抗酸化性成分の取得方法及び機能性組成物
【課題】 黒糖に含まれる機能性成分を効率的に抽出して、健康食品や医薬の原料として用いることのできる組成物を提供することを目的とする。
【解決手段】 黒糖から、高濃度酢酸を用いて分離抽出操作を施すことにより、また、必要によりゲルクロマトグラフィーで精製することによって、フラボノイドを含有またはフラボノイドを主成分とし、ヒト赤血球変形能低下抑制作用をも有する抗酸化性成分を取得する。得られた組成物は、フラボノイドに起因して健康食品や医薬の原料となるものである。
【解決手段】 黒糖から、高濃度酢酸を用いて分離抽出操作を施すことにより、また、必要によりゲルクロマトグラフィーで精製することによって、フラボノイドを含有またはフラボノイドを主成分とし、ヒト赤血球変形能低下抑制作用をも有する抗酸化性成分を取得する。得られた組成物は、フラボノイドに起因して健康食品や医薬の原料となるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、黒糖からの分離抽出によって得られる、抗酸化性、さらには抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有する抗酸化性成分の取得方法に関するものである。
また、黒糖から分離抽出された抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有する機能性組成物に関するものであって、健康食品の原料として、あるいは各種疾病の予防又は治療用の医薬として使用される可能性の高いもので、それらの健康食品調製技術、医薬調製技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
黒糖は、砂糖キビの搾り汁に石灰を加えてアク抜きをしたのち、加熱濃縮して、固形化された含蜜糖の一種であって、産地の沖縄では、お茶うけとしてよく使われているものである。
この黒糖は、砂糖キビに由来するビタミンやミネラルを多く含み、最近では、健康食品の一つとして、賞揚されているものである。
【０００３】
これらビタミンやミネラルなどの黒糖に含まれる成分は、砂糖キビの産地や種類、製造方法、特にアク抜きの影響を強く受けるものであるが、それらについての研究は、あまり行われていないのが現状である。
【０００４】
数少ない研究の内の一つとして、黒糖を適当量の水に溶解し、色素成分を吸着剤に吸着させ、アルコールにより溶離させた色素成分を皮膚外用剤の成分とすることが、特許第２７１１６３０号公報（特許文献１）に示されている。
【０００５】
また、ジクロロメタンを用いて黒糖からの抽出物を、シリカゲルカラムにより分離精製することによりフェノール性抗酸化成分を得たことが、高良等によって、日本農芸化学会誌（Ｖｏｌ．７４・Ｎｏ．８；ｐｐ．８８５〜８９０，２０００（非特許文献１））で報告されている。
【特許文献１】特許第２７１１６３０号公報（特許請求の範囲、段落番号００１４，００１５）
【非特許文献１】日本農芸化学会誌 Ｖｏｌ．７４・Ｎｏ．８；ｐｐ．８８５〜８９０，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者は、黒糖に含有される各種成分の特性をより深く追求し、それらの特性を有効に活用するために、黒糖における有効成分を探索する一方、健康食品や医薬の原料として用い、より効率的に黒糖を使用することについて検討した。
【０００７】
その結果、発明者等は、黒糖からの高濃度酢酸による抽出・分離により、抗酸化性成分が容易に取得できること、得た抗酸化性成分を、ゲルクロマトグラフィーを用いることにより、フェノール性成分とフラボノイドに分離し、得られたフラボノイドが、ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有することを見出して、この発明を完成したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
酢酸を用いて黒糖から分離抽出すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法である。
【０００９】
また、この発明の請求項２に記載の発明は、
酢酸を用いて黒糖から分離抽出したのち、ゲルクロマトグラフィーで精製すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法である。
【００１０】
また、この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記酢酸が、
濃度８５〜９５％の高濃度酢酸水溶液であること
を特徴とするものである。
【００１１】
また、この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記抗酸化性成分が、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するものであること
を特徴とするものである。
【００１２】
