抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性の活性を有するズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸（ｔｉａｒｅｌｌｉｃａｃｉｄ）を含有する組成物
本発明は、抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性の活性を有するズダヤクシュ(Tiarella Polyphylla)抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸(tiarellic acid)を含む組成物に関する。ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸は、ＯＶＡ誘導性喘息マウスのインビトロテストにおけるＬＴＣ４放出の抑制効果、ＩｇＥレベル及びサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）産生の抑制効果、気道過敏性の抑制効果、並びに白血球浸潤の抑制効果を示す。したがって、本発明は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための治療剤又は機能性健康食品として使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性の活性を有するズダヤクシュ(Tiarella Polyphylla)抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸(tiarellic acid)を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息(asthma)とは、気道に発生する複合症候群であって、例えば気道障害、急性又は慢性炎症、気道過敏性(airway hyper-responsiveness)（ＡＨＲ）及び構造的リモデリング(Kumar R. K.の論文 Pharmacol. Ther., 91, pp 93-104, 2001)などの多様な疾患が現れる。
気道に発生するアレルギー性炎症は、喘息発達に重要な役割を果たすものと報告されており、アレルギー性喘息に苦しむ患者の数は、最近、世界人口の約１０％まで増加した。その数は米国において１７００万名に達し、アレルギー性喘息治療剤の米国市場の規模は現在まで約６４００億米ドルであると報告されている。
【０００３】
喘息は、２つの型、すなわち外因性喘息と内因性喘息に分けられる。主要抗原としてのイエホコリダニ（デルマトファゴイド類（Dermatophagoides））、花粉、動物の上皮、カビなどの抗原への曝露により引き起こされる外因性喘息は、該抗原に対する皮膚試験又は気管支誘発試験において陽性反応を示し、かつ一般的には若者において発生する。上気道感染、運動、情緒不安、寒冷気候及び湿度の変化などにより引き起こされる内因性喘息は、成人患者に起こる。
【０００４】
病態生理学的な側面によると、喘息は、以下の過程によって起こる慢性的炎症として認識されている；Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ２免疫細胞で再生産されるサイトカインによって炎症細胞が増殖、分化及び活性化され、気道又は気道周辺組織に移動する。好中球(neutrophil)や肥満細胞(mast cell)などの活性化された炎症細胞は、サイトカイン、ケモカイン、シグナル分子、接着分子及び成長因子などの多様な炎症媒介因子を放出し、気道中の構造細胞は喘息の多様な段階に関与する(Elias JA らの論文, J Clin Invest., 111, pp 291-7, 2003)。ノックアウトマウスモデルを用いた多数の研究及び臨床的研究において、喘息における決定的所見は、例えば免疫反応、好中球増加症(eosinophilia)、ＡＨＲ及び構造的リモデリングなどの幾つかの特徴的パラメータに落とし込むことができた（Moffatt JD.の論文, Pharmacol Ther. 107, pp 343-57, 2005; Spina D らの論文, Trends Pharmacol Sci, 23, pp 311-5, 2002)。各々のパラメータは、互いに直接関連していないようであるが、ＩｇＥ介在性免疫反応及び好中球増加症はアレルギー性喘息の気道における重要な症状であり(Bochner B.S. らの論文, Annu. Rev. Immunol., 12, pp 295-335, 1994; Bousquet H らの論文 N. Med. 323, pp 1033-9, 1990)、アレルギー過程で産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３などのサイトカインもＡＨＲの進行及び気道リモデリングに重要な役割を果たす(Riffo-Vasquez Y らの論文, Pharmacol. Ther., 94, pp 185-211, 2002)。実際、喘息は組織化された炎症の結果であり、その多くは喘息の気道に作用する特異的阻害剤に関連し、例えばヒスタミンＨ１拮抗剤、トロンボキサン拮抗剤、血小板活性化因子拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、窒素モノオキシゲナーゼ阻害剤、及びプロスタグランジン阻害剤が臨床試験に試みられたが、失敗した(Moffatt J.D.の論文, Pharmacol. Ther., 107, pp 343-57, 2005)。反面、サイトカイン合成及びサイトカイン介在性免疫細胞生存の広範囲な阻害によって炎症細胞の先駆レベルを基準にまで抑制するグルココルチコイドは、現在まで３０年の期間にわたって喘息患者の症状を管理するのに用いられてきた(Baatjes A. J. らの論文, Pharmacol, Ther., 95, pp 63-72, 2002)。これらの報告は、喘息管理のための治療学的アプローチは、喘息過程の特定経路の強力な阻害剤の検索よりもむしろ、喘息的パラメータの均衡を回復することに焦点を合わせるべきであるということを示唆している。
【０００５】
ズダヤクシュ(Tiarella Polyphylla)D.Don（ユキノシタ科(Saxifragaceae)）は、韓国において、ズダヤクシュ属に属する単一種である。ズダヤクシュD.Donは中国の南西部に自生しているが、韓国においては鬱陵島の山頂でのみ自生している。以前に、コロソリン酸(corosolic acid)、トルメンチン酸(tormentic acid)などと共にチアレリン酸(tiarellic acid)が単離されており(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)、及び他のグループは、紫外線を照射した線維芽細胞におけるＭＭＰ−１及び１型プロコラーゲンの発現における阻害的効果を報告した (Moon らの論文, J Ethnopharmacol., 98, pp 185-189, 2005)。
【０００６】
しかしながら、引用により本明細書に組み込まれる上記文献の全てにおいて、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸の抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性における抑制的効果については、報告又は開示されていない。
したがって、本発明者らは、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸が、インビトロにおけるＬＴＣ４放出に対するチアレリンの酸抑制効果、並びにＩｇＥレベル及びサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）産生、気道過敏性、及び喘息の管理に寄与するものと予想されるＯＶＡ誘導型喘息マウスにおける白血球浸潤における抑制的効果を示すことを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（技術的課題）
したがって、今日までに、毒性がなく、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療並びに予防するためのより有効な薬剤を発見する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（技術的解決）
したがって、本発明の目的は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分としてズダヤクシュ粗抽出物又はズダヤクシュの有機溶媒可溶性抽出物を含有する組成物を提供することにある。
本明細書に記載の用語「粗抽出物」は、水、例えばメタノール、エタノールなどのＣ１〜Ｃ４低級アルコール、好ましくはメタノール及びその類似体、又はそれらの混合物などを用いて植物材料を抽出することにより製造される抽出物を含む。
本明細書に記載の用語「有機溶媒可溶性抽出物」は、上述した粗抽出物を、有機溶媒、例えばブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン又はヘキサン、好ましくはブタノールで抽出することにより製造できる。
【０００９】
本発明は、下記化学式１で表される、ズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物から単離されたチアレリン酸を含有する医薬組成物、又は炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防及び治療のための有効量を活性成分とするその医薬として許容し得る塩を提供する。
【化１】
【００１０】
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための薬剤の製造のためのズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物、若しくはそれから単離されたチアレリン酸の使用を提供する。
本発明の別の様態において、哺乳類における炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための方法を提供する。該方法は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患に苦しむ哺乳類にズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物又はこれから単離されたチアレリン酸の治療学有効量を投与することを含む。
ズダヤクシュから単離された発明的抽出物及びそれから単離されたチアレリン酸は、以下の好適な実施態様によって製造できる。
【発明の効果】
【００１１】
（有利な効果）
本発明は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための有効量での活性成分としてズダヤクシュ抽出物又はそれから単離したチアレリン酸を含む、医薬組成物及び健康食品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に記述する。
本発明に関して、例えば、乾燥させたズダヤクシュの植物体全体を小片に切り、該小片を、２〜２０倍容量、好ましくは５〜１０倍容量の極性溶媒、例えば水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール例えばメタノール、エタノール、ブタノールなど、又はそれらの混合物、好ましくはメタノール、と共に混合し；及び、熱水を用いる還流抽出、冷水抽出、超音波抽出、又は従来型の抽出、好ましくは冷水抽出によって、２０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃にて、１０〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間にわたり加熱し；残渣は濾過を濾過し、その後それらの極性溶媒可溶抽出物を収得するために該濾過物を乾燥させた。
上記ステップによって製造された上記粗抽出物を、水に懸濁した後、前記懸濁液を、約１〜１００倍、好ましくは１〜５倍の体積の有機溶媒ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン又はヘキサン、好ましくはブタノールと混合し、本発明の有機溶媒可溶抽出物を収得する。
【００１３】
前記有機溶媒可溶抽出物をさらに、シリカゲルで充填されたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ、８．５×６５ｃｍ）に供し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（酢酸エチル１０〜２０％、段階勾配）及びクロロホルム：メタノール（メタノール０〜１００％、段階勾配）の混合溶媒で溶出して、９つの画分を得る。該画分のうち６番目の画分は、順相シリカゲルカラム(シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール５〜５０％段階勾配)を用いてさらに再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、本発明のチアレリン酸を収得する。ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）、ＥＩ−ＭＳ、及び以前に報告された旋光度(optical rotation)によって構造が確認された(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)。純度は、ＨＰＬＣシステム（Shimadzu社 SCL-1OA搭載SPD-M 1OA vp PDA検出器, カラム; Phenomenex Synergi 4 um Fusion RP-80, 4.6x50 mm, 溶出: ACN/0.1% TFA含有DW, 4/1, v/v).）によって９９．５％より高いと分析された。
【００１４】
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患のを予防及び治療するための活性成分として前述した製造方法によって単離されたズダヤクシュの粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又はチアレリン酸を含有する、医薬組成物を提供する。
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防する薬剤を生産するための前述した製造方法による、ズダヤクシュ粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又はチアレリン酸の使用を提供する。
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための方法も提供し、該方法は、前述した製造方法で製造されたズダヤクシュ粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又は単離されたチアレリン酸を含有する治療的有効量の投与を含む。
