抗新形成性のココア抽出物の製造および使用方法
【課題】ココア抽出物を提供する。
【解決手段】以下の工程を含む方法によって調製される、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
発酵していないまたは部分発酵したココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
得られたココア抽出物を精製する。
【解決手段】以下の工程を含む方法によって調製される、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
発酵していないまたは部分発酵したココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
得られたココア抽出物を精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール、好ましくはプロシアニジンにより質的に向上されたポリフェノール等のココア抽出物に関する。本発明はまた、そのような抽出物の調製方法、並びにそれらの、例えば抗新形成剤および抗酸化剤等としての使用に関する。
【０００２】
文献が、クレームの前の、明細書の終りの参考文献の部分に示されている各々の文献の完全な引用とともに、この開示で引用されている。これらの文献は、本発明の分野に関係するものであり；そして、ここに引用されている各々の文献は、ここにおいて参考文献として取り込まれている。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノールは、多様な植物中で生産される信じられないほど多様化した化合物の群であり（非特許文献１）、そのうちのいくつかは食物連鎖に組み込まれている。いくつかの場合において、それらは人間の制限食のために重要な化合物のクラスを代表している。いくつかのポリフェノールは非栄養性であると考えられているが、これらの化合物への関心は、それらの潜在的な健康への有利な効果によるものである。例えば、ケルセチン（フラボノイドの１つ）は、実験動物での研究において抗ガン原性活性を有することが示された（非特許文献２および３）。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキン（フラバン−３−オール）は、白血病ウイルス逆転写酵素活性を阻害する（非特許文献４）。ノボタニン（Ｎｏｂｏｔａｎｉｎ）（加水分解可能なオリゴマー性タンニン）もまた、抗腫瘍性活性を有することが示されている（非特許文献５）。日本の茶を生産している地域においては胃ガンの死亡率が顕著に低いということを静力学的な報告が示している。エピガロカテキン没食子酸は緑茶中の薬理学的活性物質であると報告されている（非特許文献５）。エラグ酸もまた抗ガン原性活性を多様な動物細胞腫瘍モデルで有することが示された（非特許文献６）。最近、プロアントシアニジンオリゴマーの抗変異剤としての利用がキッコーマンコーポレーションによって特許にされた。勿論、食品中のフェノール性化合物の範囲およびその実験動物モデルにおける腫瘍発展の調節は、最近の、２０２ｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで発表された（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【０００４】
しかしながら、これらの報告のうち、ココア抽出物、そのような抽出物の調製方法、またはココア抽出物の抗新形成剤としての利用を教示または示唆するものはなかった。
【０００５】
発酵されていないココア豆はかなりのレベルのポリフェノールを含有するので、本発明者等は、同様な活性および利用が、ココア内の化合物等のココア抽出物に関してもあり得、そのような化合物をココアから抽出し、抽出物の活性を検索することにより明らかにすることが可能であると考えた。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、その大型天然生成物選択プログラムの一部として、多様なＴｈｅｏｂｒｏｍａおよびＨｅｒｒａｎｉａ種を、抗ガン活性に関して検索した。いくつかのココア組織の抽出物において低レベルの活性が報告されたが、その研究は追求されなかった。このように、抗新形成または抗ガン分野において、ココアおよびその抽出物は有用であるとは考えられていなかった；即ち、抗新形成または抗ガン分野の教示は、当業者をココアおよびその抽出物をガン治療として用いることから遠ざけていた。数多くのココアポリフェノールの味覚開発への貢献を研究するための分析的手順が開発されているので（非特許文献７）、本発明者等は抗ガン検索のための試料を調製するために、抗新形成または抗ガン分野の知識とは違う、アナログ法を応用することを決めた。驚くべきことに、この分野の知識、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの検索、に反して、本発明者等はプロシアニジンを含むココアポリフェノール抽出物は、抗ガンまたは抗新形成剤として重要な用途を有していることを発見した。付加的には、発明者等はプロシアニジンを含むココア抽出物が抗酸化剤としての用途を有していることを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ferreira, D. et al., Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803 (1992)
【非特許文献２】Deschner, E. E, et al, Quercetin and Rutin as Inhibitors of Azoxymethanol-Induced Colonic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (1991)
【非特許文献３】Kato, R., et al, Inhibition of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Induced Tumor Promotion and Ornithine Decarboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983)
【非特許文献４】Chu, S.-C., et al., Inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity, J. of Natural Products, 55:2, 179-183 (1992)
【非特許文献５】Okuda, T., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols-Oligomeric Hydrolyzable Tannins and Others-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【非特許文献６】Boukharta, M., et al, Efficacy of Ellagitannins and Ellagic Acid as Cancer Chemopreventive Agents-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【非特許文献７】Clapperton, J., et al, Polyphenols and Cocoa Flavor-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ココア抽出物を製造するための方法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
ココア抽出物を提供することが本発明の別の目的である。
【０００９】
抗酸化組成物を提供することが本発明の別の目的である。
【００１０】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素活性の阻害を示すことが本発明の別の目的である。
【００１１】
腫瘍またはガンを治療するための方法を提供することが本発明のまた別の目的である。
【００１２】
抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を提供することが提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１３】
抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を製造するための方法を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１４】
そして、腫瘍またはガン治療において用いられるキットを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、ココア抽出物が抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成活性を有すること；または、抗酸化組成物であること、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素活性を阻害することが発見された。従って、本発明は実質的に純粋なココア抽出物を提供する。抽出物は好ましくは、ココアプロシアニジン（群）で質的に向上されたポリフェノール（群）等で、（−）エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、２から１２、好ましくは２から５、または４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択される少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール群等のポリフェノール（群）を含んでいる。本発明はまた、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤組成物であって、実質的に純粋な、プロシアニジン（群）により質的に向上されたポリフェノール（群）等のココア抽出物または合成ポリフェノール（群）、および適当な担体から成るものを提供する。抽出物は好ましくはココアプロシアニジン（群）を含んでいる。ココア抽出物は好ましくは、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、そして粉末から活性化合物（群）を抽出することから成る工程によって得られる。
【００１６】
本発明はまた、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）、および、好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必要のある患者を治療する方法を包括する。ココア抽出物は、ココアプロシアニジン（群）であってもよい；そして、好ましくは、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、そして粉末から活性化合物を抽出することから成る工程によって得られる。
【００１７】
付加的には、本発明は、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）、および、抽出物または合成ポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）との混合物に好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必要のある患者を治療するためのキットを提供する。
【００１８】
これらのおよび他の目的および態様が開示されているか、または以下の詳細な説明から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、粗ココアプロシアニジンの画分からの代表的なゲル濾過クロマトグラムを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分離（溶出特性）を示している代表的な逆相クロマトグラムを示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分離（溶出特性）を示している代表的な順相クロマトグラムを示している。
【図３】図３は、いくつかの代表的なプロシアニジンの構造を示している。
【図４Ａ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｃ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｄ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｅ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、ココア抽出物とガン細胞ＡＣＨＮとの間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆Ｍ２ Ｆ４／９２
【図６Ａ】図６Ａは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＡ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ１。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＢ＋Ｅ Ｙ１９２Ｐ１。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＣ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＤ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２。
【図７Ａ】図７Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０２１２Ｐ３。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ｂ ０１６２Ｐ１。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１２２Ｐ３。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１２２Ｐ３。
【図７Ｅ】図７Ｅまでは、ココアプロシアニジン画分ＥとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｐ８。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＢとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９２Ｐ６。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｅ ０２９２Ｐ６。
【図７Ｈ】図７Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＤとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｄ ０２９２Ｐ６。
【図８Ａ】図８Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０９２Ｋ３。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｋ５。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１６Ｋ３。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｋ５。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｋ５。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＢとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９２Ｋ３。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ／Ｅ ０２９２Ｋ４。
【図８Ｈ】図８Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ／Ｅ ０２９２Ｋ５。
【図９Ａ】図９Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）。
【図９Ｃ】図９Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＣとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ｃ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｄ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｅ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＤとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０２６２Ｈ２。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ａ／Ｅ ０２６２Ｈ３。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ ０２６２Ｈ１。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０９２Ａ５。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０９２Ａ５。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆Ｍ１ Ｅ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０３０２Ａ６。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ ０３０２Ａ６。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ＆Ｅ ０２６２Ａ６。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０１９２５８。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０９２５６。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１９２５９。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１９２５８。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０１９２５８。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ａ／Ｅ ０２６２５４。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｅ ０３０２５５。
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ６２５５。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ Ｎ３２Ｓ１。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＣとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｃ Ｎ３２Ｓ２。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ Ｎ３２Ｓ３。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ３２Ｓ３。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ Ｎ２２Ｍ３。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０３０２Ｍ２。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＣとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ／Ｃ ０３０２Ｍ４。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３。
【図１４】図１４は、ココアプロシアニジン（特に画分Ｄ）とＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（細胞／ｍｌｖｓ増殖日数、白丸は対照、黒丸は１２５μｇ画分Ｄ、白逆三角形は２５０μｇ画分Ｄ、黒逆三角形は５００μｇ画分Ｄ）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、画分Ｄ＋Ｅで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞に対するＸＴＴおよびクリスタルバイオレット細胞毒性アッセイの比較を示している（白丸はＸＴＴ、黒丸はクリスタルバイオレット）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＭＤＡ ＭＢ２３１胸部細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＰＣ−３前立腺ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ、黒四角は１μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＨｅｌａ子宮ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、異なったココアポリフェノール画分で処理されたＨｅｌａ子宮ガン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−Ｅ、黒丸は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−Ｃ、白逆三角形は１００μｇ／ｍｌの画分Ｄ＆Ｅ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、１００μｌ／ｍｌでの、異なったココアポリフェノール画分で処理されたＳＫＢＲ−３胸部ガン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は画分Ａ−Ｅ、黒丸は画分Ａ−Ｃ、白逆三角形は画分Ｄ＆Ｅ。
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨｅｌａ細胞との間の典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は５０μｇ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｉ】図１５Ｉは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＳＫＢＲ−３細胞系統との間の典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は５０μｇ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｊ】図１５Ｊは、軟寒天クローニングアッセイを用いた、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨｅｌａガン細胞との間の典型的な投与量反応関係を示している（棒グラフ；コロニー数ｖｓ対照、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｋ】図１５Ｋは、異なるココア遺伝子型から得られた粗ポリフェノール抽出物で処理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖阻害を示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸はＣ−１、黒丸はＣ−２、白逆三角形はＣ−３、黒逆三角形はＣ−４、白四角はＣ−５、黒四角はＣ−６、白三角形はＣ−７、黒三角形はＣ−８；Ｃ−１＝ＵＦ−１２：園芸種＝Ｃｒｉｏｌｌｏおよび記述はＵＦ−１２（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−２＝ＮＡ−３３：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＮＡ−３３（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−３＝ＥＥＧ−４８：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＥＥＧ−４８（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−４＝不明：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述は不明（Ｗ．アフリカ）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−５＝ＵＦ−６１３：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＵＦ−６１３（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−６＝ＩＣＳ−１００：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＩＣＳ−１００（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−７＝ＩＣＳ−１３９：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＩＣＳ−１３９（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−８＝ＵＩＴ−１：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＵＩＴ−１（マレーシア）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）。
【図１５Ｌ】図１５Ｌは、発酵されたココア豆および乾燥されたココア豆から得られた粗ポリフェノール抽出物で処理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖の阻害を示す（完全な発酵段階および太陽での乾燥；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸は０日画分、黒丸は１日画分、白逆三角形は２日画分、黒逆三角形は３日画分、白四角は４日画分、黒四角は９日画分）。
【図１５Ｍ】図１５Ｍは、酵素的に酸化されたココアプロシアニジンのＨｅｌａ細胞に対する影響を示す（ポリフェノールオキシダーゼ処理されたココアポリフェノールに対する投与量反応；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；黒四角は粗ＵＩＴ−１（カフェインおよびテオブロミンとともに）、白丸は粗ＵＩＴ−１（カフェインおよびテオブロミン無し）および黒丸は粗ＵＩＴ−１（ポリフェノールオキシダーゼ分解された）。
