができる。
さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、画像処理を行うことにより定量的に検出することができる。
なお、本発明でいう検出とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、他との分離、定性的検出、定量的検出、スクリーニング、生死判別等を包含するものである。
【００２２】
具体的には、例えば、下記の一部又は全部を構成要件として備えた微粒子検出装置である。
（１）微粒子を含む試料を、泳動液を用いて微細管電気泳動する。
（２）微粒子を含む試料を微粒子に選択的に結合するように蛍光染色し、これを微細管電気泳動に供して、蛍光染色された微粒子を蛍光検出する。
（３）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、泳動液を含む水槽、泳動液に注入された微粒子を濃縮分離する微細管、及び濃縮された微粒子を検出するための検出手段を備えている。
（４）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、微細管内に設けた電圧勾配により微粒子を濃縮する。
（５）検出手段として蛍光検出器を備えており、蛍光染色した微粒子に励起光照射し、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出し、蛍光検出した検出信号から微粒子を検出する。
（６）また、光学系で蛍光検出した信号を画像信号とし、画像信号を記録する画像信号記録装置、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置を有する。
（７）さらには、微粒子検出信号は、画像の輝度、規定した輝度以上の信号を有する画像の面積、画像を空間的、時間的に特徴付けて検出した微粒子の数等とする。
（８）微粒子検出制御装置には、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能、微粒子検出信号記録機能等を有するとともに、微細管内電流、微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵する。
【実施例１】
【００２３】
図１に、本発明の微細管電気泳動システムの基本的構成を一例として示す。
図１において、１は微粒子検出装置本体であり、ダイオード等の励起光発光器２、対物レンズ４、例えば、ＣＣＤカメラや光電管等の蛍光検出器５等から構成されている。
検出対象物である有害菌等の微粒子、例えば、大腸菌等の人体に有害な微生物は、予め微生物とのみ選択的に結合するように蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管６の内部に、その両端に設置した溶液９ａ又は９ｂより注入する。
溶液９ａ又は溶液９ｂは検出の段階に応じて変更し、電極７ａ、７ｂにより微細管６の両端に高圧電源を印加する。高電圧は高圧電源７より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８より制御する。
【００２４】
２ａは励起光発光器２から発した励起光であり、微細管６の検出窓６ａより、蛍光染色された微粒子に照射される。
蛍光染色された微粒子は励起光により蛍光２ｂを発光し、対物レンズ４より装置本体内に入射し、例えば、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５に結像され、検出される。
蛍光検出器５により検出した検出画像信号は、画像信号記録装置５ａに記録するとともに、微粒子検出制御装置８に接続される。微粒子検出制御装置８では、この画像信号から微粒子の検出を行い、その結果を記録、表示する。
【００２５】
蛍光染色された微粒子は、例えば、等電点電気泳動等既知の電気泳動技術（非特許文献１）により、検出窓６ａ内に濃縮される。
この濃縮された微粒子を検出するために、アーム１１に固定した微細管６を略円形状に形成し、略円形状に形成した微細管６の中心、すなわちアーム１１の中心１２にモータ１０を接続する。
モータ１０によりアーム１１を回転し、微細管６、検出窓６ａ及び溶液９ａ、９ｂ等を一体として１２を中心に回転させ、対物レンズ４と検出窓６ａとの距離を一定に保ち、検出窓６ａの端から端までを相対的に移動しながら走査する。この走査過程において、微粒子の検出動作を行う。
なお、この実施例では、モータ１０により微細管６を回転させたが、微細管６を固定し、励起光発光器２と微粒子検出装置１を含む光学系全体にモータを取り付け、例えば、１２を中心とする円の軌跡で回転させてもよい。
すなわち、励起光発光器２と対物レンズ４を含む光学系全体、と検出窓６ａの少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、検出窓６ａの端から端までを走査することにより、全く同様にこの走査過程において、微粒子の検出動作を行うことができる。
【００２６】
図２は、微細管６内における有害菌の泳動状況を示したものであり、次に示す検出過程を踏む。検出対象としての微粒子２１を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液９ａとして準備し、溶液９ｂの側から吸引することにより、微細管６内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、溶液９ａ、９ｂとして酸性、アルカリ性の溶液を用い、電極７ａ、７ｂをそれぞれ高圧電源７に接続し、微粒子検出制御装置８により、電極７ａ、電極７ｂに高電圧を印加するように接続する。次いで高圧電源７を作動すると、微細管６内の検水溶液２０に電位勾配が発生し、その結果、微細管内の泳動領域内の液全体は等電点現象により陰極方向と陽極方向の間にｐＨ勾配を発生する。
【００２７】
この既知の微細管等電点電気泳動技術により、検水溶液２０内に存在し得る微粒子は、微粒子細胞が有する等電点と同じｐＨ条件の領域（等電点位置）に濃縮することができる（例えば、非特許文献１等参照）。
一般的には、微粒子の表面電荷成分は特定の等電点を持つので、上記微細管内ｐＨ勾配により、微粒子はそれぞれの特定箇所である等電点位置に濃縮される。この等電点位置は対象の微粒子の種類により変化する。
この状態になると、両電極７ａ、７ｂ間の泳動電流は定常状態になり、ほとんど流れなくなる。
【００２８】
図２は、検出窓６ａと対物レンズ４との相対距離を変えないで、励起光発光器と対物レンズ４を含む光学系全体を微細管６の検出窓６ａに沿って２６の方向に回転した図として模式的に示しているが、図１に示したようにモータ１０により微細管６を回転してもよい。
このとき、濃縮微粒子２７の存在を、対物レンズ４を通じて蛍光検出器５により検出する。
【００２９】
微細管６内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００３０】
また、上記で例示した一対の電極７ａ、７ｂ及び高圧電源７は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段である。
かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加するその他の手段）を使用することができる。
【００３１】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）製等を任意に例示することができる。
【００３２】
図３は、例えば、ここで検出対象とする微粒子２１として、微生物に適用した場合の微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体、及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光２ｂが発せられるが、濃縮位置が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することは可能である。
【００３３】
図４は、前述した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入３２し、電位勾配を設けることにより微粒子を等電点電気泳動し、微粒子塊（濃縮）３３とする。次に、検出窓６ａを相対的に移動して微粒子塊の探索３４を行い、対物レンズを通じてＣＣＤカメラ等で微粒子検出３５する。以上の過程で対象微粒子を検出する。
【００３４】
図５は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８における微粒子の画像処理表示例を示した図である。
主なキーには、４０開始、４１中止、４２波形、４３画像、４４終了等がある。
開始キー４０をクリックして微粒子の検出動作を開始すると、状態表示４５は検出中となり、経過時間は４６に表示し、コメント欄４７には異常の有無（ここでは正常）をそれぞれ表示する。
検出途中で検出動作を中止する場合は中止キー４１を、検出動作を終了する場合は終了キー４４をクリックする。
【００３５】
図５は画像キー４３をクリックした場合の図であり、波形キー４２をクリックした場合は後述する。
画像キー４３をクリックすると、ＣＣＤカメラの出力画像が画像領域５０に表示される。ここで、５１は微細管の管壁を、その間の画像は泳動溶液部画像５２を示しており、蛍光色素で標識された微粒子を検出すると、例えば、５３のように表示される。
これらの検出画像の輝度、形状、面積、空間的位置、その移動方向等からその検出微粒子５３に固有の番号を付す。この実施例では５個の微粒子を検出した場合を示しており、２１から２５の番号を付した例を示す。
泳動溶液部画像５２において、検出する微粒子の画像輝度やその面積等は、励起光２ａ、蛍光２ｂの強さ、対象とする微粒子の種類により変化する。
そこで、画像処理により検出する画像輝度値のレベル調整は輝度値キー６０の▽（図においては黒塗り。以下、同じ。）をクリックすることにより変更する。また、検出する画像面積の調整は面積キー６１の▽をクリックすることにより変更する。このような画像処理による微粒子検出技術は既存の技術であり容易に実現可能である。
【００３６】
さらに、本実施例では検出した輝度の合計値６２、検出した微粒子の面積の総和６３、検出した微粒子数の瞬時値６４、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６５をそれぞれ表示している。
これにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。また、得られたデータは微粒子検出制御装置８に内蔵するメモリ等の波形制御装置に保存する。
【００３７】
図６は、微粒子検出制御装置８において、波形キー４２をクリックして、微粒子の画像処理に関わる信号波形の表示例を示した図である。
開始キー４０により検出動作を開始すると、そのときの高電圧印加条件に基づき、高電圧が装置に印加される。このとき、横軸は７０の時間における▽をクリックすることにより、例えば、１分、２分等と選択して、１目盛の値を規定することができる。このとき、実際にかかっている高電圧監視値は７１における▽をクリックすることにより、例えば、１ｋＶ、２ｋＶ等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。
このときの泳動電流の監視値は７２における▽をクリックすることにより、例えば、５００μＡ、１ｍＡ等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。このときの画像輝度値は７３における▽をクリックすることにより、例えば、１０、１５、２０、３０等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。
【００３８】
このように、表示するパラメータの単位が各パラメータ毎に相違し、その大きさも目的に応じて変化する。ここでは縦軸の１目盛を明確に示すために、３種類の値、７１ａ、７２ａ、７３ａをそれぞれ並べて表示している。
ここで、７１ａは高電圧に関する目盛を、７２ａは泳動電流に関する目盛を、７３ａは画像輝度値に関する目盛をそれぞれ示している。また、７１ｂは高電圧の波形、７２ｂは泳動電流の波形、７３ｂは画像輝度の波形のそれぞれ時間経過を示している。
【００３９】
経過時間が１０分を越えた場合、本実施例の場合は横軸の１目盤を１分としたため、すべてを表示できないので自動的にスクロールする。
このとき、スクロールバー８０をドラッグ又は記号８１、８２をクリックすることにより、所望の時間波形を表示することができる。
８３は縦軸のスクロールバーで、ドラッグすることにより、縦軸の表示位置、すなわち波形の表示位置を変更することができる。又は記号８４、８５をクリックしても同機能を使用することができる。
【００４０】
図７は、図６において、７２により泳動電流の１目盛の値を５００μＡから２００μＡに変更、すなわち波形拡大し、７３により画像輝度の１目盤を３０から１５に変更、すなわち波形拡大し、さらに縦軸のスクロールバー８３を上方向にドラッグした場合の波形を示している。
泳動電流の波形７２ｄが上下に拡大表示し、画像輝度の波形７３ｄが上下に拡大表示している。また、スクロールバー８３により波形全体を上方向にドラッグしたので、縦軸の値は変化し、７１ｃ、７２ｃ、７３ｃのように変化する。ただし、１目盛の値は変更した泳動電流７２ｃと画像輝度７３ｃのみが変化している。
泳動電流波形７２ｂは拡大されて７２ｄとなり、画像輝度７３ｂは拡大されて７３ｄとなり、高電圧波形７１ｂはそのままスクロールし、７１ｄとなる。本実施例の場合は約８分の経過時間において、微粒子の画像輝度が最大ピークを示していることが判る。
【００４１】
このように、縦軸の１目盛の値を各パラメータ毎に独立して変更することが可能であると同時に、その表示位置を上下方向にスクロールすることにより、興味のある泳動パラメータを拡大、又は縮小して表示することが自由に可能となる。
また、高電圧、泳動電流、画像輝度等複数の波形を一度に表示するので、観察者の混乱を避けるため、その波形、目盛の値、文字等をそれぞれ別の色分け表示するとよい。
【００４２】
次に、図８に、本発明の微粒子検出装置の他の実施例を示す。
