抗体の安定性試験
抗体は、改変過程及び分解過程を受け得る、生物学的な巨大分子である。抗体特異的分解産物を分離及び特徴づけるための新規なＬＣ/ＭＳに基づいた方法が本出願書に記載されており、これには、酵素ＩｄｅＳを使用して重鎖を開裂する酵素消化工程が含まれている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景情報
製薬産業分野では、近年、とりわけ、酵素、抗体及びサイトカイン（例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、プラスミノーゲンアクチベーターなど）に基づいた製品が非常に成功を収めている。タンパク質治療剤に対する世界中からの要望は年々増している。治療モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ、monoclonal antibodies）は、タンパク質治療薬の中でも重要な一群である。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、単一の抗体形成細胞に由来する免疫細胞（細胞クローン）により分泌されるので、モノクローナルと呼ばれる。モノクローナル抗体の特徴は、それらは各々、免疫原性物質の１つのエピトープのみに指向され、従って、１つの抗原性決定基に対してのみ指向され、それ故、疾病の処置において非常に特異的に使用され得るということである。タンパク質治療薬の例としては、Roche Diagnostics GmbH社のモノクローナル抗体のトラスツズマブ（市販名：ハーセプチン）、ダクリズマブ（市販名：ゼナパックス）及びリツキシマブ（市販名：マブセラ）があり、これらは、とりわけ乳ガン（トラスツズマブ）の処置に、臓器拒絶（ダクリズマブ）の処置に、そして非ホジキンリンパ腫（リツキシマブ）の処置に成功裏に使用されている。
【０００２】
治療モノクローナル抗体は、複雑なバイオテクノロジー過程により得られる。その作製、製剤化、及び保存中に分解産物が形成される場合があり、これは、酸化反応及び脱アミド化反応並びにタンパク質分解的開裂のような過程に起因することが多い（Yan, B., et al., J. Chromatog. A 1164 (2007) 153-161)。生物学的製品の改変により、たとえ改変の程度がほんの僅かであったとしても、分子中の構造的変化に起因する活性及び／又は免疫原性の変化が起こり得る。
【０００３】
バイオ医薬品の品質は、その作用と共に大変に重要である。それ故、治療剤として安全に使用されるためには、作用機序を詳細に調査することに加えて、タンパク質に基づいた薬物の同一性、純度及び活性を測定することは絶対的に不可欠である。
【０００４】
ｍＡｂｓは、様々な分離技術及び試験技術により成功裏に分析することができるが、長年、ＲＰ−ＨＰＬＣ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー）を適用及び最適化することにより、抗体種を分離することは困難であった。しかしながら、分解過程の経過で抗体の様々な改変型が同時に存在することが多いため、多様なクロマトグラフィーバンド及び電気泳動バンドの分析がより困難となっている。高分解能質量分析計を接続された液体クロマトグラフィー分離法（ＬＣ／ＭＳ、液体クロマトグラフィー／質量分析計）による分析により、様々な種の正確な質量に関する情報が得られ、これにより、抗体変種の同定が容易になる（Dillon, T.M., et al., J. Chromatogr. A, 1053 (2004) 299-305)。
【０００５】
ヒト病原体の化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するシステインエンドプロテアーゼＩｄｅＳ（免疫グロブリン分解酵素Ｓ、Immunoglobulin degrading enzyme S）は、Ｍａｃ−１又はｓｉｂ−３８とも呼ばれているが、これは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）抗体の重鎖を特異的に開裂するシステインプロテアーゼである。ＩｇＧは、これまで知られている中で唯一のＩｄｅＳの基質である(Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549)。ＩｄｅＳは、２９アミノ酸を含むシグナルペプチドを含んだ３３９アミノ酸からなり（von Pawel-Rammingen, U., et al., EMBO J. 21 (2002) 1607-1615）、ここでアミノ酸２１４〜２１６によりＲＧＤモチーフが形成されている。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧ（Ｇクラス免疫グロブリン）のアミノ酸２３６と２３７（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の間を開裂し、この部位は、認識配列ＬＬＧＧＰに含まれている。ヒトＩｇＧ２は、認識モチーフＰＶＡＧＰの中のアミノ酸アラニンとグリシンの間で開裂される。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３型のマウス抗体も開裂される（Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549）。
【０００６】
Hess, J.K., et al. (Hess, J.K., et al., J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291)は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いてＩｄｅＳの酵素活性を測定するための質量分光法を報告している。化膿性連鎖球菌から単離され、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、米国公開特許第２００７／０２３７７８４号に報告されている。抗体のＦｃ又はＦａｂ断片の形成法が、欧州特許出願第ＥＰ１４５８８６１号に報告されている。Ａ群ストレプトコッカス由来のＩｄｅＳプロテアーゼが、国際公開公報第２００６／１３１３４７号に報告されている。
【０００７】
発明の要約
本発明は、試料中の抗体及び抗体断片又は改変型の抗体を検出する方法を記載しており、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた溶液中に含まれるインタクトな抗体を検出、及び抗体の断片もしくは改変型を検出する工程
を含むことを特徴とする。
【０００８】
該方法の１つの態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼはＩｄｅＳである。更なる態様において、システインプロテアーゼＩｄｅＳは、化膿性連鎖球菌又はトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）に由来する。他の更なる態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の態様は、ｐＨ範囲５．５〜８．５におけるＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションを含む。別の態様において、ｐＨ範囲はｐＨ７．０〜８．０であり、更なる態様においてはｐＨ７．５〜８．０である。他の更なる態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと、試料中に含まれる抗体及び／又は抗体断片のモル比は、１：２５から１：２５００であり、好ましくは１：２５から１：１００である。別の態様において、グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）である。別の態様は、Ｎ−グリコシダーゼＦが、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）に由来していることを特徴とする（EC 3.2.2.18, EC 3.5.1.52）。別の態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨであり、ｐＨ６．０〜６．５で使用される。別の態様において、グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。別の態様において、該方法は、ａ）で得られた試料を、まず最初に、ｂ）の下でＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、その後、グリコシダーゼと共にインキュベートすることを特徴とする。別の態様はまた、還元剤がリン酸トリクロロエチル（ＴＣＥＰ）であるものである。別の態様は、還元剤がギ酸と同時に加えられ、インキュベーションは両試薬の存在下で行なわれるものである。更なる態様は、還元剤とのインキュベーションが、６０℃以上の温度において行なわれるものである。更なる態様において、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。他の更なる態様において、液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はπ−π相互作用クロマトグラフィーである。疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、別の態様におけるクロマトグラフィーリガンドは、孔サイズ３００Åのクロマトグラフィー材料に結合したＣ８又はＣ１８リガンドのいずれかであるか、あるいは、π−π相互作用クロマトグラフィーの場合ではクロマトグラフィーリガンドはジフェニルリガンドである。更なる態様において、液体クロマトグラフィーに、Jupiter C18カラム又はZorbax 300SB C8カラム又はPursuitジフェニルカラムのいずれかが使用される。別の態様においてPursuitジフェニルカラムが使用される。更なる態様において、工程ｃ）の液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーである。本発明の別の局面は、改変型の抗体を検出する方法であり、この方法において、工程ｃ）では、ｂ）でインキュベートされた試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析している。
【０００９】
本発明は更に、試料中の抗体又は抗体断片を検出するためのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼの使用を包含し、ここでは、試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、そしてグリコシダーゼと共にインキュベートした後、得られた断片を液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする。
【００１０】
本発明の局面はまた、抗体又は抗体断片を検出するためのキットであり、該キットは、
ｉ）化膿性連鎖球菌に由来するＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカムに由来するエンドグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含む。
【００１１】
詳細な説明
本研究は、治療モノクローナル抗体の分解産物及び改変体の分析に関し、これらは、例えば、抗体の作製中、抗体の保存中に、又は抗体の製剤化中のストレス条件により形成される。
【００１２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共に連結しているアミノ酸からなるポリマーである。酵素的に作製されても合成的に作製されてもよい。２０未満のアミノ酸を含むポリペプチドは、「ペプチド」ともいう。
【００１３】
「タンパク質」は、２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む巨大分子であるか、あるいは、１００を超えるアミノ酸からなるポリペプチドである。タンパク質はまた、非ペプチド性成分、例えば炭水化物を含んでいてもよい。炭水化物及び他の非ペプチド性改変が、タンパク質を発現する細胞により加えられ、それ故、細胞型に依存する。本出願では、タンパク質はそのアミノ酸配列により規定される。炭水化物などの改変は、明記されていないが、常に存在していてもよい。
【００１４】
本出願において同義語として使用される用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、少なくとも２本のポリペプチド軽鎖（ＬＣ）及び２本のポリペプチド重鎖（ＨＣ）を含む分子のことをいう。ポリペプチド軽鎖及び重鎖の各々が可変領域（通常、ポリペプチドのアミノ末端）を含み、これには抗原との結合のための結合ドメインが含まれている。ポリペプチド重鎖及び軽鎖の各々が定常領域（通常、ポリペプチドのカルボキシ末端）を含み、これは、例えば、細胞への抗体の結合に関与している。軽ポリペプチドすなわち軽鎖（ＬＣ）は、通常、可変ドメインＶＬ及び定常ドメインＣＬから構成される。重ポリペプチドすなわち重鎖（ＨＣ）は、通常、可変ドメインＶＨ及び定常領域から構成され、この定常領域は、ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４により構成される。抗体は、数多くの形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに、単鎖（ｓｃＦｖ）で存在し得る（例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; and Hood, L. E., et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd Edition (1984) and Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。抗体（免疫グロブリン、Ｉｇ）は、抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて様々なクラスに分類される：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのクラスのいくつかは、更に、亜クラス（アイソタイプ）へと亜分類され、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４へと、あるいは、ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２へと亜分類される。重鎖の定常領域は、抗体が属するクラスに応じて、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）及びμ（ＩｇＭ）と称される。
【００１５】
一般的なクロマトグラフィー法、例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.); Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, D.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York、は当業者には公知である。
【００１６】
抗体は、改変過程及び分解過程を受け得る、生物学的な巨大分子である。これらの過程は、酵素的（触媒的）過程又は非酵素的（非触媒的）過程に基づき得る（Perkins, M., et al., Pharm. Res. 17 (2000) 1110-1117）。起こることの多い非酵素的分解反応の例が以下に記載されている。
【００１７】
アミノ酸の酸化
抗体の酸化は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸の共有結合的な改変に相当し、これは、反応性酸素種により誘発される。殆ど全てのアミノ酸が原則的には酸化され得るが、メチオニン（Ｍ）及びトリプトファン（Ｗ）が最も酸化に対して感受性が高い。これらのアミノ酸の酸化（図１参照）は、非常に多くの異なるタンパク質において起こり、その生物学的活性を低下または消失させたり、凝集を誘発したり、タンパク質分解を促進したりすることが多いために特に関心が高い（Houde, D., et al., J. Chromatogr. A 1123 (2006) 189-198）。メチオニンからメチオニンスルホキシドへと単純に酸化されることにより、酸化種においてΔｍ＝＋１６Daの質量差が生じる。トリプトファンは通常２回酸化されて、その結果、Δｍ＝＋３２Daの質量差が生じる。更なる反応において、２回酸化型のトリプトファンはキヌレニンへと再編成され、その結果、Δｍ＝＋４Daの質量差が生じる。
【００１８】
アミノ酸の脱アミド化
抗体分子中のアミノ酸の脱アミド化は、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）において起こり得る。しかしながら、通常、アスパラギンで起こる。更に、特定のアミノ酸配列及びアミノ酸組合せ、例えばアスパラギンとグリシン（ＮＧ）、アスパラギンとセリン（ＮＳ）、及びアスパラギンとトレオニン（ＮＴ）が特に受け易い。アスパラギンの脱アミド化が、保存中の生物学的分子の分解の主な原因である。折り畳まれたインタクトな抗体の脱アミド化は、最初、ストレスの高い条件下でゆっくりとしか起こらない。抗体の３次元構造が例えば、還元及び酵素的開裂後に破壊された場合に、脱アミド化が促進される。なぜなら、これらの場合、アミノ酸は、周囲の媒体とより反応し易くなるからである（図２）。アスパラギンは、中間体産物の形態の環式アミド（スクシンイミド）を形成し得、これは自発的に加水分解されることにより、イソアスパルチルペプチドとアスパルチルペプチドの約３：１の比の混合物が生じる（Chelius, D., et al., Anal. Chem. 77 (2005) 6004-6011）。この反応は、塩基性ｐＨ値において優先的に起こる。脱アミド化種のΔｍ＝＋１Daの質量差は、アスパラギンからアスパルテート及びイソアスパルテートへの脱アミド化の結果として起こる。１０kDaを超える分子量を有するペプチド及びタンパク質の場合、現在の質量分析計を使用してΔｍ＝＋１Daの質量差を直接検出することは不可能か又は非常に困難である。更に、荷電分布の変化、より正確には荷電の不均一性の変化が起こる。
【００１９】
チオエーテル結合の形成
非還元性チオエーテル架橋の形成は、モノクローナル抗体、特にＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体で頻繁に観察される現象である。これは、抗体の重鎖と軽鎖を共に連結しているか、又は、軽鎖及び重鎖を分子内的に安定化している、ジスルフィド架橋の中の硫黄原子の消失に基づく。この抗体の改変は、ストレスの高い条件下、この場合では特に高いｐＨ値において好まれる。このような反応はβ脱離であると推定される（Cohen, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc., 129 (2007) 6976-6977）。チオエーテル架橋の形成中に硫黄原子が失われるので、これにより、還元されていない改変された抗体種ではΔｍ＝−３２Daの質量差が生じる。これに対して、このジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ）は抗体の還元中に２つのＳＨ基へと開裂される。この理由から、還元された抗体成分における生じる質量差は、Δｍ＝−３４Daである。
【００２０】
断片の形成
ストレスにより誘発される断片化反応は、通常、タンパク質のポリペプチド鎖中のペプチド結合の加水分解性開裂、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の加水分解性開裂に基づく。タンパク質分解及びこのようなペプチド結合の加水分解は、原則的には、全てのアミノ酸の間で起こり得、特に、立体的緊張、又は、加水分解を好む他のアミノ酸の側鎖が存在する場合に起こり得る。
【００２１】
抗体の特異的開裂
モノクローナル抗体は、非常に大きなタンパク質であり、更に、その重鎖の糖構造に因り極めて不均一（微小不均一）である。分解産物及び改変体の形成について抗体を調べるために、分析前により小さな断片へと開裂することが便宜である。それ故、試料調製の一部としての抗体の開裂は、分析調査を実施する際の重要な方法である。殆どの場合、抗体はジスルフィド架橋の還元によりその重鎖及び軽鎖へと単純に分解される。しかしながら、更に、他の抗体開裂法も存在する。
【００２２】
ジスルフィド架橋の開裂
ＩｇＧ分子に存在する全てのジスルフィド架橋は、還元により開裂することができる。抗体の遊離の重鎖及び軽鎖が、還元中に得られる。トリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、抗体の全てのジスルフィド架橋が短時間で完全に開裂され、還元が全ｐＨ範囲におよび起こるため、しばしば使用されている還元剤である（例えば、Hau, J.C. and Hau, C.Y., Anal. Biochem. 220 (1994) 5-10を参照されたい）。１つの態様において、ｐＨ範囲は１．５〜８．５である。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）もまた、ジスルフィド架橋の急速な開裂を特徴とする。しかしながら、酸性環境におけるＤＴＴ還元は、非常にわずかにしか進行しない。重鎖及び軽鎖の解離を完了させるために通常、変性工程が必要とされる。変性により更にジスルフィド基により近づき易くなる。変性は、例えば、グアニジン/ＨＣｌ又はギ酸を用いて実施することができる。