【図１５Ｎ】図１５Ｎは、組み合わされたココアプロシアニジン画分ＤおよびＥの、代表的な半調製逆相ＨＰＬＣ分離を示す。
【図１５Ｏ】図１５Ｏは、粗ココアポリフェノール抽出物の、代表的な半調製順相ＨＰＬＣ分離を示す。
【図１６】図１６は、ココアプロシアニジン抽出物および画分のランシマット（Ｒａｎｃｉｍａｔ）酸化曲線を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較して示している（任意の単位ｖｓ時間；破線およびクロス（＋）はＢＨＡおよびＢＨＴ；＊はＤ−Ｅ；ｘは粗試料；白四角はＡ−Ｃ；および白ひし形は対照）。
【図１７】図１７は、キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ触媒鎖分解の、ココアプロシアニジン画分による阻害を示している典型的なアガロースゲルである。（レーン１は、０．５μｇのマーカー（Ｍ）モノマー長キネトプラストＤＮＡ環を含む；レーン２および２０は、トポイソメラーゼＩＩとともに４％ＤＭＳＯ存在下であって、何れのココアプロシアニジンの不在下で保温されたキネトプラストＤＮＡを含む。（対照−Ｃ）；レーン３および４は、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ａの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン５および６は、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｂの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン７、８、９、１３、１４、および１５は、０．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｄの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である；レーン１０、１１、１２、１６、１７、および１８は、０．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である；レーン１９は、５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である。
【図１８】図１８はココアプロシアニジン画分Ｄの、ＤＮＡ修復能を有する、およびそれを欠失している細胞系統に対する投与量反応関係を示している（部分的生存ｖｓμｇ／ｍｌ；左側はｘｒｓ−６ＤＮＡ欠損修復細胞系統、ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８２Ｘ１；右側はＢＲ１ＤＮＡ修復可能細胞系統ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８２Ｂ１）。
【図１９】図１９は、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋Ｅで処理された場合の、アドリアマイシン耐性ＭＣＦ−７細胞に対する投与量反応曲線を、ＭＣＦ−７ ｐ１６８親細胞系統と比較して示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸はＭＣＦ−７ ｐ１６８；黒丸はＭＣＦ−７ ＡＤＲ）。
【図２０】図２０は、順相半調製ＨＰＬＣにより調製された１２の画分の、１００μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのレベルで処理された場合の、Ｈｅｌａ細胞に対する投与量反応効果を示している（棒グラフ、％対照ｖｓ対照および画分１−１２）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上で議論したとおり、今、驚くべきことに、ココア抽出物が抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性、抗酸化活性を示し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害することが発見された。抽出物は、一般的に、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、活性な化合物（群）を脱脂された粉末から抽出することにより調製される。粉末はココア豆およびパルプを凍結乾燥し、ココア豆およびパルプを脱パルプ化し、凍結乾燥されたココア豆を脱穀し、脱穀された豆を粉砕することによって調製されてもよい。活性な化合物（群）の抽出は溶媒抽出技術で可能である。抽出物は精製できる；例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによるかまたは調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によるか、またはこれらの技術の組合せによる。活性を有する抽出物は、何れかの特定の理論に必ず拘束されることを望まないが、プロシアニジン等のココアポリフェノール（群）であると同定された。これらのココアプロシアニジンは、重要な抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性；抗酸化活性；を有し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害する。
【００２１】
本発明のココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む抗ガン、抗腫瘍または抗新形成、または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害組成物は、薬学的分野の当業者によく知られた標準的な技術に従って調製可能である。そのような組成物は、そのような投与を要する患者に対して、医学分野の当業者に良く知られた技術により、年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および投与経路等を考慮して、投与することができる。この組成物は、他の抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤および／または、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤とともに、またはそれと連続的に、再び年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および投与経路等を考慮して、投与することができる。
【００２２】
本発明の組成物の例には、カプセル、錠剤、丸薬、およびその様なもの、並びに咀嚼可能な固体配合物であって、本発明が食用給源なのでそれにふさわしいもの（ココアまたはチョコレート味の固体組成物等）；経口、経鼻孔、経肛門、経膣等の開口部用の液体調製物、懸濁物、シロップまたは内用液等の投与；および、非経口、皮下、皮内、筋内または滅菌懸濁物またはエマルジョン等の静脈内投与（注入可能投与等）が含まれる。しかしながら、組成物中の活性な成分は、血液流中に投与された場合に、血液タンパク質の沈殿により凝集を生じ得るようなタンパク質複合体であるかも知れない；そして、当業者はこのことを考慮すべきである。このような組成物においては、活性ココア抽出物は、好適な担体、希釈液または滅菌水、生理食塩水、グルコースまたはその様なもの等の賦形剤との混合物であってもよい。本発明の活性ココア抽出物は、例えば等圧水性食塩水バッファー中等の再配合のための、凍結乾燥の形状で提供されることもできる。
【００２３】
さらに、本発明は、活性ココア抽出物が提供されているキットを包括する。キットは、適当な担体、希釈液または賦形剤を含む独立したコンテナを有していてもよい。キットはまた、付加的な抗ガン、抗腫瘍または抗新形成剤、または抗酸化剤、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤および／または、共にまたは続けて投与するための、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤を含んでいてもよい。付加的な薬剤（群）は別個のコンテナ（群）中、または活性ココア抽出物との混合物として提供されてもよい。付加的には、キットは、内容物の混合または混合および／または投与のための指示書を含んでもよい。
【００２４】
さらには、本発明は、好ましくはココアプロシアニジンを含むココア抽出物に関して記載されているが、この開示から熟練した有機化学者は、活性化合物を得るための合成経路を理解し想像するであろう。従って、本発明は、合成ココアポリフェノールまたはプロシアニジンまたはその派生体であって、グリコシド、没食子酸、エステル等およびその様なものを腹部がこれに限定されないものをも包括する。
【００２５】
以下の限定的ではない例は説明のみのために提供されており、本発明の限定と考えられるべきではなく、本発明の精神またはその範囲から離れることなく、多くの明白な変化が可能である。
【実施例】
【００２６】
実施例１： ココア給源および調製方法
３種類の認識されたココアの園芸種を代表するいくつかのＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ遺伝子型（Ｅｎｒｉｑｕｅｚ、１９６７；Ｅｎｇｅｌ、１９８１）を、世界の３つの主要なココア生産起源より得た。この研究に用いられたこれらの遺伝子型のリストを表１に示す。収穫されたココアさやを開き、パルプを有する豆を凍結乾燥用に取り除いた。パルプを凍結乾燥された塊から手作業で除去し、豆を以下のように分析した。発酵されていない、凍結乾燥されたココア豆を最初に手作業で脱穀し、ＴＥＫＭＡＲ Ｍｉｌｌで細かい粉末塊へと粉砕した。その結果生じた塊を、続いて、再蒸留ヘキサンを溶媒として用いたＳｏｘｈｌｅｔ抽出で一晩脱脂した。残存溶媒を脱脂された塊から常温で真空により取り除いた。
【表１】
【００２７】
実施例２： プロシアニジン抽出の手順
Ａ．方法１
プロシアニジンは、脱脂され、発酵されていない、凍結乾燥された実施例１のココア豆から、ＪａｌａｌおよびＣｏｌｌｉｎ（１９７７）によって記述された方法の改変型を用いて抽出した。プロシアニジンは、５０ｇの脱脂されたココア塊のバッチから、４００ｍｌの７０％アセトン／脱塩水で２回、続いて４００ｍｌの７０％メタノール／脱塩水により抽出した。抽出物を貯蔵し、溶媒を４５℃で部分的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。その結果生じた水相を、脱塩水で１ｌに希釈し、４００ｍｌ ＣＨＣｌ３ で２回抽出した。この溶媒相は廃棄した。水相を続いて、５００ｍｌ酢酸エチルで４回抽出した。生じたエマルジョンの何れをも、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ２８Ｓ遠心機での、２０００ｇ、３０分間の１０℃での遠心により破壊した。統合された酢酸エチル抽出物に、１００−２００ｍｌの脱塩水を添加した。溶媒を４５℃で部分的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。その結果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。異なったココア遺伝子型より得られた粗プロシアニジンの収量を表２にリストした。
【表２】
【００２８】
Ｂ．方法２
別の選択としては、プロシアニジンは、脱脂された、発酵されていない、実施例１の凍結乾燥ココア豆から７０％水性アセトンにより抽出される。１０ｇの脱脂原料を１００ｍｌの溶媒で５−１０分間スラリー化した。スラリーを４℃で３０００ｇで１５分間遠心し、上清をグラスウールに通した。濾過したものを部分的な真空の下で蒸留し、その結果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。粗プロシアニジンの収量は１５−２０％の範囲にあった。
【００２９】
何れかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、粗収量における違いは、異なった遺伝子型、地理的起源、園芸的種および調製方法によって生じた変化を反映していると信じられている。
【００３０】
実施例３： ココアプロシアニジンの部分精製
Ａ．ゲル濾過クロマトグラフィー
実施例２により得られたプロシアニジンをセファデックスＬＨ−２０（２８ ｘ ２．５ｃｍ）での液体クロマトグラフィーにより部分的に精製した。分離を、脱塩水からメタノールへの段階グラジエントにより支援した。初期グラジエント組成物は脱塩水中の１５％メタノールで開始され、３０分毎に脱塩水中の２５％メタノール、脱塩水中の３５％メタノール、脱塩水中の７０％メタノール、そして最終的には１００％メタノールと段階的に続いて行った。キサンチンアルカロイド（カフェインおよびテオブロミン）の溶出に続く溶出物は単一の画分として集められた。この画分は、キサンチンアルカロイドを含有していない副画分であって、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅと命名された５つの副画分を得るために提出されたものを得た。各々の副画分から、溶媒を４５℃でロータリーエバポレーターを部分真空下で用いて除去した。その結果生じた水相を液体窒素中で凍結させ、ＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システムで一晩凍結乾燥した。画分をしめす代表的なゲル濾過クロマトグラフィーを図１に示す。この方法により、およそ１００ｍｇの材料が副画分化された。
【００３１】
図１：粗プロシアニジンのセファデックスＬＨ−２０上でのゲル濾過クロマトグラフ
クロマトグラフ条件： カラム；２８ ｘ ２．５ｃｍ セファデックスＬＨ−２０、移動相：メタノール／水段階グラジエント、１５：８５、２５：７５、３５：６５、７０：３０、１００：０、１／２時間間隔で段階化した、流速；１．５ｍｌ／分、検出器；ＵＶ＠λ１＝２５４ｎｍおよびλ２＝３６５ｎｍ、チャート速度０．５ｍｍ／分、カラム充填；１２０ｍｇ。
【００３２】
Ｂ．半調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
方法１：逆相分離
実施例２および／または３Ａのプロシアニジンは半調製的ＨＰＬＣによって部分精製された。多様な波長の検出器を備えたヒューレットパッカード１０５０ＨＰＬＣ、１ｍｌ注入ループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅ７０１０注入バルブを、ファルマシアＦＲＡＣ−１００フラクションコレクターと共に組み立てた。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ １０μ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ（６０ ｘ １０ｍｍ）ガードカラムと連結されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ １０μ ＯＤＳカラム（２５０ ｘ ２２．５ｍｍ）上でもたらされた。移動相組成物は、Ａ＝水；Ｂ＝以下の直線的グラジエント条件で用いられたメタノール；［時間、％Ａ］；（０、８５）、（６０、５０）、（９０、０）、および（１１０、０）、流速５ｍｌ／分。
【００３３】
画分Ｄ＋Ｅ中に存在するプロシアニジンの分離のための代表的な半調製的ＨＰＬＣトレースを図１５Ｎに示す。個々のピークおよび選択クロマトグラフ領域を、時間を決めた間隔または手作業でフラクションコレクターによって、更なる精製およびそれに続く評価のために収集した。注入充填量は、物質２５−１００ｍｇの範囲にあった。
【００３４】
方法２．順相分離
実施例２および／または３Ａで得られたプロシアニジン抽出物を、半調製的ＨＰＬＣにより部分精製した。ヒューレットパッカード１０５０ＨＰＬＣシステム、２５４ｎｍでのミリポアウォーターモデル４８０ＬＣ検出器セットを、ピークモードにセットしたファルマシアＦｒａｃ−１００フラクションコレクターとともに組み立てた。分離は、Ｓｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連結されたＳｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉカラム（２５０ ｘ １０ｍｍ）上でもたらされた。プロシアニジンは以下の条件下での直線的グラジエントで溶出した：（時間、％Ａ、％Ｂ）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４）、（６０、４６、５０）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）続いて１０分間再び平衡化した。移動相組成物はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール；およびＣ＝酢酸：水（１：１）。流速３ｍｌ／分を用いた。成分を２５４ｎｍのＵＶで検出し、Ｋｉｐｐ ＆ Ｚｏｎａｎ ＢＤ４１記録器で記録した。注入量は、０．２５ｍｌの７０％水性アセトン中に溶解された１０ｍｇのプロシアニジンの、１００−２５０μｌの範囲であった。代表的な半調製的ＨＰＬＣトレースを図１５ Ｏに示す。個々のピークまたは選択されたクロマトグラフ領域を、時間を決めた間隔で、または手作業でフラクションコレクターにより、更なる精製およびそれに続く評価のために収集した。
【００３５】
ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ １０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）半調製的カラム
２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）ガードカラム
検出器： Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ 分光光度計 モデル４８０＠２５４ｎｍ
流速： ３ｍｌ／分
カラム温度： 室温
注入： ２５０μｌの７０％水性アセトン抽出物：
【００３６】
得られた画分は以下のとおり：
【００３７】
実施例４： プロシアニジン抽出物の分析的ＨＰＬＣ分析
方法１： 逆相分離
実施例３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５μフィルターで濾過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器備えたヒューレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステムにより分析した。分離は、４５℃で、ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２００ ｘ ２．１ｍｍ）上でもたらされた。フラバノールおよびプロシアニジンを、６０％のＢからＡへの直線的グラジエントにより溶出し、続いてカラムをＢで流速０．３ｍｌ／分で洗浄した。移動相組成物は、Ｂ＝メタノール中の０．５％酢酸で、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸である。ＡおよびＢ移動相の酢酸レベルは２％まで増加してもよい。化合物は蛍光によって検出され、λｅｘ＝２７６ｎｍ、でλｅｍ＝３１６ｎｍであった。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキンの濃度は標準参照溶液と関連して決定された。プロシアニジンレベルを（−）−エピカテキンに対する反応因子を用いて評価した。多様な成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つのココア遺伝子型について図２Ａに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺伝子型についても見られた。
【００３８】
ＨＰＬＣ条件： カラム： ２００ ｘ ２．１ｍｍ ヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（５μ）
ガードカラム：２０ ｘ ２．１ｍｍヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（５μ）
検出器： ダイオード配列＠２８０ｎｍ 蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３１６ｎｍ
流速： ０．３ｍｌ／分
カラム温度： ４５℃
【００３９】
方法２： 順相分離
実施例２および／または３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５μフィルターで濾過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器備えたヒューレットパッカード１０９０シリーズＩＩ ＨＰＬＣシステムにより分析した。分離は、３７℃で、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｒｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ５μ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連結された５μ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（２５０ ｘ ３．２ｍｍ）によりもたらされた。プロシアニジンは以下の条件での直線状グラジエントにより溶出した：（時間、Ａ％、Ｂ％）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４）、（６０、４６、５０）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）、続いて８分間再び平衡化した。移動相組成物は、Ａ＝ジクロロメタン、Ｂ＝メタノール、およびＣ＝容量比で１：１の酢酸：水であった。流速は０．５ｍｌであった。成分を、蛍光によりλｅｘ＝２７６ｎｍおよびλｅｍ＝３１６ｎｍで、または２８０ｎｍのＵＶにより検出した。多様な成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つのココア遺伝子型について図２Ｂに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺伝子型についても見られた。
【００４０】
ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ ３．２ｍｍ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（５μ） ２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ（５μ） ガードカラム
検出器： フォトダイオード配列＠２８０ｎｍ
蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３１６ｎｍ
流速： ０．５ｍｌ／分
カラム温度： ３７℃
【００４１】
実施例５： プロシアニジンの同定
プロシアニジンを、セファデックスＬＨ−２０（２８ ｘ ２．５ｃｍ）カラム上での液体クロマトグラフィーで精製し、続いて、１０μ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（１００ ｘ ８ｍｍ）カラムを用いた半調製的ＨＰＬＣまたは５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（２５０ ｘ １０ｍｍ）カラムを用いた半調製的ＨＰＬＣを行った。
【００４２】
特に精製された単離物は、高速原子衝撃質量分析器（ＦＡＢ−ＭＳ）により、ＶＧ ＺＡＢ−Ｔ高解像度ＭＳシステム上で、液体２次イオン質量分析器（ＬＳＩＭＳ）技術を陽および陰イオンモードで用いて分析した。セシウムイオン銃をイオン化源として３０ｋＶで用い、「Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ Ｍａｔｒｉｘ」（１：１ ジチオスレイトール／ジチオエリスリトール）をプロトンドナーとして用いた。
【００４３】
これらの画分のＬＳＩＭＳによる分析的調査により、表３に示されている多くのフラバン−３−オールオリゴマーの存在が明らかとなった。
【表３】
【００４４】
主要な質量断片イオンは、陽および陰イオンの両方のプロシアニジンのＦＡＢ−ＭＳ分析について以前に報告された結果と一致していた（Ｓｅｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９８６およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ｍ／ｚ ５７７（Ｍ＋Ｈ）＋に相当するイオンおよびそのｍ／ｚ ５９９（Ｍ＋Ｎａ）＋でのナトリウム内転は、単離物中に二重結合したプロシアニジンダイマーが存在することを示唆していた。より高度なオリゴマーは、それらのプロトン化分子イオン（Ｍ＋Ｎａ）＋よりも、より多くのナトリウム内転（Ｍ＋Ｎａ）＋を形成しがちであることに注意すると興味深い。プロシアニジン異性体Ｂ−２、Ｂ−５およびＣ−１は、試験的にＲｅｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｓｅｌｆ ｅｔ ａｌ．（１９８６）およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって報告された結果に基づいて同定した。オクタマーおよびデカマーの両方までのプロシアニジンを、部分精製画分中にＦＡＢ−ＭＳによって確認した。付加的に、ドデカマーまでのプロシアニジンの証拠が、順相ＨＰＬＣ分析から観察された（図２Ｂを参照）。何れの特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ドデカマーは抽出および精製計画に用いられた溶媒中での溶解性の限界であると信じられている。表４は、キサンチンアルカロイドを含まない単離物中に見られたプロシアニジンの、逆相ＨＰＬＣ分析に基づいた相対濃度を列挙している。表５は、順相ＨＰＬＣ分析に基づいたプロシアニジンの相対濃度を列挙している。
【表４】
【表５】
【００４５】
図３は、いくつかのプロシアニジン構造を示し、図４Ａ−４Ｅは、以下の抗ガンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図４Ａ−４ＥのためのＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：
ＨＰＬＣ条件： ＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器を備えたヒューレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステム。
【００４６】
カラム： ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２００ ｘ ２．１ｍｍ） ６０％のＢからＡへの直線的グラジエント、流速０．３ｍｌ／分 Ｂ＝メタノール中の０．５％酢酸、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸、λｅｘ＝２８０ｎｍ、λｅｍ＝３１６ｎｍ。
