扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法および予後予測用キット
【課題】本発明は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を簡便に予測できる方法と、当該方法で用い得る予後予測用キットを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法、および扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
扁平上皮がんは扁平重層上皮などの基底細胞が悪性化したものである。よって、基底細胞組織は全てがん化する可能性があるが、主な扁平上皮がんは、子宮頸部、頭頸部、食道、肺などで発生する。その中でも我が国における子宮頸がんの発生頻度は１６，０００〜１８，０００人／年と多く、年間約５，０００人が亡くなっている。子宮頸がんは主に５０歳代の女性に発生するが、近年では若年層患者が増加しており、問題になっている。
【０００３】
がんの治療方法としては、主として抗がん剤の投与などの化学療法、外科的手術および放射線療法が挙げられ、それぞれに一長一短がある。また、各治療手段に対する感受性はがんの種類や重篤度などによっても異なるので、がんの種類などに応じて治療手段が選択されることがある。
【０００４】
例えば扁平上皮がんは放射線に対する感受性が高く、外科的手術と同等の効果が得られることもあるので、放射線による治療が行われることが多い。特にＩＩＩ期以上にまで進行した子宮頸がんの場合には、放射線療法が主に選択される。
【０００５】
しかし、がんに対する治療効果は、がん種のみならず個人差が大きいという事実がある。例えば子宮頸がんは、放射線療法のみで治癒することもある一方で、放射線治療後に再発することがあり、さらに遠隔転移した場合の５年相対生存率は１０％にも満たないとのデータがある。よって、放射線治療後における予後が予測できれば、より効果的な治療が可能になり得る。
【０００６】
より具体的には、予後が良好であると予測できる患者に対しては、有害な放射線の照射量を低減したり、或いは抗がん剤の併用は控えるなどして患者の肉体的または経済的な負担を軽減することができる。それに対して、予後が良好でないと予測できる患者には、抗がん剤を積極的に併用して再発を未然に防ぎ得る。
【０００７】
このような予後の判定方法が、特許文献１に記載されている。当該技術では、Ｍｅｔタンパク質のリン酸化が乳がんの予後に関係するとの知見に基づいて、リン酸化Ｍｅｔタンパク質とは結合するが非リン酸化Ｍｅｔタンパク質とは結合しないモノクローナル抗体を利用して、悪性領域と正常領域におけるＭｅｔタンパク質のリン酸化状態を比較することにより予後を判定している。また、本発明者は、これまでにも放射線治療に対する子宮頸がん患者の感受性と遺伝子の発現状態などとの関係につき研究を進めていた（非特許文献１など）。
【０００８】
しかし、上記技術ではがん組織を採取する必要があり、特に特許文献１の技術ではがん組織のみならず正常組織からも試料を作製する必要がある。それでは患者に苦痛を与え、また、手間がかかるため迅速に判断できないという問題がある。
【０００９】
ところで、アポリポタンパク質は血漿リポタンパク質から脂質部分を除いたタンパク質部分であって、リポタンパク質を構成するのみならず、補酵素として働くものもある。例えばアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、リポタンパク質から脂質を切り離すリポプロテインリパーゼを活性化する作用を有する。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの発現異常は、高脂血症に深く関係する。例えばアポリポタンパク質が遺伝的に欠損するために起こるアポＣ−ＩＩ欠損症では、血清トリグリセライド濃度が著しく上昇し、腹痛発作や急性膵炎が引き起こされる。
【００１０】
そこで、高脂血症や動脈硬化症などの診断のために、ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを測定する方法や、当該方法に用いるモノクローナル抗体が、特許文献２に記載されている。
【００１１】
しかし、これまでアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩとがんとの関係は一切知られていない。特許文献２でも、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに関係する疾患としては高脂血症と動脈硬化症が記載されているのみであり、また、その実施例では単に試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの濃度が測定されているだけであって、その測定値と疾患との関係は全く確認されていない。
【特許文献１】特表２００３−５０６０２１号公報
【非特許文献１】Yoko HARIMAら，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ラジエーション・オンコロジー・バイオロジー・フィジックス（Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.），第６０巻，第２３７〜２４８頁（２００４年）
【特許文献２】特開平２−２６５４９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様に、扁平上皮がんは放射線療法に対する感受性が高いものの、その後に再発する場合と再発しない場合がある。例えば子宮頸がんの場合、その５年後における累積生存率は４５〜５０％とほぼ五分五分であり、このことからも扁平上皮がんに対する放射線治療後の予後の判断は非常に難しいことが分かる。その一方で、効率的な治療のためには迅速な判断が求められる。
【００１３】
そこで本発明が解決すべき課題は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を簡便に予測できる方法、および当該方法で用い得る予後予測用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、ある血漿タンパク質の発現量が、扁平上皮がんの放射線治療後における再発の可能性と有意に相関することを見出して本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
上記方法は、特に子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するために有用である。上記方法は、がんの分類を考慮すれば、およそ扁平上皮がん一般に適用可能であると考えられるが、子宮頸がんに対する本発明方法の有効性は、本発明者による実験により実証されている。
【００１７】
上記方法において、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定するための手段としては、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法またはＥＬＩＳＡが好適である。これら方法の有効性は、本発明者により実験的に確認されている。
【００１８】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットは、上記方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする。
【００１９】
上記予後予測用キットも、子宮頸がんの放射線治療後における予後の予測検査において、特に有用である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法は、放射線療法による扁平上皮がんの治療後における再発リスクを簡便に判定することができる。それによって、再発の可能性が高いと判定された場合には、例えば治療後に抗がん剤の投与を積極的に行うなどして再発可能性を低減し得る。一方、再発の可能性が低いと判定された場合には、例えば抗がん剤を併用することなく予後のモニタリングを定期的に継続するのみとするなどして、患者の肉体的および精神的な苦痛の軽減を図ることが可能になる。よって、本発明方法と試薬キットは、扁平上皮がん患者の効率的な再発防止に寄与し得るものとして非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明方法により予後を予測すべき扁平上皮がんの種類は、特に制限されない。例えば、子宮頸部、舌や口腔などの頭頸部、食道や直腸などの消化器官、肺などにおける扁平上皮がんを挙げることができる。少なくとも、本発明方法は、子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測できることが、本発明者による実験により実証されている。
【００２３】
本発明方法は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を予測するために用いられる。予後の予測とは、扁平上皮がんに対する放射線治療がいったん終了した後、同組織で或いは別組織においてがんが再発するか否かを予測することをいう。即ち、扁平上皮がんに対する放射線治療後において、患者の血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの濃度が高ければ再発の可能性は低いといえ、同濃度が低ければ再発の可能性が高いといえる。