【００２３】
酵素的開裂
システインプロテアーゼであるパパインは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）及びチロシン（Ｙ）の後で比較的非特異的にペプチド結合を開裂する。インキュベーション時間が十分に長ければ、パパインによる消化により全体の加水分解が行われる。しかしながら、抗体は、限定的なタンパク質分解によりそのヒンジ領域において比較的選択的に開裂され得る（Lottspeich, F., and Engels, J.W., "Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag" Munich 2nd Edition (2006) 201-214）。開裂は、２つの重鎖を共に接続しているジスルフィド架橋のＮ末端側で起こる。ジスルフィド架橋はこの過程において保持されているので、３つの断片（２つのＦａｂ断片、１つのＦｃ断片）が消化後に得られる。２つのＮ末端断片は抗原結合断片（Ｆａｂ、抗原結合断片（antigen-binding fragment））と称され、Ｃ末端断片は結晶性断片（Ｆｃ、結晶性断片（crystallizing fragment））と称される。各Ｆａｂ断片は、完全な軽鎖と、重鎖のアミノ末端半分から構成される。Ｆｃ断片は、重鎖の２つのカルボキシ末端半分から構成され、これらは、ジスルフィド架橋により依然として共に連結されている。
【００２４】
ＩｄｅＳ消化
ＩｄｅＳ（化膿性連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素、immunoglobulin G-degrading enzyme of S. Pyogenes）は、病原性細菌である化膿性連鎖球菌から単離することができる細胞性システインプロテアーゼである。この酵素は、認識配列ＧＰＳＶＦＬＦＰの直前で高い特異性でもってヒトＩｇＧを開裂する。この配列は、ＩｇＧのヒンジ領域の、２つの重鎖（ＨＣ）を共に連結しているジスルフィド架橋のＣ末端側に位置している。開裂により２本の重鎖（２つのＨＣ−Ｆｃ断片）のＣ末端とＦａｂ”断片が得られ、このＦａｂ”断片は、ジスルフィド架橋により連結された軽鎖及び重鎖のＦａｂ断片腕から得られる（図３）（von Pavel-Rammingen, U., et al., EMBO Journal 21 (2002) 1607-1615）。
【００２５】
ＩｄｅＳ抗体断片は、消化後にＤＴＴ又はＴＣＥＰを用いて還元されると、Ｆａｂ”断片の代わりに、抗体の２本の軽鎖（２本のＬＣ）及び重鎖のＮ末端断片（２本のＨＣ Ｆａｂ）が得られる。重鎖のＣ末端（ＨＣ−Ｆｃ）は還元により影響を受けない。
【００２６】
脱グリコシル化
Ｎ−グリコシダーゼＦ酵素は、いわゆるエンドグリコシダーゼであり、糖タンパク質の糖構造、例えば抗体の重鎖の糖構造を、ペプチド鎖と近くのＮ−アセチルグルコサミン残基の間で開裂する。
【００２７】
様々なタンパク質又はペプチド成分の混合物の分析で時として得られる非常に複雑なマススペクトルを、成分を前以って分離することにより単純化するために、液体クロマトグラフィー法と併用した質量分析が行われることが多い（ＬＣ/ＭＳ）。この目的のために、質量分光分析の前に、その成分に従って、溶解された物質混合物を分離するために、とりわけ高性能なＨＰＬＣシステムが使用される。分析混合物のクロマトグラフィーによる分離の結果、成分は異なる時間で分離カラムから溶出し、このように、その溶出順に質量分析計により分析することができる。
【００２８】
溶出プロファイルの各ピークのマススペクトルは、質量分析計と接続されたクロマトグラフィーにより得られる。この利点は、分析物の溶液の全ての成分の複雑な全スペクトルが得られるのではなく、むしろ、理想的な場合では、分離された成分の均一なスペクトルが得られることである。
【００２９】
エレクトロスプレー法（ＥＳＩ）は、質量分析において、溶解された分子をガス性イオンに変換するために頻繁に使用されるイオン化法である。これは、液体を電場に分散させることにより達成される（エレクトロスプレー）。分析物の分子を含む非常に多くの小さな荷電された液滴がこの過程で形成される。
【００３０】
高度に荷電されたイオンの形成が、ＥＳＩ過程の特徴である。従って、所定のタンパク質種のマススペクトルにおいて、その分子量に応じて各々荷電差Δｚ＝１（原則として、ポジティブモードでは１つのプロトンの付加、又は、ネガティブモードでは１つのプロトンの引き算による）を有する全シリーズのイオンシグナルが観察される。タンパク質のスペクトルは、特徴的なおよそベル形状の分子イオン荷電分布を示す。分布の最大値は、ＥＳＩ質量分析計のパラメータ、溶媒のｐＨ、及びタンパク質の変性状態に依存する。ジスルフィド架橋の開裂後、変性の結果として、タンパク質は空間的により広がった構造をとり、それにより、より多くの荷電が分子により受容（又は放出）され得る。それ故、荷電分布の最大値はより高い（より低い）荷電にシフトし得る。
【００３１】
多価荷電分子イオンの荷電数ｎ及び従って分子量（Ｍ）は、荷電分布のいずれか２つの連続的な分子イオン（ｍ２＞ｍ１）の測定されたｍ／ｚ比（ｍ）から計算することができる：
【数１】
【００３２】
ここでのＸは、チャージキャリアの質量であり、すなわち、１つのプロトンの付加の場合ではＸ＝１（ポジティブモード）、１つのプロトンの引き算の場合ではＸ＝−１（ネガティブモード）である。ｎの値は、変数ｎを解き、式１及び２の方程式を解くことにより計算することができる：
【数２】
【００３３】
分子イオンの分子量は、Ｍについて式２を解き、式３でｎの計算結果を使用することにより計算することができる：
【数３】
【００３４】
スペクトルは、コンピュータープログラムを用いて通常分析され、これを使用して全てのシグナル又は個々の選択されたシグナルのいずれかから分子量を決定することができる。結果として、対応する分子量範囲（複雑ではないスペクトル）について再計算された所定のスペクトルを示す、いわゆる再構成が得られる。分子量は、現在では、計算されたピークから直接的に解読することができる。
【００３５】
以前使用されていた方法では起こっていた問題を、本発明に記載の方法を使用することにより防ぐことができることが今回驚くべきことに判明した。また、酵素ＩｄｅＳの使用は、抗体のＬＣ／ＭＳ分析を行なう上で有利であることも驚くべきことに判明した。
【００３６】
従って、本発明の第一の局面は、試料中の抗体及び抗体断片並びに抗体の改変型を検出する方法であり、これは、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物及び／又は抗体の改変型を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた溶液中に含まれるインタクトな抗体を検出及び抗体断片を検出する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３７】
得られた試料は、例えば、抗体を含む溶液、例えば、凍結乾燥抗体製剤の復元溶液であり得る。保存中及び凍結乾燥中に、改変された抗体分子がこの溶液中に形成される。これらの改変は、とりわけ、個々のアミノ酸の酸化及び脱アミド化、チオエーテル結合の形成、及び抗体断片の形成である。
【００３８】
本発明に記載の方法は、様々な薬剤と試料とのインキュベーションを含む。これらの薬剤を使用することにより、試料中に含まれる抗体分子及び抗体断片分子は、所定の断片へと変換される。該方法の１つの態様において、第一インキュベーション工程は、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳ、好ましくは化膿性連鎖球菌又はトレポネーマ・デンティコラ由来のＩｄｅＳを用いた分子の開裂である。更に好ましい態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションは、１つの態様において、ｐＨ５．５〜８．５のｐＨ範囲で行なわれる。１つの態様において、インキュベーションは、ｐＨ７．０〜８．０のｐＨ範囲である。また、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと抗体分子（抗体断片分子を含む）のモル比は、１：２５から１：２５００であり、好ましい態様では１：２５から１：１００とすべきである。
【００３９】
該方法の１つの態様において、第二インキュベーション工程は、グリコシダーゼを用いての抗体断片からの炭水化物の開裂である。１つの態様において、グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＨ、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼ、又はＯ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼから選択される。１つの態様において、グリコシダーゼはＮ−グリコシダーゼＦであり、これはＰＮＧアーゼＦとも呼ばれる。１つの態様において、Ｎ−グリコシダーゼＦは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカムに由来する。１つの態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＦ２であり、これはエンドＦ２とも呼ばれる。別の態様において、エンドグリコシダーゼＦ２は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム又はクリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Chryseobacterium meningosepticum）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨであり、これはまたエンドＨとも呼ばれる。更なる態様において、エンドグリコシダーゼＨは、ストレプトマイセス・プリカタス（Streptomyces plicatus）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼは、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼであり、これはまたノイラミニダーゼとも呼ばれる。更に別の態様において、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼは、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼはＯ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎアセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼであり、これはまたＤ−グリコシダーゼとも呼ばれる。１つの態様において、Ｏ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎアセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼは、肺炎連鎖球菌に由来する。更なる態様において、グリコシダーゼは、ＥＣ３．２．２１８又はＥＣ３．５．１．５２又はＥＣ３．２．１．９６又はＥＣ３．２．１．１８又はＥＣ３．２．１．９７である。更なる態様において、グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
まず最初に、得られた試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、その後、それをグリコシダーゼで処理することが有利である。
【００４１】
第三の工程において、還元剤を加えることにより、好ましくはリン酸トリクロロエチル（ＴＣＥＰ）を加えることによりジスルフィド架橋を開裂する。１つの態様において、還元剤の添加と同時にギ酸を加える。
【００４２】
液体クロマトグラフィーと質量分析の組合せを使用することにより、得られた所定の抗体断片が分析される。個々の断片は液体クロマトグラフィーにより分離され、その後、質量分析計により測定することができる。１つの態様において、質量分析計はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。１つの態様において、液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はπ−π相互作用クロマトグラフィーである。疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、クロマトグラフィーリガンドは、１つの態様において、孔サイズ３００Åのクロマトグラフィー材料に所在するＣ８もしくはＣ１８リガンドであるか、又は、π−π相互作用クロマトグラフィーの場合、ジフェニルリガンドがクロマトグラフィーリガンドとして使用される。１つの態様において、Jupiter C18カラム又はZorbax 300SB C8カラム又はPursuitジフェニルカラム、好ましい態様において、Pursuitジフェニルカラムが液体クロマトグラフィーに使用される。
【００４３】
本発明は更に、試料中の抗体又は抗体断片を検出するためのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼの使用に関し、これは、試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、得られた断片をグリコシダーゼと共にインキュベートした後に、液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする。
【００４４】
本発明の別の局面は、抗体又は抗体断片を検出するためのキットであり、これは、該キットが、
ｉ）化膿性連鎖球菌由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のエンドグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含むことを特徴とする。
【００４５】
まず最初に、ＩｄｅＳ消化のインキュベーション条件を最適化するために、酵素：抗体比の低下及びインキュベーション時間の短縮について試験された。消化された抗体分析物溶液中の酵素成分の存在が、得られるマススペクトルのシグナルに干渉する可能性があるため、可能な最も短いインキュベーション時間及び可能な最小の酵素：抗体比が、実践的な理由から望ましかった。抗体消化に使用される酵素の量は、これを避けるためにできるだけ少なくすべきである。同時に、抗体分子は消化後に完全に開裂されていなければならない。更に可能な最も多い試料処理量を達成し、実験的な時間経過を最適化するために、完全な消化が確実になされつつもインキュベーション時間は短くすべきである。消化調製物のゲル電気泳動による分離の結果（図７参照）により、予期されるＩｄｅＳ開裂産物に相当する２本の主なバンド（約１００kDa及び約２５kDa）が、全ての消化条件下で形成されたことが示された。分子量約１００kDaを有するより大きな主なバンドは、２本の軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）のＦａｂ断片とを含む、予期される抗体のＦａｂ''部分に相当する。分子量約２５kDaのより小さな主なバンドは、予期されるＨＣのＦｃ断片である。消化調製物のゲル電気泳動による分離の結果により、酵素：抗体の比率は、ＩｄｅＳ消化に対してより有意な効果を及ぼすことが示される。様々な調製物のＩｄｅＳ消化の効率に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、酵素：抗体の比が１：５０、インキュベーション時間が０．５時間及び１時間でも、インタクトな抗体（２ＨＣ／２ＬＣ）のバンドが最小強度で依然として存在することが示される（図７Ａ、レーン６及び９参照）。酵素：抗体の比が同じで、２時間及び５時間のインキュベーション時間では（図７Ｂ、レーン６及び９）、インタクトな抗体分子のバンドは消失していた。従って、好ましいインキュベーション時間は、２時間から５時間の間であり、特に好ましいのは２時間である。また、１８時間のインキュベーション時間及び１：５０、１：５００、１：２５００、１：１００００の酵素：抗体の比は、同じ酵素：抗体比で５時間のインキュベーションと比べて差異は認められなかった。従って、１：２５から１：１００の酵素：抗体比が好ましい。１：５０の酵素：抗体比が特に好ましい。
【００４６】
ＬＣ／ＭＳに基づいた方法には、ストレスにより誘発される分解産物を分離及び検出するのに特に適した試料調製法が含まれる。原則的に、試料調製には可能な４つの変法がある：
１．抗体の還元のみ；
２．抗体を脱グリコシル化し、その後、還元；
３．抗体をＩｄｅＳで消化し、その後、還元；
４．抗体を脱グリコシル化し、その後、ＩｄｅＳで消化し還元
【００４７】
還元しかされていない調製物（変法１）及びＩｄｅＳで消化され還元された調製物（変法３）は、抗体溶液のＬＣ／ＭＳ分析には適していないことが判明した。なぜなら、重鎖の糖構造に因り異種のスペクトルが得られ、これがＬＣ／ＭＳの測定の感度を低下させ、分析をより困難なものとしているからである。
【００４８】
ＩｄｅＳで消化され、脱グリコシル化され、還元された試料調製物は、脱グリコシル化され還元された試料調製物よりも好ましいことが今回驚くべきことに判明した。なぜなら、より小さな抗体断片が得られ、これによりＬＣ／ＭＳ測定の質量分解能にプラスの効果を及ぼし、抗体のＨＣ−Ｆｃ又はＨＣ−Ｆａｂ部分のいずれかに位置及び配置されるように更に存在し得る改変が可能となるからである。更に、重鎖の開裂により、該断片のクロマトグラフィー挙動で起こり得るストレスにより誘発された改変の効果を増幅することにより、互いのその分離を促進することができる。ＩｄｅＳ及びＮ−グリコシダーゼＦの２つの酵素を同時に使用することによる問題はなかった。
【００４９】
実践的な理由から、最初に抗体をＩｄｅＳで消化し、その後、脱グリコシル化することが特に有利であることが判明した。実践的な理由からこのように手順が変更されたが、分析の結果についての有意な効果はなかった。ＴＣＥＰ溶液の添加と同時にギ酸が添加され、すなわち、ギ酸及びＴＣＥＰ溶液は両方共、インキュベーション前に加えられ、よって、１つのインキュベーション中に両成分が存在している。
【００５０】
抗体溶液の分解産物の形成を明瞭かつ簡単に検出し定量するために、それぞれの分解種を分離することが有利である。分析物溶液の分離の品質は、とりわけ、クロマトグラフィーの固定相の特性により有意に影響を受ける。クロマトグラフィー分離の品質は、それぞれのカラムのピーク分解能及びピークの鋭さに基づいて評価された。
【００５１】
カラムを選択する際、カラムマトリックスの極性に加えて更なる重要なパラメーターを、分離においては考慮に入れなければならず、例えば、粒子サイズは、可能な最も高いプレート数を達成するためにできるだけ小さくすべきである。更に、抗体は非常に大きな分子であることを心に留めておくべきである。結果として、マトリックス粒子の孔サイズもまた、適切なカラムを選択する場合に決定的な役割を果たす。マトリックス粒子の孔が大きければ大きいほど、抗体成分が孔の中へと拡散し易くなり、これにより分離が向上する。
【００５２】
参照カラムとして使用されるJupiter C18カラムと比べて、Vydac C4カラムでは、使用されたクロマトグラフィー条件下で、分解産物の分離の効果的な向上は得られなかった。Zorbax 300SB C8は、Jupiter C18カラムとは異なるクロマトグラフィー選択性を示すが、様々な抗体断片の分離に関して同等な良好な結果が得られる。これに対し、Pursuitジフェニルカラムは、向上した分離結果を示した。このカラムの分離プロファイルは、Jupiter C18カラムの分離プロファイルと比べて、溶出プロファイルにおいて良好な分解能及び許容可能なピークの鋭さを持つピーク及びショルダーがより多かった。それ故、このカラムは、本発明の方法に従って得られた抗体の分解産物の分離に好ましい。
【００５３】
以下の実施例、参考文献及び図面により、本発明を更に解明しよう。実際の保護範囲は、本発明に添付の特許請求の範囲から導かれる。
【００５４】
本発明は、抗体の例（ｍＡｂＩＧＦ−１Ｒ）に基づいて以下の実施例において記載されている。これは、本発明を制限するものではなく、むしろ本発明を説明するためだけのものである。
【００５５】
（好ましくはモノクローナル）抗体の例は、WO 02/053596、WO 2004/071529、WO 2005/016967、WO 2006/008639、US 2005/0249730、US 2005/0084906、WO 2005/058967、WO 2006/013472、WO 2006/00181、US 2003/0165502、WO 2005/082415、WO 2005/016970、WO 03/106621、WO 04/083248、WO 2003/100008、WO 2004/087756、WO 2005/005635、WO 2005/094376、及びWO 2007/115814に記載のように、ＩＧＦ−１受容体に対する抗体（ｍＡｂＩＧＦ−１Ｒ）である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】一例としてのメチオニン（ａ）及びトリプトファン（ｂ）の酸化反応（e.g. Taylor, S., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 19587-19590を参照）。