【００４７】
図１５ Ｏは、抗ガンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた付加的な１２の画分の、代表的な半調製的ＨＰＬＣクロマトグラムを示している（ＨＰＬＣ条件は上記と同じ）。
【００４８】
実施例６ ココア抽出物の抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性
元々はＭｏｓｍａｎｎ（１９８３）により開発された、ＭＴＴ（３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）−マイクロタイタープレートテトラゾリウム細胞毒性アッセイを、実施例５の試験試料の探索に用いた。試験試料、標準試料（ｃｉｓｐｌａｔｉｎおよびｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）およびＭＴＴ試薬を１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。連続的希釈物をストック溶液から調製した。試験試料の場合、希釈は０．０１から１００μｇの範囲で０．５％ＤＭＳＯ中に調製された。
【００４９】
全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。細胞を、１０％胎児ウシ血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２４０単位／ｍｌのナイスタチンを含むアルファＭＥＭ中で単層として増殖させた。細胞は加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気中で３７℃で培養した。
【００５０】
トリプシン化の後で、細胞を計数し５０ ｘ １０５ 細胞／ｍｌの濃度に調製した（ガン細胞系統によって異なっていた）。２００μｌの細胞懸濁液をウェルに４列の９６ウェルマイクロタイタープレートに注入した。細胞が４時間取付可能にされた後、２μｌのＤＭＳＯ含有試験試料溶液を、四重に用意したウェルに添加した。初期投与量反応を見つける実験で、試験試料希釈の規模の桁を用いたものを、試験する投与量の範囲を決定するために行った。ウェルの５４０ｎｍでの吸光を続いてＢＩＯ ＲＡＤ ＭＰ４５０プレートリーダー上で測定した。四重に用意された、試験試料で処理されたウェルの吸光度の平均を対照と比較し、その結果を対照の吸光度のパーセンテージ±標準偏差で表した。ＭＴＴの紫のホルマザン生成物への還元は、ウェル中で生きている細胞数と直線的に関連している。このように、還元生成物の吸光度を測定することにより、所定の試験試料投与量における細胞生存のパーセントの定量を行うことができる。対照ウェルは終濃度で１％のＤＭＳＯを含んでいた。
【００５１】
試料の内の２つは、最初にこの手順により試験した。試料ＭＭ１はココアプロシアニジンの非常に粗な単離物を代表し、かなりの量のカフェインとテオブロミンを含有していた。試料ＭＭ２はゲル濾過クロマトグラフィーによって部分精製されたココアプロシアニジン単離物を代表していた。ＭＭ２中にはカフェインとテオブロミンは存在しなかった。両方の試料は、以下のガン細胞系統について前述の手順を用いて活性を検索した。
【００５２】
ＨＣＴ１１６結腸ガン
ＡＣＨＮ腎臓アデノカルシノーマ
ＳＫ−５メラノーマ
Ａ４９８腎臓アデノカルシノーマ
ＭＣＦ−７胸部ガン
ＰＣ−３前立腺ガン
ＣＡＰＡＮ−２膵臓ガン
調べられたガン細胞系統の何れにおいても、ＭＭ１に関しては活性は僅かに見られるかまたは全く見られなかった。ＭＭ２は、ＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３、およびＡＣＨＮガン細胞系統に対して活性を有することが判明した。しかしながら、ＭＭ１およびＭＭ２の両方は、ＭＭＴと、生存細胞数の減少を反映する吸光度の減少を弱めるように干渉することが判明した。この干渉はまた大きな誤差の障害にも貢献しているが、それは、プレートの周辺にそったウェルの内部で化学反応がより迅速に進行するように見えるためである。これらの効果の典型例を、図５に示した。試験材料の高い濃度において、示された高い生存レベルと比較して生存の大きな減少を見ることが期待できる。しかしながら、顕微鏡観察によって、ＭＭＴ干渉効果にもかかわらず、細胞毒性効果が生じていることが判明した。例えば、ＭＭ２のＡＣＨＮ細胞系統に対する効果の、０．５μｌ／ｍｌのＩＣ５０値が、この方式において得られた。
【００５３】
これらの予備的な結果から、本発明者等の見解では、ＭＴＴの干渉を排除するためにアッセイ手法の補正が必要であった。これは以下のようにして実現した。加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気において３７℃で１８時間プレートを保温した後、培地を注意深く吸引し、新鮮アルファ−ＭＥＭ培地で置換した。この培地をアッセイの３日目にウェルから再び吸引し、新たに調製した１００μｌのＭｃＣｏｙ培地で置換した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴストック溶液を１１μｌ、続いて各々のプレートのウェルに添加した。加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気において３７℃で４時間保温した後、イソプロパノール中の０．０４Ｎ ＨＣｌを１００μｌ、プレートの全てのウェルに添加し、続いて混合し、何れかの生存細胞により生成されたホルマザンを可溶化させた。付加的には、活性を有している特定の成分を決定するために、プロシアニジンを副画分化することが決定された
前述の副画分化の手順を更なる検索のための試料調製のために用いた。図１に示した範囲および図４Ａ−４Ｅの成分（群）の配分を代表する５つの画分を調製した。試料は、これらの分析的特徴およびカフェインおよびテオブロミンの不在を表示するため、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅとコード化した。
【００５４】
各々の画分を、独立にＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３およびＡＣＨＮガン細胞系統について検索した。その結果は、活性は何れかの特定の画分に集中してはいないことを示していた。この型の結果は異常ではないと考えられたが、それは「活性な」天然生産物単離物中の成分は相乗効果的に振る舞うことがありえるからである。ココアプロシアニジン単離物（ＭＭ２）の場合は、２０以上の検出可能な成分が単離物に含まれている。独立した成分（群）に活性が関連しているというよりは、異なった画分中に存在する成分の組合せに活性が関連している可能性があることが考えられた。
【００５５】
これらの結果に基づき、画分を組み合わせて同じガン細胞系統についてアッセイを繰り返すことを決定した。いくつかの画分の組合せがＰＣ−３ガン細胞系統に対して細胞毒性を生じさせた。特に、ＭＭ２ＡおよびＭＭ２Ｅの組合せに対するそれぞれ４０μｇ／ｍｌの、およびＭＭ２ＣおよびＭＭ２Ｅの組合せに対するそれぞれ２０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が得られた。活性はＨＣＴ−１１６およびＡＣＨＮ細胞系統に対しても報告されたが、前回のように、ＭＴＴ指示薬の干渉により精密な観察は不可能だった。複数回の実験をくり返しＨＣＴ−１１６およびＡＣＨＮ系統上で行い、データを改善した。しかしながら、これらの結果は細菌汚染および試験試料材料の疲弊により明確なものではない。図６Ａ−６Ｄはココア抽出物とＰＣ−３ガン細胞との間の投与量反応関係を示すものである。
【００５６】
しかしながら、このデータから、ココア抽出物、特にココアポリフェノールまたはプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍、抗ガン、抗新形成活性を、特にヒトＰＣ−３（前立腺）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、およびＡＣＨＮ（腎臓）ガン細胞系統に関して有することは明白である。加えて、これらの結果は特定のプロシアニジン画分がＰＣ−３細胞系統に対して関与していることを示唆している。
【００５７】
実施例７： ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成活性
上記の発見を確認し、さらに組合せ画分を研究するために、別の包括的なスクリーニングを行った。
【００５８】
全ての調製された材料および手順は、試験投与量毎に四重であった標準を、試験投与量毎に八重または十二重に増加させた点を除いて、上記の報告と同一であった。この研究のために、個々の５個のココアプロシアニジン画分、およびその組合せを、以下のガン細胞系統について検索した。
【００５９】
ＰＣ−３前立腺
ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ
ＨＣＴ−１１６結腸
ＡＣＨＮ腎臓
ＭＣＦ−７胸部
ＳＫ−５メラノーマ
Ａ−５４９肺
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病
個々のスクリーニングは、異なった投与量レベル（０．０１−１００μｇ／ｍｌ）の画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ（図４Ａ−４Ｅおよびその検討、前出を参照されたい）を各々の細胞系統についてアッセイすることから成る。組合せのスクリーニングは、同じ投与量レベルの画分Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｄ、Ａ＋Ｅ、Ｂ＋Ｃ、Ｂ＋Ｄ、Ｂ＋Ｅ、Ｃ＋Ｄ、Ｃ＋Ｅ、およびＤ＋Ｅを、各々の細胞系統について組み合わせることから成る。これらのアッセイからの結果は、独立して検討し、続いて全体をまとめた。
【００６０】
Ａ．ＰＣ−３前立腺細胞系統
図７Ａ−７Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図７Ｄおよび７Ｅは、画分ＤおよびＥが、７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。他のプロシアニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分ＤまたはＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々のＩＣ５０値は表６に列挙した。
【００６１】
Ｂ．ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統
図８Ａ−８Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図８Ｄおよび８Ｅは、画分ＤおよびＥが、７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。図８Ｆ−８Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＡ＋Ｂは効果を有していなかったが、一方で画分の組合せＢ＋ＥおよびＤ＋Ｅは、６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であった。他のプロシアニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分ＤまたはＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々のＩＣ５０値は表６に列挙した。これらの結果は、ＰＣ−３細胞系統について得られたものと本質的に同じである。
【００６２】
Ｃ．ＨＣＴ−１１６結腸細胞系統
図９Ａ−９Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＨＣＴ−１１６結腸細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図９Ｄおよび９Ｅは、画分Ｅが、約４００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。この値は実在の曲線を外挿して得た。画分Ｄについての投与量反応曲線の勾配もまた活性を示していることに注意されたい。しかしながら、ＩＤ５０値はこのプロットからは得られなかったが、それは曲線の勾配が、信頼できる値を得るためにはあまりにも浅いものであったためである。図９Ｆ−９Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＢ＋Ｄは認識できる効果を有していなかったが、一方で画分の組合せＡ＋ＥおよびＤ＋Ｅは、それぞれ５００μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であった。他の画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分Ｅが存在する場合には平均で約２５０μｇ／ｍｌであった。外挿されたＩＣ５０値を表６に列挙した。
【００６３】
Ｄ．ＡＣＨＮ腎臓細胞系統
図１０Ａ−１０Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図１０Ａから１０Ｅは、独立の画分はこの細胞系統については活性を有していないことを示している。図１０Ｆ−１０Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＢ＋Ｃは活性ではなかったが、一方で画分の組合せＡ＋Ｅは、５００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であるという結果であった。Ｃ＋Ｄの組合せと同様の投与量反応曲線は不活性と考えられたが、それはそれらの勾配があまりに浅かったからである。その他の画分についての外挿されたＩＣ５０値を表６に列挙した
Ｅ．Ａ−５４９肺細胞系統
図１１Ａ−１１Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６４】
Ｆ．ＳＫ−５メラノーマ細胞系統
図１２Ａ−１２Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６５】
Ｇ．ＭＣＦ−７胸部細胞系統
図１３Ａ−１３Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６６】
Ｈ．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統に対する、本来の典型的な投与量反応曲線を得た。しかしながら、顕微鏡での細胞数の計数ｖｓ異なった画分濃度での時間は、５００μｇの画分Ａ、ＢおよびＤが４日間の期間にわたる８０％の増殖の減少をもたらしたことを示している。代表的な投与量反応関係を図１４に示す。
【００６７】
Ｉ．まとめ
これらのアッセイから得られたＩＣ５０値は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病を除く全ての細胞系統について、表６に集められて列挙されている。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病は意図的に表からはずされたが、それは異なったアッセイの手順を用いたためである。これらの結果の全体的なまとめは、最も高い活性は画分ＤおよびＥに関連するものであることを示している。これらの画分はＰＣ−３（前立腺）およびＫＢ（鼻咽頭／Ｈｅｌａ）細胞系統に対してもっとも活性であった。これらの画分はまた、ＨＣＴ−１１６（結腸）およびＡＣＨＮ（腎臓）細胞系統に対しても活性であったが、しかし、非常に高い投与量においてのみであった。ＭＣＦ−７（胸部）、ＳＫ−５（メラノーマ）、およびＡ−５４９（肺）細胞系統に対しては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はそれでもこれらの細胞系統に関して用途を有しているかもしれない。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞白血病）細胞系統に対しても活性が見られた。画分ＤおよびＥは組成物として最も複雑であることに注意すべきである。しかしながら、このデータから、ココア抽出物、特にココアプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍、抗ガンまたは抗新形成活性を有していることは明白である。
【表６】
【００６８】
実施例８ ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性
いくつかの付加的な生体外アッセイの手順を、実施例６および７で示された結果を補完し、拡張するために用いた。
【００６９】
方法Ａ．クリスタルバイオレット染色アッセイ
全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を含まないＩＭＥＭ中で単層として増殖させた。細胞を加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気中で３７℃で維持した。
【００７０】
トリプシン化の後、細胞を計数し、濃度を１００μｌあたり１０００−２０００細胞に調節した。細胞拡散を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に細胞をプレートする（ウェルあたり１０００−２０００細胞）ことにより決定した。ウェルあたり１００μｌの細胞を添加した後、細胞を２４時間取付可能とした。２４時間の期間の終りには、多様なココア画分を異なった濃度で、投与量反応結果を得るために添加した。ココア画分を２倍の濃度で培地中に溶解させ、各々の溶液の１００μｇを、三重に用意したウェルに添加した。連続した日に、プレートを５０μｌのクリスタルバイオレット（１２５ｍｌのメタノール、３７５ｍｌの水に溶解された２．５ｇのクリスタルバイオレット）で１５分間染色した。染色液を除き、プレートを穏やかに冷水に浸し、過剰の染色を除去した。洗浄をさらに２回くり返し、プレートを乾燥させた。残存している染色は１００μｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム／５０％エタノールを各々のウェルに添加することにより可溶化した。可溶化の後、細胞の数をＥＬＩＳＡプレートリーダー上で５４０ｎｍで定量化した（参照フィルターは４１０ｎｍ）。ＥＬＩＳＡリーダーからの結果は、ｙ軸に吸光度、ｘ軸に日数としてグラフ化した。
【００７１】
方法Ｂ．軟寒天クローニングアッセイ
Ｎａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記述された方法に従って、細胞を軟寒天中にクローン化した。単一の細胞懸濁液を、０．８％寒天を含む培地中に様々な濃度のココア抽出物と共に生成した。懸濁液は１．０％寒天を含有する培地でコートされた３５ｍｍのディッシュに分配した。１０日間の保温の後、直径６０μｍ以上のコロニーの数を、Ｏｍｉｃｒｏｎ ３６００イメージ分析システム上で計数した。この結果は、ｙ軸上にコロニーの数、そしてココア画分の濃度をｘ軸上にプロットした。
【００７２】
方法Ｃ．ＸＴＴマイクロカルチャー テトラゾリウムアッセイ
Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）によって記載されたＸＴＴアッセイの手順を、多様なココア画分の検索のために用いた。ＸＴＴアッセイは、以下の変更を除いては、実質的には記載されたＭＴＴを用いた手順（実施例６）と同じである。ＸＴＴ（（２、３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド）を、１ｍｇ／ｍｌで血清を含まない培地で調製し、３７℃で前加熱した。ＰＭＳを５ｍＭ ＰＢＳで調製した。ＸＴＴおよびＰＭＳは共に混合した；１０μｌのＰＭＳを１ｍｌあたりのＸＴＴ、および５０μｌのＰＭＳ−ＸＴＴを各々のウェルに添加した。３７℃で４時間の保温の後、プレートを３０分間、機械式振とう機で混合し、４５０−６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、吸光度をｙ軸に、増殖日数または濃度をｘ軸にプロットした。
【００７３】
方法ＡおよびＣについては、結果はまた、パーセント対照をｙ軸に、増殖日数または濃度をｘ軸にしてプロットした。
【００７４】
ＸＴＴおよびクリスタルバイオレットアッセイ手順比較を、ココア画分Ｄ＆Ｅ（実施例３Ｂ）を胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８に対して行い、どのアッセイが最も敏感であるか決定した。図１５Ａに示されたとおり、両方のアッセイは、濃度＞７５μｇ／ｍｌでは同じ投与量反応効果をしめした。この値より小さい濃度では、クリスタルバイオレットはＸＴＴアッセイの結果よりも高い標準偏差を示した。しかしながら、クリスタルバイオレットアッセイはより容易に用いることが出来るので、全てのこの後のアッセイは、特に断らないかぎり、この手順により行った。
【００７５】
クリスタルバイオレットアッセイの結果は示されているが（図１５Ｂ−１５Ｅ）、粗ポリフェノール抽出物（実施例２）の、胸部ガン細胞系統ＭＤＡ ＭＢ２３１、前立腺ガン細胞系統ＰＣ−３、胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６３、および子宮ガン細胞系統Ｈｅｌａそれぞれに対する効果を表している。全ての場合において、２５０μｇ／ｍｌの投与量は完全に全てのガン細胞の増殖を、５−７日の期間にわたって阻害した。Ｈｅｌａ細胞系統はこの抽出物に対して最も感受性であるように見えたが、それは１００μｇ／ｍｌの投与量でもまた生育を阻害したからである。実施例３Ｂ由来のココア抽出物はまた、Ｈｅｌａおよび他の胸部ガン細胞系統ＳＫＢＲ−３に対してアッセイした。結果（図１５Ｆおよび図１５Ｇ）は、画分Ｄ＆Ｅが最も高い活性を有していることを示している。図１５Ｈおよび１５Ｉに示されているとおり、約４０μｇ／ｍｌのＤ＆ＥのＩＣ５０値が両方のガン細胞系統に対して得られた。
【００７６】
ココア画分Ｄ＆Ｅはまた、試験化合物（群）の固定独立増殖を阻害する能力を決定するための軟寒天クローニングアッセイにおいてもまた試験された。図１５Ｊに示されているとおり、１００μｇ／ｍｌの濃度でＨｅｌａ細胞のコロニー形成を完全に阻害した。
【００７７】
３種類のココア園芸種を代表している、８種類の異なったココア遺伝子型から得られた粗フェノール抽出物についてもまた、Ｈｅｌａ細胞に対してアッセイした。図１５Ｋに示されているように、全ての多様なココアは同様の投与量反応効果を示した。ＵＩＴ−１種はＨｅｌａ細胞に関して最も高い活性を示した。これらの結果は、全てのココア遺伝子型が、地理的起源、園芸種および遺伝子型とは独立に、少なくとも１つのヒトガン細胞系統に対して活性を誘導するポリフェノール画分を有していることを示している。
【００７８】
別の一連のアッセイを、１トンスケールの、ブラジルココア豆の伝統的な５日間の発酵で、その後４日間の太陽乾燥段階を行ったものから、毎日の基本として調製された粗ポリフェノール抽出物について行った。図１５Ｌに示された結果は、これらの初期処理工程の明白な影響を示しておらず、ポリフェノールの成分のわずかな変化を示唆していた。しかしながら、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）が発酵工程の間にポリフェノールを酸化することが知られている（Ｌｅｈｒｉａｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、１９８３）。酵素的に酸化されたポリフェノールが活性にどのような効果を有するかを決定するために、別の実験を行った。粗ＰＰＯを、細かく粉砕された、発酵されていない、凍結乾燥され、脱脂されたブラジルココア豆を、１ｇの粉末に対して１０ｍｌのアセトンで抽出することにより調製した。スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。これを３回くり返し、上清をその度に廃棄し、ブフナー漏斗を通して注いだ４回目の抽出を行った。アセトン粉末は空気乾燥され、続いてＭｃＬｏｒｄ ａｎｄ Ｋｉｌａｒａ（１９８３）によって記述された手順に従ってアッセイした。粗ポリフェノール溶液（１００ｍｇ／１０ｍｌクエン酸−リン酸バッファー、０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）に、１００ｍｇのアセトン粉末（４０００μ／ｍｇタンパク質）を添加し、スラリー中を泡立たせた空気流とともに３０分間撹拌した。この試料を、５０００ｇで１５分間遠心し、上清を３回２０ｍｌ酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を統合し、部分的真空下で蒸留し乾燥させ、５ｍｌの水を添加し、続いて凍結乾燥を行った。物質を続いてＨｅｌａ細胞に対してアッセイし、投与量反応を酵素的に処理されていない粗ポリフェノール抽出物と比較した。結果（図１５Ｍ）は、酵素的に酸化された抽出物の投与量反応曲線は顕著に変化していることを示し、酸化された生成物はそれらの天然型よりも阻害的であることを示した。
【００７９】
実施例９： プロシアニジンを含むココア抽出物の抗酸化剤活性
文献中の証拠は、天然に生成される抗酸化剤（ビタミンＣ、Ｅ、およびＢ−カロテン）の消費と、ガンを含む病気の低減された発生率との関係を示唆している（Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｆｏｏｄｓ、１９９３；Ｃａｒａｇａｙ、１９９２）。これらの抗酸化剤は、いくつかの腫瘍成長の型に関与している、特定の酸化的でフリーラジカル工程に影響すると一般に考えられている。付加的には、抗ガン原性であることが示されているいくつかの植物ポリフェノール性化合物は、実質的な抗酸化剤活性もまた有している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００８０】
プロシアニジンを含むココア抽出物が抗酸化剤活性を有するか否かを決定するために、標準的なＲａｎｃｉｍａｔ法を用いた。実施例１、２および３に記載された手順を、ココア抽出物を調製するために用い、抽出物をさらに２つのゲル濾過由来の画分を生成させるために操作した。これらの２つの画分は実際には画分ＡからＣを統合したもの、およびＤとＥ（図１を参照）であり、それらの抗酸化剤特性を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較した。
【００８１】
ローストされていないピーナツから、皮を除去してピーナツ油をプレスした。各々の試験化合物は、各々試験化合物を、１００ｐｐｍ程度と２０ｐｐｍ程度の２つのレベルで（実際のレベルは表７中に示されている）油中に添加した。５０μｌのメタノール可溶化抗酸化剤を、各々の試料に抗酸化剤の分散を補助するために添加した。抗酸化剤を含まない５０μｌのメタノールを有する対照試料を調製した。
【００８２】
試料を、酸化安定性に関して、１００℃で２０ｃｃ／分の空気でのＲａｎｃｉｍａｔ安定性試験を用いて二重に評価した。実験的変数は活性酸素法（ＡＯＭ）またはＳｗｉｆｔ安定性試験（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１）について用いられたものと対応させて選択した。典型的なＲａｎｃｉｍａｔトレースは図１６に示されている。結果を表８に、１００ｍｅｇの過酸化物レベルに達するために必要な時間として報告する。
【表７】
【表８】
【００８３】
