心筋前駆細胞の単離方法及び単離用デバイス
【課題】 心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの提供、並びに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス及び心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供。
【解決手段】 中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、及びＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法、及び当該方法を用いるデバイス。
【解決手段】 中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、及びＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法、及び当該方法を用いるデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋前駆細胞の同定に関する。より詳細には心筋前駆細胞を単離する方法、並びに単離する為のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスとしては、末梢血から造血幹細胞を含む単核球細胞分画を体外血液循環下で分離する血液分離装置と、さらに造血幹細胞を単離するための抗ＣＤ３４抗体カラム装着装置とが知られている。このような２段階の幹細胞純化操作で幹細胞が採取されているが、現在のところ血液幹細胞以外では心筋組織になりうる心筋幹細胞も含め生体組織幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスは存在していない。
【０００３】
心臓疾患の再生医療では、心筋幹細胞の選択的採取とそれに続く心筋幹細胞の患部への細胞移植が必要であり、心筋幹細胞を純化・採取するデバイスの開発が強く望まれている。しかしながらこのようなデバイスが存在しなかった理由としては、心筋幹細胞・心筋前駆細胞の分化過程の探索は、主に転写因子などの遺伝子やシグナル分子を心筋発生のマーカーとした場合、細胞膜を破壊して（いわば細胞を殺して）、それらの分子の挙動を検出しなければならかったことが挙げられる。一方、生きたままの細胞を峻別するために細胞の表面抗原発現様式によって心筋幹細胞の分化・成熟度を峻別する方法があるが、現在まで心筋幹細胞・心筋前駆細胞の適切なマーカー、特に表面マーカーがなかったため、表面マーカーによる心筋幹細胞・心筋前駆細胞の同定の研究が進んでいなかった。
【０００４】
中胚葉はＥＳ細胞から分化誘導できる胚葉の中で最も研究されたものの一つであり、中でも心筋細胞は側部中胚葉に由来する細胞系列に含まれる。側部中胚葉に由来する細胞のうちＦｌｋ１陽性（以下、Ｆｌｋ１（＋）とも称す）として特徴付けられる細胞（Ｆｌｋ１（＋）細胞）から血管系細胞（血液細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）へ分化誘導が行われたという報告がある（非特許文献１）。
【０００５】
ヒトの幹細胞ソース（骨髄、臍帯血、ヒトＥＳ細胞株）から、マウスＥＳ細胞と同様なＦｌｋ１＋で分画される中胚葉系前駆細胞の同定は行われていないが、日本において公開されている研究計画書（http://www.tanabe.co.jp/kenkyu/reports/shinsa/es1.pdf）等から、ヒトＥＳ細胞からの同マーカーを使用した中胚葉系分化実験として、近々予定されているものが存在すると推測される。
又、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞にて、未分化状態でＣＤ４４が陽性の細胞を、ＶＥＧＦ存在下、半固形培養にてＦｌｋ１＋血管内皮細胞に分化誘導し得ることが報告されている（非特許文献５）。
【非特許文献１】ヤマシタ ジェイ．（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．）ら，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，２０００年，第４０８巻，第６８０８号，ｐ．９２−９６
【非特許文献２】スーザン シー．（Ｓｕｓａｎ Ｃ．）ら，「セル アドヒージョン アンド コミュニケーション（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１９９５年，第３巻，ｐ．２１７−２３０
【非特許文献３】ノブユキ タカクラ（Ｎｏｂｕｙｕｋｉ Ｔａｋａｋｕｒａ）ら，「ザ ジャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイトケミストリー （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９７年，第４５巻，ｐ．８８３−８９３
【非特許文献４】ナオキ ナカヤマ（Ｎａｏｋｉ Ｎａｋａｙａｍａ）ら，「ジャーナル オブ セル サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，２００３年，第１１６巻，ｐ．２０１５−２０２８
【非特許文献５】ヨアヒム オスワルド（Ｊｏａｃｈｉｍ Ｏｓｗａｌｄ）ら,「ステム セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」，２００４年，第２２巻，ｐ．３７７−３８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの確立及び提供を目的とし、さらに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス並びに心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、表面マーカーの発現様式の検討に、マウスＥＳ細胞を用いた心筋分化過程を選定し、未分化細胞が心筋細胞に分化する過程を経時的に解析できる培養系を用いた。すなわちＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することにより拍動能を有する心筋様細胞に分化誘導し、表面マーカーの発現様式の変化を解析した。
結果、血管系細胞への分化を特徴づける表面マーカーとして報告されているＦｌｋ１が、心筋前駆細胞においても顕著に発現上昇していることが確認された。さらに、Ｆｌｋ１の発現量の増加という特徴に加え、ＥＳ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによってＣＤ４４およびＰＤＧＦＲαにおいてもその発現に顕著な上昇傾向が確認された。これらの知見を得て、本発明者らは、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を効率的に単離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔２〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔３〕少なくとも２種の蛋白質がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである上記〔２〕に記載の方法。
〔４〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαを全て発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔５〕中胚葉細胞が幹細胞由来である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記〔５〕記載の方法。
〔７〕中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、上記〔７〕記載の方法。
〔９〕中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、上記〔７〕記載の方法。
〔１０〕中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
【０００９】
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
〔１２〕ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、上記〔１２〕記載の方法。
〔１４〕Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、上記〔１４〕記載の方法。
〔１６〕ＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程が、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質が抗ＰＤＧＦＲα抗体である、上記〔１６〕記載の方法。
〔１８〕上記〔１１〕記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
〔１９〕心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）上記〔１１〕記載の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程
を含む方法。
〔２０〕工程(ｉ)における心筋前駆細胞の被検物質の存在下あるいは非存在下での培養を、ストローマ細胞の共存下で実施することを特徴とする、上記〔１９〕記載の方法。
【００１０】
〔２１〕幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
〔２２〕幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
〔２３〕少なくとも２種がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである上記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕工程（ｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現状況を測定し、工程（ｉｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子として認定する、上記〔２１〕記載の方法。
〔２５〕幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記〔２１〕又は〔２２〕記載の方法。
〔２６〕（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段のうち、少なくとも２つの手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
〔２７〕少なくとも２つの手段が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及びＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段である、上記〔２６〕記載のデバイス。
〔２８〕（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
〔２９〕ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕または〔２８〕記載のデバイス。
〔３０〕Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕〜〔２８〕のいずれかに記載のデバイス。
【００１１】
〔３１〕ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕〜〔２８〕のいずれかに記載のデバイス。
〔３２〕中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記〔２６〕〜〔３１〕のいずれかに記載のデバイス。
〔３３〕上記〔２６〕〜〔３２〕のいずれかに記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
〔３４〕心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、上記〔３３〕記載のデバイス。
〔３５〕心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである上記〔３４〕記載のデバイス。
〔３６〕移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、上記〔３５〕記載のデバイス。
〔３７〕移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、上記〔３５〕記載のデバイス。
【発明の効果】
【００１２】
心筋前駆細胞特異的な表面マーカーを用いる本発明の方法あるいはデバイスは、治療現場において、中胚葉系組織より細胞ソースを単離し迅速に心筋前駆細胞を純化・採取することを可能とする。従って、移植細胞の培養、培養にかかるコスト、培養による他の細胞への分化誘導などの懸念が不必要になる。また、迅速な移植細胞の純化・採取により、一期的な手術が可能となり、患者への負担が軽減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において心筋前駆細胞とは、中胚葉由来（Ｆｌｋ１陽性）の細胞で分化すれば自己拍動し心筋特異的遺伝子発現を有するようになる（心筋細胞になる）性状を有した細胞集団のことを指す。
本発明において中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。
【００１４】
マウスＥＳ細胞としてはＥＢ５細胞が、ヒトＥＳ細胞としては、Ｈ９．２細胞(Kehat et al.JCI,2001 vol.108 p.407-414)、ＨＥＳ−２細胞(Mummery et al.Journal of Anatomy,2002 vol.200 p.233-242)、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９細胞(Xu et al. Circulation Research,2002 vol.91 p.501-508)等が知られている。これらのヒトＥＳ細胞においてはいずれも胚葉体からの分化誘導モデルが報告されている。
【００１５】
また供給源として臍帯血を用いる場合、以下のような利点がある。
現状では、骨髄移植への利用（臍帯血バンク）が普及しており、公的組織が既に構築されているため、臍帯血採取における倫理面、技術面、社会的認知性において基盤となる問題が克服されている。同種非血縁者間の移植において、移植片対宿主反応、いわゆるＧＶＨＤ(graft-versus-host disease)の発現が、頻度、強度とも、臍帯血では骨髄片移植に比し、少ないことが知られており、免疫的寛容が期待できる。新生児組織である臍帯血では、成人組織（骨髄等）に比して、細胞老化が少ないため、多分化能を有する未熟細胞の効率的な分離、増殖が期待できる。
【００１６】
ＥＳ細胞から中胚葉細胞への分化誘導は、通常当分野で実施されている手法を用いて行えばよい（Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747）。例えばマウスＥＢ５を用いた場合について記載する。ＥＢ５細胞はゼラチン（好ましくは０．１％程度）コートした培養皿で、培養液（例えば、１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養する。分化誘導条件としては、以下のようなプロトコールが挙げられるが、最終的にＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、より好ましくは３種全ての有意な発現上昇が確認されれば、その詳細は特に限定されるものではない。また、細胞の状況等の要因によっても適宜変更され得る。
（分化誘導プロトコール）
１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養する。
【００１７】
