抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物
【課題】 寒天多糖の分析方法及び分画方法、寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法、及び寒天由来の抗腫瘍活性を有するオリゴ糖組成物の提供。
【解決手段】 (1)セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又はその分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行う寒天多糖の分析方法、(2)寒天の水性溶液を寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持して、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら溶出を行う寒天多糖の分画方法、(3)寒天又はその分画物の水溶液を酸の規定度が0.001〜0.2Ｎの水溶液とし、温度を60〜105℃に保持して多糖類の加水分解を行う寒天又はその分画物中の多糖のオリゴ糖化方法、及び(4)上記分画方法で分画した特定の寒天の画分を上記オリゴ糖化方法で加水分解して得られる抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【解決手段】 (1)セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又はその分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行う寒天多糖の分析方法、(2)寒天の水性溶液を寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持して、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら溶出を行う寒天多糖の分画方法、(3)寒天又はその分画物の水溶液を酸の規定度が0.001〜0.2Ｎの水溶液とし、温度を60〜105℃に保持して多糖類の加水分解を行う寒天又はその分画物中の多糖のオリゴ糖化方法、及び(4)上記分画方法で分画した特定の寒天の画分を上記オリゴ糖化方法で加水分解して得られる抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寒天多糖の分析方法、寒天多糖の分画方法、寒天又はその分画物中の多糖のオリゴ糖化方法、及び寒天由来の抗腫瘍活性を有するオリゴ糖組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本では食生活の欧米化に伴い、生活習慣病が増加しており、その要因の一つとして食物繊維摂取量の減少が考えられている。食物繊維は消化吸収されず、従来は非栄養素であるとされていたが、排便を円滑にし、有害物質を吸着・排除する効果があることなどから、第六の栄養素であるとして見直されてきている。そこで、食物繊維を豊富に含む海藻が注目されるようになった。海藻には、ビタミン、タンパク質、ミネラルなども豊富に含有されており、健康食品として話題になっている。
【０００３】
ところで、海藻の多糖類は、セルロースなどの藻体の骨格を作る骨格多糖類、デンプンやラミナランなどの光合成産物である貯蔵多糖類、及びアルギン酸などの細胞間を充填する粘質多糖類の３種類に分類される。粘質多糖類には、抗腫瘍活性、血圧降下作用、コレステロール低下作用、抗酸化作用ならびに抗血液凝固作用などの生物活性を有するものが多数報告されている。
【０００４】
海藻類の中で、紅藻は、寒天に加工されて古くから利用されてきた。寒天は、和菓子等の食品における利用を初めとして、工業用、医療用、化粧品用及び試薬用（細菌培地、組織培養）等、様々な用途で使用されている。そして、近年になり、寒天の様々な生理機能が明らかとされ、よって、寒天に対する健康を促進する食品としての期待が高まっている。
【０００５】
寒天の原料は紅藻で、主としてテングサ属（Gelidium）、オゴノリ属（Gracilaria）、オバクサ属（Pterocladia）、イタニグサ属（Ahnfeltia）等に属する紅藻類が利用されている。天草の主産地は日本、モロッコ、チリ、韓国、スペイン等であり、オゴノリの主産地はチリ、南アフリカ、アルゼンチン、日本等である。このように、寒天の原料及び産地は種々様々であるが、そのような原料や産地の相違よる成分組成、物性、構成糖、硫酸基含量や生物活性の相違等は、明らかとされていない。特にその構成多糖に関しては、寒天が常温で固化するため、これまでは分析や分画が為されてこなかった。わずかに、非特許文献１に、寒天の精製方法と、寒天の主成分の一つであるアガロースが、Ｄ−ガラクトース残基と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基が交互にくる線状多糖からなることが記載されているのみである。
【０００６】
一方、１９７０年代から種々のオリゴ糖が開発され、それらの機能、具体的には、非う触性、腸内菌叢改善作用、ミネラル吸収促進作用、免疫賦活作用等の生理機能や生体調節機能に関する研究が活発になされてきている。また、世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、２００５年、世界の死亡者の１３％は、悪性腫瘍による死亡である。日本でも、１９８１年からは悪性腫瘍が死因のトップとなっており、２００６年度における死因の３割が悪性腫瘍である。このような状況下、世界中において、抗腫瘍活性を有する物質の探索が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｅｌｌａｎ Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ６１（１９７１）ｐｐ．７３−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、多糖を多く含有する寒天に着目した。そして、寒天多糖からも、様々な生理機能や生体調節機能を有するオリゴ糖を得ることが可能であると考えた。しかし、そのような研究を行うためには、先ず、寒天の物理的・化学的特性を明らかにし、また寒天に含まれる有用成分の生理機能等を明らかにする必要があると考え、そのためには、寒天多糖の分析、分画方法を確立する必要があると考えた。
【０００９】
本発明の目的は、寒天多糖の分析方法を提供することにある。また、本発明の目的は、寒天多糖の分画方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法を提供することにある。そして、本発明の目的は、寒天由来の抗腫瘍活性を有するオリゴ糖組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、寒天多糖の分析方法及び分画方法を開発すべく、鋭意検討した。その結果、本発明をなすに至った。
【００１１】
即ち本発明は、セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を電気泳動することからなる寒天多糖の分析方法であって、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行うことを特徴とする寒天多糖の分析方法に関する。
【００１２】
本発明は、セルロースアセテート膜又は濾紙を用い、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を寒天が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行い、泳動後に検出されたスポットの位置及び数から、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定することを特徴とする、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定する方法にも関する。
【００１３】
本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行うことを特徴とする寒天多糖の分画方法に関する。
【００１４】
また、本発明者らは、寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法を開発すべく、鋭意検討した。その結果、本発明をなすに至った。
【００１５】
即ち本発明は、寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことを特徴とする寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法に関する。
【００１６】
さらに、本発明者らは、寒天由来のオリゴ糖組成物の生理活性について検討し、寒天からの特定の分画物中の多糖類を加水分解してなるオリゴ糖組成物が、抗腫瘍活性を示すことを見いだし、本発明を完成させた。
【００１７】
即ち本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物に関する。
【００１８】
また、本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、寒天の室温におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、寒天の６０℃におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、寒天全糖及びその分画物の６０℃におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、寒天全糖及びその分画物のゲルの平均最大荷重を示すグラフである。
【図５】図５は、寒天全糖及びその分画物のゲルの最大荷重を示すチャートである。
【図６】図６は、傾けたエッペンドルフ内での寒天全糖及びその分画物のゲルの状態を示す写真である。
【図７】図７は、寒天全糖及びその分画物のゲルの見かけ粘度を示すグラフである。
【図８】図８は、寒天全糖のガスクロマトグラムである。
【図９】図９は、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物のガスクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物のガスクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３５．５分）である。
【図１２】図１２は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３５．８分）である。
【図１３】図１３は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３７．３分）である。
【図１４】図１４は、寒天全糖の加水分解物（オリゴ糖化物）の薄層クロマトグラムである。
【図１５】図１５は、分子量検量線を示す。
【図１６】図１６は、寒天全糖の各加水分解条件におけるオリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、寒天全糖由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、蒸留水で溶出された寒天分画物（非吸着画分）由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２１】図２１は、０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＨＬ−６０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ＨＬ６０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＨＬ６０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２９】図２９は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図３０】図３０は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図３１】図３１は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を加えた系（濃度は５０μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図３２】図３２は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を加えた系（濃度は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図３３】図３３は、腫瘍細胞を移植したマウスに寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を投与（１００μｇ／ｋｇ又は５００μｇ／ｋｇ）した場合における、マウス生存数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、発明を実施するための形態に基づき、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明の寒天多糖の分析方法は、セルロースアセテート膜又は濾紙を用いた電気泳動によって行う。電気泳動に使用するセルロースアセテート膜や濾紙は市販されているので、それらを用いればよい。