これらの結果は、試験された全ての添加物について、ピーナツ油の増加した酸化安定性を示した。酸化安定性の最も高い増加は、ココアの酢酸エチル粗抽出物を添加した試料によって実現された。これらの結果は、プロシアニジンを含むココア抽出物は、同じ量の合成ＢＨＡまたはＢＨＴと同等かまたはそれ以上の抗酸化的潜在性を有することを示している。従って、本発明は、例えば抗酸化剤および／または食品添加物等の公知のＢＨＡまたはＢＨＴの用途においてＢＨＡまたはＢＨＴに代わって用いられ得る。そして、この点に関して、本発明は食品の給源由来であることにも注意すべきである。これらの得られた結果から、当業者は、そのような「ＢＨＡまたはＢＨＴ」の用途における本発明の好適な量、例えば食品への添加量を、実験によらずに容易に決定できる。
【００８４】
実施例１０： トポイソメラーゼＩＩ阻害の研究
ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＩＩは、ＤＮＡ鎖の開裂および再結合を触媒し、それによりＤＮＡの位相的状態を制御している酵素である（Ｗａｎｇ，１９８５）。細胞内のトポイソメラーゼの機能の研究に加え、最も重要な発見の１つは、トポイソメラーゼＩＩが、介在物質（ｍ−ＡＭＳＡ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）並びに非介在エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）を含む数多くの診療において重要な抗腫瘍化合物に対する主要な細胞内標的として同定されたことである（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。いくつかの証拠の系統が、いくつかの抗腫瘍薬が、変性剤へさらすとＤＮＡの分解という結果となるＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ複合体（分解複合体）を安定化するという共通の特性を有することを示している（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。抗腫瘍薬による分解複合体形成は、細胞死につながりうる巨大ＤＮＡ反転をもたらすことが提唱されている。
【００８５】
この魅力的なモデルに従えば、特定のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ分解複合体の新規な誘導剤が、抗ガン、抗腫瘍、抗新形成剤として有用である。細胞毒性化合物を、標的ＤＮＡの活性により同定する試みにおいて、ココアプロシアニジンを、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対する促進された細胞毒性活性およびリンパ腫から得られたヒトトポイソメラーゼＩＩでの酵素アッセイに関して検索した。
【００８６】
Ａ．キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩによる鎖分解（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）
Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されている、キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩの鎖分解の生体外での阻害を以下のように行った。トポイソメラーゼＩＩ活性を含む核抽出物を、ヒトリンパ腫からＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）およびＤａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）の方法を変更して抽出した。精製酵素の１単位は０．２５μｍｏｌのキネトプラストＤＮＡを３４℃で３０分間に鎖分解する（ｄｅｃａｔｅｎａｔｅ）ために十分なものである。キネトプラストＤＮＡは、トリパノソーマ類Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａから得た。各々の反応は、１９．５μｌＨ２ Ｏ、２．５μｌ １０ｘバッファー（１ｘバッファーは、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、０．５ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭジチオスレイトールおよび３０μｇ ＢＳＡ／ｍｌを含む）、１μｌキネトプラストＤＮＡ（０．２μｇ）、および、１μｌの、様々な濃度での、ＤＭＳＯ含有ココアプロシアニジン試験画分を含む０．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中で行った。この組合せを、完全に混合し氷上に保存した。１単位のトポイソメラーゼを、３４℃で３０分間ウォーターバス中で保温する直前に添加した。
【００８７】
保温に続いて、鎖分解アッセイは５μｌ停止バッファー（５％サルコシル、０．００２５％ブロモフェニルブルー、２５％グリセロール）の添加により停止させ、氷上に静置した。ＤＮＡを、エチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）を含むＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上で電気泳動させた。波長３１０ｎｍでの紫外線発光により、ＤＮＡを可視化した。ポラロイドランドカメラを用いてゲルを撮影した。
【００８８】
図１７は、これらの実験の結果を示している。完全に鎖形成されたキネトプラストＤＮＡは１％アガロースゲル中で移動しない。キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩによる鎖分解は、ゲル中で移動するモノマーＤＮＡ（モノマーサークル、Ｉ型およびＩＩ型）を生じさせる。ココアプロシアニジンの添加による酵素の阻害は、増加する濃度の関数としてのモノマーバンドの増加的な消失から明らかである。これらの結果に基づいて、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥは、０．５から５．０μｇ／ｍｌの範囲にある濃度でトポイソメラーゼＩＩの阻害を示した。これらの阻害剤濃度は、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｈｒｏｎｅ）およびｍ−ＡＭＳＡ（４’−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルホン−ｍ−アニシジド）について得られたものと非常に類似したものであった。
【００８９】
Ｂ．薬剤感受性細胞系統
ココアプロシアニジンを、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対して検索した。これらの細胞系統の１つは、Ｐ．Ｊｅｇｇｏによって開発されたｘｒｓ−６ＤＮＡ二本鎖修復変異体である（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ｘｒｓ−６細胞系統のＤＮＡ修復欠損は、それら自身を、Ｘ照射、ＤＮＡ二本鎖形成を直接破壊するブレオマイシン等の化合物、およびトポイソメラーゼＩＩを阻害し、それにより間接的に二本鎖を破壊するＷａｒｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって提唱された化合物に対して特に感受性であるものとする。修復欠損系統に対しての細胞毒性を、ＤＮＡ修復能力の高いＣＨＯ系統、ＢＲ１に対する細胞毒性と比較した。修復欠損（ｘｒｓ−６）系統に対しての促進された細胞毒性を、ＤＮＡ分解二本鎖破壊の形成に対する証拠として解した。
【００９０】
ＤＮＡ修復可能ＣＨＯ系統、ＢＲ１は、Ｂａｒｒｏｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって開発され、Ｏ６ −アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼを、通常のＣＨＯ ＤＮＡ修復酵素に加えて発現する。ＣＨＯ二本鎖破壊修復欠損系統は、Ｐ．Ｊｅｇｇｏ博士およびその共同研究者（Ｊｅｇｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）からの寛大なる贈り物である。これらの両方の系統をアルファ−ＭＥＭ含有血清および抗生物質中で実施例６に記載のとおりに単層として増殖させた。細胞は加湿５％ＣＯ２ 雰囲気下で維持した。ココアプロシアニジン処理の前に、単層として増殖させた細胞をトリプシン処理により引き離した。実施例６に記載されているＭＴＴアッセイの手順を用いたアッセイを行った。
【００９１】
その結果は（図１８）、ｘｒｓ−６に対する促進された細胞毒性はみられないことを示し、ココアプロシアニジンは分解二本鎖破壊形成とは異なった方式でトポイソメラーゼＩＩを阻害したことを示唆していた。即ち、ココアプロシアニジンは、トポイソメラーゼＩＩと、それがＤＮＡと相互作用し非分解型複合体を形成する前に相互作用する。
【００９２】
非分解型複合体形成化合物は比較的新しい発見である。アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ポドフィリンアルカロイド（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ ａｌｋａｌｏｉｄ）、アントラセネジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎ）、アクリジンおよびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）の同類は、全て臨床用の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成のための使用が是認されており、それらは分解型複合体を形成する（Ｌｉｕ、１９８９）。いくつかの新しいクラスの、分解型複合体を形成するようには見えないトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が近年同定されてきた。これらには、アモナフィド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）（Ｈｓｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ディスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）（Ｆｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、フラバノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、メンブラノン（ｍｅｍｂｒａｎｏｎｅ）（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）（Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、アントラピラゾール（ａｎｔｈｒａｐｙｒａｚｏｌｅ）（Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、ジオキソピペラジン（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）およびマリンアクリジン−デルシチン（ｍａｒｉｎｅ ａｃｒｉｄｉｎｅ−ｄｅｒｃｉｔｉｎ）（Ｂｕｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）が含まれる。
【００９３】
ココアプロシアニジンは、分解性複合体が形成される前にトポイソメラーゼＩＩを不活性化するので、それらは単独で、または公知で機構的に決定されているトポイソメラーゼＩＩインヒビターと組み合わせて、化学治療法的価値を有する。付加的には、ココアプロシアニジンはまた、新規クラスのトポイソメラーゼＩＩインヒビターであるように見え（Ｋａｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、そしてそれ故に他の公知のインヒビターよりも細胞に対して毒性が少なく、それによりそれらの化学治療法における用途を拡大している。
【００９４】
膜結合糖タンパク質（ｇｐ１７０）を発現し複数の薬剤耐性を付与するヒト胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７（ＡＤＲ）、およびその親系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８を、ココア画分ＤおよびＥの効果をアッセイするために用いた。図１９に示されるように、親系統は増加されたレベルでの画分ＤおよびＥで阻害されたが、一方でアドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ＡＤＲ）耐性の系統は高い投与量では影響は少なかった。これらの結果は、ココア画分ＤおよびＥは複数の薬物耐性細胞系統に効果を有することを示している。
【００９５】
実施例１１： プロシアニジンの合成
プロシアニジンの合成を、Ｄｅｌｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）によって開発された手順に従って、変更を加えて行った。（＋）−カテキンをジヒドロケルセチンとともに還元的条件下で濃縮することに加え、（−）−エピカテキンもまた、発酵されていないココア豆中に天然にもたらされる（−）−エピカテキンの高濃度を反映させるために用いた。合成生成物を単離し、精製し、分析し、実施例３、４および５に記載されている手順により同定した。このやり方により、ビフラバノイド、トリフラバノイドおよびテトラフラバノイドを調製し、分析用標準試料として、上記の方式でココア抽出物に関して用いた。
【００９６】
実施例１２： 順相半調製画分のアッセイ
ポリフェノール抽出物は組成物として複雑であるので、更なる精製、投与量反応アッセイ、および包括的な構造の同定のために、どの成分がガン細胞に対して活性であるのかを決定する必要があった。順相半調製ＨＰＬＣ分離（実施例３Ｂ）をココアプロシアニジンをオリゴマーの大きさに基づいて分離するために用いた。元々の抽出物に加え、１２の画分を調整し（図２Ｂおよび１５ Ｏ）、１００μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの投与量でＨｅｌａ細胞に対して、どのオリゴマーが最大の活性を有しているかを決定するためにアッセイした。図２０に示されているように、画分４−１１は（ペンタマーからドデカマー）は、約２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値を示した。これらの結果は、これらの特定のオリゴマーが、Ｈｅｌａ細胞に対する最大の活性を有していることを示した。付加的には、ココア画分ＤおよびＥの順相ＨＰＬＣ分析により、この画分がこれらのオリゴマーを豊富に有することが示された。
【００９７】
上記から、本発明の、抽出物およびココアポリフェノール、並びに組成物、方法およびキットは用途を有していることは明らかである。この見地から、本発明は、食料品由来であり、生体外で示された活性は、少なくともいくつかの活性は生体内で、特に上記の投与量を考慮して示され得るといえる。
【００９８】
付加的には、これまでの記述は、抽出物およびココアポリフェノール、ならびに組成物、方法およびキットは、ＢＨＴおよびＢＨＡに類似した抗酸化剤活性を、酸化安定性と同様に有していることを示している。このように、本発明は、例えば抗酸化食品添加物等の抗酸化剤等の公知のＢＨＡ、ＢＨＴの用途においてＢＨＴまたはＢＨＡに代わって用いられることができる。本発明はまた、トポイソメラーゼ阻害剤として、現在そのために知られている用途において用いられることができる。従って、本発明によって想像できる組成物および方法が数多く存在する：例えば、抗酸化剤または保存用組成物、トポイソメラーゼ阻害組成物、食品または何れかの所望の品の、酸化等からの保存方法、およびトポイソメラーゼ阻害のための方法であって、抽出物および／またはココアポリフェノールを含有するもの、または、食品、品物またはトポイソメラーゼをそれぞれの組成物即ち抽出物および／またはココアポリフェノール（群）と接触させることから成るものの何れか、等である。
【００９９】
このように詳細に、好ましい本発明の態様を記述してきたが、添付の請求の範囲により定義された本発明は、上記の記述中に示された特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の範囲および精神から離れるものではない数多くのその変化体があり得ることは理解されるべきである。
【０１００】
他の実施態様
１．ココアポリフェノール（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物。
２．ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出および精製すること、
から成る工程により調製される実施態様１記載の抽出物。
３．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様２記載の抽出物。
４．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様２または３記載の抽出物。
５．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール（群）を含有することを特徴とする実施態様４記載の抽出物。
６．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る抗新形成性組成物。
７．ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様６記載の抗新形成性組成物。
８．前記ココアプロシアニジン（群）が、
ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、
から成る工程により調製される実施態様７記載の抗新形成性組成物。
９．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様８記載の抗新形成性組成物。
10．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様８または９記載の抗新形成性組成物。
11．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール群を含有することを特徴とする実施態様１０記載の抗新形成性組成物。
12．有効量の実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に投与することから成る、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療する方法。
13．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様１２記載の方法。
14．前記ココアポリシアニジン（群）が、
ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、
から成る工程により調製されることを特徴とする実施態様１３記載の方法。
15．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様１４記載の方法。
16．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様１４または１５記載の抗新形成性組成物。
17．前記抽出物が、（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール（群）を含有することを特徴とする実施態様１６記載の抗新形成性組成物。
18．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療するためのキット。
19．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含み；前記キットが原料の混合および／または患者への投与のための指示書を含むことを特徴とする実施態様１８記載のキット。
20．実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含むことを特徴とする凍結乾燥された抗新形成性組成物。
21．前記組成物が実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様２０記載の凍結乾燥された抗新形成性組成物。
22．実施態様１記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含む抗酸化性または保存性組成物。
23．実施態様１記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含むトポイソメラーゼ阻害性組成物。
24．品物を実施態様２２記載の組成物と接触させることから成る、所望の品物を保存または酸化から防護するための方法。
25．前記品物が食品であることを特徴とする実施態様２４記載の方法。
26．実施態様２３記載の組成物とトポイソメラーゼを接触させることから成るトポイソメラーゼを阻害するための方法。
【参考文献】
【０１０１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール、好ましくはプロシアニジンにより質的に向上されたポリフェノール等のココア抽出物に関する。本発明はまた、そのような抽出物の調製方法、並びにそれらの、例えば抗新形成剤および抗酸化剤等としての使用に関する。
【０００２】
文献が、クレームの前の、明細書の終りの参考文献の部分に示されている各々の文献の完全な引用とともに、この開示で引用されている。これらの文献は、本発明の分野に関係するものであり；そして、ここに引用されている各々の文献は、ここにおいて参考文献として取り込まれている。
【背景技術】
【０００３】
ポリフェノールは、多様な植物中で生産される信じられないほど多様化した化合物の群であり（非特許文献１）、そのうちのいくつかは食物連鎖に組み込まれている。いくつかの場合において、それらは人間の制限食のために重要な化合物のクラスを代表している。いくつかのポリフェノールは非栄養性であると考えられているが、これらの化合物への関心は、それらの潜在的な健康への有利な効果によるものである。例えば、ケルセチン（フラボノイドの１つ）は、実験動物での研究において抗ガン原性活性を有することが示された（非特許文献２および３）。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキン（フラバン−３−オール）は、白血病ウイルス逆転写酵素活性を阻害する（非特許文献４）。ノボタニン（Ｎｏｂｏｔａｎｉｎ）（加水分解可能なオリゴマー性タンニン）もまた、抗腫瘍性活性を有することが示されている（非特許文献５）。日本の茶を生産している地域においては胃ガンの死亡率が顕著に低いということを静力学的な報告が示している。エピガロカテキン没食子酸は緑茶中の薬理学的活性物質であると報告されている（非特許文献５）。エラグ酸もまた抗ガン原性活性を多様な動物細胞腫瘍モデルで有することが示された（非特許文献６）。最近、プロアントシアニジンオリゴマーの抗変異剤としての利用がキッコーマンコーポレーションによって特許にされた。勿論、食品中のフェノール性化合物の範囲およびその実験動物モデルにおける腫瘍発展の調節は、最近の、２０２ｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで発表された（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【０００４】
しかしながら、これらの報告のうち、ココア抽出物、そのような抽出物の調製方法、またはココア抽出物の抗新形成剤としての利用を教示または示唆するものはなかった。
【０００５】
発酵されていないココア豆はかなりのレベルのポリフェノールを含有するので、本発明者等は、同様な活性および利用が、ココア内の化合物等のココア抽出物に関してもあり得、そのような化合物をココアから抽出し、抽出物の活性を検索することにより明らかにすることが可能であると考えた。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、その大型天然生成物選択プログラムの一部として、多様なＴｈｅｏｂｒｏｍａおよびＨｅｒｒａｎｉａ種を、抗ガン活性に関して検索した。いくつかのココア組織の抽出物において低レベルの活性が報告されたが、その研究は追求されなかった。このように、抗新形成または抗ガン分野において、ココアおよびその抽出物は有用であるとは考えられていなかった；即ち、抗新形成または抗ガン分野の教示は、当業者をココアおよびその抽出物をガン治療として用いることから遠ざけていた。数多くのココアポリフェノールの味覚開発への貢献を研究するための分析的手順が開発されているので（非特許文献７）、本発明者等は抗ガン検索のための試料を調製するために、抗新形成または抗ガン分野の知識とは違う、アナログ法を応用することを決めた。驚くべきことに、この分野の知識、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの検索、に反して、本発明者等はプロシアニジンを含むココアポリフェノール抽出物は、抗ガンまたは抗新形成剤として重要な用途を有していることを発見した。付加的には、発明者等はプロシアニジンを含むココア抽出物が抗酸化剤としての用途を有していることを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ferreira, D. et al., Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803 (1992)
【非特許文献２】Deschner, E. E, et al, Quercetin and Rutin as Inhibitors of Azoxymethanol-Induced Colonic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (1991)
【非特許文献３】Kato, R., et al, Inhibition of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Induced Tumor Promotion and Ornithine Decarboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983)
【非特許文献４】Chu, S.-C., et al., Inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity, J. of Natural Products, 55:2, 179-183 (1992)
