抗癌タンパク質−白金コンジュゲート
本発明は、癌細胞に比較的特異的に結合するポリペプチドにコンジュゲートさせた抗癌白金錯体を含むポリペプチド−白金コンジュゲートを提供する。これにより、コンジュゲートが癌細胞に向けられ、シスプラチン及び他の従来の抗癌白金錯体と比べて抗癌効果が上昇し、副作用が低減される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
シスプラチンは利用可能な最も強力な抗癌化学療法薬であり、とりわけ、精巣、卵巣、膀胱、頭頸部、結腸、及び肺の癌に対して広く使用されている。しかし、シスプラチンは多くの他の化学療法薬よりも副作用がはるかに強く、とりわけ、骨髄抑制、悪心、神経障害、及び腎毒性を引き起こす。より新しい白金系薬物であるカルボプラチン及びオキサリプラチンが開発されたが、これらもシスプラチンと大きく変わらない全身性作用及び副作用プロフィールを有する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチンの構造を以下に示す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
引用した全ての特許文献及びその他の文献を参照により援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Momekov, G. et al., 2005, Novel approaches towards development of non-classical platinum-based antineoplastic agents: design of platinum complexes characterized by an alternative DNA-binding pattern and/or tumor-targeted cytotoxicity. Curr. Med. Chem. 12:2177-2191.
【非特許文献２】Cleare, M.J. et al. 1978. Anti-tumour platinum complexes: relationships between chemical properties and activity. Biochimie 60:835-850.
【非特許文献３】Harrison, R.C. et al. 1980. An efficient route for the preparation of highly soluble platinum(II) antitumour agents. Inorganica Chimica Acta 46:L15-L16.
【非特許文献４】Kidani, Y. et al. 1978. Antitumor activity of 1,2-diaminocyclohexane-platinum complexes against Sarcoma-180 ascites form. J. Med. Chem. 21:1315-1318.
【非特許文献５】Li, Jie Jack, et al. 2007. Modern Organic Synthesis in the Laboratory: a collection of standard experimental procedures. Oxford University Press, Oxford, UK.
【非特許文献６】Wyatt, Paul, and Stuart Warren. 2007. Organic Synthesis: strategy and control. John Wiley, Hoboken, NJ, USA.
【非特許文献７】Tojo, Gabriel. 2006. Oxidation of primary alcohols to carboxylic acids: a guide to common practice. Springer Science and Business Media, Boston, MA, USA.
【非特許文献８】Tojo, Gabriel. 2006. Oxidation of alcohols to aldehydes and ketones: a guide to common practice. Springer Science and Business Media, Boston, MA, USA.
【非特許文献９】Taber, D.F. 2007. Organic synthesis: state of the art 2005-2007. John Wiley, Hoboken, NJ, USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌標的化の向上した新規な化学療法薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タンパク質にコンジュゲートさせることができる新規な白金錯体、タンパク質及びペプチドと白金錯体とのコンジュゲート、コンジュゲートの製造方法、並びにコンジュゲートを用いて癌を処置する方法を提供する。
【０００８】
例えば、化合物１１が提供される。
【０００９】
【化２】
【００１０】
錯体１１は、錯体の配位していないカルボキシル基を介してタンパク質のアミノ基にカップリングすることができる。タンパク質は、好ましくは、白金錯体をより特異的に癌細胞に向けることができるタンパク質であり、例えば癌細胞上にだけ若しくは主に癌細胞上に見られる受容体タンパク質に対する抗体、又はその受容体が癌細胞上で過剰発現されている成長因子である。
【００１１】
したがって、一実施形態では、式Ｉ又はＩＩで表される白金錯体が提供される：
【００１２】
【化３】
【００１３】
式Ｉ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＮＸ２、ＳＨ、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく、
式ＩＩ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン（ｆｏｒｍａｔｅ）、炭酸水素イオン（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＯＯＣ−ＣＯＯ−、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＯＨＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを形成してもよく；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも１つはＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００１４】
別の実施形態は、式ＩＩＩ又はＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートを提供する：
【００１５】
【化４】
【００１６】
式ＩＩＩ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく、
式ＩＶ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＣＯＯ−ＣＯＯ−、カルボキシ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ１１及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；Ｒ９及びＲ１０は一緒に１〜１００原子のリンカー部分を形成してもよく；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００１７】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：上記白金錯体を形成する工程；及び白金錯体をリンカー反応物及びポリペプチドと反応させてポリペプチド−白金コンジュゲートを形成する工程。
【００１８】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：白金錯体を、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【００１９】
【化５】
【００２０】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００２１】
【化６】
【００２２】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程。特定の実施形態におけるポリペプチド−白金は式ＩＩＩ又はＩＶで表されるコンジュゲートである。
【００２３】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：白金錯体を、式ＶＩｂで表されるポリペプチド−リガンドコンジュゲート
【００２４】
【化７】
【００２５】
と反応させて式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００２６】
【化８】
【００２７】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程。好ましくは、式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートは式ＩＩＩ又はＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートである。
【００２８】
別の実施形態は、式Ｘで表されるポリペプチド−白金錯体を提供する：
【００２９】
【化９】
【００３０】
式中、Ｌ１は、Ｐｔのリガンドであるポリペプチドのアミノ、カルボキシ、又はスルフヒドリル基であり、Ｌ２〜Ｌ４はリガンドである。
【００３１】
別の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物に式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩｂ、又はＸで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートを投与することを含む癌の処置方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義：
特定の受容体に対するリガンドの「結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」という用語は、会合定数ＫＡ（解離定数ＫＤの逆数）又は実験により決定されたその近似値を意味する。
【００３３】
「アゴニスト」という用語は、受容体（例えば、インスリン受容体、１型ＩＧＦ受容体、又はＥＧＦ受容体）のリガンドであって、受容体に結合した時に、その受容体の天然リガンド（例えば、インスリン受容体に対するインスリン、ＩＧＦ−１受容体に対するＩＦＧ−１、又はＥＧＦ受容体に対するＥＧＦ）の結合により引き起こされる正常な生化学的及び生理学的事象を活性化するものを意味する。特定の実施形態では、アゴニストは、天然リガンドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％の生物学的活性を有する。インスリン受容体リガンドの活性は例えば血糖降下作用を測定することによって測定することができる（Poznansky, M.J., et al., 1984, Science 223:1304）。インスリン受容体リガンド又はＩＧＦ−１受容体リガンドの活性は、Satyamarthy, K., et al., 2001, Cancer Res. 61:7318に記載されているように、リガンドの結合に応答する受容体の自己リン酸化の程度を測定することでインビトロで測定することができる。ＩＧＦ−１受容体の場合にはＭＡＰキナーゼリン酸化を測定することもできる（Satyamarthy, K., et al., 2001, Cancer Res. 61:7318）。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの活性はBeerli, R.R., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076に記載されているようにアッセイすることができる。
【００３４】
「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合した時に刺激活性をほとんど又は全く有さず、受容体への天然リガンドの結合と競合するかこれを阻害するリガンドを意味する。特定の実施形態では、アンタゴニストの活性は天然リガンド（インスリン受容体に対するインスリン又はＩＧＦ−１受容体に対するＩＧＦ−１）の２０％未満、１０％未満、又は５％未満である。
【００３５】
アルキルは、本明細書中で、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分岐、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよいと記載されている。したがって、例えば「（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル」はヘテロアリール環であってもよい。
【００３６】
説明：
本発明の実施形態は、癌の処置に適したポリペプチド−白金コンジュゲート及びその製造方法に関する。シスプラチンは、最も効果的な抗癌化学療法薬の１つであるが、極度の副作用を生じるという欠点がある。カルボプラチン、オキサリプラチン等の抗癌特性を有する複数のその他の白金錯体が研究されてきた（文献１〜４）が、シスプラチン同様、これらは癌細胞を特異的に標的とせず、体内の全ての細胞に取り込まれる。したがって、これらも同様に極度の全身性副作用を有する。
【００３７】
本発明の目的は、癌細胞に少なくとも幾分特異的に結合するタンパク質又はペプチドに結合した抗癌白金錯体を含むコンジュゲートを開発することである。好適なタンパク質の例としては、癌細胞上でその受容体が過剰発現されている成長因子又はホルモンが含まれる。上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、Ｉ型インシュリン様成長因子受容体、及びインスリン受容体は全て、ほとんどではなくとも多くの種類の癌で過剰発現されている。したがって、これらの受容体のリガンド又は癌細胞に幾分特異的に結合するその他のポリペプチドを白金錯体に結合させて白金錯体をより特異的に癌細胞に送達させることができる。これらのポリペプチドリガンドはその受容体に結合した時に細胞によって内部移行されることが好ましい。これによって、白金錯体も効率的に癌細胞中に内部移行される。アゴニストは内部移行されるが、アンタゴニストは内部移行されないこともある。
【００３８】
コンジュゲートは、ポリペプチドへの架橋に化学的に適したフリーの基を備えた少なくとも１つのリガンドを有する白金錯体を作製することで形成される。そのような基としては、カルボキシル基、アミノ基、及びメルカプト基、並びにアルデヒド基及びジ−ケトン基が含まれる。カルボキシル基及びアミノ基と反応して例えばこれらを互いに架橋することができる架橋剤が存在する。したがって、フリーのカルボキシル基を有する白金錯体をタンパク質上のアミノ基、例えばリジン側鎖に架橋して、ポリペプチド−白金錯体を形成することができる。あるいは、フリーのリガンド分子をタンパク質に架橋し、その後、白金に配位（ｌｉｇａｔｅ）させることでポリペプチド−白金錯体を形成することもできる。
【００３９】
例えば、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３を白金に配位させて、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３の３つのカルボキシルの２つが白金に配位し且つ１つのカルボキシルが架橋剤との反応にフリーである白金錯体１１を形成することができる。
【００４０】
【化１０】
【００４１】
あるいは、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３を最初にタンパク質に架橋して、その後、得られた（タンパク質−ＮＨ）−ＣＯ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２コンジュゲートを錯体中の白金原子に配位させて同じタンパク質−白金コンジュゲートを形成してもよい。
【００４２】
別の例としては、アミノ基と反応してそのアミノ基を介してリガンドをポリペプチドのアミノ基に架橋する二機能性架橋試薬によって二座リガンドＨ２ＮＣＨ（ＣＯＯＨ）２をポリペプチドにカップリングさせてコンジュゲート（ポリペプチド−ＮＨ）−リンカー−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２を形成させ、その後、コンジュゲートの２個のカルボキシルを介してコンジュゲートを白金原子に配位させてもよい。
【００４３】
リガンド又は白金錯体をポリペプチドにカップリングさせるための指針