また、この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項４に記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記抗酸化性成分が、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とするものであること
を特徴とするものである。
【００１３】
また、この発明の請求項６に記載の発明は、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とし、
抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とする機能性組成物である。
【００１４】
また、この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項６に記載の機能性組成物において、
前記フラボノイドは、
黒糖から分離抽出されたものであること
を特徴とする機能性組成物である。
【００１５】
また、この発明の請求項８に記載の発明は、
請求項７に記載の機能性組成物において、
前記分離抽出は、
酢酸を用いて行われたこと
を特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
この発明の抗酸化性成分の取得方法は、黒糖中の有効成分である抗酸化性成分を容易に取出すことができるものである。
また、この取得方法により得られる機能性組成物は、抗酸化性機能とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するもので、健康食品の素材として、あるいは、医薬の原料として、有効に利用されるものである。
【００１７】
また、この発明の薬効性組成物は、粉末状態でも、酢酸あるいは水又はエタノール溶液としても使用することができるため、また、上記のような効果を発現させるために、健康食品や医薬として利用する際に、効率的にまた効果的に活用することを可能とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この発明における分離抽出は、黒糖を対象にして行われるものである。
黒糖は、その成分が、砂糖キビの産地や種類、製造方法、特にアク抜きの影響を強く受けるため、この発明により得られる抽出物の収量や構成成分に多少の差異を有するが、それらの違いに関わらず、この発明では何らそれらの違いを問題にすることなく用いることができる。
それら黒糖は、分離抽出効率を良くするために、乳鉢等を用いて粉末化しておくのが好ましい。
【００１９】
分離抽出には、酢酸、通常は濃度８５〜９５％の高濃度酢酸が用いられる。
分離抽出は、室温で０．５〜１時間、攪拌しながら、さらには超音波処理を施して行なうことが好ましく、それにより、目的とする抽出物が得られる。
【実施例】
【００２０】
＜抗酸化性成分の取得＞
[黒糖からの分離抽出］
下記１０種類の黒糖のそれぞれについて、酢酸を用いて抗酸化性成分を以下の手順で取得した。
黒糖を乳鉢で擂り潰し、得られた黒糖粉末２０ｇを食品添加用酢酸（酢酸濃度９０％）６０ｍｌに加え、よく攪拌し、超音波処理を施した後、ガラスフィルターで洗浄液として上記酢酸を２０ｍｌ用いて濾過した。
得られた濾液を、減圧乾固し、５０％のエタノールに溶解し、２０ｍｌの分離抽出成分溶液とした。
得られた分離抽出成分の収量および収率を、表１に示した。
［黒糖の種類］
Ｎｏ．１： 黒糖工房八風畑
Ｎｏ．２： 喜界島産
Ｎｏ．３： ＪＡ沖縄与那国製糖工場
Ｎｏ．４： 西表製糖工場
Ｎｏ．５： 宮古製糖（株）多良間工場
Ｎｏ．６： ＪＡ沖縄粟国製糖工場
Ｎｏ．７： ＪＡ沖縄伊平屋製糖工場
Ｎｏ．８： 小浜糖業株式会社
Ｎｏ．９： 波照間製糖株式会社
Ｎｏ．１０： 薩南製糖株式会社
【００２１】
＜ラジカル捕捉活性の測定＞
上記で得られた各分離抽出物のラジカル捕捉活性を、以下の方法で測定し、その結果を表１に示した。
表１から明らかなように、各分離抽出物は、いずれもラジカル捕捉活性を示した。
【００２２】
＜ラジカル捕捉活性測定法＞
試料溶液０．３ｍｌに、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）溶液０．３ｍｌ、ＭＥＳ緩衝液０．３ｍｌ、２０％エタノール０．３ｍｌを加え、室温で２０分間反応させた後、５２０ｎｍでの吸光度を測定した。
その活性は、同様にして行った、アスコルビン酸（ＡｓＡ）でＤＰＰＨラジカル捕捉活性の検量線を作成し、試料ｇ当たりのラジカル捕捉活性をアスコルビン酸（ＡｓＡ）当量（μｍｏｌ／ｇ）で表した。
【００２３】
＜抗酸化活性の測定＞
上記で得られた各分離抽出物の抗酸化活性を、リノール酸の酸化物がβ−カロチンを退色させる作用を利用したＭｉｌｌｅｒらの方法に準じ、以下の方法で測定した結果を表１に示した。
表１から明らかなように、各分離抽出物に抗酸化活性が認められ、いずれも黒糖から分離抽出された抗酸化性成分であった。
【００２４】
＜抗酸化活性の測定方法＞