中胚葉細胞への分化は細胞表面マーカーの発現様式を解析することによって確認することができる。すなわち、分化誘導前には検出されないか、あるいは検出されても僅かであって、分化誘導後に顕著にその発現量が増加する細胞表面抗原（細胞表面マーカー）であるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。中胚葉細胞のソースとしてＥＳ細胞を用いる場合には、中胚葉分化誘導条件下で培養した後の細胞（細胞集団）における細胞表面マーカーの発現を測定し、Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、特に好ましくはＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの３種全てを発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。中胚葉細胞のソースとして末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞を用いる場合には、当該細胞（細胞集団）におけるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定し、Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、特に好ましくはＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの３種全てを発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。
【００１８】
Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程は、細胞の表面マーカーであるこれらの蛋白質の発現が解析できれば特にその手法は限定されないが、一般的に免疫反応を用いた方法が簡便であり、また細胞を傷つけることなく好ましい。細胞を傷つけないという利点は心筋前駆細胞の体内導入という本発明の目的において特に有利である。具体的にはＦｌｋ１に特異的親和性を有する物質、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質、並びにＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行う。
【００１９】
Ｆｌｋ１は、血管内皮増殖因子受容体ＶＥＧＦの受容体として機能し、膜１回貫通型のチロシンキナ−ゼで、細胞外には７つの免疫グロブリン様構造をもち、細胞内にはキナーゼドメインとこれを二分するキナーゼインサートをもつことが特徴である（Developmental Biology S.F.Gilbert 7th Edition Chapter 15 Lateral Plate Mesoderm. Sinauer）。正常血管や腫瘍血管の新生、血管透過性に極めて重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。また、血管内皮前駆細胞のマーカー、中胚葉のマーカーと考えられている（Cortes et al. 1999, Mech Dev. 83(1-2):161-4、Ogawa et al. Blood 1999 93;(4):1168-77）
【００２０】
ＣＤ４４は、細胞接着機能をもつＩ型膜貫通糖蛋白質の１つで、ヒアルロン酸レセプターである。選択的スプライシングによってさまざまなアイソフォームが作り出され種々の分子サイズを有するＣＤ４４が特定の細胞に発現することが知られている。胎児性癌細胞（ＥＣ細胞）や胚幹細胞（ＥＳ細胞）の分化過程でその発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２）。
【００２１】
ＰＤＧＦＲ（血小板由来増殖因子受容体）は、種々の間葉系細胞に発現している分子量約１８万の糖鎖を有する膜蛋白質でチロシンキナーゼ活性を有する。アミノ酸残基配列の類似したα及びβ受容体が存在する。
マウス発生の原腸陥入期に、沿軸中胚葉に強い発現がみられ、発生の進行とともに間葉系組織に広く分布すること（非特許文献３）、マウスＥＳ細胞よりＢＭＰ４刺激により誘導されるＰＤＧＦＲα陽性細胞群から、中胚葉組織の軟骨形成が効率的に分化誘導されること（非特許文献４）が報告されている。
【００２２】
本発明はこれらの蛋白質が心筋前駆細胞においてその発現量が顕著に増加するという新たな知見に基づいている。本明細書中、「マーカー（又は表面マーカー）」とは特にことわりのない限り、上記した心筋前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、また特にＣＤ４４のように多彩なスプライシングにより幾つかのアイソフォームを有する場合がある。本発明においてはその心筋前駆細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。
【００２３】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００２４】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２５】
本発明の心筋前駆細胞を単離する方法はあるいはその為のデバイス、当該方法又はデバイスを用いる心筋前駆細胞投与用デバイスは、マーカー蛋白質、即ちＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαとそれぞれ特異的親和性を有する物質のうち１種、好ましくは２種、特に好ましくは３種全てを用いることを特徴とする。また、２種としてはＦｌｋ１とＰＤＧＦＲαとの組み合わせが特に好ましい。本発明の単離方法において、あるいはデバイスを用いて当該マーカー蛋白質の発現を解析する。各蛋白質を発現している場合、それぞれ「＋」と表現することもあり、また、発現していない場合には、それぞれ「−」と表現することもある。例えば本発明の心筋前駆細胞の好適な態様であるＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαを共発現している細胞は、［Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋］と記載することができる。
【００２６】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー蛋白質を発現している細胞を単離、回収する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４４抗体を、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質として抗Ｆｌｋ１抗体を、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質として抗ＰＤＧＦＲα抗体をそれぞれ用いた場合の具体的手法について以下に述べるが、本発明はかかる例示に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体並びに抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体を調製する工程
抗ＣＤ４４抗体、抗Ｆｌｋ１抗体あるいは抗ＰＤＧＦＲα抗体を用いて通常当分野で実施されているような方法によって行う。具体的には固相担体を臭化シアン処理等によって活性化し、そこにアミノ基あるいはヒドロキシル基を有する抗体を結合させる方法等によって行う。各抗体は商業的に入手可能であり、また、上記したような手順によって適宜調製することもできる。本発明において用いられる固相担体は、その上で抗ＣＤ４４抗体とＣＤ４４抗原との抗原抗体反応（あるいは抗Ｆｌｋ１抗体とＦｌｋ１抗原との抗原抗体反応若しくは抗ＰＤＧＦＲα抗体とＰＤＧＦＲα抗原との抗原抗体反応）が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用できる。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス等が用いられる。これらの固相担体は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後の工程等に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし得る。
【００２８】
（２−１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＣＤ４４抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料、あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＣＤ４４抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳともいう）等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＣＤ４４抗原を加える等の処理によって抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＣＤ４４を発現している細胞集団（［ＣＤ４４＋］細胞）を回収する（［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液）。
【００２９】
（２−２）抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体（以下、単に抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＦｌｋ１抗原を加える等の処理によって抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、Ｆｌｋ１を発現している細胞集団（［Ｆｌｋ１＋］細胞）を回収する（［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液）。
【００３０】
（２−３）抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＰＤＧＦＲα抗原を加える等の処理によって抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団（［ＰＤＧＦＲα＋］細胞）を回収する（［ＰＤＧＦＲα＋］細胞懸濁液）。
【００３１】
上記工程（２−１）〜（２−３）はそれぞれ単独で実施することもできるが、より効率良く心筋前駆細胞を取得するには２工程、好ましくは３工程全てを組み合わせて行うことが好ましい。２工程の例として工程（２−２）と工程（２−３）を組み合わせた場合の態様は以下のとおりである。工程（２−３）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−２）で調製された［Ｆｌｋ＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋］細胞であり、工程（２−２）で抗Ｆｌｋ＋抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［Ｆｌｋ１−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［Ｆｌｋ１−，ＰＤＧＦＲα＋］細胞である。勿論その逆、すなわち工程（２−２）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−３）で調製された［ＰＤＧＦＲα＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、工程（２−２）で抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［ＰＤＧＦＲα−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＰＤＧＦＲα−，Ｆｌｋ１＋］細胞である。
【００３２】
さらに３工程全てを実施する場合には上述の如く２工程を経て得られた各種の表現型を有する細胞（細胞懸濁液）を残るもう１工程に付すことによって行われる。例えば［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋］細胞の懸濁液を中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−１）に付すことによって［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋］細胞あるいは［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４−］細胞が得られる。
ＣＤ４４、Ｆｌｋ１、ＰＤＧＦＲαの順に、あるいはＣＤ４４、ＰＤＧＦＲα、Ｆｌｋ１の順に回収工程を行うことが好ましい。
【００３３】
分離、回収には種々の公知の手段が適用できるが、膜を用いた濾過処理等が好ましい。例えば各工程を経て得られる心筋前駆細胞の懸濁液を、例えば内部にフィルターを仕込んだシリンジ等を用いて、まずシリンジ内のフィルターに細胞をトラップさせ、次いでシリンジ内のプランジャーを押してフィルターから前駆細胞をはずして回収する。２工程を用いた心筋前駆細胞の回収の為のデバイスの一例を図１に示すが、何ら限定されるものではない。
図１中、「試料」は中胚葉細胞を含有する細胞集団であり、抗体カラム１及び２は抗ＣＤ４４抗体固定化カラム、抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムから選ばれる２種のカラムである。好ましくは抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム及び抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムであり、その順番は特に限定されない。三方活栓を使用することにより所望の細胞画分を容易に得ることができる。
【００３４】
各種の表現型を有する細胞の回収は磁気細胞分離法によっても実施することができる。例えば磁気細胞分離法による〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離は以下のようにして行われる。概略図を図２に示す。
基本的にＣＤ３４陽性細胞を効率よく回収することができる市販の「アイソレックスＴＭ３００ｉ」（米国Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）（医療用具承認番号 ２１３００ＢＺＹ００４６９０００）と同じ原理で〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞を分離・回収する。
＜構造・原理＞
モノクローナル抗体（抗Ｆｌｋ１抗体及び抗ＰＤＧＦＲα抗体）を固定化した磁気ビーズをＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞と特異的に結合させ、磁石を使って選別（免疫磁気ビーズ法）し、最後に磁気ビーズを切り離してＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞のみを回収するシステムである。Ｆｌｋ１陽性細胞の分離とＰＤＧＦＲα陽性細胞の分離は別々に行う。順序についてはどちらが先でも構わない。
分離装置に加え、ディスポーザブルセット及び／又は幹細胞分離キットの構成品を含むことができる。
幹細胞を含む細胞群からＦｌｋ１（ＰＤＧＦＲα）細胞を分離採取する目的で、分離装置にディスポーザブルセットを装着し、幹細胞分離キットを用いてＦｌｋ１（ＰＤＧＦＲα）細胞を磁気的に分離する磁気細胞分離システムである。
＜操作方法・使用方法＞
Ｆｌｋ１陽性細胞の分離とＰＤＧＦＲα陽性細胞の分離は別々に行う。順序についてはどちらが先でも構わない（以下Ｆｌｋ１→ＰＤＧＦＲαの順の場合を例示する）。
（Ａ）Ｆｌｋ１陽性細胞の分離法
１．分離装置にディスポーザブルセットを装着する。
２．バッグ内で幹細胞を含む細胞群中のＦｌｋ１陽性細胞と抗Ｆｌｋ１モノクローナル抗体（マウス）を結合させ、ディスポ一ザブルセットに接続する。
３．洗浄用のバッファーを入れたバッグ、分離したＦｌｋ１陽性細胞を採取するバッグ及び廃液バッグをディスボーザブルセットに接続する。
４．Ｆｌｋ１陽性細胞を含む細胞浮遊液をバッグから一次側分離チヤンバーへ移し、抗マウス抗体結合常磁性ビーズを加え、ローテーターを作動させて混合する。
５．常磁性ビーズと結合したＦｌｋ１陽性細胞を一次マグネットで保持し、保持されない細胞は廃液バッグヘ流す。
６．分離された常磁性ビーズと結合しているＦｌｋ１陽性細胞を洗浄した後、ペプチド９０６９Ｎ（競合反応によりビーズからＦｌｋ１陽性細胞を遊離）を添加して再びローテーターを作動させ、Ｆｌｋ１陽性細胞を常磁性ビーズから遊離させる。
７．抗マウス抗体（ヒツジ）常磁性ビーズを一次マグネットで保持し、遊離したＦｌｋ１陽性細胞を二次側分離チャンバーをとおして、採取バッグに収集する。一次マグネットで保持されなかった常磁性ビーズは二次マグネットで保持される。
８．収集したＦｌｋ１陽性細胞は遠心分離、洗浄をくり返し、余剰のペプチド９０６９Ｎを除去し、最終Ｆｌｋ１陽性細胞を得る。
（Ｂ）〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離法
（Ａ）で得たＦｌｋ１陽性細胞群について、（Ａ）の操作においてＦｌｋ１をＰＤＧＦＲαと読み替えた方法を施すことによって、〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞を得る。
【００３５】