【００１５】
化学式（Ｉ）で表される発明的化合物は、当業界に周知の従来法によって、医薬として許容し得る塩及び溶媒和物に変形できる。塩に関して、医薬として許容し得るその遊離酸によって形成されるその酸付加塩は、有用であり、かつ従来法で製造できる。例えば、酸溶液の過剰量に化合物を溶解させた後、該塩を、メタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒で沈殿させてその酸付加塩を調製し、さらに化合物と、水又はアルコール例えばグリコールモノメチルエーテルで希釈した酸との等量混合物を加熱し、その次に蒸発により乾燥させるか又は減圧下で濾過して、その乾燥塩形態を得ることができる。
【００１６】
上記方法の遊離酸として、有機酸又は無機酸が使用できる。例えば、 有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などを本明細書で使用することができ、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などを本明細書で使用することができる。
【００１７】
さらに、塩基を用いることにより、発明的化合物の医薬として許容し得る金属塩を製造することができる。そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、従来法で製造できるが、例えば化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させた後、不溶性塩を濾過し、フィルターに残った物質を蒸発させ、その金属塩を収得する。本発明の金属塩としては、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩が医薬的に適し、また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を適切な銀塩（例えば硝酸銀）と反応させて調整することができる。
【００１８】
前記化合物の医薬として許容し得る塩は、本明細書に特に示さない場合、該化合物に存在し得る全ての酸性又は塩基性の塩を含む。例えば、本発明の医薬として許容し得る塩は、例えばそのナトリウム、カルシウム及びカリウム塩などのヒドロキシル基の塩；及び例えば臭化水素塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、及びｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）などのアミノ基の塩を含み、これらは当業界で知られている従来法によって製造できる。
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を予防及び治療するための発明的組成物は、前記抽出物又は該組成物の総重量に基づく重量の０．１〜５０％の化合物を含んでよい。
【００１９】
本発明による組成物は、医薬として許容し得るキャリア、アジュバント、又は 希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含有する医薬組成物として提供できる。該製剤は、充填剤、抗アグルチナート化剤（anti-agglutinating agent）、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存料などを追加的に含んでよい。本発明の組成物は、当業界で周知の任意の手順を使用することによる患者への該組成物の投与後、該活性成分が即時放出、持続放出又は遅延放出されるように製剤してもよい。
【００２０】
例えば、本発明の組成物は、注射剤の生産に一般的に使用される、オイル、プロピレングリコール又は他の溶媒に溶解できる。キャリアの適切な例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル、ミリスチン酸イソプロピルなどを含むが、これらに限定されない。局所投与のために、本発明の抽出物は軟膏又はクリームの形で製造できる。
【００２１】
本発明の組成物を含む医薬製剤は、経口剤形（粉末剤、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、液状薬、シロップ、エリキシル丸薬、粉末剤、サシェ(sachet)、顆粒剤）、又は局所用製剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム(balm)、パッチ(patch)、ペースト、スプレー溶液、エアロゾルなど）、又は注射用製剤（溶液、懸濁液、エマルジョン）などのいずれの形態でも製造できる。
医薬剤形における、本発明の組成物は、これらの医薬として許容し得る塩の形態で使用してもよく、単独で又は適切な集合形態で、並びに他の薬学的活性化合物との組み合わせで使用してもよい。
【００２２】
本発明の抽出物又は化合物の好ましい投与量は、投与対象の状態及び体重、重症度、薬物形態、投与経路及び期間などによって異なるが、当業者により選択され得る。しかしながら、所望の効果を得るためには、一般的に、本発明の発明的抽出物は重量／日として０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与することを推奨する。該用量を、１日に１回又は数回に分けて投与してもよい。
本発明の医薬組成物は、多様な経路を介して哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒトなど）などの対象動物に投与できる。投与の全ての様式が考慮されるが、投与は例えば経口、直腸を介して、又は静脈、筋肉、皮下、皮内、くも膜下、硬膜外、又は脳室内注射によって行われることが可能である。
【００２３】
本発明の他の目的は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防、及び緩和のための食品学的に許容される添加物と共に、ズダヤクシュ抽出物又はこれから単離された化合物を含む機能性健康食品を提供することにある。
機能性健康食品の開発のために、本発明の上記抽出物又は化合物を含む添加食品の例は、多様な食品、飲料、ガムである。ビタミン複合体、健康増進食品及びこれと類似のものは、粉末剤、顆粒剤、錠剤、チューイン錠剤、カプセル剤又は飲料などとして使用できる。
上述した組成物は、食品、添加剤又は飲料に添加できる。ここで、食品又は飲料中の上記抽出物又は化合物の量は、一般に、健康食品組成物の食品総重量の約０．０１〜８０重量／重量％、好ましくは０．０１〜１５重量／重量％の範囲であり、並びに健康飲料組成物１００ｍＬ当りの割合で０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇである。
【００２４】
本発明の健康飲料組成物が上記抽出物又は化合物を重要構成成分として提示割合で含んでいる場合を条件として、他の液体成分の特別な制限はなく、ここで、他の構成成分は、通常の飲料のように様々な防臭剤(deodorant)又は天然炭水化物などを意味する。上述した天然炭水化物の例としては、例えばグルコース、果糖などの単糖類；例えばマルトース、スクロースなどの二糖類；例えばデキストリン、シクロテキストリンなどの通常の糖；及び例えばキシリトール、エリトリトール(erythritol)などの糖アルコール；などがある。上述したもの以外の防臭剤として、天然防臭剤（タウマチン(taumatin)）、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシド(levaudioside)Ａ、グリシルヒジン(glycyrrhizin)など）及び合成防臭剤（例えばサッカリン、アスパルテームなど）を有用に使用することができる。前記天然炭水化物の量は、本飲料組成物１００□当り一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇの範囲である。
【００２５】
前述した組成物とは異なる構成成分は、多様な栄養成分、ビタミン、鉱物又は電解質、合成香料、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなどの場合）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド粘着剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭化剤などがある。これらの構成成分とは異なる構成成分は、天然果物ジュースを製造するための果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料であってよく、ここで、該構成成分は、独立に又は組み合わせて使用することができる。構成成分の割合は、あまり重要ではないが、一般的には１００重量／重量％の本組成物当り０〜約２０重量／重量％程度の範囲である。上述した抽出物を含む添加食品の例は、様々な食物、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品及びこれと類似のものがある。
本発明の発明的抽出物は、毒性及び副作用がないので、安全に使用できる。
本発明は、以下の実施例にさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、 本発明はこれらの実施例によって限定されないことは理解されるべきである。
【００２６】
(本発明を実施するための最良の様式)
本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び製造において多様な改良及び変化を加え得ることは、当業者には自明なことである。
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。
（本発明の様式）
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００２７】
以下の参考例、実施例及び実験例は、その範囲を限定するものではなく、本発明をさらに詳しく説明することを意図する。
（実施例１）ズダヤクシュ粗抽出物の製造
２００３年８月韓国、鬱陵島でズダヤクシュを収集し、その標本（ＰＥＢ ３０６８）は、韓国、大田にあるＫＲＩＢＢ(Korea Reseach Institute of Bioscience and Biotechnology)の植物抽出物バンクに寄託された。
乾燥したズダヤクシュ１．１ｋｇを粉末化し、５Ｌのメタノールと混合し、この混合物を室温で２４時間攪拌し、３回にわたって冷浸抽出を行った。抽出物は、ろ紙で濾して残渣を除去した。ろ液を収集し、減圧下で回転蒸発装置によって５５〜６５℃で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥させて、１００．５ｇの乾燥したズダヤクシュ粗抽出物を収得した。
【００２８】
（実施例２）ブタノール可溶性画分製造
蒸留水１Ｌを、実施例１で収得した粗抽出物１００．５ｇに添加した。分液漏斗にて、該混合物にブタノール１Ｌを加えてはげしく混合し、ブタノール溶解層と水溶解層に分離した。
前記ブタノール溶解層を、回転蒸発装置で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥させてブタノール可溶抽出物を得、最終的に、次の実験に試料として使用する、ブタノール可溶抽出物８０．０ｇ及び水可溶性抽出物を収得した。
【００２９】
（実施例３）ズダヤクシュ抽出物からのチアレリン酸の製造
乾燥したズダヤクシュ３．２９ｋｇは、室温にて２回メタノール（１０Ｌ）抽出し、３５２ｇの抽出物を得た。この抽出物を水１Ｌに懸濁し、同量のｎ−ヘキサンで分画した。ｎ−ヘキサン可溶画分６５．１ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ、８．５×６５ｃｍ）に供し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル混合物（酢酸エチル１０〜２０％、段階勾配）、及びクロロホルム−メタノール混合物（メタノール０〜１００％、段階勾配）で溶出させ、成功的に、９つの画分を得た（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９）。Ｆｒ．６の７．４ｇ（クロロホルム−メタノール９／１〜７／３、ｖ／ｖ）を、順相シリカカラム（シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６．０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール５〜５０％段階勾配）を使用するカラムクロマトグラフィーに供し、４００ｍｇのチアレリン酸を収得した。構造は、前述したようにＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）、ＥＩ−ＭＳ及び旋光度で確認し(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)、９９．５％より高いの純度であることが、ＨＰＬＣシステム（Shimadzu社 SCL-1OA搭載SPD-M 1OA vp PDA検出器, カラム; Phenomenex Synergi 4 um Fusion RP-80, 4.6x50 mm, 溶出: ACN/0.1% TFA含有DW, 4/1, v/v).）によって分析された。
【００３０】
チアレリン酸
針状 (MeOH);
mp 254-256℃ ;
[a]２３Ｄ +94 (ピリジン, c 0.14);
IR (KBr, cm-1): 3491 (OH), 1689 (CO), 1645 (C=C), 1450, 1388, 1262, 1222, 1044; HRMS m/z 472.3552 (M+, 計算値 C30H48O4: 472.3553);
EIMS (rel. int.) m/z: 472 [M]+ (61), 454 [M-H2O]+ (34), 436 [M-2H2O]+ (62), 424 (42), 396 (26), 205 (75), 187 (71), 175 (87), 173 (100);
13C-NMR (150 MHz, ピリジン-d5): 13.0 (C-24), 17.4 (C-25), 17.5 (C-26), 18.7 (C-6), 18.8 (C-28), 19.4 (C-30), 21.3 (C-11), 25.8 (C-15), 26.7 (C-12), 27.9 (C-2), 30.1 (C-21), 37.7 (C-10), 38.2 (C-7), 38.3 (C-16), 39.2 (C-1), 39.6 (C-13), 40.4 (C-22), 40.8 (C-8), 42.9 (C-4), 43.0 (C-17), 48.1 (C-19), 49.2 (C-5), 51.4 (C-18), 51.6 (C-9), 60.4 (C-14), 68.2 (C-23), 73.6 (C-3), 110.2 (C-29), 150.9 (C-20), 178.3 (C-27).