【００２４】
本発明方法では、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する。
【００２５】
血液試料の種類は特に制限されず、血液自体、血漿、血清のいずれも含まれる。但し、本発明方法の測定対象であるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは血漿タンパク質であり、その他の水不溶成分は測定誤差の要因になり得るので、好適には血清試料を用いる。なお、血漿や血清を得る方法としては常法を適用すればよく、より具体的には遠心分離や濾過を用いればよい。
【００２６】
本発明方法は、ヒトのみならず他の温血動物に対しても有効であると考えられることから、血液試料としてはヒト由来のもののみならず、他の温血動物由来のものも用いることができる。
【００２７】
本発明方法では血液試料を用いることから、実施の際に患者から組織を切除して試料とする必要はなく、血液を採取すればよい。よって、本発明方法では、患者に与える苦痛がより低減されている。
【００２８】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、リポタンパク質の構成成分であって、リポタンパク質から脂質を切断するリポプロテインリパーゼを活性化する作用を有する。アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、先天性アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ欠損症によるＩ型高脂血症の診断指標として用いられるが、従来、がんとの関連性は知られていない。それに対して本発明では、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩをがんの予後を簡便に予測するための指標として用いる。
【００２９】
本発明方法で測定するアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの絶対量や濃度に限定されず、相対的な量や濃度であってもよい。即ち、本発明方法で測定されるべきアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の種類は、測定手段などにより異なる。
【００３０】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段は特に制限されず、常法を用いればよい。例えば、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法、ＥＬＩＳＡなどを用いることができる。
【００３１】
ＴＯＦ−ＭＳとしては、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど、特に制限なく利用することができる。
【００３２】
例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合には、少なくともアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを吸着できるプロテインチップに血液試料中のタンパク質を吸着し、適切なバッファーで洗浄した後、マススペクトル測定を行う。この場合、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は、相対的なピーク強度として表れる。なお、本発明者の知見によれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは陽イオン交換チップと陰イオン交換チップには吸着されたが、逆相チップと銅修飾チップには吸着されなかった。また、陰イオン交換チップを用いた場合であっても、洗浄用バッファーのｐＨや塩濃度によってはアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩが溶出する場合もあり得る。
【００３３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合は、例えばトリプシンなどにより血液試料中のタンパク質を選択的に切断した上でマススペクトル測定を行い、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特有のペプチド断片のピーク強度を求めることが考えられる。
【００３４】
マススペクトル測定におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの分子量は、測定誤差により測定するごとに多少異なる可能性がある。よって、８．９０±０．０５ｋＤａ程度、より好ましくは８．９０±０．０２ｋＤａ程度の範囲で予備実験などによりアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩのピークを特定した上で判断することが必要である場合があり得る。
【００３５】
免疫比濁法を利用する場合、血液試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的な抗体を結合させた上で特定の光を照射し、生じた不溶性複合体の量に応じた濁度を測定することによりアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を求める。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は濁度に応じた相対値として得られるが、事前に作成した検量線を用いることによって、絶対的な量や濃度を求めることも可能である。
【００３６】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を免疫比濁法により測定するための試薬キットは市販もされているので、それを用いてもよい。
【００３７】
ＥＬＩＳＡとしては、直接吸着法とサンドイッチ法の何れも利用することができる。何れにしても、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特異的な抗体を用いることが好ましい。
【００３８】
なお、本発明方法で用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも用いることができる。これら抗体は、常法により調製することができる。例えばアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特異的なモノクローナル抗体は、精製されたアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００３９】
本発明方法においてＥＬＩＳＡを利用した場合の結果は、発光強度などタンパク質の検出手段に応じた相対的な値として得られる。
【００４０】
本発明者の知見によれば、放射線治療を受けた扁平上皮がん患者のうち予後が良好であった群と予後が不良であった群の間では、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量に明らかに有意差があり、予後不良群の血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の方が明らかに少なかった。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段に応じて、予備実験などにより予後良好群と予後不良群との閾値を事前に決定することで、扁平上皮がんの放射線治療後における予後の予測が可能になる。
【００４１】
実際には、予後良好群と予後不良群の定義や、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段によって、閾値は変わり得る。従って、一般的な基準が無い段階では、本発明方法の実施者が測定手段や閾値を予備実験などにより事前に決定した上で、測定を行う必要がある。
【００４２】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定は、効率的な治療の選択のために初診時など放射線治療前に行ってもよいし、治療効果判定のために、放射線治療や放射線治療後に行ってもよい。
【００４３】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットは、本発明方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする。
【００４４】
当該抗体は、扁平上皮がん患者の血液試料中に含まれるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的に結合し、その量の測定に役立つ。特に当該試薬キットは、ＥＬＩＳＡや免疫比濁法を用いた本発明方法の実施のために有用である。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４６】
実施例１ 予後に関係する血漿タンパク質の同定