この微粒子検出装置は、微細管１３を略直線状に形成し、モータ１０の回転により、微細管１３、その検出窓１３ａ、及び溶液９ａ、９ｂ等を一体としてピニオン１４とラック１５の組み合わせにより直線方向に移動させ、対物レンズ４と検出窓１３ａとの相対距離を一定に保ちながら、蛍光検出器５を相対的に走査させながら対象微粒子を検出しようとするものである。
すなわち、図１における、円形状の微細管６の回転移動を、この図８では、直管状の微細管１３の直線移動に変更した点が異なり、それ以外の機能効果は以下全く同様であるので、その詳細は省略する。
【００４３】
図９は、微細管１３に取り付けたラック１５とピニオン１４の関係を示した模式図であり、モータ１０を回転すると、ピニオン１４が回転し、それにかみ合っているラック１５、すなわち微細管１３が直線移動する。
なお、図８及び図９では、微細管１３をモータ１０により移動する実施例を示したが、微細管１３を固定し、励起光発光器２と対物レンズ４を含む微粒子検出装置１全体を図示しない方法で走査方向に移動してもよい。
すなわち、励起光発光器２と対物レンズ４を含む光学系全体と微細管１３の検出窓１３ａとの相対距離を一定に保ち、対物レンズを相対的に移動しながら走査することにより、蛍光検出器５により対象微粒子を検出することができる。
なお、その機能及び作用効果は同様であるので、その詳細説明は省略する。
【００４４】
通常、微生物等の微粒子の検出に要する時間は数分から数十分と長時間に亘ることから、画像信号記録装置５ａは多くの画像信号を記録できるＤＶＤデッキ等とすることが望ましい。 また、微粒子検出制御装置８としては通常のパソコンで十分機能が発揮できるが、検出期間すべての画像の記録は困難なので、対象微粒子を検出した前後の画像のみを記録する、又は画像の記録は画像信号記録装置５ａ専用とし、微粒子検出制御装置８には本実施例で示したような画像処理結果、すなわち、対象微粒子に対する画像輝度、微粒子の数、その大きさ等、及び電気泳動のパラメータ等のみに限定してもよい。
【００４５】
また、微細管内にｐＨ勾配を設けることにより、微粒子を濃縮する方法の代りに、泳動領域で微細管内に電位勾配を発生させ、この電位勾配により微細管内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陽極から陰極方向への流れとなる。
微細管内に注入された微粒子は、上記発生した電位勾配に応答して、微粒子が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。
結果として、微細管内での微粒子の泳動方向（陰極から陽極方向）及び速度は、上記電気浸透流速度と微粒子の移動度によって決まり、微細管の反対端の近く（陽極の近く）に濃縮する方式で微粒子を検出する方法等、適宜その方式を変更することができる。
【００４６】
また、微細管内で濃縮分離された微粒子を検出する手段としては、一般的には、分光学的、電気化学的、重量検出的方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。
中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、ＬＥＤで光量が不足の場合は、より高感度検出が可能なレーザー励起検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、免疫反応（抗原抗体反応）、細胞内酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応等の反応を目的微粒子に応じて適宜組み合わせることで、目的微粒子をより特異的かつ高感度に検出することができる。
これらの方法の中でも免疫反応は、微粒子試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微粒子を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００４７】
かくして、本実施例の微粒子検出装置によれば、検体試料中の微粒子を短時間でかつ精度よく分離、検出、定量化することができる。すなわち、微粒子の菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。また、対象とする微粒子に対して選択的に結合するように蛍光染色するので、特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間にかつ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微粒子検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。
また、画像処理技術を用いて微粒子を検出することにより、その画像処理結果、及び微粒子検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。したがって、その保存データを呼び出すことにより、検出結果の再確認、検体溶液供給者への詳細結果報告が可能となる。また、迅速な微粒子対策、滅菌対策等に寄与することが可能となる。
また、励起光発光器２における励起光源として、安価なＬＥＤ又はレーザー発光器等を利用することにより、所望の微粒子を高感度かつ特異的に検出することができるので、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微粒子を精度よく分離検出することができる。
また、本実施例の微粒子検出装置は、定量性を有するため、試料中に存在する微生物等の菌体数を判別測定（定量検出）することも可能であり、また、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
このように、本実施例の微粒子検出装置は、有害微生物等の微粒子の検出（定性検出、定量検出）に適しているため、病原性微粒生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００４８】
以上、本発明の微粒子検出装置について、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において他の実施例を挙げることができる。
例えば、図６及び図７における波形の１つとして、画像輝度値を示したが、これに限定されるものではなく、検出した微粒子の（画像）面積、微粒子数の瞬時値、検出した微粒子の総和等を自由に選択、変更可能であることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、浴槽水やプール、冷却塔の冷却水等の環境水、食品及び医療分野等において採取した検体試料中に混在する有害微粒子である微生物、例えば、レジオネラ属菌等の有害菌を精度よく検出する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】微細管電気泳動による微粒子の検出過程を示す説明図である。
【図３】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図４】微粒子を検出する動作フロー図である。