1H-NMR (600 MHz, ピリジン-d5): 1.05, 1.71 (2H, m, 各々, H-1), 1.82, 1.91 (2H, m, 各々, H-2), 4.02 (1H, dd, J = 4.7, 11.6 Hz, H-3), 1.51 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-5), 1.48, 1.65 (2H, m, 各々, H-6), 1.87, 2.06 (2H, m, 各々, H-7), 2.02 (1H, dd, J = 1.7, 12.7 Hz, H-9), 1.32, 1.64 (2H, m, 各々, H-11), 1.87, 2.60 (2H, m, 各々, H-12), 1.88 (1H, m, H-13), 1.67, 2.28 (2H, m, 各々, H-15), 1.70, 1.78 (2H, m, 各々, H-16), 1.81 (1H, m, H-18), 2.60 (1H, m, H-19), 1.36, 1.97 (2H, m, 各々, H-21), 1.16, 1.40 (2H, m, 各々, H-22), 3.57, 4.07 (2H, d, J=10.4, 各々, H-23), 1.04 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-25), 1.21 (3H, s, H-26), 0.90 (1H, s, H-28). 4.76, 4.96 (2H, s, 各々, H-29), 1.86 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-30)．
【００３１】
（実験例１）動物感作及び気道感作
マウス群（ｎ＝５〜６）で実験した；以下の処理を行った：
（１）リン酸−緩衝生理液（ＰＢＳ；ｉｐＮｅｂ）を用いたシャム感作(sham-sensitization)及び誘発；（２）ＯＶＡ（卵白アルブミン：Ｓｉｇｍａ社 Ａ５５０３；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（ｉｂＮｅｂ）を用いた感作及び誘発；（３）ＯＶＡ（ｉｐ）を用いた感作、並びにＯＶＡ（Ｎｅｂ）及び試料（チアレリン酸又はジレウトン(zileuton)、ｐｏ）を用いた誘発。手短にいうと、2mgの水酸化アルミニウムを用いて100μlのPBS緩衝液（pH 7.4）中に乳化させた20μgのOVAを、0日目及び11日目に腹膜注射することにより、マウスを感作させた。最初の感作後の１９、２０、２１及び２５日目に、超音波噴霧器（ＮＥ−Ｕ１２；Ｏｍｒｏｎ社、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して２０分間、ＯＶＡ（ＰＢＳ中１％）を用いて、気道でマウスを誘発させた。最後の誘発（２７日目）の４８時間後にマウスを犠牲にし、アレルギー性喘息の気道上におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を測定した。
【００３２】
（実験例２）ＭＴＴアッセイ
ズダヤクシュの発明的抽出物及びそれから単離されたチアレリン酸の細胞毒性活性を調べるために、ＭＴＴ((3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイ法を、次の手順で実施した(Wang Z らの論文, Biol., Pharm. Bull., 24, pp 159-162, 2001)。
前骨髄ＨＬ−６０細胞（ＨＬ−１８１０３、５×１０５細胞／ｍＬ）を、ＮＧＦ欠乏条件の下で９６ウェルプレートに播いた。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＤＭＳＯ１０μＬとＭＴＴ溶液１０μＬ（５／ｍＬ）に溶解された試料の混合物で処理し、同様の条件下で４時間インキュベートした。４時間後、ＭＴＴを除去し、ＤＭＳＯ１００μＬを各ウェルに滴下して、結晶を溶解させた。ＵＶ吸収を、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、米国）で５７０ｎｍにて測定し、細胞生存率を計算した。
表１に示すように、本発明の発明的抽出物又は化合物は、細胞毒性を示さないことを確認した。
【表１】
【００３３】
（実験例３）骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）の調整及び活性化
ＢＭＭＣを、オスのＢａｌｂ／ｃマウスから収得し、ＩＬ−３（Ｓｉｇｍａ社 Ｉ４１４４、２ｎｇ／ｍＬ）と共に１０％牛胎仔血清を含有する５０％富栄養培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ、２ｍｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、０．２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ）(Murakami M らの論文, J. Bio. Chem., 39, pp 22653-22656, 1995)中で４週まで培養した。培養の３週後、トルイジンブルーを用いた染色方法により、調査した細胞において、９８％よりも高頻度にＢＭＭＣが見出された。
【００３４】
ＢＭＭＣを１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で富栄養培地に懸濁し、しかる後、３７℃で３０分間ＤＭＳＯ（最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％より低い）に試料と共に又は試料なしで湿っぽい５％ＣＯ２培養器にてインキュベートした。幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｓｉｇｍａ社、Ｓ９９１５、１００ｎｇ／ｍＬ）で２０分間刺激した後、上清液におけるＬＴＣ４放出を、製造社の指示に従い、酵素免疫アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、米国）で測定した。
全ての実験は３回反復で実施し、ＬＴＣ４放出の阻害は、対照群からＬＴＣ４放出の減少百分率（％）を計算することにより測定した(Lee SH らの論文, Biol. Pharm. Bull., 27, pp786-788, 2004)。
【００３５】
（実験例４）ＬＴＣ４放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
実施例３で記述したように、システイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotriene) 放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の阻害効果は、ＬＴＣ４−モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡ法を使用するＢＭＭＢで測定した。
チアレリン酸のＩＣ５０は、５−リポキシゲナーゼ阻害剤として知られているジレウトン(zileuton)よりは低いが、著しかった（表２を参照されたい）。
【表２】
【００３６】
（実験例５）気道過敏（ＡＨＲ）におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
最終エアロゾル誘発の２４時間後、身体全体のプレチスモグフィー（plethysmography)（ＯＣＰ３０００；Ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）(Hamelmann E らの論文, Am J Respir Crit Care Med., 156, pp 766-775, 1997)を用いてＡＨＲを測定した。各々のマウスを、ブロメトリックプレチスモグラフィーチャンバ（bronmetric phlethysmographic chamber)に置き、エアロゾイル化ＰＢＳの後、エアゾロイル化メタコリン（１２．５、２５及び５０ｍｇ／ｍＬ）の増加濃度で３分間誘発させた。気管支収縮(bronchoconstriction)を、各濃度で５分間さらに記録した。各試料の最も高いＰｅｎｈ値は、各々のメタコリン誘発中に得られ、対照群（ＰＢＳ）の誘発に対応する基礎Ｐｅｎｈ値の百分率で表現した。
【００３７】
表３に示すように、ＯＶＡ処理群のＰｅｎｈ値は、メタコリン５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ対照群（Ｐ＜０．０５）の場合より著しく高かった。チアレリン酸＋ＯＶＡ誘発群におけるＰｅｎｈ値は、ＯＶＡ処理群（Ｐ＜０．０５）と比較して顕著に減少していた。抗喘息薬として開発されたジレウトン(zileuton)の陽性対照群は、チアレリン酸よりは少ないが、ＡＨＲの減少を示した（図２を参照されたい）。
【表３】
【００３８】
（実験例６）ＯＶＡ−特異的ＩｇＥにおけるチアレリン酸の効果
最終誘発４８時間後、マウスに対してペントバルビタール(pentobarbital)（Ｓｉｇｍａ社 Ｐ３７６１）を過量使用して致死させ、気管切開術を行った。氷冷ＰＢＳ（０．５ｍＬ）を肺に流入した後、導管カニューレ挿入(tracheal cannulation)を介して３回吸入させることにより、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収得した。ＢＡＬＦを遠心分離して、上清液を収集し、使用前に−７０℃で貯蔵した。ＢＡＬＦ内のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の量は、製造社の指示に従い、特異的マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で測定した。該アッセイの検出限界は２５０ｐｇ／ｍＬであった。
【００３９】
気管切開術の後、心臓穿刺(cardiac puncture)によって血漿を得た。マウスＩｇＥ抗体に対する補完的なキャプチャー(capture)及び検出抗体対は、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)を製造社の指示に従い実施した。血漿中の２倍数試料を１：１００に希釈した。各試料における、ＩｇＥレベルを、４５０ｎｍでの光学密度読み込みで測定し、ＯＶＡ−特異的ＩｇＥ濃度を、組み換えＩｇＥ（５〜２，０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した場合に作成した標準曲線から計算した。
表４に示すように、チアレリン酸処理マウスのＩｇＥレベルは著しく減少し、かつジレウトンはチアレリン酸と同様の抑制効果を示した。
【００４０】
【表４】
【００４１】
（実験例７）サイトカインレベルにおけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
ＯＶＡで誘発した喘息マウスでのサイトカイン放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果を確認するために、最終誘発４８時間後、ＢＡＬＦ中のサイトカインレベル（ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３）をＥＬＩＳＡ法で測定した。
表５に示すように、チアレリン酸処理群において、サイトカインは著しく抑制された；ＯＶＡ誘導群よりも、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３においてそれぞれ９０．５±４．０％、５４．６±２３．０％、及び４３．７±２８．２％さらに減少した（Ｐ＜０．０５）。チアレリン酸よりはずっと少なかったが、ジレウトンも対照群より減少した活性が示された。これらの結果は、チアレリン酸が、喘息モデルのＢＡＬＦ中のＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３の濃度を著しく減少させたことを示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
（実験例８）肺組織のＯＶＡ誘導性の炎症におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