【図２】アスパラギンの脱アミド化及びアスパルテートへの異性体化；塩基性条件下（ｐＨ＞８）では経路Ｉが好ましく、酸性条件下（ｐＨ＜５）では経路ＩＩが好ましい。
【図３】ＩｇＧ１抗体のＩｄｅＳによる消化の図解。
【図４】４０℃でインキュベートし、−８０℃で保存された抗体のゲル電気泳動による分離結果レーン１−試料緩衝液；レーン２−分子量標準物質；レーン３−試料緩衝液；レーン４−還元されていない標準物質；レーン５−還元されていない抗体（−８０℃）；レーン６−還元されていない抗体（３０日間／４０℃）；レーン７−試料緩衝液；レーン８−還元された標準物質；レーン９−還元された抗体（−８０℃）；レーン１０−還元された抗体（３０日間／４０℃）；レーン１１−試料緩衝液；レーン１２−試料緩衝液。
【図５】ストレスのかけられた抗体（１：４０℃、３０日間）及びストレスのかけられていない抗体（２：−８０℃）及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液（３）のＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ。
【図６】ストレスのかけられた抗体溶液（１：４０℃、３０日間）及びストレスのかけられていない抗体溶液（２：−８０℃）及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液（３）についてのイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム。
【図７】様々な酵素と抗体の比率（１：５０から１：１２５０）及び様々なインキュベーション時間（０．５時間から５時間）でＩｄｅＳにより消化された抗体の分離：レーン番号−ゲルＡ−ゲルＢ：１−試料緩衝液−試料緩衝液；２−分子量標準物質−分子量標準物質；３−標準物質−標準物質；４−消化されていない抗体−消化されていない抗体；５−試料緩衝液−試料緩衝液；６−１：５０、０．５時間−１：５０、２．０時間；７−１：１２５、０．５時間−１：１２５、２．０時間；８−１：１２５０、０．５時間−１：１２５０、２．０時間；９−１：５０、１．０時間−１：１２５、５．０時間；１０−１：１２５、１．０時間−１：１２５、５．０時間；１１−１：１２５０、１．０時間−１：１２５０、５．０時間；１２−試料緩衝液−試料緩衝液。
【図８】Jupiter C18標準カラム（Ａ）及びPursuitジフェニルカラム（Ｂ）でのストレスのかけられた抗体及びストレスのかけられていない抗体の溶出プロファイルの重ね合わせ。
【図９】Pursuitジフェニルカラムでのストレスのかけられた抗体（１）及びストレスのかけられていない抗体（２）の溶出プロファイルの重ね合わせ。
【００５７】
実施例１
材料及び方法
本研究で実験に使用された抗体は、ＩｇＧ１型のヒト組換え抗体である。この抗体は、ＣＨＯ細胞で発現され、アフィニティクロマトグラフィー及び様々なイオン交換クロマトグラフィー工程により精製された。
【００５８】
熱ストレス
約２２mgのＩｇＧ１抗体を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中で透析することにより再緩衝化した。再緩衝化された抗体溶液の一部を、４０℃で３０日間インキュベートした。他の部分は、対照として−８０℃で凍結させた。
【００５９】
透析
透析のために、１．５mlの抗体溶液（ｃ＝１４．６mg/ml）を、スライドＡ−ライザー透析カセット（容量：０．５〜３ｍｌ、分子量排除サイズ：１０kDa）に移し、透析緩衝液中に吊り下げた。透析中は緩衝液を連続的に撹拌し、約８℃に維持した。透析中、透析緩衝溶液を、数回、新しいのと取り換えることにより、緩衝溶液が可能な限り完全に交換されるようにした。表１は、緩衝溶液の交換の時間スキームを示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
透析の完了後、抗体溶液をスライドＡ−ライザーカセットから５mlの反応容器に移した。透析された抗体溶液の容量は、化学天秤（AT261 Delta Range, Mettler-Toledo）で秤量することにより測定した。
【００６２】
滅菌ろ過
透析後、抗体溶液を、細菌レベルの低い条件下で１枚のMinisartシリンジフィルター（０．２μｍ、Sartorius）を通してろ過することにより滅菌した。抗体濃度の測定のためのサンプリングもまた、細菌レベルの低い条件下で行なった。
【００６３】
抗体濃度の測定
抗体濃度は、Uvikon XL型(Goebel Company)のスペクトルフォトメーターで２８０nmでの吸光度の測定により決定した。使用された抗体の消衰係数は１．５５mL・mg−１・cm−１であり、Pace, C.N., et al., (Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423)の方法に従って計算された。
【００６４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ
抗体溶液は、Power Ease 300電気泳動ステーション並びにInvitrogen社のゲル、緩衝液、及び他の試薬を使用してゲル電気泳動により分離した。トリス−グリシン４〜２０％勾配ゲルを分離に使用した。使用前に２倍の蒸留水で１：１０（ｖ/ｖ）に希釈したトリス−グリシンＳＤＳ泳動緩衝液（１０×）を泳動緩衝液として使用した。
【００６５】
４０℃でインキュベートした抗体溶液及び−８０℃で保存しておいた抗体溶液を、還元条件下並びに非還元条件下でアプライした。５μlのMark 12（商標）タンパク質マーカーも参照物質としてゲルにアプライすることにより、調べる試料の相対的分子量を測定した。電気泳動による分離は１２５Ｖの電圧で行ない、泳動時間は約９５分間であった。ゲル電気泳動後、ゲルを、製造業者の指示に従ってSimply Blue Safe Stain（クーマシーＧ２５０染色溶液）で染色した。その後、ゲルを蒸留水で２回脱色した。
【００６６】
染色されたゲルを、Dry-Easeミニセロファン及び乾燥溶液（１０％グリセロール（ｖ/ｖ）、４０％メタノール（ｖ/ｖ）、１０％酢酸（ｖ/ｖ）、４０％水（ｖ/ｖ））を使用して保存した。このために、ゲルを、５分間、乾燥溶液中でインキュベートし、２つのセロファンを加えた後に更に１０分間インキュベートした。その後、ゲルをセロファン間の泡を除去して置いた後、クランピングフレームで乾燥させた。
【００６７】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために抗体溶液を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で約１mg・ml−１の濃度まで希釈した。その後、１０μl（１０μgの抗体に相当する）の希釈された抗体溶液を、１０μlのＳＤＳ試料緩衝液（２×）と１：２（ｖ/ｖ）の比で混合し、混合し、最後に簡単に遠心分離にかけた。試料を７０℃で１０分間かけて変性させた。その後、それらを再度簡単に遠心分離にかけた。電気泳動分離のために、１６μl（８μgの抗体に相当する）の変性試料をゲルにアプライした。タンパク質マーカーに加えて、１mg・ml−１の濃度まで希釈しその後抗体試料と同じように処理した抗体参照標準物質（ｃ＝１６．５mg・ml−１）を、参照物質としてアプライした。
【００６８】
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、抗体溶液もまた、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて１mg・ml−１の濃度まで希釈した。ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を使用することにより溶液を還元した。抗体が完全に確実に還元されるために、ＤＴＴ溶液をＳＤＳ試料緩衝液（２×）中で１００mMの濃度で調製した。その後、１０μl（１０μgの抗体に相当する）の希釈溶液を、１：２の比率で（ｖ/ｖ）、１０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液＋１００mM ＤＴＴと混合し、混合し、簡潔に遠心分離にかけた。試料を７０℃で１０分間かけて変性させた。その後、再度簡単に遠心分離にかけた。電気泳動分離のために、１６μl（８μgの抗体に相当する）の変性試料をゲルにアプライした。タンパク質マーカーに加えて、１mg・ml−１の濃度まで希釈し、その後、抗体試料と同じように処理した、抗体参照標準物質（ｃ＝１６．５mg・ml−１）を参照物質としてアプライした。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
Tosoh Bioscience CompanyのＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬゲルろ過カラム（７．８×３００mm；５μm、２５０Å）を使用することにより、サイズに従って抗体溶液の成分をクロマトグラフィーにより分離した。分離は、島津−ＨＰＬＣシステムで行なった。試料成分は、２００mMのリン酸カリウム、２５０mMの塩化カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて均一濃度で、３０分間かけて流速０．５ml・分−１で溶出した。ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬゲルろ過カラムの温度は分離中２５℃で一定に維持した。オートサンプラーの温度は６℃であった。試料成分は、ダイオードアレイ検出器を使用して２８０nmの波長で検出された。
【００７０】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
Agilent Companyの弱カチオン交換カラムSynChropak WCX (4.6 x 250 mm, 6 μm, 300A)が、イオンクロマトグラフィーによる抗体溶液の成分の分離に使用された。分離は、島津ＨＰＬＣシステムで行なった。試料成分は、溶出液Ａ（１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）及び溶出液Ｂ（１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、７５０mM塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）の２勾配システムを用いて、流速１ml・分−１、泳動時間５５分間で溶出された。溶出プロファイルを表２に示す。SynChropak WCXカチオン交換カラムの温度は、分離中、２５℃で一定に維持した。オートサンプラーの温度は６℃であった。試料成分は、ダイオードアレイ検出器を使用して２８０nmの波長で検出された。
【００７１】
【表２】
【００７２】
実施例２
熱ストレス
モノクローナル抗体の分解産物及び改変体の形成を加速させるために、インキュベーター(Venticell, MM-Medcenter)中で所定の熱ストレスにかけた。インキュベーションのために、透析された抗体溶液を、４０℃で３０日間インキュベートした。更に、２５０μlの抗体溶液を１０μlずつのアリコートに分け、−８０℃で保存した。これらは、ゼロ点の対照として使用した。
【００７３】
３０日後、熱ストレスにかけられたアリコートをインキュベーターから取り出し、微生物の感染について眼で確認した。取り出されたアリコートを反応容器にプールすることにより、均一でストレスのかけられた分析溶液が得られた。抗体溶液を注意深く混合(MS2 minishaker, IKA, Staufen)することにより均質化を行なった。均質化された抗体溶液を、２０μlずつのアリコートに分け、−８０℃で保存した。
【００７４】
液体クロマトグラフィー及び質量分析による分析のために、約２２mgの抗体（ｃ＝１４．６mg・ml−１）を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中で再緩衝化し、その後、４０℃で３０日間インキュベートした。
【００７５】
熱でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液の調製
後の分析で、４０℃の保存から得られた抗体溶液において観察された変化が、緩衝溶液中での変化に起因しないことを確かめるために、２つの１５mlアリコートの１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液を、細菌レベルの低い条件下でろ過することにより滅菌し、また４０℃で３０日間インキュベーター(Venticell, MM-Medcenter)中でインキュベートした。その後の過程は、抗体溶液と同様に行なった。
【００７６】
ゲル電気泳動による熱でインキュベートされた溶液の分析
４０℃でインキュベートし、−８０℃で保存された抗体のゲル電気泳動による分離の結果を図４に示す。４０℃でのインキュベーションにより、抗体分子の凝集物並びに抗体分子の断片が形成される（レーン６及び１０）。インキュベートされていない抗体試料は、非還元条件下でＩｇＧ１分子の典型的なバンドパターンを示す（レーン４及び５を参照）。主なバンドは、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）からなるインタクトな抗体に相当する。更に、構造が完全に保存されていない抗体種のバンドも見られる。これらのバンドは、１本の軽鎖を欠失した２ＨＣ/ＬＣ種、抗体の半分（ＨＣ/ＬＣ）、遊離重鎖（ＨＣ）、及び遊離軽鎖（ＬＣ）である（レーン４及び５を参照）。
【００７７】
この典型的なバンドパターンはまた、４０℃でインキュベートされた還元されていない抗体試料でも基本的に見られる（レーン６を参照）。主なバンドは、ここでもインタクトな抗体である（２ＨＣ/２ＬＣ）。更に、−８０℃で保存された抗体試料よりも高い強度で、様々なインタクトではない抗体種（２ＨＣ/ＬＣ、ＨＣ/ＬＣ、ＨＣ、ＬＣ）のバンドが存在する。更に、ストレスのかけられた試料においては、約９０kDaから２００kDaを超える範囲の更なるバンドが形成されている（レーン６を参照）。主なバンドよりも下に存在する種は抗体断片であり、主なバンドよりも上に存在する種は凝集物である。
【００７８】
ＬＣ/ＭＳによる分析において特に興味深いと思われる２本のバンドは、約２１kDaの領域に存在する（レーン６を参照）。これは、共有結合していないＦａｂ断片であり、ここでは、ＨＣ Ｆａｂ断片（ＡＡ１〜２２０）及びＬＣは、ジスルフィド架橋ではなく、むしろ非共有結合的な相互作用（イオン相互作用、水素結合、双極子間相互作用、ファンデルワールス力）により維持されている。試料は変性条件下でゲルにアプライされるので、ＨＣ Ｆａｂ及びＬＣは、ゲル中に１本のバンドとして出現する（レーン６参照）。これに関して、ゲル中の上のバンドは、ＬＣ（ＬＣ★）であり、下のバンドは、ＨＣ Ｆａｂ断片である(Cohen, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc., 129 (2007) 6976-6977)。第二のＦａｂ断片及びＦｃ断片からなる残りの抗体は、９７kDa及び１１６kDaの領域に弱い強度で存在するバンドに割り当てることができる（レーン６参照）。
【００７９】
還元条件下での分離における主なバンドは、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）である（レーン８、９及び１０参照）。ストレスのかけられていない抗体試料において、２本の主なバンドに加えて、より低い強度で約９７kDa及び１２０kDaの範囲に２本の更なるバンドが存在する。これらは、共有結合した非還元性の凝集物である（レーン８及び９参照）。
【００８０】
４０℃でインキュベートされた抗体溶液は、インキュベートされていない抗体溶液と同じバンドパターンを示す（レーン１０参照）。ストレスのかけられていない試料の場合の非還元性の種に割り当てられ得る２本のバンドは、ストレスのかけられた試料では非常に大きな強度では存在しない（レーン１０参照）。すでに記載された種に加えて（ＨＣ、ＬＣ、及び２本の共有結合された非還元性のバンド）、ストレスのかけられた抗体溶液では約３０kDaから２００kDaの範囲に多くの更なるバンドが存在する。これらは還元された共有結合された凝集物、非還元性の種、及び還元された種の断片である（レーン１０参照）。
【００８１】
ゲルにおいて約９０kDaから９５kDaの位置にあり、抗体の半分に割り当てられ得る、非還元性の凝集物の種のバンドが、ＬＣ／ＭＳ分析において特に興味深い。このバンドの強度は、インキュベーションの結果、有意に増加する。このバンドにおける強度の増加は、チオエーテル種の形成に殆ど起因するようである。この種は、実際の質量が７５kDaの抗体の半分の分子であり、そのＨＣ及びＬＣはジスルフィド架橋によって連結しておらず、むしろ、非還元性のチオエーテル架橋により連結されている(Tous, G.I., et al., Anal. Chem. 77 (2005) 2675-2682)。
【００８２】
ＳＥＣによる熱でインキュベートされた溶液の分析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ストレスにより誘発された断片及び凝集物の形成の概観が得られる。ＳＥＣは天然条件下で行なわれるので、共有結合した凝集物並びに共有結合していない凝集物が分析で検出される。分解産物の形成と４０℃でのインキュベーションの間の関連を確立するために、ストレスのかけられた抗体溶液に加えて、−８０℃で保存されていたストレスのかけられていない試料も分析する。
【００８３】
図５は、４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液、４０℃でインキュベートされた抗体、及び−８０℃で保存された抗体に関するＳＥＣの結果を示す。分析のために５０μl又は５０μgの抗体を、各場合においてアプライした。分子量標準物質の分析結果は、抗体溶液の成分の分子量サイズを決定するための参照物質として作用した。それらを表４に列挙する。表３は、溶出プロファイルにおける様々な抗体種の比率を示す。計算された比率は、存在する全てのピークの面積の合計と比較した、特定の種のピークのそれぞれの面積の比率に基づく。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
ストレスのかけられた抗体種の溶出プロファイルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と相関する。またＳＥＣの結果により、凝集物が形成され、抗体がインキュベート中に分解したことが示された（図５参照）。
【００８７】
保持時間が約１５〜１６．５分である主な種は、インタクトな抗体に割り当てることができるが、これは、４０℃でのインキュベーション中に、全面積が約９６％から７２％へと減少している（表３参照）。主な種の保持時間（ＲＴは１５〜１６．５分）は、分子量標準物質に基づくと約１５０kDaの分子量に相当する（表４参照）。１５８kDaを超える分子量を有する凝集物は、約１２〜１４．５分の時間窓で溶出される。この溶出時間を示すピークは、４０℃のインキュベーションの結果、全面積が約３％から約１２％へと増加している（表３参照）。ストレスのかけられた抗体の溶出プロファイルにおいて主な種のピークが減少しつつある領域（ＲＴは約１６．５〜１８分）に明瞭なショルダーが形成されており、これは面積にして約１１％の比率を有し、−８０℃で保存された抗体溶液ではこれ程までは存在していない（図５参照）。ショルダーの領域で溶出される抗体種は、約７０kDaから１２０kDaの分子量を有する（表４参照）。これらは、抗体の半分（ＨＣ/ＬＣ）、１本の軽鎖を欠失した抗体（２ＨＣ/ＬＣ）、及びＦａｂ＋Ｆｃ断片を示す種である。約１９〜２０分の保持時間において更なるピークが更に見られ、これは、約２０kDaから４０kDaの分子量が割り当てられ得る（表４参照）。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）並びに共有結合していないＦａｂ断片のＨＣ Ｆａｂが、この時間窓で溶出される。このピークは、４０℃のインキュベーションの結果、全面積の約１％から５％まで増加する（表３参照）。
【００８８】
４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液の溶出プロファイルと、４０℃でインキュベートされた抗体溶液の溶出プロファイルを比較することにより、緩衝液のインキュベーションの結果としてのピークは全く生じないことが示される。
【００８９】
ＩＥＣによる熱でインキュベートされた溶液の分析
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、抗体分子の改変に起因する荷電の変化を検出するのに適している。
【００９０】
抗体におけるストレスに関連した変化を同定できるようにするために、４０℃でインキュベートされた抗体の他に、−８０℃で保存されたストレスをかけられていない抗体をアプライする。
【００９１】
図６は、ストレスのかけられた抗体溶液及びストレスのかけられていない抗体溶液及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液についてイオン交換クロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを示す。分析では各場合において５０μl又は２５μgの抗体をアプライした。溶出プロファイルの様々な種の比率を表５に示す。計算された比率とは、存在する全てのピーク面積の合計と比較した、特定の種のピークのそれぞれの面積の比のことをいう。
【００９２】
【表５】
【００９３】