【図５】微粒子検出制御装置における画像処理状況を表示した画面図である。
【図６】微粒子検出制御装置における波形状況を表示した画面図である。
【図７】微粒子検出制御装置における他の波形状況を表示した画面図である。
【図８】本発明の微粒子検出装置の他の実施例を示す概略構成図である。
【図９】同実施例のラックとピニオンを示す平面図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ 微粒子検出装置本体
２ 励起光発光器
２ａ 励起光
２ｂ 蛍光
４ 対物レンズ
５ 蛍光検出器
５ａ 画像信号記録装置
６ 微細管
６ａ 検出窓
７ａ 電極
７ｂ 電極
７ 高圧電源
８ 微粒子検出制御装置
９ａ 溶液
９ｂ 溶液
１０ モータ
１１ アーム
１２ 中心
１３ 微細管
１４ ピニオン
１５ ラック
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２１ａ 微粒子の外壁
２７ 濃縮微粒子
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
３２ 検体溶液の注入
３３ 電気泳動（濃縮）
３４ 電気泳動（微粒子塊の探索）
３５ 微粒子検出
４０ 開始キー
４１ 中止キー
４２ 波形キー
４３ 画像キー
４４ 終了キー
４５ 状態表示
４６ 経過時間
４７ コメント欄
５０ 画像域
５１ 微細管の管壁
５２ 泳動溶液部画像
５３ 微粒子の検出画像
６０ 輝度値調整キー
６１ 面積調整キー
６２ 輝度合計値
６３ 微粒子の面積総和
６４ 微粒子数の瞬時値
６５ 微粒子の総和
７０ 時間
７１ 高電圧監視値
７１ａ 高電圧目盛
７１ｂ 高電圧の波形
７１ｃ 高電圧目盤
７１ｄ 高電圧の波形
７２ 泳動電流
７２ａ 泳動電流目盛
７２ｂ 泳動電流波形
７２ｃ 泳動電流目盛
７２ｄ 泳動電流波形
７３ 画像輝度値
７３ａ 画像輝度値目盛
７３ｂ 画像輝度値波形
７３ｃ 画像輝度値目盤
７３ｄ 画像輝度値波形
８０ スクロールバー
８１ 記号
８２ 記号
８３ 縦軸のスクロールバー
８４ 記号
８５ 記号
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細管電気泳動を用いて、検体試料中に存在する細胞等の各種微粒子を検出する微粒子検出装置に関し、特に人体に有害なレジオネラ属菌等の微生物を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料中に細胞等の各種微粒子が存在するか否かを調べたり、また試料中に含まれる微生物の種類や量を迅速に調べるための分離・検出手法として、微細管内で予め蛍光染色した微生物を電気泳動させ、励起光を照射してその時発生する蛍光から検出する電気泳動技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
また、微細管等電点電気泳動技術により微生物等の微粒子細胞をそれが持つ等電点のｐＨ領域に濃縮する技術に関する論文はあるが、その具体的検出手段の詳細は記述されていない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、微細管内で微生物を泳動分離する際には、微生物細胞と細管内壁、あるいは細胞と細胞との相互作用が大きいため、迅速かつ高感度に微細管内で微生物を分離するために、泳動液にアルギン酸塩を含有させることが有効であることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
この方法において、微生物の分離効率を向上させる添加剤として用いられるアルギン酸塩は、すべての微生物に対して同様に機能するものではなく、多種多様な微生物種に対応できるより多くのタイプの分離効率向上剤の導入が期待されている。
【０００６】
環境水や食品汚染及び感染症疾患に対して迅速に適切な処置を施したり、その汚染源や感染源を迅速に突きとめ対処したりするためには、汚染源や感染源となり得る微生物の迅速でかつ特異的な検出方法が要請されている。
【特許文献１】特開２００２−３４５４５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１７８１号公報
【非特許文献１】微細管電気泳動法による微生物の分離検出法（月刊フードケミカル２００５−２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、微生物等の各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出することができる微粒子検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の微粒子検出装置は、微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器の検出信号から検出するようにしたことを特徴とする。
【０００９】
この場合において、蛍光検出器により検出した信号を画像信号として記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えることができる。
【００１０】
また、微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることができる。
【００１１】
また、表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えることができる。
【００１２】
また、印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵することができる。
【００１３】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微粒子検出装置によれば、微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器の検出信号から検出することから、特殊な技術を必要とすることなく、試料中に種々含まれる微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離するとともに、目的の微粒子を予め蛍光染色することにより、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出し、一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子を検出することができ、さらに、試料中に混在する微粒子の検出器としてＣＣＤ画像センサ等を用いることにより、単に信号検出できるだけでなく、得られた画像信号から定量的に検出することができる。
【００１５】
また、蛍光検出器により検出した画像信号を記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えることにより、その画像処理結果、又は微粒子検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。