過去１０年の間、主治医が患者本人とその家族と直接面談し、研究以外で用いないことや個人情報を公表しないこと等を説明し、且つ同意を得た上で採取・分離した血清試料であって、−８０℃で関西医科大学の冷凍庫に保存されていたものを用いた。かかる血清試料の中から、放射線治療を受けた子宮頸がん患者であって放射線治療から３年以上再発しなかった患者（以下、「予後良好群」という）８名、放射線治療を受けた子宮頸がん患者であって放射線治療から半年以内に再発した患者（以下、「予後不良群」という）４名の血清試料を選択し、さらに健常人４名から血清試料を得た。凍結した血清試料は氷上で融解した。各血清試料を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上澄を実験に用いた。
【００４７】
得られた各血清試料上澄２０μＬを９６ウェルフォーマットマイクロプレートに加え、さらに３０μＬのＵ９バッファー（９Ｍ尿素／２％ＣＨＡＰＳ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９）を加え、４℃で２０分間振盪した。別途、強陰イオン交換樹脂（ＰＡＬＬ社製、製品名「Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ ＤＦ」）をｐＨ９の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで平衡化した上で、５０％樹脂スラリーとした。当該樹脂スラリー１８０μＬを９６ウェルフォーマットマイクロプレートのウェルに加え、さらにＵ１バッファー（Ｕ９バッファーを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で９倍に希釈したもの）２００μＬを加えてから除去する操作を３回行って平衡化した。上記各血清試料上澄を樹脂スラリーのウェルに添加した。血清試料が添加されていたウェルをＵ１バッファー５０μＬで洗浄し、当該洗浄液も樹脂スラリーウェルに添加した上で、４℃で３０分間振盪した。樹脂スラリーウェルの液体分（非吸着画分）を回収した後、１００μＬの下記洗浄バッファー１を樹脂に加え、当該洗浄バッファー１も回収した。残った樹脂へ下記洗浄バッファー２を樹脂に１００μＬ加えては回収する操作を２回ずつ行い、次いで下記洗浄バッファー３を用いて同様の操作を行って、段階的なｐＨ勾配によりタンパク質を溶出させた。最後に、樹脂へ強固に結合したタンパク質を溶出するために、下記洗浄バッファー４を１００μＬ加えては回収する操作を２回行った。
洗浄バッファー１： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ９
洗浄バッファー２： １００ｍＭ酢酸ナトリウム／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ５．８
洗浄バッファー３： １００ｍＭ酢酸ナトリウム／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ４
洗浄バッファー４： ３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
【００４８】
陽イオン交換プロテインチップ（ＢｉｏＲａｄ社製、製品名「ＣＭ１０」）の各スポットに、洗浄バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７）を１５０μＬずつ添加し、室温で５分間振盪してから洗浄バッファーを除去するという操作を２回繰り返し、チップ表面を平衡化した。次に、洗浄バッファー４により溶出されたフラクションの１０μＬに、Ｕ９バッファー９０μＬを加えて１０倍に希釈した。当該希釈試料をチップのスポットに１０μＬずつ添加し、室温で３０分間振盪して試料中のタンパク質をチップ表面に吸着させた。次いで、スポット当り１５０μＬの洗浄バッファーを加え、室温で５分間振盪した後に液体分を除去する操作を３回繰り返し、チップ表面に結合していない分子を除去した。さらにスポット当り２００μＬの超純水を加えた後に液体分を除去する操作を２回繰り返して脱塩した。
【００４９】
チップを風乾した後、エネルギー吸収分子であるシナピン酸の飽和水溶液を１μＬずつ各スポットに添加した上でさらに風乾するという操作を２回繰り返した。得られたプロテインチップについて、ＢｉｏＲａｄ社製のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ ＳＥＬＤＩシステムＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩ Ｃを用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより各分子量に対する相対強度チャートを得た。データの取得は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ３．２とＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより行った。標準測定範囲は、低分子領域データとして３，０００〜１０，０００ｍ／ｚ、高分子領域データとして１０，０００〜３０，０００ｍ／ｚ、最高測定分子量は、低分子領域データとして１００，０００ｍ／ｚ、高分子領域データとして２００，０００ｍ／ｚとした。得られたチャートから、各群間で相対強度が異なる分子量を探索したところ、ｍ／ｚ＝８９１８のピークが候補に挙がった。当該ピーク強度を定量化したところ、当該ピークの相対強度は健常人群で０．９４６〜１．３２６、予後良好群で０．７１３〜１．３９６、予後不良群で０．５３０〜０．８４７に分布しており、平均値はそれぞれ１．０９２、１．０２９、０．７３２であった。各平均値の有意差をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−テストにより検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．２３４と有意差はなかったものの、健常人群−予後不良群間と予後良好群−予後不良群間では、それぞれｐ＝０．０２１およびｐ＝０．０２７とｐ＜０．０５で有意差が見られた。
【００５０】
従って、本発明に係る血漿タンパク質であり、測定誤差を考慮して分子量が８９１８±５０であるものは、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測に用いることができるバイオマーカータンパク質であることが実証された。また、当該タンパク質に対する抗体は、当該タンパク質の血清濃度を測定するために用い得ることから、同様に扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測に用いることができる。
【００５１】
実施例２ バイオマーカータンパク質の同定
上記実施例１で特定されたｍ／ｚ＝８９１８のタンパク質を精製した上で、同定した。具体的な実験条件は、以下のとおりである。
【００５２】
（１） タンパク質の精製
健常人の血清サンプル（２００μＬ）を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を得た。得られた上澄に９Ｍ尿酸バッファー（ｐＨ７，３００μＬ）とＵ１バッファー（５００μＬ）を加えて５倍に希釈した。別途、陰イオン交換カラム（GE Healthcare製，Q Sepharose Fast Flow，１ｍＬ）を４倍量のバッファー（ｐＨ９）で３回洗浄して平衡化した後、上記血清上澄の分画に使用した。溶出液は、酢酸バッファー（ｐＨ５）、酢酸バッファー（ｐＨ４）、クエン酸バッファー（ｐＨ３）を各１ｍＬずつ用い、最後に３３．３％イソプロパノール／１６．７％酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸の混合溶媒で溶出した。得られた各フラクションを陰イオン交換基固定チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析したところ、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質は有機溶媒画分に含まれていた。
【００５３】
上記有機溶媒画分（２ｍＬ）を７５０μＬまで濃縮した上で、酢酸バッファー（ｐＨ４，１．５ｍＬ）を加えた。別途、陽イオン交換カラム（GE Healthcare製，CM Sepharose Fast Flow，１００μＬ）を５倍量のバッファー（ｐＨ４）で３回洗浄して平衡化した後、上記有機溶媒画分の分画に使用した。溶出液は、酢酸バッファー（ｐＨ４）を用い、その塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから１０００ｍＭまで段階的に高くし、最後に３３．３％イソプロパノール／１６．７％酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸の混合溶媒で溶出した。得られた各フラクションを陰イオン交換基固定チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析したところ、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質は有機溶媒画分に含まれていた。
【００５４】
さらに、上記有機溶媒画分を、以下の条件の逆相ＨＰＬＣで精製した。