【非特許文献５】Okuda, T., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols-Oligomeric Hydrolyzable Tannins and Others-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【非特許文献６】Boukharta, M., et al, Efficacy of Ellagitannins and Ellagic Acid as Cancer Chemopreventive Agents-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【非特許文献７】Clapperton, J., et al, Polyphenols and Cocoa Flavor-Presented at the XVIth International Conference of the Group Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ココア抽出物を製造するための方法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
ココア抽出物を提供することが本発明の別の目的である。
【０００９】
抗酸化組成物を提供することが本発明の別の目的である。
【００１０】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素活性の阻害を示すことが本発明の別の目的である。
【００１１】
腫瘍またはガンを治療するための方法を提供することが本発明のまた別の目的である。
【００１２】
抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を提供することが提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１３】
抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を製造するための方法を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１４】
そして、腫瘍またはガン治療において用いられるキットを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、ココア抽出物が抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成活性を有すること；または、抗酸化組成物であること、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素活性を阻害することが発見された。従って、本発明は実質的に純粋なココア抽出物を提供する。抽出物は好ましくは、ココアプロシアニジン（群）で質的に向上されたポリフェノール（群）等で、（−）エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、２から１２、好ましくは２から５、または４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択される少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール群等のポリフェノール（群）を含んでいる。本発明はまた、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤組成物であって、実質的に純粋な、プロシアニジン（群）により質的に向上されたポリフェノール（群）等のココア抽出物または合成ポリフェノール（群）、および適当な担体から成るものを提供する。抽出物は好ましくはココアプロシアニジン（群）を含んでいる。ココア抽出物は好ましくは、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、そして粉末から活性化合物（群）を抽出することから成る工程によって得られる。
【００１６】
本発明はまた、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）、および、好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必要のある患者を治療する方法を包括する。ココア抽出物は、ココアプロシアニジン（群）であってもよい；そして、好ましくは、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、そして粉末から活性化合物を抽出することから成る工程によって得られる。
【００１７】
付加的には、本発明は、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）、および、抽出物または合成ポリフェノール（群）またはプロシアニジン（群）との混合物に好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必要のある患者を治療するためのキットを提供する。
【００１８】
これらのおよび他の目的および態様が開示されているか、または以下の詳細な説明から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、粗ココアプロシアニジンの画分からの代表的なゲル濾過クロマトグラムを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分離（溶出特性）を示している代表的な逆相クロマトグラムを示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分離（溶出特性）を示している代表的な順相クロマトグラムを示している。
【図３】図３は、いくつかの代表的なプロシアニジンの構造を示している。
【図４Ａ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｃ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｄ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｅ】抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】図５は、ココア抽出物とガン細胞ＡＣＨＮとの間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆Ｍ２ Ｆ４／９２
【図６Ａ】図６Ａは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＡ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ１。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＢ＋Ｅ Ｙ１９２Ｐ１。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＣ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ココア抽出物とガン細胞ＰＣ−３との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆ＭＤ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２。
【図７Ａ】図７Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０２１２Ｐ３。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ｂ ０１６２Ｐ１。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１２２Ｐ３。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１２２Ｐ３。
【図７Ｅ】図７Ｅまでは、ココアプロシアニジン画分ＥとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｐ８。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＢとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９２Ｐ６。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｅ ０２９２Ｐ６。
【図７Ｈ】図７Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＤとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｄ ０２９２Ｐ６。
【図８Ａ】図８Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０９２Ｋ３。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｋ５。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１６Ｋ３。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｋ５。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｋ５。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＢとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９２Ｋ３。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ／Ｅ ０２９２Ｋ４。
【図８Ｈ】図８Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ／Ｅ ０２９２Ｋ５。
【図９Ａ】図９Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）。
【図９Ｃ】図９Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＣとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ｃ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｄ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｅ ０１９２Ｈ５。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＤとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０２６２Ｈ２。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ａ／Ｅ ０２６２Ｈ３。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ ０２６２Ｈ１。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０９２Ａ５。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０９２Ａ５。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ｍ＆Ｍ１ Ｅ ０１９２Ａ７。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０３０２Ａ６。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＤとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ ０３０２Ａ６。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ＆Ｅ ０２６２Ａ６。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０１９２５８。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０９２５６。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０１９２５９。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０１９２５８。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０１９２５８。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ａ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；Ａ／Ｅ ０２６２５４。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｅ ０３０２５５。
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ６２５５。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｓ４。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ Ｎ３２Ｓ１。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＣとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ＆Ｃ Ｎ３２Ｓ２。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ Ｎ３２Ｓ３。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ３２Ｓ３。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ココアプロシアニジン画分ＡとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ココアプロシアニジン画分ＢとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ココアプロシアニジン画分ＣとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ Ｎ２２Ｍ４。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ココアプロシアニジン画分ＤとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ Ｎ２２Ｍ３。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ココアプロシアニジン画分ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｅ ０３０２Ｍ２。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、ココアプロシアニジン画分Ｂ＋ＣとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｂ／Ｃ ０３０２Ｍ４。
【図１３Ｇ】図１３Ｇは、ココアプロシアニジン画分Ｃ＋ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３。
【図１３Ｈ】図１３Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３。
【図１４】図１４は、ココアプロシアニジン（特に画分Ｄ）とＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（細胞／ｍｌｖｓ増殖日数、白丸は対照、黒丸は１２５μｇ画分Ｄ、白逆三角形は２５０μｇ画分Ｄ、黒逆三角形は５００μｇ画分Ｄ）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、画分Ｄ＋Ｅで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞に対するＸＴＴおよびクリスタルバイオレット細胞毒性アッセイの比較を示している（白丸はＸＴＴ、黒丸はクリスタルバイオレット）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＭＤＡ ＭＢ２３１胸部細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＰＣ−３前立腺ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ、黒四角は１μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフェノールで処理されたＨｅｌａ子宮ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、異なったココアポリフェノール画分で処理されたＨｅｌａ子宮ガン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−Ｅ、黒丸は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−Ｃ、白逆三角形は１００μｇ／ｍｌの画分Ｄ＆Ｅ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、１００μｌ／ｍｌでの、異なったココアポリフェノール画分で処理されたＳＫＢＲ−３胸部ガン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は画分Ａ−Ｅ、黒丸は画分Ａ−Ｃ、白逆三角形は画分Ｄ＆Ｅ。
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨｅｌａ細胞との間の典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は５０μｇ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）。
【図１５Ｉ】図１５Ｉは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＳＫＢＲ−３細胞系統との間の典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は５０μｇ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｊ】図１５Ｊは、軟寒天クローニングアッセイを用いた、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨｅｌａガン細胞との間の典型的な投与量反応関係を示している（棒グラフ；コロニー数ｖｓ対照、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｋ】図１５Ｋは、異なるココア遺伝子型から得られた粗ポリフェノール抽出物で処理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖阻害を示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸はＣ−１、黒丸はＣ−２、白逆三角形はＣ−３、黒逆三角形はＣ−４、白四角はＣ−５、黒四角はＣ−６、白三角形はＣ−７、黒三角形はＣ−８；Ｃ−１＝ＵＦ−１２：園芸種＝Ｃｒｉｏｌｌｏおよび記述はＵＦ−１２（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−２＝ＮＡ−３３：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＮＡ−３３（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−３＝ＥＥＧ−４８：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＥＥＧ−４８（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−４＝不明：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述は不明（Ｗ．アフリカ）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−５＝ＵＦ−６１３：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＵＦ−６１３（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−６＝ＩＣＳ−１００：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＩＣＳ−１００（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−７＝ＩＣＳ−１３９：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＩＣＳ−１３９（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−８＝ＵＩＴ−１：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＵＩＴ−１（マレーシア）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）。
【図１５Ｌ】図１５Ｌは、発酵されたココア豆および乾燥されたココア豆から得られた粗ポリフェノール抽出物で処理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖の阻害を示す（完全な発酵段階および太陽での乾燥；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸は０日画分、黒丸は１日画分、白逆三角形は２日画分、黒逆三角形は３日画分、白四角は４日画分、黒四角は９日画分）。
【図１５Ｍ】図１５Ｍは、酵素的に酸化されたココアプロシアニジンのＨｅｌａ細胞に対する影響を示す（ポリフェノールオキシダーゼ処理されたココアポリフェノールに対する投与量反応；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；黒四角は粗ＵＩＴ−１（カフェインおよびテオブロミンとともに）、白丸は粗ＵＩＴ−１（カフェインおよびテオブロミン無し）および黒丸は粗ＵＩＴ−１（ポリフェノールオキシダーゼ分解された）。
【図１５Ｎ】図１５Ｎは、組み合わされたココアプロシアニジン画分ＤおよびＥの、代表的な半調製逆相ＨＰＬＣ分離を示す。
【図１５Ｏ】図１５Ｏは、粗ココアポリフェノール抽出物の、代表的な半調製順相ＨＰＬＣ分離を示す。
【図１６】図１６は、ココアプロシアニジン抽出物および画分のランシマット（Ｒａｎｃｉｍａｔ）酸化曲線を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較して示している（任意の単位ｖｓ時間；破線およびクロス（＋）はＢＨＡおよびＢＨＴ；＊はＤ−Ｅ；ｘは粗試料；白四角はＡ−Ｃ；および白ひし形は対照）。
【図１７】図１７は、キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ触媒鎖分解の、ココアプロシアニジン画分による阻害を示している典型的なアガロースゲルである。（レーン１は、０．５μｇのマーカー（Ｍ）モノマー長キネトプラストＤＮＡ環を含む；レーン２および２０は、トポイソメラーゼＩＩとともに４％ＤＭＳＯ存在下であって、何れのココアプロシアニジンの不在下で保温されたキネトプラストＤＮＡを含む。（対照−Ｃ）；レーン３および４は、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ａの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン５および６は、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｂの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン７、８、９、１３、１４、および１５は、０．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｄの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である；レーン１０、１１、１２、１６、１７、および１８は、０．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である；レーン１９は、５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である。
【図１８】図１８はココアプロシアニジン画分Ｄの、ＤＮＡ修復能を有する、およびそれを欠失している細胞系統に対する投与量反応関係を示している（部分的生存ｖｓμｇ／ｍｌ；左側はｘｒｓ−６ＤＮＡ欠損修復細胞系統、ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８２Ｘ１；右側はＢＲ１ＤＮＡ修復可能細胞系統ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８２Ｂ１）。
【図１９】図１９は、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋Ｅで処理された場合の、アドリアマイシン耐性ＭＣＦ−７細胞に対する投与量反応曲線を、ＭＣＦ−７ ｐ１６８親細胞系統と比較して示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸はＭＣＦ−７ ｐ１６８；黒丸はＭＣＦ−７ ＡＤＲ）。
【図２０】図２０は、順相半調製ＨＰＬＣにより調製された１２の画分の、１００μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのレベルで処理された場合の、Ｈｅｌａ細胞に対する投与量反応効果を示している（棒グラフ、％対照ｖｓ対照および画分１−１２）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上で議論したとおり、今、驚くべきことに、ココア抽出物が抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性、抗酸化活性を示し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害することが発見された。抽出物は、一般的に、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、活性な化合物（群）を脱脂された粉末から抽出することにより調製される。粉末はココア豆およびパルプを凍結乾燥し、ココア豆およびパルプを脱パルプ化し、凍結乾燥されたココア豆を脱穀し、脱穀された豆を粉砕することによって調製されてもよい。活性な化合物（群）の抽出は溶媒抽出技術で可能である。抽出物は精製できる；例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによるかまたは調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によるか、またはこれらの技術の組合せによる。活性を有する抽出物は、何れかの特定の理論に必ず拘束されることを望まないが、プロシアニジン等のココアポリフェノール（群）であると同定された。これらのココアプロシアニジンは、重要な抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性；抗酸化活性；を有し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素を阻害する。