試料液０．１ｍｌを分注した分光光度計用試験管セルに、リノ−ル酸−β−カロチン溶液４．９ｍｌを加えて攪拌し、温度５０℃の恒温槽で、２０分間反応させた場合のβ−カロチンの退色度を４７０ｎｍの吸光度によって求め、合成抗酸化剤ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）による吸光度の減少量を測定し、試料と同じ減少量を与えるＢＨＡの濃度によって、試料の抗酸化活性を表した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
＜抗酸化性成分の分画＞
［ゲルクロマトグラフィーによる分画］
上記の分離抽出物である抗酸化性成分を、１％酢酸溶液で洗浄したバイオゲルＰ−１０カラム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製：２×２９ｃｍ）に添加し、同溶液を用い室温で展開した後、吸着した成分を５０％エタノールとメタノールで溶出した。
図１にＮｏ．１〜３の黒糖から取得した抗酸化性成分のパターンを示した。
また、図２に示すように、Ｎｏ．３の黒糖から取得した抗酸化性成分を、該パターンに基づいて試料を１２に分画し、各画分について、ラジカル捕捉活性と抗酸化活性を測定した結果を、表２に示した。
表２に明らかように、各画分とも、ラジカル捕捉活性と抗酸化活性を有するものであった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
［紫外線吸収スペクトルによる同定］
分画された抗酸化性成分のそれぞれを、下記条件で高速液体クロマトグラフィーに付し、よって得られた主なピークについて紫外線吸収スペクトルによる同定を行った。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
Ｗａｔｅｒｓ社製装置のＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｒ Ｃ１８ ５μｍカラム（４．６×２５０ｍｍ）を用い、０．１％ＴＦＡ溶液中ＭｅＣＮ濃度を４０分間に０から６０％へ直線的に上昇させて溶出した。
溶出温度 ４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍ
図３にその結果を示した。
この結果から、抗酸化性成分は、主にメラノイジン、フェノール性成分及びフラボノイドの３種から構成されていることが判明した。
また、１０種の黒糖から分離抽出された抗酸化性成分を高速液体クロマトグラフィーに付し、フラボノイド成分を３４０ｎｍで検出した結果、図４に示すように、フラボノイドとしては、６種（ａ〜ｆ）以上が含まれるが、黒糖の種類毎に含有量が異なることが判明した。
【００２９】
［赤血球変形能低下抑制作用測定］
成分が、フラボノイドと同定された画分ＦＲ．１０とＦＲ．１２について、赤血球変形能低下抑制作用を、赤血球変形能低下抑制作用を有する、酸化剤（ＡＡＰＨ：２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）との比較で検討した。
測定方法は、以下のとおりである。
図５に示される結果から、黒糖から分離抽出されたフラボノイドは、赤血球変形能低下抑制作用を有することが認められる。
【００３０】
［赤血球変形能低下抑制作用測定法］
３．８％クエン酸ソーダ溶液１．０ｍｌ入りの真空採血管に、全量１０．０ｍｌとなるように採血したのち、２５００ｒｐｍ×１０分遠心分離して赤血球を沈殿させた後、洗浄し、ＨＥＰＥＳを加え、ヘマトクリット値６．０％赤血球浮遊液を調製した。
このヘマトクリット値６．０％赤血球浮遊液３．０ｍｌに、ＨＥＰＥＳを（ａ；３．０ｍｌ、ｂ；２．４０ｍｌ、ｃ；２．３４ｍｌ、ｄ；２．３４ｍｌ）加え、温度３７．０℃で予備インキュベートしたのち、ｂとｃとｄには、５００ｍＭのＡＡＰＨ溶液０．６ｍｌ、 ｃには、画分ＦＲ．１０を０．０６ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ｄには、画分ＦＲ．１２を０．０６ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、温度３７．０℃で４５分インキュベートした。
その後、測定するまで氷冷し、測定は、温度２５．０℃で７分、再度インキュベートしてから行なった。
なお、ａはコントロールである。
【００３１】
なお、赤血球変形能は、従来の定量性と再現性に難点のある微細孔（ｎｕｃｌｅｉｐｏｒｅ）フィルターを用いた方法に代わるものとして、発明者が開発したフィルター特性が顕著に改善された、ニッケルメッシュ（ｎｉｃｋｅｌ ｍｅｓｈ）フィルターを用いる、以下の方法で測定した。
ニッケルメッシュは、フォトレジスト法と特殊メッキ法を組み合わせて作成されたニッケル薄膜フィル茶葉、微小孔の数、形状、分布が正確に一定であるばかりでなく、数秒間の超音波洗浄によって１００回以上の再使用が可能である。
加えて、ニッケルメッシュの微小孔の辺縁は、滑らかでテーパを持ち、これにより混入白血球が機械的影響を受けることはなく、微小孔には融合や分枝がまったくない。
これらの特徴により、以下の方法は、高い定量性と再現性を保持するものである。
【００３２】