カラム： 東ソー社製，ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ，１×５０ｍｍ
流速： ５３μＬ／分
検出光波長： ２１０ｎｍ
溶媒： ０．１％ＴＦＡと９０％アセトニトリル／０．１％を用い、９０％アセトニトリル／０．１％の割合を、０→３０％（５分間）→７０％（４０分間）とした
【００５５】
５３μＬずつのフラクションに分画し、各フラクションを順相チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析し、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を含むフラクションを合わせた。
【００５６】
さらに、上記フラクションを、以下の条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
ポリアクリルアミドゲル濃度： １５％
ゲルサイズ： １ｍｍ×６ｃｍ×８．５ｃｍ
サンプルバッファー： ２％ＳＤＳ／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２％ＤＴＴ（ｐＨ６．８）
泳動条件： 室温，３０ｍＡ
染色法： ＣＢＢ染色，銀染色ＭＳキット（和光純薬製）を使用
【００５７】
ゲルから各バンドを切り出し、５０％ギ酸／２５％アセトニトリル／１５％イソプロパノール／１０％水の混合溶媒中で２時間振とうすることにより、タンパク質を溶出させた。得られた各タンパク質を順相チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析し、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を特定した。なお、当該タンパク質のｍ／ｚは、測定誤差のため、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの測定結果ごとに多少異なっていた。
【００５８】
（２） タンパク質の同定
ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を含む上記アクリルアミドゲルのバンドを切り出し、５０％メタノール／１０％酢酸（４００μＬ）、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，４００μＬ）、５０％アセトニトリル／０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，４００μＬ）、１００％アセトニトリル（５０μＬ）中、室温で１時間ずつ振とうし、最後にアセトニトリルを減圧留去して、脱色と脱水を行った。１０ｎｇ／μＬのトリプシンを含んだ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８，１０μＬ）へ、得られた試料を添加し、３７℃で一晩静置することによりタンパク質を分解した。反応液へ５０％アセトニトリル／５％ＴＦＡ（２５μＬ）を添加し、室温で３０分間振とうして試料溶液とした。当該試料溶液を、順相チップ上の１スポット当たり５μＬずつ添加して風乾し、さらに２０％ＣＨＣＡ／５０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡ（０．５μＬ）で２回洗浄した。
【００５９】
当該チップを用い、ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）と、ＭＳ／ＭＳを用いたフラグメント分析でタンパク質を同定した。データベースは、ＮＣＢＩｎｒを用いた。これらいずれの分析からも、精製されたタンパク質はヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩであるとの結果が得られた。ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの配列を配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）に示す。なお、配列番号１中、１〜３０および３９〜７９のアミノ酸配列はＰＭＦ法でヒットした領域であり、１〜１９および３９〜５５のアミノ酸配列はＭＳ／ＭＳを用いたフラグメント分析でヒットした領域である。この事実からも、本発明に係るバイオマーカータンパク質がアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩであるとの判断の正確性は極めて高いといえる。
【００６０】
実施例３ 再現実験
新たに健常人群９例、予後良好群１８例、予後不良群１０例の血清試料を採取し、上記実施例１と同様の条件で、各血清試料中におけるヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の相対値を測定した。得られた結果を棒グラフとして図１に示す。
【００６１】
図１のとおり、予後不良群に１例異常値が見られるものの、予後不良群の相対値はおしなべて健常人群と予後良好群よりも低いといえる。また、結果について有意差検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．８０と有意差はなかったものの、健常人群−予後不良群間と予後良好群−予後不良群間では、それぞれｐ＝０．０１４およびｐ＝０．００１１とｐ＜０．０５で有意差が見られた。よって、ＴＯＦ−ＭＳを用いた血清試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ量の相対強度を利用した予後予測方法の再現性が示された。
【００６２】
実施例４ 免疫比濁法を利用した本発明方法
上記実施例３で用いたサンプルと同様の血清試料中におけるヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ測定試薬（積水メディカル社製，試薬名「アポＣ−ＩＩオート・Ｎ「第一」」）を用い、免疫比濁法により測定した。
【００６３】
具体的には、先ず各血清試料（３０μＬ）を生理食塩水（１２０μＬ）で希釈した。当該希釈試料（１０．１μＬ）へ１００ｍｍｏｌ／Ｌの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール緩衝液（ｐＨ８．５，６０μＬ）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、１０Ｕ／ｍＬの抗ヒトアポリポ蛋白Ｃ−ＩＩヤギポリクローナル抗体（２０μＬ）を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その後、反応混合液における特定波長（正：３４０ｎｍ，副：８０５ｎｍ）の吸光度を測定した。得られた結果を、棒グラフとして図２に示す。
【００６４】
各群の測定値（相対強度）の平均値±標準偏差は、健常人群：３．５±１．５０、予後良好群：４．０±１．３７、予後不良群：２．６±１．７７であった。また、得られた結果について有意差検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．７１、健常人群−予後不良群間ではｐ＝０．３６、予後良好群−予後不良群間ではｐ＝０．０５１と、いずれもｐ＜０．０５で有意差は見られなかった。
【００６５】
また、ＴＯＦ−ＭＳを用いた上記実施例３の方法と免疫比濁法を用いた上記結果を比較したところ、健常人群ではｐ＝０．００５，ｒ＝０．８３４という強い相関が見られたが、予後良好群での相関はｐ＝０．１４２，ｒ＝０．３６と弱いものであり、予後不良群での相関はｐ＝０．０６０，ｒ＝０．３６と中程度のものであった。しかし、図１と図２のグラフを比較すると、全体的には同様の傾向が見られるといえる。以上の結果より、本発明方法は、多少精度が劣るおそれはあるものの、より簡便な免疫比濁法を利用して実施できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＴＯＦ−ＭＳを用いた本発明方法の実施結果を示す棒グラフである。
【図２】免疫比濁法を用いた本発明方法の実施結果を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法、および扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
扁平上皮がんは扁平重層上皮などの基底細胞が悪性化したものである。よって、基底細胞組織は全てがん化する可能性があるが、主な扁平上皮がんは、子宮頸部、頭頸部、食道、肺などで発生する。その中でも我が国における子宮頸がんの発生頻度は１６，０００〜１８，０００人／年と多く、年間約５，０００人が亡くなっている。子宮頸がんは主に５０歳代の女性に発生するが、近年では若年層患者が増加しており、問題になっている。
【０００３】
がんの治療方法としては、主として抗がん剤の投与などの化学療法、外科的手術および放射線療法が挙げられ、それぞれに一長一短がある。また、各治療手段に対する感受性はがんの種類や重篤度などによっても異なるので、がんの種類などに応じて治療手段が選択されることがある。
【０００４】
例えば扁平上皮がんは放射線に対する感受性が高く、外科的手術と同等の効果が得られることもあるので、放射線による治療が行われることが多い。特にＩＩＩ期以上にまで進行した子宮頸がんの場合には、放射線療法が主に選択される。