【００２１】
本発明のココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む抗ガン、抗腫瘍または抗新形成、または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害組成物は、薬学的分野の当業者によく知られた標準的な技術に従って調製可能である。そのような組成物は、そのような投与を要する患者に対して、医学分野の当業者に良く知られた技術により、年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および投与経路等を考慮して、投与することができる。この組成物は、他の抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤および／または、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤とともに、またはそれと連続的に、再び年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および投与経路等を考慮して、投与することができる。
【００２２】
本発明の組成物の例には、カプセル、錠剤、丸薬、およびその様なもの、並びに咀嚼可能な固体配合物であって、本発明が食用給源なのでそれにふさわしいもの（ココアまたはチョコレート味の固体組成物等）；経口、経鼻孔、経肛門、経膣等の開口部用の液体調製物、懸濁物、シロップまたは内用液等の投与；および、非経口、皮下、皮内、筋内または滅菌懸濁物またはエマルジョン等の静脈内投与（注入可能投与等）が含まれる。しかしながら、組成物中の活性な成分は、血液流中に投与された場合に、血液タンパク質の沈殿により凝集を生じ得るようなタンパク質複合体であるかも知れない；そして、当業者はこのことを考慮すべきである。このような組成物においては、活性ココア抽出物は、好適な担体、希釈液または滅菌水、生理食塩水、グルコースまたはその様なもの等の賦形剤との混合物であってもよい。本発明の活性ココア抽出物は、例えば等圧水性食塩水バッファー中等の再配合のための、凍結乾燥の形状で提供されることもできる。
【００２３】
さらに、本発明は、活性ココア抽出物が提供されているキットを包括する。キットは、適当な担体、希釈液または賦形剤を含む独立したコンテナを有していてもよい。キットはまた、付加的な抗ガン、抗腫瘍または抗新形成剤、または抗酸化剤、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤および／または、共にまたは続けて投与するための、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤を含んでいてもよい。付加的な薬剤（群）は別個のコンテナ（群）中、または活性ココア抽出物との混合物として提供されてもよい。付加的には、キットは、内容物の混合または混合および／または投与のための指示書を含んでもよい。
【００２４】
さらには、本発明は、好ましくはココアプロシアニジンを含むココア抽出物に関して記載されているが、この開示から熟練した有機化学者は、活性化合物を得るための合成経路を理解し想像するであろう。従って、本発明は、合成ココアポリフェノールまたはプロシアニジンまたはその派生体であって、グリコシド、没食子酸、エステル等およびその様なものを腹部がこれに限定されないものをも包括する。
【００２５】
以下の限定的ではない例は説明のみのために提供されており、本発明の限定と考えられるべきではなく、本発明の精神またはその範囲から離れることなく、多くの明白な変化が可能である。
【実施例】
【００２６】
実施例１： ココア給源および調製方法
３種類の認識されたココアの園芸種を代表するいくつかのＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ遺伝子型（Ｅｎｒｉｑｕｅｚ、１９６７；Ｅｎｇｅｌ、１９８１）を、世界の３つの主要なココア生産起源より得た。この研究に用いられたこれらの遺伝子型のリストを表１に示す。収穫されたココアさやを開き、パルプを有する豆を凍結乾燥用に取り除いた。パルプを凍結乾燥された塊から手作業で除去し、豆を以下のように分析した。発酵されていない、凍結乾燥されたココア豆を最初に手作業で脱穀し、ＴＥＫＭＡＲ Ｍｉｌｌで細かい粉末塊へと粉砕した。その結果生じた塊を、続いて、再蒸留ヘキサンを溶媒として用いたＳｏｘｈｌｅｔ抽出で一晩脱脂した。残存溶媒を脱脂された塊から常温で真空により取り除いた。
【表１】
【００２７】
実施例２： プロシアニジン抽出の手順
Ａ．方法１
プロシアニジンは、脱脂され、発酵されていない、凍結乾燥された実施例１のココア豆から、ＪａｌａｌおよびＣｏｌｌｉｎ（１９７７）によって記述された方法の改変型を用いて抽出した。プロシアニジンは、５０ｇの脱脂されたココア塊のバッチから、４００ｍｌの７０％アセトン／脱塩水で２回、続いて４００ｍｌの７０％メタノール／脱塩水により抽出した。抽出物を貯蔵し、溶媒を４５℃で部分的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。その結果生じた水相を、脱塩水で１ｌに希釈し、４００ｍｌ ＣＨＣｌ３ で２回抽出した。この溶媒相は廃棄した。水相を続いて、５００ｍｌ酢酸エチルで４回抽出した。生じたエマルジョンの何れをも、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ２８Ｓ遠心機での、２０００ｇ、３０分間の１０℃での遠心により破壊した。統合された酢酸エチル抽出物に、１００−２００ｍｌの脱塩水を添加した。溶媒を４５℃で部分的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。その結果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。異なったココア遺伝子型より得られた粗プロシアニジンの収量を表２にリストした。
【表２】
【００２８】
Ｂ．方法２
別の選択としては、プロシアニジンは、脱脂された、発酵されていない、実施例１の凍結乾燥ココア豆から７０％水性アセトンにより抽出される。１０ｇの脱脂原料を１００ｍｌの溶媒で５−１０分間スラリー化した。スラリーを４℃で３０００ｇで１５分間遠心し、上清をグラスウールに通した。濾過したものを部分的な真空の下で蒸留し、その結果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。粗プロシアニジンの収量は１５−２０％の範囲にあった。
【００２９】
何れかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、粗収量における違いは、異なった遺伝子型、地理的起源、園芸的種および調製方法によって生じた変化を反映していると信じられている。
【００３０】
実施例３： ココアプロシアニジンの部分精製
Ａ．ゲル濾過クロマトグラフィー
実施例２により得られたプロシアニジンをセファデックスＬＨ−２０（２８ ｘ ２．５ｃｍ）での液体クロマトグラフィーにより部分的に精製した。分離を、脱塩水からメタノールへの段階グラジエントにより支援した。初期グラジエント組成物は脱塩水中の１５％メタノールで開始され、３０分毎に脱塩水中の２５％メタノール、脱塩水中の３５％メタノール、脱塩水中の７０％メタノール、そして最終的には１００％メタノールと段階的に続いて行った。キサンチンアルカロイド（カフェインおよびテオブロミン）の溶出に続く溶出物は単一の画分として集められた。この画分は、キサンチンアルカロイドを含有していない副画分であって、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅと命名された５つの副画分を得るために提出されたものを得た。各々の副画分から、溶媒を４５℃でロータリーエバポレーターを部分真空下で用いて除去した。その結果生じた水相を液体窒素中で凍結させ、ＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システムで一晩凍結乾燥した。画分をしめす代表的なゲル濾過クロマトグラフィーを図１に示す。この方法により、およそ１００ｍｇの材料が副画分化された。
【００３１】
図１：粗プロシアニジンのセファデックスＬＨ−２０上でのゲル濾過クロマトグラフ
クロマトグラフ条件： カラム；２８ ｘ ２．５ｃｍ セファデックスＬＨ−２０、移動相：メタノール／水段階グラジエント、１５：８５、２５：７５、３５：６５、７０：３０、１００：０、１／２時間間隔で段階化した、流速；１．５ｍｌ／分、検出器；ＵＶ＠λ１＝２５４ｎｍおよびλ２＝３６５ｎｍ、チャート速度０．５ｍｍ／分、カラム充填；１２０ｍｇ。
【００３２】
Ｂ．半調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
方法１：逆相分離
実施例２および／または３Ａのプロシアニジンは半調製的ＨＰＬＣによって部分精製された。多様な波長の検出器を備えたヒューレットパッカード１０５０ＨＰＬＣ、１ｍｌ注入ループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅ７０１０注入バルブを、ファルマシアＦＲＡＣ−１００フラクションコレクターと共に組み立てた。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ １０μ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ（６０ ｘ １０ｍｍ）ガードカラムと連結されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ １０μ ＯＤＳカラム（２５０ ｘ ２２．５ｍｍ）上でもたらされた。移動相組成物は、Ａ＝水；Ｂ＝以下の直線的グラジエント条件で用いられたメタノール；［時間、％Ａ］；（０、８５）、（６０、５０）、（９０、０）、および（１１０、０）、流速５ｍｌ／分。
【００３３】
画分Ｄ＋Ｅ中に存在するプロシアニジンの分離のための代表的な半調製的ＨＰＬＣトレースを図１５Ｎに示す。個々のピークおよび選択クロマトグラフ領域を、時間を決めた間隔または手作業でフラクションコレクターによって、更なる精製およびそれに続く評価のために収集した。注入充填量は、物質２５−１００ｍｇの範囲にあった。
【００３４】
方法２．順相分離
実施例２および／または３Ａで得られたプロシアニジン抽出物を、半調製的ＨＰＬＣにより部分精製した。ヒューレットパッカード１０５０ＨＰＬＣシステム、２５４ｎｍでのミリポアウォーターモデル４８０ＬＣ検出器セットを、ピークモードにセットしたファルマシアＦｒａｃ−１００フラクションコレクターとともに組み立てた。分離は、Ｓｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連結されたＳｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉカラム（２５０ ｘ １０ｍｍ）上でもたらされた。プロシアニジンは以下の条件下での直線的グラジエントで溶出した：（時間、％Ａ、％Ｂ）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４）、（６０、４６、５０）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）続いて１０分間再び平衡化した。移動相組成物はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノール；およびＣ＝酢酸：水（１：１）。流速３ｍｌ／分を用いた。成分を２５４ｎｍのＵＶで検出し、Ｋｉｐｐ ＆ Ｚｏｎａｎ ＢＤ４１記録器で記録した。注入量は、０．２５ｍｌの７０％水性アセトン中に溶解された１０ｍｇのプロシアニジンの、１００−２５０μｌの範囲であった。代表的な半調製的ＨＰＬＣトレースを図１５ Ｏに示す。個々のピークまたは選択されたクロマトグラフ領域を、時間を決めた間隔で、または手作業でフラクションコレクターにより、更なる精製およびそれに続く評価のために収集した。
【００３５】
ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ １０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）半調製的カラム
２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）ガードカラム
検出器： Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ 分光光度計 モデル４８０＠２５４ｎｍ
流速： ３ｍｌ／分
カラム温度： 室温
注入： ２５０μｌの７０％水性アセトン抽出物：
【００３６】
得られた画分は以下のとおり：
【００３７】
実施例４： プロシアニジン抽出物の分析的ＨＰＬＣ分析
方法１： 逆相分離
実施例３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５μフィルターで濾過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器備えたヒューレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステムにより分析した。分離は、４５℃で、ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２００ ｘ ２．１ｍｍ）上でもたらされた。フラバノールおよびプロシアニジンを、６０％のＢからＡへの直線的グラジエントにより溶出し、続いてカラムをＢで流速０．３ｍｌ／分で洗浄した。移動相組成物は、Ｂ＝メタノール中の０．５％酢酸で、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸である。ＡおよびＢ移動相の酢酸レベルは２％まで増加してもよい。化合物は蛍光によって検出され、λｅｘ＝２７６ｎｍ、でλｅｍ＝３１６ｎｍであった。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキンの濃度は標準参照溶液と関連して決定された。プロシアニジンレベルを（−）−エピカテキンに対する反応因子を用いて評価した。多様な成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つのココア遺伝子型について図２Ａに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺伝子型についても見られた。
【００３８】
ＨＰＬＣ条件： カラム： ２００ ｘ ２．１ｍｍ ヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（５μ）
ガードカラム：２０ ｘ ２．１ｍｍヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（５μ）
検出器： ダイオード配列＠２８０ｎｍ 蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３１６ｎｍ
流速： ０．３ｍｌ／分
カラム温度： ４５℃
【００３９】
方法２： 順相分離
実施例２および／または３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５μフィルターで濾過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器備えたヒューレットパッカード１０９０シリーズＩＩ ＨＰＬＣシステムにより分析した。分離は、３７℃で、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｒｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ５μ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連結された５μ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（２５０ ｘ ３．２ｍｍ）によりもたらされた。プロシアニジンは以下の条件での直線状グラジエントにより溶出した：（時間、Ａ％、Ｂ％）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４）、（６０、４６、５０）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）、続いて８分間再び平衡化した。移動相組成物は、Ａ＝ジクロロメタン、Ｂ＝メタノール、およびＣ＝容量比で１：１の酢酸：水であった。流速は０．５ｍｌであった。成分を、蛍光によりλｅｘ＝２７６ｎｍおよびλｅｍ＝３１６ｎｍで、または２８０ｎｍのＵＶにより検出した。多様な成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つのココア遺伝子型について図２Ｂに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺伝子型についても見られた。
【００４０】
ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ ３．２ｍｍ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（５μ） ２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ（５μ） ガードカラム
検出器： フォトダイオード配列＠２８０ｎｍ
蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３１６ｎｍ
流速： ０．５ｍｌ／分
カラム温度： ３７℃
【００４１】
実施例５： プロシアニジンの同定
プロシアニジンを、セファデックスＬＨ−２０（２８ ｘ ２．５ｃｍ）カラム上での液体クロマトグラフィーで精製し、続いて、１０μ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（１００ ｘ ８ｍｍ）カラムを用いた半調製的ＨＰＬＣまたは５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（２５０ ｘ １０ｍｍ）カラムを用いた半調製的ＨＰＬＣを行った。
【００４２】
特に精製された単離物は、高速原子衝撃質量分析器（ＦＡＢ−ＭＳ）により、ＶＧ ＺＡＢ−Ｔ高解像度ＭＳシステム上で、液体２次イオン質量分析器（ＬＳＩＭＳ）技術を陽および陰イオンモードで用いて分析した。セシウムイオン銃をイオン化源として３０ｋＶで用い、「Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ Ｍａｔｒｉｘ」（１：１ ジチオスレイトール／ジチオエリスリトール）をプロトンドナーとして用いた。
【００４３】
これらの画分のＬＳＩＭＳによる分析的調査により、表３に示されている多くのフラバン−３−オールオリゴマーの存在が明らかとなった。
【表３】
【００４４】
主要な質量断片イオンは、陽および陰イオンの両方のプロシアニジンのＦＡＢ−ＭＳ分析について以前に報告された結果と一致していた（Ｓｅｌｆ ｅｔ ａｌ．，１９８６およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ｍ／ｚ ５７７（Ｍ＋Ｈ）＋に相当するイオンおよびそのｍ／ｚ ５９９（Ｍ＋Ｎａ）＋でのナトリウム内転は、単離物中に二重結合したプロシアニジンダイマーが存在することを示唆していた。より高度なオリゴマーは、それらのプロトン化分子イオン（Ｍ＋Ｎａ）＋よりも、より多くのナトリウム内転（Ｍ＋Ｎａ）＋を形成しがちであることに注意すると興味深い。プロシアニジン異性体Ｂ−２、Ｂ−５およびＣ−１は、試験的にＲｅｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｓｅｌｆ ｅｔ ａｌ．（１９８６）およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって報告された結果に基づいて同定した。オクタマーおよびデカマーの両方までのプロシアニジンを、部分精製画分中にＦＡＢ−ＭＳによって確認した。付加的に、ドデカマーまでのプロシアニジンの証拠が、順相ＨＰＬＣ分析から観察された（図２Ｂを参照）。何れの特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ドデカマーは抽出および精製計画に用いられた溶媒中での溶解性の限界であると信じられている。表４は、キサンチンアルカロイドを含まない単離物中に見られたプロシアニジンの、逆相ＨＰＬＣ分析に基づいた相対濃度を列挙している。表５は、順相ＨＰＬＣ分析に基づいたプロシアニジンの相対濃度を列挙している。
【表４】
【表５】
【００４５】
図３は、いくつかのプロシアニジン構造を示し、図４Ａ−４Ｅは、以下の抗ガンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた５つの画分の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図４Ａ−４ＥのためのＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：
ＨＰＬＣ条件： ＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器を備えたヒューレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステム。
【００４６】
カラム： ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２００ ｘ ２．１ｍｍ） ６０％のＢからＡへの直線的グラジエント、流速０．３ｍｌ／分 Ｂ＝メタノール中の０．５％酢酸、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸、λｅｘ＝２８０ｎｍ、λｅｍ＝３１６ｎｍ。
【００４７】
図１５ Ｏは、抗ガンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた付加的な１２の画分の、代表的な半調製的ＨＰＬＣクロマトグラムを示している（ＨＰＬＣ条件は上記と同じ）。
【００４８】
実施例６ ココア抽出物の抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性
元々はＭｏｓｍａｎｎ（１９８３）により開発された、ＭＴＴ（３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）−マイクロタイタープレートテトラゾリウム細胞毒性アッセイを、実施例５の試験試料の探索に用いた。試験試料、標準試料（ｃｉｓｐｌａｔｉｎおよびｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）およびＭＴＴ試薬を１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。連続的希釈物をストック溶液から調製した。試験試料の場合、希釈は０．０１から１００μｇの範囲で０．５％ＤＭＳＯ中に調製された。
【００４９】
全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。細胞を、１０％胎児ウシ血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２４０単位／ｍｌのナイスタチンを含むアルファＭＥＭ中で単層として増殖させた。細胞は加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気中で３７℃で培養した。
【００５０】
トリプシン化の後で、細胞を計数し５０ ｘ １０５ 細胞／ｍｌの濃度に調製した（ガン細胞系統によって異なっていた）。２００μｌの細胞懸濁液をウェルに４列の９６ウェルマイクロタイタープレートに注入した。細胞が４時間取付可能にされた後、２μｌのＤＭＳＯ含有試験試料溶液を、四重に用意したウェルに添加した。初期投与量反応を見つける実験で、試験試料希釈の規模の桁を用いたものを、試験する投与量の範囲を決定するために行った。ウェルの５４０ｎｍでの吸光を続いてＢＩＯ ＲＡＤ ＭＰ４５０プレートリーダー上で測定した。四重に用意された、試験試料で処理されたウェルの吸光度の平均を対照と比較し、その結果を対照の吸光度のパーセンテージ±標準偏差で表した。ＭＴＴの紫のホルマザン生成物への還元は、ウェル中で生きている細胞数と直線的に関連している。このように、還元生成物の吸光度を測定することにより、所定の試験試料投与量における細胞生存のパーセントの定量を行うことができる。対照ウェルは終濃度で１％のＤＭＳＯを含んでいた。
【００５１】
試料の内の２つは、最初にこの手順により試験した。試料ＭＭ１はココアプロシアニジンの非常に粗な単離物を代表し、かなりの量のカフェインとテオブロミンを含有していた。試料ＭＭ２はゲル濾過クロマトグラフィーによって部分精製されたココアプロシアニジン単離物を代表していた。ＭＭ２中にはカフェインとテオブロミンは存在しなかった。両方の試料は、以下のガン細胞系統について前述の手順を用いて活性を検索した。
【００５２】
ＨＣＴ１１６結腸ガン
ＡＣＨＮ腎臓アデノカルシノーマ
ＳＫ−５メラノーマ
Ａ４９８腎臓アデノカルシノーマ
ＭＣＦ−７胸部ガン
ＰＣ−３前立腺ガン
ＣＡＰＡＮ−２膵臓ガン
調べられたガン細胞系統の何れにおいても、ＭＭ１に関しては活性は僅かに見られるかまたは全く見られなかった。ＭＭ２は、ＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３、およびＡＣＨＮガン細胞系統に対して活性を有することが判明した。しかしながら、ＭＭ１およびＭＭ２の両方は、ＭＭＴと、生存細胞数の減少を反映する吸光度の減少を弱めるように干渉することが判明した。この干渉はまた大きな誤差の障害にも貢献しているが、それは、プレートの周辺にそったウェルの内部で化学反応がより迅速に進行するように見えるためである。これらの効果の典型例を、図５に示した。試験材料の高い濃度において、示された高い生存レベルと比較して生存の大きな減少を見ることが期待できる。しかしながら、顕微鏡観察によって、ＭＭＴ干渉効果にもかかわらず、細胞毒性効果が生じていることが判明した。例えば、ＭＭ２のＡＣＨＮ細胞系統に対する効果の、０．５μｌ／ｍｌのＩＣ５０値が、この方式において得られた。
【００５３】
これらの予備的な結果から、本発明者等の見解では、ＭＴＴの干渉を排除するためにアッセイ手法の補正が必要であった。これは以下のようにして実現した。加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気において３７℃で１８時間プレートを保温した後、培地を注意深く吸引し、新鮮アルファ−ＭＥＭ培地で置換した。この培地をアッセイの３日目にウェルから再び吸引し、新たに調製した１００μｌのＭｃＣｏｙ培地で置換した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴストック溶液を１１μｌ、続いて各々のプレートのウェルに添加した。加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気において３７℃で４時間保温した後、イソプロパノール中の０．０４Ｎ ＨＣｌを１００μｌ、プレートの全てのウェルに添加し、続いて混合し、何れかの生存細胞により生成されたホルマザンを可溶化させた。付加的には、活性を有している特定の成分を決定するために、プロシアニジンを副画分化することが決定された