本発明の白金錯体は通常、タンパク質上に存在する反応性基を介してポリペプチドにカップリングされている。これらには、Ｎ末端アルファ−アミノ基、Ｃ末端アルファ−カルボキシル基、リジンの側鎖アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖カルボキシル基、システインの側鎖チオール、及びアルギニン側鎖が含まれる。タンパク質上に見られるその他の反応性側鎖としては、セリン及びスレオニンの側鎖ヒドロキシル、チロシンのヒドロキシアリール、ヒスチジンのイミダゾール、及びメチオニン側鎖が挙げられる。しかし、主な反応性基は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖及びアミノ末端及びカルボキシル末端に見られるアミノ基、カルボキシル基、及びメルカプト基である。
【００４４】
本発明の実施形態では、白金へのリガンド上、好ましくは白金への二座リガンド上に、同じ反応性基が配置され、リガンドの反応性基がポリペプチドの反応性基に架橋される。したがって、ポリペプチドへのリガンド又は白金錯体の架橋は２個のポリペプチドの架橋と類似している。
【００４５】
タンパク質のコンジュゲート化及び架橋の化学及び原理はWong, Shan S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1991, CRC Press, Boca Raton, Floridaに記載されている。この化学に関するその他の情報源としてはピアース・バイオケミストリー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のカタログ、並びにGreene, T. W., and Wutz, P.G.M., Protecting Groups in Organic Synthesis, second edition 1991, John Wiley & Sons, Inc., New York及びその中に引用されている文献が含まれる。
【００４６】
アミノ酸側鎖の最も強力な求核試薬は還元システイン側鎖のチオールである。チオールはほとんどのタンパク質修飾試薬と反応する。アルファ−ハロアセトアミド及びマレイミドは、特にｐＨ７．０以下で、システイン残基と特異的に反応すると考えられている。チオールはジスルフィド試薬とのジスルフィド交換によっても反応する。
【００４７】
【化１１】
【００４８】
タンパク質上に見られるその次に強い求核試薬はアミノ基である。アルデヒドはアミノ基と反応してシッフ塩基を形成する。シッフ塩基は加水分解でき、このことは本発明において利点となり得る。リガンド−化学療法薬コンジュゲートの癌細胞中への取込みと共に、化学療法薬が活性になるためにコンジュゲートから化学療法薬が切断される必要がある場合がある。これは化学療法薬が加水分解可能な結合等の切断可能な結合によってリガンドに連結されている場合によりよく達成される。切断可能な結合は細胞中で自発的に又は酵素によって切断され得る。例えば、アミド結合はプロテアーゼ等の特定の酵素によって切断される。シッフ塩基結合はかなりの速度で自発的に加水分解する。ジスフルフィド結合は癌細胞の細胞内還元性環境中で還元切断されると予想される。
【００４９】
【化１２】
【００５０】
アミノ基とアルデヒドの反応によって形成されたシッフ塩基は、例えば水素化ホウ素ナトリウム又はピリジンボランによる還元によって安定化することができる。ピリジンボランには、インスリン、ＩＧＦ−１、及びＩＧＦ−２で見られ且つこれらのタンパク質の構造に必須であるジスルフィドを還元しないという利点がある。
【００５１】
グルタルアルデヒド等のジアルデヒドはアミノ基を有する２個の分子を架橋する。
【００５２】
その他のアミノ試薬としては、活性カルボニル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、又は酸無水物（例えば無水コハク酸）が含まれる。
【００５３】
【化１３】
【００５４】
アミノ基はハロゲン化スルホニル及びハロゲン化アリール（例えば２，４−ジニトロフルオロベンゼン）とも反応する。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
アミノ基はまた、イソシアナート及びイソチオシアナートと反応して尿素又はチオ尿素誘導体を形成する。
【００５７】
【化１５】
【００５８】
イミドエステルはアミノ基の最も特異的なアシル化剤である。イミドエステルはｐＨ約７〜１０でアミンと特異的に反応してイミドアミド（ｉｍｉｄｏａｍｉｄｅ）を形成する。この反応には、元のアミノ基に正に帯電した基（イミドアミド）を生じることで電荷安定性を維持するという利点がある。イミドアミドはまた、中性より高いｐＨで徐々に加水分解される。このことも、加水分解によって癌細胞中にフリーの化学療法薬が放出される点で利点となり得る。
【００５９】
【化１６】
【００６０】
カルボキシル基は穏やかな酸条件下、例えばｐＨ５で、ジアゾアセタート及びジアゾアセトアミドと特異的に反応する。
【００６１】
【化１７】
【００６２】
カルボキシルの最も重要な化学修飾では、カルボジイミド、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）及び３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用する。アミン存在下でカルボジイミドは２段階でカルボキシルへのアミド結合を形成する。第１段階では、カルボキシル基がカルボジイミドに付加されてＯ−アシルイソ尿素中間体が形成される。その後のアミンとの反応によって対応するアミドが生成する。
【００６３】
【化１８】
【００６４】
特に重要なカルボジイミド反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてカルボキシルを活性化してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する際におけるその使用である。
【００６５】
【化１９】
【００６６】
活性化カルボキシルは単離するのに十分な安定性を有するが、その後容易にアミノ基と反応してアミド結合を形成する。
【００６７】
Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート（ＳＰＤＰ）等のスクシンイミドを用いてアミノ基を介して２個の化合物をカップリングさせることができる（ピアース・バイオテクノロジー社（ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のカタログ及びThorpe, P.E. et al. 1982, Immunol. Rev. 62:119-158参照）。
【００６８】
【化２０】
【００６９】
アルギニンはビシナルなジアルデヒド又はジケトン、例えばグリオキサール、２，３−ブタンジオン、及び１，２−シクロヘキサンジオンと反応する。安定化が所望される場合、ボラート（ｂｏｒａｔｅ）は付加体を安定化し得る。
【００７０】
【化２１】
【００７１】
上記の反応のいくつかによって反応性基を別の反応性基と交換することもできる。例えば、無水コハク酸等の酸無水物を用いてアミノ基を修飾することで、正に帯電したアミノ基がフリーのカルボキシル基で置換される。同様に、カルボキシル基とカルボジイミド及びジアミン（例えばエチレンジアミン）との反応は、カルボキシル基をフリーのアミノ基で置換する。
【００７２】
架橋：
上記反応性基を２個含む試薬、例えば２個のアミノ反応性基を含む試薬又はアミノ反応性基とチオール反応性基を含む試薬を用いて、適当な基の１つ、特にカルボキシル、アミノ、又はメルカプト、を含む白金錯体（又は白金と錯体を形成することができるリガンド）を別の適当な基を含むポリペプチドに架橋することができる。例えば、２個のアミン反応性基を有する架橋剤により、フリーのアミノ基を含む白金錯体をポリペプチドのアミノ基（リジン側鎖又はＮ末端アミノ）に架橋することができる。例えば、白金錯体又は白金リガンド上のフリーのアミノを、ジ−イミドエステル、例えばアジプイミド酸ジメチル−２−ＨＣｌ（ピアース・バイオケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）製）によって、又はジスクシンイミジルエステル、例えばジスクシンイミジルグルタラート（ピアース・バイオケミカル社製）によって、ポリペプチド上のアミノにカップリングさせることができる。
【００７３】
カルボジイミド又はカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてカルボキシル（例えば、白金錯体のフリーのカルボキシル）を活性化させて（例えばタンパク質リガンドの）アミノ基と反応させてアミド結合架橋を形成させることができる。
【００７４】
リガンド又は試薬が市販されていない場合、有機化学者に公知の原理及び手法並びに文献５〜９に記載されている原理及び手法によって合成することができる。
【００７５】
具体的実施形態
式Ｉで表される白金錯体又は式ＩＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートの特定の実施形態では、Ｒ３〜Ｒ８はそれぞれＨである。別の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、Ｒ５〜Ｒ８はそれぞれＨである。
【００７６】
式Ｉで表される白金錯体又は式ＩＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートのいくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、これは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルで置換されていてもよく、両方のアルキルに−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、オキソ、アミノ、カルボキシ、又はメルカプトで置換されていてもよい。この場合、白金に配位している２個のアミンが一緒に連結されて二座リガンドを形成する。
【００７７】
同様に、式ＩＩで表される錯体の特定の実施形態では、Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、これは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルで置換されていてもよく、両方のアルキルに−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、オキソ、アミノ、カルボキシ、又はメルカプトで置換されていてもよい。この場合、白金に配位している２個のアミンが一緒に連結されて二座リガンドを形成する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれＨであり、Ｒ９及びＲ１０は一緒に、カルボキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１３及びＲ１４は独立してＨ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。
【００７９】
式ＩＩで表される錯体の別の実施形態では、Ｒ９及びＲ１０は一緒に、カルボキシ又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１１〜Ｒ１４はそれぞれ独立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；Ｒ９〜Ｒ１４の少なくとも１つはカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである。
【００８０】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの特定の実施形態では、錯体はアミド結合によってポリペプチドに連結されている。したがって、リンカー部分はアミド結合の−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＮＨ−部分を含む。別の実施形態では、錯体はジスルフィド結合又はシッフ塩基又は還元シッフ塩基によってポリペプチドに連結されている。
【００８１】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法の特定の実施形態では、方法は、式Ｖで表される白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【００８２】
【化２２】
【００８３】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００８４】
【化２３】
【００８５】
（式中、Ｌ１〜Ｌ６はそれぞれリガンドである。）を形成する工程を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートは式ＶＩＩＩで表されるコンジュゲートである：
【００８７】
【化２４】
【００８８】
式中、Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ２は１〜１００原子のリンカー部分であり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００８９】
別の実施形態では、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートは式ＩＸで表されるコンジュゲートである：
【００９０】
【化２５】
【００９１】
式中、Ｒ２１は、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルで置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００９２】
式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートは、癌を処置するための最終生成物にするために更なるリガンドの置換がなされてもよい。例えば、Ｌ１及びＬ２が二座ジアミンリガンドである場合、Ｌ３及びＬ４はヨード（ｉｏｄｉｄｅ）であってもよく、このヨードは後の工程において例えばクロリド、オキサラート、又はマロナートで置換されてもよい。
【００９３】
ポリペプチド
白金錯体にコンジュゲートさせるのに適したタンパク質の例としては、その受容体が癌細胞上で過剰発現されている成長因子又はホルモンが含まれる。上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、Ｉ型インシュリン様成長因子受容体、及びインスリン受容体は全て、ほとんどではなくとも多くの種類の癌において過剰発現されている。したがって、これらの受容体のリガンド、又は癌細胞に幾分特異的に結合するその他のポリペプチドが、白金錯体をより特異的に癌細胞に送達するために白金錯体に結合され得る。ポリペプチドリガンドはその受容体に結合した時に細胞によって内部移行されることが好ましい。これによって、白金錯体も効率的に癌細胞中に内部移行される。アゴニストは内部移行されるが、アンタゴニストは内部移行されないこともある。
【００９４】
当然ながら、インスリンはインスリン受容体の天然リガンドである。インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）はＩ型ＩＧＦ受容体の天然リガンドである。インスリン及びＩＧＦ−１は互いの受容体とも交差反応し、ＩＧＦ−２も両方の受容体に結合する。
【００９５】
しばしば癌細胞中で同じ種類の組織の正常細胞中よりも多く見られる別の受容体は上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体である（Nicholson, R.I. et al., 2001, Eur. J. Cancer 37:S9-S15；Kopp, R., et al, 2003, Recent Results in Cancer Research 162:115-132；Fox, S.B. et al., 1994, Breast Cancer Res. Treat. 29:41-49。ＥＧＦ受容体はＥｒｂＢ−１としても知られ、ＥＧＦ自身、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）等の複数のアゴニストによって活性化される（Beerli, R.R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076；Earp, H.S., et al., 2003, Trans. Am. Clin. Clim. Assoc. 114:315-333）。３つのその他の受容体もＥＧＦファミリーの受容体の一員とみなされる。それらはＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、及びＥｒｂＢ−４（それぞれヒトＥＧＦ受容体２、３、及び４を意味するＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４としても知られる）である。これらの受容体、特にＥｒｂＢ−２も、癌細胞上で過剰発現されていることが多い。受容体ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−４はチロシンキナーゼである。上記のＥＧＦ受容体アゴニストはＥＧＦ受容体に最も強く結合する。ＥＧＦ受容体ファミリーに含まれる他の受容体にはこれらはそれほど強く結合しない。Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）／ヘレグリンはＥｂｒＢ−３及びＥｒｂＢ−４のリガンドである（Beerli, R.R., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076；Carraway, K.L. et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:14303-14306；Plowman, G.D., et al., 1993, Nature 366:473-475）。