【００１６】
また、微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数とすることにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。
【００１７】
また、表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えることにより、微粒子検出の自動制御を集約して行うことができる。
【００１８】
また、印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵することにより、時間経過とともに長くなる波形記録を見やすい画面で表示することができる。
【００１９】
また、検出対象物である微粒子が微生物、例えば、レジオネラ属菌等の人体に有害な微生物とすることにより、微生物、例えば、温泉やプール等で生息し易いレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の微粒子検出装置の実施の形態を、図面に基づいて説明する。
【００２１】
本発明の微粒子検出装置は、泳動液を用いた微細管電気泳動法を利用することにより、試料中に種々含まれる微粒子を高い分離能をもってかつ再現性よく分離する。
また、この微細管電気泳動法において、検出手段として蛍光検出器を利用することにより、目的の微粒子を予め蛍光染色することによって、微量の微粒子であっても培養等の増殖処理することなく高感度に検出できること、また、これによりさらに一層高い分離能でもって精度よく所望の微粒子が検出することができる。
さらに、試料中に混在する微粒子が単に検出できるだけでなく、画像処理を行うことにより定量的に検出することができる。
なお、本発明でいう検出とは、試料中に含まれる所望微粒子の濃縮、他との分離、定性的検出、定量的検出、スクリーニング、生死判別等を包含するものである。
【００２２】
具体的には、例えば、下記の一部又は全部を構成要件として備えた微粒子検出装置である。
（１）微粒子を含む試料を、泳動液を用いて微細管電気泳動する。
（２）微粒子を含む試料を微粒子に選択的に結合するように蛍光染色し、これを微細管電気泳動に供して、蛍光染色された微粒子を蛍光検出する。
（３）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、泳動液を含む水槽、泳動液に注入された微粒子を濃縮分離する微細管、及び濃縮された微粒子を検出するための検出手段を備えている。
（４）微細管電気泳動を用いて微粒子を検出する装置であって、微細管内に設けた電圧勾配により微粒子を濃縮する。
（５）検出手段として蛍光検出器を備えており、蛍光染色した微粒子に励起光照射し、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出し、蛍光検出した検出信号から微粒子を検出する。
（６）また、光学系で蛍光検出した信号を画像信号とし、画像信号を記録する画像信号記録装置、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置を有する。
（７）さらには、微粒子検出信号は、画像の輝度、規定した輝度以上の信号を有する画像の面積、画像を空間的、時間的に特徴付けて検出した微粒子の数等とする。
（８）微粒子検出制御装置には、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能、微粒子検出信号記録機能等を有するとともに、微細管内電流、微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵する。
【実施例１】
【００２３】
図１に、本発明の微細管電気泳動システムの基本的構成を一例として示す。
図１において、１は微粒子検出装置本体であり、ダイオード等の励起光発光器２、対物レンズ４、例えば、ＣＣＤカメラや光電管等の蛍光検出器５等から構成されている。
検出対象物である有害菌等の微粒子、例えば、大腸菌等の人体に有害な微生物は、予め微生物とのみ選択的に結合するように蛍光染色しておき、例えば、キャピラリー等の微細管６の内部に、その両端に設置した溶液９ａ又は９ｂより注入する。
溶液９ａ又は溶液９ｂは検出の段階に応じて変更し、電極７ａ、７ｂにより微細管６の両端に高圧電源を印加する。高電圧は高圧電源７より供給し、その電圧の大きさ、印加時間等は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８より制御する。
【００２４】
２ａは励起光発光器２から発した励起光であり、微細管６の検出窓６ａより、蛍光染色された微粒子に照射される。
蛍光染色された微粒子は励起光により蛍光２ｂを発光し、対物レンズ４より装置本体内に入射し、例えば、ＣＣＤカメラ等で構成される蛍光検出器５に結像され、検出される。
蛍光検出器５により検出した検出画像信号は、画像信号記録装置５ａに記録するとともに、微粒子検出制御装置８に接続される。微粒子検出制御装置８では、この画像信号から微粒子の検出を行い、その結果を記録、表示する。
【００２５】
蛍光染色された微粒子は、例えば、等電点電気泳動等既知の電気泳動技術（非特許文献１）により、検出窓６ａ内に濃縮される。
この濃縮された微粒子を検出するために、アーム１１に固定した微細管６を略円形状に形成し、略円形状に形成した微細管６の中心、すなわちアーム１１の中心１２にモータ１０を接続する。
モータ１０によりアーム１１を回転し、微細管６、検出窓６ａ及び溶液９ａ、９ｂ等を一体として１２を中心に回転させ、対物レンズ４と検出窓６ａとの距離を一定に保ち、検出窓６ａの端から端までを相対的に移動しながら走査する。この走査過程において、微粒子の検出動作を行う。
なお、この実施例では、モータ１０により微細管６を回転させたが、微細管６を固定し、励起光発光器２と微粒子検出装置１を含む光学系全体にモータを取り付け、例えば、１２を中心とする円の軌跡で回転させてもよい。
すなわち、励起光発光器２と対物レンズ４を含む光学系全体、と検出窓６ａの少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、検出窓６ａの端から端までを走査することにより、全く同様にこの走査過程において、微粒子の検出動作を行うことができる。
【００２６】
図２は、微細管６内における有害菌の泳動状況を示したものであり、次に示す検出過程を踏む。検出対象としての微粒子２１を含む試料である検水溶液を、例えば、溶液９ａとして準備し、溶液９ｂの側から吸引することにより、微細管６内に対象とする検水溶液２０として注入する。
次に、溶液９ａ、９ｂとして酸性、アルカリ性の溶液を用い、電極７ａ、７ｂをそれぞれ高圧電源７に接続し、微粒子検出制御装置８により、電極７ａ、電極７ｂに高電圧を印加するように接続する。次いで高圧電源７を作動すると、微細管６内の検水溶液２０に電位勾配が発生し、その結果、微細管内の泳動領域内の液全体は等電点現象により陰極方向と陽極方向の間にｐＨ勾配を発生する。
【００２７】