【０００５】
しかし、がんに対する治療効果は、がん種のみならず個人差が大きいという事実がある。例えば子宮頸がんは、放射線療法のみで治癒することもある一方で、放射線治療後に再発することがあり、さらに遠隔転移した場合の５年相対生存率は１０％にも満たないとのデータがある。よって、放射線治療後における予後が予測できれば、より効果的な治療が可能になり得る。
【０００６】
より具体的には、予後が良好であると予測できる患者に対しては、有害な放射線の照射量を低減したり、或いは抗がん剤の併用は控えるなどして患者の肉体的または経済的な負担を軽減することができる。それに対して、予後が良好でないと予測できる患者には、抗がん剤を積極的に併用して再発を未然に防ぎ得る。
【０００７】
このような予後の判定方法が、特許文献１に記載されている。当該技術では、Ｍｅｔタンパク質のリン酸化が乳がんの予後に関係するとの知見に基づいて、リン酸化Ｍｅｔタンパク質とは結合するが非リン酸化Ｍｅｔタンパク質とは結合しないモノクローナル抗体を利用して、悪性領域と正常領域におけるＭｅｔタンパク質のリン酸化状態を比較することにより予後を判定している。また、本発明者は、これまでにも放射線治療に対する子宮頸がん患者の感受性と遺伝子の発現状態などとの関係につき研究を進めていた（非特許文献１など）。
【０００８】
しかし、上記技術ではがん組織を採取する必要があり、特に特許文献１の技術ではがん組織のみならず正常組織からも試料を作製する必要がある。それでは患者に苦痛を与え、また、手間がかかるため迅速に判断できないという問題がある。
【０００９】
ところで、アポリポタンパク質は血漿リポタンパク質から脂質部分を除いたタンパク質部分であって、リポタンパク質を構成するのみならず、補酵素として働くものもある。例えばアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、リポタンパク質から脂質を切り離すリポプロテインリパーゼを活性化する作用を有する。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの発現異常は、高脂血症に深く関係する。例えばアポリポタンパク質が遺伝的に欠損するために起こるアポＣ−ＩＩ欠損症では、血清トリグリセライド濃度が著しく上昇し、腹痛発作や急性膵炎が引き起こされる。
【００１０】
そこで、高脂血症や動脈硬化症などの診断のために、ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを測定する方法や、当該方法に用いるモノクローナル抗体が、特許文献２に記載されている。
【００１１】
しかし、これまでアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩとがんとの関係は一切知られていない。特許文献２でも、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに関係する疾患としては高脂血症と動脈硬化症が記載されているのみであり、また、その実施例では単に試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの濃度が測定されているだけであって、その測定値と疾患との関係は全く確認されていない。
【特許文献１】特表２００３−５０６０２１号公報
【非特許文献１】Yoko HARIMAら，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ラジエーション・オンコロジー・バイオロジー・フィジックス（Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.），第６０巻，第２３７〜２４８頁（２００４年）
【特許文献２】特開平２−２６５４９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した様に、扁平上皮がんは放射線療法に対する感受性が高いものの、その後に再発する場合と再発しない場合がある。例えば子宮頸がんの場合、その５年後における累積生存率は４５〜５０％とほぼ五分五分であり、このことからも扁平上皮がんに対する放射線治療後の予後の判断は非常に難しいことが分かる。その一方で、効率的な治療のためには迅速な判断が求められる。
【００１３】
そこで本発明が解決すべき課題は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を簡便に予測できる方法、および当該方法で用い得る予後予測用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、ある血漿タンパク質の発現量が、扁平上皮がんの放射線治療後における再発の可能性と有意に相関することを見出して本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
上記方法は、特に子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するために有用である。上記方法は、がんの分類を考慮すれば、およそ扁平上皮がん一般に適用可能であると考えられるが、子宮頸がんに対する本発明方法の有効性は、本発明者による実験により実証されている。
【００１７】
上記方法において、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定するための手段としては、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法またはＥＬＩＳＡが好適である。これら方法の有効性は、本発明者により実験的に確認されている。
【００１８】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットは、上記方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする。
【００１９】
上記予後予測用キットも、子宮頸がんの放射線治療後における予後の予測検査において、特に有用である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法は、放射線療法による扁平上皮がんの治療後における再発リスクを簡便に判定することができる。それによって、再発の可能性が高いと判定された場合には、例えば治療後に抗がん剤の投与を積極的に行うなどして再発可能性を低減し得る。一方、再発の可能性が低いと判定された場合には、例えば抗がん剤を併用することなく予後のモニタリングを定期的に継続するのみとするなどして、患者の肉体的および精神的な苦痛の軽減を図ることが可能になる。よって、本発明方法と試薬キットは、扁平上皮がん患者の効率的な再発防止に寄与し得るものとして非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明方法により予後を予測すべき扁平上皮がんの種類は、特に制限されない。例えば、子宮頸部、舌や口腔などの頭頸部、食道や直腸などの消化器官、肺などにおける扁平上皮がんを挙げることができる。少なくとも、本発明方法は、子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測できることが、本発明者による実験により実証されている。
【００２３】
本発明方法は、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を予測するために用いられる。予後の予測とは、扁平上皮がんに対する放射線治療がいったん終了した後、同組織で或いは別組織においてがんが再発するか否かを予測することをいう。即ち、扁平上皮がんに対する放射線治療後において、患者の血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの濃度が高ければ再発の可能性は低いといえ、同濃度が低ければ再発の可能性が高いといえる。
【００２４】
本発明方法では、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する。
【００２５】
血液試料の種類は特に制限されず、血液自体、血漿、血清のいずれも含まれる。但し、本発明方法の測定対象であるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは血漿タンパク質であり、その他の水不溶成分は測定誤差の要因になり得るので、好適には血清試料を用いる。なお、血漿や血清を得る方法としては常法を適用すればよく、より具体的には遠心分離や濾過を用いればよい。
【００２６】
本発明方法は、ヒトのみならず他の温血動物に対しても有効であると考えられることから、血液試料としてはヒト由来のもののみならず、他の温血動物由来のものも用いることができる。
【００２７】
本発明方法では血液試料を用いることから、実施の際に患者から組織を切除して試料とする必要はなく、血液を採取すればよい。よって、本発明方法では、患者に与える苦痛がより低減されている。