【００２２】
本発明に係る寒天多糖の分析方法の特徴は、セルロースアセテート膜又は濾紙に寒天又は寒天の分画物の水性溶液をスポットした後、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行う点にある。ここで、スポットする水性溶液における寒天又は寒天の分画物（固形分）の濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜３．０％程度である。また、水性溶液は、好ましくは水溶液である。
【００２３】
寒天は、その産地や原料海藻の種類によって溶解温度が異なる。従って、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度は一概には決められないが、例えば４０℃〜７０℃である。寒天又は寒天の分画物が溶解状態にある温度では、その構成成分である多糖類がランダム状態を維持するので、電気泳動が可能である。
【００２４】
寒天は、その産地や原料海藻の種類によって構成多糖類も相違する。そこで、上記の方法で電気泳動を行えば、泳動スポットの位置や数の相違から、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定することができる。
【００２５】
本発明の寒天多糖の分画方法では、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら溶出を行う。この際、分画はバッチ法でもカラムクロマト法でもかまわない。
【００２６】
イオン交換樹脂に寒天を付与した後の溶出は、先ず、水で行う。このとき、非吸着物が流出してくるので、それを「非吸着画分」という。その後、無機塩水溶液を使用して、イオン交換樹脂に保持された成分を溶出させる。
【００２７】
無機塩水溶液での溶出にあたり、使用する無機塩の種類は特に限定されないが、塩化ナトリウムが好ましい。無機塩濃度も特に限定されないが、例えば０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲内において、適当な範囲を選択することが好ましく、０．２Ｍ〜２．０Ｍの範囲内で無機塩濃度を変化させていくことがより好ましい。
【００２８】
溶出された試料は、透析等によって脱塩することが好ましい。また、溶出された試料や透析後の試料は、凍結乾燥等の方法によって粉体化されてもよい。
【００２９】
本発明は、多糖類のオリゴ糖化方法にも関する。本発明では、寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことにより、オリゴ糖を得る。酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液を調製するために、通常は、寒天又は寒天の分画物の水溶液に酸を添加するか、寒天又は寒天の分画物を酸の水溶液に溶解させる。
【００３０】
使用する酸の例としては、塩酸、硫酸等の強酸や、酢酸などが挙げられ、強酸が好ましく、塩酸がさらに好ましい。加水分解の際、寒天又は寒天の分画物含有水溶液における酸の規定度は０．００１Ｎ〜０．２Ｎであり、０．００５Ｎ〜０．１Ｎが好ましく、０．０２Ｎ〜０．０５Ｎがさらに好ましい。また、温度は６０℃〜１０５℃であり、８０℃〜１０５℃が好ましく、９０℃〜１００℃がさらに好ましい。
【００３１】
加水分解に要する時間は特に限定されないが、１０〜１２０分間程度が好ましく、１５〜６０分間程度がさらに好ましい。
【００３２】
本発明は、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物にも関する。「オリゴ糖組成物」とは、オリゴ糖一種以上と他の成分とを含有するか、オリゴ糖を二種以上含有するものを指す。抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物には二種類あり、その一つは、上記の本発明に係る寒天多糖の分画方法で、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解することによって得られ、他方は、上記の本発明に係る寒天多糖の分画方法で、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解することによって得られる。これを凍結乾燥等の方法で粉体化してもよい。
【００３３】
「０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度での溶出」や、「０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度での溶出」を行うに際し、無機塩濃度は、段階的に変化させてもよく、また、グラディエントで変化させてもよい。また、加水分解は、０．００１Ｎ〜０．２Ｎの酸（好ましくは強酸）の存在下に行うことが好ましく、その時間は、１０〜１２０分間程度である。
【００３４】
本発明に係る抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物を得るための最もよい条件は、次の通りである。
（１）約６０℃に温めておいた陰イオン交換樹脂に、９０〜１００℃に加熱しておいた寒天水溶液（濃度：１〜１００ｍｇ／ｍｌ程度）を加える。
（２）順に、蒸留水、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ及び１．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液で、バッチ法により溶出する。
（３）各溶出液を透析に供して脱塩し、その後、凍結乾燥する。
（４）凍結乾燥品の水溶液（濃度：０．１〜１．０％程度）に塩酸を加え、０．０１〜０．１Ｎとする。９０〜１００℃で、１５〜６０分間加水分解を行う。
（５）公知の方法により、精製を行う。
【００３５】
本発明に係る分画法において、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出される画分に含有される多糖類と０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出される画分に含有される多糖類は、いずれも、その構成糖として３，６−アンヒドロガラクトースとガラクトースとを含有する。従って、これらの画分に含有される多糖を加水分解してなるオリゴ糖も、その構成糖として３，６−アンヒドロガラクトースとガラクトースとを含有すると考えられる。しかし、同定されていない物質も含有している。
【００３６】
また、オリゴ糖の分子量は、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料の加水分解物では約７５０（単一）であり、一方、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料の加水分解物では、約１６００と約１２，０００（二種類）であった。
【００３７】
本発明に係る抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物二種は、実施例５に示すように、マウスにおいて抗腫瘍活性を示した。これらの組成物を用いた薬剤の剤型は限定されないが、注射剤、経口剤等に加工することができる。また、その投与量も、特に限定されない。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【００３９】
［実施例１］電気泳動による寒天多糖分析方法の検討
（１）材料
寒天ＸＲ−２３９
寒天ＸＲ−２４０
寒天ＸＲ−２４１
これらの寒天は、伊那食品工業株式会社より分与していただいた。また、これらの寒天の種類、産地及び基本物性は、表１に示すとおりであった。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（３）セルロースアセテート膜電気泳動
（３−１）方法
電解液として０．４ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液を用い、５ｍｇ／ｍｌ寒天水溶液を幅１ｃｍの帯状にスポットした。比較対照として、スサビノリ由来ポルフィラン（伊那食品工業株式会社；細胞壁を構成する水溶性食物繊維）、フクロフノリ由来フノラン（伊那食品工業株式会社；食物繊維）、κ−カラギーナン（ＳＩＧＭＡ；直鎖含硫黄多糖類）、アルギン酸（和光純薬工業株式会社；多糖類の食物繊維）、フコイダン（理研ビタミン株式会社；硫酸多糖類）の各々１ｍｇ／ｍｌ水溶液を用いた。泳動は、室温と６０℃インキュベーター内の二条件で、１ｍＡ／ｃｍで１２０分間行った。
【００４２】
（３−２）結果
室温での泳動結果を図１に、６０℃での泳動結果を図２に示す。
【００４３】
室温での泳動では、寒天３種のうち、寒天２３９で不明瞭なスポットが検出されたのみであり、他の２種ではスポットは検出されなかった。ノリの繊維であるポルフィランからも、スポットは検出されなかった。フノリから得られるフノラン、スギノリやツノマタなど紅藻から得られるκ−カラギーナン並びに褐藻から得られるアルギン酸は、泳動方向に広いピークを示した。同じく褐藻から得られるフコイダンは、明瞭なスポットを示した。
【００４４】
６０℃での泳動では、寒天２３９が、室温における泳動に比べてより明瞭なスポットを示した。寒天２４０、寒天２４１及びノリ抽出物においても、スポットが検出された。フノラン及びκ−カラギーナンは、室温泳動時と同様に、泳動方向に広いピークを示した。
【００４５】
室温条件下で泳動バンドが検出できない理由として、寒天がゲル化して泳動されなかったことが考えられる。唯一バンドが検出できたＸＲ−２３９は、凝固点が４５℃（伊那食品工業株式会社による）であり、室温では全成分が溶解しているとは考えられない。よって、一部の成分のみが泳動されたことが示唆される。この一部の成分の凝固点は、室温よりも低い可能性がある。
【００４６】
一方、加温（６０℃）条件下では、泳動が可能であった。また、そのバンドはすべて陽極側に泳動していたことから、構成糖が酸性糖であることが分かった。泳動スポットは、ＸＲ−２３９では１本、ＸＲ−２４０では２本、ＸＲ−２４１では３本が確認でき、しかもそれぞれ泳動距離が異なっていた。
【００４７】
以上の結果より、加温電気泳動法により、原料や産地の異なる寒天が、その構成成分においても異なることが明らかとなった。また、この方法により、寒天の産地や原料海藻の特定が可能になると考えられた。
【００４８】
［実施例２］寒天多糖の分画方法の検討
（１）材料
寒天ＸＲ−２４１
【００４９】
（２）陰イオン交換樹脂を用いた寒天多糖の分画
陰イオン交換樹脂として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０Ｍを用いた。６０℃に温めておいた約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂に、９５℃に加熱しておいた寒天ＸＲ−２４１水溶液（濃度：２５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、陰イオン交換樹脂を約６０℃に保ちながら、順に、蒸留水、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ及び１．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液（各１５０ｍｌ）でバッチ法により溶出した。各溶出液は、４℃にて３日間透析し、その後、ナス型フラスコを用いて凍結乾燥した。
【００５０】
（３）セルロースアセテート膜電気泳動
（２）で得られた分画物を、セルロースアセテート膜電気泳動に供した。電解液として０．４ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液を用い、５ｍｇ／ｍｌ寒天分画物凍結乾燥品の水溶液を幅１ｃｍの帯状にスポットした。泳動は１ｍＡ／ｃｍで２時間半行った。泳動の間、常に６０℃に加熱した。
【００５１】
（４）結果
泳動結果を図３に示す。
【００５２】