この試験は、図６に示すように、垂直に立てたガラス管（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｔｕｂｅ）１に、タイゴンチューブを介してニッケルメッシュホルダー２を接続し、通常１５ｃｍの高さ（ｈｅｉｇｈｔ：ｈ）より、ＨＥＰＥＳバッファーで調整した生理食塩水を用いて作成した赤血球浮遊液４を濾過させて行なう。
ガラス管１の周囲は、恒温水５を還流させて、試料を定温に保っている。
ガラス管のゼロレベルに設置した圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ：Ｐ）トランスデューサー６で、試料を濾過中の圧力降下を連続的に検出し、これを増幅器とＡＤ変換器（いずれも図示せず）を介してパソコン７に取り込み、流量（ｆｌｏｗｒａｔｅ：Ｑ）を計算する。
流量は、圧力を高さに変換し（Ｐ＝ρｇｈ）、高さ‐時間（ｈ−ｔ）曲線の微分値（ｄｈ／ｄｔ）を取って、これにガラス管の断面積（ａ）を乗じて得られる（Ｑ＝ｄｈ／ｄｔ・ａ）。
血球を含まないコントロール溶液（ＨＥＰＥＳバッファー調整生食水：ニュートン流体）の圧−流量曲線を対照として、赤血球浮遊液の圧−流量曲線を検討し、ある一定圧（通常１００ｍｍ・Ｈ２Ｏ）での、対照液の流量に対する赤血球浮遊液の流量(％)をもって赤血球変形能を評価する。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
この発明によれば、上記のような優れた特性を有し、かつ粉末ないし水、酢酸又はエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能な抗酸化性成分を、黒糖から容易に得られることができるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。
また、この機能性組成物は、上記のような優れた特性を有し、かつ粉末ないし水、酢酸又はエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能なものであるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】黒糖Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３から分離抽出された抗酸化性成分のゲルクロマトグラフィーのパターンを比較した図である。
【図２】黒糖Ｎｏ．３から分離抽出された抗酸化性成分のゲルクロマトグラフィーのパターンを示す図である。
【図３】図２で分画された１２画分のそれぞれの、高速液体クロマトグラフィーによって得られた主なピークの吸収スペクトルを示す図である。
【図４】黒糖から分離抽出された抗酸化性成分の高速液体クロマトグラフィーのパターンを示す図である。
【図５】黒糖から分離抽出されたフラボノイドの赤血球変形能低下抑制作用を示す図である。
【図６】赤血球変形能低下抑制作用測定装置の概念図である。
【符号の説明】
【００３５】
１ ガラス管
２ ニッケルメッシュホルダー
３ ニッケルメッシュフィルター
４ 赤血球浮遊液
５ 恒温水
６ 圧力トランスデューサー
７ パソコン
【技術分野】
【０００１】
この発明は、黒糖からの分離抽出によって得られる、抗酸化性、さらには抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有する抗酸化性成分の取得方法に関するものである。
また、黒糖から分離抽出された抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有する機能性組成物に関するものであって、健康食品の原料として、あるいは各種疾病の予防又は治療用の医薬として使用される可能性の高いもので、それらの健康食品調製技術、医薬調製技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
黒糖は、砂糖キビの搾り汁に石灰を加えてアク抜きをしたのち、加熱濃縮して、固形化された含蜜糖の一種であって、産地の沖縄では、お茶うけとしてよく使われているものである。
この黒糖は、砂糖キビに由来するビタミンやミネラルを多く含み、最近では、健康食品の一つとして、賞揚されているものである。
【０００３】
これらビタミンやミネラルなどの黒糖に含まれる成分は、砂糖キビの産地や種類、製造方法、特にアク抜きの影響を強く受けるものであるが、それらについての研究は、あまり行われていないのが現状である。
【０００４】
数少ない研究の内の一つとして、黒糖を適当量の水に溶解し、色素成分を吸着剤に吸着させ、アルコールにより溶離させた色素成分を皮膚外用剤の成分とすることが、特許第２７１１６３０号公報（特許文献１）に示されている。
【０００５】
また、ジクロロメタンを用いて黒糖からの抽出物を、シリカゲルカラムにより分離精製することによりフェノール性抗酸化成分を得たことが、高良等によって、日本農芸化学会誌（Ｖｏｌ．７４・Ｎｏ．８；ｐｐ．８８５〜８９０，２０００（非特許文献１））で報告されている。
【特許文献１】特許第２７１１６３０号公報（特許請求の範囲、段落番号００１４，００１５）