【００２８】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、リポタンパク質の構成成分であって、リポタンパク質から脂質を切断するリポプロテインリパーゼを活性化する作用を有する。アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは、先天性アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ欠損症によるＩ型高脂血症の診断指標として用いられるが、従来、がんとの関連性は知られていない。それに対して本発明では、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩをがんの予後を簡便に予測するための指標として用いる。
【００２９】
本発明方法で測定するアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの絶対量や濃度に限定されず、相対的な量や濃度であってもよい。即ち、本発明方法で測定されるべきアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の種類は、測定手段などにより異なる。
【００３０】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段は特に制限されず、常法を用いればよい。例えば、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法、ＥＬＩＳＡなどを用いることができる。
【００３１】
ＴＯＦ−ＭＳとしては、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど、特に制限なく利用することができる。
【００３２】
例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合には、少なくともアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを吸着できるプロテインチップに血液試料中のタンパク質を吸着し、適切なバッファーで洗浄した後、マススペクトル測定を行う。この場合、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は、相対的なピーク強度として表れる。なお、本発明者の知見によれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩは陽イオン交換チップと陰イオン交換チップには吸着されたが、逆相チップと銅修飾チップには吸着されなかった。また、陰イオン交換チップを用いた場合であっても、洗浄用バッファーのｐＨや塩濃度によってはアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩが溶出する場合もあり得る。
【００３３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いる場合は、例えばトリプシンなどにより血液試料中のタンパク質を選択的に切断した上でマススペクトル測定を行い、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特有のペプチド断片のピーク強度を求めることが考えられる。
【００３４】
マススペクトル測定におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの分子量は、測定誤差により測定するごとに多少異なる可能性がある。よって、８．９０±０．０５ｋＤａ程度、より好ましくは８．９０±０．０２ｋＤａ程度の範囲で予備実験などによりアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩのピークを特定した上で判断することが必要である場合があり得る。
【００３５】
免疫比濁法を利用する場合、血液試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的な抗体を結合させた上で特定の光を照射し、生じた不溶性複合体の量に応じた濁度を測定することによりアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を求める。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量は濁度に応じた相対値として得られるが、事前に作成した検量線を用いることによって、絶対的な量や濃度を求めることも可能である。
【００３６】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を免疫比濁法により測定するための試薬キットは市販もされているので、それを用いてもよい。
【００３７】
ＥＬＩＳＡとしては、直接吸着法とサンドイッチ法の何れも利用することができる。何れにしても、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特異的な抗体を用いることが好ましい。
【００３８】
なお、本発明方法で用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも用いることができる。これら抗体は、常法により調製することができる。例えばアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに特異的なモノクローナル抗体は、精製されたアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩを用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００３９】
本発明方法においてＥＬＩＳＡを利用した場合の結果は、発光強度などタンパク質の検出手段に応じた相対的な値として得られる。
【００４０】
本発明者の知見によれば、放射線治療を受けた扁平上皮がん患者のうち予後が良好であった群と予後が不良であった群の間では、血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量に明らかに有意差があり、予後不良群の血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の方が明らかに少なかった。よって、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段に応じて、予備実験などにより予後良好群と予後不良群との閾値を事前に決定することで、扁平上皮がんの放射線治療後における予後の予測が可能になる。
【００４１】
実際には、予後良好群と予後不良群の定義や、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定手段によって、閾値は変わり得る。従って、一般的な基準が無い段階では、本発明方法の実施者が測定手段や閾値を予備実験などにより事前に決定した上で、測定を行う必要がある。
【００４２】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の測定は、効率的な治療の選択のために初診時など放射線治療前に行ってもよいし、治療効果判定のために、放射線治療や放射線治療後に行ってもよい。
【００４３】
本発明に係る扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キットは、本発明方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする。
【００４４】
当該抗体は、扁平上皮がん患者の血液試料中に含まれるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩへ特異的に結合し、その量の測定に役立つ。特に当該試薬キットは、ＥＬＩＳＡや免疫比濁法を用いた本発明方法の実施のために有用である。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４６】
実施例１ 予後に関係する血漿タンパク質の同定
過去１０年の間、主治医が患者本人とその家族と直接面談し、研究以外で用いないことや個人情報を公表しないこと等を説明し、且つ同意を得た上で採取・分離した血清試料であって、−８０℃で関西医科大学の冷凍庫に保存されていたものを用いた。かかる血清試料の中から、放射線治療を受けた子宮頸がん患者であって放射線治療から３年以上再発しなかった患者（以下、「予後良好群」という）８名、放射線治療を受けた子宮頸がん患者であって放射線治療から半年以内に再発した患者（以下、「予後不良群」という）４名の血清試料を選択し、さらに健常人４名から血清試料を得た。凍結した血清試料は氷上で融解した。各血清試料を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上澄を実験に用いた。
【００４７】