蒸留水で溶出した画分（以下、「非吸着画分」という）、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．２５Ｎ画分」という）、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．５Ｎ画分」という）、及び０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．７５Ｎ画分」という）においては一本の、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．０Ｎ画分」という）においては二本の明瞭なスポットが検出された。全糖では上下に広いピークが検出されており、この広いピークが、非吸着画分から１．０Ｎ画分において分離されたことがわかる。分画時に用いた塩化ナトリウムの濃度が高くなるにつれて、泳動距離も長くなった。１．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．２５Ｎ画分」という）及び１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．５Ｎ画分」という）では、スポットを検出できなかった。
【００５３】
［実施例３］分画物の物理的、化学的性状の検討
（１）ゲルの固さの測定
（１−１）クリープメータによる測定
（１−１−１）方法
寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の１％水溶液を、沸騰水浴させて溶解させることによって調製し、充分に撹拌した後に冷蔵し、ゲル化させた。室温（約２０℃）に戻してから、クリープメータ（株式会社山電）を用いて物性を測定した。クリープメータの測定条件は、表２に示すとおりであった。ゲルの固さの指標として最大荷重を採用した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（１−１−２）結果
結果を図４に示す。平均最大荷重は、全糖が最も高く、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分の順で低くなっていった。非吸着画分は、ゲル化能が著しく低いため、クリープメータでは測定不可能であった。
【００５６】
（１−２）破断曲線の測定
（１−２−１）方法
寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の１％水溶液を、沸騰水浴させて溶解させることによって調製し、充分に撹拌した後に冷蔵し、ゲル化させた。室温（約２０℃）に戻してから、クリープメータを用いてゲルの硬さを測定した。ゲルの硬さの測定条件は、容器として内径８ｍｍのエッペンドルフを用いたこと以外は、表２に示すものと同様であった。ゲルの固さの指標として最大荷重を採用し、測定時間の経過による最大荷重の変化をチャートに記載した。なお、寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分については、各々三試料について測定を行った。
【００５７】
（１−２−２）結果
結果を図５に示す。全糖で最も破断曲線が高い位置となり、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分の順で低くなった。０．７５Ｎ画分及び非吸着画分は、ともにゲル化能が弱く、破断曲線のみでは両者の比較はできなかった。
【００５８】
（１−３）エッペンドルフ内でのゲルの状態の観察
（１−３−１）方法
視覚的にゲルの固さを表現するため、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ内で、寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の０．５％水溶液を、上記と同様の方法で調製した。これを冷蔵してゲル化させ、室温に戻し、真横に倒した時の様子を観察した。
【００５９】
（１−３−２）結果
結果を図６に示す。全糖がゲル化能が最も高く、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分の順にゲル化能が低下した。０．７５Ｎ画分及び非吸着画分は、ゲル化能が著しく低かった。
【００６０】
（１−４）回転粘度形による粘度の測定
（１−４−１）方法
ＥＭＤ回転粘度計（Tokimec社）によって、粘度を測定した。測定条件は、次の通りであった。
（測定条件）
温度： ２０℃
画分の凍結乾燥品の濃度： ０．５％
回転速度： ５０ｒｐｍ
コーンの種類： １°、３４´
【００６１】
寒天ゲルは非ニュートン流体であるため、結果は見かけ粘度（μ）で表した。見かけ粘度は次の公式により求めた。
見かけ粘度（μ）＝Ｋｎ・θ（ｍＰａ・ｓ）
Ｋｎ： 換算乗数（Tokimec ＥＭＤ型、５０ｒｐｍでは２．５６）
θ：目盛指度
【００６２】
（１−４−２）結果
結果を図７に示す。全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分の順に粘度が高かった。また、クリープメータではゲルの硬さを測定することができなかった非吸着画分も、測定が可能であった。
【００６３】
（２）硫酸基濃度の測定
（２−１）方法
硫酸基濃度はドッジソン法を用いて測定した。寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに、等量の８Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１００℃にて３時間、加水分解した。その後、減圧乾固し、残渣を蒸留水１ｍｌに溶解させた。このように調製した水溶液０．２ｍｌを試験管に取り、４％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液３．８ｍｌと塩化バリウム−ゼラチン水溶液（塩化バリウム：特級ゼラチン：水＝１ｇ：１ｇ：２００ｍｌ）１ｍｌとを加えた。２０分間室温で放置した後、吸光度（３６０ｎｍ）を測定した。スタンダードには硫酸を用いた。
【００６４】
（２−２）結果
結果を表３に示す。硫酸基濃度は、０．５Ｎ画分が最も高く、次いで全糖であり、それ以降は非吸着画分、０．２５Ｎ画分の順で低くなり、０．７５Ｎ画分が最も低かった。分画時のＮａＣｌ濃度と硫酸基濃度に比例関係はなかったものの、画分により大きな差があることが明らかになった。
【００６５】
【表３】
【００６６】
（３）ガスクロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ−マススペクトル法による構成糖の検討
（３−１）方法
寒天の構成糖を調べるために、ガスクロマトグラフ法（ＧＬＣ）を採用した。スタンダードとして、グルコース、ガラクトース、フルクトースを用いた。
【００６７】
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品１ｍｇに１０％塩酸−メタノールを１ｍｌ添加した。その後、１００℃で１６時間加熱することにより、多糖を完全に分解した。窒素ガス通気で乾固した後、水を加えて糖の１０％水溶液を調製した。含水糖試料用トリメチルシリル化剤ピリジン溶液（ＴＭＳ−ＰＺ）試薬（東京化成工業株式会社）５００μｌに糖の１０％水溶液５μｌを加え、30秒間振り混ぜた。その後、ウォーターバスを用い、６０℃にて１５分間の温浴をし、ＴＭＳ誘導体とした。このように調製された混合液１μｌを、ＧＬＣ分析に供した。ＧＬＣの条件は、次の通りであった。また、マススペクトルも測定した。
【００６８】
（条件）
カラム： ＤＢ１７（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
カラム温度： １５０〜２５０℃(昇温速度：２℃／分)
インジェクション温度： ２３０℃
キャリアガス： Ｎ２（１ｍｌ／分）
検出： 水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）
【００６９】
（３−２）結果
寒天全糖を用いた場合のガスクロマトグラムを図８に、０．２５Ｎ画分を用いた場合のガスクロマトグラムを図９に、０．７５Ｎ画分を用いた場合のガスクロマトグラムを図１０に示した。また、寒天全糖を用いた場合のマススペクトルを図１１乃至図１３に示した。各サンプルの構成多糖は、次の通りであった。
【００７０】
（寒天全糖）
ガスクロマトグラム（図８）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク１とピーク３は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク２とピーク４はガラクトースであると推定された。ピーク５は同定することができなかった。
【００７１】
（０．２５Ｎ画分）
ガスクロマトグラム（図９）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク６とピーク９は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク８とピーク１０はガラクトースであると推定された。ピーク７は図８には出現しなかったピークであり、未同定である。また、ピーク１１は、保持時間が同一であるので、ピーク５（図８）と同一の物質である。
【００７２】
（０．７５Ｎ画分）
ガスクロマトグラム（図１０）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク１４は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク１３とピーク１５はガラクトースであると推定された。ピーク１２は、保持時間が同一であるので、ピーク７（図９）と同一の物質である。また、ピーク１６は、保持時間が同一であるので、ピーク５（図８）及びピーク１１（図９）と同一の物質である。図８及び図９と比較して、ピーク１６が相対的に大きなピークであることが、このガスクロマトグラムの最大の特徴である。
【００７３】
なお、図１１は、保持時間３５．５分で、ガラクトースのスペクトルである。ガスクロマトグラムにおけるピーク２、４、８、１０、１３及び１５は、すべてこのスペクトルとほぼ同様の結果を示した。
【００７４】
図１２は、保持時間３５．８分で、３，６−アンヒドロガラクトースのスペクトルであると考えられる。ガスクロマトグラムにおけるピーク１、３、６、９及び１４は、すべてこのスペクトルとほぼ同様の結果を示した。
【００７５】
図１３は、保持時間３７．３分であるが、この物質は未同定である。ガスクロマトグラムにおけるピーク５、１１及び１６は、すべてこのスペクトルと同様の結果を示した。この物質は、図１０の０．７５Ｎ画分のガスクロマトグラムにおいて、相対的に大きなピークを示した物質であり、今後の構造解析が待たれる。
【００７６】
［実施例４］寒天多糖のオリゴ糖化の検討
（１）薄層クロマトグラフィーによる検討
（１−１）方法
寒天全糖のオリゴ糖化を試みた。寒天全糖５ｍｇに、塩酸水溶液（０．０５Ｍ（＝０．０５Ｎ）又は０．１Ｍ（＝０．１Ｎ））もしくは酢酸水溶液（０．０５Ｍ（＝０．０５Ｎ）又は０．１Ｍ（＝０．１Ｎ））８ｍｌを加え、３７℃のインキュベーター内で５時間、加水分解を行い、その後、減圧乾固させた。これを少量の水に溶解した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣにはシリカゲル６０Ｆ２５４シートを用い、展開溶媒には酢酸エチル：酢酸：水 （２：１：１（容量比））を用いた。比較対照には、ガラクトースを用いた。検出は、濃硫酸を噴霧し、１２０℃に加熱して行った。
【００７７】
（１−２）結果
結果を図１４に示す。０．０５Ｍ塩酸水溶液で加水分解されたものと、０．１Ｍ塩酸水溶液で加水分解されたものとを比較すると、いずれもガラクトースのスポットが明確であるから、塩酸の場合には０．０５Ｍで十分に加水分解が行われたことがわかる。一方、酢酸による加水分解では、スポットが著しく不明確であることから、濃度が０．１Ｍでも、加水分解は十分には行われなかったことがわかる。
【００７８】
（２）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検討
（２−１）各加水分解条件における寒天全糖由来オリゴ糖の分子量の推定
（１）のＴＬＣの結果を踏まえ、加水分解に用いる塩酸の濃度、加水分解時の温度及び時間の最適条件を検討するために、ＨＰＬＣを用いて得られたオリゴ糖の分子量を推定した。
【００７９】
（２−１−１）方法
予め加熱溶解した０．２５％寒天水溶液を、以下の各加水分解条件においてオリゴ糖化し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）モードのＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、表４に記載の通りである。なお、カラムはＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製；φ７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、移動相は０．０１ＮのＴＦＡであり、流速は１ｍｌ／分、検出にはラジオアイソトープを使用した。また、分子量標準物質として、市販のプルランシリーズ Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２、ラクトース（関東化学製）、ガラクトース（ＳＩＧＭＡ製）を用いた。これらの分子量は、表５に示した。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