【非特許文献１】日本農芸化学会誌 Ｖｏｌ．７４・Ｎｏ．８；ｐｐ．８８５〜８９０，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者は、黒糖に含有される各種成分の特性をより深く追求し、それらの特性を有効に活用するために、黒糖における有効成分を探索する一方、健康食品や医薬の原料として用い、より効率的に黒糖を使用することについて検討した。
【０００７】
その結果、発明者等は、黒糖からの高濃度酢酸による抽出・分離により、抗酸化性成分が容易に取得できること、得た抗酸化性成分を、ゲルクロマトグラフィーを用いることにより、フェノール性成分とフラボノイドに分離し、得られたフラボノイドが、ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有することを見出して、この発明を完成したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
酢酸を用いて黒糖から分離抽出すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法である。
【０００９】
また、この発明の請求項２に記載の発明は、
酢酸を用いて黒糖から分離抽出したのち、ゲルクロマトグラフィーで精製すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法である。
【００１０】
また、この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記酢酸が、
濃度８５〜９５％の高濃度酢酸水溶液であること
を特徴とするものである。
【００１１】
また、この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記抗酸化性成分が、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するものであること
を特徴とするものである。
【００１２】
また、この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項４に記載の抗酸化性成分の取得方法において、
前記抗酸化性成分が、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とするものであること
を特徴とするものである。
【００１３】
また、この発明の請求項６に記載の発明は、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とし、
抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とする機能性組成物である。
【００１４】
また、この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項６に記載の機能性組成物において、
前記フラボノイドは、
黒糖から分離抽出されたものであること
を特徴とする機能性組成物である。
【００１５】
また、この発明の請求項８に記載の発明は、
請求項７に記載の機能性組成物において、
前記分離抽出は、
酢酸を用いて行われたこと
を特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
この発明の抗酸化性成分の取得方法は、黒糖中の有効成分である抗酸化性成分を容易に取出すことができるものである。
また、この取得方法により得られる機能性組成物は、抗酸化性機能とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するもので、健康食品の素材として、あるいは、医薬の原料として、有効に利用されるものである。
【００１７】
また、この発明の薬効性組成物は、粉末状態でも、酢酸あるいは水又はエタノール溶液としても使用することができるため、また、上記のような効果を発現させるために、健康食品や医薬として利用する際に、効率的にまた効果的に活用することを可能とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この発明における分離抽出は、黒糖を対象にして行われるものである。
黒糖は、その成分が、砂糖キビの産地や種類、製造方法、特にアク抜きの影響を強く受けるため、この発明により得られる抽出物の収量や構成成分に多少の差異を有するが、それらの違いに関わらず、この発明では何らそれらの違いを問題にすることなく用いることができる。
それら黒糖は、分離抽出効率を良くするために、乳鉢等を用いて粉末化しておくのが好ましい。
【００１９】
分離抽出には、酢酸、通常は濃度８５〜９５％の高濃度酢酸が用いられる。
分離抽出は、室温で０．５〜１時間、攪拌しながら、さらには超音波処理を施して行なうことが好ましく、それにより、目的とする抽出物が得られる。
【実施例】
【００２０】
＜抗酸化性成分の取得＞
[黒糖からの分離抽出］
下記１０種類の黒糖のそれぞれについて、酢酸を用いて抗酸化性成分を以下の手順で取得した。