【００９６】
したがって、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＴＣ、及びＮＤＦも白金錯体にカップリングされ得るタンパク質である。
【００９７】
例えばファージディスプレイライブラリー技術によってペプチドライブラリーをスクリーニングし、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ−２等の癌細胞上で過剰発現されている標的受容体タンパク質の１つに結合する非天然ペプチドを同定してもよい。これらのペプチドを前述の白金錯体とコンジュゲートさせてもよい。
【００９８】
これらの受容体又は癌細胞に比較的特異的なその他の標的に対する抗体を白金錯体とコンジュゲートさせることもできる。例としてＣＡ１２５に対する抗体が挙げられる。
【００９９】
したがって、ポリペプチドは、化学合成された短いペプチドから巨大なマルチサブユニットタンパク質までの如何なるサイズであってよい。
【０１００】
白金錯体にコンジュゲートさせる別の特定のポリペプチドはＩ型ＩＧＦ受容体への結合が低下しているＩＧＦ−１のバリアントである。
【０１０１】
特定の実施形態では、ポリペプチドはインスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、又はＥｒｂ−２のリガンドである。
【０１０２】
ＥＧＦ前駆体の配列が配列番号１である。成熟ＥＧＦでは、配列番号１のアミノ末端メチオニンが除去されている（Gregory, H., 1975, Nature 257:325-327）。ＴＧＦα前駆体の配列が配列番号２である。成熟ＴＧＦαは配列番号２の残基４０〜８９であると考えられている（Qian, J.F., et al., 1993, Gene 132:291- 296；Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。アンフィレギュリン前駆体の配列が配列番号３である。成熟アンフィレギュリンは配列番号３の残基１０１〜１８４であると考えられている（Plowman, G.D., et al., 1990, Mol Cell Biol. 10:1969-1981）。ＨＢ−ＥＧＦ前駆体の配列が配列番号４である。成熟ＨＢ−ＥＧＦは配列番号４の残基６３〜１４８であると考えられている（Higashayama, S. et al., 1992, J. Biol Chem. 267:6205-6212；Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。ベータセルリン前駆体の配列が配列番号５である。成熟ベータセルリンは配列番号５の残基３２〜１１１であると考えられている（Sasada, R. et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Comm. 190:1173-1179）。成熟ＥＧＦでは、配列番号１のシステイン残基７と２１、１５と３２、及び３４と４３が互いにジスルフィドブリッジを形成している（Gregory, H., 1975, Nature 257:325-327）。他の天然ＥＧＦ受容体リガンド中の相同なシステイン残基もジスルフィドブリッジを形成する（Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。ＥＧＦ受容体の別のポリペプチドリガンドとして、天然ＥＧＦ受容体リガンドの配列のキメラ、例えば、ＥＧＦ配列とＴＧＦα配列とのキメラであり且つＥＧＦ又はＴＧＦαよりも活性なアゴニストであるキメラＥ４Ｔが挙げられる（Lenferink, A.E.G., et al., 1998, EMBO J. 17:3385-3397；Kramer, R.H., et al., 1994, J Biol. Chem. 269:8708-8711）。
【０１０３】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＥＧＦ受容体のリガンドであって、リガンドは、配列番号１の残基２〜５４、配列番号２の残基４０〜８９、配列番号３の残基１０１〜１８４、配列番号４の残基６３〜１４８、配列番号５の残基３２〜１１１、及びＥ４Ｔからなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
【０１０４】
インスリンの構造は周知であり、米国特許出願公開第２００６０２５８５６９号に開示されている。ＩＧＦ−１のアミノ酸配列は配列番号６である。
【０１０５】
ＩＧＦ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニストであるペプチドリガンド並びにＩＧＦ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニストであるペプチドリガンドの同定方法の例は米国特許出願公開第２００４／００２３８８７号及び同第２００３／００９２６３１号に開示されている。アンタゴニストの１つはペプチドＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫ（配列番号７）である。
【０１０６】
ＩＧＦ−１受容体アゴニストのその他の例としては、米国特許第４，８７６，２４２号に開示されている、受容体を活性化するが可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下しているＩＧＦ−１のバリアントが含まれる。ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−１に結合してＩＧＦ−１の循環を維持し且つその生物学的半減期を延長する、天然の血清タンパク質である。本発明のＩＧＦ−１受容体リガンド、特に別個の分子として化学療法薬剤と共投与されるアゴニストのＩＧＦ−１結合タンパク質への結合が低下していることは、薬剤が放出されてＩＧＦ−１受容体に結合し易くなるため、利点となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１受容体のリガンド又はアゴニストは、天然ＩＧＦ−１と比較して、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下している。米国特許第４，８７６，２４２号に開示されているバリアントには、バリアントＩＧＦ−１がポリペプチド構造Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−ＬＣＧ−Ａ５−Ａ６−ＬＶ−Ａ７−ＡＬ−Ａ８−Ａ９−Ｒ１（式中、Ａ１はＧ、Ｖ、又はＦＶであり；Ａ２はＰ又はＮであり；Ａ３はＥ又はＱであり；Ａ４はＴ、Ｈ、又はＡであり；Ａ５はＡ又はＳであり；Ａ６はＥ又はＨであり；Ａ７はＤ又はＥであり；Ａ８はＱ又はＹであり；Ａ９はＦ又はＬであり；Ｒ１は配列番号８である。）を含む、バリアントが含まれる。具体的な実施形態では、Ａ１はＦＶであり、Ａ２はＮであり、Ａ３はＱであり、Ａ４はＨであり、Ａ５はＳであり、Ａ６はＨであり、Ａ７はＥであり、Ａ８はＹであり、及びＡ９はＬであり、したがって、バリアントは配列番号１４である。別の実施形態では、バリアントは、配列番号１４又は米国特許第４，８７６，２４２号に開示されている別のバリアントを含む。別の実施形態では、バリアントは配列番号８を含む。
【０１０７】
本発明の方法及びコンジュゲートに使用するための、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質への結合が低下した好ましいバリアントＩＧＦ−１の１つは、ＬＯＮＧ−Ｒ３−ＩＧＦ−１（配列番号１３）である（Francis, G.L., et al.l992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223；Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol. 137:413-421）。可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したその他のバリアントＩＧＦ−１としては、配列番号９〜１２、特に野生型ＩＧＦ−１の最初の３残基が欠けたＤｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１（配列番号１２）が含まれる。したがって、特定の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合が低下したバリアントＩＧＦ−１であるポリペプチドは配列番号９〜１３のいずれか１つを含む。
【０１０８】
好ましくは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したＩＧＦ−１受容体リガンドは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合親和性が野生型ＩＧＦ−１の５分の１以下、より好ましくは１０分の１以下、更により好ましくは１００分の１以下である。可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合親和性は、Francis, G.L., et al.（1992 J. Mol Endocrinol. 8:213-223）及びSzabo, L. et al.（1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:207-214）に記載されているように、精製ＩＧＦ−１結合タンパク質の混合物又はラットＬ６筋芽細胞馴化培地（ＩＧＦ−１結合タンパク質の天然生成混合物）を用いて標識ＩＧＦ−１（例えばＩ−１２５−ＩＧＦ−１）に対する競合結合アッセイにより測定することができる。好ましくは、Ｌ６筋芽細胞馴化培地中での可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合に対する標識野生型ＩＧＦ−１との競合結合アッセイにおけるバリアントＩＧＦ−１のＩＣ５０は、１０ｎＭ超、より好ましくは１００ｎＭ超である。
【０１０９】
好ましくは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したバリアントＩＧＦ−１は、野生型ＩＧＦ−１に近いＩＧＦ−１受容体への親和性を有する（例えば野生型ＩＧＦ−１の３０倍未満、より好ましくは野生型ＩＧＦ−１の１０倍未満）。具体的な実施形態では、（例えばＭＣＦ−７細胞上の）ＩＧＦ−１受容体への結合に対する標識野生型ＩＧＦ−１との競合結合アッセイにおけるバリアントＩＧＦ−１のＩＣ５０は、５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、更により好ましくは５ｎＭ未満、更により好ましくは３ｎＭ未満）である。このアッセイは、Ross, M. et al.（1989, Biochem. J. 258:267-272）及びFrancis, G.L., et al.（1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223）に記載されている。
【０１１０】
好ましくは、ポリペプチド及び／又はポリペプチド−白金コンジュゲートは、癌細胞に幾分特異的な標的受容体又は標的分子へのＫＤが１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満である。
【０１１１】
ほとんどのサイトカインは中性水溶液中で極度に可溶性ではない。したがって、可溶性を増大させるために、これらを血清アルブミンの全体又は一部等のより可溶性の高い配列との融合タンパク質として発現させてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、サイトカインの全体若しくは一部又は別のポリペプチド配列の全体若しくは一部を含む融合タンパク質である。
【０１１２】
ＥＧＦ前駆体：
ＭＮＳＤＳＥＣＰＬＳ ＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶ ＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹ ＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧ ＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ ＷＥＬＲ（配列番号１）
【０１１３】
ＴＧＦα前駆体
ＭＶＰＳＡＧＱＬＡＬ ＦＡＬＧＩＶＬＡＡＣ ＱＡＬＥＮＳＴＳＰＬ ＳＡＤＰＰＶＡＡＡＶ ＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳ ＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣ ＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡ ＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡ ＲＣＥＨＡＤＬＬＡＶ ＶＡＡＳＱＫＫＱＡＩ ＴＡＬＶＶＶＳＩＶＡ ＬＡＶＬＩＩＴＣＶＬ ＩＨＣＣＱＶＲＫＨＣ ＥＷＣＲＡＬＩＣＲＨ ＥＫＰＳＡＬＬＫＧＲ ＴＡＣＣＨＳＥＴＶＶ（配列番号２）
【０１１４】
アンフィレギュリン前駆体：
ＭＲＡＰＬＬＰＰＡＰ ＶＶＬＳＬＬＩＬＧＳ ＧＨＹＡＡＧＬＤＬＮ ＤＴＹＳＧＫＲＥＰＦ ＳＧＤＨＳＡＤＧＦＥ ＶＴＳＲＳＥＭＳＳＧ ＳＥＩＳＰＶＳＥＭＰ ＳＳＳＥＰＳＳＧＡＤ ＹＤＹＳＥＥＹＤＮＥ ＰＱＩＰＧＹＩＶＤＤ ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰ ＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴ ＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧ ＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲ ＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦ ＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫ ＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣ ＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲ ＣＧＥＫＳＭＫＴＨＳ ＭＩＤＳＳＬＳＫＩＡ ＬＡＡＩＡＡＦＭＳＡ ＶＩＬＴＡＶＡＶＩＴ ＶＱＬＲＲＱＹＶＲＫ ＹＥＧＥＡＥＥＲＫＫ ＬＲＱＥＮＧＮＶＨＡ ＩＡ（配列番号３）
【０１１５】
ＨＤ−ＥＧＦ前駆体
ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫ ＬＬＬＡＡＶＬＳＡＬ ＶＴＧＥＳＬＥＱＬＲ ＲＧＬＡＡＧＴＳＮＰ ＤＰＳＴＧＳＴＤＱＬ ＬＲＬＧＧＧＲＤＲＫ ＶＲＤＬＱＥＡＤＬＤ ＬＬＲＶＴＬＳＳＫＰ ＱＡＬＡＴＰＳＫＥＥ ＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧ ＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲ ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥ ＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ ＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧ ＥＲＣＨＧＬＳＬＰＶ ＥＮＲＬＹＴＹＤＨＴ ＴＩＬＡＶＶＡＶＶＬ ＳＳＶＣＬＬＶＩＶＧ ＬＬＭＦＲＹＨＲＲＧ ＧＹＤＶＥＮＥＥＫＶ ＫＬＧＭＴＮＳＨ（配列番号４）
【０１１６】
ベータセルリン前駆体：
ＭＤＲＡＡＲＣＳＧＡ ＳＳＬＰＬＬＬＡＬＡ ＬＧＬＶＩＬＨＣＶＶ ＡＤＧＮＳＴＲＳＰＥ ＴＮＧＬＬＣＧＤＰＥ ＥＮＣＡＡＴＴＴＱＳ ＫＲＫＧＨＦＳＲＣＰ ＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧ ＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴ ＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩ ＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦ ＹＬＲＧＤＲＧＱＩＬ ＶＩＣＬＩＡＶＭＶＶ ＦＩＩＬＶＩＧＶＣＴ ＣＣＨＰＬＲＫＲＲＫ ＲＫＫＫＥＥＥＭＥＴ ＬＧＫＤＩＴＰＩＮＥ ＤＩＥＥＴＮＩＡ（配列番号５）
【０１１７】
ＩＧＦ−１：
ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号６）