肺組織を１０％中性バッファ化されたホルマリン溶液に２４時間固定した。パラフィンに包埋した後、該組成をスライスして厚さ４μｍの切片を作成し、Ｈ＆Ｅ溶液(ヘマトキシリン；Ｓｉｇｍａ社 ＭＨＳ−１６及びエオシン、Ｓｉｇｍａ社 ＨＴ１１０−１−３２）で染色した。その後、染色された組織をマウントし、ダコ−マウンティングメディウム(Dako-mounting medium)（Dakocytomation；Ｄｅｎｍａｒｋ Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ ＣＡ）でカバースリップを覆った。気道における細胞浸潤の度合いは、２つの独立的調査(Myou S らの論文, J. Exp. Med., 198, pp1573-1582, 2003)によって実施されるダブルブラインドテスト(double-blind test)で点数化した。抹消細気管支(peri-bronchiole)及び抹消血管の炎症は、特定の基準すなわち、０〜３の点数によって評価した：０，細胞なし；１，若干の細胞；２，１〜５細胞層深のリング；３，５細胞層深よりも深いリング。白血球浸潤(leukocyte infiltration)におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を評価するために、炎症の度合いを、最終誘発４８時間後に肺組織において定量的分析で点数化した（図２を参照されたい）。
図１に示すように、チアレリン酸は、ＯＶＡ誘導マウスの肺組織炎症において最も強力な抑制効果を示し、次にズダヤクシュ抽出物及びジレウトンであった。肺組織のＨ＆Ｅ染色において、ＯＶＡ処理マウス内の白血球は、正常マウス由来の抹消細気管支及び抹消血管結合組織に大量浸潤した。ズダヤクシュ抽出物又はチアレリン酸処理されたマウスにおいて、好中球リッチ白血球の浸潤は、ＯＶＡ処理マウスと比較して著しく弱化した。
【００４４】
（実験例９）カラギナン(carageenan)誘導マウスの足部浮腫におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
ＩＣＲマウスの浮腫形成において、上記実施例から調製したズダヤクシュ及びチアレリン酸の抑制活性は次のように決定された。
マウスは、各群当り６個体からなる３グループに分けた。すなわち、それぞれ、Ｔ１は陰性対照群として溶媒のみで処理されたグループ、Ｔ２はズダヤクシュ抽出物５０ｍｇ／ｋｇで処理されたグループ、Ｔ３はアスピリン５０ｍｇ／ｋｇで処理されたグループである。処理１時間後、１％カラギナン溶液をマウスの足首内に注入して浮腫を誘導し、Ｖｅｒｎｉｅｒ’ｓ ｃａｌｉｐｅｒで足首の厚さを測定し、浮腫の度合いを測定した。測定された厚さを下記の数式１で計算した。
【数１】
【００４５】
表６に示すように、浮腫は、処理後最大４時間目に最大値に至った。したがって、ズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸は、マウス足浮腫の強力な阻害効果を示したことが確認された。
【表６】
以下、製造方法及び賦形剤の種類について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製造例は次の通りである。
【００４６】
注射剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム(Sodium metabisulfite)３．０ｍｇ
メチルパラベン ０．８ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
注射用蒸留水 適量
注射剤の製造は、活性成分を溶解させ、約７．５にｐＨを調節した後、全成分を２ｍＬのアンプルに充填し、通常の注射剤製造方法に従って滅菌することにより行われた。
【００４７】
粉末剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 ５００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
粉末剤の製造は、上記の成分を混合してシールパッケージに充填することにより実施した。
【００４８】
錠剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 ２００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
錠剤の製造は、上記の成分を混合し、打錠することにより実施した。
【００４９】
カプセル剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １００ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 ５０ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
錠剤の製造は、上記の成分を混合し、通常のゼラチン製造方法によってゼラチンカプセルに充填することにより実施した。
【００５０】
液剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
糖 ２０ｇ
多糖類 ２０ｇ
レモン香料(Lemon flavor) ２０ｇ
液剤の製造は、活性成分を溶解させた後、全成分を１０００ｍＬのアンプルに充填し、通常の液剤製造方法に従って滅菌することにより実施した。
【００５１】
健康食品の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｍｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物は様々に変化させることができる。このような多様性は本発明の領域及び思想から逸脱しているものとみなすべきではない。
【００５２】
健康飲料の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水 ９００ｍＬ
健康飲料の製造は、活性成分を溶解させ、混合し、８５℃で１時間攪拌し、ろ過して全ての構成成分を１０００ｍＬのアンプルに充填し、通常の健康飲料製造方法に従って滅菌することにより実施した。
上述した本発明は様々な方法で変化できることは明らかである。このような多様性は本発明の思想又は領域から逸脱しているとみなされるべきではなく、当業者に自明な全ての変形は請求の範囲の領域に含まれることを意図する。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
上述したように、本発明において、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸は、インビトロにおけるＬＴＣ４分泌に対するチアレリン酸の抑制効果を示し、ＩｇＥレベルの抑制効果及びサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）産生の抑制効果、気道過敏性の抑制効果、並びにＯＶＡ誘導性喘息マウスにおける白血球浸潤の抑制効果を示す。したがって、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の治療及び予防のための治療剤又は機能性健康食品として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本発明の上記及び他の目的、特性及びその他の利点は、添付図面との関連で取り込まれる以下の詳細記載からより明確に理解されるであろう；
【図１】図１は、気管支肺胞の組織学的検査に使用された肺組織細胞におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果を示す（Ａ：正常対照群マウス、Ｂ：ＰＢＳ処理マウス、Ｃ：ズダヤクシュ抽出物処理マウス、Ｄ：チアレリン酸処理マウス）。
【図２】図２は、肺組織でのＯＶＡ誘導性炎症におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性の活性を有するズダヤクシュ(Tiarella Polyphylla)抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸(tiarellic acid)を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息(asthma)とは、気道に発生する複合症候群であって、例えば気道障害、急性又は慢性炎症、気道過敏性(airway hyper-responsiveness)（ＡＨＲ）及び構造的リモデリング(Kumar R. K.の論文 Pharmacol. Ther., 91, pp 93-104, 2001)などの多様な疾患が現れる。
気道に発生するアレルギー性炎症は、喘息発達に重要な役割を果たすものと報告されており、アレルギー性喘息に苦しむ患者の数は、最近、世界人口の約１０％まで増加した。その数は米国において１７００万名に達し、アレルギー性喘息治療剤の米国市場の規模は現在まで約６４００億米ドルであると報告されている。
【０００３】
喘息は、２つの型、すなわち外因性喘息と内因性喘息に分けられる。主要抗原としてのイエホコリダニ（デルマトファゴイド類（Dermatophagoides））、花粉、動物の上皮、カビなどの抗原への曝露により引き起こされる外因性喘息は、該抗原に対する皮膚試験又は気管支誘発試験において陽性反応を示し、かつ一般的には若者において発生する。上気道感染、運動、情緒不安、寒冷気候及び湿度の変化などにより引き起こされる内因性喘息は、成人患者に起こる。
【０００４】
病態生理学的な側面によると、喘息は、以下の過程によって起こる慢性的炎症として認識されている；Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ２免疫細胞で再生産されるサイトカインによって炎症細胞が増殖、分化及び活性化され、気道又は気道周辺組織に移動する。好中球(neutrophil)や肥満細胞(mast cell)などの活性化された炎症細胞は、サイトカイン、ケモカイン、シグナル分子、接着分子及び成長因子などの多様な炎症媒介因子を放出し、気道中の構造細胞は喘息の多様な段階に関与する(Elias JA らの論文, J Clin Invest., 111, pp 291-7, 2003)。ノックアウトマウスモデルを用いた多数の研究及び臨床的研究において、喘息における決定的所見は、例えば免疫反応、好中球増加症(eosinophilia)、ＡＨＲ及び構造的リモデリングなどの幾つかの特徴的パラメータに落とし込むことができた（Moffatt JD.の論文, Pharmacol Ther. 107, pp 343-57, 2005; Spina D らの論文, Trends Pharmacol Sci, 23, pp 311-5, 2002)。各々のパラメータは、互いに直接関連していないようであるが、ＩｇＥ介在性免疫反応及び好中球増加症はアレルギー性喘息の気道における重要な症状であり(Bochner B.S. らの論文, Annu. Rev. Immunol., 12, pp 295-335, 1994; Bousquet H らの論文 N. Med. 323, pp 1033-9, 1990)、アレルギー過程で産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３などのサイトカインもＡＨＲの進行及び気道リモデリングに重要な役割を果たす(Riffo-Vasquez Y らの論文, Pharmacol. Ther., 94, pp 185-211, 2002)。実際、喘息は組織化された炎症の結果であり、その多くは喘息の気道に作用する特異的阻害剤に関連し、例えばヒスタミンＨ１拮抗剤、トロンボキサン拮抗剤、血小板活性化因子拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、窒素モノオキシゲナーゼ阻害剤、及びプロスタグランジン阻害剤が臨床試験に試みられたが、失敗した(Moffatt J.D.の論文, Pharmacol. Ther., 107, pp 343-57, 2005)。反面、サイトカイン合成及びサイトカイン介在性免疫細胞生存の広範囲な阻害によって炎症細胞の先駆レベルを基準にまで抑制するグルココルチコイドは、現在まで３０年の期間にわたって喘息患者の症状を管理するのに用いられてきた(Baatjes A. J. らの論文, Pharmacol, Ther., 95, pp 63-72, 2002)。これらの報告は、喘息管理のための治療学的アプローチは、喘息過程の特定経路の強力な阻害剤の検索よりもむしろ、喘息的パラメータの均衡を回復することに焦点を合わせるべきであるということを示唆している。