黒糖を乳鉢で擂り潰し、得られた黒糖粉末２０ｇを食品添加用酢酸（酢酸濃度９０％）６０ｍｌに加え、よく攪拌し、超音波処理を施した後、ガラスフィルターで洗浄液として上記酢酸を２０ｍｌ用いて濾過した。
得られた濾液を、減圧乾固し、５０％のエタノールに溶解し、２０ｍｌの分離抽出成分溶液とした。
得られた分離抽出成分の収量および収率を、表１に示した。
［黒糖の種類］
Ｎｏ．１： 黒糖工房八風畑
Ｎｏ．２： 喜界島産
Ｎｏ．３： ＪＡ沖縄与那国製糖工場
Ｎｏ．４： 西表製糖工場
Ｎｏ．５： 宮古製糖（株）多良間工場
Ｎｏ．６： ＪＡ沖縄粟国製糖工場
Ｎｏ．７： ＪＡ沖縄伊平屋製糖工場
Ｎｏ．８： 小浜糖業株式会社
Ｎｏ．９： 波照間製糖株式会社
Ｎｏ．１０： 薩南製糖株式会社
【００２１】
＜ラジカル捕捉活性の測定＞
上記で得られた各分離抽出物のラジカル捕捉活性を、以下の方法で測定し、その結果を表１に示した。
表１から明らかなように、各分離抽出物は、いずれもラジカル捕捉活性を示した。
【００２２】
＜ラジカル捕捉活性測定法＞
試料溶液０．３ｍｌに、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）溶液０．３ｍｌ、ＭＥＳ緩衝液０．３ｍｌ、２０％エタノール０．３ｍｌを加え、室温で２０分間反応させた後、５２０ｎｍでの吸光度を測定した。
その活性は、同様にして行った、アスコルビン酸（ＡｓＡ）でＤＰＰＨラジカル捕捉活性の検量線を作成し、試料ｇ当たりのラジカル捕捉活性をアスコルビン酸（ＡｓＡ）当量（μｍｏｌ／ｇ）で表した。
【００２３】
＜抗酸化活性の測定＞
上記で得られた各分離抽出物の抗酸化活性を、リノール酸の酸化物がβ−カロチンを退色させる作用を利用したＭｉｌｌｅｒらの方法に準じ、以下の方法で測定した結果を表１に示した。
表１から明らかなように、各分離抽出物に抗酸化活性が認められ、いずれも黒糖から分離抽出された抗酸化性成分であった。
【００２４】
＜抗酸化活性の測定方法＞
試料液０．１ｍｌを分注した分光光度計用試験管セルに、リノ−ル酸−β−カロチン溶液４．９ｍｌを加えて攪拌し、温度５０℃の恒温槽で、２０分間反応させた場合のβ−カロチンの退色度を４７０ｎｍの吸光度によって求め、合成抗酸化剤ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）による吸光度の減少量を測定し、試料と同じ減少量を与えるＢＨＡの濃度によって、試料の抗酸化活性を表した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
＜抗酸化性成分の分画＞
［ゲルクロマトグラフィーによる分画］
上記の分離抽出物である抗酸化性成分を、１％酢酸溶液で洗浄したバイオゲルＰ−１０カラム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製：２×２９ｃｍ）に添加し、同溶液を用い室温で展開した後、吸着した成分を５０％エタノールとメタノールで溶出した。
図１にＮｏ．１〜３の黒糖から取得した抗酸化性成分のパターンを示した。
また、図２に示すように、Ｎｏ．３の黒糖から取得した抗酸化性成分を、該パターンに基づいて試料を１２に分画し、各画分について、ラジカル捕捉活性と抗酸化活性を測定した結果を、表２に示した。
表２に明らかように、各画分とも、ラジカル捕捉活性と抗酸化活性を有するものであった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
［紫外線吸収スペクトルによる同定］
分画された抗酸化性成分のそれぞれを、下記条件で高速液体クロマトグラフィーに付し、よって得られた主なピークについて紫外線吸収スペクトルによる同定を行った。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
Ｗａｔｅｒｓ社製装置のＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｒ Ｃ１８ ５μｍカラム（４．６×２５０ｍｍ）を用い、０．１％ＴＦＡ溶液中ＭｅＣＮ濃度を４０分間に０から６０％へ直線的に上昇させて溶出した。
溶出温度 ４０℃、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍ
図３にその結果を示した。
この結果から、抗酸化性成分は、主にメラノイジン、フェノール性成分及びフラボノイドの３種から構成されていることが判明した。
また、１０種の黒糖から分離抽出された抗酸化性成分を高速液体クロマトグラフィーに付し、フラボノイド成分を３４０ｎｍで検出した結果、図４に示すように、フラボノイドとしては、６種（ａ〜ｆ）以上が含まれるが、黒糖の種類毎に含有量が異なることが判明した。
【００２９】
［赤血球変形能低下抑制作用測定］
成分が、フラボノイドと同定された画分ＦＲ．１０とＦＲ．１２について、赤血球変形能低下抑制作用を、赤血球変形能低下抑制作用を有する、酸化剤（ＡＡＰＨ：２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩）との比較で検討した。