【０１１８】
配列番号７
ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫ（配列番号７）
【０１１９】
配列番号８
ＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮ ＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲ ＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥ ＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰ ＡＫＳＡ（配列番号８）
【０１２０】
Ｌｏｎｇ−ＩＧＦ−１
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＥＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号９）
【０１２１】
Ｌｏｎｇ−Ｇｌｙ３−ＩＧＦ１
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＧＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号１０）
【０１２２】
Ｒ３−ＩＧＦ１
ＧＰＲＴＬＣＧＡＥＬ ＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱ ＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号１１）
【０１２３】
Ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ１
ＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡ ＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦ ＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳ ＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩ ＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤ ＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰ ＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号１２）
【０１２４】
Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１：
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＲＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号１３）
【０１２５】
インスリン−ＩＧＦ１ハイブリッド
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ ＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮ ＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲ ＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥ ＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰ ＡＫＳＡ（配列番号１４）
【実施例１】
【０１２６】
ヨード白金沈殿の形成を避けるために全ての手順を暗黒下又は薄明りの中で行う。
【０１２７】
＜Ｋ２ＰｔＩ４の形成＞
５ｇ（１２ｍｍｏｌ）のＫ２ＰｔＣＬ４の溶液をＫＩ（１２ｇ、７２ｍｍｏｌ）水溶液１８ｍｌで処理し、７０℃に加熱して冷ます（０．５時間）。生成物のＫ２ＰｔＩ４をろ過する。
【０１２８】
＜シス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２の形成＞
ろ過したＫ２ＰｔＩ４の溶液を１２〜１３ｍｌの２．０Ｍ ＮＨ３で処理する。３０分後、生成物のシス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２をろ過し、冷水で洗浄し、デシケーター中で乾燥させる。
【０１２９】
＜シス（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＣＨ（ＣＯＯ）３）の形成＞
シス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２を２モル当量の硝酸銀と水溶液中で一晩撹拌する。次いで、ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液には生成物であるシス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２が含まれる。
【０１３０】
シス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２を１モル当量のＫ３ＣＨ（ＣＯＯ）３と混合する。この溶液を２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１１である。
【０１３１】
【化２６】
【０１３２】
この生成物混合物には硝酸カリウムも含まれる。
【０１３３】
＜タンパク質コンジュゲート化＞
白金錯体１１（３０μモル）をインスリン（２μモル）と共に３．４ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）中に溶解させる。架橋剤の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（３００μモル）を新たに０．６ｍｌのバッファーに溶解させ、タンパク質−錯体１１溶液に添加する。この溶液を室温で２時間反応させ、その後、透析バッグ（カットオフ３，５００ｍ．ｗ．）に入れる。溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に対して３時間透析し、その後、２ｍＭのＮａＯＨに対して一晩透析する。
【０１３４】
この生成物は、インスリンのアミノ基と錯体１１のフリーのカルボキシル基の間の直接アミド結合によりインスリン１個当たり約３個の錯体１１がコンジュゲートしたインスリン−白金コンジュゲートである。
【０１３５】
インスリンは尿素のない中性ｐＨでは溶解性が低く、尿素はより高い濃度の可溶性インスリンを可能にするので、透析バッファーは尿素を含む。同様に、インスリンは中性ｐＨよりも２ｍＭのＮａＯＨ中で溶解性が高いため、生成物を２ｍＭのＮａＯＨに対して透析する。尿素がＰｔのリガンドとして競合することが分かった場合には透析バッファーから尿素を省いてもよいが、インスリンの可溶性を維持するために反応混合物の体積を増やすべきである（比例して全成分の濃度が低くなる）。同様に、２ｍＭのＮａＯＨが白金錯体に悪影響を与えることが分かった場合、可溶性を維持するためにコンジュゲートの濃度をより低くして２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して生成物を透析してもよい。
【実施例２】
【０１３６】
本実施例では、ジカルボキシラート二座リガンドを最初にタンパク質にコンジュゲートさせ、その後、この修飾タンパク質を白金錯体に配位させて、実施例１と同じインスリン−白金コンジュゲートを形成する。
【０１３７】
ＣＨ（ＣＯＯ）３Ｎａ３（３０μモル）をインスリン（２μモル）と共に３．４ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に溶解させる。架橋剤の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（３００μモル）を新たに０．６ｍｌのバッファーに溶解させ、インスリン溶液に添加する。この溶液を室温で２時間反応させ、その後、透析バッグ（カットオフ３，５００ｍ．ｗ．）に入れる。溶液を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に対して３時間透析し、その後、２ｍＭのＮａＯＨに対して一晩透析する。この生成物は、全てのアミノ基が−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＯＯ）２Ｎａ２を形成するように修飾されたインスリンである。これにより、タンパク質のアミノ末端及び各リジン側鎖に二座ジカルボキシラート配位基（ｌｉｇａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が生じる。
【０１３８】
＜インスリン−白金コンジュゲートの形成＞
修飾されたインスリンを実施例１と同様に調製した４モル当量のシス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２と混合する。このジカルボキシラートが水リガンドに取って代わり、コンジュゲート１２が形成される。
【０１３９】
【化２７】
【実施例３】
【０１４０】
本実施例では、錯体１３を作製し、インスリンにコンジュゲートさせる。
【０１４１】
【化２８】
【０１４２】
Ｋ２ＰｔＩ４（１２ｍｍｏｌ）を実施例１と同様に形成し、その後、１２〜１３ｍｌの２．０Ｍグリシンと混合する。３０分後、生成物のシス−（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２ＰｔＩ２沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、乾燥させる。
【０１４３】
シス−（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２ＰｔＩ２を２モル当量の硝酸銀と一晩撹拌する。沈殿したＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液にはシス−［（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２が含まれる。
【０１４４】
シス−［（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２を１モル当量のシュウ酸ナトリウムと混合する。この溶液を２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１３である。生成物混合物には硝酸カリウムも含まれる。
【０１４５】
インスリンとのコンジュゲート化を実施例１と同様に行う。この生成物は、インスリン１モル当たり約３個の錯体１３を有するコンジュゲート１４である。
【０１４６】
【化２９】
【実施例４】
【０１４７】
本実施例では、リジン残基及びＮ末端の第一級アミノ基を白金へのリガンドとして用い、白金をインスリンと錯体化する。Ｋ２ＰｔＩ４をインスリン及びアンモニアと３Ｋ２ＰｔＩ４：１インスリン：３ＮＨ３のモル比でインキュベートする。混合物を中性ｐＨの水溶液中で一晩撹拌する。インスリンには３個のアミノ基がある（１個のリジン及び成熟インスリンの２個のポリペプチドに対する２個のアミノ末端）ので、インスリン１個当たり３個のＰｔが錯体化され、各Ｐｔは、平均して、２個のＩに加えてインスリンの１個のアミノ基及び１個のＮＨ３によって錯体化される。
【０１４８】
次いで、この錯体を、Ｐｔ１モル当たり２モル当量の硝酸銀と一晩撹拌する。ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液を１モル当量のシュウ酸カリウムと混合し、一晩置く。生成物はコンジュゲート１５である。
【０１４９】
【化３０】
【実施例５】
【０１５０】
実施例１と同様に調製したＫ２ＰｔＩ４を１モル当量のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸（ＥＤＤＡ）で処理する。ＥＤＤＡを有する白金錯体をろ過し、冷水で洗浄する。次いで、２モル当量の硝酸銀と水溶液中で一晩撹拌する。次いで、ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液にはＥＤＤＡ−Ｐｔ（ＯＨ２）２（ＮＯ３）２が含まれる。ＥＤＤＡ−Ｐｔ（ＯＨ２）２（ＮＯ３）２を１モル当量のシュウ酸カリウムと混合し、２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１６である。
【０１５１】
【化３１】
【０１５２】
実施例１と同様に、インスリンのアミノ基とアミド結合を形成する錯体１６のフリーのカルボキシルを介して、錯体１６をインスリンにコンジュゲートさせて、コンジュゲート１７を形成する。
【０１５３】
【化３２】
【実施例６】
【０１５４】
本実施例では、実施例２でＣＨ（ＣＯＯＨ）３をインスリンにコンジュゲートさせたのと同様な手順で最初にＥＤＤＡをインスリンにコンジュゲートさせることでコンジュゲート１７を調製する。これによりコンジュゲート１８が生成する。
【０１５５】
【化３３】
【０１５６】
次いで、このコンジュゲートを実施例５と同様にＫ２ＰｔＩ４と反応させ、その後、実施例５と同様に硝酸銀及びシュウ酸カリウムと反応させて、Ｐｔが配位したコンジュゲート１７を形成する。
【技術分野】
【０００１】
シスプラチンは利用可能な最も強力な抗癌化学療法薬であり、とりわけ、精巣、卵巣、膀胱、頭頸部、結腸、及び肺の癌に対して広く使用されている。しかし、シスプラチンは多くの他の化学療法薬よりも副作用がはるかに強く、とりわけ、骨髄抑制、悪心、神経障害、及び腎毒性を引き起こす。より新しい白金系薬物であるカルボプラチン及びオキサリプラチンが開発されたが、これらもシスプラチンと大きく変わらない全身性作用及び副作用プロフィールを有する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチンの構造を以下に示す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
引用した全ての特許文献及びその他の文献を参照により援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Momekov, G. et al., 2005, Novel approaches towards development of non-classical platinum-based antineoplastic agents: design of platinum complexes characterized by an alternative DNA-binding pattern and/or tumor-targeted cytotoxicity. Curr. Med. Chem. 12:2177-2191.
【非特許文献２】Cleare, M.J. et al. 1978. Anti-tumour platinum complexes: relationships between chemical properties and activity. Biochimie 60:835-850.
【非特許文献３】Harrison, R.C. et al. 1980. An efficient route for the preparation of highly soluble platinum(II) antitumour agents. Inorganica Chimica Acta 46:L15-L16.
【非特許文献４】Kidani, Y. et al. 1978. Antitumor activity of 1,2-diaminocyclohexane-platinum complexes against Sarcoma-180 ascites form. J. Med. Chem. 21:1315-1318.
【非特許文献５】Li, Jie Jack, et al. 2007. Modern Organic Synthesis in the Laboratory: a collection of standard experimental procedures. Oxford University Press, Oxford, UK.
【非特許文献６】Wyatt, Paul, and Stuart Warren. 2007. Organic Synthesis: strategy and control. John Wiley, Hoboken, NJ, USA.
【非特許文献７】Tojo, Gabriel. 2006. Oxidation of primary alcohols to carboxylic acids: a guide to common practice. Springer Science and Business Media, Boston, MA, USA.
【非特許文献８】Tojo, Gabriel. 2006. Oxidation of alcohols to aldehydes and ketones: a guide to common practice. Springer Science and Business Media, Boston, MA, USA.