得られた各血清試料上澄２０μＬを９６ウェルフォーマットマイクロプレートに加え、さらに３０μＬのＵ９バッファー（９Ｍ尿素／２％ＣＨＡＰＳ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９）を加え、４℃で２０分間振盪した。別途、強陰イオン交換樹脂（ＰＡＬＬ社製、製品名「Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ ＤＦ」）をｐＨ９の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで平衡化した上で、５０％樹脂スラリーとした。当該樹脂スラリー１８０μＬを９６ウェルフォーマットマイクロプレートのウェルに加え、さらにＵ１バッファー（Ｕ９バッファーを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で９倍に希釈したもの）２００μＬを加えてから除去する操作を３回行って平衡化した。上記各血清試料上澄を樹脂スラリーのウェルに添加した。血清試料が添加されていたウェルをＵ１バッファー５０μＬで洗浄し、当該洗浄液も樹脂スラリーウェルに添加した上で、４℃で３０分間振盪した。樹脂スラリーウェルの液体分（非吸着画分）を回収した後、１００μＬの下記洗浄バッファー１を樹脂に加え、当該洗浄バッファー１も回収した。残った樹脂へ下記洗浄バッファー２を樹脂に１００μＬ加えては回収する操作を２回ずつ行い、次いで下記洗浄バッファー３を用いて同様の操作を行って、段階的なｐＨ勾配によりタンパク質を溶出させた。最後に、樹脂へ強固に結合したタンパク質を溶出するために、下記洗浄バッファー４を１００μＬ加えては回収する操作を２回行った。
洗浄バッファー１： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ９
洗浄バッファー２： １００ｍＭ酢酸ナトリウム／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ５．８
洗浄バッファー３： １００ｍＭ酢酸ナトリウム／０．１％ ＯＧＰ、ｐＨ４
洗浄バッファー４： ３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
【００４８】
陽イオン交換プロテインチップ（ＢｉｏＲａｄ社製、製品名「ＣＭ１０」）の各スポットに、洗浄バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７）を１５０μＬずつ添加し、室温で５分間振盪してから洗浄バッファーを除去するという操作を２回繰り返し、チップ表面を平衡化した。次に、洗浄バッファー４により溶出されたフラクションの１０μＬに、Ｕ９バッファー９０μＬを加えて１０倍に希釈した。当該希釈試料をチップのスポットに１０μＬずつ添加し、室温で３０分間振盪して試料中のタンパク質をチップ表面に吸着させた。次いで、スポット当り１５０μＬの洗浄バッファーを加え、室温で５分間振盪した後に液体分を除去する操作を３回繰り返し、チップ表面に結合していない分子を除去した。さらにスポット当り２００μＬの超純水を加えた後に液体分を除去する操作を２回繰り返して脱塩した。
【００４９】
チップを風乾した後、エネルギー吸収分子であるシナピン酸の飽和水溶液を１μＬずつ各スポットに添加した上でさらに風乾するという操作を２回繰り返した。得られたプロテインチップについて、ＢｉｏＲａｄ社製のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ ＳＥＬＤＩシステムＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩ Ｃを用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより各分子量に対する相対強度チャートを得た。データの取得は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ３．２とＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより行った。標準測定範囲は、低分子領域データとして３，０００〜１０，０００ｍ／ｚ、高分子領域データとして１０，０００〜３０，０００ｍ／ｚ、最高測定分子量は、低分子領域データとして１００，０００ｍ／ｚ、高分子領域データとして２００，０００ｍ／ｚとした。得られたチャートから、各群間で相対強度が異なる分子量を探索したところ、ｍ／ｚ＝８９１８のピークが候補に挙がった。当該ピーク強度を定量化したところ、当該ピークの相対強度は健常人群で０．９４６〜１．３２６、予後良好群で０．７１３〜１．３９６、予後不良群で０．５３０〜０．８４７に分布しており、平均値はそれぞれ１．０９２、１．０２９、０．７３２であった。各平均値の有意差をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−テストにより検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．２３４と有意差はなかったものの、健常人群−予後不良群間と予後良好群−予後不良群間では、それぞれｐ＝０．０２１およびｐ＝０．０２７とｐ＜０．０５で有意差が見られた。
【００５０】
従って、本発明に係る血漿タンパク質であり、測定誤差を考慮して分子量が８９１８±５０であるものは、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測に用いることができるバイオマーカータンパク質であることが実証された。また、当該タンパク質に対する抗体は、当該タンパク質の血清濃度を測定するために用い得ることから、同様に扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測に用いることができる。
【００５１】
実施例２ バイオマーカータンパク質の同定
上記実施例１で特定されたｍ／ｚ＝８９１８のタンパク質を精製した上で、同定した。具体的な実験条件は、以下のとおりである。
【００５２】
（１） タンパク質の精製
健常人の血清サンプル（２００μＬ）を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を得た。得られた上澄に９Ｍ尿酸バッファー（ｐＨ７，３００μＬ）とＵ１バッファー（５００μＬ）を加えて５倍に希釈した。別途、陰イオン交換カラム（GE Healthcare製，Q Sepharose Fast Flow，１ｍＬ）を４倍量のバッファー（ｐＨ９）で３回洗浄して平衡化した後、上記血清上澄の分画に使用した。溶出液は、酢酸バッファー（ｐＨ５）、酢酸バッファー（ｐＨ４）、クエン酸バッファー（ｐＨ３）を各１ｍＬずつ用い、最後に３３．３％イソプロパノール／１６．７％酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸の混合溶媒で溶出した。得られた各フラクションを陰イオン交換基固定チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析したところ、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質は有機溶媒画分に含まれていた。
【００５３】
上記有機溶媒画分（２ｍＬ）を７５０μＬまで濃縮した上で、酢酸バッファー（ｐＨ４，１．５ｍＬ）を加えた。別途、陽イオン交換カラム（GE Healthcare製，CM Sepharose Fast Flow，１００μＬ）を５倍量のバッファー（ｐＨ４）で３回洗浄して平衡化した後、上記有機溶媒画分の分画に使用した。溶出液は、酢酸バッファー（ｐＨ４）を用い、その塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから１０００ｍＭまで段階的に高くし、最後に３３．３％イソプロパノール／１６．７％酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸の混合溶媒で溶出した。得られた各フラクションを陰イオン交換基固定チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析したところ、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質は有機溶媒画分に含まれていた。
【００５４】
さらに、上記有機溶媒画分を、以下の条件の逆相ＨＰＬＣで精製した。
カラム： 東ソー社製，ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｓｕｐｅｒ ＯＤＳ，１×５０ｍｍ
流速： ５３μＬ／分
検出光波長： ２１０ｎｍ
溶媒： ０．１％ＴＦＡと９０％アセトニトリル／０．１％を用い、９０％アセトニトリル／０．１％の割合を、０→３０％（５分間）→７０％（４０分間）とした
【００５５】
５３μＬずつのフラクションに分画し、各フラクションを順相チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析し、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を含むフラクションを合わせた。
【００５６】
さらに、上記フラクションを、以下の条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
ポリアクリルアミドゲル濃度： １５％
ゲルサイズ： １ｍｍ×６ｃｍ×８．５ｃｍ
サンプルバッファー： ２％ＳＤＳ／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２％ＤＴＴ（ｐＨ６．８）
泳動条件： 室温，３０ｍＡ
染色法： ＣＢＢ染色，銀染色ＭＳキット（和光純薬製）を使用
【００５７】