測定方法は、以下のとおりである。
図５に示される結果から、黒糖から分離抽出されたフラボノイドは、赤血球変形能低下抑制作用を有することが認められる。
【００３０】
［赤血球変形能低下抑制作用測定法］
３．８％クエン酸ソーダ溶液１．０ｍｌ入りの真空採血管に、全量１０．０ｍｌとなるように採血したのち、２５００ｒｐｍ×１０分遠心分離して赤血球を沈殿させた後、洗浄し、ＨＥＰＥＳを加え、ヘマトクリット値６．０％赤血球浮遊液を調製した。
このヘマトクリット値６．０％赤血球浮遊液３．０ｍｌに、ＨＥＰＥＳを（ａ；３．０ｍｌ、ｂ；２．４０ｍｌ、ｃ；２．３４ｍｌ、ｄ；２．３４ｍｌ）加え、温度３７．０℃で予備インキュベートしたのち、ｂとｃとｄには、５００ｍＭのＡＡＰＨ溶液０．６ｍｌ、 ｃには、画分ＦＲ．１０を０．０６ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ｄには、画分ＦＲ．１２を０．０６ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、温度３７．０℃で４５分インキュベートした。
その後、測定するまで氷冷し、測定は、温度２５．０℃で７分、再度インキュベートしてから行なった。
なお、ａはコントロールである。
【００３１】
なお、赤血球変形能は、従来の定量性と再現性に難点のある微細孔（ｎｕｃｌｅｉｐｏｒｅ）フィルターを用いた方法に代わるものとして、発明者が開発したフィルター特性が顕著に改善された、ニッケルメッシュ（ｎｉｃｋｅｌ ｍｅｓｈ）フィルターを用いる、以下の方法で測定した。
ニッケルメッシュは、フォトレジスト法と特殊メッキ法を組み合わせて作成されたニッケル薄膜フィル茶葉、微小孔の数、形状、分布が正確に一定であるばかりでなく、数秒間の超音波洗浄によって１００回以上の再使用が可能である。
加えて、ニッケルメッシュの微小孔の辺縁は、滑らかでテーパを持ち、これにより混入白血球が機械的影響を受けることはなく、微小孔には融合や分枝がまったくない。
これらの特徴により、以下の方法は、高い定量性と再現性を保持するものである。
【００３２】
この試験は、図６に示すように、垂直に立てたガラス管（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｔｕｂｅ）１に、タイゴンチューブを介してニッケルメッシュホルダー２を接続し、通常１５ｃｍの高さ（ｈｅｉｇｈｔ：ｈ）より、ＨＥＰＥＳバッファーで調整した生理食塩水を用いて作成した赤血球浮遊液４を濾過させて行なう。
ガラス管１の周囲は、恒温水５を還流させて、試料を定温に保っている。
ガラス管のゼロレベルに設置した圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ：Ｐ）トランスデューサー６で、試料を濾過中の圧力降下を連続的に検出し、これを増幅器とＡＤ変換器（いずれも図示せず）を介してパソコン７に取り込み、流量（ｆｌｏｗｒａｔｅ：Ｑ）を計算する。
流量は、圧力を高さに変換し（Ｐ＝ρｇｈ）、高さ‐時間（ｈ−ｔ）曲線の微分値（ｄｈ／ｄｔ）を取って、これにガラス管の断面積（ａ）を乗じて得られる（Ｑ＝ｄｈ／ｄｔ・ａ）。
血球を含まないコントロール溶液（ＨＥＰＥＳバッファー調整生食水：ニュートン流体）の圧−流量曲線を対照として、赤血球浮遊液の圧−流量曲線を検討し、ある一定圧（通常１００ｍｍ・Ｈ２Ｏ）での、対照液の流量に対する赤血球浮遊液の流量(％)をもって赤血球変形能を評価する。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
この発明によれば、上記のような優れた特性を有し、かつ粉末ないし水、酢酸又はエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能な抗酸化性成分を、黒糖から容易に得られることができるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。
また、この機能性組成物は、上記のような優れた特性を有し、かつ粉末ないし水、酢酸又はエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能なものであるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】黒糖Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３から分離抽出された抗酸化性成分のゲルクロマトグラフィーのパターンを比較した図である。
【図２】黒糖Ｎｏ．３から分離抽出された抗酸化性成分のゲルクロマトグラフィーのパターンを示す図である。
【図３】図２で分画された１２画分のそれぞれの、高速液体クロマトグラフィーによって得られた主なピークの吸収スペクトルを示す図である。
【図４】黒糖から分離抽出された抗酸化性成分の高速液体クロマトグラフィーのパターンを示す図である。
【図５】黒糖から分離抽出されたフラボノイドの赤血球変形能低下抑制作用を示す図である。
【図６】赤血球変形能低下抑制作用測定装置の概念図である。
【符号の説明】