−８０℃で保存された抗体と４０℃でインキュベートされた抗体の溶出プロファイルの比較により、酸性範囲への有意な荷電のシフトがインキュベーションにより誘発されることが示される（図６参照）。従って、インタクトな抗体に割り当てられ得る主な種のピーク（保持時間ＲＴは約２２〜２５分）の強度は、全面積の約６１％から約４０％へと減少し（表５参照）、一方、溶出プロファイルの酸性範囲におけるピーク（ＲＴ１２〜１８分）の強度は有意に増加した（全面積の約８％から約４４％に増加）。ストレスのかけられていない抗体試料の塩基性範囲でみられるショルダーは（ＲＴ２６〜３２分）、４０℃でのインキュベーション中に完全に消失する（図６参照）。代わりに、ストレスのかけられた抗体溶液の場合では、主なピークの酸性部分におけるショルダー（ＲＴ１９〜２２分）は強度が増加する。この場合、面積は全面積の約５％から約１７％へと増加している（表５参照）。４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液の溶出プロファイルと、４０℃でインキュベートされた抗体溶液の溶出プロファイルの比較により、緩衝液のインキュベーションの結果としてのピークは全く生じないことが示される。
【００９４】
抗体のインキュベーションにより誘発される酸性範囲への荷電シフトは、通常、主に、脱アミド化反応に起因する。脱アミド化反応では、アミノ基がヒドロキシル基により置き換えられ、これにより、分子に更なる負の荷電が導入される。ＩＥＣクロマトグラムの結果により、脱アミド化及び他の荷電変化は、４０℃でのインキュベーションの結果、高度に起こったことが示される。
【００９５】
実施例３
ＩｄｅＳによる消化の最適化
酵素ＩｄｅＳは、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に１mg/mlの濃度で存在していた。３つの異なるＩｄｅＳ濃度を含む希釈シリーズを、消化溶液への酵素の添加のために調製した。希釈前溶液（Ｖ）中のＩｄｅＳの最終濃度は、０．１mg・ml−１（Ｖ１）、０．０１mg・ml−１（Ｖ２）、及び０．００１mg・ml−１（Ｖ３）であった。希釈は、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して行なった。
【００９６】
分析しようとする抗体は、ヒスチジン緩衝溶液（ｐＨ６．０）中１５．５mg/mlの濃度で存在していた。抗体溶液を、消化溶液に添加するために、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｃ＝５mg・ml−１の濃度まで希釈した。
【００９７】
消化溶液の調製のためのピペッティングスキームは表６に列挙されている。
【００９８】
【表６】
【００９９】
調製された消化溶液を、３７℃で、０．５、１．０、２．０、及び５．０時間インキュベートした。酵素を全く加えない抗体溶液を、ゼロ対照として調製した。対照溶液では、１０μl（５０μg）の抗体をピペットにより、４０μlの５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に加えた。インキュベーションは、３７℃で５．０時間行なった。
【０１００】
更に、抗体参照標準物質溶液（２０mMヒスチジン、２４０mMトレハロース、０．０２％Tween２０中の抗体、ｐＨ６．０、ｃ＝１６．５mg・ml−１）を、追加の対照として、５０mMのトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１mg・ml−１の濃度まで希釈した。参照標準物質溶液は、事前にインキュベーションすることなくアプライした。
【０１０１】
様々な抗体消化溶液を、非還元条件下でアプライした。
【０１０２】
実施例４
様々な試料調製法の比較
還元のみ：
４３μgの抗体を、０．４３Ｍのリン酸トリクロロエチル（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を用いてｃ＝１mg・ml−１の濃度で還元した。この目的のために、３８μlのＴＣＥＰ溶液（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を、５μlのストレスのかけられていない抗体溶液（ｃ＝８．５５mg・ml−１）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、抗体溶液を、１：２（ｖ/ｖ）の比率でギ酸（１％、ｖ/ｖ）を用いて希釈した。ギ酸で希釈した後、抗体の濃度は、０．５mg・ml−１であった。ギ酸の比率は、０．５％（ｖ/ｖ）であった。得られた溶液を、１３,４００rpmで２分間、遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットを用いて注意深く取り出し、分析チューブに移した。４μl（２μg）の抗体をＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした。
【０１０３】
ＩｄｅＳによる消化及び還元：
ＩｄｅＳによる消化は、４３μgの抗体を１mg・ml−１の濃度でインキュベートすることにより行なわれた。この目的のために、５μlのストレスのかけられていない抗体溶液（ｃ＝８．５５mg・ml−１）を、３４μlの５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、４μlのＩｄｅＳ溶液（５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中０．２５mg・ml−１）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、０．２５ＭのＴＣＥＰ（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を用いて０．５mg・ml−１の濃度で還元した。この目的のために、３５μlの消化抗体溶液（ｃ＝１mg・ml−１）を、３５μlのＴＣＥＰ溶液（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、抗体溶液を、１：２（ｖ/ｖ）の比率でギ酸（１％、ｖ/ｖ）を用いて希釈した。ギ酸で希釈した後、抗体の濃度は、０．２５mg・ml−１であった。ギ酸の比率は０．５％であった。得られた抗体溶液を、１３,４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットを用いて注意深く取り出し、分析チューブに移した。８μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした。
【０１０４】
実施例５
ＬＣ−ＭＳ分析法
抗体を、抗体の分解産物を特徴づけるためのＬＣ/ＭＳ分析のために、まずＩｄｅＳで消化し、その後、脱グリコシル化し、その後、還元した。
【０１０５】
ＩｄｅＳによる消化
ＩｄｅＳによる消化のために、４μlのＩｄｅＳ溶液（５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液中ｃ＝０．２５mg・ml−１、ｐＨ８．０）を各々、７．９μlのストレスのかけられた抗体（ｃ＝６．２６mg・ml−１）及び５．８μｌのストレスのかけられていない抗体（ｃ＝８．５５mg・ml−１）に加えた。この溶液を、抗体濃度が１mg・ml−１となるまで５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。酵素：抗体の比は１：５０であった。
【０１０６】
Ｎ−グリコシダーゼＦによる脱グリコシル化
抗体の重鎖の糖構造を、Ｎ−グリコシダーゼＦ酵素を用いて開裂除去した。Ｎ−グリコシダーゼで結合された糖は、ＩｄｅＳによる消化後に、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５mg・ml−１の抗体濃度でインキュベーションすることにより開裂した。開裂は、０．５μl（活性：１０Ｕ・ml−１）のＮ−グリコシダーゼＦの添加により開始された。インキュベーションは３７℃で４時間行なわれた。
【０１０７】
還元−実施例１
ＩｄｅＳにより消化し、６０μlのＴＣＥＰ（リン酸トリクロロエチル；Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）の添加により脱グリコシル化した後に、還元が行なわれた。その後、この混合物を１：２（ｖ/ｖ）の比でギ酸（１％、ｖ/ｖ）で希釈し、これにより、還元溶液中の抗体の濃度が０．１６mg・ml−１となった。ＴＣＥＰの濃度は０．１Ｍであり、溶液中のギ酸の比率は０．５％（ｗ/ｖ）であった。ギ酸及びＴＣＥＰの両方の存在下で３７℃で３０分間インキュベーションを行なった。その後、得られた抗体溶液を、１３４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットにより注意深く取り出し、分析チューブに移した。１３μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした（図８）。
【０１０８】
還元−実施例２
ＩｄｅＳにより消化し、６０μlのＴＣＥＰ（リン酸トリクロロエチル；Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）の添加により脱グリコシル化した後に、還元が行なわれた。その後、この混合物を１：２（ｖ/ｖ）の比でギ酸（１％、ｖ/ｖ）で希釈し、これにより、還元溶液中の抗体の濃度が０．１６mg・ml−１となった。ＴＣＥＰの濃度は０．１Ｍであり、溶液中のギ酸の比率は０．５％（ｗ/ｖ）であった。ギ酸及びＴＣＥＰの両方の存在下で７０℃で１０分間インキュベーションを行なった。その後、得られた抗体溶液を、１３４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットにより注意深く取り出し、分析チューブに移した。１３μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした（図９）。
【０１０９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分離手順
調製物の逆相（ＲＰ）分離が、ミクロ脱気装置、キャピラリーポンプ、ミクロオートサンプラー（温度制御ユニット、カラムオーブンを含む）、及び多波長検出器を備えた、Agilent 1100 Cap-LCシステムで行なわれた(Agilent, Waldbronn)。粒子サイズ３．５μm、孔サイズ３００Å、寸法１．０×２５０mmを有するJupiter C18カラム(Phenomenex, Aschaffenburg)が標準的な分離に使用され、これにより参照基準点が示される。クロマトグラフィー分離は、７５℃、流速４０μl・分−１で行なわれた。各々の調製物において２μgの抗体がカラムにアプライされた。試料成分は、溶出液Ａ（Ｈ２Ｏ中０．５％ギ酸（ｖ/ｖ））から溶出液Ｂ（７０％の２−プロパノール、２０％アセトニトリル、９．５％Ｈ２Ｏ、及び０．５％ギ酸（ｖ/ｖ））へと混合された二相勾配を用いて溶出された。表７は、溶出に使用された勾配のプロファイルを示す。
【０１１０】
【表７】
【０１１１】
溶出された試料成分は、２８０nmの波長でＵＶ検出器を用いて検出された。オンラインＴＯＦ質量分析では、ＨＰＬＣシステムが、micromass LCT質量分析計(Waters, Eschborn)に接続された。１０μlの溶出液Ａを注入することによりブランク値が記録された。
【０１１２】
質量分光分析
液体クロマトグラフィーにより分離された溶出液のオンラインＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析を、電子スプレーイオン源を備えたmicromass LCT質量分析計(Waters, Eschborn)で行なった。データは、８０℃のコーン温度及び１００℃の脱溶媒和温度でポジティブモード（ＥＳ＋）で６００〜２０００amu（原子質量単位、atomic mass units）の質量範囲で記録された。キャピラリー電圧は３０００Ｖであり、コーン電圧は３０Ｖであり、ＲＦレンズ電圧は４００Ｖであり、抽出コーン電圧は１Ｖであった。ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析における他のパラメーター設定は表８に要約されている。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
Hamiltonポンプ(pump 11, Harvard Apparatus)を用いて流速５μl・分−１で質量分析計に供給される５０％アセトニトリル中０．０８５％Ｈ３ＰＯ４を使用して１点校正（LTeff測定）が行なわれた。質量の正確度は約１００ppmであった。データは、Mass Lynx 4.0データ記録ソフトウェアを用いて評価された。
【０１１５】
実施例６
Pursuitジフェニルカラムのマススペクトルと、Jupiter C18カラムのマススペクトルの比較
Jupiter C18カラムと同様に、Pursuitジフェニルカラムでは、ピーク１のプレショルダーにおける酸化ＨＣ−Ｆｃ種（２３７７８Da）の部分的な分離しかできなかった（図８参照）。また、抗体の軽鎖のピログルタメート種でも分離の向上は全く達成されなかった。Jupiter C18カラム並びにPursuitジフェニルカラムではピーク３ａにおいて同等な分解能で溶出された。ＨＣ−Ｆａｂ断片（アミノ酸（ＡＡ）１〜２２０）もまた２つのカラムで同時に溶出され、インタクトなＨＣ−Ｆａｂ種は溶出プロファイルの最後のピークで溶出された。従って、この断片を、Pursuitジフェニルカラムを使用した分離で別個のピークとして分離することは不可能であった。Jupiter C18カラムのマスプロファイルと、Pursuitジフェニルカラムのマスプロファイルの比較により更に、Pursuitジフェニルカラムのピーク３ｂの質量は、Jupiterカラムのピーク４と相関していることが示された。両方が３３６３０Daの質量を示し、これは、ＩｄｅＳ酵素に割り当てられ得る。更に、Pursuit DPカラムのピーク５は、Jupiter C18カラムのピーク５と相関している。両方の場合において、チオエーテルを含むＨＣ−Ｆａｂ−ＬＣ複合体の質量（４８９１８Da）、不完全に還元されたＨＣ−Ｆａｂ断片の質量（２５３７７Da）、及びＮ−グリコシダーゼＦの質量（３４７８３Da）が存在している。
【０１１６】
これに対し、Pursuitジフェニルカラムのピーク４は、Jupiter C18カラムのどのピークとも関連せず、従って、Jupiter C18カラムの溶出プロファイルとは差異が生じている。このピークは質量４８９１６Da（これはチオエーテル種に割り当てられ得る）及び質量４９１１８Daを示す。この質量は、抗体の重鎖の分子量に相当する。従って、質量４９１１８Daは、試料調製の経過中に還元により残りの抗体分子から分離されたＩｄｅＳにより開裂されていないインタクトな抗体重鎖を示す。
【０１１７】
２つのカラムの溶出プロファイルの比較の差異は、ピーク１ａの場合にも見られ、これは、Jupiter C18カラムの溶出プロファイルでは検出不可能である。２００３７Daの質量を有する種が、Pursuitジフェニルカラムのピーク１ａにおいて分離されている。これは、アスパラギン酸２７１（Ｄ２７１）とプロリン２７２（Ｐ２７２）の間のＡｓｐ−Ｐｒｏ開裂の結果として形成されるＨＣ断片に割り当てることができる。Ａｓｐ−Ｐｒｏ開裂のＣ末端断片の理論的質量は、２００３３Daの値を有する。この質量は、ストレスのかけられた抗体のマススペクトルにも、ストレスのかけられていない抗体のマススペクトルにも存在するので、この開裂産物は、４０℃のインキュベーションの結果として得られる分解産物ではない。この断片は、４０℃のインキュベーションにより明らかに形成されるわけではないが、それにも関らず、Pursuitジフェニルカラムによりのみ分離することのできる抗体の分解産物である。Jupiter C18カラムの場合、この断片は、ピーク１のショルダーにおいて酸化種と共に存在し、このことから、Pursuitジフェニルカラムの分離性能がより良好であることが示される。
【０１１８】
PursuitジフェニルカラムとJupiter C18カラムの比較により、Pursuitジフェニルカラムは、特別な点においてJupiter C18カラムよりも良好な分離特性を有し（ピーク１ａ及びピーク４参照）、他の点でも同等な結果を有することが示される。従って、抗体種の分離を効率的に向上させることが可能であった。
【技術分野】
【０００１】
背景情報
製薬産業分野では、近年、とりわけ、酵素、抗体及びサイトカイン（例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、プラスミノーゲンアクチベーターなど）に基づいた製品が非常に成功を収めている。タンパク質治療剤に対する世界中からの要望は年々増している。治療モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ、monoclonal antibodies）は、タンパク質治療薬の中でも重要な一群である。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、単一の抗体形成細胞に由来する免疫細胞（細胞クローン）により分泌されるので、モノクローナルと呼ばれる。モノクローナル抗体の特徴は、それらは各々、免疫原性物質の１つのエピトープのみに指向され、従って、１つの抗原性決定基に対してのみ指向され、それ故、疾病の処置において非常に特異的に使用され得るということである。タンパク質治療薬の例としては、Roche Diagnostics GmbH社のモノクローナル抗体のトラスツズマブ（市販名：ハーセプチン）、ダクリズマブ（市販名：ゼナパックス）及びリツキシマブ（市販名：マブセラ）があり、これらは、とりわけ乳ガン（トラスツズマブ）の処置に、臓器拒絶（ダクリズマブ）の処置に、そして非ホジキンリンパ腫（リツキシマブ）の処置に成功裏に使用されている。
【０００２】
治療モノクローナル抗体は、複雑なバイオテクノロジー過程により得られる。その作製、製剤化、及び保存中に分解産物が形成される場合があり、これは、酸化反応及び脱アミド化反応並びにタンパク質分解的開裂のような過程に起因することが多い（Yan, B., et al., J. Chromatog. A 1164 (2007) 153-161)。生物学的製品の改変により、たとえ改変の程度がほんの僅かであったとしても、分子中の構造的変化に起因する活性及び／又は免疫原性の変化が起こり得る。
【０００３】
バイオ医薬品の品質は、その作用と共に大変に重要である。それ故、治療剤として安全に使用されるためには、作用機序を詳細に調査することに加えて、タンパク質に基づいた薬物の同一性、純度及び活性を測定することは絶対的に不可欠である。
【０００４】
ｍＡｂｓは、様々な分離技術及び試験技術により成功裏に分析することができるが、長年、ＲＰ−ＨＰＬＣ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー）を適用及び最適化することにより、抗体種を分離することは困難であった。しかしながら、分解過程の経過で抗体の様々な改変型が同時に存在することが多いため、多様なクロマトグラフィーバンド及び電気泳動バンドの分析がより困難となっている。高分解能質量分析計を接続された液体クロマトグラフィー分離法（ＬＣ／ＭＳ、液体クロマトグラフィー／質量分析計）による分析により、様々な種の正確な質量に関する情報が得られ、これにより、抗体変種の同定が容易になる（Dillon, T.M., et al., J. Chromatogr. A, 1053 (2004) 299-305)。
【０００５】
ヒト病原体の化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するシステインエンドプロテアーゼＩｄｅＳ（免疫グロブリン分解酵素Ｓ、Immunoglobulin degrading enzyme S）は、Ｍａｃ−１又はｓｉｂ−３８とも呼ばれているが、これは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）抗体の重鎖を特異的に開裂するシステインプロテアーゼである。ＩｇＧは、これまで知られている中で唯一のＩｄｅＳの基質である(Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549)。ＩｄｅＳは、２９アミノ酸を含むシグナルペプチドを含んだ３３９アミノ酸からなり（von Pawel-Rammingen, U., et al., EMBO J. 21 (2002) 1607-1615）、ここでアミノ酸２１４〜２１６によりＲＧＤモチーフが形成されている。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧ（Ｇクラス免疫グロブリン）のアミノ酸２３６と２３７（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の間を開裂し、この部位は、認識配列ＬＬＧＧＰに含まれている。ヒトＩｇＧ２は、認識モチーフＰＶＡＧＰの中のアミノ酸アラニンとグリシンの間で開裂される。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３型のマウス抗体も開裂される（Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549）。
【０００６】
