改善された生物発光を有する発光タンパク質
改善された発光活性を有する発光タンパク質、カルシウム指示薬としての、および、細胞内カルシウムの検出および測定のための細胞ベースアッセイにおけるその使用が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された発光作用を有するキメラ発光タンパク質、レポーター遺伝子系および細胞内カルシウムの検出および測定のための細胞ベースアッセイにおけるカルシウム指示薬としてのその使用を提供する。
【０００２】
(発明の背景)
生物発光は、種々の化学発光反応系を介して可視光を放出する生体の能力である。生物発光反応は、３つの主要な構成要素であるルシフェリン、ルシフェラーゼおよび酸素分子を必要とする。しかしながら、一部の反応においては、カチオン(Ｃａ++およびＭｇ++)および補因子(ＡＴＰ、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ)を含む他の構成要素が必要となる場合がある。ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸化を触媒し、不安定な中間体を生成する酵素である。この不安定な中間体が基底状態に分解し、オキシルシフェリンを発生するときに、光が放出される。多くの異なる無関係な種類のルシフェリンが存在するが、少なくとも７つの門からの多くの種は、３個のアミノ酸(２個のチロシンと１個のフェニルアラニン)により形成される環を含む、セレンテラジンとして知られる同じルシフェリンを用いている。一部の動物(例えば、クラゲ)においては、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、安定した「発光タンパク質」の形態で抽出することができ、これはカルシウムの結合により光を放出する。発光タンパク質は、これらがルシフェラーゼとルシフェリンとの安定化した酸素化(oxygenated)中間体複合体である点でルシフェラーゼと異なる。発光タンパク質は、多くの海洋性腔腸動物に存在し、これらの生物が、繁殖、摂食および防御を含む種々の目的のために光を放出することを可能にする(1)。細菌は連続して光を放出するが、他の多くの生物においては、発光は、典型的には継続時間0.1〜１秒の閃光として生じる。これは、酵素反応の迅速なスイッチのオン／オフと、適切に隔離されかつ素早い動員の準備ができている反応物とを必要とする。腔腸動物においては、閃光の発生はカルシウムの流入によって引き起こされる。発光タンパク質のカルシウム結合部位はカルモジュリンと相同(homologous)である。カルシウムの存在下、発光タンパク質は分子内反応により可視光を放出する。多くの発光生物がいるが、７種のみの発光タンパク質、すなわち、タラシコリン(Thalassicolin)(2、3)、エクオリン(4〜6)、ミトロコミン(ハリスタウリン(Halistaurin)と同義)(7、8)、クリチン(Clytin)(フィアリジン(Phialidin)と同義)(8、9)、オベリン(Obelin)(2、6、10、11)、ニミオプシン(Mnemiopsin)(12、13)、およびベロビン(Berovin)(12、13)がこれまでに単離されている。これらのタンパク質は全てアポタンパク質、イミダゾピラジン発色団(セレンテラジン)および酸素の複合体である。これらの構造は、特に３つのカルシウム結合部位(ＥＦハンド構造)を含む領域において高度に保存されている。これらのＥＦハンド構造は、カルシウム結合タンパク質ファミリーに特徴的である。発光タンパク質は、ＥＦハンドポケットに強固に結合するカルシウムとの反応の際に光を放出する。この反応は、単一回転の(single turnover)事象であり、ＣＯ2の放出と、青色領域(λmax＝470ｎｍ)の光の放出をもたらす。用語「発光タンパク質」は、発光可能なルシフェリン結合ポリペプチドを指すが、「アポ発光タンパク質」は、ルシフェリンを有しないタンパク質を示すのに用いられる。
【０００３】
最も研究されている発光タンパク質は、Aequorea victoriaから単離されたエクオリン(14)、およびObelia longissimaから単離されたオベリン(15)である。Ｃａ++を結合すると、エクオリンはコンホメーション変化を起こし、自身をオキシゲナーゼ(ルシフェラーゼ)に変換し、これが次に結合した酸素分子によるセレンテラジンの酸化を触媒する。この青色の蛍光タンパク質は、アポ発光タンパク質に共有結合していない、セレンテラジンの酸化産物であるセレンテラミドからなる。この発光タンパク質は、アポ発光タンパク質から、セレンテラジン、酸素分子、ＥＤＴＡおよび２−メルカプトエタノールもしくはジチオスレイトールとのインキュベーションにより再生することができる。セレンテラジンは、発光タンパク質であるエクオリン、ミトロコミン(Mitrocomin)、クリチンおよびオベリンにより用いられる共通の発光基質であるため、光放出反応は、これら４種の発光タンパク質において同様であるとみられる(16)。最近エクオリンおよびオベリンの一次構造と結晶学的データが得られ、これらの機能について追加の情報がもたらされた。ヒドロ虫Obelia longissimaからの未変性のオベリンは、195アミノ酸残基(aa)の単鎖タンパク質であり、概算分子質量は、非共有結合した発色団基セレンテラジンを含めて20ｋＤａである。クリチンの一次構造の分析により、これは189アミノ酸残基を含み、発光タンパク質のファミリーに属することが示された。しかし、ヒドロ虫類のＣａ++結合発光タンパク質は、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンおよびチロシン残基の含量が比較的高い点で、カルモジュリンおよびトロポニンＣなどの他のＣａ++結合タンパク質と異なっている。
【０００４】
オベリンの構造および機能の研究は、Bondar VS et al., Biochemistry(2001), 66(9)：1014−8、 Vysotski ES et al., (2003), 42(20)：6013−24およびDeng L. et al., FEBS Lett.(2001), 506(3)：281−5に報告されている。後ろ２つは特にオベリン変異体Ｗ９２Ｆの生物発光および放出特性を記載している。
【０００５】
発光タンパク質は、信号伝達および遺伝子発現に伴う細胞事象をモニターするためのレポーター遺伝子技術に広く用いられている。
【０００６】
細胞事象およびその調節の研究は、高感度の、非侵襲性の分析方法を必要とする。発光タンパク質、そして一般的には生物発光は、蛍光系とは異なり実質的にバックグラウンドがないため、優れたレポーター系である。
【０００７】
発光タンパク質は、様々な刺激に対するカルシウムの変化をモニターするために、哺乳類細胞で発現されてきた。細胞内カルシウム濃度は、発光タンパク質を発現している哺乳類細胞にセレンテラジン補因子を添加し、細胞内カルシウム濃度を示す光子の放出を検出することにより測定することができる。
【０００８】