上記デバイスに、さらに得られた心筋前駆細胞を患者に投与するための手段を含めて心筋前駆細胞投与用デバイスを構築することができる。心筋前駆細胞を患者に投与するための手段としては、通常細胞を用いた治療に利用されるような手段、用具等が用いられ、例えばシリンジやカテーテル等が挙げられる。シリンジは図１で示した回収用のシリンジと同一のものであっても構わないし、回収した細胞を別の新しいシリンジに充填して患者に投与することもできる。同様にカテーテルも回収用に用いたものと同一のものであってもよいし、別途用意されるものであってもよい。
【００３６】
さらに、本発明の心筋前駆細胞を体外にて培養して、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織とした後そのシートを投与対象（患者）に移植してもよいし、又、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織を投与対象（患者）に移植してもよい。支持体は当分野で通常用いられるものが利用できるが、非生物由来の支持体としては（１）ポリグリコール酸（Ｐｏｌｙ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＧＡ））、（２）ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＡ））、（３）ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、（４）ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）等が、生物由来の支持体としては（１）界面活性剤、リボヌクレアーゼ等を用いて脱細胞化処理を施すことによって得た、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスからなる組織、（２）コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分を用いて人工的に構成した組織等が挙げられる。
【００３７】
本発明の心筋前駆細胞のヒトへの治療における適用は、例えば心筋梗塞亜急性期、あるいは心筋症慢性期患者への移植が想定される。治療評価としては、一般的な心不全治療に対する効果判定基準に、現在、既に実用化されている血液疾患領域における同種臍帯血幹細胞移植の治療評価基準（特に、ＧＶＨＤ等の有害副反応の評価基準）を加味したものが適当と考えられる。より具体的には、既に公開されている大規模臨床試験プロトコールの治療効果評価を参照することができる（例えばhttp://poppy.ac/j-chf/doc/jchfplot_ver2_030925.pdf等）。
【００３８】
実施例で後述するが、本発明の心筋前駆細胞は特定の培養条件下、好ましくはストローマ細胞との共培養条件下で心筋細胞へと分化し得る。このような本発明の心筋前駆細胞を用いる分化誘導系を利用して、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法を構築することができる。具体的には以下のような工程からなる方法が挙げられる。
（ｉ）上述のように、本発明の方法によって得られた本発明の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程。
【００３９】
本スクリーニング方法で用いる被検物質は、新規のものであっても既知のものであってもよく、その調製方法や使用濃度等の条件は各物質の特性に応じて適宜決定される。また、被検物質を段階希釈して用い至適濃度を予め決定しておくことが好ましい。工程（ｉ）における細胞の培養時間は、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化が誘導され得る期間であれば特に限定されないが、通常、心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養した場合に心筋細胞の発生が確認される７日間程度を目安とする。工程（ｉ）は好ましくはストローマ細胞との共培養条件下で行うが、心筋細胞への誘導が可能であれば必須ではない。ストローマ細胞非存在下での心筋細胞への誘導を可能とする物質を得ることも本発明のスクリーニング方法の目的の一つである。
【００４０】
工程（ｉ）を経て得られた心筋前駆細胞について拍動の有無及び／又は心筋マーカーの発現を測定する。拍動の有無は光学顕微鏡下、目視にて観察し、培養皿中の拍動を観察したコロニー数を測定する。また対象となる心筋マーカーとしては、Ｎｌｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＬＣ２ａ、Ｔｂｘ５、ｃＴｎＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＣＡＭ等が挙げられる。蛋白質レベルでの発現であっても遺伝子レベルでの発現であっても構わない。蛋白質レベルでの発現を測定する場合には各蛋白質の特異抗体を用いてウェスタンブロット等により、遺伝子レベルでの発現を測定する場合には各遺伝子の特異プローブを用いてノザンブロット等を行うことにより実施する。
【００４１】
被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ培養した心筋前駆細胞について拍動の有無及び／又は心筋マーカーの発現、好ましくは拍動の有無及び心筋マーカーの発現を測定し、拍動及び／又は心筋マーカーの発現を確認した細胞の出現率を算出し（分化誘導する前の時点をベースとする）被検物質存在下の場合と非存在下の場合とで比較する。被検物質の非存在下で培養した場合に比べて出現率を顕著に上昇させた被検物質を、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定することができる。
【００４２】
さらに本発明は幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法を提供する。即ち、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種を、心筋前駆細胞への中胚葉系分化のマーカーとして用いる。具体的には以下のような工程からなる方法が例示される。
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程。
【００４３】
幹細胞としては、心筋前駆細胞への中胚葉系分化し得る細胞であれば、特に限定されないが、多能性であることが好ましく、例えばＥＳ細胞や組織幹細胞が用いられる。
本スクリーニング方法で用いる被検物質は、新規のものであっても既知のものであってもよく、その調製方法や使用濃度等の条件は各物質の特性に応じて適宜決定される。また、被検物質を段階希釈して用い至適濃度を予め決定しておくことが好ましい。工程（ｉ）における細胞の培養時間は、幹細胞から心筋前駆細胞への分化が誘導され得る期間であれば特に限定されないが、通常、ＥＢ５細胞を中胚葉系分化誘導した場合に各マーカーの発現が確認される５日間程度を目安とする。
【００４４】
工程（ｉ）を経て得られた心筋前駆細胞についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種の発現を測定する。本発明はスクリーニング方法が目的であるので心筋前駆細胞の回収を伴わない。従って、蛋白質レベルで、特に膜表面で各蛋白質の特異抗体を用いる方法に加え、遺伝子レベルでの発現によって測定することもできる。その場合には各遺伝子の特異プローブを用いてノザンブロット等を行うことにより実施する。
【００４５】
被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ培養した幹細胞についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種の発現を測定し、その程度を算出し（分化誘導する前の時点をベースとする）被検物質存在下の場合と非存在下の場合とで比較する。被検物質の非存在下で培養した場合に比べて発現の程度を顕著に上昇させた被検物質を、幹細胞から心筋前駆細胞への分化を誘導し得る因子と認定することができる。
【００４６】
本発明はＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種を発現している中胚葉細胞を含有する細胞集団が、心筋前駆細胞であり得、特定の条件下で心筋前駆細胞へ分化誘導され得るという知見に基づく。またＢＩＴ９５００培地でこのような表現型の細胞集団を培養すると管構造を持つ血管内皮細胞と浮遊細胞である血液細胞が誘導される。即ち本発明のＦｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲａ＋の心筋前駆細胞群には同じく側板中胚葉起源で血管・血液前駆細胞であるｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ（血管芽細胞）も含まれることが示された。
【実施例】
【００４７】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：Ｆｌｋ１＋細胞，ＣＤ４４＋細胞，ＰＤＧＦＲα＋細胞からの心筋細胞への分化の検討
ＥＳ細胞としてＥＢ５細胞を用いた。ＥＢ５細胞は０．１％ゼラチンコートした６ｃｍ培養皿で、培養液（１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養した。０．１％ゼラチンコートは、０．１％ゼラチン（Nakarai Japan）／蒸留水を培養皿上に積層し常温で固相化することによって行った。
【００４８】
分化誘導は、１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養することによって行った。分化誘導後、経時的にフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ解析）を行うことによってＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現を測定した。
Ｆｌｋ１抗体としてはマウスモノクローナル抗体「ＡＶＡＳ１２α１」（理化学研究所、西川氏より供与された）を用い、ビオチン標識した後、ＦＡＣＳ解析を行った。該解析は「ｃａｌｉｂｕｒ」及び「Ａｒｉａ」（ともにＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を使用して行った。ＣＤ４４抗体は、ＢＤバイオサイエンス社のＣｌｏｎｅ ＩＭ７を、ＰＤＧＦＲα抗体は、理化学研究所 西川氏より供与されたＣｌｏｎｅ ＡＰＡ５をＢｉｏｔｉｎ標識したものを使用した。Ｆｌｋ１抗体についてはShin-Ichi Nishikawa et al. Development, 1998 vol. 125 p.1747-1757及びKataoka H et al. Dev Growth Differ. 1997 vol. 39, p.729-740等に詳述されている。
結果を図３に示す。
分化誘導５日目の細胞からＦｌｋ１＋細胞をソーティングした。得られたＦｌｋ１＋細胞をストローマ細胞ＯＰ９上で共培養した。
ストローマ細胞ＯＰ９と共培養することによりＥＳ細胞が血液細胞、神経細胞、リンパ球等へと分化誘導されることは既に知られており（Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747、Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Ogawa et al. Blood 1999 93;(4):1168-77）、本実施例においても心筋細胞への分化を期待してストローマ細胞ＯＰ９との共培養を行った。尚、ＯＰ９細胞はＡＴＣＣ等の公的機関からも入手可能であり、本実施例においてはコダマ氏より供与された。
またコントロールとしてＦｌｋ１−細胞についても同様にストローマＯＰ９細胞との共培養を行い、心筋細胞への分化を検討した。
セルソーターにて分離した細胞群（３．６×１０4細胞ずつ）をＯＰ９と６ｃｍ培養皿上で分化培地（上述）にて７日間培養した。
ＯＰ９との共培養から７日経過した時点で心筋細胞の出現率（拍動細胞のコロニー数）について確認した。結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
さらに、７日目に拍動している細胞集団（コロニー）をカルチャーリング（ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｉｎｇ）にて採取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ−ＰＣＲ）解析に供し、Ｆｌｋ１＋細胞由来の拍動細胞コロニーについて心筋分化マーカーの発現を確認した。合成したプライマーは以下の通り。
・Ｎｋｘ２−５
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｇｇｇｃｇｇａｔａａａａａａｇａｇｃｔ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔ（配列番号２）
・ＧＡＴＡ４
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇａｃａｃｃｃｃａａｔｃｔｃｇａｔ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｇｃｃｃｃａｃａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ（配列番号４）
・αＭＨＣ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｃｔｇａｃａｇａｔｃｇｇｇａｇａａｔｃａｇ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｔｇｇｃａａａｇｔａｃｔｇｇａｔｇａｃａ（配列番号６）
・ＭＬＣ２ｖ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇａｃｃａｔｔｃｔｃａａｃｇｃａｔｔｃａａｇ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｔｃａｇｃａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃａｔａｇｔ（配列番号８）
・ＭＬＣ２ａ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃａｇｃｔｇｃａｔｔｇａｃｃａｇａａｃａ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃｔｇｇｇａａｔａｇｇｔｃｔｃｃｔｔ（配列番号１０）
・Ｔｂｘ５
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｇａａｃｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇａａ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｔｇｇｔｇａｔ（配列番号１２）
・ｃＴｎＴ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｃｃｔｃａａａｇａｃａｇｇａｔｃｇａａ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔｔｃｔ（配列番号１４）
・Ｆｌｋ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｇａｇａｃａｇａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａａｃ（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａａａｃｔｇｇｔｇｔｇａｇｔｇａｔｔｃｇ（配列番号１６）
・ｃ−Ｋｉｔ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇｃｇｔｇａｃｔｃｇｔｔｔａｔｔｔｔｃ（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｇｃａｇａａｇｇｔｔ（配列番号１８）
・ＨＡＮＤ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｔｃｃｃｔｃｇｔｔｇｃｃｔａｃａｇａａａ（配列番号１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃａａｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇａｃ（配列番号２０）
・ＨＡＮＤ２
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｃａｇｃｔａｃａｔｃｇｃｃｔａｃｃｔｃａｔ（配列番号２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｔｔｃａｃｇｔｃｇｇｔｃｔｔｃｔｔｇａｔｃ（配列番号２２）
・ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｔｇｇｃｃａａａｇａｃｃｃｔｇａｃａａ（配列番号２３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｇｇａａｇａａｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔ（配列番号２４）
・ＰＣＡＭ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｔｇｃａｇａａｇｔｃｔｔｔｃａｇｇａｔｔｃａ（配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａｔａｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｔｇａｇｔ（配列番号２６）
いずれのマーカーの発現も他のコロニー群に比べて顕著に増加していた。
【００５１】
Ｆｌｋ１＋細胞をＯＰ９と共培養するとＦｌｋ１−細胞をＯＰ９と共培養したときよりも高頻度に拍動細胞が認められ。この拍動細胞は心筋マーカーを発現していることから、心筋細胞であることが確認できた。
【００５２】
以下さらに実施例を挙げて本発明を説明するが、細胞培養技術や細胞の単離技術等は特に言及しない限り実施例１に準じて行う。
【００５３】
実施例２：中胚葉分化誘導系における表面抗原の検討
Ｆｌｋ１の発現がピークになる分化誘導５日目の中胚葉系細胞の表面抗原の解析を行った。解析は各表面抗原に対する特異抗体を用い、免疫細胞染色を行った。表面抗原に対する特異抗体のうち、抗Ｆｌｋ１抗体、抗ＰＤＧＦＲα抗体以外はすべてＢＤバイオサイエンス社より入手した。抗Ｆｌｋ１抗体、抗ＰＤＧＦＲα抗体は理化学研究所 西川氏より供与されたものを用いた。抗Ｇｒ１抗体及び抗Ｍａｃ１抗体については４００倍希釈、それ以外の抗体は２００倍希釈にて反応に供した。抗ＰＤＧＦＲα、Ｆｌｋ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ a２，ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ b１，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ b７抗体はｂｉｏｔｉｎラベルされていたので２次抗体としてストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７を４００倍希釈で使用した。
分化誘導は概ね実施例１と同様な手法に基づくが、実験プロトコールを図４に示す。
ＰＤＧＦＲα、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１抗原等が、分化とともにその発現量を増強させた。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例３：Ｆｌｋ１／ＰＤＧＦＲαと心筋細胞出現率の関係の検討
細胞集団をＦｌｋ１＋／−，ＰＤＧＦＲα＋／−の４つの分画にそれぞれソーティングし、実施例１と同様にして心筋分化誘導を行い、拍動コロニーの出現率を測定した。実験プロトコールを模式的に示し（図４）、結果を図５に示す。
ＰＤＧＦＲα及びＦｌｋ１を共発現している心筋前駆細胞をストローマ細胞ＯＰ９と共培養した場合に拍動コロニー数が顕著に増加した。
【００５６】
実施例４：ヒト臍帯血からの心筋前駆細胞分離
＜プロトコール＞
臍帯血全血を、生理食塩水にて２倍希釈し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭＴｕｂｅ（ｗｗｗ．ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ−ｐｏｃ．ｃｏｍ）による比重遠心分離法にて、単核球分画を得、ＭＡＣＳ（登録名）ビーズ−抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体（ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉ．ｃｏｍ）と反応後、自動細胞分離装置ａｕｔｏＭＡＣＳＴＭにて、ＣＤ３４陽性単核球を得る。心筋前駆細胞群を、メチルセルロース培養（培養条件以下）にて、培養皿底に付着する細胞コロニー群を集めることによって得た。本細胞群について定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を未分化増殖培地（培養条件以下）にて５日間培養した細胞群をコントロールとした。
＜心筋前駆細胞を得るための「メチルセルロース培養」の条件＞
・ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ＋Ｈ４４３５ （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｒｉｔａｓｔｋ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｄｂ／ｓｈｏ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｔ＝１＆Ｓｈｏ＝０２００＆Ｃｈｕ＝０１００＃ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＧＦ＋Ｈ４４３５参照）を使用。
・αＭＥＭ １０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）にサイトカインカクテル（１００ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＳＣＦ， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＩＬ−６， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ｓＩＬ−６Ｒ， １０ｎｇ ｒｈ ＴＰＯ， ３０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ Ｆｌｔ２／３Ｌ；「ｒｈ」はヒト組み換え体であることを示す）を混合したものにて３日間培養した１００個のＣＤ３４＋細胞を１．２ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ＋Ｈ４４３５とともに３ｃｍ培養皿に播く。
＜「未分化増殖培地」を用いた培養の条件＞
・２×１０４ＣＤ３４＋細胞（純度９８％）を、αＭＥＭ １０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）にサイトカインカクテル（１００ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＳＣＦ， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＩＬ−６， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ｓＩＬ−６Ｒ， １０ｎｇ ｒｈ ＴＰＯ， ３０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ Ｆｌｔ２／３Ｌ；「ｒｈ」はヒト組み換え体であることを示す）を混合したものにて５日間培養する。
＜データ＞
得られた臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来の付着細胞の表面マーカー（ＰＤＧＦＲα、ＫＤＲ（ヒトのＦｌｋ−１））についてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＧＡＰＤＨ ｃｏｎｔｒｏｌ）により解析した。両表面マーカーともに心筋前駆細胞群で発現の増加がみられた（図６）。
【００５７】
配列表フリーテキスト
配列番号１：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号７：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号８：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号９：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１０：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１１：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１２：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１３：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１４：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１５：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１７：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１８：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１９：ＨＡＮＤ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２０：ＨＡＮＤ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２１：ＨＡＮＤ２のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２２：ＨＡＮＤ２のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２３：ＶＥ−ＣａｄｈｅｒｉｎのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２４：ＶＥ−ＣａｄｈｅｒｉｎのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２５：ＰＣＡＭ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２６：ＰＣＡＭ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、本発明の心筋前駆細胞単離用デバイスあるいは心筋前駆細胞投与用デバイスの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、磁気細胞分離法による〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離方法の概略図である。
【図３】図３はＥＢ５細胞の分化誘導におけるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの経時的発現の結果を示す図である。
【図４】図４はＥＢ５細胞の中胚葉分化誘導系における表面抗原を検討する際の実験プロトコールを模式化したものである。
【図５】ソーティングしたＦｌｋ１＋／ＰＤＧＦＲα＋細胞について心筋分化誘導（ＯＰ９上での共培養）を行い、得られた拍動コロニーの数を示すグラフである。
【図６】臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をメチルセルロース培養して培養皿底に付着した細胞について、その表面マーカー（ＰＤＧＦＲα及びＫＤＲ（ヒトのＦｌｋ１））の発現を調べた結果を示す図である。白カラムがメチルセルロース培養前の細胞、黒カラムがメチルセルロース培養後の培養皿底に付着した細胞の結果を示す。メチルセルロース培養後に得られる心筋前駆細胞群で両表面マーカーの発現の増加が見られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋前駆細胞の同定に関する。より詳細には心筋前駆細胞を単離する方法、並びに単離する為のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスとしては、末梢血から造血幹細胞を含む単核球細胞分画を体外血液循環下で分離する血液分離装置と、さらに造血幹細胞を単離するための抗ＣＤ３４抗体カラム装着装置とが知られている。このような２段階の幹細胞純化操作で幹細胞が採取されているが、現在のところ血液幹細胞以外では心筋組織になりうる心筋幹細胞も含め生体組織幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスは存在していない。
【０００３】
心臓疾患の再生医療では、心筋幹細胞の選択的採取とそれに続く心筋幹細胞の患部への細胞移植が必要であり、心筋幹細胞を純化・採取するデバイスの開発が強く望まれている。しかしながらこのようなデバイスが存在しなかった理由としては、心筋幹細胞・心筋前駆細胞の分化過程の探索は、主に転写因子などの遺伝子やシグナル分子を心筋発生のマーカーとした場合、細胞膜を破壊して（いわば細胞を殺して）、それらの分子の挙動を検出しなければならかったことが挙げられる。一方、生きたままの細胞を峻別するために細胞の表面抗原発現様式によって心筋幹細胞の分化・成熟度を峻別する方法があるが、現在まで心筋幹細胞・心筋前駆細胞の適切なマーカー、特に表面マーカーがなかったため、表面マーカーによる心筋幹細胞・心筋前駆細胞の同定の研究が進んでいなかった。
【０００４】
中胚葉はＥＳ細胞から分化誘導できる胚葉の中で最も研究されたものの一つであり、中でも心筋細胞は側部中胚葉に由来する細胞系列に含まれる。側部中胚葉に由来する細胞のうちＦｌｋ１陽性（以下、Ｆｌｋ１（＋）とも称す）として特徴付けられる細胞（Ｆｌｋ１（＋）細胞）から血管系細胞（血液細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）へ分化誘導が行われたという報告がある（非特許文献１）。
【０００５】
ヒトの幹細胞ソース（骨髄、臍帯血、ヒトＥＳ細胞株）から、マウスＥＳ細胞と同様なＦｌｋ１＋で分画される中胚葉系前駆細胞の同定は行われていないが、日本において公開されている研究計画書（http://www.tanabe.co.jp/kenkyu/reports/shinsa/es1.pdf）等から、ヒトＥＳ細胞からの同マーカーを使用した中胚葉系分化実験として、近々予定されているものが存在すると推測される。
又、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞にて、未分化状態でＣＤ４４が陽性の細胞を、ＶＥＧＦ存在下、半固形培養にてＦｌｋ１＋血管内皮細胞に分化誘導し得ることが報告されている（非特許文献５）。
【非特許文献１】ヤマシタ ジェイ．（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．）ら，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，２０００年，第４０８巻，第６８０８号，ｐ．９２−９６
【非特許文献２】スーザン シー．（Ｓｕｓａｎ Ｃ．）ら，「セル アドヒージョン アンド コミュニケーション（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１９９５年，第３巻，ｐ．２１７−２３０
【非特許文献３】ノブユキ タカクラ（Ｎｏｂｕｙｕｋｉ Ｔａｋａｋｕｒａ）ら，「ザ ジャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイトケミストリー （Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９７年，第４５巻，ｐ．８８３−８９３
【非特許文献４】ナオキ ナカヤマ（Ｎａｏｋｉ Ｎａｋａｙａｍａ）ら，「ジャーナル オブ セル サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，２００３年，第１１６巻，ｐ．２０１５−２０２８
【非特許文献５】ヨアヒム オスワルド（Ｊｏａｃｈｉｍ Ｏｓｗａｌｄ）ら,「ステム セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」，２００４年，第２２巻，ｐ．３７７−３８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの確立及び提供を目的とし、さらに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス並びに心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、表面マーカーの発現様式の検討に、マウスＥＳ細胞を用いた心筋分化過程を選定し、未分化細胞が心筋細胞に分化する過程を経時的に解析できる培養系を用いた。すなわちＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することにより拍動能を有する心筋様細胞に分化誘導し、表面マーカーの発現様式の変化を解析した。