前述の副画分化の手順を更なる検索のための試料調製のために用いた。図１に示した範囲および図４Ａ−４Ｅの成分（群）の配分を代表する５つの画分を調製した。試料は、これらの分析的特徴およびカフェインおよびテオブロミンの不在を表示するため、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅとコード化した。
【００５４】
各々の画分を、独立にＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３およびＡＣＨＮガン細胞系統について検索した。その結果は、活性は何れかの特定の画分に集中してはいないことを示していた。この型の結果は異常ではないと考えられたが、それは「活性な」天然生産物単離物中の成分は相乗効果的に振る舞うことがありえるからである。ココアプロシアニジン単離物（ＭＭ２）の場合は、２０以上の検出可能な成分が単離物に含まれている。独立した成分（群）に活性が関連しているというよりは、異なった画分中に存在する成分の組合せに活性が関連している可能性があることが考えられた。
【００５５】
これらの結果に基づき、画分を組み合わせて同じガン細胞系統についてアッセイを繰り返すことを決定した。いくつかの画分の組合せがＰＣ−３ガン細胞系統に対して細胞毒性を生じさせた。特に、ＭＭ２ＡおよびＭＭ２Ｅの組合せに対するそれぞれ４０μｇ／ｍｌの、およびＭＭ２ＣおよびＭＭ２Ｅの組合せに対するそれぞれ２０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が得られた。活性はＨＣＴ−１１６およびＡＣＨＮ細胞系統に対しても報告されたが、前回のように、ＭＴＴ指示薬の干渉により精密な観察は不可能だった。複数回の実験をくり返しＨＣＴ−１１６およびＡＣＨＮ系統上で行い、データを改善した。しかしながら、これらの結果は細菌汚染および試験試料材料の疲弊により明確なものではない。図６Ａ−６Ｄはココア抽出物とＰＣ−３ガン細胞との間の投与量反応関係を示すものである。
【００５６】
しかしながら、このデータから、ココア抽出物、特にココアポリフェノールまたはプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍、抗ガン、抗新形成活性を、特にヒトＰＣ−３（前立腺）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、およびＡＣＨＮ（腎臓）ガン細胞系統に関して有することは明白である。加えて、これらの結果は特定のプロシアニジン画分がＰＣ−３細胞系統に対して関与していることを示唆している。
【００５７】
実施例７： ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成活性
上記の発見を確認し、さらに組合せ画分を研究するために、別の包括的なスクリーニングを行った。
【００５８】
全ての調製された材料および手順は、試験投与量毎に四重であった標準を、試験投与量毎に八重または十二重に増加させた点を除いて、上記の報告と同一であった。この研究のために、個々の５個のココアプロシアニジン画分、およびその組合せを、以下のガン細胞系統について検索した。
【００５９】
ＰＣ−３前立腺
ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ
ＨＣＴ−１１６結腸
ＡＣＨＮ腎臓
ＭＣＦ−７胸部
ＳＫ−５メラノーマ
Ａ−５４９肺
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病
個々のスクリーニングは、異なった投与量レベル（０．０１−１００μｇ／ｍｌ）の画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ（図４Ａ−４Ｅおよびその検討、前出を参照されたい）を各々の細胞系統についてアッセイすることから成る。組合せのスクリーニングは、同じ投与量レベルの画分Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｄ、Ａ＋Ｅ、Ｂ＋Ｃ、Ｂ＋Ｄ、Ｂ＋Ｅ、Ｃ＋Ｄ、Ｃ＋Ｅ、およびＤ＋Ｅを、各々の細胞系統について組み合わせることから成る。これらのアッセイからの結果は、独立して検討し、続いて全体をまとめた。
【００６０】
Ａ．ＰＣ−３前立腺細胞系統
図７Ａ−７Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図７Ｄおよび７Ｅは、画分ＤおよびＥが、７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。他のプロシアニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分ＤまたはＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々のＩＣ５０値は表６に列挙した。
【００６１】
Ｂ．ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統
図８Ａ−８Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図８Ｄおよび８Ｅは、画分ＤおよびＥが、７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。図８Ｆ−８Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＡ＋Ｂは効果を有していなかったが、一方で画分の組合せＢ＋ＥおよびＤ＋Ｅは、６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であった。他のプロシアニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分ＤまたはＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々のＩＣ５０値は表６に列挙した。これらの結果は、ＰＣ−３細胞系統について得られたものと本質的に同じである。
【００６２】
Ｃ．ＨＣＴ−１１６結腸細胞系統
図９Ａ−９Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＨＣＴ−１１６結腸細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図９Ｄおよび９Ｅは、画分Ｅが、約４００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。この値は実在の曲線を外挿して得た。画分Ｄについての投与量反応曲線の勾配もまた活性を示していることに注意されたい。しかしながら、ＩＤ５０値はこのプロットからは得られなかったが、それは曲線の勾配が、信頼できる値を得るためにはあまりにも浅いものであったためである。図９Ｆ−９Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＢ＋Ｄは認識できる効果を有していなかったが、一方で画分の組合せＡ＋ＥおよびＤ＋Ｅは、それぞれ５００μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であった。他の画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分Ｅが存在する場合には平均で約２５０μｇ／ｍｌであった。外挿されたＩＣ５０値を表６に列挙した。
【００６３】
Ｄ．ＡＣＨＮ腎臓細胞系統
図１０Ａ−１０Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図１０Ａから１０Ｅは、独立の画分はこの細胞系統については活性を有していないことを示している。図１０Ｆ−１０Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＢ＋Ｃは活性ではなかったが、一方で画分の組合せＡ＋Ｅは、５００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であるという結果であった。Ｃ＋Ｄの組合せと同様の投与量反応曲線は不活性と考えられたが、それはそれらの勾配があまりに浅かったからである。その他の画分についての外挿されたＩＣ５０値を表６に列挙した
Ｅ．Ａ−５４９肺細胞系統
図１１Ａ−１１Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６４】
Ｆ．ＳＫ−５メラノーマ細胞系統
図１２Ａ−１２Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６５】
Ｇ．ＭＣＦ−７胸部細胞系統
図１３Ａ−１３Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。
【００６６】
Ｈ．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統に対する、本来の典型的な投与量反応曲線を得た。しかしながら、顕微鏡での細胞数の計数ｖｓ異なった画分濃度での時間は、５００μｇの画分Ａ、ＢおよびＤが４日間の期間にわたる８０％の増殖の減少をもたらしたことを示している。代表的な投与量反応関係を図１４に示す。
【００６７】
Ｉ．まとめ
これらのアッセイから得られたＩＣ５０値は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病を除く全ての細胞系統について、表６に集められて列挙されている。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病は意図的に表からはずされたが、それは異なったアッセイの手順を用いたためである。これらの結果の全体的なまとめは、最も高い活性は画分ＤおよびＥに関連するものであることを示している。これらの画分はＰＣ−３（前立腺）およびＫＢ（鼻咽頭／Ｈｅｌａ）細胞系統に対してもっとも活性であった。これらの画分はまた、ＨＣＴ−１１６（結腸）およびＡＣＨＮ（腎臓）細胞系統に対しても活性であったが、しかし、非常に高い投与量においてのみであった。ＭＣＦ−７（胸部）、ＳＫ−５（メラノーマ）、およびＡ−５４９（肺）細胞系統に対しては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジン画分はそれでもこれらの細胞系統に関して用途を有しているかもしれない。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞白血病）細胞系統に対しても活性が見られた。画分ＤおよびＥは組成物として最も複雑であることに注意すべきである。しかしながら、このデータから、ココア抽出物、特にココアプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍、抗ガンまたは抗新形成活性を有していることは明白である。
【表６】
【００６８】
実施例８ ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成活性
いくつかの付加的な生体外アッセイの手順を、実施例６および７で示された結果を補完し、拡張するために用いた。
【００６９】
方法Ａ．クリスタルバイオレット染色アッセイ
全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を含まないＩＭＥＭ中で単層として増殖させた。細胞を加湿、５％ＣＯ２ 雰囲気中で３７℃で維持した。
【００７０】
トリプシン化の後、細胞を計数し、濃度を１００μｌあたり１０００−２０００細胞に調節した。細胞拡散を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に細胞をプレートする（ウェルあたり１０００−２０００細胞）ことにより決定した。ウェルあたり１００μｌの細胞を添加した後、細胞を２４時間取付可能とした。２４時間の期間の終りには、多様なココア画分を異なった濃度で、投与量反応結果を得るために添加した。ココア画分を２倍の濃度で培地中に溶解させ、各々の溶液の１００μｇを、三重に用意したウェルに添加した。連続した日に、プレートを５０μｌのクリスタルバイオレット（１２５ｍｌのメタノール、３７５ｍｌの水に溶解された２．５ｇのクリスタルバイオレット）で１５分間染色した。染色液を除き、プレートを穏やかに冷水に浸し、過剰の染色を除去した。洗浄をさらに２回くり返し、プレートを乾燥させた。残存している染色は１００μｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム／５０％エタノールを各々のウェルに添加することにより可溶化した。可溶化の後、細胞の数をＥＬＩＳＡプレートリーダー上で５４０ｎｍで定量化した（参照フィルターは４１０ｎｍ）。ＥＬＩＳＡリーダーからの結果は、ｙ軸に吸光度、ｘ軸に日数としてグラフ化した。
【００７１】
方法Ｂ．軟寒天クローニングアッセイ
Ｎａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記述された方法に従って、細胞を軟寒天中にクローン化した。単一の細胞懸濁液を、０．８％寒天を含む培地中に様々な濃度のココア抽出物と共に生成した。懸濁液は１．０％寒天を含有する培地でコートされた３５ｍｍのディッシュに分配した。１０日間の保温の後、直径６０μｍ以上のコロニーの数を、Ｏｍｉｃｒｏｎ ３６００イメージ分析システム上で計数した。この結果は、ｙ軸上にコロニーの数、そしてココア画分の濃度をｘ軸上にプロットした。
【００７２】
方法Ｃ．ＸＴＴマイクロカルチャー テトラゾリウムアッセイ
Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）によって記載されたＸＴＴアッセイの手順を、多様なココア画分の検索のために用いた。ＸＴＴアッセイは、以下の変更を除いては、実質的には記載されたＭＴＴを用いた手順（実施例６）と同じである。ＸＴＴ（（２、３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒドロキシド）を、１ｍｇ／ｍｌで血清を含まない培地で調製し、３７℃で前加熱した。ＰＭＳを５ｍＭ ＰＢＳで調製した。ＸＴＴおよびＰＭＳは共に混合した；１０μｌのＰＭＳを１ｍｌあたりのＸＴＴ、および５０μｌのＰＭＳ−ＸＴＴを各々のウェルに添加した。３７℃で４時間の保温の後、プレートを３０分間、機械式振とう機で混合し、４５０−６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、吸光度をｙ軸に、増殖日数または濃度をｘ軸にプロットした。
【００７３】
方法ＡおよびＣについては、結果はまた、パーセント対照をｙ軸に、増殖日数または濃度をｘ軸にしてプロットした。
【００７４】
ＸＴＴおよびクリスタルバイオレットアッセイ手順比較を、ココア画分Ｄ＆Ｅ（実施例３Ｂ）を胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８に対して行い、どのアッセイが最も敏感であるか決定した。図１５Ａに示されたとおり、両方のアッセイは、濃度＞７５μｇ／ｍｌでは同じ投与量反応効果をしめした。この値より小さい濃度では、クリスタルバイオレットはＸＴＴアッセイの結果よりも高い標準偏差を示した。しかしながら、クリスタルバイオレットアッセイはより容易に用いることが出来るので、全てのこの後のアッセイは、特に断らないかぎり、この手順により行った。
【００７５】
クリスタルバイオレットアッセイの結果は示されているが（図１５Ｂ−１５Ｅ）、粗ポリフェノール抽出物（実施例２）の、胸部ガン細胞系統ＭＤＡ ＭＢ２３１、前立腺ガン細胞系統ＰＣ−３、胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６３、および子宮ガン細胞系統Ｈｅｌａそれぞれに対する効果を表している。全ての場合において、２５０μｇ／ｍｌの投与量は完全に全てのガン細胞の増殖を、５−７日の期間にわたって阻害した。Ｈｅｌａ細胞系統はこの抽出物に対して最も感受性であるように見えたが、それは１００μｇ／ｍｌの投与量でもまた生育を阻害したからである。実施例３Ｂ由来のココア抽出物はまた、Ｈｅｌａおよび他の胸部ガン細胞系統ＳＫＢＲ−３に対してアッセイした。結果（図１５Ｆおよび図１５Ｇ）は、画分Ｄ＆Ｅが最も高い活性を有していることを示している。図１５Ｈおよび１５Ｉに示されているとおり、約４０μｇ／ｍｌのＤ＆ＥのＩＣ５０値が両方のガン細胞系統に対して得られた。
【００７６】
ココア画分Ｄ＆Ｅはまた、試験化合物（群）の固定独立増殖を阻害する能力を決定するための軟寒天クローニングアッセイにおいてもまた試験された。図１５Ｊに示されているとおり、１００μｇ／ｍｌの濃度でＨｅｌａ細胞のコロニー形成を完全に阻害した。
【００７７】
３種類のココア園芸種を代表している、８種類の異なったココア遺伝子型から得られた粗フェノール抽出物についてもまた、Ｈｅｌａ細胞に対してアッセイした。図１５Ｋに示されているように、全ての多様なココアは同様の投与量反応効果を示した。ＵＩＴ−１種はＨｅｌａ細胞に関して最も高い活性を示した。これらの結果は、全てのココア遺伝子型が、地理的起源、園芸種および遺伝子型とは独立に、少なくとも１つのヒトガン細胞系統に対して活性を誘導するポリフェノール画分を有していることを示している。
【００７８】
別の一連のアッセイを、１トンスケールの、ブラジルココア豆の伝統的な５日間の発酵で、その後４日間の太陽乾燥段階を行ったものから、毎日の基本として調製された粗ポリフェノール抽出物について行った。図１５Ｌに示された結果は、これらの初期処理工程の明白な影響を示しておらず、ポリフェノールの成分のわずかな変化を示唆していた。しかしながら、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）が発酵工程の間にポリフェノールを酸化することが知られている（Ｌｅｈｒｉａｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、１９８３）。酵素的に酸化されたポリフェノールが活性にどのような効果を有するかを決定するために、別の実験を行った。粗ＰＰＯを、細かく粉砕された、発酵されていない、凍結乾燥され、脱脂されたブラジルココア豆を、１ｇの粉末に対して１０ｍｌのアセトンで抽出することにより調製した。スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。これを３回くり返し、上清をその度に廃棄し、ブフナー漏斗を通して注いだ４回目の抽出を行った。アセトン粉末は空気乾燥され、続いてＭｃＬｏｒｄ ａｎｄ Ｋｉｌａｒａ（１９８３）によって記述された手順に従ってアッセイした。粗ポリフェノール溶液（１００ｍｇ／１０ｍｌクエン酸−リン酸バッファー、０．０２Ｍ、ｐＨ５．５）に、１００ｍｇのアセトン粉末（４０００μ／ｍｇタンパク質）を添加し、スラリー中を泡立たせた空気流とともに３０分間撹拌した。この試料を、５０００ｇで１５分間遠心し、上清を３回２０ｍｌ酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を統合し、部分的真空下で蒸留し乾燥させ、５ｍｌの水を添加し、続いて凍結乾燥を行った。物質を続いてＨｅｌａ細胞に対してアッセイし、投与量反応を酵素的に処理されていない粗ポリフェノール抽出物と比較した。結果（図１５Ｍ）は、酵素的に酸化された抽出物の投与量反応曲線は顕著に変化していることを示し、酸化された生成物はそれらの天然型よりも阻害的であることを示した。
【００７９】
実施例９： プロシアニジンを含むココア抽出物の抗酸化剤活性
文献中の証拠は、天然に生成される抗酸化剤（ビタミンＣ、Ｅ、およびＢ−カロテン）の消費と、ガンを含む病気の低減された発生率との関係を示唆している（Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｆｏｏｄｓ、１９９３；Ｃａｒａｇａｙ、１９９２）。これらの抗酸化剤は、いくつかの腫瘍成長の型に関与している、特定の酸化的でフリーラジカル工程に影響すると一般に考えられている。付加的には、抗ガン原性であることが示されているいくつかの植物ポリフェノール性化合物は、実質的な抗酸化剤活性もまた有している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。
【００８０】
プロシアニジンを含むココア抽出物が抗酸化剤活性を有するか否かを決定するために、標準的なＲａｎｃｉｍａｔ法を用いた。実施例１、２および３に記載された手順を、ココア抽出物を調製するために用い、抽出物をさらに２つのゲル濾過由来の画分を生成させるために操作した。これらの２つの画分は実際には画分ＡからＣを統合したもの、およびＤとＥ（図１を参照）であり、それらの抗酸化剤特性を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較した。
【００８１】
ローストされていないピーナツから、皮を除去してピーナツ油をプレスした。各々の試験化合物は、各々試験化合物を、１００ｐｐｍ程度と２０ｐｐｍ程度の２つのレベルで（実際のレベルは表７中に示されている）油中に添加した。５０μｌのメタノール可溶化抗酸化剤を、各々の試料に抗酸化剤の分散を補助するために添加した。抗酸化剤を含まない５０μｌのメタノールを有する対照試料を調製した。
【００８２】
試料を、酸化安定性に関して、１００℃で２０ｃｃ／分の空気でのＲａｎｃｉｍａｔ安定性試験を用いて二重に評価した。実験的変数は活性酸素法（ＡＯＭ）またはＳｗｉｆｔ安定性試験（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１）について用いられたものと対応させて選択した。典型的なＲａｎｃｉｍａｔトレースは図１６に示されている。結果を表８に、１００ｍｅｇの過酸化物レベルに達するために必要な時間として報告する。
【表７】
【表８】
【００８３】
これらの結果は、試験された全ての添加物について、ピーナツ油の増加した酸化安定性を示した。酸化安定性の最も高い増加は、ココアの酢酸エチル粗抽出物を添加した試料によって実現された。これらの結果は、プロシアニジンを含むココア抽出物は、同じ量の合成ＢＨＡまたはＢＨＴと同等かまたはそれ以上の抗酸化的潜在性を有することを示している。従って、本発明は、例えば抗酸化剤および／または食品添加物等の公知のＢＨＡまたはＢＨＴの用途においてＢＨＡまたはＢＨＴに代わって用いられ得る。そして、この点に関して、本発明は食品の給源由来であることにも注意すべきである。これらの得られた結果から、当業者は、そのような「ＢＨＡまたはＢＨＴ」の用途における本発明の好適な量、例えば食品への添加量を、実験によらずに容易に決定できる。
【００８４】
実施例１０： トポイソメラーゼＩＩ阻害の研究
ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＩＩは、ＤＮＡ鎖の開裂および再結合を触媒し、それによりＤＮＡの位相的状態を制御している酵素である（Ｗａｎｇ，１９８５）。細胞内のトポイソメラーゼの機能の研究に加え、最も重要な発見の１つは、トポイソメラーゼＩＩが、介在物質（ｍ−ＡＭＳＡ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）並びに非介在エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）を含む数多くの診療において重要な抗腫瘍化合物に対する主要な細胞内標的として同定されたことである（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。いくつかの証拠の系統が、いくつかの抗腫瘍薬が、変性剤へさらすとＤＮＡの分解という結果となるＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ複合体（分解複合体）を安定化するという共通の特性を有することを示している（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。抗腫瘍薬による分解複合体形成は、細胞死につながりうる巨大ＤＮＡ反転をもたらすことが提唱されている。
【００８５】
この魅力的なモデルに従えば、特定のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ分解複合体の新規な誘導剤が、抗ガン、抗腫瘍、抗新形成剤として有用である。細胞毒性化合物を、標的ＤＮＡの活性により同定する試みにおいて、ココアプロシアニジンを、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対する促進された細胞毒性活性およびリンパ腫から得られたヒトトポイソメラーゼＩＩでの酵素アッセイに関して検索した。
【００８６】
Ａ．キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩによる鎖分解（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）
Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されている、キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩの鎖分解の生体外での阻害を以下のように行った。トポイソメラーゼＩＩ活性を含む核抽出物を、ヒトリンパ腫からＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）およびＤａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）の方法を変更して抽出した。精製酵素の１単位は０．２５μｍｏｌのキネトプラストＤＮＡを３４℃で３０分間に鎖分解する（ｄｅｃａｔｅｎａｔｅ）ために十分なものである。キネトプラストＤＮＡは、トリパノソーマ類Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａから得た。各々の反応は、１９．５μｌＨ２ Ｏ、２．５μｌ １０ｘバッファー（１ｘバッファーは、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、０．５ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭジチオスレイトールおよび３０μｇ ＢＳＡ／ｍｌを含む）、１μｌキネトプラストＤＮＡ（０．２μｇ）、および、１μｌの、様々な濃度での、ＤＭＳＯ含有ココアプロシアニジン試験画分を含む０．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中で行った。この組合せを、完全に混合し氷上に保存した。１単位のトポイソメラーゼを、３４℃で３０分間ウォーターバス中で保温する直前に添加した。
【００８７】
保温に続いて、鎖分解アッセイは５μｌ停止バッファー（５％サルコシル、０．００２５％ブロモフェニルブルー、２５％グリセロール）の添加により停止させ、氷上に静置した。ＤＮＡを、エチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）を含むＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上で電気泳動させた。波長３１０ｎｍでの紫外線発光により、ＤＮＡを可視化した。ポラロイドランドカメラを用いてゲルを撮影した。