(発明の説明)
今回、オベリンタンパク質(アポベリン(Apobelin))の最初の２つのカルシウム結合部位の間に含まれる領域の、クリチン、エクオリン、タラシコリン、ミトロコミン、ニミオプシンおよびベロビンから選択される発光タンパク質の対応する領域による置換を介した、オベリンタンパク質のキメラ化により、改善された生物発光を有する新規な発光タンパク質が得られることが見出された。
【０００９】
本明細書中で用いる場合、オベリンは、Obelia longissimaおよびObelia geniculata(17)を含むオベリア属(Obelia)の様々な種から単離された任意の発光タンパク質を示し得る。参照となるオベリンヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１および２にそれぞれ記載されている。クリチン、ミトロコミンおよびエクオリンの参照アミノ酸およびヌクレオチド配列は、GenBankに、受託番号Q08121、P39047、AAA27720およびL13247、L31623、L29571でそれぞれ寄託されており、一方タラシコリン、ニミオプシンおよびベロビンについての配列は、参考文献２、３、12および13に記載されている。
【００１０】
本明細書中で用いる場合、「対応する領域または断片」は、それぞれの配列アラインメントにおいて、関連するタンパク質(オベリンと選択された発光タンパク質)に保存されていない、少なくとも１個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基を除き、オベリンの配列とマッチする、選択された発光タンパク質内の任意のアミノ酸配列を意味し、該領域または断片は、オベリンの配列を参照した場合、好ましくは残基42から122、より好ましくは残基50から95に及ぶ。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態によれば、キメラタンパク質は、オベリンのアミノ酸配列の残基50から94を、クリチンの配列の残基53から97に及ぶ断片で置換することにより得られる。こうして得た発光タンパク質は「フォチン(Photin)」と呼ばれ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明のキメラタンパク質は、１または２個以上のアミノ酸残基の欠失、付加または置換によりさらに変更することができるが、ただし、発光タンパク質の、光放出およびカルシウム反応性に関する活性プロファイルが維持されまたは増大しているという条件においてである。特に好ましいのは、オベリンの配列を参照した場合の位置55、66、67、73、74、75、78、83、84、87、89および94における置換である。
【００１３】
in vitroでの研究で示されるように、フォチンはカルシウム刺激に応答して強力な生物発光をもたらし、これは天然の発光タンパク質で観察されるものよりも一般に強いものである。
【００１４】
キメラ発光タンパク質の調製に関しては、オベリンのコード配列の部分およびオベリン以外の選択された発光タンパク質の部分を有する組換えＤＮＡ構築物を慣用の遺伝子操作により調製し、得られたキメラ産物をベクターに挿入し、適した宿主で発現させ、そしてその後単離・精製する。例えば、オベリン、および異なる発光タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲで増幅すること、または合成オリゴヌクレオチドでin vitroで構築することができ、そして、該産物は、増幅もしくはin vitroでの構築に用いられるオリゴヌクレオチドに天然に存在するか、もしくは人工的に導入された適切な制限部位を利用して、組換えを行うことができる。発現ベクターは、組換え構築物に加えて、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドンまたは転写エンハンサーのためのコンセンサス部位を含むことができる。ベクターはまた、ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を単離するための選択マーカーを含むことができる。好適なベクターは、例えば、酵母もしくは細菌プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、レトロウイルスまたはＤＮＡである。組換え構築物を担持するベクターは、慣用の技法により宿主に導入することができる。宿主細胞は原核性もしくは真核性、例えば細菌、酵母もしくは哺乳類細胞であってもよい。発光タンパク質の発現／産生のために好ましい宿主は哺乳類細胞であり、上皮またはリンパ芽球由来の細胞、例えばHek−293、CHO−K1、HepG2およびHL−60などを包含する。これらの細胞は、細胞質中に(18)、発光タンパク質にミトコンドリア標的配列を付加することによりミトコンドリア中に、またはその他の任意の細胞区画中に(19〜21)アポ発光タンパク質を発現することができる。あるいは、細菌または真菌などの非哺乳類細胞を使うこともできる。宿主細胞の種類が選択されたら、遺伝子構築物を、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔または他の慣用の技法により導入することができる。トランスフェクションの後、細胞を好適な培地で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングする。本発明の発光タンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの慣用の手順で単離および精製することができる。
【００１５】
オーバーラップ伸長(overlap extension)ＰＣＲにより、キメラ産物に点突然変異を導入することができる。
【００１６】
フォチンを産生するため、オベリン遺伝子のＮｄｅＩ/ＭｕｎＩ断片を、ヌクレオチド156から291にわたるクリチンのコード配列に相当する135ヌクレオチドの断片で置換した。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸分子に関する。ＤＮＡコード配列は、遺伝コードの縮重に基づいて変更することができ、例えば、異種の系での発現を改善するためにコドンの使い方を変えることができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、フォチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号４および５から選択される。
【００１９】