Hess, J.K., et al. (Hess, J.K., et al., J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291)は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いてＩｄｅＳの酵素活性を測定するための質量分光法を報告している。化膿性連鎖球菌から単離され、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、米国公開特許第２００７／０２３７７８４号に報告されている。抗体のＦｃ又はＦａｂ断片の形成法が、欧州特許出願第ＥＰ１４５８８６１号に報告されている。Ａ群ストレプトコッカス由来のＩｄｅＳプロテアーゼが、国際公開公報第２００６／１３１３４７号に報告されている。
【０００７】
発明の要約
本発明は、試料中の抗体及び抗体断片又は改変型の抗体を検出する方法を記載しており、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた溶液中に含まれるインタクトな抗体を検出、及び抗体の断片もしくは改変型を検出する工程
を含むことを特徴とする。
【０００８】
該方法の１つの態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼはＩｄｅＳである。更なる態様において、システインプロテアーゼＩｄｅＳは、化膿性連鎖球菌又はトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）に由来する。他の更なる態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。別の態様は、ｐＨ範囲５．５〜８．５におけるＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションを含む。別の態様において、ｐＨ範囲はｐＨ７．０〜８．０であり、更なる態様においてはｐＨ７．５〜８．０である。他の更なる態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと、試料中に含まれる抗体及び／又は抗体断片のモル比は、１：２５から１：２５００であり、好ましくは１：２５から１：１００である。別の態様において、グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）である。別の態様は、Ｎ−グリコシダーゼＦが、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）に由来していることを特徴とする（EC 3.2.2.18, EC 3.5.1.52）。別の態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨであり、ｐＨ６．０〜６．５で使用される。別の態様において、グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。別の態様において、該方法は、ａ）で得られた試料を、まず最初に、ｂ）の下でＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、その後、グリコシダーゼと共にインキュベートすることを特徴とする。別の態様はまた、還元剤がリン酸トリクロロエチル（ＴＣＥＰ）であるものである。別の態様は、還元剤がギ酸と同時に加えられ、インキュベーションは両試薬の存在下で行なわれるものである。更なる態様は、還元剤とのインキュベーションが、６０℃以上の温度において行なわれるものである。更なる態様において、質量分析は、エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。他の更なる態様において、液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はπ−π相互作用クロマトグラフィーである。疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、別の態様におけるクロマトグラフィーリガンドは、孔サイズ３００Åのクロマトグラフィー材料に結合したＣ８又はＣ１８リガンドのいずれかであるか、あるいは、π−π相互作用クロマトグラフィーの場合ではクロマトグラフィーリガンドはジフェニルリガンドである。更なる態様において、液体クロマトグラフィーに、Jupiter C18カラム又はZorbax 300SB C8カラム又はPursuitジフェニルカラムのいずれかが使用される。別の態様においてPursuitジフェニルカラムが使用される。更なる態様において、工程ｃ）の液体クロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーである。本発明の別の局面は、改変型の抗体を検出する方法であり、この方法において、工程ｃ）では、ｂ）でインキュベートされた試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析している。
【０００９】
本発明は更に、試料中の抗体又は抗体断片を検出するためのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼの使用を包含し、ここでは、試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、そしてグリコシダーゼと共にインキュベートした後、得られた断片を液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする。
【００１０】
本発明の局面はまた、抗体又は抗体断片を検出するためのキットであり、該キットは、
ｉ）化膿性連鎖球菌に由来するＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカムに由来するエンドグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含む。
【００１１】
詳細な説明
本研究は、治療モノクローナル抗体の分解産物及び改変体の分析に関し、これらは、例えば、抗体の作製中、抗体の保存中に、又は抗体の製剤化中のストレス条件により形成される。
【００１２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共に連結しているアミノ酸からなるポリマーである。酵素的に作製されても合成的に作製されてもよい。２０未満のアミノ酸を含むポリペプチドは、「ペプチド」ともいう。
【００１３】
「タンパク質」は、２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む巨大分子であるか、あるいは、１００を超えるアミノ酸からなるポリペプチドである。タンパク質はまた、非ペプチド性成分、例えば炭水化物を含んでいてもよい。炭水化物及び他の非ペプチド性改変が、タンパク質を発現する細胞により加えられ、それ故、細胞型に依存する。本出願では、タンパク質はそのアミノ酸配列により規定される。炭水化物などの改変は、明記されていないが、常に存在していてもよい。
【００１４】
本出願において同義語として使用される用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、少なくとも２本のポリペプチド軽鎖（ＬＣ）及び２本のポリペプチド重鎖（ＨＣ）を含む分子のことをいう。ポリペプチド軽鎖及び重鎖の各々が可変領域（通常、ポリペプチドのアミノ末端）を含み、これには抗原との結合のための結合ドメインが含まれている。ポリペプチド重鎖及び軽鎖の各々が定常領域（通常、ポリペプチドのカルボキシ末端）を含み、これは、例えば、細胞への抗体の結合に関与している。軽ポリペプチドすなわち軽鎖（ＬＣ）は、通常、可変ドメインＶＬ及び定常ドメインＣＬから構成される。重ポリペプチドすなわち重鎖（ＨＣ）は、通常、可変ドメインＶＨ及び定常領域から構成され、この定常領域は、ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び場合によりＣＨ４により構成される。抗体は、数多くの形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに、単鎖（ｓｃＦｖ）で存在し得る（例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; and Hood, L. E., et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd Edition (1984) and Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。抗体（免疫グロブリン、Ｉｇ）は、抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて様々なクラスに分類される：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのクラスのいくつかは、更に、亜クラス（アイソタイプ）へと亜分類され、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４へと、あるいは、ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２へと亜分類される。重鎖の定常領域は、抗体が属するクラスに応じて、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）及びμ（ＩｇＭ）と称される。
【００１５】
一般的なクロマトグラフィー法、例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.); Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, D.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York、は当業者には公知である。
【００１６】
抗体は、改変過程及び分解過程を受け得る、生物学的な巨大分子である。これらの過程は、酵素的（触媒的）過程又は非酵素的（非触媒的）過程に基づき得る（Perkins, M., et al., Pharm. Res. 17 (2000) 1110-1117）。起こることの多い非酵素的分解反応の例が以下に記載されている。
【００１７】
アミノ酸の酸化
抗体の酸化は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸の共有結合的な改変に相当し、これは、反応性酸素種により誘発される。殆ど全てのアミノ酸が原則的には酸化され得るが、メチオニン（Ｍ）及びトリプトファン（Ｗ）が最も酸化に対して感受性が高い。これらのアミノ酸の酸化（図１参照）は、非常に多くの異なるタンパク質において起こり、その生物学的活性を低下または消失させたり、凝集を誘発したり、タンパク質分解を促進したりすることが多いために特に関心が高い（Houde, D., et al., J. Chromatogr. A 1123 (2006) 189-198）。メチオニンからメチオニンスルホキシドへと単純に酸化されることにより、酸化種においてΔｍ＝＋１６Daの質量差が生じる。トリプトファンは通常２回酸化されて、その結果、Δｍ＝＋３２Daの質量差が生じる。更なる反応において、２回酸化型のトリプトファンはキヌレニンへと再編成され、その結果、Δｍ＝＋４Daの質量差が生じる。
【００１８】
アミノ酸の脱アミド化
抗体分子中のアミノ酸の脱アミド化は、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）において起こり得る。しかしながら、通常、アスパラギンで起こる。更に、特定のアミノ酸配列及びアミノ酸組合せ、例えばアスパラギンとグリシン（ＮＧ）、アスパラギンとセリン（ＮＳ）、及びアスパラギンとトレオニン（ＮＴ）が特に受け易い。アスパラギンの脱アミド化が、保存中の生物学的分子の分解の主な原因である。折り畳まれたインタクトな抗体の脱アミド化は、最初、ストレスの高い条件下でゆっくりとしか起こらない。抗体の３次元構造が例えば、還元及び酵素的開裂後に破壊された場合に、脱アミド化が促進される。なぜなら、これらの場合、アミノ酸は、周囲の媒体とより反応し易くなるからである（図２）。アスパラギンは、中間体産物の形態の環式アミド（スクシンイミド）を形成し得、これは自発的に加水分解されることにより、イソアスパルチルペプチドとアスパルチルペプチドの約３：１の比の混合物が生じる（Chelius, D., et al., Anal. Chem. 77 (2005) 6004-6011）。この反応は、塩基性ｐＨ値において優先的に起こる。脱アミド化種のΔｍ＝＋１Daの質量差は、アスパラギンからアスパルテート及びイソアスパルテートへの脱アミド化の結果として起こる。１０kDaを超える分子量を有するペプチド及びタンパク質の場合、現在の質量分析計を使用してΔｍ＝＋１Daの質量差を直接検出することは不可能か又は非常に困難である。更に、荷電分布の変化、より正確には荷電の不均一性の変化が起こる。
【００１９】
チオエーテル結合の形成
非還元性チオエーテル架橋の形成は、モノクローナル抗体、特にＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体で頻繁に観察される現象である。これは、抗体の重鎖と軽鎖を共に連結しているか、又は、軽鎖及び重鎖を分子内的に安定化している、ジスルフィド架橋の中の硫黄原子の消失に基づく。この抗体の改変は、ストレスの高い条件下、この場合では特に高いｐＨ値において好まれる。このような反応はβ脱離であると推定される（Cohen, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc., 129 (2007) 6976-6977）。チオエーテル架橋の形成中に硫黄原子が失われるので、これにより、還元されていない改変された抗体種ではΔｍ＝−３２Daの質量差が生じる。これに対して、このジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ）は抗体の還元中に２つのＳＨ基へと開裂される。この理由から、還元された抗体成分における生じる質量差は、Δｍ＝−３４Daである。
【００２０】
断片の形成
ストレスにより誘発される断片化反応は、通常、タンパク質のポリペプチド鎖中のペプチド結合の加水分解性開裂、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の加水分解性開裂に基づく。タンパク質分解及びこのようなペプチド結合の加水分解は、原則的には、全てのアミノ酸の間で起こり得、特に、立体的緊張、又は、加水分解を好む他のアミノ酸の側鎖が存在する場合に起こり得る。
【００２１】
抗体の特異的開裂
モノクローナル抗体は、非常に大きなタンパク質であり、更に、その重鎖の糖構造に因り極めて不均一（微小不均一）である。分解産物及び改変体の形成について抗体を調べるために、分析前により小さな断片へと開裂することが便宜である。それ故、試料調製の一部としての抗体の開裂は、分析調査を実施する際の重要な方法である。殆どの場合、抗体はジスルフィド架橋の還元によりその重鎖及び軽鎖へと単純に分解される。しかしながら、更に、他の抗体開裂法も存在する。
【００２２】
ジスルフィド架橋の開裂
ＩｇＧ分子に存在する全てのジスルフィド架橋は、還元により開裂することができる。抗体の遊離の重鎖及び軽鎖が、還元中に得られる。トリス−（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、抗体の全てのジスルフィド架橋が短時間で完全に開裂され、還元が全ｐＨ範囲におよび起こるため、しばしば使用されている還元剤である（例えば、Hau, J.C. and Hau, C.Y., Anal. Biochem. 220 (1994) 5-10を参照されたい）。１つの態様において、ｐＨ範囲は１．５〜８．５である。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）もまた、ジスルフィド架橋の急速な開裂を特徴とする。しかしながら、酸性環境におけるＤＴＴ還元は、非常にわずかにしか進行しない。重鎖及び軽鎖の解離を完了させるために通常、変性工程が必要とされる。変性により更にジスルフィド基により近づき易くなる。変性は、例えば、グアニジン/ＨＣｌ又はギ酸を用いて実施することができる。
【００２３】
酵素的開裂
システインプロテアーゼであるパパインは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）及びチロシン（Ｙ）の後で比較的非特異的にペプチド結合を開裂する。インキュベーション時間が十分に長ければ、パパインによる消化により全体の加水分解が行われる。しかしながら、抗体は、限定的なタンパク質分解によりそのヒンジ領域において比較的選択的に開裂され得る（Lottspeich, F., and Engels, J.W., "Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag" Munich 2nd Edition (2006) 201-214）。開裂は、２つの重鎖を共に接続しているジスルフィド架橋のＮ末端側で起こる。ジスルフィド架橋はこの過程において保持されているので、３つの断片（２つのＦａｂ断片、１つのＦｃ断片）が消化後に得られる。２つのＮ末端断片は抗原結合断片（Ｆａｂ、抗原結合断片（antigen-binding fragment））と称され、Ｃ末端断片は結晶性断片（Ｆｃ、結晶性断片（crystallizing fragment））と称される。各Ｆａｂ断片は、完全な軽鎖と、重鎖のアミノ末端半分から構成される。Ｆｃ断片は、重鎖の２つのカルボキシ末端半分から構成され、これらは、ジスルフィド架橋により依然として共に連結されている。
【００２４】
ＩｄｅＳ消化
ＩｄｅＳ（化膿性連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素、immunoglobulin G-degrading enzyme of S. Pyogenes）は、病原性細菌である化膿性連鎖球菌から単離することができる細胞性システインプロテアーゼである。この酵素は、認識配列ＧＰＳＶＦＬＦＰの直前で高い特異性でもってヒトＩｇＧを開裂する。この配列は、ＩｇＧのヒンジ領域の、２つの重鎖（ＨＣ）を共に連結しているジスルフィド架橋のＣ末端側に位置している。開裂により２本の重鎖（２つのＨＣ−Ｆｃ断片）のＣ末端とＦａｂ”断片が得られ、このＦａｂ”断片は、ジスルフィド架橋により連結された軽鎖及び重鎖のＦａｂ断片腕から得られる（図３）（von Pavel-Rammingen, U., et al., EMBO Journal 21 (2002) 1607-1615）。
【００２５】
ＩｄｅＳ抗体断片は、消化後にＤＴＴ又はＴＣＥＰを用いて還元されると、Ｆａｂ”断片の代わりに、抗体の２本の軽鎖（２本のＬＣ）及び重鎖のＮ末端断片（２本のＨＣ Ｆａｂ）が得られる。重鎖のＣ末端（ＨＣ−Ｆｃ）は還元により影響を受けない。
【００２６】
脱グリコシル化
Ｎ−グリコシダーゼＦ酵素は、いわゆるエンドグリコシダーゼであり、糖タンパク質の糖構造、例えば抗体の重鎖の糖構造を、ペプチド鎖と近くのＮ−アセチルグルコサミン残基の間で開裂する。
【００２７】
様々なタンパク質又はペプチド成分の混合物の分析で時として得られる非常に複雑なマススペクトルを、成分を前以って分離することにより単純化するために、液体クロマトグラフィー法と併用した質量分析が行われることが多い（ＬＣ/ＭＳ）。この目的のために、質量分光分析の前に、その成分に従って、溶解された物質混合物を分離するために、とりわけ高性能なＨＰＬＣシステムが使用される。分析混合物のクロマトグラフィーによる分離の結果、成分は異なる時間で分離カラムから溶出し、このように、その溶出順に質量分析計により分析することができる。
【００２８】
溶出プロファイルの各ピークのマススペクトルは、質量分析計と接続されたクロマトグラフィーにより得られる。この利点は、分析物の溶液の全ての成分の複雑な全スペクトルが得られるのではなく、むしろ、理想的な場合では、分離された成分の均一なスペクトルが得られることである。
【００２９】
エレクトロスプレー法（ＥＳＩ）は、質量分析において、溶解された分子をガス性イオンに変換するために頻繁に使用されるイオン化法である。これは、液体を電場に分散させることにより達成される（エレクトロスプレー）。分析物の分子を含む非常に多くの小さな荷電された液滴がこの過程で形成される。
【００３０】
高度に荷電されたイオンの形成が、ＥＳＩ過程の特徴である。従って、所定のタンパク質種のマススペクトルにおいて、その分子量に応じて各々荷電差Δｚ＝１（原則として、ポジティブモードでは１つのプロトンの付加、又は、ネガティブモードでは１つのプロトンの引き算による）を有する全シリーズのイオンシグナルが観察される。タンパク質のスペクトルは、特徴的なおよそベル形状の分子イオン荷電分布を示す。分布の最大値は、ＥＳＩ質量分析計のパラメータ、溶媒のｐＨ、及びタンパク質の変性状態に依存する。ジスルフィド架橋の開裂後、変性の結果として、タンパク質は空間的により広がった構造をとり、それにより、より多くの荷電が分子により受容（又は放出）され得る。それ故、荷電分布の最大値はより高い（より低い）荷電にシフトし得る。
【００３１】
多価荷電分子イオンの荷電数ｎ及び従って分子量（Ｍ）は、荷電分布のいずれか２つの連続的な分子イオン（ｍ２＞ｍ１）の測定されたｍ／ｚ比（ｍ）から計算することができる：
【数１】
【００３２】
ここでのＸは、チャージキャリアの質量であり、すなわち、１つのプロトンの付加の場合ではＸ＝１（ポジティブモード）、１つのプロトンの引き算の場合ではＸ＝−１（ネガティブモード）である。ｎの値は、変数ｎを解き、式１及び２の方程式を解くことにより計算することができる：
【数２】