（２−１−２）結果
得られた分子量検量線を、図１５に示す。図１５では、ラクトースの溶出量に対する相対値を用いた。近似曲線は三次曲線となった。
【００８３】
検討条件(1)、(4)及び(7)におけるＨＰＬＣのクロマトグラムを図１６に示す。(1)の加水分解条件では、加水分解が不十分のため、上下に広いピークが現れた。(4)の加水分解条件では、塩酸の濃度が高くなったことにより分解が進み、二つのピークが現れた。(7)の加水分解条件では、(4)の二つのピークとそれぞれほぼ同一の保持時間にピークが現れたが、前半に現れるピークの、後半のピークに対する相対的大きさが異なっていた。
【００８４】
（２−２）寒天分画物由来オリゴ糖の分子量推定
（２−２−１）方法
予め加熱溶解した寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品の０．２５％水溶液であって塩酸濃度が０．０２５Ｎのものを、１００℃に２０分間保持して多糖を加水分解し、オリゴ糖を得た。得られたサンプルをＧＰＣモードのＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの実施に使用したカラムはＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製；φ７．８ｍｍ×３０ｃｍ）であり、移動相は０．０１ＮのＴＦＡであり、流速は１ｍｌ／分、検出にはラジオアイソトープを使用した。また、カラムは温度２７℃であった。
【００８５】
（２−２−２）結果
オリゴ糖の原料と、得られたオリゴ糖それぞれの分子量、糖数（グルコース換算）を表６に示す。画分により、オリゴ糖の分子量に大きく差があることがわかる。また、寒天全糖由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に、非吸着画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１９に、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図２０に、そして０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示す。
【００８６】
全糖由来オリゴ糖と０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖は、分子量が一種類であり、非吸着画分由来オリゴ糖、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖及び０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖は、それぞれ図１８、図２０及び図２１においてピークが二つに分かれたことから明らかなように、二種類の分子量を有する。
【００８７】
【表６】
【００８８】
［実施例５］抗腫瘍活性の測定
（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性の測定
（１−１）寒天多糖の抗腫瘍活性
（１−１−１）方法
実施例１で使用した寒天Ｘ−２４１のＰＢＳ溶液（寒天濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。４８穴プレートを用い、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０（マウス腹水腫由来）、ＨＬ６０（ヒト白血病由来）及びＫＭＳＴ−６（胎児線維芽細胞由来）の各細胞を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合で各ウェルに浮遊させ、ここに、寒天としての最終濃度が５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌになるように、寒天のＰＢＳ溶液を加えた。コントロール用には、同量のＰＢＳを加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件で、インキュベーター内で培養した。培養開始から、２４時間、４８時間、７２時間後に、細胞を含む培養液を採取し、それに０．５％トリパンブルー水溶液を加え、染色されなかった生細胞数を、血球計算板を用いて計測した。また、Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＬＤＨ活性を指標として細胞毒性を評価した。
【００８９】
（１−１−２）結果
（直接細胞障害活性）
コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系における細胞数の相対値を、図２２乃至図２４に示す。なお、図２２はＳａｒｃｏｍａ−１８０、図２３はＨＬ６０、そして図２４はＫＭＳＴ−６を使用した実験結果である。いずれの細胞を使用した場合も、また、寒天Ｘ−２４１の濃度が５０μｇ／ｍｌの場合も１００μｇ／ｍｌの場合も、細胞は障害されなかった。
【００９０】
（ＬＤＨ活性）
コントロール及び寒天添加時のＬＤＨ活性を、図２５乃至図３０に示す。なお、図２５及び図２６はＫＭＳＴ−６、図２７及び図２８はＨＬ６０、そして図２９及び図３０はＳａｒｃｏｍａ−１８０を使用した実験結果である。いずれの細胞を使用した場合も、また、寒天Ｘ−２４１の濃度が５０μｇ／ｍｌの場合も１００μｇ／ｍｌの場合も、ＬＤＨ活性はコントロールと差がなかった。
【００９１】
（１−２）寒天多糖由来オリゴ糖の細胞毒性
実施例２（２）で分画し、凍結乾燥したものを、加水分解によってオリゴ糖化した。そのオリゴ糖化したサンプルを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞毒性を調べた。
【００９２】
（１−２−１）方法
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品３ｍｇに５ｍｌの蒸留水を加え、充分に加熱溶解した。その後、最終濃度が０．０２５Ｍ（＝０．０２５Ｎ）となるように塩酸を加え、１００℃で２０分間加水分解した。加水分解後のサンプルを遠心エバポレーターにかけ、乾固させ、蒸留水を加え、再び乾固させて塩酸を十分に除去した。乾固したサンプルをＰＢＳ３ｍｌに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ濃度のオリゴ糖ＰＢＳ溶液とした。
【００９３】
オリゴ糖ＰＢＳ溶液を、０．２μｍのシリンジ・フィルターを用いてろ過滅菌した。この滅菌後の溶液を、オリゴ糖の最終濃度が５０μｌ／ｍｌ又は１００μｌ／ｍｌとなるように、細胞懸濁液（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に加え、（１−１）と同様の方法で、オリゴ糖が細胞増殖に与える影響について検討した。なお、用いた細胞はＳａｒｃｏｍａ１８０であった。コントロール用には、同量のＰＢＳを加えた。また、試験区は表７に示すとおりであった。
【００９４】
【表７】
【００９５】
（１−２−２）結果
コントロールの血球数に対する、寒天全糖由来オリゴ糖又は寒天分画物由来オリゴ糖を加えた系における血球数の相対値を、図３１及び図３２に示す。なお、図３１は、オリゴ糖の最終濃度が５０μｌ／ｍｌの場合の、図３２は、オリゴ糖の最終濃度が１００μｌ／ｍｌの場合の実験結果である。いずれの場合も、細胞は障害されなかった。
【００９６】
（２）ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の測定
実施例２（２）で分画し、凍結乾燥したものを、加水分解によってオリゴ糖化した。そのオリゴ糖化したサンプルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を調べた。
【００９７】
（２−１）方法
（２−１−１）投与サンプルの調製
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品に糖濃度が０．２５％になるよう蒸留水を加え、充分に加熱溶解した。その後、最終濃度が０．０２５Ｍ（＝０．０２５Ｎ）となるように塩酸を加え、１００℃で２０分間加水分解した。加水分解後のサンプルを遠心エバポレーターにかけ、乾固させ、蒸留水を加え、再び乾固させて塩酸を十分に除去した。乾固したサンプルを滅菌生理食塩水（ＮａＣｌ濃度：０．９％（ｗ／ｖ））に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のオリゴ糖の生理食塩水溶液とした。
【００９８】
オリゴ糖の生理食塩水溶液を、０．２μｍのシリンジ・フィルターを用いてろ過滅菌し、その後、凍結保存した。
【００９９】
（２−１−２）マウスへの投与実験方法
Ｓｔｄ：ｄｄｙ系マウス（６週齢、♂、平均体重２８ｇ）（日本エスエルシー社より購入）を使用した。1週間予備飼育した後、１日目に、予め別のマウス腹腔内で培養しておいたＳａｒｃｏｍａ１８０細胞を滅菌生理食塩水に懸濁させた状態で、1匹あたり１×１０６個腹腔内に投与した。コントロール１のマウスには、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を投与しなかった。
【０１００】
２日目からの１０日間は、試験区のマウスには、毎日、オリゴ糖の生理食塩水溶液を腹腔内投与した。また、コントロール１及びコントロール２のマウスには、同量の生理食塩水溶液を投与した。１回あたりの投与量は、全て０．１ｍｌとした。１試験区あたりのマウスは７匹とし、各試験区は表８に示すとおりであった。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
投与開始から、体重と生存数を測定した。動物福祉の観点から、マウスを死亡したと見なす際に、当研究室で定めている人道的エンドポイントを判断基準として用いた。すなわち、（１）真上から測定した胸部の体幅に対する腹部の体幅が２００％を超えるとき、及び（２）対照１のマウスの平均体重に対し、体重が１５０％を超えるときの２点である。
【０１０３】
（２−２）結果
各試験区のマウス生存数を表９及び図３３に示す。０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と、０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群で、最も生存率（７１．４％）が高かった。これらに次ぐ生存率（４２．９％）を示したのは、非吸着画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖を５００μｇ／ｋｇで投与した群と、全糖由来オリゴ糖を５００μｇ／ｋｇで投与した群であった。
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
以上のように、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群で、抗腫瘍活性が認められた。しかし、これらの画分由来オリゴ糖を初めとして、寒天多糖由来のオリゴ糖は、（１−２）に示したように、直接細胞を攻撃しない。従って、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖と０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖は、免疫システムを賦活することにより、結果的に腫瘍を抑制したのではないかと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る寒天多糖類の分析方法や分画方法は、寒天の分類や分離精製に利用できる。また、本発明は、寒天多糖由来のオリゴ糖を、寒天全糖又はその分画物から得ることを可能にする。さらに、本発明は、抗腫瘍活性を示す組成物の調製に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寒天多糖の分析方法、寒天多糖の分画方法、寒天又はその分画物中の多糖のオリゴ糖化方法、及び寒天由来の抗腫瘍活性を有するオリゴ糖組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本では食生活の欧米化に伴い、生活習慣病が増加しており、その要因の一つとして食物繊維摂取量の減少が考えられている。食物繊維は消化吸収されず、従来は非栄養素であるとされていたが、排便を円滑にし、有害物質を吸着・排除する効果があることなどから、第六の栄養素であるとして見直されてきている。そこで、食物繊維を豊富に含む海藻が注目されるようになった。海藻には、ビタミン、タンパク質、ミネラルなども豊富に含有されており、健康食品として話題になっている。
【０００３】
ところで、海藻の多糖類は、セルロースなどの藻体の骨格を作る骨格多糖類、デンプンやラミナランなどの光合成産物である貯蔵多糖類、及びアルギン酸などの細胞間を充填する粘質多糖類の３種類に分類される。粘質多糖類には、抗腫瘍活性、血圧降下作用、コレステロール低下作用、抗酸化作用ならびに抗血液凝固作用などの生物活性を有するものが多数報告されている。