【非特許文献９】Taber, D.F. 2007. Organic synthesis: state of the art 2005-2007. John Wiley, Hoboken, NJ, USA.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌標的化の向上した新規な化学療法薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、タンパク質にコンジュゲートさせることができる新規な白金錯体、タンパク質及びペプチドと白金錯体とのコンジュゲート、コンジュゲートの製造方法、並びにコンジュゲートを用いて癌を処置する方法を提供する。
【０００８】
例えば、化合物１１が提供される。
【０００９】
【化２】
【００１０】
錯体１１は、錯体の配位していないカルボキシル基を介してタンパク質のアミノ基にカップリングすることができる。タンパク質は、好ましくは、白金錯体をより特異的に癌細胞に向けることができるタンパク質であり、例えば癌細胞上にだけ若しくは主に癌細胞上に見られる受容体タンパク質に対する抗体、又はその受容体が癌細胞上で過剰発現されている成長因子である。
【００１１】
したがって、一実施形態では、式Ｉ又はＩＩで表される白金錯体が提供される：
【００１２】
【化３】
【００１３】
式Ｉ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＮＸ２、ＳＨ、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく、
式ＩＩ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン（ｆｏｒｍａｔｅ）、炭酸水素イオン（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＯＯＣ−ＣＯＯ−、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＯＨＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを形成してもよく；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも１つはＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００１４】
別の実施形態は、式ＩＩＩ又はＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートを提供する：
【００１５】
【化４】
【００１６】
式ＩＩＩ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく、
式ＩＶ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＣＯＯ−ＣＯＯ−、カルボキシ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ１１及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；Ｒ９及びＲ１０は一緒に１〜１００原子のリンカー部分を形成してもよく；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００１７】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：上記白金錯体を形成する工程；及び白金錯体をリンカー反応物及びポリペプチドと反応させてポリペプチド−白金コンジュゲートを形成する工程。
【００１８】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：白金錯体を、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【００１９】
【化５】
【００２０】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００２１】
【化６】
【００２２】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程。特定の実施形態におけるポリペプチド−白金は式ＩＩＩ又はＩＶで表されるコンジュゲートである。
【００２３】
別の実施形態は、以下を含むポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法を提供する：白金錯体を、式ＶＩｂで表されるポリペプチド−リガンドコンジュゲート
【００２４】
【化７】
【００２５】
と反応させて式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００２６】
【化８】
【００２７】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程。好ましくは、式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートは式ＩＩＩ又はＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートである。
【００２８】
別の実施形態は、式Ｘで表されるポリペプチド−白金錯体を提供する：
【００２９】
【化９】
【００３０】
式中、Ｌ１は、Ｐｔのリガンドであるポリペプチドのアミノ、カルボキシ、又はスルフヒドリル基であり、Ｌ２〜Ｌ４はリガンドである。
【００３１】
別の実施形態は、癌に罹患している哺乳動物に式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩｂ、又はＸで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートを投与することを含む癌の処置方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義：
特定の受容体に対するリガンドの「結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」という用語は、会合定数ＫＡ（解離定数ＫＤの逆数）又は実験により決定されたその近似値を意味する。
【００３３】
「アゴニスト」という用語は、受容体（例えば、インスリン受容体、１型ＩＧＦ受容体、又はＥＧＦ受容体）のリガンドであって、受容体に結合した時に、その受容体の天然リガンド（例えば、インスリン受容体に対するインスリン、ＩＧＦ−１受容体に対するＩＦＧ−１、又はＥＧＦ受容体に対するＥＧＦ）の結合により引き起こされる正常な生化学的及び生理学的事象を活性化するものを意味する。特定の実施形態では、アゴニストは、天然リガンドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％の生物学的活性を有する。インスリン受容体リガンドの活性は例えば血糖降下作用を測定することによって測定することができる（Poznansky, M.J., et al., 1984, Science 223:1304）。インスリン受容体リガンド又はＩＧＦ−１受容体リガンドの活性は、Satyamarthy, K., et al., 2001, Cancer Res. 61:7318に記載されているように、リガンドの結合に応答する受容体の自己リン酸化の程度を測定することでインビトロで測定することができる。ＩＧＦ−１受容体の場合にはＭＡＰキナーゼリン酸化を測定することもできる（Satyamarthy, K., et al., 2001, Cancer Res. 61:7318）。ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの活性はBeerli, R.R., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076に記載されているようにアッセイすることができる。
【００３４】
「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合した時に刺激活性をほとんど又は全く有さず、受容体への天然リガンドの結合と競合するかこれを阻害するリガンドを意味する。特定の実施形態では、アンタゴニストの活性は天然リガンド（インスリン受容体に対するインスリン又はＩＧＦ−１受容体に対するＩＧＦ−１）の２０％未満、１０％未満、又は５％未満である。
【００３５】
アルキルは、本明細書中で、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分岐、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよいと記載されている。したがって、例えば「（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル」はヘテロアリール環であってもよい。
【００３６】
説明：
本発明の実施形態は、癌の処置に適したポリペプチド−白金コンジュゲート及びその製造方法に関する。シスプラチンは、最も効果的な抗癌化学療法薬の１つであるが、極度の副作用を生じるという欠点がある。カルボプラチン、オキサリプラチン等の抗癌特性を有する複数のその他の白金錯体が研究されてきた（文献１〜４）が、シスプラチン同様、これらは癌細胞を特異的に標的とせず、体内の全ての細胞に取り込まれる。したがって、これらも同様に極度の全身性副作用を有する。
【００３７】
本発明の目的は、癌細胞に少なくとも幾分特異的に結合するタンパク質又はペプチドに結合した抗癌白金錯体を含むコンジュゲートを開発することである。好適なタンパク質の例としては、癌細胞上でその受容体が過剰発現されている成長因子又はホルモンが含まれる。上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、Ｉ型インシュリン様成長因子受容体、及びインスリン受容体は全て、ほとんどではなくとも多くの種類の癌で過剰発現されている。したがって、これらの受容体のリガンド又は癌細胞に幾分特異的に結合するその他のポリペプチドを白金錯体に結合させて白金錯体をより特異的に癌細胞に送達させることができる。これらのポリペプチドリガンドはその受容体に結合した時に細胞によって内部移行されることが好ましい。これによって、白金錯体も効率的に癌細胞中に内部移行される。アゴニストは内部移行されるが、アンタゴニストは内部移行されないこともある。
【００３８】
コンジュゲートは、ポリペプチドへの架橋に化学的に適したフリーの基を備えた少なくとも１つのリガンドを有する白金錯体を作製することで形成される。そのような基としては、カルボキシル基、アミノ基、及びメルカプト基、並びにアルデヒド基及びジ−ケトン基が含まれる。カルボキシル基及びアミノ基と反応して例えばこれらを互いに架橋することができる架橋剤が存在する。したがって、フリーのカルボキシル基を有する白金錯体をタンパク質上のアミノ基、例えばリジン側鎖に架橋して、ポリペプチド−白金錯体を形成することができる。あるいは、フリーのリガンド分子をタンパク質に架橋し、その後、白金に配位（ｌｉｇａｔｅ）させることでポリペプチド−白金錯体を形成することもできる。
【００３９】
例えば、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３を白金に配位させて、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３の３つのカルボキシルの２つが白金に配位し且つ１つのカルボキシルが架橋剤との反応にフリーである白金錯体１１を形成することができる。
【００４０】
【化１０】
【００４１】
あるいは、ＣＨ（ＣＯＯＨ）３を最初にタンパク質に架橋して、その後、得られた（タンパク質−ＮＨ）−ＣＯ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２コンジュゲートを錯体中の白金原子に配位させて同じタンパク質−白金コンジュゲートを形成してもよい。
【００４２】
別の例としては、アミノ基と反応してそのアミノ基を介してリガンドをポリペプチドのアミノ基に架橋する二機能性架橋試薬によって二座リガンドＨ２ＮＣＨ（ＣＯＯＨ）２をポリペプチドにカップリングさせてコンジュゲート（ポリペプチド−ＮＨ）−リンカー−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２を形成させ、その後、コンジュゲートの２個のカルボキシルを介してコンジュゲートを白金原子に配位させてもよい。
【００４３】
リガンド又は白金錯体をポリペプチドにカップリングさせるための指針
本発明の白金錯体は通常、タンパク質上に存在する反応性基を介してポリペプチドにカップリングされている。これらには、Ｎ末端アルファ−アミノ基、Ｃ末端アルファ−カルボキシル基、リジンの側鎖アミノ基、アスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖カルボキシル基、システインの側鎖チオール、及びアルギニン側鎖が含まれる。タンパク質上に見られるその他の反応性側鎖としては、セリン及びスレオニンの側鎖ヒドロキシル、チロシンのヒドロキシアリール、ヒスチジンのイミダゾール、及びメチオニン側鎖が挙げられる。しかし、主な反応性基は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖及びアミノ末端及びカルボキシル末端に見られるアミノ基、カルボキシル基、及びメルカプト基である。
【００４４】
本発明の実施形態では、白金へのリガンド上、好ましくは白金への二座リガンド上に、同じ反応性基が配置され、リガンドの反応性基がポリペプチドの反応性基に架橋される。したがって、ポリペプチドへのリガンド又は白金錯体の架橋は２個のポリペプチドの架橋と類似している。
【００４５】
タンパク質のコンジュゲート化及び架橋の化学及び原理はWong, Shan S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1991, CRC Press, Boca Raton, Floridaに記載されている。この化学に関するその他の情報源としてはピアース・バイオケミストリー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のカタログ、並びにGreene, T. W., and Wutz, P.G.M., Protecting Groups in Organic Synthesis, second edition 1991, John Wiley & Sons, Inc., New York及びその中に引用されている文献が含まれる。
【００４６】
アミノ酸側鎖の最も強力な求核試薬は還元システイン側鎖のチオールである。チオールはほとんどのタンパク質修飾試薬と反応する。アルファ−ハロアセトアミド及びマレイミドは、特にｐＨ７．０以下で、システイン残基と特異的に反応すると考えられている。チオールはジスルフィド試薬とのジスルフィド交換によっても反応する。
【００４７】
【化１１】
【００４８】
タンパク質上に見られるその次に強い求核試薬はアミノ基である。アルデヒドはアミノ基と反応してシッフ塩基を形成する。シッフ塩基は加水分解でき、このことは本発明において利点となり得る。リガンド−化学療法薬コンジュゲートの癌細胞中への取込みと共に、化学療法薬が活性になるためにコンジュゲートから化学療法薬が切断される必要がある場合がある。これは化学療法薬が加水分解可能な結合等の切断可能な結合によってリガンドに連結されている場合によりよく達成される。切断可能な結合は細胞中で自発的に又は酵素によって切断され得る。例えば、アミド結合はプロテアーゼ等の特定の酵素によって切断される。シッフ塩基結合はかなりの速度で自発的に加水分解する。ジスフルフィド結合は癌細胞の細胞内還元性環境中で還元切断されると予想される。
【００４９】
【化１２】
【００５０】
アミノ基とアルデヒドの反応によって形成されたシッフ塩基は、例えば水素化ホウ素ナトリウム又はピリジンボランによる還元によって安定化することができる。ピリジンボランには、インスリン、ＩＧＦ−１、及びＩＧＦ−２で見られ且つこれらのタンパク質の構造に必須であるジスルフィドを還元しないという利点がある。
【００５１】
グルタルアルデヒド等のジアルデヒドはアミノ基を有する２個の分子を架橋する。
【００５２】
その他のアミノ試薬としては、活性カルボニル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、又は酸無水物（例えば無水コハク酸）が含まれる。
【００５３】
【化１３】
【００５４】
アミノ基はハロゲン化スルホニル及びハロゲン化アリール（例えば２，４−ジニトロフルオロベンゼン）とも反応する。
【００５５】
【化１４】
【００５６】
アミノ基はまた、イソシアナート及びイソチオシアナートと反応して尿素又はチオ尿素誘導体を形成する。
【００５７】
【化１５】
【００５８】
イミドエステルはアミノ基の最も特異的なアシル化剤である。イミドエステルはｐＨ約７〜１０でアミンと特異的に反応してイミドアミド（ｉｍｉｄｏａｍｉｄｅ）を形成する。この反応には、元のアミノ基に正に帯電した基（イミドアミド）を生じることで電荷安定性を維持するという利点がある。イミドアミドはまた、中性より高いｐＨで徐々に加水分解される。このことも、加水分解によって癌細胞中にフリーの化学療法薬が放出される点で利点となり得る。
【００５９】
【化１６】
【００６０】
カルボキシル基は穏やかな酸条件下、例えばｐＨ５で、ジアゾアセタート及びジアゾアセトアミドと特異的に反応する。
【００６１】
【化１７】
【００６２】
カルボキシルの最も重要な化学修飾では、カルボジイミド、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）及び３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用する。アミン存在下でカルボジイミドは２段階でカルボキシルへのアミド結合を形成する。第１段階では、カルボキシル基がカルボジイミドに付加されてＯ−アシルイソ尿素中間体が形成される。その後のアミンとの反応によって対応するアミドが生成する。
【００６３】
【化１８】
【００６４】
特に重要なカルボジイミド反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてカルボキシルを活性化してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する際におけるその使用である。
【００６５】
【化１９】
【００６６】
活性化カルボキシルは単離するのに十分な安定性を有するが、その後容易にアミノ基と反応してアミド結合を形成する。
【００６７】
Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート（ＳＰＤＰ）等のスクシンイミドを用いてアミノ基を介して２個の化合物をカップリングさせることができる（ピアース・バイオテクノロジー社（ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のカタログ及びThorpe, P.E. et al. 1982, Immunol. Rev. 62:119-158参照）。
【００６８】
【化２０】
【００６９】
アルギニンはビシナルなジアルデヒド又はジケトン、例えばグリオキサール、２，３−ブタンジオン、及び１，２−シクロヘキサンジオンと反応する。安定化が所望される場合、ボラート（ｂｏｒａｔｅ）は付加体を安定化し得る。
【００７０】
【化２１】
【００７１】
上記の反応のいくつかによって反応性基を別の反応性基と交換することもできる。例えば、無水コハク酸等の酸無水物を用いてアミノ基を修飾することで、正に帯電したアミノ基がフリーのカルボキシル基で置換される。同様に、カルボキシル基とカルボジイミド及びジアミン（例えばエチレンジアミン）との反応は、カルボキシル基をフリーのアミノ基で置換する。
【００７２】
架橋：