この既知の微細管等電点電気泳動技術により、検水溶液２０内に存在し得る微粒子は、微粒子細胞が有する等電点と同じｐＨ条件の領域（等電点位置）に濃縮することができる（例えば、非特許文献１等参照）。
一般的には、微粒子の表面電荷成分は特定の等電点を持つので、上記微細管内ｐＨ勾配により、微粒子はそれぞれの特定箇所である等電点位置に濃縮される。この等電点位置は対象の微粒子の種類により変化する。
この状態になると、両電極７ａ、７ｂ間の泳動電流は定常状態になり、ほとんど流れなくなる。
【００２８】
図２は、検出窓６ａと対物レンズ４との相対距離を変えないで、励起光発光器と対物レンズ４を含む光学系全体を微細管６の検出窓６ａに沿って２６の方向に回転した図として模式的に示しているが、図１に示したようにモータ１０により微細管６を回転してもよい。
このとき、濃縮微粒子２７の存在を、対物レンズ４を通じて蛍光検出器５により検出する。
【００２９】
微細管６内への検体試料の注入方法は、特に制限されず、従来使用される重力法、加圧法及び減圧法のいずれをも使用することができる。注入量も特に制限されないが、通常用いる微細管全域に試料を満たすため、その微細管のサイズに依存し、０．１〜１００μＬ、好ましくは０．５〜１００μＬ、より好ましくは０．５〜１０μＬを例示することができる。
【００３０】
また、上記で例示した一対の電極７ａ、７ｂ及び高圧電源７は、微細管内に注入された微粒子が微細管内の泳動液中を泳動するのに必要な強さの電位勾配を、微細管中の泳動液に対して印加するための手段である。
かかる目的が達成できるものであれば、これらのもの（電源及び一対の電極）に何ら限定されることなく任意の手段（電位勾配を印加するその他の手段）を使用することができる。
【００３１】
電極間にかけられる電圧としては、微細管長さに対して、一般に約１ｋＶ／ｍ〜約５００ｋＶ／ｍ、好ましくは約２ｋＶ／ｍ〜約１００ｋＶ／ｍ、より好ましくは約５ｋＶ／ｍ〜約２０ｋＶ／ｍを挙げることができる。
微細管としては、内径１〜１５０μｍ、長さ０．１〜１００ｃｍ、好ましくは内径２０〜１００μｍ、長さ１〜５０ｃｍの中空管を挙げることができる。その材質としては特に制限されず、ガラス（フューズドシリカ）製等を任意に例示することができる。
【００３２】
図３は、例えば、ここで検出対象とする微粒子２１として、微生物に適用した場合の微生物を拡大して示したもので、その外壁２１ａに選択的に結合する抗体３０、抗体３０を蛍光標識した蛍光色素３１等を示している。
なお、図示しないが、検出対象である微粒子２１に結合している抗体、及び蛍光色素３１以外に、微粒子に結合しないままに溶液中を浮遊している抗体及び蛍光色素からも蛍光２ｂが発せられるが、濃縮位置が検出対象微粒子とは異なるので、時間経過を見ることにより分離することは可能である。
【００３３】
図４は、前述した対象微粒子の検出過程をフロー図で示したものである。
まず、検体溶液を微細管に注入３２し、電位勾配を設けることにより微粒子を等電点電気泳動し、微粒子塊（濃縮）３３とする。次に、検出窓６ａを相対的に移動して微粒子塊の探索３４を行い、対物レンズを通じてＣＣＤカメラ等で微粒子検出３５する。以上の過程で対象微粒子を検出する。
【００３４】
図５は、例えば、パソコン等の微粒子検出制御装置８における微粒子の画像処理表示例を示した図である。
主なキーには、４０開始、４１中止、４２波形、４３画像、４４終了等がある。
開始キー４０をクリックして微粒子の検出動作を開始すると、状態表示４５は検出中となり、経過時間は４６に表示し、コメント欄４７には異常の有無（ここでは正常）をそれぞれ表示する。
検出途中で検出動作を中止する場合は中止キー４１を、検出動作を終了する場合は終了キー４４をクリックする。
【００３５】
図５は画像キー４３をクリックした場合の図であり、波形キー４２をクリックした場合は後述する。
画像キー４３をクリックすると、ＣＣＤカメラの出力画像が画像領域５０に表示される。ここで、５１は微細管の管壁を、その間の画像は泳動溶液部画像５２を示しており、蛍光色素で標識された微粒子を検出すると、例えば、５３のように表示される。
これらの検出画像の輝度、形状、面積、空間的位置、その移動方向等からその検出微粒子５３に固有の番号を付す。この実施例では５個の微粒子を検出した場合を示しており、２１から２５の番号を付した例を示す。
泳動溶液部画像５２において、検出する微粒子の画像輝度やその面積等は、励起光２ａ、蛍光２ｂの強さ、対象とする微粒子の種類により変化する。
そこで、画像処理により検出する画像輝度値のレベル調整は輝度値キー６０の▽（図においては黒塗り。以下、同じ。）をクリックすることにより変更する。また、検出する画像面積の調整は面積キー６１の▽をクリックすることにより変更する。このような画像処理による微粒子検出技術は既存の技術であり容易に実現可能である。
【００３６】
さらに、本実施例では検出した輝度の合計値６２、検出した微粒子の面積の総和６３、検出した微粒子数の瞬時値６４、及び検出動作開始後に検出した微粒子の総和６５をそれぞれ表示している。
これにより、画像処理が正常に動作していることの確認ができる。また、得られたデータは微粒子検出制御装置８に内蔵するメモリ等の波形制御装置に保存する。
【００３７】
図６は、微粒子検出制御装置８において、波形キー４２をクリックして、微粒子の画像処理に関わる信号波形の表示例を示した図である。
開始キー４０により検出動作を開始すると、そのときの高電圧印加条件に基づき、高電圧が装置に印加される。このとき、横軸は７０の時間における▽をクリックすることにより、例えば、１分、２分等と選択して、１目盛の値を規定することができる。このとき、実際にかかっている高電圧監視値は７１における▽をクリックすることにより、例えば、１ｋＶ、２ｋＶ等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。
このときの泳動電流の監視値は７２における▽をクリックすることにより、例えば、５００μＡ、１ｍＡ等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。このときの画像輝度値は７３における▽をクリックすることにより、例えば、１０、１５、２０、３０等と選択して、縦軸の１目盛の値を規定することができる。
【００３８】
このように、表示するパラメータの単位が各パラメータ毎に相違し、その大きさも目的に応じて変化する。ここでは縦軸の１目盛を明確に示すために、３種類の値、７１ａ、７２ａ、７３ａをそれぞれ並べて表示している。
ここで、７１ａは高電圧に関する目盛を、７２ａは泳動電流に関する目盛を、７３ａは画像輝度値に関する目盛をそれぞれ示している。また、７１ｂは高電圧の波形、７２ｂは泳動電流の波形、７３ｂは画像輝度の波形のそれぞれ時間経過を示している。
【００３９】
経過時間が１０分を越えた場合、本実施例の場合は横軸の１目盤を１分としたため、すべてを表示できないので自動的にスクロールする。
このとき、スクロールバー８０をドラッグ又は記号８１、８２をクリックすることにより、所望の時間波形を表示することができる。
８３は縦軸のスクロールバーで、ドラッグすることにより、縦軸の表示位置、すなわち波形の表示位置を変更することができる。又は記号８４、８５をクリックしても同機能を使用することができる。