【０００５】
ズダヤクシュ(Tiarella Polyphylla)D.Don（ユキノシタ科(Saxifragaceae)）は、韓国において、ズダヤクシュ属に属する単一種である。ズダヤクシュD.Donは中国の南西部に自生しているが、韓国においては鬱陵島の山頂でのみ自生している。以前に、コロソリン酸(corosolic acid)、トルメンチン酸(tormentic acid)などと共にチアレリン酸(tiarellic acid)が単離されており(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)、及び他のグループは、紫外線を照射した線維芽細胞におけるＭＭＰ−１及び１型プロコラーゲンの発現における阻害的効果を報告した (Moon らの論文, J Ethnopharmacol., 98, pp 185-189, 2005)。
【０００６】
しかしながら、引用により本明細書に組み込まれる上記文献の全てにおいて、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸の抗炎症性、抗アレルギー性及び抗喘息性における抑制的効果については、報告又は開示されていない。
したがって、本発明者らは、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸が、インビトロにおけるＬＴＣ４放出に対するチアレリンの酸抑制効果、並びにＩｇＥレベル及びサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）産生、気道過敏性、及び喘息の管理に寄与するものと予想されるＯＶＡ誘導型喘息マウスにおける白血球浸潤における抑制的効果を示すことを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（技術的課題）
したがって、今日までに、毒性がなく、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療並びに予防するためのより有効な薬剤を発見する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（技術的解決）
したがって、本発明の目的は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分としてズダヤクシュ粗抽出物又はズダヤクシュの有機溶媒可溶性抽出物を含有する組成物を提供することにある。
本明細書に記載の用語「粗抽出物」は、水、例えばメタノール、エタノールなどのＣ１〜Ｃ４低級アルコール、好ましくはメタノール及びその類似体、又はそれらの混合物などを用いて植物材料を抽出することにより製造される抽出物を含む。
本明細書に記載の用語「有機溶媒可溶性抽出物」は、上述した粗抽出物を、有機溶媒、例えばブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン又はヘキサン、好ましくはブタノールで抽出することにより製造できる。
【０００９】
本発明は、下記化学式１で表される、ズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物から単離されたチアレリン酸を含有する医薬組成物、又は炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防及び治療のための有効量を活性成分とするその医薬として許容し得る塩を提供する。
【化１】
【００１０】
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための薬剤の製造のためのズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物、若しくはそれから単離されたチアレリン酸の使用を提供する。
本発明の別の様態において、哺乳類における炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための方法を提供する。該方法は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患に苦しむ哺乳類にズダヤクシュ粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物又はこれから単離されたチアレリン酸の治療学有効量を投与することを含む。
ズダヤクシュから単離された発明的抽出物及びそれから単離されたチアレリン酸は、以下の好適な実施態様によって製造できる。
【発明の効果】
【００１１】
（有利な効果）
本発明は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための有効量での活性成分としてズダヤクシュ抽出物又はそれから単離したチアレリン酸を含む、医薬組成物及び健康食品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に記述する。
本発明に関して、例えば、乾燥させたズダヤクシュの植物体全体を小片に切り、該小片を、２〜２０倍容量、好ましくは５〜１０倍容量の極性溶媒、例えば水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール例えばメタノール、エタノール、ブタノールなど、又はそれらの混合物、好ましくはメタノール、と共に混合し；及び、熱水を用いる還流抽出、冷水抽出、超音波抽出、又は従来型の抽出、好ましくは冷水抽出によって、２０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃にて、１０〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間にわたり加熱し；残渣は濾過を濾過し、その後それらの極性溶媒可溶抽出物を収得するために該濾過物を乾燥させた。
上記ステップによって製造された上記粗抽出物を、水に懸濁した後、前記懸濁液を、約１〜１００倍、好ましくは１〜５倍の体積の有機溶媒ブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン又はヘキサン、好ましくはブタノールと混合し、本発明の有機溶媒可溶抽出物を収得する。
【００１３】
前記有機溶媒可溶抽出物をさらに、シリカゲルで充填されたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ、８．５×６５ｃｍ）に供し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（酢酸エチル１０〜２０％、段階勾配）及びクロロホルム：メタノール（メタノール０〜１００％、段階勾配）の混合溶媒で溶出して、９つの画分を得る。該画分のうち６番目の画分は、順相シリカゲルカラム(シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール５〜５０％段階勾配)を用いてさらに再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、本発明のチアレリン酸を収得する。ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）、ＥＩ−ＭＳ、及び以前に報告された旋光度(optical rotation)によって構造が確認された(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)。純度は、ＨＰＬＣシステム（Shimadzu社 SCL-1OA搭載SPD-M 1OA vp PDA検出器, カラム; Phenomenex Synergi 4 um Fusion RP-80, 4.6x50 mm, 溶出: ACN/0.1% TFA含有DW, 4/1, v/v).）によって９９．５％より高いと分析された。
【００１４】
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患のを予防及び治療するための活性成分として前述した製造方法によって単離されたズダヤクシュの粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又はチアレリン酸を含有する、医薬組成物を提供する。
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防する薬剤を生産するための前述した製造方法による、ズダヤクシュ粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又はチアレリン酸の使用を提供する。
本発明の別の態様に従って、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するための方法も提供し、該方法は、前述した製造方法で製造されたズダヤクシュ粗抽出物及び有機溶媒可溶抽出物、又は単離されたチアレリン酸を含有する治療的有効量の投与を含む。
【００１５】
化学式（Ｉ）で表される発明的化合物は、当業界に周知の従来法によって、医薬として許容し得る塩及び溶媒和物に変形できる。塩に関して、医薬として許容し得るその遊離酸によって形成されるその酸付加塩は、有用であり、かつ従来法で製造できる。例えば、酸溶液の過剰量に化合物を溶解させた後、該塩を、メタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒で沈殿させてその酸付加塩を調製し、さらに化合物と、水又はアルコール例えばグリコールモノメチルエーテルで希釈した酸との等量混合物を加熱し、その次に蒸発により乾燥させるか又は減圧下で濾過して、その乾燥塩形態を得ることができる。
【００１６】
上記方法の遊離酸として、有機酸又は無機酸が使用できる。例えば、 有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などを本明細書で使用することができ、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などを本明細書で使用することができる。
【００１７】
さらに、塩基を用いることにより、発明的化合物の医薬として許容し得る金属塩を製造することができる。そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、従来法で製造できるが、例えば化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させた後、不溶性塩を濾過し、フィルターに残った物質を蒸発させ、その金属塩を収得する。本発明の金属塩としては、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩が医薬的に適し、また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を適切な銀塩（例えば硝酸銀）と反応させて調整することができる。
【００１８】
前記化合物の医薬として許容し得る塩は、本明細書に特に示さない場合、該化合物に存在し得る全ての酸性又は塩基性の塩を含む。例えば、本発明の医薬として許容し得る塩は、例えばそのナトリウム、カルシウム及びカリウム塩などのヒドロキシル基の塩；及び例えば臭化水素塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、及びｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）などのアミノ基の塩を含み、これらは当業界で知られている従来法によって製造できる。
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を予防及び治療するための発明的組成物は、前記抽出物又は該組成物の総重量に基づく重量の０．１〜５０％の化合物を含んでよい。