【０００４】
海藻類の中で、紅藻は、寒天に加工されて古くから利用されてきた。寒天は、和菓子等の食品における利用を初めとして、工業用、医療用、化粧品用及び試薬用（細菌培地、組織培養）等、様々な用途で使用されている。そして、近年になり、寒天の様々な生理機能が明らかとされ、よって、寒天に対する健康を促進する食品としての期待が高まっている。
【０００５】
寒天の原料は紅藻で、主としてテングサ属（Gelidium）、オゴノリ属（Gracilaria）、オバクサ属（Pterocladia）、イタニグサ属（Ahnfeltia）等に属する紅藻類が利用されている。天草の主産地は日本、モロッコ、チリ、韓国、スペイン等であり、オゴノリの主産地はチリ、南アフリカ、アルゼンチン、日本等である。このように、寒天の原料及び産地は種々様々であるが、そのような原料や産地の相違よる成分組成、物性、構成糖、硫酸基含量や生物活性の相違等は、明らかとされていない。特にその構成多糖に関しては、寒天が常温で固化するため、これまでは分析や分画が為されてこなかった。わずかに、非特許文献１に、寒天の精製方法と、寒天の主成分の一つであるアガロースが、Ｄ−ガラクトース残基と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース残基が交互にくる線状多糖からなることが記載されているのみである。
【０００６】
一方、１９７０年代から種々のオリゴ糖が開発され、それらの機能、具体的には、非う触性、腸内菌叢改善作用、ミネラル吸収促進作用、免疫賦活作用等の生理機能や生体調節機能に関する研究が活発になされてきている。また、世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、２００５年、世界の死亡者の１３％は、悪性腫瘍による死亡である。日本でも、１９８１年からは悪性腫瘍が死因のトップとなっており、２００６年度における死因の３割が悪性腫瘍である。このような状況下、世界中において、抗腫瘍活性を有する物質の探索が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｔｅｌｌａｎ Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ６１（１９７１）ｐｐ．７３−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、多糖を多く含有する寒天に着目した。そして、寒天多糖からも、様々な生理機能や生体調節機能を有するオリゴ糖を得ることが可能であると考えた。しかし、そのような研究を行うためには、先ず、寒天の物理的・化学的特性を明らかにし、また寒天に含まれる有用成分の生理機能等を明らかにする必要があると考え、そのためには、寒天多糖の分析、分画方法を確立する必要があると考えた。
【０００９】
本発明の目的は、寒天多糖の分析方法を提供することにある。また、本発明の目的は、寒天多糖の分画方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法を提供することにある。そして、本発明の目的は、寒天由来の抗腫瘍活性を有するオリゴ糖組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、寒天多糖の分析方法及び分画方法を開発すべく、鋭意検討した。その結果、本発明をなすに至った。
【００１１】
即ち本発明は、セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を電気泳動することからなる寒天多糖の分析方法であって、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行うことを特徴とする寒天多糖の分析方法に関する。
【００１２】
本発明は、セルロースアセテート膜又は濾紙を用い、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を寒天が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行い、泳動後に検出されたスポットの位置及び数から、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定することを特徴とする、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定する方法にも関する。
【００１３】
本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行うことを特徴とする寒天多糖の分画方法に関する。
【００１４】
また、本発明者らは、寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法を開発すべく、鋭意検討した。その結果、本発明をなすに至った。
【００１５】
即ち本発明は、寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことを特徴とする寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法に関する。
【００１６】
さらに、本発明者らは、寒天由来のオリゴ糖組成物の生理活性について検討し、寒天からの特定の分画物中の多糖類を加水分解してなるオリゴ糖組成物が、抗腫瘍活性を示すことを見いだし、本発明を完成させた。
【００１７】
即ち本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物に関する。
【００１８】
また、本発明は、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、寒天の室温におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、寒天の６０℃におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図３】図３は、寒天全糖及びその分画物の６０℃におけるセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、寒天全糖及びその分画物のゲルの平均最大荷重を示すグラフである。
【図５】図５は、寒天全糖及びその分画物のゲルの最大荷重を示すチャートである。
【図６】図６は、傾けたエッペンドルフ内での寒天全糖及びその分画物のゲルの状態を示す写真である。
【図７】図７は、寒天全糖及びその分画物のゲルの見かけ粘度を示すグラフである。
【図８】図８は、寒天全糖のガスクロマトグラムである。
【図９】図９は、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物のガスクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物のガスクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３５．５分）である。
【図１２】図１２は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３５．８分）である。
【図１３】図１３は、寒天全糖のマススペクトル（保持時間３７．３分）である。
【図１４】図１４は、寒天全糖の加水分解物（オリゴ糖化物）の薄層クロマトグラムである。
【図１５】図１５は、分子量検量線を示す。
【図１６】図１６は、寒天全糖の各加水分解条件におけるオリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、寒天全糖由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、蒸留水で溶出された寒天分画物（非吸着画分）由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２１】図２１は、０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出された寒天分画物由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＨＬ−６０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、ＫＭＳＴ６細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ＨＬ６０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２８】図２８は、ＨＬ６０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図２９】図２９は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は５０μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図３０】図３０は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールと寒天を加えた系（寒天濃度は１００μｇ／ｍｌ）におけるＬＤＨ活性を示すグラフである。
【図３１】図３１は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を加えた系（濃度は５０μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図３２】図３２は、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を用いた場合の、コントロールの細胞数に対する、寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を加えた系（濃度は１００μｇ／ｍｌ）における細胞数の相対値を示すグラフである。
【図３３】図３３は、腫瘍細胞を移植したマウスに寒天全糖又はその分画物由来のオリゴ糖を投与（１００μｇ／ｋｇ又は５００μｇ／ｋｇ）した場合における、マウス生存数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、発明を実施するための形態に基づき、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明の寒天多糖の分析方法は、セルロースアセテート膜又は濾紙を用いた電気泳動によって行う。電気泳動に使用するセルロースアセテート膜や濾紙は市販されているので、それらを用いればよい。
【００２２】
本発明に係る寒天多糖の分析方法の特徴は、セルロースアセテート膜又は濾紙に寒天又は寒天の分画物の水性溶液をスポットした後、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行う点にある。ここで、スポットする水性溶液における寒天又は寒天の分画物（固形分）の濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜３．０％程度である。また、水性溶液は、好ましくは水溶液である。
【００２３】
寒天は、その産地や原料海藻の種類によって溶解温度が異なる。従って、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度は一概には決められないが、例えば４０℃〜７０℃である。寒天又は寒天の分画物が溶解状態にある温度では、その構成成分である多糖類がランダム状態を維持するので、電気泳動が可能である。
【００２４】
寒天は、その産地や原料海藻の種類によって構成多糖類も相違する。そこで、上記の方法で電気泳動を行えば、泳動スポットの位置や数の相違から、寒天の産地及び／又は原料海藻の種類を特定することができる。
【００２５】
本発明の寒天多糖の分画方法では、寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら溶出を行う。この際、分画はバッチ法でもカラムクロマト法でもかまわない。
【００２６】
イオン交換樹脂に寒天を付与した後の溶出は、先ず、水で行う。このとき、非吸着物が流出してくるので、それを「非吸着画分」という。その後、無機塩水溶液を使用して、イオン交換樹脂に保持された成分を溶出させる。
【００２７】
無機塩水溶液での溶出にあたり、使用する無機塩の種類は特に限定されないが、塩化ナトリウムが好ましい。無機塩濃度も特に限定されないが、例えば０．１Ｍ〜３．０Ｍの範囲内において、適当な範囲を選択することが好ましく、０．２Ｍ〜２．０Ｍの範囲内で無機塩濃度を変化させていくことがより好ましい。
【００２８】
溶出された試料は、透析等によって脱塩することが好ましい。また、溶出された試料や透析後の試料は、凍結乾燥等の方法によって粉体化されてもよい。
【００２９】