【００４０】
図７は、図６において、７２により泳動電流の１目盛の値を５００μＡから２００μＡに変更、すなわち波形拡大し、７３により画像輝度の１目盤を３０から１５に変更、すなわち波形拡大し、さらに縦軸のスクロールバー８３を上方向にドラッグした場合の波形を示している。
泳動電流の波形７２ｄが上下に拡大表示し、画像輝度の波形７３ｄが上下に拡大表示している。また、スクロールバー８３により波形全体を上方向にドラッグしたので、縦軸の値は変化し、７１ｃ、７２ｃ、７３ｃのように変化する。ただし、１目盛の値は変更した泳動電流７２ｃと画像輝度７３ｃのみが変化している。
泳動電流波形７２ｂは拡大されて７２ｄとなり、画像輝度７３ｂは拡大されて７３ｄとなり、高電圧波形７１ｂはそのままスクロールし、７１ｄとなる。本実施例の場合は約８分の経過時間において、微粒子の画像輝度が最大ピークを示していることが判る。
【００４１】
このように、縦軸の１目盛の値を各パラメータ毎に独立して変更することが可能であると同時に、その表示位置を上下方向にスクロールすることにより、興味のある泳動パラメータを拡大、又は縮小して表示することが自由に可能となる。
また、高電圧、泳動電流、画像輝度等複数の波形を一度に表示するので、観察者の混乱を避けるため、その波形、目盛の値、文字等をそれぞれ別の色分け表示するとよい。
【００４２】
次に、図８に、本発明の微粒子検出装置の他の実施例を示す。
この微粒子検出装置は、微細管１３を略直線状に形成し、モータ１０の回転により、微細管１３、その検出窓１３ａ、及び溶液９ａ、９ｂ等を一体としてピニオン１４とラック１５の組み合わせにより直線方向に移動させ、対物レンズ４と検出窓１３ａとの相対距離を一定に保ちながら、蛍光検出器５を相対的に走査させながら対象微粒子を検出しようとするものである。
すなわち、図１における、円形状の微細管６の回転移動を、この図８では、直管状の微細管１３の直線移動に変更した点が異なり、それ以外の機能効果は以下全く同様であるので、その詳細は省略する。
【００４３】
図９は、微細管１３に取り付けたラック１５とピニオン１４の関係を示した模式図であり、モータ１０を回転すると、ピニオン１４が回転し、それにかみ合っているラック１５、すなわち微細管１３が直線移動する。
なお、図８及び図９では、微細管１３をモータ１０により移動する実施例を示したが、微細管１３を固定し、励起光発光器２と対物レンズ４を含む微粒子検出装置１全体を図示しない方法で走査方向に移動してもよい。
すなわち、励起光発光器２と対物レンズ４を含む光学系全体と微細管１３の検出窓１３ａとの相対距離を一定に保ち、対物レンズを相対的に移動しながら走査することにより、蛍光検出器５により対象微粒子を検出することができる。
なお、その機能及び作用効果は同様であるので、その詳細説明は省略する。
【００４４】
通常、微生物等の微粒子の検出に要する時間は数分から数十分と長時間に亘ることから、画像信号記録装置５ａは多くの画像信号を記録できるＤＶＤデッキ等とすることが望ましい。 また、微粒子検出制御装置８としては通常のパソコンで十分機能が発揮できるが、検出期間すべての画像の記録は困難なので、対象微粒子を検出した前後の画像のみを記録する、又は画像の記録は画像信号記録装置５ａ専用とし、微粒子検出制御装置８には本実施例で示したような画像処理結果、すなわち、対象微粒子に対する画像輝度、微粒子の数、その大きさ等、及び電気泳動のパラメータ等のみに限定してもよい。
【００４５】
また、微細管内にｐＨ勾配を設けることにより、微粒子を濃縮する方法の代りに、泳動領域で微細管内に電位勾配を発生させ、この電位勾配により微細管内液体全体の流れである電気浸透流が生じ、通常それは陽極から陰極方向への流れとなる。
微細管内に注入された微粒子は、上記発生した電位勾配に応答して、微粒子が有する表面電荷とは反対の極性を有する電極方向へ移動する。
結果として、微細管内での微粒子の泳動方向（陰極から陽極方向）及び速度は、上記電気浸透流速度と微粒子の移動度によって決まり、微細管の反対端の近く（陽極の近く）に濃縮する方式で微粒子を検出する方法等、適宜その方式を変更することができる。
【００４６】
また、微細管内で濃縮分離された微粒子を検出する手段としては、一般的には、分光学的、電気化学的、重量検出的方法のいずれもが使用できるが、好ましくはＵＶ−可視検出、蛍光検出、発光検出、光散乱検出等の光学検出法が挙げられる。
中でも検出の特異性と感度に優れた蛍光検出法が好ましく、ＬＥＤで光量が不足の場合は、より高感度検出が可能なレーザー励起検出法が望ましい。これらの蛍光に基づく検出は、免疫反応（抗原抗体反応）、細胞内酵素反応、及び核酸相補鎖形成反応等の反応を目的微粒子に応じて適宜組み合わせることで、目的微粒子をより特異的かつ高感度に検出することができる。
これらの方法の中でも免疫反応は、微粒子試料に特別な前処理をする必要がなく、また特異性に優れている点で、好ましい方法の１つである。かかる免疫反応としては、具体的には蛍光色素標識抗体（単に蛍光抗体ともいう）、酵素標識抗体（単に酵素抗体ともいう）等を用いて目的の微粒子を蛍光や酵素等で標識する方法を挙げることができる。
【００４７】
かくして、本実施例の微粒子検出装置によれば、検体試料中の微粒子を短時間でかつ精度よく分離、検出、定量化することができる。すなわち、微粒子の菌種・菌株を個々に分離することが可能となる。また、対象とする微粒子に対して選択的に結合するように蛍光染色するので、特殊な技術を必要とすることなく、また培養操作なしに短時間にかつ容易にまた正確に検出できるため、高い精度の微粒子検査とモニタリングシステムの確立が可能となる。
また、画像処理技術を用いて微粒子を検出することにより、その画像処理結果、及び微粒子検出画像をパソコン等のメモリに保存、記録することができる。したがって、その保存データを呼び出すことにより、検出結果の再確認、検体溶液供給者への詳細結果報告が可能となる。また、迅速な微粒子対策、滅菌対策等に寄与することが可能となる。
また、励起光発光器２における励起光源として、安価なＬＥＤ又はレーザー発光器等を利用することにより、所望の微粒子を高感度かつ特異的に検出することができるので、試料を培養する等の増殖処理を施すことなく、微量の微粒子を精度よく分離検出することができる。
また、本実施例の微粒子検出装置は、定量性を有するため、試料中に存在する微生物等の菌体数を判別測定（定量検出）することも可能であり、また、試料中の微生物の検出が可能であるだけでなく、種々の微生物に特有の特異的検出試薬（例えば、抗体等）を使用することにより菌種の同定も可能である。
このように、本実施例の微粒子検出装置は、有害微生物等の微粒子の検出（定性検出、定量検出）に適しているため、病原性微粒生物によって汚染された環境水や食品が早期に排除でき、病気の発生の防止に有用である。また、病原性微生物による患者の早期診断が可能になることから、有害微生物による被害の蔓延防止並びに早期治療の一助となる。さらには、食品の品質管理期間が短縮でき、また衛生管理の厳格性から賞味期間も延長可能であり、食品流通の経済性に大きく貢献することができる効果がある。