結果、血管系細胞への分化を特徴づける表面マーカーとして報告されているＦｌｋ１が、心筋前駆細胞においても顕著に発現上昇していることが確認された。さらに、Ｆｌｋ１の発現量の増加という特徴に加え、ＥＳ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによってＣＤ４４およびＰＤＧＦＲαにおいてもその発現に顕著な上昇傾向が確認された。これらの知見を得て、本発明者らは、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を効率的に単離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔２〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔３〕少なくとも２種の蛋白質がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである上記〔２〕に記載の方法。
〔４〕（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαを全て発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
〔５〕中胚葉細胞が幹細胞由来である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記〔５〕記載の方法。
〔７〕中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、上記〔７〕記載の方法。
〔９〕中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、上記〔７〕記載の方法。
〔１０〕中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
【０００９】
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
〔１２〕ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、上記〔１２〕記載の方法。
〔１４〕Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、上記〔１４〕記載の方法。
〔１６〕ＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程が、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質が抗ＰＤＧＦＲα抗体である、上記〔１６〕記載の方法。
〔１８〕上記〔１１〕記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
〔１９〕心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）上記〔１１〕記載の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程
を含む方法。
〔２０〕工程(ｉ)における心筋前駆細胞の被検物質の存在下あるいは非存在下での培養を、ストローマ細胞の共存下で実施することを特徴とする、上記〔１９〕記載の方法。
【００１０】
〔２１〕幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
〔２２〕幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
〔２３〕少なくとも２種がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである上記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕工程（ｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現状況を測定し、工程（ｉｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子として認定する、上記〔２１〕記載の方法。
〔２５〕幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記〔２１〕又は〔２２〕記載の方法。
〔２６〕（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段のうち、少なくとも２つの手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
〔２７〕少なくとも２つの手段が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及びＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段である、上記〔２６〕記載のデバイス。
〔２８〕（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
〔２９〕ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕または〔２８〕記載のデバイス。
〔３０〕Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕〜〔２８〕のいずれかに記載のデバイス。
【００１１】
〔３１〕ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体である、上記〔２６〕〜〔２８〕のいずれかに記載のデバイス。
〔３２〕中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記〔２６〕〜〔３１〕のいずれかに記載のデバイス。
〔３３〕上記〔２６〕〜〔３２〕のいずれかに記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
〔３４〕心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、上記〔３３〕記載のデバイス。
〔３５〕心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである上記〔３４〕記載のデバイス。
〔３６〕移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、上記〔３５〕記載のデバイス。
〔３７〕移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、上記〔３５〕記載のデバイス。
【発明の効果】
【００１２】
心筋前駆細胞特異的な表面マーカーを用いる本発明の方法あるいはデバイスは、治療現場において、中胚葉系組織より細胞ソースを単離し迅速に心筋前駆細胞を純化・採取することを可能とする。従って、移植細胞の培養、培養にかかるコスト、培養による他の細胞への分化誘導などの懸念が不必要になる。また、迅速な移植細胞の純化・採取により、一期的な手術が可能となり、患者への負担が軽減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において心筋前駆細胞とは、中胚葉由来（Ｆｌｋ１陽性）の細胞で分化すれば自己拍動し心筋特異的遺伝子発現を有するようになる（心筋細胞になる）性状を有した細胞集団のことを指す。
本発明において中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。
【００１４】
マウスＥＳ細胞としてはＥＢ５細胞が、ヒトＥＳ細胞としては、Ｈ９．２細胞(Kehat et al.JCI,2001 vol.108 p.407-414)、ＨＥＳ−２細胞(Mummery et al.Journal of Anatomy,2002 vol.200 p.233-242)、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９細胞(Xu et al. Circulation Research,2002 vol.91 p.501-508)等が知られている。これらのヒトＥＳ細胞においてはいずれも胚葉体からの分化誘導モデルが報告されている。
【００１５】
また供給源として臍帯血を用いる場合、以下のような利点がある。
現状では、骨髄移植への利用（臍帯血バンク）が普及しており、公的組織が既に構築されているため、臍帯血採取における倫理面、技術面、社会的認知性において基盤となる問題が克服されている。同種非血縁者間の移植において、移植片対宿主反応、いわゆるＧＶＨＤ(graft-versus-host disease)の発現が、頻度、強度とも、臍帯血では骨髄片移植に比し、少ないことが知られており、免疫的寛容が期待できる。新生児組織である臍帯血では、成人組織（骨髄等）に比して、細胞老化が少ないため、多分化能を有する未熟細胞の効率的な分離、増殖が期待できる。
【００１６】
ＥＳ細胞から中胚葉細胞への分化誘導は、通常当分野で実施されている手法を用いて行えばよい（Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747）。例えばマウスＥＢ５を用いた場合について記載する。ＥＢ５細胞はゼラチン（好ましくは０．１％程度）コートした培養皿で、培養液（例えば、１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養する。分化誘導条件としては、以下のようなプロトコールが挙げられるが、最終的にＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、より好ましくは３種全ての有意な発現上昇が確認されれば、その詳細は特に限定されるものではない。また、細胞の状況等の要因によっても適宜変更され得る。
（分化誘導プロトコール）
１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養する。
【００１７】
中胚葉細胞への分化は細胞表面マーカーの発現様式を解析することによって確認することができる。すなわち、分化誘導前には検出されないか、あるいは検出されても僅かであって、分化誘導後に顕著にその発現量が増加する細胞表面抗原（細胞表面マーカー）であるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。中胚葉細胞のソースとしてＥＳ細胞を用いる場合には、中胚葉分化誘導条件下で培養した後の細胞（細胞集団）における細胞表面マーカーの発現を測定し、Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、特に好ましくはＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの３種全てを発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。中胚葉細胞のソースとして末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞を用いる場合には、当該細胞（細胞集団）におけるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定し、Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種、特に好ましくはＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの３種全てを発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。
【００１８】
Ｆｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程は、細胞の表面マーカーであるこれらの蛋白質の発現が解析できれば特にその手法は限定されないが、一般的に免疫反応を用いた方法が簡便であり、また細胞を傷つけることなく好ましい。細胞を傷つけないという利点は心筋前駆細胞の体内導入という本発明の目的において特に有利である。具体的にはＦｌｋ１に特異的親和性を有する物質、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質、並びにＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行う。
【００１９】
Ｆｌｋ１は、血管内皮増殖因子受容体ＶＥＧＦの受容体として機能し、膜１回貫通型のチロシンキナ−ゼで、細胞外には７つの免疫グロブリン様構造をもち、細胞内にはキナーゼドメインとこれを二分するキナーゼインサートをもつことが特徴である（Developmental Biology S.F.Gilbert 7th Edition Chapter 15 Lateral Plate Mesoderm. Sinauer）。正常血管や腫瘍血管の新生、血管透過性に極めて重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。また、血管内皮前駆細胞のマーカー、中胚葉のマーカーと考えられている（Cortes et al. 1999, Mech Dev. 83(1-2):161-4、Ogawa et al. Blood 1999 93;(4):1168-77）
【００２０】
ＣＤ４４は、細胞接着機能をもつＩ型膜貫通糖蛋白質の１つで、ヒアルロン酸レセプターである。選択的スプライシングによってさまざまなアイソフォームが作り出され種々の分子サイズを有するＣＤ４４が特定の細胞に発現することが知られている。胎児性癌細胞（ＥＣ細胞）や胚幹細胞（ＥＳ細胞）の分化過程でその発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２）。
【００２１】
ＰＤＧＦＲ（血小板由来増殖因子受容体）は、種々の間葉系細胞に発現している分子量約１８万の糖鎖を有する膜蛋白質でチロシンキナーゼ活性を有する。アミノ酸残基配列の類似したα及びβ受容体が存在する。
マウス発生の原腸陥入期に、沿軸中胚葉に強い発現がみられ、発生の進行とともに間葉系組織に広く分布すること（非特許文献３）、マウスＥＳ細胞よりＢＭＰ４刺激により誘導されるＰＤＧＦＲα陽性細胞群から、中胚葉組織の軟骨形成が効率的に分化誘導されること（非特許文献４）が報告されている。
【００２２】
本発明はこれらの蛋白質が心筋前駆細胞においてその発現量が顕著に増加するという新たな知見に基づいている。本明細書中、「マーカー（又は表面マーカー）」とは特にことわりのない限り、上記した心筋前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、また特にＣＤ４４のように多彩なスプライシングにより幾つかのアイソフォームを有する場合がある。本発明においてはその心筋前駆細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。
【００２３】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００２４】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２５】
本発明の心筋前駆細胞を単離する方法はあるいはその為のデバイス、当該方法又はデバイスを用いる心筋前駆細胞投与用デバイスは、マーカー蛋白質、即ちＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαとそれぞれ特異的親和性を有する物質のうち１種、好ましくは２種、特に好ましくは３種全てを用いることを特徴とする。また、２種としてはＦｌｋ１とＰＤＧＦＲαとの組み合わせが特に好ましい。本発明の単離方法において、あるいはデバイスを用いて当該マーカー蛋白質の発現を解析する。各蛋白質を発現している場合、それぞれ「＋」と表現することもあり、また、発現していない場合には、それぞれ「−」と表現することもある。例えば本発明の心筋前駆細胞の好適な態様であるＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαを共発現している細胞は、［Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋］と記載することができる。
【００２６】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー蛋白質を発現している細胞を単離、回収する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４４抗体を、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質として抗Ｆｌｋ１抗体を、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質として抗ＰＤＧＦＲα抗体をそれぞれ用いた場合の具体的手法について以下に述べるが、本発明はかかる例示に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体並びに抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体を調製する工程