本発明は、多糖類のオリゴ糖化方法にも関する。本発明では、寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことにより、オリゴ糖を得る。酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液を調製するために、通常は、寒天又は寒天の分画物の水溶液に酸を添加するか、寒天又は寒天の分画物を酸の水溶液に溶解させる。
【００３０】
使用する酸の例としては、塩酸、硫酸等の強酸や、酢酸などが挙げられ、強酸が好ましく、塩酸がさらに好ましい。加水分解の際、寒天又は寒天の分画物含有水溶液における酸の規定度は０．００１Ｎ〜０．２Ｎであり、０．００５Ｎ〜０．１Ｎが好ましく、０．０２Ｎ〜０．０５Ｎがさらに好ましい。また、温度は６０℃〜１０５℃であり、８０℃〜１０５℃が好ましく、９０℃〜１００℃がさらに好ましい。
【００３１】
加水分解に要する時間は特に限定されないが、１０〜１２０分間程度が好ましく、１５〜６０分間程度がさらに好ましい。
【００３２】
本発明は、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物にも関する。「オリゴ糖組成物」とは、オリゴ糖一種以上と他の成分とを含有するか、オリゴ糖を二種以上含有するものを指す。抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物には二種類あり、その一つは、上記の本発明に係る寒天多糖の分画方法で、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解することによって得られ、他方は、上記の本発明に係る寒天多糖の分画方法で、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解することによって得られる。これを凍結乾燥等の方法で粉体化してもよい。
【００３３】
「０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度での溶出」や、「０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度での溶出」を行うに際し、無機塩濃度は、段階的に変化させてもよく、また、グラディエントで変化させてもよい。また、加水分解は、０．００１Ｎ〜０．２Ｎの酸（好ましくは強酸）の存在下に行うことが好ましく、その時間は、１０〜１２０分間程度である。
【００３４】
本発明に係る抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物を得るための最もよい条件は、次の通りである。
（１）約６０℃に温めておいた陰イオン交換樹脂に、９０〜１００℃に加熱しておいた寒天水溶液（濃度：１〜１００ｍｇ／ｍｌ程度）を加える。
（２）順に、蒸留水、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ及び１．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液で、バッチ法により溶出する。
（３）各溶出液を透析に供して脱塩し、その後、凍結乾燥する。
（４）凍結乾燥品の水溶液（濃度：０．１〜１．０％程度）に塩酸を加え、０．０１〜０．１Ｎとする。９０〜１００℃で、１５〜６０分間加水分解を行う。
（５）公知の方法により、精製を行う。
【００３５】
本発明に係る分画法において、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出される画分に含有される多糖類と０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出される画分に含有される多糖類は、いずれも、その構成糖として３，６−アンヒドロガラクトースとガラクトースとを含有する。従って、これらの画分に含有される多糖を加水分解してなるオリゴ糖も、その構成糖として３，６−アンヒドロガラクトースとガラクトースとを含有すると考えられる。しかし、同定されていない物質も含有している。
【００３６】
また、オリゴ糖の分子量は、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料の加水分解物では約７５０（単一）であり、一方、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料の加水分解物では、約１６００と約１２，０００（二種類）であった。
【００３７】
本発明に係る抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物二種は、実施例５に示すように、マウスにおいて抗腫瘍活性を示した。これらの組成物を用いた薬剤の剤型は限定されないが、注射剤、経口剤等に加工することができる。また、その投与量も、特に限定されない。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【００３９】
［実施例１］電気泳動による寒天多糖分析方法の検討
（１）材料
寒天ＸＲ−２３９
寒天ＸＲ−２４０
寒天ＸＲ−２４１
これらの寒天は、伊那食品工業株式会社より分与していただいた。また、これらの寒天の種類、産地及び基本物性は、表１に示すとおりであった。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（３）セルロースアセテート膜電気泳動
（３−１）方法
電解液として０．４ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液を用い、５ｍｇ／ｍｌ寒天水溶液を幅１ｃｍの帯状にスポットした。比較対照として、スサビノリ由来ポルフィラン（伊那食品工業株式会社；細胞壁を構成する水溶性食物繊維）、フクロフノリ由来フノラン（伊那食品工業株式会社；食物繊維）、κ−カラギーナン（ＳＩＧＭＡ；直鎖含硫黄多糖類）、アルギン酸（和光純薬工業株式会社；多糖類の食物繊維）、フコイダン（理研ビタミン株式会社；硫酸多糖類）の各々１ｍｇ／ｍｌ水溶液を用いた。泳動は、室温と６０℃インキュベーター内の二条件で、１ｍＡ／ｃｍで１２０分間行った。
【００４２】
（３−２）結果
室温での泳動結果を図１に、６０℃での泳動結果を図２に示す。
【００４３】
室温での泳動では、寒天３種のうち、寒天２３９で不明瞭なスポットが検出されたのみであり、他の２種ではスポットは検出されなかった。ノリの繊維であるポルフィランからも、スポットは検出されなかった。フノリから得られるフノラン、スギノリやツノマタなど紅藻から得られるκ−カラギーナン並びに褐藻から得られるアルギン酸は、泳動方向に広いピークを示した。同じく褐藻から得られるフコイダンは、明瞭なスポットを示した。
【００４４】
６０℃での泳動では、寒天２３９が、室温における泳動に比べてより明瞭なスポットを示した。寒天２４０、寒天２４１及びノリ抽出物においても、スポットが検出された。フノラン及びκ−カラギーナンは、室温泳動時と同様に、泳動方向に広いピークを示した。
【００４５】
室温条件下で泳動バンドが検出できない理由として、寒天がゲル化して泳動されなかったことが考えられる。唯一バンドが検出できたＸＲ−２３９は、凝固点が４５℃（伊那食品工業株式会社による）であり、室温では全成分が溶解しているとは考えられない。よって、一部の成分のみが泳動されたことが示唆される。この一部の成分の凝固点は、室温よりも低い可能性がある。
【００４６】
一方、加温（６０℃）条件下では、泳動が可能であった。また、そのバンドはすべて陽極側に泳動していたことから、構成糖が酸性糖であることが分かった。泳動スポットは、ＸＲ−２３９では１本、ＸＲ−２４０では２本、ＸＲ−２４１では３本が確認でき、しかもそれぞれ泳動距離が異なっていた。
【００４７】
以上の結果より、加温電気泳動法により、原料や産地の異なる寒天が、その構成成分においても異なることが明らかとなった。また、この方法により、寒天の産地や原料海藻の特定が可能になると考えられた。
【００４８】
［実施例２］寒天多糖の分画方法の検討
（１）材料
寒天ＸＲ−２４１
【００４９】
（２）陰イオン交換樹脂を用いた寒天多糖の分画
陰イオン交換樹脂として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０Ｍを用いた。６０℃に温めておいた約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂に、９５℃に加熱しておいた寒天ＸＲ−２４１水溶液（濃度：２５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加え、陰イオン交換樹脂を約６０℃に保ちながら、順に、蒸留水、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．２５Ｍ及び１．５Ｍの塩化ナトリウム水溶液（各１５０ｍｌ）でバッチ法により溶出した。各溶出液は、４℃にて３日間透析し、その後、ナス型フラスコを用いて凍結乾燥した。
【００５０】
（３）セルロースアセテート膜電気泳動
（２）で得られた分画物を、セルロースアセテート膜電気泳動に供した。電解液として０．４ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液を用い、５ｍｇ／ｍｌ寒天分画物凍結乾燥品の水溶液を幅１ｃｍの帯状にスポットした。泳動は１ｍＡ／ｃｍで２時間半行った。泳動の間、常に６０℃に加熱した。
【００５１】
（４）結果
泳動結果を図３に示す。
【００５２】
蒸留水で溶出した画分（以下、「非吸着画分」という）、０．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．２５Ｎ画分」という）、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．５Ｎ画分」という）、及び０．７５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「０．７５Ｎ画分」という）においては一本の、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．０Ｎ画分」という）においては二本の明瞭なスポットが検出された。全糖では上下に広いピークが検出されており、この広いピークが、非吸着画分から１．０Ｎ画分において分離されたことがわかる。分画時に用いた塩化ナトリウムの濃度が高くなるにつれて、泳動距離も長くなった。１．２５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．２５Ｎ画分」という）及び１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出した画分（以下、「１．５Ｎ画分」という）では、スポットを検出できなかった。
【００５３】
［実施例３］分画物の物理的、化学的性状の検討
（１）ゲルの固さの測定
（１−１）クリープメータによる測定
（１−１−１）方法
寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の１％水溶液を、沸騰水浴させて溶解させることによって調製し、充分に撹拌した後に冷蔵し、ゲル化させた。室温（約２０℃）に戻してから、クリープメータ（株式会社山電）を用いて物性を測定した。クリープメータの測定条件は、表２に示すとおりであった。ゲルの固さの指標として最大荷重を採用した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（１−１−２）結果
結果を図４に示す。平均最大荷重は、全糖が最も高く、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分の順で低くなっていった。非吸着画分は、ゲル化能が著しく低いため、クリープメータでは測定不可能であった。
【００５６】
（１−２）破断曲線の測定
（１−２−１）方法
寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の１％水溶液を、沸騰水浴させて溶解させることによって調製し、充分に撹拌した後に冷蔵し、ゲル化させた。室温（約２０℃）に戻してから、クリープメータを用いてゲルの硬さを測定した。ゲルの硬さの測定条件は、容器として内径８ｍｍのエッペンドルフを用いたこと以外は、表２に示すものと同様であった。ゲルの固さの指標として最大荷重を採用し、測定時間の経過による最大荷重の変化をチャートに記載した。なお、寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分については、各々三試料について測定を行った。
【００５７】
（１−２−２）結果
結果を図５に示す。全糖で最も破断曲線が高い位置となり、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分の順で低くなった。０．７５Ｎ画分及び非吸着画分は、ともにゲル化能が弱く、破断曲線のみでは両者の比較はできなかった。
【００５８】
（１−３）エッペンドルフ内でのゲルの状態の観察
（１−３−１）方法