キメラ産物が機能するかどうかを試験するため、in vitro転写および翻訳実験を、セレンテラジンの存在下、無細胞小麦胚芽翻訳系(cell-free wheat germ translation system)で行った。これらの実験では、活性な発光タンパク質の形成を、カルシウムイオンを添加した後、翻訳混合物からの発光を試験することにより記録する。測定した発光を産生されたタンパク質の量と相関させるため、翻訳反応を35Ｓ−メチオニンの存在下で行った。新規に合成されたポリペプチドの量は、35Ｓ−メチオニンのトリクロロ酢酸不溶分画への取り込みを測定することにより決定した。これらの実験の結果は、フォチンのカルシウムイオン刺激に応答した生物発光の発生に関する感受性および有効性を示すものである。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態では、ここで提供されるキメラタンパク質は、カルシウム指示薬として、特に細胞内カルシウム濃度の測定のために用いられる。典型的なアッセイでは、セレンテラジンなどの補因子を発光タンパク質を発現する哺乳類細胞に添加し、光の放出を、当該技術分野で知られた方法、例えば市販の照度計を用いて記録する。
【００２１】
発光タンパク質と、細胞内カルシウム動員に関与する受容体の両方を発現する細胞は、候補分子を、受容体調節におけるそれらの効果について試験するのに用いることができる。本発明のキメラ発光タンパク質は、細胞内カルシウムの測定を利用してタンパク質の活性、特にＧタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲ)および細胞膜イオンチャンネルの活性を評価する種々の細胞ベースの機能アッセイに用いることができる。ＧＰＣＲおよびイオンチャンネル刺激に引き続く細胞内カルシウム濃度の大幅かつ迅速な増大は、カルシウム感受性蛍光色素などの種々のレポーターにより検出することができるが、蛍光色素と異なりバックグラウンドが実質的に存在しないことから、生物発光性発光タンパク質の使用が好ましい(22)。しかも、発光タンパク質によるカルシウム測定は、迅速なシグナルを発生させるほか、幅広いレンジの検出感度を有する高い信号対ノイズ比をもたらす(22、23)。細胞ベースの機能アッセイは、典型的には、ＧＰＣＲもしくはイオンチャンネルと、発光タンパク質の両方を発現する細胞の培養物に適切なアゴニストを添加すること、および、その後、カルシウム濃度の任意の変動、例えば、細胞外部位からの迅速な流入または細胞内貯蔵部位からの放出により惹起されるカルシウムの増加(18)を、発光タンパク質活性の測定を介して決定することを含む。
【００２２】
フォチンと、細胞内カルシウム濃度の調節に関与する受容体との両方を発現する細胞の使用は、化合物を細胞内カルシウムの放出に関するその効果についてスクリーニングするための有効なシステムを提供する。ハイスループットスクリーニングアッセイを、本発明による発光タンパク質をレポーター系として用いて設計することもできる。この系の感度ならびにその高い信号対ノイズ比により少ないアッセイ体積を用いることが可能となる。
【００２３】
さらなる実施形態においては、本発明の発光タンパク質を、分析、診断もしくは治療上重要な分子に結合させ、該結合物を競合固相イムノアッセイに用いて、生物学的試料中の当該分子の量を決定することができる。例えば、発光タンパク質は、ホルモンタンパク質に化学的に結合させ、ホルモン特異的抗体による固相イムノアッセイに用いて、ホルモンの唾液中のレベルを決定することができる(24)。さらに別の実施形態では、様々な(ポリ)ペプチド(例えば、ホルモン、抗原性ペプチド、免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖、アビジン、ストレプトアビジンまたはプロテインＡなど)と本発明の発光タンパク質との間の融合体を、US6087476(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されているような遺伝子工学の公知の技法を用いて作製し、免疫診断法もしくは画像化法に用いる。
【００２４】
以下の実施例は、本発明をより詳細に解説する。
【００２５】
(図面の説明)
図１ 新規に合成された発光タンパク質のカルシウム誘導性生物発光。発光タンパク質は、小麦胚芽無細胞系において、セレンテラジンの存在下翻訳した。すべての翻訳混合物のアリコートを、２時間、暗中で、30℃にてインキュベートした。反応にＣａＣｌ2 50ｍＭを負荷し、発光を10秒間記録した。
【００２６】
図２ セレンテラジン存在下における発光タンパク質ＤＮＡの翻訳。発光は反応混合物を希釈して測定した。ＡＱ：エクオリン、ＰＨ：フォチン、ＯＢ：オベリン。
【００２７】
図３ （Ａ）フォチンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現された内在性ＡＴＰ受容体の刺激時におけるＡＴＰ量依存性の光放出。細胞のトランスフェクション、採取、およびフォチンの発現は実施例１に記載のとおりに行った。細胞は、２種類の異なる濃度のＡＴＰで処理した。（Ｂ）オベリンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陽性対照として用いた。発光はＲＬＵ(相対発光量)で表示した。
【００２８】
図４ エンドセリンＡ受容体およびフォチンの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のフォチン活性の用量依存曲線。受容体は、100および500ｎＭの濃度のエンドセリンの注入により活性化させた。
【００２９】
図５ 発光タンパク質フォチンとラットバニロイド受容体１(ＶＲ１)とを発現する細胞で得られた用量依存曲線。特異的アゴニストであるカプサイシンは、10および50μＭの濃度で用いた。
【００３０】
実施例
１．発光タンパク質ＤＮＡのin vitroでの転写／翻訳
発光タンパク質の翻訳は、小麦胚無細胞系(ＴＮＴキット、Promega)にて、供給者の一般的な指示に従って行った。およそ２μｇのＤＮＡを各in vitro転写／翻訳反応混合物に用いた。翻訳体積(50μｌ)は、25μｌの小麦胚芽抽出物、２μｌの反応バッファー、メチオニンを除くアミノ酸の混合物、Rnasinおよびセレンテラジン(40μＭ)、Ｔ７ポリメラーゼを含むものであった。混合物はまた35Ｓ−メチオニン(比活性1000Ｃｉ/ｍｍｏｌ)を含有した。35Ｓ−メチオニンはin vitroで合成された発光タンパク質の量を決定するのに用いた。この目的で、翻訳混合物の各試料からの５μｌを、氷中、30分間ＴＣＡ沈殿し、濾過し、冷５％ＴＣＡ、メタノールで洗浄し、乾燥させ、計数バイアル中に入れた。
【００３１】
無細胞系で産生されたフォチンおよびオベリンの量を表Ｉに示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
２．発光タンパク質アッセイ
５および10μｌの翻訳混合物を、96穴プレート中の95〜90μｌのＰＢＳ溶液に直接混合し、照度計(Berthold)に設置した。発光タンパク質の光放出を誘発するために、50μｌの溶液(50ｍＭ ＣａＣｌ2)をウェルに注入し、発光を10秒間記録した。
【００３４】
フォチン、オベリンおよびエクオリンＤＮＡのin vitroでの翻訳の結果を図１に示す。発光タンパク質のin vitro翻訳反応物を希釈することにより得た発光の測定値を図２に示す。様々な量のフォチンおよびオベリンＤＮＡの翻訳の最中に得られたＴＣＡ計数による発光量データの比較を表IIに示す(測定した発光量は、新規に合成された発光タンパク質の量に比例する）。