上記反応性基を２個含む試薬、例えば２個のアミノ反応性基を含む試薬又はアミノ反応性基とチオール反応性基を含む試薬を用いて、適当な基の１つ、特にカルボキシル、アミノ、又はメルカプト、を含む白金錯体（又は白金と錯体を形成することができるリガンド）を別の適当な基を含むポリペプチドに架橋することができる。例えば、２個のアミン反応性基を有する架橋剤により、フリーのアミノ基を含む白金錯体をポリペプチドのアミノ基（リジン側鎖又はＮ末端アミノ）に架橋することができる。例えば、白金錯体又は白金リガンド上のフリーのアミノを、ジ−イミドエステル、例えばアジプイミド酸ジメチル−２−ＨＣｌ（ピアース・バイオケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．）製）によって、又はジスクシンイミジルエステル、例えばジスクシンイミジルグルタラート（ピアース・バイオケミカル社製）によって、ポリペプチド上のアミノにカップリングさせることができる。
【００７３】
カルボジイミド又はカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてカルボキシル（例えば、白金錯体のフリーのカルボキシル）を活性化させて（例えばタンパク質リガンドの）アミノ基と反応させてアミド結合架橋を形成させることができる。
【００７４】
リガンド又は試薬が市販されていない場合、有機化学者に公知の原理及び手法並びに文献５〜９に記載されている原理及び手法によって合成することができる。
【００７５】
具体的実施形態
式Ｉで表される白金錯体又は式ＩＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートの特定の実施形態では、Ｒ３〜Ｒ８はそれぞれＨである。別の実施形態では、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、Ｒ５〜Ｒ８はそれぞれＨである。
【００７６】
式Ｉで表される白金錯体又は式ＩＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートのいくつかの実施形態では、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、これは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルで置換されていてもよく、両方のアルキルに−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、オキソ、アミノ、カルボキシ、又はメルカプトで置換されていてもよい。この場合、白金に配位している２個のアミンが一緒に連結されて二座リガンドを形成する。
【００７７】
同様に、式ＩＩで表される錯体の特定の実施形態では、Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成し、これは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルで置換されていてもよく、両方のアルキルに−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、オキソ、アミノ、カルボキシ、又はメルカプトで置換されていてもよい。この場合、白金に配位している２個のアミンが一緒に連結されて二座リガンドを形成する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれＨであり、Ｒ９及びＲ１０は一緒に、カルボキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１３及びＲ１４は独立してＨ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。
【００７９】
式ＩＩで表される錯体の別の実施形態では、Ｒ９及びＲ１０は一緒に、カルボキシ又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１１〜Ｒ１４はそれぞれ独立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；Ｒ９〜Ｒ１４の少なくとも１つはカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである。
【００８０】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの特定の実施形態では、錯体はアミド結合によってポリペプチドに連結されている。したがって、リンカー部分はアミド結合の−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＮＨ−部分を含む。別の実施形態では、錯体はジスルフィド結合又はシッフ塩基又は還元シッフ塩基によってポリペプチドに連結されている。
【００８１】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法の特定の実施形態では、方法は、式Ｖで表される白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【００８２】
【化２２】
【００８３】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【００８４】
【化２３】
【００８５】
（式中、Ｌ１〜Ｌ６はそれぞれリガンドである。）を形成する工程を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートは式ＶＩＩＩで表されるコンジュゲートである：
【００８７】
【化２４】
【００８８】
式中、Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ２は１〜１００原子のリンカー部分であり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００８９】
別の実施形態では、式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートは式ＩＸで表されるコンジュゲートである：
【００９０】
【化２５】
【００９１】
式中、Ｒ２１は、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルで置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【００９２】
式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートは、癌を処置するための最終生成物にするために更なるリガンドの置換がなされてもよい。例えば、Ｌ１及びＬ２が二座ジアミンリガンドである場合、Ｌ３及びＬ４はヨード（ｉｏｄｉｄｅ）であってもよく、このヨードは後の工程において例えばクロリド、オキサラート、又はマロナートで置換されてもよい。
【００９３】
ポリペプチド
白金錯体にコンジュゲートさせるのに適したタンパク質の例としては、その受容体が癌細胞上で過剰発現されている成長因子又はホルモンが含まれる。上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、Ｉ型インシュリン様成長因子受容体、及びインスリン受容体は全て、ほとんどではなくとも多くの種類の癌において過剰発現されている。したがって、これらの受容体のリガンド、又は癌細胞に幾分特異的に結合するその他のポリペプチドが、白金錯体をより特異的に癌細胞に送達するために白金錯体に結合され得る。ポリペプチドリガンドはその受容体に結合した時に細胞によって内部移行されることが好ましい。これによって、白金錯体も効率的に癌細胞中に内部移行される。アゴニストは内部移行されるが、アンタゴニストは内部移行されないこともある。
【００９４】
当然ながら、インスリンはインスリン受容体の天然リガンドである。インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）はＩ型ＩＧＦ受容体の天然リガンドである。インスリン及びＩＧＦ−１は互いの受容体とも交差反応し、ＩＧＦ−２も両方の受容体に結合する。
【００９５】
しばしば癌細胞中で同じ種類の組織の正常細胞中よりも多く見られる別の受容体は上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体である（Nicholson, R.I. et al., 2001, Eur. J. Cancer 37:S9-S15；Kopp, R., et al, 2003, Recent Results in Cancer Research 162:115-132；Fox, S.B. et al., 1994, Breast Cancer Res. Treat. 29:41-49。ＥＧＦ受容体はＥｒｂＢ−１としても知られ、ＥＧＦ自身、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）等の複数のアゴニストによって活性化される（Beerli, R.R. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076；Earp, H.S., et al., 2003, Trans. Am. Clin. Clim. Assoc. 114:315-333）。３つのその他の受容体もＥＧＦファミリーの受容体の一員とみなされる。それらはＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、及びＥｒｂＢ−４（それぞれヒトＥＧＦ受容体２、３、及び４を意味するＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４としても知られる）である。これらの受容体、特にＥｒｂＢ−２も、癌細胞上で過剰発現されていることが多い。受容体ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−４はチロシンキナーゼである。上記のＥＧＦ受容体アゴニストはＥＧＦ受容体に最も強く結合する。ＥＧＦ受容体ファミリーに含まれる他の受容体にはこれらはそれほど強く結合しない。Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）／ヘレグリンはＥｂｒＢ−３及びＥｒｂＢ−４のリガンドである（Beerli, R.R., 1996, J. Biol. Chem. 271:6071-6076；Carraway, K.L. et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:14303-14306；Plowman, G.D., et al., 1993, Nature 366:473-475）。
【００９６】
したがって、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＴＣ、及びＮＤＦも白金錯体にカップリングされ得るタンパク質である。
【００９７】
例えばファージディスプレイライブラリー技術によってペプチドライブラリーをスクリーニングし、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ−２等の癌細胞上で過剰発現されている標的受容体タンパク質の１つに結合する非天然ペプチドを同定してもよい。これらのペプチドを前述の白金錯体とコンジュゲートさせてもよい。
【００９８】
これらの受容体又は癌細胞に比較的特異的なその他の標的に対する抗体を白金錯体とコンジュゲートさせることもできる。例としてＣＡ１２５に対する抗体が挙げられる。
【００９９】
したがって、ポリペプチドは、化学合成された短いペプチドから巨大なマルチサブユニットタンパク質までの如何なるサイズであってよい。
【０１００】
白金錯体にコンジュゲートさせる別の特定のポリペプチドはＩ型ＩＧＦ受容体への結合が低下しているＩＧＦ−１のバリアントである。
【０１０１】
特定の実施形態では、ポリペプチドはインスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、又はＥｒｂ−２のリガンドである。
【０１０２】
ＥＧＦ前駆体の配列が配列番号１である。成熟ＥＧＦでは、配列番号１のアミノ末端メチオニンが除去されている（Gregory, H., 1975, Nature 257:325-327）。ＴＧＦα前駆体の配列が配列番号２である。成熟ＴＧＦαは配列番号２の残基４０〜８９であると考えられている（Qian, J.F., et al., 1993, Gene 132:291- 296；Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。アンフィレギュリン前駆体の配列が配列番号３である。成熟アンフィレギュリンは配列番号３の残基１０１〜１８４であると考えられている（Plowman, G.D., et al., 1990, Mol Cell Biol. 10:1969-1981）。ＨＢ−ＥＧＦ前駆体の配列が配列番号４である。成熟ＨＢ−ＥＧＦは配列番号４の残基６３〜１４８であると考えられている（Higashayama, S. et al., 1992, J. Biol Chem. 267:6205-6212；Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。ベータセルリン前駆体の配列が配列番号５である。成熟ベータセルリンは配列番号５の残基３２〜１１１であると考えられている（Sasada, R. et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Comm. 190:1173-1179）。成熟ＥＧＦでは、配列番号１のシステイン残基７と２１、１５と３２、及び３４と４３が互いにジスルフィドブリッジを形成している（Gregory, H., 1975, Nature 257:325-327）。他の天然ＥＧＦ受容体リガンド中の相同なシステイン残基もジスルフィドブリッジを形成する（Higashayaam, S., et al., 1991, Science 251:936-939）。ＥＧＦ受容体の別のポリペプチドリガンドとして、天然ＥＧＦ受容体リガンドの配列のキメラ、例えば、ＥＧＦ配列とＴＧＦα配列とのキメラであり且つＥＧＦ又はＴＧＦαよりも活性なアゴニストであるキメラＥ４Ｔが挙げられる（Lenferink, A.E.G., et al., 1998, EMBO J. 17:3385-3397；Kramer, R.H., et al., 1994, J Biol. Chem. 269:8708-8711）。
【０１０３】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＥＧＦ受容体のリガンドであって、リガンドは、配列番号１の残基２〜５４、配列番号２の残基４０〜８９、配列番号３の残基１０１〜１８４、配列番号４の残基６３〜１４８、配列番号５の残基３２〜１１１、及びＥ４Ｔからなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。
【０１０４】
インスリンの構造は周知であり、米国特許出願公開第２００６０２５８５６９号に開示されている。ＩＧＦ−１のアミノ酸配列は配列番号６である。
【０１０５】
ＩＧＦ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニストであるペプチドリガンド並びにＩＧＦ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニストであるペプチドリガンドの同定方法の例は米国特許出願公開第２００４／００２３８８７号及び同第２００３／００９２６３１号に開示されている。アンタゴニストの１つはペプチドＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫ（配列番号７）である。
【０１０６】
ＩＧＦ−１受容体アゴニストのその他の例としては、米国特許第４，８７６，２４２号に開示されている、受容体を活性化するが可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下しているＩＧＦ−１のバリアントが含まれる。ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−１に結合してＩＧＦ−１の循環を維持し且つその生物学的半減期を延長する、天然の血清タンパク質である。本発明のＩＧＦ−１受容体リガンド、特に別個の分子として化学療法薬剤と共投与されるアゴニストのＩＧＦ−１結合タンパク質への結合が低下していることは、薬剤が放出されてＩＧＦ−１受容体に結合し易くなるため、利点となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１受容体のリガンド又はアゴニストは、天然ＩＧＦ−１と比較して、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下している。米国特許第４，８７６，２４２号に開示されているバリアントには、バリアントＩＧＦ−１がポリペプチド構造Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−ＬＣＧ−Ａ５−Ａ６−ＬＶ−Ａ７−ＡＬ−Ａ８−Ａ９−Ｒ１（式中、Ａ１はＧ、Ｖ、又はＦＶであり；Ａ２はＰ又はＮであり；Ａ３はＥ又はＱであり；Ａ４はＴ、Ｈ、又はＡであり；Ａ５はＡ又はＳであり；Ａ６はＥ又はＨであり；Ａ７はＤ又はＥであり；Ａ８はＱ又はＹであり；Ａ９はＦ又はＬであり；Ｒ１は配列番号８である。）を含む、バリアントが含まれる。具体的な実施形態では、Ａ１はＦＶであり、Ａ２はＮであり、Ａ３はＱであり、Ａ４はＨであり、Ａ５はＳであり、Ａ６はＨであり、Ａ７はＥであり、Ａ８はＹであり、及びＡ９はＬであり、したがって、バリアントは配列番号１４である。別の実施形態では、バリアントは、配列番号１４又は米国特許第４，８７６，２４２号に開示されている別のバリアントを含む。別の実施形態では、バリアントは配列番号８を含む。
【０１０７】
本発明の方法及びコンジュゲートに使用するための、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質への結合が低下した好ましいバリアントＩＧＦ−１の１つは、ＬＯＮＧ−Ｒ３−ＩＧＦ−１（配列番号１３）である（Francis, G.L., et al.l992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223；Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol. 137:413-421）。可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したその他のバリアントＩＧＦ−１としては、配列番号９〜１２、特に野生型ＩＧＦ−１の最初の３残基が欠けたＤｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１（配列番号１２）が含まれる。したがって、特定の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合が低下したバリアントＩＧＦ−１であるポリペプチドは配列番号９〜１３のいずれか１つを含む。
【０１０８】
好ましくは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したＩＧＦ−１受容体リガンドは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合親和性が野生型ＩＧＦ−１の５分の１以下、より好ましくは１０分の１以下、更により好ましくは１００分の１以下である。可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合親和性は、Francis, G.L., et al.（1992 J. Mol Endocrinol. 8:213-223）及びSzabo, L. et al.（1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:207-214）に記載されているように、精製ＩＧＦ−１結合タンパク質の混合物又はラットＬ６筋芽細胞馴化培地（ＩＧＦ−１結合タンパク質の天然生成混合物）を用いて標識ＩＧＦ−１（例えばＩ−１２５−ＩＧＦ−１）に対する競合結合アッセイにより測定することができる。好ましくは、Ｌ６筋芽細胞馴化培地中での可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合に対する標識野生型ＩＧＦ−１との競合結合アッセイにおけるバリアントＩＧＦ−１のＩＣ５０は、１０ｎＭ超、より好ましくは１００ｎＭ超である。