【００８８】
図１７は、これらの実験の結果を示している。完全に鎖形成されたキネトプラストＤＮＡは１％アガロースゲル中で移動しない。キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩによる鎖分解は、ゲル中で移動するモノマーＤＮＡ（モノマーサークル、Ｉ型およびＩＩ型）を生じさせる。ココアプロシアニジンの添加による酵素の阻害は、増加する濃度の関数としてのモノマーバンドの増加的な消失から明らかである。これらの結果に基づいて、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥは、０．５から５．０μｇ／ｍｌの範囲にある濃度でトポイソメラーゼＩＩの阻害を示した。これらの阻害剤濃度は、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｈｒｏｎｅ）およびｍ−ＡＭＳＡ（４’−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルホン−ｍ−アニシジド）について得られたものと非常に類似したものであった。
【００８９】
Ｂ．薬剤感受性細胞系統
ココアプロシアニジンを、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対して検索した。これらの細胞系統の１つは、Ｐ．Ｊｅｇｇｏによって開発されたｘｒｓ−６ＤＮＡ二本鎖修復変異体である（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ｘｒｓ−６細胞系統のＤＮＡ修復欠損は、それら自身を、Ｘ照射、ＤＮＡ二本鎖形成を直接破壊するブレオマイシン等の化合物、およびトポイソメラーゼＩＩを阻害し、それにより間接的に二本鎖を破壊するＷａｒｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって提唱された化合物に対して特に感受性であるものとする。修復欠損系統に対しての細胞毒性を、ＤＮＡ修復能力の高いＣＨＯ系統、ＢＲ１に対する細胞毒性と比較した。修復欠損（ｘｒｓ−６）系統に対しての促進された細胞毒性を、ＤＮＡ分解二本鎖破壊の形成に対する証拠として解した。
【００９０】
ＤＮＡ修復可能ＣＨＯ系統、ＢＲ１は、Ｂａｒｒｏｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）によって開発され、Ｏ６ −アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼを、通常のＣＨＯ ＤＮＡ修復酵素に加えて発現する。ＣＨＯ二本鎖破壊修復欠損系統は、Ｐ．Ｊｅｇｇｏ博士およびその共同研究者（Ｊｅｇｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）からの寛大なる贈り物である。これらの両方の系統をアルファ−ＭＥＭ含有血清および抗生物質中で実施例６に記載のとおりに単層として増殖させた。細胞は加湿５％ＣＯ２ 雰囲気下で維持した。ココアプロシアニジン処理の前に、単層として増殖させた細胞をトリプシン処理により引き離した。実施例６に記載されているＭＴＴアッセイの手順を用いたアッセイを行った。
【００９１】
その結果は（図１８）、ｘｒｓ−６に対する促進された細胞毒性はみられないことを示し、ココアプロシアニジンは分解二本鎖破壊形成とは異なった方式でトポイソメラーゼＩＩを阻害したことを示唆していた。即ち、ココアプロシアニジンは、トポイソメラーゼＩＩと、それがＤＮＡと相互作用し非分解型複合体を形成する前に相互作用する。
【００９２】
非分解型複合体形成化合物は比較的新しい発見である。アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ポドフィリンアルカロイド（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ ａｌｋａｌｏｉｄ）、アントラセネジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎ）、アクリジンおよびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）の同類は、全て臨床用の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成のための使用が是認されており、それらは分解型複合体を形成する（Ｌｉｕ、１９８９）。いくつかの新しいクラスの、分解型複合体を形成するようには見えないトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が近年同定されてきた。これらには、アモナフィド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）（Ｈｓｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ディスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）（Ｆｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、フラバノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、メンブラノン（ｍｅｍｂｒａｎｏｎｅ）（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、テルペノイド（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）（Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、アントラピラゾール（ａｎｔｈｒａｐｙｒａｚｏｌｅ）（Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、ジオキソピペラジン（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）およびマリンアクリジン−デルシチン（ｍａｒｉｎｅ ａｃｒｉｄｉｎｅ−ｄｅｒｃｉｔｉｎ）（Ｂｕｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）が含まれる。
【００９３】
ココアプロシアニジンは、分解性複合体が形成される前にトポイソメラーゼＩＩを不活性化するので、それらは単独で、または公知で機構的に決定されているトポイソメラーゼＩＩインヒビターと組み合わせて、化学治療法的価値を有する。付加的には、ココアプロシアニジンはまた、新規クラスのトポイソメラーゼＩＩインヒビターであるように見え（Ｋａｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、そしてそれ故に他の公知のインヒビターよりも細胞に対して毒性が少なく、それによりそれらの化学治療法における用途を拡大している。
【００９４】
膜結合糖タンパク質（ｇｐ１７０）を発現し複数の薬剤耐性を付与するヒト胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７（ＡＤＲ）、およびその親系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８を、ココア画分ＤおよびＥの効果をアッセイするために用いた。図１９に示されるように、親系統は増加されたレベルでの画分ＤおよびＥで阻害されたが、一方でアドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ＡＤＲ）耐性の系統は高い投与量では影響は少なかった。これらの結果は、ココア画分ＤおよびＥは複数の薬物耐性細胞系統に効果を有することを示している。
【００９５】
実施例１１： プロシアニジンの合成
プロシアニジンの合成を、Ｄｅｌｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）によって開発された手順に従って、変更を加えて行った。（＋）−カテキンをジヒドロケルセチンとともに還元的条件下で濃縮することに加え、（−）−エピカテキンもまた、発酵されていないココア豆中に天然にもたらされる（−）−エピカテキンの高濃度を反映させるために用いた。合成生成物を単離し、精製し、分析し、実施例３、４および５に記載されている手順により同定した。このやり方により、ビフラバノイド、トリフラバノイドおよびテトラフラバノイドを調製し、分析用標準試料として、上記の方式でココア抽出物に関して用いた。
【００９６】
実施例１２： 順相半調製画分のアッセイ
ポリフェノール抽出物は組成物として複雑であるので、更なる精製、投与量反応アッセイ、および包括的な構造の同定のために、どの成分がガン細胞に対して活性であるのかを決定する必要があった。順相半調製ＨＰＬＣ分離（実施例３Ｂ）をココアプロシアニジンをオリゴマーの大きさに基づいて分離するために用いた。元々の抽出物に加え、１２の画分を調整し（図２Ｂおよび１５ Ｏ）、１００μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの投与量でＨｅｌａ細胞に対して、どのオリゴマーが最大の活性を有しているかを決定するためにアッセイした。図２０に示されているように、画分４−１１は（ペンタマーからドデカマー）は、約２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値を示した。これらの結果は、これらの特定のオリゴマーが、Ｈｅｌａ細胞に対する最大の活性を有していることを示した。付加的には、ココア画分ＤおよびＥの順相ＨＰＬＣ分析により、この画分がこれらのオリゴマーを豊富に有することが示された。
【００９７】
上記から、本発明の、抽出物およびココアポリフェノール、並びに組成物、方法およびキットは用途を有していることは明らかである。この見地から、本発明は、食料品由来であり、生体外で示された活性は、少なくともいくつかの活性は生体内で、特に上記の投与量を考慮して示され得るといえる。
【００９８】
付加的には、これまでの記述は、抽出物およびココアポリフェノール、ならびに組成物、方法およびキットは、ＢＨＴおよびＢＨＡに類似した抗酸化剤活性を、酸化安定性と同様に有していることを示している。このように、本発明は、例えば抗酸化食品添加物等の抗酸化剤等の公知のＢＨＡ、ＢＨＴの用途においてＢＨＴまたはＢＨＡに代わって用いられることができる。本発明はまた、トポイソメラーゼ阻害剤として、現在そのために知られている用途において用いられることができる。従って、本発明によって想像できる組成物および方法が数多く存在する：例えば、抗酸化剤または保存用組成物、トポイソメラーゼ阻害組成物、食品または何れかの所望の品の、酸化等からの保存方法、およびトポイソメラーゼ阻害のための方法であって、抽出物および／またはココアポリフェノールを含有するもの、または、食品、品物またはトポイソメラーゼをそれぞれの組成物即ち抽出物および／またはココアポリフェノール（群）と接触させることから成るものの何れか、等である。
【００９９】
このように詳細に、好ましい本発明の態様を記述してきたが、添付の請求の範囲により定義された本発明は、上記の記述中に示された特定の詳細に限定されるものではなく、本発明の範囲および精神から離れるものではない数多くのその変化体があり得ることは理解されるべきである。
【０１００】
他の実施態様
１．ココアポリフェノール（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物。
２．ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出および精製すること、
から成る工程により調製される実施態様１記載の抽出物。
３．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様２記載の抽出物。
４．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様２または３記載の抽出物。
５．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール（群）を含有することを特徴とする実施態様４記載の抽出物。
６．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る抗新形成性組成物。
７．ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様６記載の抗新形成性組成物。
８．前記ココアプロシアニジン（群）が、
ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、
から成る工程により調製される実施態様７記載の抗新形成性組成物。
９．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様８記載の抗新形成性組成物。
10．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様８または９記載の抗新形成性組成物。
11．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール群を含有することを特徴とする実施態様１０記載の抗新形成性組成物。
12．有効量の実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に投与することから成る、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療する方法。
13．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様１２記載の方法。
14．前記ココアポリシアニジン（群）が、
ココア豆を粉末に還元すること、
粉末を脱脂すること、および
粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、
から成る工程により調製されることを特徴とする実施態様１３記載の方法。
15．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥すること、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および
脱穀された豆を粉砕すること、
から成ることを特徴とする実施態様１４記載の方法。
16．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むことを特徴とする実施態様１４または１５記載の抗新形成性組成物。
17．前記抽出物が、（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリフェノール（群）を含有することを特徴とする実施態様１６記載の抗新形成性組成物。
18．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）および好適な担体から成る、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療するためのキット。
19．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含み；前記キットが原料の混合および／または患者への投与のための指示書を含むことを特徴とする実施態様１８記載のキット。
20．実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含むことを特徴とする凍結乾燥された抗新形成性組成物。
21．前記組成物が実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする実施態様２０記載の凍結乾燥された抗新形成性組成物。
22．実施態様１記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含む抗酸化性または保存性組成物。
23．実施態様１記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含むトポイソメラーゼ阻害性組成物。
24．品物を実施態様２２記載の組成物と接触させることから成る、所望の品物を保存または酸化から防護するための方法。
25．前記品物が食品であることを特徴とする実施態様２４記載の方法。
26．実施態様２３記載の組成物とトポイソメラーゼを接触させることから成るトポイソメラーゼを阻害するための方法。
【参考文献】
【０１０１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法によって調製される、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
発酵していないまたは部分発酵したココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
得られたココア抽出物を精製する。
【請求項２】
前記調製方法が、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって抽出物を精製することを含む、請求項１記載のココア抽出物。
【請求項３】
ココアプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体のそれぞれを少なくとも１つ含有する請求項１記載のココア抽出物。
【請求項４】
以下の工程を含む方法によって調製され、かつキサンチンアルカロイドを含まない、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
ココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
前記抽出物からキサンチンアルカロイドを除去して、キサンチンアルカロイドを含まない副画分を得る。
【請求項５】
前記ココア豆を粉末に粉砕する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥し、
凍結乾燥した塊を脱パルプ化し、
凍結乾燥したココア豆を脱穀し、さらに
前記脱穀した豆を粉砕することを含む、請求項１から４いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項６】
凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項７】
５量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含むココアポリフェノールを含有するココア抽出物。
【請求項８】
２量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有する粗ココア抽出物である請求項７記載のココア抽出物。
【請求項９】
以下の工程を含む方法によって調製されることを特徴とする請求項７記載のココア抽出物：
ココア豆を粉末に粉砕し、
粉末を脱脂し、
粉末からココアポリフェノールを抽出し、さらに
得られた抽出物を精製する。
【請求項１０】
前記ココア豆を粉末に粉砕する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥し、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化し、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀し、さらに
脱穀された豆を粉砕することを含む、請求項９記載のココア抽出物。
【請求項１１】
前記調製方法が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することを含む、請求項９または１０記載のココア抽出物。
【請求項１２】
前記ココア豆が未発酵のものである請求項９から１１いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項１３】
少なくとも１つの４量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物、および担体を含む、経口投与用の液体調製物。
【請求項１４】
請求項１記載のココア抽出物、および担体を含む、経口投与用の液体調製物。
【請求項１５】
懸濁物、シロップまたは内用液であることを特徴とする請求１３または１４記載の液体調製物。
【請求項１６】
少なくとも１つの４量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物を用いることを含む、請求項１３記載の液体調製物を作成する方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの５量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含むココアポリフェノールを含有するココア抽出物を用いることを含む、請求項１３記載の液体調製物を作成する方法。
【請求項１８】
請求項７記載のココア抽出物を含む、抗酸化または保存組成物。
【請求項１】
以下の工程を含む方法によって調製される、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
発酵していないまたは部分発酵したココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
得られたココア抽出物を精製する。
【請求項２】
前記調製方法が、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって抽出物を精製することを含む、請求項１記載のココア抽出物。
【請求項３】
ココアプロシアニジン２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体のそれぞれを少なくとも１つ含有する請求項１記載のココア抽出物。
【請求項４】
以下の工程を含む方法によって調製され、かつキサンチンアルカロイドを含まない、ココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物：
ココア豆を粉末に粉砕し；
前記粉末を脱脂し；
溶媒抽出技術によって前記粉末からココアプロシアニジンオリゴマーを抽出し；さらに
前記抽出物からキサンチンアルカロイドを除去して、キサンチンアルカロイドを含まない副画分を得る。
【請求項５】
前記ココア豆を粉末に粉砕する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥し、
凍結乾燥した塊を脱パルプ化し、
凍結乾燥したココア豆を脱穀し、さらに
前記脱穀した豆を粉砕することを含む、請求項１から４いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項６】
凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項７】
５量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含むココアポリフェノールを含有するココア抽出物。
【請求項８】
２量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有する粗ココア抽出物である請求項７記載のココア抽出物。
【請求項９】
以下の工程を含む方法によって調製されることを特徴とする請求項７記載のココア抽出物：
ココア豆を粉末に粉砕し、
粉末を脱脂し、
粉末からココアポリフェノールを抽出し、さらに
得られた抽出物を精製する。
【請求項１０】
前記ココア豆を粉末に粉砕する工程が、
豆およびパルプを凍結乾燥し、
凍結乾燥された塊を脱パルプ化し、
凍結乾燥されたココア豆を脱穀し、さらに
脱穀された豆を粉砕することを含む、請求項９記載のココア抽出物。
【請求項１１】
前記調製方法が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することを含む、請求項９または１０記載のココア抽出物。
【請求項１２】
前記ココア豆が未発酵のものである請求項９から１１いずれか１項記載のココア抽出物。
【請求項１３】
少なくとも１つの４量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物、および担体を含む、経口投与用の液体調製物。
【請求項１４】
請求項１記載のココア抽出物、および担体を含む、経口投与用の液体調製物。
【請求項１５】
懸濁物、シロップまたは内用液であることを特徴とする請求１３または１４記載の液体調製物。
【請求項１６】
少なくとも１つの４量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含有するココア抽出物を用いることを含む、請求項１３記載の液体調製物を作成する方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの５量体から１２量体のココアプロシアニジンオリゴマーを含むココアポリフェノールを含有するココア抽出物を用いることを含む、請求項１３記載の液体調製物を作成する方法。
【請求項１８】
請求項７記載のココア抽出物を含む、抗酸化または保存組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１３Ｈ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１５Ｉ】
【図１５Ｊ】
【図１５Ｋ】
【図１５Ｌ】
【図１５Ｍ】
【図１５Ｎ】
【図１５Ｏ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】
【図９Ｈ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１３Ｆ】
【図１３Ｇ】
【図１３Ｈ】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１５Ｉ】
【図１５Ｊ】
【図１５Ｋ】
【図１５Ｌ】
【図１５Ｍ】
【図１５Ｎ】
【図１５Ｏ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００９−２８６７９６（Ｐ２００９−２８６７９６Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０３５４１（Ｐ２００９−２０３５４１）
【出願日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【分割の表示】特願平８−５１２１５２の分割
【原出願日】平成７年１０月３日（１９９５．１０．３）
【出願人】（５０９２４８１５４）マーズ インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＲＳ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【分割の表示】特願平８−５１２１５２の分割
【原出願日】平成７年１０月３日（１９９５．１０．３）
【出願人】（５０９２４８１５４）マーズ インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＲＳ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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