【００３５】
【表２】
【００３６】
３．細胞ベース機能アッセイの例
３．１ フォチン発現クローンはＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションにより得た(材料と方法)。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、10または100倍に希釈した。細胞が良好に孤立したコロニーにまで増殖したら、コロニーを新しいプレートに移し、ＣＨＯの内在性受容体を刺激して細胞質Ｃａ++濃度を上昇させることが知られている様々な濃度のＡＴＰに対するその機能的な応答(発光シグナル)に基づいて選択した。各実験の終わりに細胞をTriton X-100およびＣａＣｌ2を含む溶液の潅流により溶解した。活性な発光タンパク質は、細胞を、２ｍＭカルシウムを含むＰＢＳに希釈した10μＭセレンテラジンと共に、暗中、37℃で、５％ＣＯ2雰囲気下、３時間インキュベートすることにより再構成した。光放出の測定のために、細胞をカルシウムの存在下で溶解し、放出された発光量を記録した。最初の10秒間に放出された光子数を照度計で積分し、画面上に視覚化した。空のプラスミドでトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞(データは示さず)は、光子放出を増大させなかった。カルシウム濃度の変化を検出するために、10、50および100μＭのＡＴＰを注入し、カルシウム反応の動態(kinetics)を決定した。得られた曲線を図３(Ａ)に示す。発光タンパク質オベリンを発現する細胞系を図３(Ｂ)で陽性対照として用いた。
【００３７】
３．２ エンドセリンＡ受容体とフォチンとを発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。この受容体は、アゴニストでの刺激により細胞内カルシウム濃度の増加を誘導し、これがフォチンの発光により測定される。細胞は、単層の状態で、10％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、96穴プレートにて培養した。実験日に、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ中の10μＭセレンテラジンで少なくとも３時間インキュベートした。エンドセリンペプチドを、ＰＢＳ中、100および500ｎＭの濃度に希釈した。およそ50μｌのエンドセリンを各ウェルに注入し、反応を測定した。放出された光を、直ちに、30秒間にわたって記録した。エンドセリンに対する用量依存性の応答が図４に示されている。
【００３８】
３．３ アポフォチンとラットＶＲ１カプサイシン受容体(カルシウム透過性イオンチャンネル)との両方を発現するＣＨＯ細胞系を組織培養フラスコで80〜95％コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理により採取した。細胞を10,000細胞/ウェルで、96穴ホワイトプレート中の増殖培地に分配し、一晩、37℃で、加湿したインキュベーター中、５％ＣＯ2にて培養した。発光実験では、細胞にセレンテラジン10μＭを３時間、37℃、５％ＣＯ2にて負荷した。カルシウム応答は、各ウェルに10および50μＭカプサイシンを添加することにより刺激した。閃光発光の動態は、試薬を注入し、各単一ウェルからの光放出を記録するLabsystem Luminoskan Ascentを用いて追跡した。カプサイシンの添加は、30秒以内に迅速かつ一過性の発光シグナルをもたらし、ピークレベルは約10秒以内に生じた(図５)。
【００３９】
材料と方法
試薬
制限酵素はNew England Biolabsから購入し供給者の説明書に従って使用した。in vitro転写および翻訳のためのRnasinおよびＴＮＴキットはPromega(Madison, WI)からのものである。Pfu Turboポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、および大腸菌XL-1blueおよびBL21株のコンピテント細胞はStratagene(La Jolla, Ca)からのものである。オリゴヌクレオチドはPrimm(Milan)から購入した。セレンテラジンはProlume Ltd.(Pittsburg, PA)からのものである。他のすべての化学品は、標準的な給源からのものであり、試薬グレードか、それより良質のものである。
【００４０】
オベリンＤＮＡ配列の一工程合成のためのアセンブリ(assembly)ＰＣＲ
ＰＣＲアセンブリには４つの工程：オリゴの合成、遺伝子のアセンブリ、遺伝子の増幅およびクローニングを要した。我々は、合わせてオベリン遺伝子配列の両方の鎖をコードする、長さ40ｎｔの、30種のオリゴを合成した。相補的なオリゴのオーバーラップは20ｎｔであった。30種のオリゴ溶液のそれぞれから等量を取り出し、最終濃度約250μＭの混合オリゴとなるように混合し、その後、20μｌのGeneamp XL PCR混合液(Perkin Elmer)に250倍に希釈した。増幅過程は３段階で行った。最初の工程はプールされたオリゴで以下の通りに行った：40℃で２分、その後ポリメラーゼを加え、72℃で10秒、その後40サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で10秒)。反応混合物を新鮮なＰＣＲおよびポリメラーゼ混合液で３倍に希釈した。第２段階は25サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で45秒)であった。反応物を完全なＰＣＲ混合液で再度３倍に希釈した。第３段階の条件は：20サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で70秒)であった。反応産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析し、特定の断片を、さらなるクローニング工程のために、pcrBluntベクターにクローニングした。このプラスミドはpcr-OBと命名した。ＰＣＲ反応の信頼性はジデオキシシークエンシングで確認した。
【００４１】
キメラタンパク質の構築
４組のオリゴをクリチン遺伝子配列に基づいて設計した。遺伝子のキメラ化のためにＥＦハンドIとＥＦハンドIIとの間の領域を選択した。オリゴヌクレオチドプライマーは以下のものであった：
【００４２】
【化１】
【００４３】
アニールしたオリゴを、pcr-OBベクターのＮｄｅＩ/ＭｕｎＩユニークサイトにクローニングした。キメラ遺伝子産物を含むプラスミドをｐｃｒ−フォチンと呼ぶ。フォチンＤＮＡは、Ｔ７プロモーターを含むｐｃＤＮＡ３ベクターにさらにサブクローニングした。
【００４４】
ＰＣＲに基づくコドン使用の変更
オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いてオベリン変異体を作製した。10種の異なるコドン使用の変更をもたらす10種の異なる点突然変異を有する６組のプライマーを設計した。オーバーラップ伸長に用いるＤＮＡ断片を増幅するために、ＰＣＲ反応を、総体積100μｌ中の2.5単位のＰｆｕポリメラーゼ、50ｎｇのＤＮＡテンプレート、250μＭの各ｄＮＴＰ、および50ｐｍｏｌの各プライマーにより行った。用いたサイクルパラメーターは、最初の10サイクルは、94℃で１分、45℃で１分、および72℃で１分30秒であり、その後の20サイクルはアニーリング温度が50℃であった。部位特異的突然変異はPrimm(Milan)で行ったＤＮＡシークエンシングで確認した。すべての分子的手順は標準的なプロトコルを用いて行った。
【００４５】
ＣＨＯ細胞の培養
すべての細胞は、37℃および５％ＣＯ２の標準的な加湿条件で培養した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭ/Ｆ12＋ＦＢＳ 10％＋Ｐｅｎ/Ｓｔｒｅｐ＋Ｇ４１８ 0.5ｍｇ/ｍｌ＋ピルビン酸塩 1.6ｍＭ＋ＮａＨＣＯ3 0.2％中で維持した。すべての試薬はLife Technologiesからのものであった。ＤＮＡトランスフェクションは、これらの細胞がプレート上で70％〜80％コンフルエントまで増殖した時に行った。
【００４６】
引用文献
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】新規に合成された発光タンパク質のカルシウム誘導性生物発光を示す。
【図２】セレンテラジン存在下における発光タンパク質ＤＮＡの翻訳を示す。
【図３】（Ａ）フォチンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現された内在性ＡＴＰ受容体の刺激時におけるＡＴＰ量依存性の光放出、（Ｂ）オベリンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陽性対照として用いた。
【図４】エンドセリンＡ受容体およびフォチンの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のフォチン活性の用量依存曲線を示す。
【図５】発光タンパク質フォチンとラットバニロイド受容体１(ＶＲ１)とを発現する細胞で得られた用量依存曲線を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された発光作用を有するキメラ発光タンパク質、レポーター遺伝子系および細胞内カルシウムの検出および測定のための細胞ベースアッセイにおけるカルシウム指示薬としてのその使用を提供する。
【０００２】
(発明の背景)
生物発光は、種々の化学発光反応系を介して可視光を放出する生体の能力である。生物発光反応は、３つの主要な構成要素であるルシフェリン、ルシフェラーゼおよび酸素分子を必要とする。しかしながら、一部の反応においては、カチオン(Ｃａ++およびＭｇ++)および補因子(ＡＴＰ、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ)を含む他の構成要素が必要となる場合がある。ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸化を触媒し、不安定な中間体を生成する酵素である。この不安定な中間体が基底状態に分解し、オキシルシフェリンを発生するときに、光が放出される。多くの異なる無関係な種類のルシフェリンが存在するが、少なくとも７つの門からの多くの種は、３個のアミノ酸(２個のチロシンと１個のフェニルアラニン)により形成される環を含む、セレンテラジンとして知られる同じルシフェリンを用いている。一部の動物(例えば、クラゲ)においては、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、安定した「発光タンパク質」の形態で抽出することができ、これはカルシウムの結合により光を放出する。発光タンパク質は、これらがルシフェラーゼとルシフェリンとの安定化した酸素化(oxygenated)中間体複合体である点でルシフェラーゼと異なる。発光タンパク質は、多くの海洋性腔腸動物に存在し、これらの生物が、繁殖、摂食および防御を含む種々の目的のために光を放出することを可能にする(1)。細菌は連続して光を放出するが、他の多くの生物においては、発光は、典型的には継続時間0.1〜１秒の閃光として生じる。これは、酵素反応の迅速なスイッチのオン／オフと、適切に隔離されかつ素早い動員の準備ができている反応物とを必要とする。腔腸動物においては、閃光の発生はカルシウムの流入によって引き起こされる。発光タンパク質のカルシウム結合部位はカルモジュリンと相同(homologous)である。カルシウムの存在下、発光タンパク質は分子内反応により可視光を放出する。多くの発光生物がいるが、７種のみの発光タンパク質、すなわち、タラシコリン(Thalassicolin)(2、3)、エクオリン(4〜6)、ミトロコミン(ハリスタウリン(Halistaurin)と同義)(7、8)、クリチン(Clytin)(フィアリジン(Phialidin)と同義)(8、9)、オベリン(Obelin)(2、6、10、11)、ニミオプシン(Mnemiopsin)(12、13)、およびベロビン(Berovin)(12、13)がこれまでに単離されている。これらのタンパク質は全てアポタンパク質、イミダゾピラジン発色団(セレンテラジン)および酸素の複合体である。これらの構造は、特に３つのカルシウム結合部位(ＥＦハンド構造)を含む領域において高度に保存されている。これらのＥＦハンド構造は、カルシウム結合タンパク質ファミリーに特徴的である。発光タンパク質は、ＥＦハンドポケットに強固に結合するカルシウムとの反応の際に光を放出する。この反応は、単一回転の(single turnover)事象であり、ＣＯ2の放出と、青色領域(λmax＝470ｎｍ)の光の放出をもたらす。用語「発光タンパク質」は、発光可能なルシフェリン結合ポリペプチドを指すが、「アポ発光タンパク質」は、ルシフェリンを有しないタンパク質を示すのに用いられる。
【０００３】