【００１９】
本発明による組成物は、医薬として許容し得るキャリア、アジュバント、又は 希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含有する医薬組成物として提供できる。該製剤は、充填剤、抗アグルチナート化剤（anti-agglutinating agent）、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存料などを追加的に含んでよい。本発明の組成物は、当業界で周知の任意の手順を使用することによる患者への該組成物の投与後、該活性成分が即時放出、持続放出又は遅延放出されるように製剤してもよい。
【００２０】
例えば、本発明の組成物は、注射剤の生産に一般的に使用される、オイル、プロピレングリコール又は他の溶媒に溶解できる。キャリアの適切な例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル、ミリスチン酸イソプロピルなどを含むが、これらに限定されない。局所投与のために、本発明の抽出物は軟膏又はクリームの形で製造できる。
【００２１】
本発明の組成物を含む医薬製剤は、経口剤形（粉末剤、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、液状薬、シロップ、エリキシル丸薬、粉末剤、サシェ(sachet)、顆粒剤）、又は局所用製剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム(balm)、パッチ(patch)、ペースト、スプレー溶液、エアロゾルなど）、又は注射用製剤（溶液、懸濁液、エマルジョン）などのいずれの形態でも製造できる。
医薬剤形における、本発明の組成物は、これらの医薬として許容し得る塩の形態で使用してもよく、単独で又は適切な集合形態で、並びに他の薬学的活性化合物との組み合わせで使用してもよい。
【００２２】
本発明の抽出物又は化合物の好ましい投与量は、投与対象の状態及び体重、重症度、薬物形態、投与経路及び期間などによって異なるが、当業者により選択され得る。しかしながら、所望の効果を得るためには、一般的に、本発明の発明的抽出物は重量／日として０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与することを推奨する。該用量を、１日に１回又は数回に分けて投与してもよい。
本発明の医薬組成物は、多様な経路を介して哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒトなど）などの対象動物に投与できる。投与の全ての様式が考慮されるが、投与は例えば経口、直腸を介して、又は静脈、筋肉、皮下、皮内、くも膜下、硬膜外、又は脳室内注射によって行われることが可能である。
【００２３】
本発明の他の目的は、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防、及び緩和のための食品学的に許容される添加物と共に、ズダヤクシュ抽出物又はこれから単離された化合物を含む機能性健康食品を提供することにある。
機能性健康食品の開発のために、本発明の上記抽出物又は化合物を含む添加食品の例は、多様な食品、飲料、ガムである。ビタミン複合体、健康増進食品及びこれと類似のものは、粉末剤、顆粒剤、錠剤、チューイン錠剤、カプセル剤又は飲料などとして使用できる。
上述した組成物は、食品、添加剤又は飲料に添加できる。ここで、食品又は飲料中の上記抽出物又は化合物の量は、一般に、健康食品組成物の食品総重量の約０．０１〜８０重量／重量％、好ましくは０．０１〜１５重量／重量％の範囲であり、並びに健康飲料組成物１００ｍＬ当りの割合で０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇである。
【００２４】
本発明の健康飲料組成物が上記抽出物又は化合物を重要構成成分として提示割合で含んでいる場合を条件として、他の液体成分の特別な制限はなく、ここで、他の構成成分は、通常の飲料のように様々な防臭剤(deodorant)又は天然炭水化物などを意味する。上述した天然炭水化物の例としては、例えばグルコース、果糖などの単糖類；例えばマルトース、スクロースなどの二糖類；例えばデキストリン、シクロテキストリンなどの通常の糖；及び例えばキシリトール、エリトリトール(erythritol)などの糖アルコール；などがある。上述したもの以外の防臭剤として、天然防臭剤（タウマチン(taumatin)）、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシド(levaudioside)Ａ、グリシルヒジン(glycyrrhizin)など）及び合成防臭剤（例えばサッカリン、アスパルテームなど）を有用に使用することができる。前記天然炭水化物の量は、本飲料組成物１００□当り一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇの範囲である。
【００２５】
前述した組成物とは異なる構成成分は、多様な栄養成分、ビタミン、鉱物又は電解質、合成香料、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなどの場合）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド粘着剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭化剤などがある。これらの構成成分とは異なる構成成分は、天然果物ジュースを製造するための果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料であってよく、ここで、該構成成分は、独立に又は組み合わせて使用することができる。構成成分の割合は、あまり重要ではないが、一般的には１００重量／重量％の本組成物当り０〜約２０重量／重量％程度の範囲である。上述した抽出物を含む添加食品の例は、様々な食物、飲料、ガム、ビタミン複合体、健康増進食品及びこれと類似のものがある。
本発明の発明的抽出物は、毒性及び副作用がないので、安全に使用できる。
本発明は、以下の実施例にさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、 本発明はこれらの実施例によって限定されないことは理解されるべきである。
【００２６】
(本発明を実施するための最良の様式)
本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び製造において多様な改良及び変化を加え得ることは、当業者には自明なことである。
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。
（本発明の様式）
本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明される。しかし、いかなる場合においても、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００２７】
以下の参考例、実施例及び実験例は、その範囲を限定するものではなく、本発明をさらに詳しく説明することを意図する。
（実施例１）ズダヤクシュ粗抽出物の製造
２００３年８月韓国、鬱陵島でズダヤクシュを収集し、その標本（ＰＥＢ ３０６８）は、韓国、大田にあるＫＲＩＢＢ(Korea Reseach Institute of Bioscience and Biotechnology)の植物抽出物バンクに寄託された。
乾燥したズダヤクシュ１．１ｋｇを粉末化し、５Ｌのメタノールと混合し、この混合物を室温で２４時間攪拌し、３回にわたって冷浸抽出を行った。抽出物は、ろ紙で濾して残渣を除去した。ろ液を収集し、減圧下で回転蒸発装置によって５５〜６５℃で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥させて、１００．５ｇの乾燥したズダヤクシュ粗抽出物を収得した。
【００２８】
（実施例２）ブタノール可溶性画分製造
蒸留水１Ｌを、実施例１で収得した粗抽出物１００．５ｇに添加した。分液漏斗にて、該混合物にブタノール１Ｌを加えてはげしく混合し、ブタノール溶解層と水溶解層に分離した。
前記ブタノール溶解層を、回転蒸発装置で濃縮し、凍結乾燥機で乾燥させてブタノール可溶抽出物を得、最終的に、次の実験に試料として使用する、ブタノール可溶抽出物８０．０ｇ及び水可溶性抽出物を収得した。
【００２９】
（実施例３）ズダヤクシュ抽出物からのチアレリン酸の製造
乾燥したズダヤクシュ３．２９ｋｇは、室温にて２回メタノール（１０Ｌ）抽出し、３５２ｇの抽出物を得た。この抽出物を水１Ｌに懸濁し、同量のｎ−ヘキサンで分画した。ｎ−ヘキサン可溶画分６５．１ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ、８．５×６５ｃｍ）に供し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル混合物（酢酸エチル１０〜２０％、段階勾配）、及びクロロホルム−メタノール混合物（メタノール０〜１００％、段階勾配）で溶出させ、成功的に、９つの画分を得た（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．９）。Ｆｒ．６の７．４ｇ（クロロホルム−メタノール９／１〜７／３、ｖ／ｖ）を、順相シリカカラム（シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６．０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール５〜５０％段階勾配）を使用するカラムクロマトグラフィーに供し、４００ｍｇのチアレリン酸を収得した。構造は、前述したようにＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）、ＥＩ−ＭＳ及び旋光度で確認し(Park らの論文, Arch Pharm Res., 25, pp 57-60, 2002)、９９．５％より高いの純度であることが、ＨＰＬＣシステム（Shimadzu社 SCL-1OA搭載SPD-M 1OA vp PDA検出器, カラム; Phenomenex Synergi 4 um Fusion RP-80, 4.6x50 mm, 溶出: ACN/0.1% TFA含有DW, 4/1, v/v).）によって分析された。
【００３０】
チアレリン酸
針状 (MeOH);
mp 254-256℃ ;
[a]２３Ｄ +94 (ピリジン, c 0.14);
IR (KBr, cm-1): 3491 (OH), 1689 (CO), 1645 (C=C), 1450, 1388, 1262, 1222, 1044; HRMS m/z 472.3552 (M+, 計算値 C30H48O4: 472.3553);
EIMS (rel. int.) m/z: 472 [M]+ (61), 454 [M-H2O]+ (34), 436 [M-2H2O]+ (62), 424 (42), 396 (26), 205 (75), 187 (71), 175 (87), 173 (100);
13C-NMR (150 MHz, ピリジン-d5): 13.0 (C-24), 17.4 (C-25), 17.5 (C-26), 18.7 (C-6), 18.8 (C-28), 19.4 (C-30), 21.3 (C-11), 25.8 (C-15), 26.7 (C-12), 27.9 (C-2), 30.1 (C-21), 37.7 (C-10), 38.2 (C-7), 38.3 (C-16), 39.2 (C-1), 39.6 (C-13), 40.4 (C-22), 40.8 (C-8), 42.9 (C-4), 43.0 (C-17), 48.1 (C-19), 49.2 (C-5), 51.4 (C-18), 51.6 (C-9), 60.4 (C-14), 68.2 (C-23), 73.6 (C-3), 110.2 (C-29), 150.9 (C-20), 178.3 (C-27).