【００３３】
分子イオンの分子量は、Ｍについて式２を解き、式３でｎの計算結果を使用することにより計算することができる：
【数３】
【００３４】
スペクトルは、コンピュータープログラムを用いて通常分析され、これを使用して全てのシグナル又は個々の選択されたシグナルのいずれかから分子量を決定することができる。結果として、対応する分子量範囲（複雑ではないスペクトル）について再計算された所定のスペクトルを示す、いわゆる再構成が得られる。分子量は、現在では、計算されたピークから直接的に解読することができる。
【００３５】
以前使用されていた方法では起こっていた問題を、本発明に記載の方法を使用することにより防ぐことができることが今回驚くべきことに判明した。また、酵素ＩｄｅＳの使用は、抗体のＬＣ／ＭＳ分析を行なう上で有利であることも驚くべきことに判明した。
【００３６】
従って、本発明の第一の局面は、試料中の抗体及び抗体断片並びに抗体の改変型を検出する方法であり、これは、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物及び／又は抗体の改変型を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた溶液中に含まれるインタクトな抗体を検出及び抗体断片を検出する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３７】
得られた試料は、例えば、抗体を含む溶液、例えば、凍結乾燥抗体製剤の復元溶液であり得る。保存中及び凍結乾燥中に、改変された抗体分子がこの溶液中に形成される。これらの改変は、とりわけ、個々のアミノ酸の酸化及び脱アミド化、チオエーテル結合の形成、及び抗体断片の形成である。
【００３８】
本発明に記載の方法は、様々な薬剤と試料とのインキュベーションを含む。これらの薬剤を使用することにより、試料中に含まれる抗体分子及び抗体断片分子は、所定の断片へと変換される。該方法の１つの態様において、第一インキュベーション工程は、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳ、好ましくは化膿性連鎖球菌又はトレポネーマ・デンティコラ由来のＩｄｅＳを用いた分子の開裂である。更に好ましい態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションは、１つの態様において、ｐＨ５．５〜８．５のｐＨ範囲で行なわれる。１つの態様において、インキュベーションは、ｐＨ７．０〜８．０のｐＨ範囲である。また、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと抗体分子（抗体断片分子を含む）のモル比は、１：２５から１：２５００であり、好ましい態様では１：２５から１：１００とすべきである。
【００３９】
該方法の１つの態様において、第二インキュベーション工程は、グリコシダーゼを用いての抗体断片からの炭水化物の開裂である。１つの態様において、グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＨ、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼ、又はＯ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼから選択される。１つの態様において、グリコシダーゼはＮ−グリコシダーゼＦであり、これはＰＮＧアーゼＦとも呼ばれる。１つの態様において、Ｎ−グリコシダーゼＦは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカムに由来する。１つの態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＦ２であり、これはエンドＦ２とも呼ばれる。別の態様において、エンドグリコシダーゼＦ２は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム又はクリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Chryseobacterium meningosepticum）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＨであり、これはまたエンドＨとも呼ばれる。更なる態様において、エンドグリコシダーゼＨは、ストレプトマイセス・プリカタス（Streptomyces plicatus）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼは、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼであり、これはまたノイラミニダーゼとも呼ばれる。更に別の態様において、アセチル−ノイラミニルヒドロラーゼは、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）に由来する。別の態様において、グリコシダーゼはＯ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎアセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼであり、これはまたＤ−グリコシダーゼとも呼ばれる。１つの態様において、Ｏ−グリコペプチドエンド−Ｄ−ガラクトシル−Ｎアセチル−ａ−ガラクトサミノヒドロラーゼは、肺炎連鎖球菌に由来する。更なる態様において、グリコシダーゼは、ＥＣ３．２．２１８又はＥＣ３．５．１．５２又はＥＣ３．２．１．９６又はＥＣ３．２．１．１８又はＥＣ３．２．１．９７である。更なる態様において、グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
まず最初に、得られた試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、その後、それをグリコシダーゼで処理することが有利である。
【００４１】
第三の工程において、還元剤を加えることにより、好ましくはリン酸トリクロロエチル（ＴＣＥＰ）を加えることによりジスルフィド架橋を開裂する。１つの態様において、還元剤の添加と同時にギ酸を加える。
【００４２】
液体クロマトグラフィーと質量分析の組合せを使用することにより、得られた所定の抗体断片が分析される。個々の断片は液体クロマトグラフィーにより分離され、その後、質量分析計により測定することができる。１つの態様において、質量分析計はエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ）である。１つの態様において、液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はπ−π相互作用クロマトグラフィーである。疎水性相互作用クロマトグラフィーの場合、クロマトグラフィーリガンドは、１つの態様において、孔サイズ３００Åのクロマトグラフィー材料に所在するＣ８もしくはＣ１８リガンドであるか、又は、π−π相互作用クロマトグラフィーの場合、ジフェニルリガンドがクロマトグラフィーリガンドとして使用される。１つの態様において、Jupiter C18カラム又はZorbax 300SB C8カラム又はPursuitジフェニルカラム、好ましい態様において、Pursuitジフェニルカラムが液体クロマトグラフィーに使用される。
【００４３】
本発明は更に、試料中の抗体又は抗体断片を検出するためのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼの使用に関し、これは、試料をＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、得られた断片をグリコシダーゼと共にインキュベートした後に、液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする。
【００４４】
本発明の別の局面は、抗体又は抗体断片を検出するためのキットであり、これは、該キットが、
ｉ）化膿性連鎖球菌由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のエンドグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含むことを特徴とする。
【００４５】
まず最初に、ＩｄｅＳ消化のインキュベーション条件を最適化するために、酵素：抗体比の低下及びインキュベーション時間の短縮について試験された。消化された抗体分析物溶液中の酵素成分の存在が、得られるマススペクトルのシグナルに干渉する可能性があるため、可能な最も短いインキュベーション時間及び可能な最小の酵素：抗体比が、実践的な理由から望ましかった。抗体消化に使用される酵素の量は、これを避けるためにできるだけ少なくすべきである。同時に、抗体分子は消化後に完全に開裂されていなければならない。更に可能な最も多い試料処理量を達成し、実験的な時間経過を最適化するために、完全な消化が確実になされつつもインキュベーション時間は短くすべきである。消化調製物のゲル電気泳動による分離の結果（図７参照）により、予期されるＩｄｅＳ開裂産物に相当する２本の主なバンド（約１００kDa及び約２５kDa）が、全ての消化条件下で形成されたことが示された。分子量約１００kDaを有するより大きな主なバンドは、２本の軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）のＦａｂ断片とを含む、予期される抗体のＦａｂ''部分に相当する。分子量約２５kDaのより小さな主なバンドは、予期されるＨＣのＦｃ断片である。消化調製物のゲル電気泳動による分離の結果により、酵素：抗体の比率は、ＩｄｅＳ消化に対してより有意な効果を及ぼすことが示される。様々な調製物のＩｄｅＳ消化の効率に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、酵素：抗体の比が１：５０、インキュベーション時間が０．５時間及び１時間でも、インタクトな抗体（２ＨＣ／２ＬＣ）のバンドが最小強度で依然として存在することが示される（図７Ａ、レーン６及び９参照）。酵素：抗体の比が同じで、２時間及び５時間のインキュベーション時間では（図７Ｂ、レーン６及び９）、インタクトな抗体分子のバンドは消失していた。従って、好ましいインキュベーション時間は、２時間から５時間の間であり、特に好ましいのは２時間である。また、１８時間のインキュベーション時間及び１：５０、１：５００、１：２５００、１：１００００の酵素：抗体の比は、同じ酵素：抗体比で５時間のインキュベーションと比べて差異は認められなかった。従って、１：２５から１：１００の酵素：抗体比が好ましい。１：５０の酵素：抗体比が特に好ましい。
【００４６】
ＬＣ／ＭＳに基づいた方法には、ストレスにより誘発される分解産物を分離及び検出するのに特に適した試料調製法が含まれる。原則的に、試料調製には可能な４つの変法がある：
１．抗体の還元のみ；
２．抗体を脱グリコシル化し、その後、還元；
３．抗体をＩｄｅＳで消化し、その後、還元；
４．抗体を脱グリコシル化し、その後、ＩｄｅＳで消化し還元
【００４７】
還元しかされていない調製物（変法１）及びＩｄｅＳで消化され還元された調製物（変法３）は、抗体溶液のＬＣ／ＭＳ分析には適していないことが判明した。なぜなら、重鎖の糖構造に因り異種のスペクトルが得られ、これがＬＣ／ＭＳの測定の感度を低下させ、分析をより困難なものとしているからである。
【００４８】
ＩｄｅＳで消化され、脱グリコシル化され、還元された試料調製物は、脱グリコシル化され還元された試料調製物よりも好ましいことが今回驚くべきことに判明した。なぜなら、より小さな抗体断片が得られ、これによりＬＣ／ＭＳ測定の質量分解能にプラスの効果を及ぼし、抗体のＨＣ−Ｆｃ又はＨＣ−Ｆａｂ部分のいずれかに位置及び配置されるように更に存在し得る改変が可能となるからである。更に、重鎖の開裂により、該断片のクロマトグラフィー挙動で起こり得るストレスにより誘発された改変の効果を増幅することにより、互いのその分離を促進することができる。ＩｄｅＳ及びＮ−グリコシダーゼＦの２つの酵素を同時に使用することによる問題はなかった。
【００４９】
実践的な理由から、最初に抗体をＩｄｅＳで消化し、その後、脱グリコシル化することが特に有利であることが判明した。実践的な理由からこのように手順が変更されたが、分析の結果についての有意な効果はなかった。ＴＣＥＰ溶液の添加と同時にギ酸が添加され、すなわち、ギ酸及びＴＣＥＰ溶液は両方共、インキュベーション前に加えられ、よって、１つのインキュベーション中に両成分が存在している。
【００５０】
抗体溶液の分解産物の形成を明瞭かつ簡単に検出し定量するために、それぞれの分解種を分離することが有利である。分析物溶液の分離の品質は、とりわけ、クロマトグラフィーの固定相の特性により有意に影響を受ける。クロマトグラフィー分離の品質は、それぞれのカラムのピーク分解能及びピークの鋭さに基づいて評価された。
【００５１】
カラムを選択する際、カラムマトリックスの極性に加えて更なる重要なパラメーターを、分離においては考慮に入れなければならず、例えば、粒子サイズは、可能な最も高いプレート数を達成するためにできるだけ小さくすべきである。更に、抗体は非常に大きな分子であることを心に留めておくべきである。結果として、マトリックス粒子の孔サイズもまた、適切なカラムを選択する場合に決定的な役割を果たす。マトリックス粒子の孔が大きければ大きいほど、抗体成分が孔の中へと拡散し易くなり、これにより分離が向上する。
【００５２】
参照カラムとして使用されるJupiter C18カラムと比べて、Vydac C4カラムでは、使用されたクロマトグラフィー条件下で、分解産物の分離の効果的な向上は得られなかった。Zorbax 300SB C8は、Jupiter C18カラムとは異なるクロマトグラフィー選択性を示すが、様々な抗体断片の分離に関して同等な良好な結果が得られる。これに対し、Pursuitジフェニルカラムは、向上した分離結果を示した。このカラムの分離プロファイルは、Jupiter C18カラムの分離プロファイルと比べて、溶出プロファイルにおいて良好な分解能及び許容可能なピークの鋭さを持つピーク及びショルダーがより多かった。それ故、このカラムは、本発明の方法に従って得られた抗体の分解産物の分離に好ましい。
【００５３】
以下の実施例、参考文献及び図面により、本発明を更に解明しよう。実際の保護範囲は、本発明に添付の特許請求の範囲から導かれる。
【００５４】
本発明は、抗体の例（ｍＡｂＩＧＦ−１Ｒ）に基づいて以下の実施例において記載されている。これは、本発明を制限するものではなく、むしろ本発明を説明するためだけのものである。
【００５５】
（好ましくはモノクローナル）抗体の例は、WO 02/053596、WO 2004/071529、WO 2005/016967、WO 2006/008639、US 2005/0249730、US 2005/0084906、WO 2005/058967、WO 2006/013472、WO 2006/00181、US 2003/0165502、WO 2005/082415、WO 2005/016970、WO 03/106621、WO 04/083248、WO 2003/100008、WO 2004/087756、WO 2005/005635、WO 2005/094376、及びWO 2007/115814に記載のように、ＩＧＦ−１受容体に対する抗体（ｍＡｂＩＧＦ−１Ｒ）である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】一例としてのメチオニン（ａ）及びトリプトファン（ｂ）の酸化反応（e.g. Taylor, S., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 19587-19590を参照）。
【図２】アスパラギンの脱アミド化及びアスパルテートへの異性体化；塩基性条件下（ｐＨ＞８）では経路Ｉが好ましく、酸性条件下（ｐＨ＜５）では経路ＩＩが好ましい。
【図３】ＩｇＧ１抗体のＩｄｅＳによる消化の図解。
【図４】４０℃でインキュベートし、−８０℃で保存された抗体のゲル電気泳動による分離結果レーン１−試料緩衝液；レーン２−分子量標準物質；レーン３−試料緩衝液；レーン４−還元されていない標準物質；レーン５−還元されていない抗体（−８０℃）；レーン６−還元されていない抗体（３０日間／４０℃）；レーン７−試料緩衝液；レーン８−還元された標準物質；レーン９−還元された抗体（−８０℃）；レーン１０−還元された抗体（３０日間／４０℃）；レーン１１−試料緩衝液；レーン１２−試料緩衝液。
【図５】ストレスのかけられた抗体（１：４０℃、３０日間）及びストレスのかけられていない抗体（２：−８０℃）及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液（３）のＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせ。
【図６】ストレスのかけられた抗体溶液（１：４０℃、３０日間）及びストレスのかけられていない抗体溶液（２：−８０℃）及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液（３）についてのイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム。
【図７】様々な酵素と抗体の比率（１：５０から１：１２５０）及び様々なインキュベーション時間（０．５時間から５時間）でＩｄｅＳにより消化された抗体の分離：レーン番号−ゲルＡ−ゲルＢ：１−試料緩衝液−試料緩衝液；２−分子量標準物質−分子量標準物質；３−標準物質−標準物質；４−消化されていない抗体−消化されていない抗体；５−試料緩衝液−試料緩衝液；６−１：５０、０．５時間−１：５０、２．０時間；７−１：１２５、０．５時間−１：１２５、２．０時間；８−１：１２５０、０．５時間−１：１２５０、２．０時間；９−１：５０、１．０時間−１：１２５、５．０時間；１０−１：１２５、１．０時間−１：１２５、５．０時間；１１−１：１２５０、１．０時間−１：１２５０、５．０時間；１２−試料緩衝液−試料緩衝液。
【図８】Jupiter C18標準カラム（Ａ）及びPursuitジフェニルカラム（Ｂ）でのストレスのかけられた抗体及びストレスのかけられていない抗体の溶出プロファイルの重ね合わせ。
【図９】Pursuitジフェニルカラムでのストレスのかけられた抗体（１）及びストレスのかけられていない抗体（２）の溶出プロファイルの重ね合わせ。
【００５７】
実施例１
材料及び方法
本研究で実験に使用された抗体は、ＩｇＧ１型のヒト組換え抗体である。この抗体は、ＣＨＯ細胞で発現され、アフィニティクロマトグラフィー及び様々なイオン交換クロマトグラフィー工程により精製された。
【００５８】
熱ストレス
約２２mgのＩｇＧ１抗体を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中で透析することにより再緩衝化した。再緩衝化された抗体溶液の一部を、４０℃で３０日間インキュベートした。他の部分は、対照として−８０℃で凍結させた。
【００５９】
透析
透析のために、１．５mlの抗体溶液（ｃ＝１４．６mg/ml）を、スライドＡ−ライザー透析カセット（容量：０．５〜３ｍｌ、分子量排除サイズ：１０kDa）に移し、透析緩衝液中に吊り下げた。透析中は緩衝液を連続的に撹拌し、約８℃に維持した。透析中、透析緩衝溶液を、数回、新しいのと取り換えることにより、緩衝溶液が可能な限り完全に交換されるようにした。表１は、緩衝溶液の交換の時間スキームを示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
透析の完了後、抗体溶液をスライドＡ−ライザーカセットから５mlの反応容器に移した。透析された抗体溶液の容量は、化学天秤（AT261 Delta Range, Mettler-Toledo）で秤量することにより測定した。
【００６２】
滅菌ろ過
透析後、抗体溶液を、細菌レベルの低い条件下で１枚のMinisartシリンジフィルター（０．２μｍ、Sartorius）を通してろ過することにより滅菌した。抗体濃度の測定のためのサンプリングもまた、細菌レベルの低い条件下で行なった。
【００６３】
抗体濃度の測定
抗体濃度は、Uvikon XL型(Goebel Company)のスペクトルフォトメーターで２８０nmでの吸光度の測定により決定した。使用された抗体の消衰係数は１．５５mL・mg−１・cm−１であり、Pace, C.N., et al., (Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423)の方法に従って計算された。
【００６４】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ
抗体溶液は、Power Ease 300電気泳動ステーション並びにInvitrogen社のゲル、緩衝液、及び他の試薬を使用してゲル電気泳動により分離した。トリス−グリシン４〜２０％勾配ゲルを分離に使用した。使用前に２倍の蒸留水で１：１０（ｖ/ｖ）に希釈したトリス−グリシンＳＤＳ泳動緩衝液（１０×）を泳動緩衝液として使用した。
【００６５】
４０℃でインキュベートした抗体溶液及び−８０℃で保存しておいた抗体溶液を、還元条件下並びに非還元条件下でアプライした。５μlのMark 12（商標）タンパク質マーカーも参照物質としてゲルにアプライすることにより、調べる試料の相対的分子量を測定した。電気泳動による分離は１２５Ｖの電圧で行ない、泳動時間は約９５分間であった。ゲル電気泳動後、ゲルを、製造業者の指示に従ってSimply Blue Safe Stain（クーマシーＧ２５０染色溶液）で染色した。その後、ゲルを蒸留水で２回脱色した。