最も研究されている発光タンパク質は、Aequorea victoriaから単離されたエクオリン(14)、およびObelia longissimaから単離されたオベリン(15)である。Ｃａ++を結合すると、エクオリンはコンホメーション変化を起こし、自身をオキシゲナーゼ(ルシフェラーゼ)に変換し、これが次に結合した酸素分子によるセレンテラジンの酸化を触媒する。この青色の蛍光タンパク質は、アポ発光タンパク質に共有結合していない、セレンテラジンの酸化産物であるセレンテラミドからなる。この発光タンパク質は、アポ発光タンパク質から、セレンテラジン、酸素分子、ＥＤＴＡおよび２−メルカプトエタノールもしくはジチオスレイトールとのインキュベーションにより再生することができる。セレンテラジンは、発光タンパク質であるエクオリン、ミトロコミン(Mitrocomin)、クリチンおよびオベリンにより用いられる共通の発光基質であるため、光放出反応は、これら４種の発光タンパク質において同様であるとみられる(16)。最近エクオリンおよびオベリンの一次構造と結晶学的データが得られ、これらの機能について追加の情報がもたらされた。ヒドロ虫Obelia longissimaからの未変性のオベリンは、195アミノ酸残基(aa)の単鎖タンパク質であり、概算分子質量は、非共有結合した発色団基セレンテラジンを含めて20ｋＤａである。クリチンの一次構造の分析により、これは189アミノ酸残基を含み、発光タンパク質のファミリーに属することが示された。しかし、ヒドロ虫類のＣａ++結合発光タンパク質は、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリンおよびチロシン残基の含量が比較的高い点で、カルモジュリンおよびトロポニンＣなどの他のＣａ++結合タンパク質と異なっている。
【０００４】
オベリンの構造および機能の研究は、Bondar VS et al., Biochemistry(2001), 66(9)：1014−8、 Vysotski ES et al., (2003), 42(20)：6013−24およびDeng L. et al., FEBS Lett.(2001), 506(3)：281−5に報告されている。後ろ２つは特にオベリン変異体Ｗ９２Ｆの生物発光および放出特性を記載している。
【０００５】
発光タンパク質は、信号伝達および遺伝子発現に伴う細胞事象をモニターするためのレポーター遺伝子技術に広く用いられている。
【０００６】
細胞事象およびその調節の研究は、高感度の、非侵襲性の分析方法を必要とする。発光タンパク質、そして一般的には生物発光は、蛍光系とは異なり実質的にバックグラウンドがないため、優れたレポーター系である。
【０００７】
発光タンパク質は、様々な刺激に対するカルシウムの変化をモニターするために、哺乳類細胞で発現されてきた。細胞内カルシウム濃度は、発光タンパク質を発現している哺乳類細胞にセレンテラジン補因子を添加し、細胞内カルシウム濃度を示す光子の放出を検出することにより測定することができる。
【０００８】
(発明の説明)
今回、オベリンタンパク質(アポベリン(Apobelin))の最初の２つのカルシウム結合部位の間に含まれる領域の、クリチン、エクオリン、タラシコリン、ミトロコミン、ニミオプシンおよびベロビンから選択される発光タンパク質の対応する領域による置換を介した、オベリンタンパク質のキメラ化により、改善された生物発光を有する新規な発光タンパク質が得られることが見出された。
【０００９】
本明細書中で用いる場合、オベリンは、Obelia longissimaおよびObelia geniculata(17)を含むオベリア属(Obelia)の様々な種から単離された任意の発光タンパク質を示し得る。参照となるオベリンヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１および２にそれぞれ記載されている。クリチン、ミトロコミンおよびエクオリンの参照アミノ酸およびヌクレオチド配列は、GenBankに、受託番号Q08121、P39047、AAA27720およびL13247、L31623、L29571でそれぞれ寄託されており、一方タラシコリン、ニミオプシンおよびベロビンについての配列は、参考文献２、３、12および13に記載されている。
【００１０】
本明細書中で用いる場合、「対応する領域または断片」は、それぞれの配列アラインメントにおいて、関連するタンパク質(オベリンと選択された発光タンパク質)に保存されていない、少なくとも１個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基を除き、オベリンの配列とマッチする、選択された発光タンパク質内の任意のアミノ酸配列を意味し、該領域または断片は、オベリンの配列を参照した場合、好ましくは残基42から122、より好ましくは残基50から95に及ぶ。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態によれば、キメラタンパク質は、オベリンのアミノ酸配列の残基50から94を、クリチンの配列の残基53から97に及ぶ断片で置換することにより得られる。こうして得た発光タンパク質は「フォチン(Photin)」と呼ばれ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明のキメラタンパク質は、１または２個以上のアミノ酸残基の欠失、付加または置換によりさらに変更することができるが、ただし、発光タンパク質の、光放出およびカルシウム反応性に関する活性プロファイルが維持されまたは増大しているという条件においてである。特に好ましいのは、オベリンの配列を参照した場合の位置55、66、67、73、74、75、78、83、84、87、89および94における置換である。
【００１３】
in vitroでの研究で示されるように、フォチンはカルシウム刺激に応答して強力な生物発光をもたらし、これは天然の発光タンパク質で観察されるものよりも一般に強いものである。
【００１４】
キメラ発光タンパク質の調製に関しては、オベリンのコード配列の部分およびオベリン以外の選択された発光タンパク質の部分を有する組換えＤＮＡ構築物を慣用の遺伝子操作により調製し、得られたキメラ産物をベクターに挿入し、適した宿主で発現させ、そしてその後単離・精製する。例えば、オベリン、および異なる発光タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲで増幅すること、または合成オリゴヌクレオチドでin vitroで構築することができ、そして、該産物は、増幅もしくはin vitroでの構築に用いられるオリゴヌクレオチドに天然に存在するか、もしくは人工的に導入された適切な制限部位を利用して、組換えを行うことができる。発現ベクターは、組換え構築物に加えて、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドンまたは転写エンハンサーのためのコンセンサス部位を含むことができる。ベクターはまた、ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞を単離するための選択マーカーを含むことができる。好適なベクターは、例えば、酵母もしくは細菌プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、レトロウイルスまたはＤＮＡである。組換え構築物を担持するベクターは、慣用の技法により宿主に導入することができる。宿主細胞は原核性もしくは真核性、例えば細菌、酵母もしくは哺乳類細胞であってもよい。発光タンパク質の発現／産生のために好ましい宿主は哺乳類細胞であり、上皮またはリンパ芽球由来の細胞、例えばHek−293、CHO−K1、HepG2およびHL−60などを包含する。これらの細胞は、細胞質中に(18)、発光タンパク質にミトコンドリア標的配列を付加することによりミトコンドリア中に、またはその他の任意の細胞区画中に(19〜21)アポ発光タンパク質を発現することができる。あるいは、細菌または真菌などの非哺乳類細胞を使うこともできる。宿主細胞の種類が選択されたら、遺伝子構築物を、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔または他の慣用の技法により導入することができる。トランスフェクションの後、細胞を好適な培地で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングする。本発明の発光タンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの慣用の手順で単離および精製することができる。