【０１０９】
好ましくは、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への親和性が低下したバリアントＩＧＦ−１は、野生型ＩＧＦ−１に近いＩＧＦ−１受容体への親和性を有する（例えば野生型ＩＧＦ−１の３０倍未満、より好ましくは野生型ＩＧＦ−１の１０倍未満）。具体的な実施形態では、（例えばＭＣＦ−７細胞上の）ＩＧＦ−１受容体への結合に対する標識野生型ＩＧＦ−１との競合結合アッセイにおけるバリアントＩＧＦ−１のＩＣ５０は、５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、更により好ましくは５ｎＭ未満、更により好ましくは３ｎＭ未満）である。このアッセイは、Ross, M. et al.（1989, Biochem. J. 258:267-272）及びFrancis, G.L., et al.（1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223）に記載されている。
【０１１０】
好ましくは、ポリペプチド及び／又はポリペプチド−白金コンジュゲートは、癌細胞に幾分特異的な標的受容体又は標的分子へのＫＤが１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満である。
【０１１１】
ほとんどのサイトカインは中性水溶液中で極度に可溶性ではない。したがって、可溶性を増大させるために、これらを血清アルブミンの全体又は一部等のより可溶性の高い配列との融合タンパク質として発現させてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、サイトカインの全体若しくは一部又は別のポリペプチド配列の全体若しくは一部を含む融合タンパク質である。
【０１１２】
ＥＧＦ前駆体：
ＭＮＳＤＳＥＣＰＬＳ ＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶ ＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹ ＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧ ＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ ＷＥＬＲ（配列番号１）
【０１１３】
ＴＧＦα前駆体
ＭＶＰＳＡＧＱＬＡＬ ＦＡＬＧＩＶＬＡＡＣ ＱＡＬＥＮＳＴＳＰＬ ＳＡＤＰＰＶＡＡＡＶ ＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳ ＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣ ＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡ ＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡ ＲＣＥＨＡＤＬＬＡＶ ＶＡＡＳＱＫＫＱＡＩ ＴＡＬＶＶＶＳＩＶＡ ＬＡＶＬＩＩＴＣＶＬ ＩＨＣＣＱＶＲＫＨＣ ＥＷＣＲＡＬＩＣＲＨ ＥＫＰＳＡＬＬＫＧＲ ＴＡＣＣＨＳＥＴＶＶ（配列番号２）
【０１１４】
アンフィレギュリン前駆体：
ＭＲＡＰＬＬＰＰＡＰ ＶＶＬＳＬＬＩＬＧＳ ＧＨＹＡＡＧＬＤＬＮ ＤＴＹＳＧＫＲＥＰＦ ＳＧＤＨＳＡＤＧＦＥ ＶＴＳＲＳＥＭＳＳＧ ＳＥＩＳＰＶＳＥＭＰ ＳＳＳＥＰＳＳＧＡＤ ＹＤＹＳＥＥＹＤＮＥ ＰＱＩＰＧＹＩＶＤＤ ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰ ＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴ ＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧ ＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲ ＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦ ＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫ ＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣ ＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲ ＣＧＥＫＳＭＫＴＨＳ ＭＩＤＳＳＬＳＫＩＡ ＬＡＡＩＡＡＦＭＳＡ ＶＩＬＴＡＶＡＶＩＴ ＶＱＬＲＲＱＹＶＲＫ ＹＥＧＥＡＥＥＲＫＫ ＬＲＱＥＮＧＮＶＨＡ ＩＡ（配列番号３）
【０１１５】
ＨＤ−ＥＧＦ前駆体
ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫ ＬＬＬＡＡＶＬＳＡＬ ＶＴＧＥＳＬＥＱＬＲ ＲＧＬＡＡＧＴＳＮＰ ＤＰＳＴＧＳＴＤＱＬ ＬＲＬＧＧＧＲＤＲＫ ＶＲＤＬＱＥＡＤＬＤ ＬＬＲＶＴＬＳＳＫＰ ＱＡＬＡＴＰＳＫＥＥ ＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧ ＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲ ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥ ＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ ＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧ ＥＲＣＨＧＬＳＬＰＶ ＥＮＲＬＹＴＹＤＨＴ ＴＩＬＡＶＶＡＶＶＬ ＳＳＶＣＬＬＶＩＶＧ ＬＬＭＦＲＹＨＲＲＧ ＧＹＤＶＥＮＥＥＫＶ ＫＬＧＭＴＮＳＨ（配列番号４）
【０１１６】
ベータセルリン前駆体：
ＭＤＲＡＡＲＣＳＧＡ ＳＳＬＰＬＬＬＡＬＡ ＬＧＬＶＩＬＨＣＶＶ ＡＤＧＮＳＴＲＳＰＥ ＴＮＧＬＬＣＧＤＰＥ ＥＮＣＡＡＴＴＴＱＳ ＫＲＫＧＨＦＳＲＣＰ ＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧ ＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴ ＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩ ＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦ ＹＬＲＧＤＲＧＱＩＬ ＶＩＣＬＩＡＶＭＶＶ ＦＩＩＬＶＩＧＶＣＴ ＣＣＨＰＬＲＫＲＲＫ ＲＫＫＫＥＥＥＭＥＴ ＬＧＫＤＩＴＰＩＮＥ ＤＩＥＥＴＮＩＡ（配列番号５）
【０１１７】
ＩＧＦ−１：
ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号６）
【０１１８】
配列番号７
ＳＦＹＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫ（配列番号７）
【０１１９】
配列番号８
ＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮ ＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲ ＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥ ＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰ ＡＫＳＡ（配列番号８）
【０１２０】
Ｌｏｎｇ−ＩＧＦ−１
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＥＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号９）
【０１２１】
Ｌｏｎｇ−Ｇｌｙ３−ＩＧＦ１
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＧＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号１０）
【０１２２】
Ｒ３−ＩＧＦ１
ＧＰＲＴＬＣＧＡＥＬ ＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱ ＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号１１）
【０１２３】
Ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ１
ＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡ ＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦ ＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳ ＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩ ＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤ ＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰ ＬＫＰＡＫＳＡ（配列番号１２）
【０１２４】
Ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ１：
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬ ＦＶＮＧＰＲＴＬＣＧ ＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶ ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬ ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡ ＫＳＡ（配列番号１３）
【０１２５】
インスリン−ＩＧＦ１ハイブリッド
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ ＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮ ＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲ ＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥ ＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰ ＡＫＳＡ（配列番号１４）
【実施例１】
【０１２６】
ヨード白金沈殿の形成を避けるために全ての手順を暗黒下又は薄明りの中で行う。
【０１２７】
＜Ｋ２ＰｔＩ４の形成＞
５ｇ（１２ｍｍｏｌ）のＫ２ＰｔＣＬ４の溶液をＫＩ（１２ｇ、７２ｍｍｏｌ）水溶液１８ｍｌで処理し、７０℃に加熱して冷ます（０．５時間）。生成物のＫ２ＰｔＩ４をろ過する。
【０１２８】
＜シス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２の形成＞
ろ過したＫ２ＰｔＩ４の溶液を１２〜１３ｍｌの２．０Ｍ ＮＨ３で処理する。３０分後、生成物のシス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２をろ過し、冷水で洗浄し、デシケーター中で乾燥させる。
【０１２９】
＜シス（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＣＨ（ＣＯＯ）３）の形成＞
シス（ＮＨ３）２ＰｔＩ２を２モル当量の硝酸銀と水溶液中で一晩撹拌する。次いで、ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液には生成物であるシス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２が含まれる。
【０１３０】
シス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２を１モル当量のＫ３ＣＨ（ＣＯＯ）３と混合する。この溶液を２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１１である。
【０１３１】
【化２６】
【０１３２】
この生成物混合物には硝酸カリウムも含まれる。
【０１３３】
＜タンパク質コンジュゲート化＞
白金錯体１１（３０μモル）をインスリン（２μモル）と共に３．４ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）中に溶解させる。架橋剤の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（３００μモル）を新たに０．６ｍｌのバッファーに溶解させ、タンパク質−錯体１１溶液に添加する。この溶液を室温で２時間反応させ、その後、透析バッグ（カットオフ３，５００ｍ．ｗ．）に入れる。溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に対して３時間透析し、その後、２ｍＭのＮａＯＨに対して一晩透析する。
【０１３４】
この生成物は、インスリンのアミノ基と錯体１１のフリーのカルボキシル基の間の直接アミド結合によりインスリン１個当たり約３個の錯体１１がコンジュゲートしたインスリン−白金コンジュゲートである。
【０１３５】
インスリンは尿素のない中性ｐＨでは溶解性が低く、尿素はより高い濃度の可溶性インスリンを可能にするので、透析バッファーは尿素を含む。同様に、インスリンは中性ｐＨよりも２ｍＭのＮａＯＨ中で溶解性が高いため、生成物を２ｍＭのＮａＯＨに対して透析する。尿素がＰｔのリガンドとして競合することが分かった場合には透析バッファーから尿素を省いてもよいが、インスリンの可溶性を維持するために反応混合物の体積を増やすべきである（比例して全成分の濃度が低くなる）。同様に、２ｍＭのＮａＯＨが白金錯体に悪影響を与えることが分かった場合、可溶性を維持するためにコンジュゲートの濃度をより低くして２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して生成物を透析してもよい。
【実施例２】
【０１３６】
本実施例では、ジカルボキシラート二座リガンドを最初にタンパク質にコンジュゲートさせ、その後、この修飾タンパク質を白金錯体に配位させて、実施例１と同じインスリン−白金コンジュゲートを形成する。
【０１３７】
ＣＨ（ＣＯＯ）３Ｎａ３（３０μモル）をインスリン（２μモル）と共に３．４ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に溶解させる。架橋剤の１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（３００μモル）を新たに０．６ｍｌのバッファーに溶解させ、インスリン溶液に添加する。この溶液を室温で２時間反応させ、その後、透析バッグ（カットオフ３，５００ｍ．ｗ．）に入れる。溶液を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４、６．５Ｍ尿素）に対して３時間透析し、その後、２ｍＭのＮａＯＨに対して一晩透析する。この生成物は、全てのアミノ基が−ＮＨＣＯＣＨ（ＣＯＯ）２Ｎａ２を形成するように修飾されたインスリンである。これにより、タンパク質のアミノ末端及び各リジン側鎖に二座ジカルボキシラート配位基（ｌｉｇａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が生じる。
【０１３８】
＜インスリン−白金コンジュゲートの形成＞
修飾されたインスリンを実施例１と同様に調製した４モル当量のシス−［（ＮＨ３）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２と混合する。このジカルボキシラートが水リガンドに取って代わり、コンジュゲート１２が形成される。
【０１３９】
【化２７】
【実施例３】
【０１４０】
本実施例では、錯体１３を作製し、インスリンにコンジュゲートさせる。
【０１４１】
【化２８】
【０１４２】
Ｋ２ＰｔＩ４（１２ｍｍｏｌ）を実施例１と同様に形成し、その後、１２〜１３ｍｌの２．０Ｍグリシンと混合する。３０分後、生成物のシス−（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２ＰｔＩ２沈殿物をろ過し、冷水で洗浄し、乾燥させる。
【０１４３】
シス−（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２ＰｔＩ２を２モル当量の硝酸銀と一晩撹拌する。沈殿したＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液にはシス−［（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２が含まれる。
【０１４４】
シス−［（ＣＯＯＨＣＨ２ＮＨ２）２Ｐｔ（ＯＨ２）２］（ＮＯ３）２を１モル当量のシュウ酸ナトリウムと混合する。この溶液を２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１３である。生成物混合物には硝酸カリウムも含まれる。
【０１４５】
インスリンとのコンジュゲート化を実施例１と同様に行う。この生成物は、インスリン１モル当たり約３個の錯体１３を有するコンジュゲート１４である。
【０１４６】
【化２９】
【実施例４】
【０１４７】
本実施例では、リジン残基及びＮ末端の第一級アミノ基を白金へのリガンドとして用い、白金をインスリンと錯体化する。Ｋ２ＰｔＩ４をインスリン及びアンモニアと３Ｋ２ＰｔＩ４：１インスリン：３ＮＨ３のモル比でインキュベートする。混合物を中性ｐＨの水溶液中で一晩撹拌する。インスリンには３個のアミノ基がある（１個のリジン及び成熟インスリンの２個のポリペプチドに対する２個のアミノ末端）ので、インスリン１個当たり３個のＰｔが錯体化され、各Ｐｔは、平均して、２個のＩに加えてインスリンの１個のアミノ基及び１個のＮＨ３によって錯体化される。
【０１４８】
次いで、この錯体を、Ｐｔ１モル当たり２モル当量の硝酸銀と一晩撹拌する。ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液を１モル当量のシュウ酸カリウムと混合し、一晩置く。生成物はコンジュゲート１５である。
【０１４９】
【化３０】
【実施例５】
【０１５０】
実施例１と同様に調製したＫ２ＰｔＩ４を１モル当量のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸（ＥＤＤＡ）で処理する。ＥＤＤＡを有する白金錯体をろ過し、冷水で洗浄する。次いで、２モル当量の硝酸銀と水溶液中で一晩撹拌する。次いで、ＡｇＩをろ過して取り除く。ろ液にはＥＤＤＡ−Ｐｔ（ＯＨ２）２（ＮＯ３）２が含まれる。ＥＤＤＡ−Ｐｔ（ＯＨ２）２（ＮＯ３）２を１モル当量のシュウ酸カリウムと混合し、２４時間置き、その後、真空下で蒸発させて乾燥させる。生成物は錯体１６である。