視覚的にゲルの固さを表現するため、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフ内で、寒天全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分及び非吸着画分の凍結乾燥品の０．５％水溶液を、上記と同様の方法で調製した。これを冷蔵してゲル化させ、室温に戻し、真横に倒した時の様子を観察した。
【００５９】
（１−３−２）結果
結果を図６に示す。全糖がゲル化能が最も高く、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分の順にゲル化能が低下した。０．７５Ｎ画分及び非吸着画分は、ゲル化能が著しく低かった。
【００６０】
（１−４）回転粘度形による粘度の測定
（１−４−１）方法
ＥＭＤ回転粘度計（Tokimec社）によって、粘度を測定した。測定条件は、次の通りであった。
（測定条件）
温度： ２０℃
画分の凍結乾燥品の濃度： ０．５％
回転速度： ５０ｒｐｍ
コーンの種類： １°、３４´
【００６１】
寒天ゲルは非ニュートン流体であるため、結果は見かけ粘度（μ）で表した。見かけ粘度は次の公式により求めた。
見かけ粘度（μ）＝Ｋｎ・θ（ｍＰａ・ｓ）
Ｋｎ： 換算乗数（Tokimec ＥＭＤ型、５０ｒｐｍでは２．５６）
θ：目盛指度
【００６２】
（１−４−２）結果
結果を図７に示す。全糖、０．２５Ｎ画分、０．５Ｎ画分、０．７５Ｎ画分の順に粘度が高かった。また、クリープメータではゲルの硬さを測定することができなかった非吸着画分も、測定が可能であった。
【００６３】
（２）硫酸基濃度の測定
（２−１）方法
硫酸基濃度はドッジソン法を用いて測定した。寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品の水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌに、等量の８Ｍトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、１００℃にて３時間、加水分解した。その後、減圧乾固し、残渣を蒸留水１ｍｌに溶解させた。このように調製した水溶液０．２ｍｌを試験管に取り、４％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液３．８ｍｌと塩化バリウム−ゼラチン水溶液（塩化バリウム：特級ゼラチン：水＝１ｇ：１ｇ：２００ｍｌ）１ｍｌとを加えた。２０分間室温で放置した後、吸光度（３６０ｎｍ）を測定した。スタンダードには硫酸を用いた。
【００６４】
（２−２）結果
結果を表３に示す。硫酸基濃度は、０．５Ｎ画分が最も高く、次いで全糖であり、それ以降は非吸着画分、０．２５Ｎ画分の順で低くなり、０．７５Ｎ画分が最も低かった。分画時のＮａＣｌ濃度と硫酸基濃度に比例関係はなかったものの、画分により大きな差があることが明らかになった。
【００６５】
【表３】
【００６６】
（３）ガスクロマトグラフ法、ガスクロマトグラフ−マススペクトル法による構成糖の検討
（３−１）方法
寒天の構成糖を調べるために、ガスクロマトグラフ法（ＧＬＣ）を採用した。スタンダードとして、グルコース、ガラクトース、フルクトースを用いた。
【００６７】
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品１ｍｇに１０％塩酸−メタノールを１ｍｌ添加した。その後、１００℃で１６時間加熱することにより、多糖を完全に分解した。窒素ガス通気で乾固した後、水を加えて糖の１０％水溶液を調製した。含水糖試料用トリメチルシリル化剤ピリジン溶液（ＴＭＳ−ＰＺ）試薬（東京化成工業株式会社）５００μｌに糖の１０％水溶液５μｌを加え、30秒間振り混ぜた。その後、ウォーターバスを用い、６０℃にて１５分間の温浴をし、ＴＭＳ誘導体とした。このように調製された混合液１μｌを、ＧＬＣ分析に供した。ＧＬＣの条件は、次の通りであった。また、マススペクトルも測定した。
【００６８】
（条件）
カラム： ＤＢ１７（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
カラム温度： １５０〜２５０℃(昇温速度：２℃／分)
インジェクション温度： ２３０℃
キャリアガス： Ｎ２（１ｍｌ／分）
検出： 水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）
【００６９】
（３−２）結果
寒天全糖を用いた場合のガスクロマトグラムを図８に、０．２５Ｎ画分を用いた場合のガスクロマトグラムを図９に、０．７５Ｎ画分を用いた場合のガスクロマトグラムを図１０に示した。また、寒天全糖を用いた場合のマススペクトルを図１１乃至図１３に示した。各サンプルの構成多糖は、次の通りであった。
【００７０】
（寒天全糖）
ガスクロマトグラム（図８）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク１とピーク３は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク２とピーク４はガラクトースであると推定された。ピーク５は同定することができなかった。
【００７１】
（０．２５Ｎ画分）
ガスクロマトグラム（図９）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク６とピーク９は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク８とピーク１０はガラクトースであると推定された。ピーク７は図８には出現しなかったピークであり、未同定である。また、ピーク１１は、保持時間が同一であるので、ピーク５（図８）と同一の物質である。
【００７２】
（０．７５Ｎ画分）
ガスクロマトグラム（図１０）とマススペクトルの結果（図１１乃至図１３）と照らし合わせた結果、ピーク１４は３，６−アンヒドロガラクトース、ピーク１３とピーク１５はガラクトースであると推定された。ピーク１２は、保持時間が同一であるので、ピーク７（図９）と同一の物質である。また、ピーク１６は、保持時間が同一であるので、ピーク５（図８）及びピーク１１（図９）と同一の物質である。図８及び図９と比較して、ピーク１６が相対的に大きなピークであることが、このガスクロマトグラムの最大の特徴である。
【００７３】
なお、図１１は、保持時間３５．５分で、ガラクトースのスペクトルである。ガスクロマトグラムにおけるピーク２、４、８、１０、１３及び１５は、すべてこのスペクトルとほぼ同様の結果を示した。
【００７４】
図１２は、保持時間３５．８分で、３，６−アンヒドロガラクトースのスペクトルであると考えられる。ガスクロマトグラムにおけるピーク１、３、６、９及び１４は、すべてこのスペクトルとほぼ同様の結果を示した。
【００７５】
図１３は、保持時間３７．３分であるが、この物質は未同定である。ガスクロマトグラムにおけるピーク５、１１及び１６は、すべてこのスペクトルと同様の結果を示した。この物質は、図１０の０．７５Ｎ画分のガスクロマトグラムにおいて、相対的に大きなピークを示した物質であり、今後の構造解析が待たれる。
【００７６】
［実施例４］寒天多糖のオリゴ糖化の検討
（１）薄層クロマトグラフィーによる検討
（１−１）方法
寒天全糖のオリゴ糖化を試みた。寒天全糖５ｍｇに、塩酸水溶液（０．０５Ｍ（＝０．０５Ｎ）又は０．１Ｍ（＝０．１Ｎ））もしくは酢酸水溶液（０．０５Ｍ（＝０．０５Ｎ）又は０．１Ｍ（＝０．１Ｎ））８ｍｌを加え、３７℃のインキュベーター内で５時間、加水分解を行い、その後、減圧乾固させた。これを少量の水に溶解した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣにはシリカゲル６０Ｆ２５４シートを用い、展開溶媒には酢酸エチル：酢酸：水 （２：１：１（容量比））を用いた。比較対照には、ガラクトースを用いた。検出は、濃硫酸を噴霧し、１２０℃に加熱して行った。
【００７７】
（１−２）結果
結果を図１４に示す。０．０５Ｍ塩酸水溶液で加水分解されたものと、０．１Ｍ塩酸水溶液で加水分解されたものとを比較すると、いずれもガラクトースのスポットが明確であるから、塩酸の場合には０．０５Ｍで十分に加水分解が行われたことがわかる。一方、酢酸による加水分解では、スポットが著しく不明確であることから、濃度が０．１Ｍでも、加水分解は十分には行われなかったことがわかる。
【００７８】
（２）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による検討
（２−１）各加水分解条件における寒天全糖由来オリゴ糖の分子量の推定
（１）のＴＬＣの結果を踏まえ、加水分解に用いる塩酸の濃度、加水分解時の温度及び時間の最適条件を検討するために、ＨＰＬＣを用いて得られたオリゴ糖の分子量を推定した。
【００７９】
（２−１−１）方法
予め加熱溶解した０．２５％寒天水溶液を、以下の各加水分解条件においてオリゴ糖化し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）モードのＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、表４に記載の通りである。なお、カラムはＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製；φ７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、移動相は０．０１ＮのＴＦＡであり、流速は１ｍｌ／分、検出にはラジオアイソトープを使用した。また、分子量標準物質として、市販のプルランシリーズ Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２、ラクトース（関東化学製）、ガラクトース（ＳＩＧＭＡ製）を用いた。これらの分子量は、表５に示した。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
（２−１−２）結果
得られた分子量検量線を、図１５に示す。図１５では、ラクトースの溶出量に対する相対値を用いた。近似曲線は三次曲線となった。
【００８３】
検討条件(1)、(4)及び(7)におけるＨＰＬＣのクロマトグラムを図１６に示す。(1)の加水分解条件では、加水分解が不十分のため、上下に広いピークが現れた。(4)の加水分解条件では、塩酸の濃度が高くなったことにより分解が進み、二つのピークが現れた。(7)の加水分解条件では、(4)の二つのピークとそれぞれほぼ同一の保持時間にピークが現れたが、前半に現れるピークの、後半のピークに対する相対的大きさが異なっていた。
【００８４】
（２−２）寒天分画物由来オリゴ糖の分子量推定
（２−２−１）方法
予め加熱溶解した寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品の０．２５％水溶液であって塩酸濃度が０．０２５Ｎのものを、１００℃に２０分間保持して多糖を加水分解し、オリゴ糖を得た。得られたサンプルをＧＰＣモードのＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの実施に使用したカラムはＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製；φ７．８ｍｍ×３０ｃｍ）であり、移動相は０．０１ＮのＴＦＡであり、流速は１ｍｌ／分、検出にはラジオアイソトープを使用した。また、カラムは温度２７℃であった。
【００８５】
（２−２−２）結果
オリゴ糖の原料と、得られたオリゴ糖それぞれの分子量、糖数（グルコース換算）を表６に示す。画分により、オリゴ糖の分子量に大きく差があることがわかる。また、寒天全糖由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１７に、非吸着画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１８に、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図１９に、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図２０に、そして０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示す。
【００８６】
全糖由来オリゴ糖と０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖は、分子量が一種類であり、非吸着画分由来オリゴ糖、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖及び０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖は、それぞれ図１８、図２０及び図２１においてピークが二つに分かれたことから明らかなように、二種類の分子量を有する。
【００８７】
【表６】
【００８８】
［実施例５］抗腫瘍活性の測定
（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性の測定
（１−１）寒天多糖の抗腫瘍活性
（１−１−１）方法