【００１５】
オーバーラップ伸長(overlap extension)ＰＣＲにより、キメラ産物に点突然変異を導入することができる。
【００１６】
フォチンを産生するため、オベリン遺伝子のＮｄｅＩ/ＭｕｎＩ断片を、ヌクレオチド156から291にわたるクリチンのコード配列に相当する135ヌクレオチドの断片で置換した。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は本明細書に開示されたキメラタンパク質をコードする核酸分子に関する。ＤＮＡコード配列は、遺伝コードの縮重に基づいて変更することができ、例えば、異種の系での発現を改善するためにコドンの使い方を変えることができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、フォチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号４および５から選択される。
【００１９】
キメラ産物が機能するかどうかを試験するため、in vitro転写および翻訳実験を、セレンテラジンの存在下、無細胞小麦胚芽翻訳系(cell-free wheat germ translation system)で行った。これらの実験では、活性な発光タンパク質の形成を、カルシウムイオンを添加した後、翻訳混合物からの発光を試験することにより記録する。測定した発光を産生されたタンパク質の量と相関させるため、翻訳反応を35Ｓ−メチオニンの存在下で行った。新規に合成されたポリペプチドの量は、35Ｓ−メチオニンのトリクロロ酢酸不溶分画への取り込みを測定することにより決定した。これらの実験の結果は、フォチンのカルシウムイオン刺激に応答した生物発光の発生に関する感受性および有効性を示すものである。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態では、ここで提供されるキメラタンパク質は、カルシウム指示薬として、特に細胞内カルシウム濃度の測定のために用いられる。典型的なアッセイでは、セレンテラジンなどの補因子を発光タンパク質を発現する哺乳類細胞に添加し、光の放出を、当該技術分野で知られた方法、例えば市販の照度計を用いて記録する。
【００２１】
発光タンパク質と、細胞内カルシウム動員に関与する受容体の両方を発現する細胞は、候補分子を、受容体調節におけるそれらの効果について試験するのに用いることができる。本発明のキメラ発光タンパク質は、細胞内カルシウムの測定を利用してタンパク質の活性、特にＧタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲ)および細胞膜イオンチャンネルの活性を評価する種々の細胞ベースの機能アッセイに用いることができる。ＧＰＣＲおよびイオンチャンネル刺激に引き続く細胞内カルシウム濃度の大幅かつ迅速な増大は、カルシウム感受性蛍光色素などの種々のレポーターにより検出することができるが、蛍光色素と異なりバックグラウンドが実質的に存在しないことから、生物発光性発光タンパク質の使用が好ましい(22)。しかも、発光タンパク質によるカルシウム測定は、迅速なシグナルを発生させるほか、幅広いレンジの検出感度を有する高い信号対ノイズ比をもたらす(22、23)。細胞ベースの機能アッセイは、典型的には、ＧＰＣＲもしくはイオンチャンネルと、発光タンパク質の両方を発現する細胞の培養物に適切なアゴニストを添加すること、および、その後、カルシウム濃度の任意の変動、例えば、細胞外部位からの迅速な流入または細胞内貯蔵部位からの放出により惹起されるカルシウムの増加(18)を、発光タンパク質活性の測定を介して決定することを含む。
【００２２】
フォチンと、細胞内カルシウム濃度の調節に関与する受容体との両方を発現する細胞の使用は、化合物を細胞内カルシウムの放出に関するその効果についてスクリーニングするための有効なシステムを提供する。ハイスループットスクリーニングアッセイを、本発明による発光タンパク質をレポーター系として用いて設計することもできる。この系の感度ならびにその高い信号対ノイズ比により少ないアッセイ体積を用いることが可能となる。
【００２３】
さらなる実施形態においては、本発明の発光タンパク質を、分析、診断もしくは治療上重要な分子に結合させ、該結合物を競合固相イムノアッセイに用いて、生物学的試料中の当該分子の量を決定することができる。例えば、発光タンパク質は、ホルモンタンパク質に化学的に結合させ、ホルモン特異的抗体による固相イムノアッセイに用いて、ホルモンの唾液中のレベルを決定することができる(24)。さらに別の実施形態では、様々な(ポリ)ペプチド(例えば、ホルモン、抗原性ペプチド、免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖、アビジン、ストレプトアビジンまたはプロテインＡなど)と本発明の発光タンパク質との間の融合体を、US6087476(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されているような遺伝子工学の公知の技法を用いて作製し、免疫診断法もしくは画像化法に用いる。
【００２４】
以下の実施例は、本発明をより詳細に解説する。
【００２５】
(図面の説明)
図１ 新規に合成された発光タンパク質のカルシウム誘導性生物発光。発光タンパク質は、小麦胚芽無細胞系において、セレンテラジンの存在下翻訳した。すべての翻訳混合物のアリコートを、２時間、暗中で、30℃にてインキュベートした。反応にＣａＣｌ2 50ｍＭを負荷し、発光を10秒間記録した。
【００２６】
図２ セレンテラジン存在下における発光タンパク質ＤＮＡの翻訳。発光は反応混合物を希釈して測定した。ＡＱ：エクオリン、ＰＨ：フォチン、ＯＢ：オベリン。
【００２７】
図３ （Ａ）フォチンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現された内在性ＡＴＰ受容体の刺激時におけるＡＴＰ量依存性の光放出。細胞のトランスフェクション、採取、およびフォチンの発現は実施例１に記載のとおりに行った。細胞は、２種類の異なる濃度のＡＴＰで処理した。（Ｂ）オベリンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陽性対照として用いた。発光はＲＬＵ(相対発光量)で表示した。