【００４８】
以上、本発明の微粒子検出装置について、その実施例に基づいて説明したが、本発明は上記実施例に記載した構成に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において他の実施例を挙げることができる。
例えば、図６及び図７における波形の１つとして、画像輝度値を示したが、これに限定されるものではなく、検出した微粒子の（画像）面積、微粒子数の瞬時値、検出した微粒子の総和等を自由に選択、変更可能であることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の微粒子検出装置は、各種微粒子を迅速かつ高感度に分離検出するという特性を有していることから、例えば、浴槽水やプール、冷却塔の冷却水等の環境水、食品及び医療分野等において採取した検体試料中に混在する有害微粒子である微生物、例えば、レジオネラ属菌等の有害菌を精度よく検出する用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の微粒子検出装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】微細管電気泳動による微粒子の検出過程を示す説明図である。
【図３】微粒子の詳細を示す拡大図である。
【図４】微粒子を検出する動作フロー図である。
【図５】微粒子検出制御装置における画像処理状況を表示した画面図である。
【図６】微粒子検出制御装置における波形状況を表示した画面図である。
【図７】微粒子検出制御装置における他の波形状況を表示した画面図である。
【図８】本発明の微粒子検出装置の他の実施例を示す概略構成図である。
【図９】同実施例のラックとピニオンを示す平面図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ 微粒子検出装置本体
２ 励起光発光器
２ａ 励起光
２ｂ 蛍光
４ 対物レンズ
５ 蛍光検出器
５ａ 画像信号記録装置
６ 微細管
６ａ 検出窓
７ａ 電極
７ｂ 電極
７ 高圧電源
８ 微粒子検出制御装置
９ａ 溶液
９ｂ 溶液
１０ モータ
１１ アーム
１２ 中心
１３ 微細管
１４ ピニオン
１５ ラック
２０ 検水溶液
２１ 微粒子
２１ａ 微粒子の外壁
２７ 濃縮微粒子
３０ 抗体
３１ 蛍光色素
３２ 検体溶液の注入
３３ 電気泳動（濃縮）
３４ 電気泳動（微粒子塊の探索）
３５ 微粒子検出
４０ 開始キー
４１ 中止キー
４２ 波形キー
４３ 画像キー
４４ 終了キー
４５ 状態表示
４６ 経過時間
４７ コメント欄
５０ 画像域
５１ 微細管の管壁
５２ 泳動溶液部画像
５３ 微粒子の検出画像
６０ 輝度値調整キー
６１ 面積調整キー
６２ 輝度合計値
６３ 微粒子の面積総和
６４ 微粒子数の瞬時値
６５ 微粒子の総和
７０ 時間
７１ 高電圧監視値
７１ａ 高電圧目盛
７１ｂ 高電圧の波形
７１ｃ 高電圧目盤
７１ｄ 高電圧の波形
７２ 泳動電流
７２ａ 泳動電流目盛
７２ｂ 泳動電流波形
７２ｃ 泳動電流目盛
７２ｄ 泳動電流波形
７３ 画像輝度値
７３ａ 画像輝度値目盛
７３ｂ 画像輝度値波形
７３ｃ 画像輝度値目盤
７３ｄ 画像輝度値波形
８０ スクロールバー
８１ 記号
８２ 記号
８３ 縦軸のスクロールバー
８４ 記号
８５ 記号
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器から検出するようにしたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器により検出した信号を画像信号として記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数としたことを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子検出装置。
【請求項４】
表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えたことを特徴とする請求項１、２又は３記載の微粒子検出装置。
【請求項５】
印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵したことを特徴とする請求項１、２、３、又は４記載の微粒子検出装置。
【請求項６】
微粒子が微生物であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の微粒子検出装置。
【請求項７】
微生物がレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物であることを特徴とする請求項６記載の微粒子検出装置。
【請求項１】
微粒子を含む試料を泳動液を用いて微細管電気泳動することにより、微粒子を検出する微粒子検出装置において、選択的に結合するように蛍光染色した微粒子に励起照射する励起光発光器と、蛍光染色された微粒子から発光された蛍光を光学系を用いて蛍光検出する蛍光検出器とを備えるとともに、励起光発光器と蛍光検出器とを含む光学系又は微細管の少なくとも一方を走査方向に移動可能となし、微細管内に濃縮された微粒子を、相対的に移動しながら走査する蛍光検出器から検出するようにしたことを特徴とする微粒子検出装置。
【請求項２】
蛍光検出器により検出した信号を画像信号として記録する画像信号記録装置と、画像信号から微粒子を検出した微粒子検出信号を記録する微粒子検出制御装置とを備えたことを特徴とする請求項１記載の微粒子検出装置。
【請求項３】
微粒子検出信号を画像の輝度、画像の面積又は微粒子の数としたことを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子検出装置。
【請求項４】
表示装置を備えるとともに、微細管電気泳動における印加電圧制御機能、微細管を流れる電流監視機能又は微粒子検出信号記録機能を備えたことを特徴とする請求項１、２又は３記載の微粒子検出装置。
【請求項５】
印加電圧信号、微細管内電流信号又は微粒子検出信号等の記録波形を表示するときの大きさを各々独立に可変とする波形制御装置を内蔵したことを特徴とする請求項１、２、３、又は４記載の微粒子検出装置。
【請求項６】
微粒子が微生物であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の微粒子検出装置。
【請求項７】
微生物がレジオネラ属菌等の人体に有害な微生物であることを特徴とする請求項６記載の微粒子検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−９６１５５（Ｐ２００８−９６１５５Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７５４６３（Ｐ２００６−２７５４６３）
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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