【０１５１】
【化３１】
【０１５２】
実施例１と同様に、インスリンのアミノ基とアミド結合を形成する錯体１６のフリーのカルボキシルを介して、錯体１６をインスリンにコンジュゲートさせて、コンジュゲート１７を形成する。
【０１５３】
【化３２】
【実施例６】
【０１５４】
本実施例では、実施例２でＣＨ（ＣＯＯＨ）３をインスリンにコンジュゲートさせたのと同様な手順で最初にＥＤＤＡをインスリンにコンジュゲートさせることでコンジュゲート１７を調製する。これによりコンジュゲート１８が生成する。
【０１５５】
【化３３】
【０１５６】
次いで、このコンジュゲートを実施例５と同様にＫ２ＰｔＩ４と反応させ、その後、実施例５と同様に硝酸銀及びシュウ酸カリウムと反応させて、Ｐｔが配位したコンジュゲート１７を形成する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ又はＩＩで表される白金錯体：
【化１】
式Ｉ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＮＸ２、ＳＨ、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；
式ＩＩ中
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＯＯＣ−ＣＯＯ−、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＯＨＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを形成してもよく；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも１つは、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項２】
前記錯体が式ＩＩで表されるものであり、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれＨであり、Ｒ９及びＲ１０が一緒に、カルボキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１３及びＲ１４が、独立して、Ｈ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項３】
前記錯体が式ＩＩで表されるものであり、Ｒ９及びＲ１０が一緒に、カルボキシ又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１１〜Ｒ１４が、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；Ｒ９〜Ｒ１４の少なくとも１つがカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項４】
前記錯体が式Ｉで表されるものであり、Ｒ３及びＲ４が一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成する、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項５】
式ＩＩＩ又は式ＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート：
【化２】
式ＩＩＩ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；
式ＩＶ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＣＯＯ−ＣＯＯ−、カルボキシ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；はＲ１１及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；Ｒ９及びＲ１０は一緒に１〜１００原子のリンカー部分を形成してもよく；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、又はＥＧＦ受容体のリガンドである、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｒ２又はＲ９のリンカー部分が、前記タンパク質又はペプチドの残基であるアミン又はカルボキシ基へのアミド結合連結の−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＮＨ−部分を含む、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＥＧＦ受容体のリガンドであり、前記リガンドが、配列番号１の残基２〜５４、配列番号２の残基４０〜８９、配列番号３の残基１０１〜１８４、配列番号４の残基６３〜１４８、配列番号５の残基３２〜１１１、及びＥ４Ｔからなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＩＧＦ−１受容体のリガンドであり、前記リガンドが、配列番号８〜１４からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１に記載の白金錯体を形成する工程；及び
前記請求項１に記載の白金錯体をリンカー反応物及びポリペプチドと反応させて請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートを形成する工程
を含む、ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法。
【請求項１１】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法であって、
白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【化３】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化４】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートが請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、方法。
【請求項１２】
式Ｖで表される白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【化５】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化６】
（式中、Ｌ１〜Ｌ６はそれぞれリガンドである）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩで表されるポリペプチド白金コンジュゲートが請求項２１に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートが式ＶＩＩＩで表されるコンジュゲートである、請求項１１に記載の方法：
【化７】
式中、Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項１４】
前記式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートが式ＩＸで表されるコンジュゲートである、請求項１１に記載の方法：
【化８】
式中、Ｒ２１は、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルで置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項１５】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法であって、
白金錯体を式ＶＩｂで表されるポリペプチド−リガンドコンジュゲート
【化９】
と反応させて式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化１０】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートが請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、方法。
【請求項１６】
式Ｘで表されるポリペプチド−白金錯体：
【化１１】
式中、Ｌ１は、Ｐｔのリガンドであるポリペプチドのアミノ、カルボキシ、又はスルフヒドリル基であり、Ｌ２〜Ｌ４はリガンドである。
【請求項１７】
癌に罹患している哺乳動物に請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートを投与すること
を含む、癌の処置方法。
【請求項１】
式Ｉ又はＩＩで表される白金錯体：
【化１】
式Ｉ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＮＸ２、ＳＨ、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；
式ＩＩ中
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＯＯＣ−ＣＯＯ−、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；Ｒ９及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＯＨＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを形成してもよく；
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の少なくとも１つは、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＨＯ、ＯＨＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項２】
前記錯体が式ＩＩで表されるものであり、Ｒ１１及びＲ１２がそれぞれＨであり、Ｒ９及びＲ１０が一緒に、カルボキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１３及びＲ１４が、独立して、Ｈ、カルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はメルカプト（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項３】
前記錯体が式ＩＩで表されるものであり、Ｒ９及びＲ１０が一緒に、カルボキシ又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルで置換されていてもよい−（Ｃ２〜Ｃ３）アルキル−を形成し；Ｒ１１〜Ｒ１４が、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、又はカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり；Ｒ９〜Ｒ１４の少なくとも１つがカルボキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項４】
前記錯体が式Ｉで表されるものであり、Ｒ３及びＲ４が一緒に（Ｃ２〜Ｃ３）アルキルを形成する、請求項１に記載の白金錯体。
【請求項５】
式ＩＩＩ又は式ＩＶで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート：
【化２】
式ＩＩＩ中、
Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり；
Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；
式ＩＶ中、
Ｌ１及びＬ２は、Ｃｌ−、ギ酸イオン、炭酸水素イオン、ＮＸ３、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、及び（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＣＯＯ−から選択されるリガンドであり、Ｌ１及びＬ２は一緒に−ＣＯＯ−ＣＯＯ−、カルボキシ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシ、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−ＮＸ２、又はＸ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル−カルボキシを形成してもよく；
Ｒ９は、１〜１００原子のリンカー部分であり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びＲ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；はＲ１１及びＲ１０は一緒に（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、ＨＯＯＣ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、Ｘ２Ｎ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキル、又はＨＳ−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキルを形成してもよく；Ｒ９及びＲ１０は一緒に１〜１００原子のリンカー部分を形成してもよく；
Ｌ１はＲ１３であってもよく、Ｌ２はＲ１４であってもよく；
各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、又はＥＧＦ受容体のリガンドである、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｒ２又はＲ９のリンカー部分が、前記タンパク質又はペプチドの残基であるアミン又はカルボキシ基へのアミド結合連結の−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＮＨ−部分を含む、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＥＧＦ受容体のリガンドであり、前記リガンドが、配列番号１の残基２〜５４、配列番号２の残基４０〜８９、配列番号３の残基１０１〜１８４、配列番号４の残基６３〜１４８、配列番号５の残基３２〜１１１、及びＥ４Ｔからなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＩＧＦ−１受容体のリガンドであり、前記リガンドが、配列番号８〜１４からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１に記載の白金錯体を形成する工程；及び
前記請求項１に記載の白金錯体をリンカー反応物及びポリペプチドと反応させて請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートを形成する工程
を含む、ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法。
【請求項１１】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法であって、
白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【化３】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化４】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートが請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、方法。
【請求項１２】
式Ｖで表される白金錯体を式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲート
【化５】
と反応させて式ＶＩＩで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化６】
（式中、Ｌ１〜Ｌ６はそれぞれリガンドである）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩで表されるポリペプチド白金コンジュゲートが請求項２１に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートが式ＶＩＩＩで表されるコンジュゲートである、請求項１１に記載の方法：
【化７】
式中、Ｒ１は、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルであり、Ｒ２は、１〜１００原子のリンカー部分であり；各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項１４】
前記式ＶＩで表されるポリペプチド−二座リガンドコンジュゲートが式ＩＸで表されるコンジュゲートである、請求項１１に記載の方法：
【化８】
式中、Ｒ２１は、（Ｃ１〜Ｃ７）アルキルで置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ２）アルキルであり、各Ｘは、独立して、Ｈ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルであり；
各アルキルは、飽和又は不飽和のいずれであってもよく、直鎖、分枝、又は環状のいずれであってもよく、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、又は＝Ｎ−が割り込んでいてもよく、ＯＨ、ハロ、又はオキソで置換されていてもよい。
【請求項１５】
ポリペプチド−白金コンジュゲートの製造方法であって、
白金錯体を式ＶＩｂで表されるポリペプチド−リガンドコンジュゲート
【化９】
と反応させて式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲート
【化１０】
（式中、Ｌ１〜Ｌ４はそれぞれリガンドである。）を形成する工程であって、前記式ＶＩＩｂで表されるポリペプチド−白金コンジュゲートが請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートである工程
を含む、方法。
【請求項１６】
式Ｘで表されるポリペプチド−白金錯体：
【化１１】
式中、Ｌ１は、Ｐｔのリガンドであるポリペプチドのアミノ、カルボキシ、又はスルフヒドリル基であり、Ｌ２〜Ｌ４はリガンドである。
【請求項１７】
癌に罹患している哺乳動物に請求項５に記載のポリペプチド−白金コンジュゲートを投与すること
を含む、癌の処置方法。
【公表番号】特表２０１２−５１６３３０（Ｐ２０１２−５１６３３０Ａ）
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４７９８０（Ｐ２０１１−５４７９８０）
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８７９７６
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０６１３７５２７）アイジーエフ オンコロジー エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０００２５０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８７９７６
【国際公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（５０６１３７５２７）アイジーエフ オンコロジー エルエルシー (3)
【Ｆターム（参考）】
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