ゲルから各バンドを切り出し、５０％ギ酸／２５％アセトニトリル／１５％イソプロパノール／１０％水の混合溶媒中で２時間振とうすることにより、タンパク質を溶出させた。得られた各タンパク質を順相チップとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析し、ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を特定した。なお、当該タンパク質のｍ／ｚは、測定誤差のため、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの測定結果ごとに多少異なっていた。
【００５８】
（２） タンパク質の同定
ｍ／ｚ＝８９１８付近のタンパク質を含む上記アクリルアミドゲルのバンドを切り出し、５０％メタノール／１０％酢酸（４００μＬ）、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，４００μＬ）、５０％アセトニトリル／０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，４００μＬ）、１００％アセトニトリル（５０μＬ）中、室温で１時間ずつ振とうし、最後にアセトニトリルを減圧留去して、脱色と脱水を行った。１０ｎｇ／μＬのトリプシンを含んだ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８，１０μＬ）へ、得られた試料を添加し、３７℃で一晩静置することによりタンパク質を分解した。反応液へ５０％アセトニトリル／５％ＴＦＡ（２５μＬ）を添加し、室温で３０分間振とうして試料溶液とした。当該試料溶液を、順相チップ上の１スポット当たり５μＬずつ添加して風乾し、さらに２０％ＣＨＣＡ／５０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡ（０．５μＬ）で２回洗浄した。
【００５９】
当該チップを用い、ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）と、ＭＳ／ＭＳを用いたフラグメント分析でタンパク質を同定した。データベースは、ＮＣＢＩｎｒを用いた。これらいずれの分析からも、精製されたタンパク質はヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩであるとの結果が得られた。ヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの配列を配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１）に示す。なお、配列番号１中、１〜３０および３９〜７９のアミノ酸配列はＰＭＦ法でヒットした領域であり、１〜１９および３９〜５５のアミノ酸配列はＭＳ／ＭＳを用いたフラグメント分析でヒットした領域である。この事実からも、本発明に係るバイオマーカータンパク質がアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩであるとの判断の正確性は極めて高いといえる。
【００６０】
実施例３ 再現実験
新たに健常人群９例、予後良好群１８例、予後不良群１０例の血清試料を採取し、上記実施例１と同様の条件で、各血清試料中におけるヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量の相対値を測定した。得られた結果を棒グラフとして図１に示す。
【００６１】
図１のとおり、予後不良群に１例異常値が見られるものの、予後不良群の相対値はおしなべて健常人群と予後良好群よりも低いといえる。また、結果について有意差検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．８０と有意差はなかったものの、健常人群−予後不良群間と予後良好群−予後不良群間では、それぞれｐ＝０．０１４およびｐ＝０．００１１とｐ＜０．０５で有意差が見られた。よって、ＴＯＦ−ＭＳを用いた血清試料中のアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ量の相対強度を利用した予後予測方法の再現性が示された。
【００６２】
実施例４ 免疫比濁法を利用した本発明方法
上記実施例３で用いたサンプルと同様の血清試料中におけるヒトアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ測定試薬（積水メディカル社製，試薬名「アポＣ−ＩＩオート・Ｎ「第一」」）を用い、免疫比濁法により測定した。
【００６３】
具体的には、先ず各血清試料（３０μＬ）を生理食塩水（１２０μＬ）で希釈した。当該希釈試料（１０．１μＬ）へ１００ｍｍｏｌ／Ｌの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール緩衝液（ｐＨ８．５，６０μＬ）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、１０Ｕ／ｍＬの抗ヒトアポリポ蛋白Ｃ−ＩＩヤギポリクローナル抗体（２０μＬ）を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その後、反応混合液における特定波長（正：３４０ｎｍ，副：８０５ｎｍ）の吸光度を測定した。得られた結果を、棒グラフとして図２に示す。
【００６４】
各群の測定値（相対強度）の平均値±標準偏差は、健常人群：３．５±１．５０、予後良好群：４．０±１．３７、予後不良群：２．６±１．７７であった。また、得られた結果について有意差検定したところ、健常人群−予後良好群間ではｐ＝０．７１、健常人群−予後不良群間ではｐ＝０．３６、予後良好群−予後不良群間ではｐ＝０．０５１と、いずれもｐ＜０．０５で有意差は見られなかった。
【００６５】
また、ＴＯＦ−ＭＳを用いた上記実施例３の方法と免疫比濁法を用いた上記結果を比較したところ、健常人群ではｐ＝０．００５，ｒ＝０．８３４という強い相関が見られたが、予後良好群での相関はｐ＝０．１４２，ｒ＝０．３６と弱いものであり、予後不良群での相関はｐ＝０．０６０，ｒ＝０．３６と中程度のものであった。しかし、図１と図２のグラフを比較すると、全体的には同様の傾向が見られるといえる。以上の結果より、本発明方法は、多少精度が劣るおそれはあるものの、より簡便な免疫比濁法を利用して実施できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＴＯＦ−ＭＳを用いた本発明方法の実施結果を示す棒グラフである。
【図２】免疫比濁法を用いた本発明方法の実施結果を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を予測するための方法であって、
血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するためのものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定するための手段として、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法またはＥＬＩＳＡを用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キット。
【請求項５】
子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するためのものである、請求項４に記載の予後予測用キット。
【請求項１】
扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後を予測するための方法であって、
血液試料中におけるアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するためのものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩの量を測定するための手段として、ＴＯＦ−ＭＳ、免疫比濁法またはＥＬＩＳＡを用いる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法に使用されるものであり、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩに対する抗体を含むことを特徴とする、扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測用試薬キット。
【請求項５】
子宮頸がんに対する放射線治療後における予後を予測するためのものである、請求項４に記載の予後予測用キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−７５０９２（Ｐ２００９−７５０９２Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１４９９２（Ｐ２００８−２１４９９２）
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（５００４０９２１９）学校法人関西医科大学 (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（５００４０９２１９）学校法人関西医科大学 (36)
【Ｆターム（参考）】
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