実施例１で使用した寒天Ｘ−２４１のＰＢＳ溶液（寒天濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。４８穴プレートを用い、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０（マウス腹水腫由来）、ＨＬ６０（ヒト白血病由来）及びＫＭＳＴ−６（胎児線維芽細胞由来）の各細胞を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合で各ウェルに浮遊させ、ここに、寒天としての最終濃度が５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌになるように、寒天のＰＢＳ溶液を加えた。コントロール用には、同量のＰＢＳを加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件で、インキュベーター内で培養した。培養開始から、２４時間、４８時間、７２時間後に、細胞を含む培養液を採取し、それに０．５％トリパンブルー水溶液を加え、染色されなかった生細胞数を、血球計算板を用いて計測した。また、Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＬＤＨ活性を指標として細胞毒性を評価した。
【００８９】
（１−１−２）結果
（直接細胞障害活性）
コントロールの細胞数に対する、寒天を加えた系における細胞数の相対値を、図２２乃至図２４に示す。なお、図２２はＳａｒｃｏｍａ−１８０、図２３はＨＬ６０、そして図２４はＫＭＳＴ−６を使用した実験結果である。いずれの細胞を使用した場合も、また、寒天Ｘ−２４１の濃度が５０μｇ／ｍｌの場合も１００μｇ／ｍｌの場合も、細胞は障害されなかった。
【００９０】
（ＬＤＨ活性）
コントロール及び寒天添加時のＬＤＨ活性を、図２５乃至図３０に示す。なお、図２５及び図２６はＫＭＳＴ−６、図２７及び図２８はＨＬ６０、そして図２９及び図３０はＳａｒｃｏｍａ−１８０を使用した実験結果である。いずれの細胞を使用した場合も、また、寒天Ｘ−２４１の濃度が５０μｇ／ｍｌの場合も１００μｇ／ｍｌの場合も、ＬＤＨ活性はコントロールと差がなかった。
【００９１】
（１−２）寒天多糖由来オリゴ糖の細胞毒性
実施例２（２）で分画し、凍結乾燥したものを、加水分解によってオリゴ糖化した。そのオリゴ糖化したサンプルを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞毒性を調べた。
【００９２】
（１−２−１）方法
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品３ｍｇに５ｍｌの蒸留水を加え、充分に加熱溶解した。その後、最終濃度が０．０２５Ｍ（＝０．０２５Ｎ）となるように塩酸を加え、１００℃で２０分間加水分解した。加水分解後のサンプルを遠心エバポレーターにかけ、乾固させ、蒸留水を加え、再び乾固させて塩酸を十分に除去した。乾固したサンプルをＰＢＳ３ｍｌに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ濃度のオリゴ糖ＰＢＳ溶液とした。
【００９３】
オリゴ糖ＰＢＳ溶液を、０．２μｍのシリンジ・フィルターを用いてろ過滅菌した。この滅菌後の溶液を、オリゴ糖の最終濃度が５０μｌ／ｍｌ又は１００μｌ／ｍｌとなるように、細胞懸濁液（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に加え、（１−１）と同様の方法で、オリゴ糖が細胞増殖に与える影響について検討した。なお、用いた細胞はＳａｒｃｏｍａ１８０であった。コントロール用には、同量のＰＢＳを加えた。また、試験区は表７に示すとおりであった。
【００９４】
【表７】
【００９５】
（１−２−２）結果
コントロールの血球数に対する、寒天全糖由来オリゴ糖又は寒天分画物由来オリゴ糖を加えた系における血球数の相対値を、図３１及び図３２に示す。なお、図３１は、オリゴ糖の最終濃度が５０μｌ／ｍｌの場合の、図３２は、オリゴ糖の最終濃度が１００μｌ／ｍｌの場合の実験結果である。いずれの場合も、細胞は障害されなかった。
【００９６】
（２）ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の測定
実施例２（２）で分画し、凍結乾燥したものを、加水分解によってオリゴ糖化した。そのオリゴ糖化したサンプルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を調べた。
【００９７】
（２−１）方法
（２−１−１）投与サンプルの調製
寒天全糖又は各画分の凍結乾燥品に糖濃度が０．２５％になるよう蒸留水を加え、充分に加熱溶解した。その後、最終濃度が０．０２５Ｍ（＝０．０２５Ｎ）となるように塩酸を加え、１００℃で２０分間加水分解した。加水分解後のサンプルを遠心エバポレーターにかけ、乾固させ、蒸留水を加え、再び乾固させて塩酸を十分に除去した。乾固したサンプルを滅菌生理食塩水（ＮａＣｌ濃度：０．９％（ｗ／ｖ））に溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のオリゴ糖の生理食塩水溶液とした。
【００９８】
オリゴ糖の生理食塩水溶液を、０．２μｍのシリンジ・フィルターを用いてろ過滅菌し、その後、凍結保存した。
【００９９】
（２−１−２）マウスへの投与実験方法
Ｓｔｄ：ｄｄｙ系マウス（６週齢、♂、平均体重２８ｇ）（日本エスエルシー社より購入）を使用した。1週間予備飼育した後、１日目に、予め別のマウス腹腔内で培養しておいたＳａｒｃｏｍａ１８０細胞を滅菌生理食塩水に懸濁させた状態で、1匹あたり１×１０６個腹腔内に投与した。コントロール１のマウスには、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を投与しなかった。
【０１００】
２日目からの１０日間は、試験区のマウスには、毎日、オリゴ糖の生理食塩水溶液を腹腔内投与した。また、コントロール１及びコントロール２のマウスには、同量の生理食塩水溶液を投与した。１回あたりの投与量は、全て０．１ｍｌとした。１試験区あたりのマウスは７匹とし、各試験区は表８に示すとおりであった。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
投与開始から、体重と生存数を測定した。動物福祉の観点から、マウスを死亡したと見なす際に、当研究室で定めている人道的エンドポイントを判断基準として用いた。すなわち、（１）真上から測定した胸部の体幅に対する腹部の体幅が２００％を超えるとき、及び（２）対照１のマウスの平均体重に対し、体重が１５０％を超えるときの２点である。
【０１０３】
（２−２）結果
各試験区のマウス生存数を表９及び図３３に示す。０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と、０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群で、最も生存率（７１．４％）が高かった。これらに次ぐ生存率（４２．９％）を示したのは、非吸着画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と、０．５Ｎ画分由来オリゴ糖を５００μｇ／ｋｇで投与した群と、全糖由来オリゴ糖を５００μｇ／ｋｇで投与した群であった。
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
以上のように、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群と０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖を１００μｇ／ｋｇで投与した群で、抗腫瘍活性が認められた。しかし、これらの画分由来オリゴ糖を初めとして、寒天多糖由来のオリゴ糖は、（１−２）に示したように、直接細胞を攻撃しない。従って、０．２５Ｎ画分由来オリゴ糖と０．７５Ｎ画分由来オリゴ糖は、免疫システムを賦活することにより、結果的に腫瘍を抑制したのではないかと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に係る寒天多糖類の分析方法や分画方法は、寒天の分類や分離精製に利用できる。また、本発明は、寒天多糖由来のオリゴ糖を、寒天全糖又はその分画物から得ることを可能にする。さらに、本発明は、抗腫瘍活性を示す組成物の調製に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を電気泳動することからなる寒天多糖の分析方法であって、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行うことを特徴とする寒天多糖の分析方法。
【請求項２】
寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度が４０℃〜７０℃である、請求項１に記載の寒天多糖の分析方法。
【請求項３】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行うことを特徴とする寒天多糖の分画方法。
【請求項４】
寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことを特徴とする寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法。
【請求項５】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項６】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項７】
無機塩濃度を段階的に高める、請求項５又は６に記載の抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項８】
加水分解を、強酸を使用して酸の規定度を０．００１Ｎ〜０．２Ｎとして行う、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項１】
セルロースアセテート膜又は濾紙で、寒天又は寒天の分画物の水性溶液を電気泳動することからなる寒天多糖の分析方法であって、寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度にて電気泳動を行うことを特徴とする寒天多糖の分析方法。
【請求項２】
寒天又は寒天の分画物が溶解状態を保つ温度が４０℃〜７０℃である、請求項１に記載の寒天多糖の分析方法。
【請求項３】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行うことを特徴とする寒天多糖の分画方法。
【請求項４】
寒天又は寒天の分画物の水溶液を、酸の規定度が０．００１Ｎ〜０．２Ｎの水溶液とし、温度を６０℃〜１０５℃に保持して多糖類の加水分解を行うことを特徴とする寒天又は寒天分画物中の多糖のオリゴ糖化方法。
【請求項５】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．２〜０．３Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項６】
寒天の水性溶液を、寒天が溶解状態を保つ温度にて陰イオン交換樹脂に通し、その後、陰イオン交換樹脂を寒天が溶解状態を保つ温度に保持したままで、水、続いて無機塩水溶液を使用してその無機塩濃度を高めながら寒天多糖の溶出を行い、０．７〜０．８Ｍの無機塩濃度にて溶出した試料を集め、その試料を温度６０℃〜１０５℃にて加水分解して得られる、抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項７】
無機塩濃度を段階的に高める、請求項５又は６に記載の抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【請求項８】
加水分解を、強酸を使用して酸の規定度を０．００１Ｎ〜０．２Ｎとして行う、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の抗腫瘍活性を示すオリゴ糖組成物。
【図４】
【図７】
【図１５】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３３】
【図７】
【図１５】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３３】
【公開番号】特開２０１０−２３０３３６（Ｐ２０１０−２３０３３６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７５３７６（Ｐ２００９−７５３７６）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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