1H-NMR (600 MHz, ピリジン-d5): 1.05, 1.71 (2H, m, 各々, H-1), 1.82, 1.91 (2H, m, 各々, H-2), 4.02 (1H, dd, J = 4.7, 11.6 Hz, H-3), 1.51 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-5), 1.48, 1.65 (2H, m, 各々, H-6), 1.87, 2.06 (2H, m, 各々, H-7), 2.02 (1H, dd, J = 1.7, 12.7 Hz, H-9), 1.32, 1.64 (2H, m, 各々, H-11), 1.87, 2.60 (2H, m, 各々, H-12), 1.88 (1H, m, H-13), 1.67, 2.28 (2H, m, 各々, H-15), 1.70, 1.78 (2H, m, 各々, H-16), 1.81 (1H, m, H-18), 2.60 (1H, m, H-19), 1.36, 1.97 (2H, m, 各々, H-21), 1.16, 1.40 (2H, m, 各々, H-22), 3.57, 4.07 (2H, d, J=10.4, 各々, H-23), 1.04 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-25), 1.21 (3H, s, H-26), 0.90 (1H, s, H-28). 4.76, 4.96 (2H, s, 各々, H-29), 1.86 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-30)．
【００３１】
（実験例１）動物感作及び気道感作
マウス群（ｎ＝５〜６）で実験した；以下の処理を行った：
（１）リン酸−緩衝生理液（ＰＢＳ；ｉｐＮｅｂ）を用いたシャム感作(sham-sensitization)及び誘発；（２）ＯＶＡ（卵白アルブミン：Ｓｉｇｍａ社 Ａ５５０３；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（ｉｂＮｅｂ）を用いた感作及び誘発；（３）ＯＶＡ（ｉｐ）を用いた感作、並びにＯＶＡ（Ｎｅｂ）及び試料（チアレリン酸又はジレウトン(zileuton)、ｐｏ）を用いた誘発。手短にいうと、2mgの水酸化アルミニウムを用いて100μlのPBS緩衝液（pH 7.4）中に乳化させた20μgのOVAを、0日目及び11日目に腹膜注射することにより、マウスを感作させた。最初の感作後の１９、２０、２１及び２５日目に、超音波噴霧器（ＮＥ−Ｕ１２；Ｏｍｒｏｎ社、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して２０分間、ＯＶＡ（ＰＢＳ中１％）を用いて、気道でマウスを誘発させた。最後の誘発（２７日目）の４８時間後にマウスを犠牲にし、アレルギー性喘息の気道上におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を測定した。
【００３２】
（実験例２）ＭＴＴアッセイ
ズダヤクシュの発明的抽出物及びそれから単離されたチアレリン酸の細胞毒性活性を調べるために、ＭＴＴ((3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイ法を、次の手順で実施した(Wang Z らの論文, Biol., Pharm. Bull., 24, pp 159-162, 2001)。
前骨髄ＨＬ−６０細胞（ＨＬ−１８１０３、５×１０５細胞／ｍＬ）を、ＮＧＦ欠乏条件の下で９６ウェルプレートに播いた。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＤＭＳＯ１０μＬとＭＴＴ溶液１０μＬ（５／ｍＬ）に溶解された試料の混合物で処理し、同様の条件下で４時間インキュベートした。４時間後、ＭＴＴを除去し、ＤＭＳＯ１００μＬを各ウェルに滴下して、結晶を溶解させた。ＵＶ吸収を、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、米国）で５７０ｎｍにて測定し、細胞生存率を計算した。
表１に示すように、本発明の発明的抽出物又は化合物は、細胞毒性を示さないことを確認した。
【表１】
【００３３】
（実験例３）骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）の調整及び活性化
ＢＭＭＣを、オスのＢａｌｂ／ｃマウスから収得し、ＩＬ−３（Ｓｉｇｍａ社 Ｉ４１４４、２ｎｇ／ｍＬ）と共に１０％牛胎仔血清を含有する５０％富栄養培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファ、２ｍｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム、１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、０．２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ）(Murakami M らの論文, J. Bio. Chem., 39, pp 22653-22656, 1995)中で４週まで培養した。培養の３週後、トルイジンブルーを用いた染色方法により、調査した細胞において、９８％よりも高頻度にＢＭＭＣが見出された。
【００３４】
ＢＭＭＣを１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で富栄養培地に懸濁し、しかる後、３７℃で３０分間ＤＭＳＯ（最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％より低い）に試料と共に又は試料なしで湿っぽい５％ＣＯ２培養器にてインキュベートした。幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｓｉｇｍａ社、Ｓ９９１５、１００ｎｇ／ｍＬ）で２０分間刺激した後、上清液におけるＬＴＣ４放出を、製造社の指示に従い、酵素免疫アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、米国）で測定した。
全ての実験は３回反復で実施し、ＬＴＣ４放出の阻害は、対照群からＬＴＣ４放出の減少百分率（％）を計算することにより測定した(Lee SH らの論文, Biol. Pharm. Bull., 27, pp786-788, 2004)。
【００３５】
（実験例４）ＬＴＣ４放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
実施例３で記述したように、システイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotriene) 放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の阻害効果は、ＬＴＣ４−モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡ法を使用するＢＭＭＢで測定した。
チアレリン酸のＩＣ５０は、５−リポキシゲナーゼ阻害剤として知られているジレウトン(zileuton)よりは低いが、著しかった（表２を参照されたい）。
【表２】
【００３６】
（実験例５）気道過敏（ＡＨＲ）におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
最終エアロゾル誘発の２４時間後、身体全体のプレチスモグフィー（plethysmography)（ＯＣＰ３０００；Ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）(Hamelmann E らの論文, Am J Respir Crit Care Med., 156, pp 766-775, 1997)を用いてＡＨＲを測定した。各々のマウスを、ブロメトリックプレチスモグラフィーチャンバ（bronmetric phlethysmographic chamber)に置き、エアロゾイル化ＰＢＳの後、エアゾロイル化メタコリン（１２．５、２５及び５０ｍｇ／ｍＬ）の増加濃度で３分間誘発させた。気管支収縮(bronchoconstriction)を、各濃度で５分間さらに記録した。各試料の最も高いＰｅｎｈ値は、各々のメタコリン誘発中に得られ、対照群（ＰＢＳ）の誘発に対応する基礎Ｐｅｎｈ値の百分率で表現した。
【００３７】
表３に示すように、ＯＶＡ処理群のＰｅｎｈ値は、メタコリン５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ対照群（Ｐ＜０．０５）の場合より著しく高かった。チアレリン酸＋ＯＶＡ誘発群におけるＰｅｎｈ値は、ＯＶＡ処理群（Ｐ＜０．０５）と比較して顕著に減少していた。抗喘息薬として開発されたジレウトン(zileuton)の陽性対照群は、チアレリン酸よりは少ないが、ＡＨＲの減少を示した（図２を参照されたい）。
【表３】
【００３８】
（実験例６）ＯＶＡ−特異的ＩｇＥにおけるチアレリン酸の効果
最終誘発４８時間後、マウスに対してペントバルビタール(pentobarbital)（Ｓｉｇｍａ社 Ｐ３７６１）を過量使用して致死させ、気管切開術を行った。氷冷ＰＢＳ（０．５ｍＬ）を肺に流入した後、導管カニューレ挿入(tracheal cannulation)を介して３回吸入させることにより、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収得した。ＢＡＬＦを遠心分離して、上清液を収集し、使用前に−７０℃で貯蔵した。ＢＡＬＦ内のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の量は、製造社の指示に従い、特異的マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で測定した。該アッセイの検出限界は２５０ｐｇ／ｍＬであった。
【００３９】
気管切開術の後、心臓穿刺(cardiac puncture)によって血漿を得た。マウスＩｇＥ抗体に対する補完的なキャプチャー(capture)及び検出抗体対は、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)を製造社の指示に従い実施した。血漿中の２倍数試料を１：１００に希釈した。各試料における、ＩｇＥレベルを、４５０ｎｍでの光学密度読み込みで測定し、ＯＶＡ−特異的ＩｇＥ濃度を、組み換えＩｇＥ（５〜２，０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した場合に作成した標準曲線から計算した。
表４に示すように、チアレリン酸処理マウスのＩｇＥレベルは著しく減少し、かつジレウトンはチアレリン酸と同様の抑制効果を示した。
【００４０】
【表４】
【００４１】
（実験例７）サイトカインレベルにおけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
ＯＶＡで誘発した喘息マウスでのサイトカイン放出におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果を確認するために、最終誘発４８時間後、ＢＡＬＦ中のサイトカインレベル（ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３）をＥＬＩＳＡ法で測定した。
表５に示すように、チアレリン酸処理群において、サイトカインは著しく抑制された；ＯＶＡ誘導群よりも、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３においてそれぞれ９０．５±４．０％、５４．６±２３．０％、及び４３．７±２８．２％さらに減少した（Ｐ＜０．０５）。チアレリン酸よりはずっと少なかったが、ジレウトンも対照群より減少した活性が示された。これらの結果は、チアレリン酸が、喘息モデルのＢＡＬＦ中のＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３の濃度を著しく減少させたことを示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
（実験例８）肺組織のＯＶＡ誘導性の炎症におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