【００６６】
染色されたゲルを、Dry-Easeミニセロファン及び乾燥溶液（１０％グリセロール（ｖ/ｖ）、４０％メタノール（ｖ/ｖ）、１０％酢酸（ｖ/ｖ）、４０％水（ｖ/ｖ））を使用して保存した。このために、ゲルを、５分間、乾燥溶液中でインキュベートし、２つのセロファンを加えた後に更に１０分間インキュベートした。その後、ゲルをセロファン間の泡を除去して置いた後、クランピングフレームで乾燥させた。
【００６７】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために抗体溶液を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で約１mg・ml−１の濃度まで希釈した。その後、１０μl（１０μgの抗体に相当する）の希釈された抗体溶液を、１０μlのＳＤＳ試料緩衝液（２×）と１：２（ｖ/ｖ）の比で混合し、混合し、最後に簡単に遠心分離にかけた。試料を７０℃で１０分間かけて変性させた。その後、それらを再度簡単に遠心分離にかけた。電気泳動分離のために、１６μl（８μgの抗体に相当する）の変性試料をゲルにアプライした。タンパク質マーカーに加えて、１mg・ml−１の濃度まで希釈しその後抗体試料と同じように処理した抗体参照標準物質（ｃ＝１６．５mg・ml−１）を、参照物質としてアプライした。
【００６８】
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、抗体溶液もまた、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて１mg・ml−１の濃度まで希釈した。ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を使用することにより溶液を還元した。抗体が完全に確実に還元されるために、ＤＴＴ溶液をＳＤＳ試料緩衝液（２×）中で１００mMの濃度で調製した。その後、１０μl（１０μgの抗体に相当する）の希釈溶液を、１：２の比率で（ｖ/ｖ）、１０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液＋１００mM ＤＴＴと混合し、混合し、簡潔に遠心分離にかけた。試料を７０℃で１０分間かけて変性させた。その後、再度簡単に遠心分離にかけた。電気泳動分離のために、１６μl（８μgの抗体に相当する）の変性試料をゲルにアプライした。タンパク質マーカーに加えて、１mg・ml−１の濃度まで希釈し、その後、抗体試料と同じように処理した、抗体参照標準物質（ｃ＝１６．５mg・ml−１）を参照物質としてアプライした。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
Tosoh Bioscience CompanyのＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬゲルろ過カラム（７．８×３００mm；５μm、２５０Å）を使用することにより、サイズに従って抗体溶液の成分をクロマトグラフィーにより分離した。分離は、島津−ＨＰＬＣシステムで行なった。試料成分は、２００mMのリン酸カリウム、２５０mMの塩化カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて均一濃度で、３０分間かけて流速０．５ml・分−１で溶出した。ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬゲルろ過カラムの温度は分離中２５℃で一定に維持した。オートサンプラーの温度は６℃であった。試料成分は、ダイオードアレイ検出器を使用して２８０nmの波長で検出された。
【００７０】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
Agilent Companyの弱カチオン交換カラムSynChropak WCX (4.6 x 250 mm, 6 μm, 300A)が、イオンクロマトグラフィーによる抗体溶液の成分の分離に使用された。分離は、島津ＨＰＬＣシステムで行なった。試料成分は、溶出液Ａ（１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）及び溶出液Ｂ（１０mMリン酸ナトリウム緩衝液、７５０mM塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）の２勾配システムを用いて、流速１ml・分−１、泳動時間５５分間で溶出された。溶出プロファイルを表２に示す。SynChropak WCXカチオン交換カラムの温度は、分離中、２５℃で一定に維持した。オートサンプラーの温度は６℃であった。試料成分は、ダイオードアレイ検出器を使用して２８０nmの波長で検出された。
【００７１】
【表２】
【００７２】
実施例２
熱ストレス
モノクローナル抗体の分解産物及び改変体の形成を加速させるために、インキュベーター(Venticell, MM-Medcenter)中で所定の熱ストレスにかけた。インキュベーションのために、透析された抗体溶液を、４０℃で３０日間インキュベートした。更に、２５０μlの抗体溶液を１０μlずつのアリコートに分け、−８０℃で保存した。これらは、ゼロ点の対照として使用した。
【００７３】
３０日後、熱ストレスにかけられたアリコートをインキュベーターから取り出し、微生物の感染について眼で確認した。取り出されたアリコートを反応容器にプールすることにより、均一でストレスのかけられた分析溶液が得られた。抗体溶液を注意深く混合(MS2 minishaker, IKA, Staufen)することにより均質化を行なった。均質化された抗体溶液を、２０μlずつのアリコートに分け、−８０℃で保存した。
【００７４】
液体クロマトグラフィー及び質量分析による分析のために、約２２mgの抗体（ｃ＝１４．６mg・ml−１）を、１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中で再緩衝化し、その後、４０℃で３０日間インキュベートした。
【００７５】
熱でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液の調製
後の分析で、４０℃の保存から得られた抗体溶液において観察された変化が、緩衝溶液中での変化に起因しないことを確かめるために、２つの１５mlアリコートの１０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液を、細菌レベルの低い条件下でろ過することにより滅菌し、また４０℃で３０日間インキュベーター(Venticell, MM-Medcenter)中でインキュベートした。その後の過程は、抗体溶液と同様に行なった。
【００７６】
ゲル電気泳動による熱でインキュベートされた溶液の分析
４０℃でインキュベートし、−８０℃で保存された抗体のゲル電気泳動による分離の結果を図４に示す。４０℃でのインキュベーションにより、抗体分子の凝集物並びに抗体分子の断片が形成される（レーン６及び１０）。インキュベートされていない抗体試料は、非還元条件下でＩｇＧ１分子の典型的なバンドパターンを示す（レーン４及び５を参照）。主なバンドは、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）からなるインタクトな抗体に相当する。更に、構造が完全に保存されていない抗体種のバンドも見られる。これらのバンドは、１本の軽鎖を欠失した２ＨＣ/ＬＣ種、抗体の半分（ＨＣ/ＬＣ）、遊離重鎖（ＨＣ）、及び遊離軽鎖（ＬＣ）である（レーン４及び５を参照）。
【００７７】
この典型的なバンドパターンはまた、４０℃でインキュベートされた還元されていない抗体試料でも基本的に見られる（レーン６を参照）。主なバンドは、ここでもインタクトな抗体である（２ＨＣ/２ＬＣ）。更に、−８０℃で保存された抗体試料よりも高い強度で、様々なインタクトではない抗体種（２ＨＣ/ＬＣ、ＨＣ/ＬＣ、ＨＣ、ＬＣ）のバンドが存在する。更に、ストレスのかけられた試料においては、約９０kDaから２００kDaを超える範囲の更なるバンドが形成されている（レーン６を参照）。主なバンドよりも下に存在する種は抗体断片であり、主なバンドよりも上に存在する種は凝集物である。
【００７８】
ＬＣ/ＭＳによる分析において特に興味深いと思われる２本のバンドは、約２１kDaの領域に存在する（レーン６を参照）。これは、共有結合していないＦａｂ断片であり、ここでは、ＨＣ Ｆａｂ断片（ＡＡ１〜２２０）及びＬＣは、ジスルフィド架橋ではなく、むしろ非共有結合的な相互作用（イオン相互作用、水素結合、双極子間相互作用、ファンデルワールス力）により維持されている。試料は変性条件下でゲルにアプライされるので、ＨＣ Ｆａｂ及びＬＣは、ゲル中に１本のバンドとして出現する（レーン６参照）。これに関して、ゲル中の上のバンドは、ＬＣ（ＬＣ★）であり、下のバンドは、ＨＣ Ｆａｂ断片である(Cohen, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc., 129 (2007) 6976-6977)。第二のＦａｂ断片及びＦｃ断片からなる残りの抗体は、９７kDa及び１１６kDaの領域に弱い強度で存在するバンドに割り当てることができる（レーン６参照）。
【００７９】
還元条件下での分離における主なバンドは、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）である（レーン８、９及び１０参照）。ストレスのかけられていない抗体試料において、２本の主なバンドに加えて、より低い強度で約９７kDa及び１２０kDaの範囲に２本の更なるバンドが存在する。これらは、共有結合した非還元性の凝集物である（レーン８及び９参照）。
【００８０】
４０℃でインキュベートされた抗体溶液は、インキュベートされていない抗体溶液と同じバンドパターンを示す（レーン１０参照）。ストレスのかけられていない試料の場合の非還元性の種に割り当てられ得る２本のバンドは、ストレスのかけられた試料では非常に大きな強度では存在しない（レーン１０参照）。すでに記載された種に加えて（ＨＣ、ＬＣ、及び２本の共有結合された非還元性のバンド）、ストレスのかけられた抗体溶液では約３０kDaから２００kDaの範囲に多くの更なるバンドが存在する。これらは還元された共有結合された凝集物、非還元性の種、及び還元された種の断片である（レーン１０参照）。
【００８１】
ゲルにおいて約９０kDaから９５kDaの位置にあり、抗体の半分に割り当てられ得る、非還元性の凝集物の種のバンドが、ＬＣ／ＭＳ分析において特に興味深い。このバンドの強度は、インキュベーションの結果、有意に増加する。このバンドにおける強度の増加は、チオエーテル種の形成に殆ど起因するようである。この種は、実際の質量が７５kDaの抗体の半分の分子であり、そのＨＣ及びＬＣはジスルフィド架橋によって連結しておらず、むしろ、非還元性のチオエーテル架橋により連結されている(Tous, G.I., et al., Anal. Chem. 77 (2005) 2675-2682)。
【００８２】
ＳＥＣによる熱でインキュベートされた溶液の分析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ストレスにより誘発された断片及び凝集物の形成の概観が得られる。ＳＥＣは天然条件下で行なわれるので、共有結合した凝集物並びに共有結合していない凝集物が分析で検出される。分解産物の形成と４０℃でのインキュベーションの間の関連を確立するために、ストレスのかけられた抗体溶液に加えて、−８０℃で保存されていたストレスのかけられていない試料も分析する。
【００８３】
図５は、４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液、４０℃でインキュベートされた抗体、及び−８０℃で保存された抗体に関するＳＥＣの結果を示す。分析のために５０μl又は５０μgの抗体を、各場合においてアプライした。分子量標準物質の分析結果は、抗体溶液の成分の分子量サイズを決定するための参照物質として作用した。それらを表４に列挙する。表３は、溶出プロファイルにおける様々な抗体種の比率を示す。計算された比率は、存在する全てのピークの面積の合計と比較した、特定の種のピークのそれぞれの面積の比率に基づく。
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】
ストレスのかけられた抗体種の溶出プロファイルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と相関する。またＳＥＣの結果により、凝集物が形成され、抗体がインキュベート中に分解したことが示された（図５参照）。
【００８７】
保持時間が約１５〜１６．５分である主な種は、インタクトな抗体に割り当てることができるが、これは、４０℃でのインキュベーション中に、全面積が約９６％から７２％へと減少している（表３参照）。主な種の保持時間（ＲＴは１５〜１６．５分）は、分子量標準物質に基づくと約１５０kDaの分子量に相当する（表４参照）。１５８kDaを超える分子量を有する凝集物は、約１２〜１４．５分の時間窓で溶出される。この溶出時間を示すピークは、４０℃のインキュベーションの結果、全面積が約３％から約１２％へと増加している（表３参照）。ストレスのかけられた抗体の溶出プロファイルにおいて主な種のピークが減少しつつある領域（ＲＴは約１６．５〜１８分）に明瞭なショルダーが形成されており、これは面積にして約１１％の比率を有し、−８０℃で保存された抗体溶液ではこれ程までは存在していない（図５参照）。ショルダーの領域で溶出される抗体種は、約７０kDaから１２０kDaの分子量を有する（表４参照）。これらは、抗体の半分（ＨＣ/ＬＣ）、１本の軽鎖を欠失した抗体（２ＨＣ/ＬＣ）、及びＦａｂ＋Ｆｃ断片を示す種である。約１９〜２０分の保持時間において更なるピークが更に見られ、これは、約２０kDaから４０kDaの分子量が割り当てられ得る（表４参照）。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）並びに共有結合していないＦａｂ断片のＨＣ Ｆａｂが、この時間窓で溶出される。このピークは、４０℃のインキュベーションの結果、全面積の約１％から５％まで増加する（表３参照）。
【００８８】
４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液の溶出プロファイルと、４０℃でインキュベートされた抗体溶液の溶出プロファイルを比較することにより、緩衝液のインキュベーションの結果としてのピークは全く生じないことが示される。
【００８９】
ＩＥＣによる熱でインキュベートされた溶液の分析
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、抗体分子の改変に起因する荷電の変化を検出するのに適している。
【００９０】
抗体におけるストレスに関連した変化を同定できるようにするために、４０℃でインキュベートされた抗体の他に、−８０℃で保存されたストレスをかけられていない抗体をアプライする。
【００９１】
図６は、ストレスのかけられた抗体溶液及びストレスのかけられていない抗体溶液及び４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝溶液についてイオン交換クロマトグラフィーで得られたクロマトグラムを示す。分析では各場合において５０μl又は２５μgの抗体をアプライした。溶出プロファイルの様々な種の比率を表５に示す。計算された比率とは、存在する全てのピーク面積の合計と比較した、特定の種のピークのそれぞれの面積の比のことをいう。
【００９２】
【表５】
【００９３】
−８０℃で保存された抗体と４０℃でインキュベートされた抗体の溶出プロファイルの比較により、酸性範囲への有意な荷電のシフトがインキュベーションにより誘発されることが示される（図６参照）。従って、インタクトな抗体に割り当てられ得る主な種のピーク（保持時間ＲＴは約２２〜２５分）の強度は、全面積の約６１％から約４０％へと減少し（表５参照）、一方、溶出プロファイルの酸性範囲におけるピーク（ＲＴ１２〜１８分）の強度は有意に増加した（全面積の約８％から約４４％に増加）。ストレスのかけられていない抗体試料の塩基性範囲でみられるショルダーは（ＲＴ２６〜３２分）、４０℃でのインキュベーション中に完全に消失する（図６参照）。代わりに、ストレスのかけられた抗体溶液の場合では、主なピークの酸性部分におけるショルダー（ＲＴ１９〜２２分）は強度が増加する。この場合、面積は全面積の約５％から約１７％へと増加している（表５参照）。４０℃でインキュベートされたプラセボ緩衝液の溶出プロファイルと、４０℃でインキュベートされた抗体溶液の溶出プロファイルの比較により、緩衝液のインキュベーションの結果としてのピークは全く生じないことが示される。
【００９４】
抗体のインキュベーションにより誘発される酸性範囲への荷電シフトは、通常、主に、脱アミド化反応に起因する。脱アミド化反応では、アミノ基がヒドロキシル基により置き換えられ、これにより、分子に更なる負の荷電が導入される。ＩＥＣクロマトグラムの結果により、脱アミド化及び他の荷電変化は、４０℃でのインキュベーションの結果、高度に起こったことが示される。
【００９５】
実施例３
ＩｄｅＳによる消化の最適化
酵素ＩｄｅＳは、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中に１mg/mlの濃度で存在していた。３つの異なるＩｄｅＳ濃度を含む希釈シリーズを、消化溶液への酵素の添加のために調製した。希釈前溶液（Ｖ）中のＩｄｅＳの最終濃度は、０．１mg・ml−１（Ｖ１）、０．０１mg・ml−１（Ｖ２）、及び０．００１mg・ml−１（Ｖ３）であった。希釈は、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して行なった。
【００９６】
分析しようとする抗体は、ヒスチジン緩衝溶液（ｐＨ６．０）中１５．５mg/mlの濃度で存在していた。抗体溶液を、消化溶液に添加するために、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｃ＝５mg・ml−１の濃度まで希釈した。
【００９７】
消化溶液の調製のためのピペッティングスキームは表６に列挙されている。
【００９８】
【表６】
【００９９】
調製された消化溶液を、３７℃で、０．５、１．０、２．０、及び５．０時間インキュベートした。酵素を全く加えない抗体溶液を、ゼロ対照として調製した。対照溶液では、１０μl（５０μg）の抗体をピペットにより、４０μlの５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に加えた。インキュベーションは、３７℃で５．０時間行なった。
【０１００】
更に、抗体参照標準物質溶液（２０mMヒスチジン、２４０mMトレハロース、０．０２％Tween２０中の抗体、ｐＨ６．０、ｃ＝１６．５mg・ml−１）を、追加の対照として、５０mMのトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１mg・ml−１の濃度まで希釈した。参照標準物質溶液は、事前にインキュベーションすることなくアプライした。
【０１０１】
様々な抗体消化溶液を、非還元条件下でアプライした。
【０１０２】
実施例４
様々な試料調製法の比較
還元のみ：
４３μgの抗体を、０．４３Ｍのリン酸トリクロロエチル（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を用いてｃ＝１mg・ml−１の濃度で還元した。この目的のために、３８μlのＴＣＥＰ溶液（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を、５μlのストレスのかけられていない抗体溶液（ｃ＝８．５５mg・ml−１）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、抗体溶液を、１：２（ｖ/ｖ）の比率でギ酸（１％、ｖ/ｖ）を用いて希釈した。ギ酸で希釈した後、抗体の濃度は、０．５mg・ml−１であった。ギ酸の比率は、０．５％（ｖ/ｖ）であった。得られた溶液を、１３,４００rpmで２分間、遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットを用いて注意深く取り出し、分析チューブに移した。４μl（２μg）の抗体をＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした。
【０１０３】
ＩｄｅＳによる消化及び還元：
ＩｄｅＳによる消化は、４３μgの抗体を１mg・ml−１の濃度でインキュベートすることにより行なわれた。この目的のために、５μlのストレスのかけられていない抗体溶液（ｃ＝８．５５mg・ml−１）を、３４μlの５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、４μlのＩｄｅＳ溶液（５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中０．２５mg・ml−１）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、０．２５ＭのＴＣＥＰ（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）を用いて０．５mg・ml−１の濃度で還元した。この目的のために、３５μlの消化抗体溶液（ｃ＝１mg・ml−１）を、３５μlのＴＣＥＰ溶液（Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、抗体溶液を、１：２（ｖ/ｖ）の比率でギ酸（１％、ｖ/ｖ）を用いて希釈した。ギ酸で希釈した後、抗体の濃度は、０．２５mg・ml−１であった。ギ酸の比率は０．５％であった。得られた抗体溶液を、１３,４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットを用いて注意深く取り出し、分析チューブに移した。８μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした。