抗ＣＤ４４抗体、抗Ｆｌｋ１抗体あるいは抗ＰＤＧＦＲα抗体を用いて通常当分野で実施されているような方法によって行う。具体的には固相担体を臭化シアン処理等によって活性化し、そこにアミノ基あるいはヒドロキシル基を有する抗体を結合させる方法等によって行う。各抗体は商業的に入手可能であり、また、上記したような手順によって適宜調製することもできる。本発明において用いられる固相担体は、その上で抗ＣＤ４４抗体とＣＤ４４抗原との抗原抗体反応（あるいは抗Ｆｌｋ１抗体とＦｌｋ１抗原との抗原抗体反応若しくは抗ＰＤＧＦＲα抗体とＰＤＧＦＲα抗原との抗原抗体反応）が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用できる。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス等が用いられる。これらの固相担体は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後の工程等に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし得る。
【００２８】
（２−１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＣＤ４４抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料、あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＣＤ４４抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳともいう）等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＣＤ４４抗原を加える等の処理によって抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＣＤ４４を発現している細胞集団（［ＣＤ４４＋］細胞）を回収する（［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液）。
【００２９】
（２−２）抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体（以下、単に抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＦｌｋ１抗原を加える等の処理によって抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、Ｆｌｋ１を発現している細胞集団（［Ｆｌｋ１＋］細胞）を回収する（［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液）。
【００３０】
（２−３）抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＰＤＧＦＲα抗原を加える等の処理によって抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団（［ＰＤＧＦＲα＋］細胞）を回収する（［ＰＤＧＦＲα＋］細胞懸濁液）。
【００３１】
上記工程（２−１）〜（２−３）はそれぞれ単独で実施することもできるが、より効率良く心筋前駆細胞を取得するには２工程、好ましくは３工程全てを組み合わせて行うことが好ましい。２工程の例として工程（２−２）と工程（２−３）を組み合わせた場合の態様は以下のとおりである。工程（２−３）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−２）で調製された［Ｆｌｋ＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋］細胞であり、工程（２−２）で抗Ｆｌｋ＋抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［Ｆｌｋ１−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［Ｆｌｋ１−，ＰＤＧＦＲα＋］細胞である。勿論その逆、すなわち工程（２−２）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−３）で調製された［ＰＤＧＦＲα＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、工程（２−２）で抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［ＰＤＧＦＲα−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＰＤＧＦＲα−，Ｆｌｋ１＋］細胞である。
【００３２】
さらに３工程全てを実施する場合には上述の如く２工程を経て得られた各種の表現型を有する細胞（細胞懸濁液）を残るもう１工程に付すことによって行われる。例えば［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋］細胞の懸濁液を中胚葉細胞を含有する細胞集団として工程（２−１）に付すことによって［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋］細胞あるいは［ＰＤＧＦＲα＋，Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４−］細胞が得られる。
ＣＤ４４、Ｆｌｋ１、ＰＤＧＦＲαの順に、あるいはＣＤ４４、ＰＤＧＦＲα、Ｆｌｋ１の順に回収工程を行うことが好ましい。
【００３３】
分離、回収には種々の公知の手段が適用できるが、膜を用いた濾過処理等が好ましい。例えば各工程を経て得られる心筋前駆細胞の懸濁液を、例えば内部にフィルターを仕込んだシリンジ等を用いて、まずシリンジ内のフィルターに細胞をトラップさせ、次いでシリンジ内のプランジャーを押してフィルターから前駆細胞をはずして回収する。２工程を用いた心筋前駆細胞の回収の為のデバイスの一例を図１に示すが、何ら限定されるものではない。
図１中、「試料」は中胚葉細胞を含有する細胞集団であり、抗体カラム１及び２は抗ＣＤ４４抗体固定化カラム、抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムから選ばれる２種のカラムである。好ましくは抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム及び抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化カラムであり、その順番は特に限定されない。三方活栓を使用することにより所望の細胞画分を容易に得ることができる。
【００３４】
各種の表現型を有する細胞の回収は磁気細胞分離法によっても実施することができる。例えば磁気細胞分離法による〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離は以下のようにして行われる。概略図を図２に示す。
基本的にＣＤ３４陽性細胞を効率よく回収することができる市販の「アイソレックスＴＭ３００ｉ」（米国Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製）（医療用具承認番号 ２１３００ＢＺＹ００４６９０００）と同じ原理で〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞を分離・回収する。
＜構造・原理＞
モノクローナル抗体（抗Ｆｌｋ１抗体及び抗ＰＤＧＦＲα抗体）を固定化した磁気ビーズをＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞と特異的に結合させ、磁石を使って選別（免疫磁気ビーズ法）し、最後に磁気ビーズを切り離してＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα陽性細胞のみを回収するシステムである。Ｆｌｋ１陽性細胞の分離とＰＤＧＦＲα陽性細胞の分離は別々に行う。順序についてはどちらが先でも構わない。
分離装置に加え、ディスポーザブルセット及び／又は幹細胞分離キットの構成品を含むことができる。
幹細胞を含む細胞群からＦｌｋ１（ＰＤＧＦＲα）細胞を分離採取する目的で、分離装置にディスポーザブルセットを装着し、幹細胞分離キットを用いてＦｌｋ１（ＰＤＧＦＲα）細胞を磁気的に分離する磁気細胞分離システムである。
＜操作方法・使用方法＞
Ｆｌｋ１陽性細胞の分離とＰＤＧＦＲα陽性細胞の分離は別々に行う。順序についてはどちらが先でも構わない（以下Ｆｌｋ１→ＰＤＧＦＲαの順の場合を例示する）。
（Ａ）Ｆｌｋ１陽性細胞の分離法
１．分離装置にディスポーザブルセットを装着する。
２．バッグ内で幹細胞を含む細胞群中のＦｌｋ１陽性細胞と抗Ｆｌｋ１モノクローナル抗体（マウス）を結合させ、ディスポ一ザブルセットに接続する。
３．洗浄用のバッファーを入れたバッグ、分離したＦｌｋ１陽性細胞を採取するバッグ及び廃液バッグをディスボーザブルセットに接続する。
４．Ｆｌｋ１陽性細胞を含む細胞浮遊液をバッグから一次側分離チヤンバーへ移し、抗マウス抗体結合常磁性ビーズを加え、ローテーターを作動させて混合する。
５．常磁性ビーズと結合したＦｌｋ１陽性細胞を一次マグネットで保持し、保持されない細胞は廃液バッグヘ流す。
６．分離された常磁性ビーズと結合しているＦｌｋ１陽性細胞を洗浄した後、ペプチド９０６９Ｎ（競合反応によりビーズからＦｌｋ１陽性細胞を遊離）を添加して再びローテーターを作動させ、Ｆｌｋ１陽性細胞を常磁性ビーズから遊離させる。
７．抗マウス抗体（ヒツジ）常磁性ビーズを一次マグネットで保持し、遊離したＦｌｋ１陽性細胞を二次側分離チャンバーをとおして、採取バッグに収集する。一次マグネットで保持されなかった常磁性ビーズは二次マグネットで保持される。
８．収集したＦｌｋ１陽性細胞は遠心分離、洗浄をくり返し、余剰のペプチド９０６９Ｎを除去し、最終Ｆｌｋ１陽性細胞を得る。
（Ｂ）〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離法
（Ａ）で得たＦｌｋ１陽性細胞群について、（Ａ）の操作においてＦｌｋ１をＰＤＧＦＲαと読み替えた方法を施すことによって、〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞を得る。
【００３５】
上記デバイスに、さらに得られた心筋前駆細胞を患者に投与するための手段を含めて心筋前駆細胞投与用デバイスを構築することができる。心筋前駆細胞を患者に投与するための手段としては、通常細胞を用いた治療に利用されるような手段、用具等が用いられ、例えばシリンジやカテーテル等が挙げられる。シリンジは図１で示した回収用のシリンジと同一のものであっても構わないし、回収した細胞を別の新しいシリンジに充填して患者に投与することもできる。同様にカテーテルも回収用に用いたものと同一のものであってもよいし、別途用意されるものであってもよい。
【００３６】
さらに、本発明の心筋前駆細胞を体外にて培養して、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織とした後そのシートを投与対象（患者）に移植してもよいし、又、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織を投与対象（患者）に移植してもよい。支持体は当分野で通常用いられるものが利用できるが、非生物由来の支持体としては（１）ポリグリコール酸（Ｐｏｌｙ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＧＡ））、（２）ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＡ））、（３）ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、（４）ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）等が、生物由来の支持体としては（１）界面活性剤、リボヌクレアーゼ等を用いて脱細胞化処理を施すことによって得た、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスからなる組織、（２）コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分を用いて人工的に構成した組織等が挙げられる。
【００３７】
本発明の心筋前駆細胞のヒトへの治療における適用は、例えば心筋梗塞亜急性期、あるいは心筋症慢性期患者への移植が想定される。治療評価としては、一般的な心不全治療に対する効果判定基準に、現在、既に実用化されている血液疾患領域における同種臍帯血幹細胞移植の治療評価基準（特に、ＧＶＨＤ等の有害副反応の評価基準）を加味したものが適当と考えられる。より具体的には、既に公開されている大規模臨床試験プロトコールの治療効果評価を参照することができる（例えばhttp://poppy.ac/j-chf/doc/jchfplot_ver2_030925.pdf等）。
【００３８】
実施例で後述するが、本発明の心筋前駆細胞は特定の培養条件下、好ましくはストローマ細胞との共培養条件下で心筋細胞へと分化し得る。このような本発明の心筋前駆細胞を用いる分化誘導系を利用して、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法を構築することができる。具体的には以下のような工程からなる方法が挙げられる。
（ｉ）上述のように、本発明の方法によって得られた本発明の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程。
【００３９】
本スクリーニング方法で用いる被検物質は、新規のものであっても既知のものであってもよく、その調製方法や使用濃度等の条件は各物質の特性に応じて適宜決定される。また、被検物質を段階希釈して用い至適濃度を予め決定しておくことが好ましい。工程（ｉ）における細胞の培養時間は、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化が誘導され得る期間であれば特に限定されないが、通常、心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養した場合に心筋細胞の発生が確認される７日間程度を目安とする。工程（ｉ）は好ましくはストローマ細胞との共培養条件下で行うが、心筋細胞への誘導が可能であれば必須ではない。ストローマ細胞非存在下での心筋細胞への誘導を可能とする物質を得ることも本発明のスクリーニング方法の目的の一つである。
【００４０】
工程（ｉ）を経て得られた心筋前駆細胞について拍動の有無及び／又は心筋マーカーの発現を測定する。拍動の有無は光学顕微鏡下、目視にて観察し、培養皿中の拍動を観察したコロニー数を測定する。また対象となる心筋マーカーとしては、Ｎｌｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、αＭＨＣ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＬＣ２ａ、Ｔｂｘ５、ｃＴｎＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＣＡＭ等が挙げられる。蛋白質レベルでの発現であっても遺伝子レベルでの発現であっても構わない。蛋白質レベルでの発現を測定する場合には各蛋白質の特異抗体を用いてウェスタンブロット等により、遺伝子レベルでの発現を測定する場合には各遺伝子の特異プローブを用いてノザンブロット等を行うことにより実施する。
【００４１】
被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ培養した心筋前駆細胞について拍動の有無及び／又は心筋マーカーの発現、好ましくは拍動の有無及び心筋マーカーの発現を測定し、拍動及び／又は心筋マーカーの発現を確認した細胞の出現率を算出し（分化誘導する前の時点をベースとする）被検物質存在下の場合と非存在下の場合とで比較する。被検物質の非存在下で培養した場合に比べて出現率を顕著に上昇させた被検物質を、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定することができる。
【００４２】
さらに本発明は幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法を提供する。即ち、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種を、心筋前駆細胞への中胚葉系分化のマーカーとして用いる。具体的には以下のような工程からなる方法が例示される。
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程。
【００４３】
幹細胞としては、心筋前駆細胞への中胚葉系分化し得る細胞であれば、特に限定されないが、多能性であることが好ましく、例えばＥＳ細胞や組織幹細胞が用いられる。