肺組織を１０％中性バッファ化されたホルマリン溶液に２４時間固定した。パラフィンに包埋した後、該組成をスライスして厚さ４μｍの切片を作成し、Ｈ＆Ｅ溶液(ヘマトキシリン；Ｓｉｇｍａ社 ＭＨＳ−１６及びエオシン、Ｓｉｇｍａ社 ＨＴ１１０−１−３２）で染色した。その後、染色された組織をマウントし、ダコ−マウンティングメディウム(Dako-mounting medium)（Dakocytomation；Ｄｅｎｍａｒｋ Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ ＣＡ）でカバースリップを覆った。気道における細胞浸潤の度合いは、２つの独立的調査(Myou S らの論文, J. Exp. Med., 198, pp1573-1582, 2003)によって実施されるダブルブラインドテスト(double-blind test)で点数化した。抹消細気管支(peri-bronchiole)及び抹消血管の炎症は、特定の基準すなわち、０〜３の点数によって評価した：０，細胞なし；１，若干の細胞；２，１〜５細胞層深のリング；３，５細胞層深よりも深いリング。白血球浸潤(leukocyte infiltration)におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を評価するために、炎症の度合いを、最終誘発４８時間後に肺組織において定量的分析で点数化した（図２を参照されたい）。
図１に示すように、チアレリン酸は、ＯＶＡ誘導マウスの肺組織炎症において最も強力な抑制効果を示し、次にズダヤクシュ抽出物及びジレウトンであった。肺組織のＨ＆Ｅ染色において、ＯＶＡ処理マウス内の白血球は、正常マウス由来の抹消細気管支及び抹消血管結合組織に大量浸潤した。ズダヤクシュ抽出物又はチアレリン酸処理されたマウスにおいて、好中球リッチ白血球の浸潤は、ＯＶＡ処理マウスと比較して著しく弱化した。
【００４４】
（実験例９）カラギナン(carageenan)誘導マウスの足部浮腫におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果
ＩＣＲマウスの浮腫形成において、上記実施例から調製したズダヤクシュ及びチアレリン酸の抑制活性は次のように決定された。
マウスは、各群当り６個体からなる３グループに分けた。すなわち、それぞれ、Ｔ１は陰性対照群として溶媒のみで処理されたグループ、Ｔ２はズダヤクシュ抽出物５０ｍｇ／ｋｇで処理されたグループ、Ｔ３はアスピリン５０ｍｇ／ｋｇで処理されたグループである。処理１時間後、１％カラギナン溶液をマウスの足首内に注入して浮腫を誘導し、Ｖｅｒｎｉｅｒ’ｓ ｃａｌｉｐｅｒで足首の厚さを測定し、浮腫の度合いを測定した。測定された厚さを下記の数式１で計算した。
【数１】
【００４５】
表６に示すように、浮腫は、処理後最大４時間目に最大値に至った。したがって、ズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸は、マウス足浮腫の強力な阻害効果を示したことが確認された。
【表６】
以下、製造方法及び賦形剤の種類について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製造例は次の通りである。
【００４６】
注射剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム(Sodium metabisulfite)３．０ｍｇ
メチルパラベン ０．８ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
注射用蒸留水 適量
注射剤の製造は、活性成分を溶解させ、約７．５にｐＨを調節した後、全成分を２ｍＬのアンプルに充填し、通常の注射剤製造方法に従って滅菌することにより行われた。
【００４７】
粉末剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 ５００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
粉末剤の製造は、上記の成分を混合してシールパッケージに充填することにより実施した。
【００４８】
錠剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 ２００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
錠剤の製造は、上記の成分を混合し、打錠することにより実施した。
【００４９】
カプセル剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １００ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 ５０ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
錠剤の製造は、上記の成分を混合し、通常のゼラチン製造方法によってゼラチンカプセルに充填することにより実施した。
【００５０】
液剤の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
糖 ２０ｇ
多糖類 ２０ｇ
レモン香料(Lemon flavor) ２０ｇ
液剤の製造は、活性成分を溶解させた後、全成分を１０００ｍＬのアンプルに充填し、通常の液剤製造方法に従って滅菌することにより実施した。
【００５１】
健康食品の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｍｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｍｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム １５ｍｇ
リン酸二カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物は様々に変化させることができる。このような多様性は本発明の領域及び思想から逸脱しているものとみなすべきではない。
【００５２】
健康飲料の製造
実施例１の乾燥粉末又はチアレリン酸 １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
精製水 ９００ｍＬ
健康飲料の製造は、活性成分を溶解させ、混合し、８５℃で１時間攪拌し、ろ過して全ての構成成分を１０００ｍＬのアンプルに充填し、通常の健康飲料製造方法に従って滅菌することにより実施した。
上述した本発明は様々な方法で変化できることは明らかである。このような多様性は本発明の思想又は領域から逸脱しているとみなされるべきではなく、当業者に自明な全ての変形は請求の範囲の領域に含まれることを意図する。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
上述したように、本発明において、ズダヤクシュ抽出物及びこれから単離されたチアレリン酸は、インビトロにおけるＬＴＣ４分泌に対するチアレリン酸の抑制効果を示し、ＩｇＥレベルの抑制効果及びサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）産生の抑制効果、気道過敏性の抑制効果、並びにＯＶＡ誘導性喘息マウスにおける白血球浸潤の抑制効果を示す。したがって、炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の治療及び予防のための治療剤又は機能性健康食品として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本発明の上記及び他の目的、特性及びその他の利点は、添付図面との関連で取り込まれる以下の詳細記載からより明確に理解されるであろう；
【図１】図１は、気管支肺胞の組織学的検査に使用された肺組織細胞におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の効果を示す（Ａ：正常対照群マウス、Ｂ：ＰＢＳ処理マウス、Ｃ：ズダヤクシュ抽出物処理マウス、Ｄ：チアレリン酸処理マウス）。
【図２】図２は、肺組織でのＯＶＡ誘導性炎症におけるズダヤクシュ抽出物及びチアレリン酸の抑制効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分としてズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物が、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン又はこれらの混合物よりなる群から選ばれた溶媒で抽出される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分として、一般化学式（Ｉ）又はこれらの医薬として許容し得る塩で表されるチアレリン酸を含む、医薬組成物。
【化１】
。
【請求項４】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するために用いられる医薬の製造のための、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物若しくはチアレリン酸の使用。
【請求項５】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患に苦しんでいる哺乳類に、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物若しくはチアレリン酸の治療的有効量を投与する方法を含む、哺乳類の炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の治療又は予防方法。
【請求項６】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防及び改善のために、食品として許容し得る添加剤と共に、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物、若しくはチアレリン酸を含む、機能性健康食品。
【請求項７】
前記健康食品が、丸薬、粉末剤、顆粒剤、錠剤、チューイン錠剤、カプセル剤又は飲料タイプである、請求項６記載の機能性健康食品。
【請求項１】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分としてズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物が、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン又はこれらの混合物よりなる群から選ばれた溶媒で抽出される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療及び予防するための活性成分として、一般化学式（Ｉ）又はこれらの医薬として許容し得る塩で表されるチアレリン酸を含む、医薬組成物。
【化１】
。
【請求項４】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患を治療又は予防するために用いられる医薬の製造のための、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物若しくはチアレリン酸の使用。
【請求項５】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患に苦しんでいる哺乳類に、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物若しくはチアレリン酸の治療的有効量を投与する方法を含む、哺乳類の炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の治療又は予防方法。
【請求項６】
炎症性、アレルギー性及び喘息性の疾患の予防及び改善のために、食品として許容し得る添加剤と共に、請求項３記載のズダヤクシュの粗抽出物又は有機溶媒可溶抽出物、若しくはチアレリン酸を含む、機能性健康食品。
【請求項７】
前記健康食品が、丸薬、粉末剤、顆粒剤、錠剤、チューイン錠剤、カプセル剤又は飲料タイプである、請求項６記載の機能性健康食品。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５０１７８７（Ｐ２００９−５０１７８７Ａ）
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２２６９５（Ｐ２００８−５２２６９５）
【出願日】平成１８年７月１８日（２００６．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２８０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１１１４８
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１８日（２００６．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００２８０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１１１４８
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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