【０１０４】
実施例５
ＬＣ−ＭＳ分析法
抗体を、抗体の分解産物を特徴づけるためのＬＣ/ＭＳ分析のために、まずＩｄｅＳで消化し、その後、脱グリコシル化し、その後、還元した。
【０１０５】
ＩｄｅＳによる消化
ＩｄｅＳによる消化のために、４μlのＩｄｅＳ溶液（５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液中ｃ＝０．２５mg・ml−１、ｐＨ８．０）を各々、７．９μlのストレスのかけられた抗体（ｃ＝６．２６mg・ml−１）及び５．８μｌのストレスのかけられていない抗体（ｃ＝８．５５mg・ml−１）に加えた。この溶液を、抗体濃度が１mg・ml−１となるまで５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。酵素：抗体の比は１：５０であった。
【０１０６】
Ｎ−グリコシダーゼＦによる脱グリコシル化
抗体の重鎖の糖構造を、Ｎ−グリコシダーゼＦ酵素を用いて開裂除去した。Ｎ−グリコシダーゼで結合された糖は、ＩｄｅＳによる消化後に、５０mMトリス/ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中０．５mg・ml−１の抗体濃度でインキュベーションすることにより開裂した。開裂は、０．５μl（活性：１０Ｕ・ml−１）のＮ−グリコシダーゼＦの添加により開始された。インキュベーションは３７℃で４時間行なわれた。
【０１０７】
還元−実施例１
ＩｄｅＳにより消化し、６０μlのＴＣＥＰ（リン酸トリクロロエチル；Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）の添加により脱グリコシル化した後に、還元が行なわれた。その後、この混合物を１：２（ｖ/ｖ）の比でギ酸（１％、ｖ/ｖ）で希釈し、これにより、還元溶液中の抗体の濃度が０．１６mg・ml−１となった。ＴＣＥＰの濃度は０．１Ｍであり、溶液中のギ酸の比率は０．５％（ｗ/ｖ）であった。ギ酸及びＴＣＥＰの両方の存在下で３７℃で３０分間インキュベーションを行なった。その後、得られた抗体溶液を、１３４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットにより注意深く取り出し、分析チューブに移した。１３μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした（図８）。
【０１０８】
還元−実施例２
ＩｄｅＳにより消化し、６０μlのＴＣＥＰ（リン酸トリクロロエチル；Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ）の添加により脱グリコシル化した後に、還元が行なわれた。その後、この混合物を１：２（ｖ/ｖ）の比でギ酸（１％、ｖ/ｖ）で希釈し、これにより、還元溶液中の抗体の濃度が０．１６mg・ml−１となった。ＴＣＥＰの濃度は０．１Ｍであり、溶液中のギ酸の比率は０．５％（ｗ/ｖ）であった。ギ酸及びＴＣＥＰの両方の存在下で７０℃で１０分間インキュベーションを行なった。その後、得られた抗体溶液を、１３４００rpmで２分間遠心分離にかけた(Minispin, Eppendorf)。上清をピペットにより注意深く取り出し、分析チューブに移した。１３μl（２μg）の抗体を、ＬＣ/ＭＳ実験のカラムにアプライした（図９）。
【０１０９】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分離手順
調製物の逆相（ＲＰ）分離が、ミクロ脱気装置、キャピラリーポンプ、ミクロオートサンプラー（温度制御ユニット、カラムオーブンを含む）、及び多波長検出器を備えた、Agilent 1100 Cap-LCシステムで行なわれた(Agilent, Waldbronn)。粒子サイズ３．５μm、孔サイズ３００Å、寸法１．０×２５０mmを有するJupiter C18カラム(Phenomenex, Aschaffenburg)が標準的な分離に使用され、これにより参照基準点が示される。クロマトグラフィー分離は、７５℃、流速４０μl・分−１で行なわれた。各々の調製物において２μgの抗体がカラムにアプライされた。試料成分は、溶出液Ａ（Ｈ２Ｏ中０．５％ギ酸（ｖ/ｖ））から溶出液Ｂ（７０％の２−プロパノール、２０％アセトニトリル、９．５％Ｈ２Ｏ、及び０．５％ギ酸（ｖ/ｖ））へと混合された二相勾配を用いて溶出された。表７は、溶出に使用された勾配のプロファイルを示す。
【０１１０】
【表７】
【０１１１】
溶出された試料成分は、２８０nmの波長でＵＶ検出器を用いて検出された。オンラインＴＯＦ質量分析では、ＨＰＬＣシステムが、micromass LCT質量分析計(Waters, Eschborn)に接続された。１０μlの溶出液Ａを注入することによりブランク値が記録された。
【０１１２】
質量分光分析
液体クロマトグラフィーにより分離された溶出液のオンラインＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析を、電子スプレーイオン源を備えたmicromass LCT質量分析計(Waters, Eschborn)で行なった。データは、８０℃のコーン温度及び１００℃の脱溶媒和温度でポジティブモード（ＥＳ＋）で６００〜２０００amu（原子質量単位、atomic mass units）の質量範囲で記録された。キャピラリー電圧は３０００Ｖであり、コーン電圧は３０Ｖであり、ＲＦレンズ電圧は４００Ｖであり、抽出コーン電圧は１Ｖであった。ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析における他のパラメーター設定は表８に要約されている。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
Hamiltonポンプ(pump 11, Harvard Apparatus)を用いて流速５μl・分−１で質量分析計に供給される５０％アセトニトリル中０．０８５％Ｈ３ＰＯ４を使用して１点校正（LTeff測定）が行なわれた。質量の正確度は約１００ppmであった。データは、Mass Lynx 4.0データ記録ソフトウェアを用いて評価された。
【０１１５】
実施例６
Pursuitジフェニルカラムのマススペクトルと、Jupiter C18カラムのマススペクトルの比較
Jupiter C18カラムと同様に、Pursuitジフェニルカラムでは、ピーク１のプレショルダーにおける酸化ＨＣ−Ｆｃ種（２３７７８Da）の部分的な分離しかできなかった（図８参照）。また、抗体の軽鎖のピログルタメート種でも分離の向上は全く達成されなかった。Jupiter C18カラム並びにPursuitジフェニルカラムではピーク３ａにおいて同等な分解能で溶出された。ＨＣ−Ｆａｂ断片（アミノ酸（ＡＡ）１〜２２０）もまた２つのカラムで同時に溶出され、インタクトなＨＣ−Ｆａｂ種は溶出プロファイルの最後のピークで溶出された。従って、この断片を、Pursuitジフェニルカラムを使用した分離で別個のピークとして分離することは不可能であった。Jupiter C18カラムのマスプロファイルと、Pursuitジフェニルカラムのマスプロファイルの比較により更に、Pursuitジフェニルカラムのピーク３ｂの質量は、Jupiterカラムのピーク４と相関していることが示された。両方が３３６３０Daの質量を示し、これは、ＩｄｅＳ酵素に割り当てられ得る。更に、Pursuit DPカラムのピーク５は、Jupiter C18カラムのピーク５と相関している。両方の場合において、チオエーテルを含むＨＣ−Ｆａｂ−ＬＣ複合体の質量（４８９１８Da）、不完全に還元されたＨＣ−Ｆａｂ断片の質量（２５３７７Da）、及びＮ−グリコシダーゼＦの質量（３４７８３Da）が存在している。
【０１１６】
これに対し、Pursuitジフェニルカラムのピーク４は、Jupiter C18カラムのどのピークとも関連せず、従って、Jupiter C18カラムの溶出プロファイルとは差異が生じている。このピークは質量４８９１６Da（これはチオエーテル種に割り当てられ得る）及び質量４９１１８Daを示す。この質量は、抗体の重鎖の分子量に相当する。従って、質量４９１１８Daは、試料調製の経過中に還元により残りの抗体分子から分離されたＩｄｅＳにより開裂されていないインタクトな抗体重鎖を示す。
【０１１７】
２つのカラムの溶出プロファイルの比較の差異は、ピーク１ａの場合にも見られ、これは、Jupiter C18カラムの溶出プロファイルでは検出不可能である。２００３７Daの質量を有する種が、Pursuitジフェニルカラムのピーク１ａにおいて分離されている。これは、アスパラギン酸２７１（Ｄ２７１）とプロリン２７２（Ｐ２７２）の間のＡｓｐ−Ｐｒｏ開裂の結果として形成されるＨＣ断片に割り当てることができる。Ａｓｐ−Ｐｒｏ開裂のＣ末端断片の理論的質量は、２００３３Daの値を有する。この質量は、ストレスのかけられた抗体のマススペクトルにも、ストレスのかけられていない抗体のマススペクトルにも存在するので、この開裂産物は、４０℃のインキュベーションの結果として得られる分解産物ではない。この断片は、４０℃のインキュベーションにより明らかに形成されるわけではないが、それにも関らず、Pursuitジフェニルカラムによりのみ分離することのできる抗体の分解産物である。Jupiter C18カラムの場合、この断片は、ピーク１のショルダーにおいて酸化種と共に存在し、このことから、Pursuitジフェニルカラムの分離性能がより良好であることが示される。
【０１１８】
PursuitジフェニルカラムとJupiter C18カラムの比較により、Pursuitジフェニルカラムは、特別な点においてJupiter C18カラムよりも良好な分離特性を有し（ピーク１ａ及びピーク４参照）、他の点でも同等な結果を有することが示される。従って、抗体種の分離を効率的に向上させることが可能であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗体及び抗体断片を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）抗体及び／又は抗体断片を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、及び
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた試料中に含まれるインタクトな抗体を検出及び／又は抗体断片を検出する工程、
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項２】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、ＩｄｅＳであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションは、ｐＨ５．５〜８．５のｐＨ範囲で行なわれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ範囲は、ｐＨ６．５〜８．５であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ範囲は、７．０〜８．０であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと、試料中に含まれる抗体及び／又は抗体断片のモル比は、１：２５から１：２５００であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
モル比は、１：２５から１：１００であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ、又はエンドグリコシダーゼＦ２、又はエンドグリコシダーゼＨ、又はノイラミニダーゼ、又はＯ−グリコシダーゼであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−グリコシダーゼＦは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）から得られることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）−ｉ）、ｂ）−ｉｉ）及びｂ）−ｉｉｉ）でのインキュベーションは、連続的であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）−ｉｉｉ）は、ｉｉｉ）還元剤及びギ酸であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
還元剤は、リン酸トリクロロエチルであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
逆相クロマトグラフィーは、Ｃ８基又はＣ１８基を有するクロマトグラフィー材料を使用することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ジフェニル基を有するクロマトグラフィー材料を使用することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試料中の抗体又は抗体断片を検出するための化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳの使用であって、該試料を、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、そして、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のＮ−グリコシダーゼＦと共にインキュベートした後、得られた断片を、液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする、該使用。
【請求項２１】
抗体又は抗体断片を検出するためのキットであって、該キットは、
ｉ）化膿性連鎖球菌由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含むことを特徴とする、該キット。
【請求項２２】
試料中の改変型の抗体を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析し、これにより、試料中の改変型の抗体を検出する工程
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項１】
試料中の抗体及び抗体断片を検出するための方法であって、以下の工程：
ａ）抗体及び／又は抗体断片を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、及び
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、液体クロマトグラフィーと接続された質量分析計により分析することにより、ａ）で得られた試料中に含まれるインタクトな抗体を検出及び／又は抗体断片を検出する工程、
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項２】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、ＩｄｅＳであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼとのインキュベーションは、ｐＨ５．５〜８．５のｐＨ範囲で行なわれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ範囲は、ｐＨ６．５〜８．５であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ範囲は、７．０〜８．０であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと、試料中に含まれる抗体及び／又は抗体断片のモル比は、１：２５から１：２５００であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
モル比は、１：２５から１：１００であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦ、又はエンドグリコシダーゼＦ２、又はエンドグリコシダーゼＨ、又はノイラミニダーゼ、又はＯ−グリコシダーゼであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
グリコシダーゼは、Ｎ−グリコシダーゼＦであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−グリコシダーゼＦは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）から得られることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
グリコシダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）−ｉ）、ｂ）−ｉｉ）及びｂ）−ｉｉｉ）でのインキュベーションは、連続的であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）−ｉｉｉ）は、ｉｉｉ）還元剤及びギ酸であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
還元剤は、リン酸トリクロロエチルであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
逆相クロマトグラフィーは、Ｃ８基又はＣ１８基を有するクロマトグラフィー材料を使用することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
液体クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ジフェニル基を有するクロマトグラフィー材料を使用することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
試料中の抗体又は抗体断片を検出するための化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳの使用であって、該試料を、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと共にインキュベートし、そして、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のＮ−グリコシダーゼＦと共にインキュベートした後、得られた断片を、液体クロマトグラフィーに接続された質量分析計により分析することを特徴とする、該使用。
【請求項２１】
抗体又は抗体断片を検出するためのキットであって、該キットは、
ｉ）化膿性連鎖球菌由来のＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳ、及び
ｉｉ）フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム由来のグリコシダーゼであるＮ−グリコシダーゼＦ
を含むことを特徴とする、該キット。
【請求項２２】
試料中の改変型の抗体を検出する方法であって、以下の工程：
ａ）抗体及び／又はその開裂産物を含む試料を得る工程、
ｂ）ａ）で得られた試料を、
ｉ）ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ、
ｉｉ）グリコシダーゼ、
ｉｉｉ）還元剤
と共にインキュベートする工程、
ｃ）ｂ）でインキュベートされた試料を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析し、これにより、試料中の改変型の抗体を検出する工程
を含むことを特徴とする、該方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５０５８４９（Ｐ２０１１−５０５８４９Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８４５６（Ｐ２０１０−５３８４５６）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０８００
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０２７８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０６１５３８１５）ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０８００
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０２７８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０６１５３８１５）ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト (25)
【Ｆターム（参考）】
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