本スクリーニング方法で用いる被検物質は、新規のものであっても既知のものであってもよく、その調製方法や使用濃度等の条件は各物質の特性に応じて適宜決定される。また、被検物質を段階希釈して用い至適濃度を予め決定しておくことが好ましい。工程（ｉ）における細胞の培養時間は、幹細胞から心筋前駆細胞への分化が誘導され得る期間であれば特に限定されないが、通常、ＥＢ５細胞を中胚葉系分化誘導した場合に各マーカーの発現が確認される５日間程度を目安とする。
【００４４】
工程（ｉ）を経て得られた心筋前駆細胞についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種の発現を測定する。本発明はスクリーニング方法が目的であるので心筋前駆細胞の回収を伴わない。従って、蛋白質レベルで、特に膜表面で各蛋白質の特異抗体を用いる方法に加え、遺伝子レベルでの発現によって測定することもできる。その場合には各遺伝子の特異プローブを用いてノザンブロット等を行うことにより実施する。
【００４５】
被検物質の存在下及び非存在下でそれぞれ培養した幹細胞についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種の発現を測定し、その程度を算出し（分化誘導する前の時点をベースとする）被検物質存在下の場合と非存在下の場合とで比較する。被検物質の非存在下で培養した場合に比べて発現の程度を顕著に上昇させた被検物質を、幹細胞から心筋前駆細胞への分化を誘導し得る因子と認定することができる。
【００４６】
本発明はＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは２種（特にＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲα）、特に好ましくは３種を発現している中胚葉細胞を含有する細胞集団が、心筋前駆細胞であり得、特定の条件下で心筋前駆細胞へ分化誘導され得るという知見に基づく。またＢＩＴ９５００培地でこのような表現型の細胞集団を培養すると管構造を持つ血管内皮細胞と浮遊細胞である血液細胞が誘導される。即ち本発明のＦｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲａ＋の心筋前駆細胞群には同じく側板中胚葉起源で血管・血液前駆細胞であるｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ（血管芽細胞）も含まれることが示された。
【実施例】
【００４７】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：Ｆｌｋ１＋細胞，ＣＤ４４＋細胞，ＰＤＧＦＲα＋細胞からの心筋細胞への分化の検討
ＥＳ細胞としてＥＢ５細胞を用いた。ＥＢ５細胞は０．１％ゼラチンコートした６ｃｍ培養皿で、培養液（１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養した。０．１％ゼラチンコートは、０．１％ゼラチン（Nakarai Japan）／蒸留水を培養皿上に積層し常温で固相化することによって行った。
【００４８】
分化誘導は、１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養することによって行った。分化誘導後、経時的にフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ解析）を行うことによってＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの発現を測定した。
Ｆｌｋ１抗体としてはマウスモノクローナル抗体「ＡＶＡＳ１２α１」（理化学研究所、西川氏より供与された）を用い、ビオチン標識した後、ＦＡＣＳ解析を行った。該解析は「ｃａｌｉｂｕｒ」及び「Ａｒｉａ」（ともにＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を使用して行った。ＣＤ４４抗体は、ＢＤバイオサイエンス社のＣｌｏｎｅ ＩＭ７を、ＰＤＧＦＲα抗体は、理化学研究所 西川氏より供与されたＣｌｏｎｅ ＡＰＡ５をＢｉｏｔｉｎ標識したものを使用した。Ｆｌｋ１抗体についてはShin-Ichi Nishikawa et al. Development, 1998 vol. 125 p.1747-1757及びKataoka H et al. Dev Growth Differ. 1997 vol. 39, p.729-740等に詳述されている。
結果を図３に示す。
分化誘導５日目の細胞からＦｌｋ１＋細胞をソーティングした。得られたＦｌｋ１＋細胞をストローマ細胞ＯＰ９上で共培養した。
ストローマ細胞ＯＰ９と共培養することによりＥＳ細胞が血液細胞、神経細胞、リンパ球等へと分化誘導されることは既に知られており（Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747、Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Ogawa et al. Blood 1999 93;(4):1168-77）、本実施例においても心筋細胞への分化を期待してストローマ細胞ＯＰ９との共培養を行った。尚、ＯＰ９細胞はＡＴＣＣ等の公的機関からも入手可能であり、本実施例においてはコダマ氏より供与された。
またコントロールとしてＦｌｋ１−細胞についても同様にストローマＯＰ９細胞との共培養を行い、心筋細胞への分化を検討した。
セルソーターにて分離した細胞群（３．６×１０4細胞ずつ）をＯＰ９と６ｃｍ培養皿上で分化培地（上述）にて７日間培養した。
ＯＰ９との共培養から７日経過した時点で心筋細胞の出現率（拍動細胞のコロニー数）について確認した。結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
さらに、７日目に拍動している細胞集団（コロニー）をカルチャーリング（ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｉｎｇ）にて採取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ−ＰＣＲ）解析に供し、Ｆｌｋ１＋細胞由来の拍動細胞コロニーについて心筋分化マーカーの発現を確認した。合成したプライマーは以下の通り。
・Ｎｋｘ２−５
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｇｇｇｃｇｇａｔａａａａａａｇａｇｃｔ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔ（配列番号２）
・ＧＡＴＡ４
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇａｃａｃｃｃｃａａｔｃｔｃｇａｔ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｇｃｃｃｃａｃａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ（配列番号４）
・αＭＨＣ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｃｔｇａｃａｇａｔｃｇｇｇａｇａａｔｃａｇ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｔｇｇｃａａａｇｔａｃｔｇｇａｔｇａｃａ（配列番号６）
・ＭＬＣ２ｖ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇａｃｃａｔｔｃｔｃａａｃｇｃａｔｔｃａａｇ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｔｃａｇｃａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃａｔａｇｔ（配列番号８）
・ＭＬＣ２ａ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃａｇｃｔｇｃａｔｔｇａｃｃａｇａａｃａ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃｔｇｇｇａａｔａｇｇｔｃｔｃｃｔｔ（配列番号１０）
・Ｔｂｘ５
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｇａａｃｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇａａ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｔｇｇｔｇａｔ（配列番号１２）
・ｃＴｎＴ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｃｃｔｃａａａｇａｃａｇｇａｔｃｇａａ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔｔｃｔ（配列番号１４）
・Ｆｌｋ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｇａｇａｃａｇａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａａｃ（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａａａｃｔｇｇｔｇｔｇａｇｔｇａｔｔｃｇ（配列番号１６）
・ｃ−Ｋｉｔ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇｃｇｔｇａｃｔｃｇｔｔｔａｔｔｔｔｃ（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｇｃａｇａａｇｇｔｔ（配列番号１８）
・ＨＡＮＤ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｔｃｃｃｔｃｇｔｔｇｃｃｔａｃａｇａａａ（配列番号１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃａａｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇａｃ（配列番号２０）
・ＨＡＮＤ２
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｃａｇｃｔａｃａｔｃｇｃｃｔａｃｃｔｃａｔ（配列番号２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｔｔｃａｃｇｔｃｇｇｔｃｔｔｃｔｔｇａｔｃ（配列番号２２）
・ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｔｇｇｃｃａａａｇａｃｃｃｔｇａｃａａ（配列番号２３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｇｇａａｇａａｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔ（配列番号２４）
・ＰＣＡＭ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｔｇｃａｇａａｇｔｃｔｔｔｃａｇｇａｔｔｃａ（配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａｔａｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｔｇａｇｔ（配列番号２６）
いずれのマーカーの発現も他のコロニー群に比べて顕著に増加していた。
【００５１】
Ｆｌｋ１＋細胞をＯＰ９と共培養するとＦｌｋ１−細胞をＯＰ９と共培養したときよりも高頻度に拍動細胞が認められ。この拍動細胞は心筋マーカーを発現していることから、心筋細胞であることが確認できた。
【００５２】
以下さらに実施例を挙げて本発明を説明するが、細胞培養技術や細胞の単離技術等は特に言及しない限り実施例１に準じて行う。
【００５３】
実施例２：中胚葉分化誘導系における表面抗原の検討
Ｆｌｋ１の発現がピークになる分化誘導５日目の中胚葉系細胞の表面抗原の解析を行った。解析は各表面抗原に対する特異抗体を用い、免疫細胞染色を行った。表面抗原に対する特異抗体のうち、抗Ｆｌｋ１抗体、抗ＰＤＧＦＲα抗体以外はすべてＢＤバイオサイエンス社より入手した。抗Ｆｌｋ１抗体、抗ＰＤＧＦＲα抗体は理化学研究所 西川氏より供与されたものを用いた。抗Ｇｒ１抗体及び抗Ｍａｃ１抗体については４００倍希釈、それ以外の抗体は２００倍希釈にて反応に供した。抗ＰＤＧＦＲα、Ｆｌｋ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ a２，ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ b１，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ b７抗体はｂｉｏｔｉｎラベルされていたので２次抗体としてストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７を４００倍希釈で使用した。
分化誘導は概ね実施例１と同様な手法に基づくが、実験プロトコールを図４に示す。
ＰＤＧＦＲα、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１抗原等が、分化とともにその発現量を増強させた。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例３：Ｆｌｋ１／ＰＤＧＦＲαと心筋細胞出現率の関係の検討
細胞集団をＦｌｋ１＋／−，ＰＤＧＦＲα＋／−の４つの分画にそれぞれソーティングし、実施例１と同様にして心筋分化誘導を行い、拍動コロニーの出現率を測定した。実験プロトコールを模式的に示し（図４）、結果を図５に示す。
ＰＤＧＦＲα及びＦｌｋ１を共発現している心筋前駆細胞をストローマ細胞ＯＰ９と共培養した場合に拍動コロニー数が顕著に増加した。
【００５６】
実施例４：ヒト臍帯血からの心筋前駆細胞分離
＜プロトコール＞
臍帯血全血を、生理食塩水にて２倍希釈し、ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭＴｕｂｅ（ｗｗｗ．ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ−ｐｏｃ．ｃｏｍ）による比重遠心分離法にて、単核球分画を得、ＭＡＣＳ（登録名）ビーズ−抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体（ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉ．ｃｏｍ）と反応後、自動細胞分離装置ａｕｔｏＭＡＣＳＴＭにて、ＣＤ３４陽性単核球を得る。心筋前駆細胞群を、メチルセルロース培養（培養条件以下）にて、培養皿底に付着する細胞コロニー群を集めることによって得た。本細胞群について定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を未分化増殖培地（培養条件以下）にて５日間培養した細胞群をコントロールとした。
＜心筋前駆細胞を得るための「メチルセルロース培養」の条件＞
・ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ＋Ｈ４４３５ （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｒｉｔａｓｔｋ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｄｂ／ｓｈｏ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｔ＝１＆Ｓｈｏ＝０２００＆Ｃｈｕ＝０１００＃ＭｅｔｈｏＣｕｌｔＧＦ＋Ｈ４４３５参照）を使用。
・αＭＥＭ １０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）にサイトカインカクテル（１００ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＳＣＦ， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＩＬ−６， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ｓＩＬ−６Ｒ， １０ｎｇ ｒｈ ＴＰＯ， ３０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ Ｆｌｔ２／３Ｌ；「ｒｈ」はヒト組み換え体であることを示す）を混合したものにて３日間培養した１００個のＣＤ３４＋細胞を１．２ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ＧＦ＋Ｈ４４３５とともに３ｃｍ培養皿に播く。
＜「未分化増殖培地」を用いた培養の条件＞