【００３５】
１ ガラス管
２ ニッケルメッシュホルダー
３ ニッケルメッシュフィルター
４ 赤血球浮遊液
５ 恒温水
６ 圧力トランスデューサー
７ パソコン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸を用いて、黒糖から分離抽出すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法。
【請求項２】
酢酸を用いて黒糖から分離抽出した後、ゲルクロマトグラフィーで精製すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法。
【請求項３】
前記酢酸が、
濃度８５〜９５％の高濃度酢酸水溶液であること
を特徴とする請求項１又は２に記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項４】
前記抗酸化性成分が、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するものであること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項５】
抗酸化性成分が、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とするものであること
を特徴とする請求項４記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項６】
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とし、
抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とする機能性組成物。
【請求項７】
前記フラボノイドは、
黒糖から分離抽出されたものであること
を特徴とする請求項６記載の機能性組成物。
【請求項８】
前記分離抽出が、
酢酸を用いて行われたこと
を特徴とする請求項７記載の機能性組成物。
【請求項１】
酢酸を用いて、黒糖から分離抽出すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法。
【請求項２】
酢酸を用いて黒糖から分離抽出した後、ゲルクロマトグラフィーで精製すること
を特徴とする抗酸化性成分の取得方法。
【請求項３】
前記酢酸が、
濃度８５〜９５％の高濃度酢酸水溶液であること
を特徴とする請求項１又は２に記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項４】
前記抗酸化性成分が、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するものであること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項５】
抗酸化性成分が、
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とするものであること
を特徴とする請求項４記載の抗酸化性成分の取得方法。
【請求項６】
フラボノイドを含有又はフラボノイドを主成分とし、
抗酸化性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とする機能性組成物。
【請求項７】
前記フラボノイドは、
黒糖から分離抽出されたものであること
を特徴とする請求項６記載の機能性組成物。
【請求項８】
前記分離抽出が、
酢酸を用いて行われたこと
を特徴とする請求項７記載の機能性組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１０２２３８（Ｐ２００９−１０２２３８Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７３６１９（Ｐ２００７−２７３６１９）
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１５日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００７年度中四国・西日本支部合同大会」に文書をもって発表
【出願人】（５９９０３５３３９）株式会社 レオロジー機能食品研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２２日（２００７．１０．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年９月１５日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００７年度中四国・西日本支部合同大会」に文書をもって発表
【出願人】（５９９０３５３３９）株式会社 レオロジー機能食品研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
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