・２×１０４ＣＤ３４＋細胞（純度９８％）を、αＭＥＭ １０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）にサイトカインカクテル（１００ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＳＣＦ， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ＩＬ−６， ５０ｎｇ／ｍｌ ｈｒ ｓＩＬ−６Ｒ， １０ｎｇ ｒｈ ＴＰＯ， ３０ｎｇ／ｍｌ ｒｈ Ｆｌｔ２／３Ｌ；「ｒｈ」はヒト組み換え体であることを示す）を混合したものにて５日間培養する。
＜データ＞
得られた臍帯血ＣＤ３４陽性細胞由来の付着細胞の表面マーカー（ＰＤＧＦＲα、ＫＤＲ（ヒトのＦｌｋ−１））についてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＧＡＰＤＨ ｃｏｎｔｒｏｌ）により解析した。両表面マーカーともに心筋前駆細胞群で発現の増加がみられた（図６）。
【００５７】
配列表フリーテキスト
配列番号１：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号７：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号８：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号９：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１０：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１１：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１２：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１３：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１４：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１５：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１７：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１８：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１９：ＨＡＮＤ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２０：ＨＡＮＤ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２１：ＨＡＮＤ２のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２２：ＨＡＮＤ２のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２３：ＶＥ−ＣａｄｈｅｒｉｎのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２４：ＶＥ−ＣａｄｈｅｒｉｎのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号２５：ＰＣＡＭ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２６：ＰＣＡＭ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、本発明の心筋前駆細胞単離用デバイスあるいは心筋前駆細胞投与用デバイスの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、磁気細胞分離法による〔Ｆｌｋ１＋，ＰＤＧＦＲα＋〕細胞の分離方法の概略図である。
【図３】図３はＥＢ５細胞の分化誘導におけるＦｌｋ１、ＣＤ４４及びＰＤＧＦＲαの経時的発現の結果を示す図である。
【図４】図４はＥＢ５細胞の中胚葉分化誘導系における表面抗原を検討する際の実験プロトコールを模式化したものである。
【図５】ソーティングしたＦｌｋ１＋／ＰＤＧＦＲα＋細胞について心筋分化誘導（ＯＰ９上での共培養）を行い、得られた拍動コロニーの数を示すグラフである。
【図６】臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をメチルセルロース培養して培養皿底に付着した細胞について、その表面マーカー（ＰＤＧＦＲα及びＫＤＲ（ヒトのＦｌｋ１））の発現を調べた結果を示す図である。白カラムがメチルセルロース培養前の細胞、黒カラムがメチルセルロース培養後の培養皿底に付着した細胞の結果を示す。メチルセルロース培養後に得られる心筋前駆細胞群で両表面マーカーの発現の増加が見られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項２】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項３】
少なくとも２種の蛋白質がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαを全て発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項５】
中胚葉細胞が幹細胞由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
【請求項１２】
ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程が、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質が抗ＰＤＧＦＲα抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
【請求項１９】
心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１１記載の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程
を含む方法。
【請求項２０】
工程(ｉ)における心筋前駆細胞の被検物質の存在下あるいは非存在下での培養を、ストローマ細胞の共存下で実施することを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
【請求項２２】
幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
【請求項２３】
少なくとも２種がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現状況を測定し、工程（ｉｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子として認定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段のうち、少なくとも２つの手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項２７】
少なくとも２つの手段が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及びＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段である、請求項２６記載のデバイス。
【請求項２８】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項２９】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、請求項２６または２８記載のデバイス。
【請求項３０】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３１】
ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３２】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【請求項３４】
心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、請求項３３記載のデバイス。
【請求項３５】
心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである請求項３４記載のデバイス。
【請求項３６】
移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、請求項３５記載のデバイス。
【請求項３７】
移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、請求項３５記載のデバイス。
【請求項１】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも１種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項２】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質の発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαからなる群より選択される少なくとも２種の蛋白質を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項３】
少なくとも２種の蛋白質がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程、および（ｉｉ）ＣＤ４４、Ｆｌｋ１およびＰＤＧＦＲαを全て発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項５】
中胚葉細胞が幹細胞由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
【請求項１２】
ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＤＧＦＲαの発現を解析する工程が、ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質が抗ＰＤＧＦＲα抗体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
【請求項１９】
心筋前駆細胞から心筋細胞への分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１１記載の心筋前駆細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、もう一方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した心筋前駆細胞について拍動の有無、及び／又は心筋マーカーの発現を測定する工程、
（ｉｉｉ）被検物質の存在下あるい非存在下で培養した心筋前駆細胞について、拍動が確認されたか、あるいは心筋マーカーの発現が確認された細胞、若しくは拍動が確認され、且つ心筋マーカーの発現が確認された細胞を心筋細胞とし、その出現率を算出する工程、および
（ｉｖ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて有意に心筋細胞の出現率を上昇させた被検物質を心筋細胞への分化を誘導し得る因子と認定する工程
を含む方法。
【請求項２０】
工程(ｉ)における心筋前駆細胞の被検物質の存在下あるいは非存在下での培養を、ストローマ細胞の共存下で実施することを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも１種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
【請求項２２】
幹細胞から心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子のスクリーニング方法であって、
（ｉ）幹細胞を２群にわけ、一方を被検物質の存在下で培養し、他方を被検物質の非存在下で培養する工程、
（ｉｉ）被検物質の存在下あるいは非存在下で培養した幹細胞について、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現状況を測定する工程、及び
（ｉｉｉ）被検物質の非存在下で培養した場合に比べて、ＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαからなる少なくとも２種の発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子と認定する工程、
を含む方法。
【請求項２３】
少なくとも２種がＦｌｋ１及びＰＤＧＦＲαである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現状況を測定し、工程（ｉｉｉ）においてＣＤ４４、Ｆｌｋ１及びＰＤＧＦＲαの全ての発現を有意に上昇させた被検物質を心筋前駆細胞への中胚葉系分化を誘導し得る因子として認定する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段のうち、少なくとも２つの手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項２７】
少なくとも２つの手段が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及びＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段である、請求項２６記載のデバイス。
【請求項２８】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、及び（ｃ）ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段を含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項２９】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、請求項２６または２８記載のデバイス。
【請求項３０】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３１】
ＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＰＤＧＦＲαを発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＰＤＧＦＲα抗体固定化固相担体である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３２】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれか１項に記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【請求項３４】
心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、請求項３３記載のデバイス。
【請求項３５】
心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである請求項３４記載のデバイス。
【請求項３６】
移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、請求項３５記載のデバイス。
【請求項３７】
移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、請求項３５記載のデバイス。
【図１】
【図３】
【図５】
【図２】
【図４】
【図６】
【図３】
【図５】
【図２】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２００６−５０９７４（Ｐ２００６−５０９７４Ａ）
【公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３５４２５（Ｐ２００４−２３５４２５）
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０２１００１３８）株式会社カルディオ (13)
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０２１００１３８）株式会社カルディオ (13)
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
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