【００２８】
図４ エンドセリンＡ受容体およびフォチンの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のフォチン活性の用量依存曲線。受容体は、100および500ｎＭの濃度のエンドセリンの注入により活性化させた。
【００２９】
図５ 発光タンパク質フォチンとラットバニロイド受容体１(ＶＲ１)とを発現する細胞で得られた用量依存曲線。特異的アゴニストであるカプサイシンは、10および50μＭの濃度で用いた。
【００３０】
実施例
１．発光タンパク質ＤＮＡのin vitroでの転写／翻訳
発光タンパク質の翻訳は、小麦胚無細胞系(ＴＮＴキット、Promega)にて、供給者の一般的な指示に従って行った。およそ２μｇのＤＮＡを各in vitro転写／翻訳反応混合物に用いた。翻訳体積(50μｌ)は、25μｌの小麦胚芽抽出物、２μｌの反応バッファー、メチオニンを除くアミノ酸の混合物、Rnasinおよびセレンテラジン(40μＭ)、Ｔ７ポリメラーゼを含むものであった。混合物はまた35Ｓ−メチオニン(比活性1000Ｃｉ/ｍｍｏｌ)を含有した。35Ｓ−メチオニンはin vitroで合成された発光タンパク質の量を決定するのに用いた。この目的で、翻訳混合物の各試料からの５μｌを、氷中、30分間ＴＣＡ沈殿し、濾過し、冷５％ＴＣＡ、メタノールで洗浄し、乾燥させ、計数バイアル中に入れた。
【００３１】
無細胞系で産生されたフォチンおよびオベリンの量を表Ｉに示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
２．発光タンパク質アッセイ
５および10μｌの翻訳混合物を、96穴プレート中の95〜90μｌのＰＢＳ溶液に直接混合し、照度計(Berthold)に設置した。発光タンパク質の光放出を誘発するために、50μｌの溶液(50ｍＭ ＣａＣｌ2)をウェルに注入し、発光を10秒間記録した。
【００３４】
フォチン、オベリンおよびエクオリンＤＮＡのin vitroでの翻訳の結果を図１に示す。発光タンパク質のin vitro翻訳反応物を希釈することにより得た発光の測定値を図２に示す。様々な量のフォチンおよびオベリンＤＮＡの翻訳の最中に得られたＴＣＡ計数による発光量データの比較を表IIに示す(測定した発光量は、新規に合成された発光タンパク質の量に比例する）。
【００３５】
【表２】
【００３６】
３．細胞ベース機能アッセイの例
３．１ フォチン発現クローンはＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションにより得た(材料と方法)。トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、10または100倍に希釈した。細胞が良好に孤立したコロニーにまで増殖したら、コロニーを新しいプレートに移し、ＣＨＯの内在性受容体を刺激して細胞質Ｃａ++濃度を上昇させることが知られている様々な濃度のＡＴＰに対するその機能的な応答(発光シグナル)に基づいて選択した。各実験の終わりに細胞をTriton X-100およびＣａＣｌ2を含む溶液の潅流により溶解した。活性な発光タンパク質は、細胞を、２ｍＭカルシウムを含むＰＢＳに希釈した10μＭセレンテラジンと共に、暗中、37℃で、５％ＣＯ2雰囲気下、３時間インキュベートすることにより再構成した。光放出の測定のために、細胞をカルシウムの存在下で溶解し、放出された発光量を記録した。最初の10秒間に放出された光子数を照度計で積分し、画面上に視覚化した。空のプラスミドでトランスフェクトされた細胞またはトランスフェクトされていない細胞(データは示さず)は、光子放出を増大させなかった。カルシウム濃度の変化を検出するために、10、50および100μＭのＡＴＰを注入し、カルシウム反応の動態(kinetics)を決定した。得られた曲線を図３(Ａ)に示す。発光タンパク質オベリンを発現する細胞系を図３(Ｂ)で陽性対照として用いた。
【００３７】
３．２ エンドセリンＡ受容体とフォチンとを発現するＣＨＯ細胞系を樹立した。この受容体は、アゴニストでの刺激により細胞内カルシウム濃度の増加を誘導し、これがフォチンの発光により測定される。細胞は、単層の状態で、10％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、96穴プレートにて培養した。実験日に、培養培地を除去し、細胞をＰＢＳ中の10μＭセレンテラジンで少なくとも３時間インキュベートした。エンドセリンペプチドを、ＰＢＳ中、100および500ｎＭの濃度に希釈した。およそ50μｌのエンドセリンを各ウェルに注入し、反応を測定した。放出された光を、直ちに、30秒間にわたって記録した。エンドセリンに対する用量依存性の応答が図４に示されている。
【００３８】
３．３ アポフォチンとラットＶＲ１カプサイシン受容体(カルシウム透過性イオンチャンネル)との両方を発現するＣＨＯ細胞系を組織培養フラスコで80〜95％コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理により採取した。細胞を10,000細胞/ウェルで、96穴ホワイトプレート中の増殖培地に分配し、一晩、37℃で、加湿したインキュベーター中、５％ＣＯ2にて培養した。発光実験では、細胞にセレンテラジン10μＭを３時間、37℃、５％ＣＯ2にて負荷した。カルシウム応答は、各ウェルに10および50μＭカプサイシンを添加することにより刺激した。閃光発光の動態は、試薬を注入し、各単一ウェルからの光放出を記録するLabsystem Luminoskan Ascentを用いて追跡した。カプサイシンの添加は、30秒以内に迅速かつ一過性の発光シグナルをもたらし、ピークレベルは約10秒以内に生じた(図５)。
【００３９】
材料と方法
試薬
制限酵素はNew England Biolabsから購入し供給者の説明書に従って使用した。in vitro転写および翻訳のためのRnasinおよびＴＮＴキットはPromega(Madison, WI)からのものである。Pfu Turboポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、および大腸菌XL-1blueおよびBL21株のコンピテント細胞はStratagene(La Jolla, Ca)からのものである。オリゴヌクレオチドはPrimm(Milan)から購入した。セレンテラジンはProlume Ltd.(Pittsburg, PA)からのものである。他のすべての化学品は、標準的な給源からのものであり、試薬グレードか、それより良質のものである。
【００４０】
オベリンＤＮＡ配列の一工程合成のためのアセンブリ(assembly)ＰＣＲ
ＰＣＲアセンブリには４つの工程：オリゴの合成、遺伝子のアセンブリ、遺伝子の増幅およびクローニングを要した。我々は、合わせてオベリン遺伝子配列の両方の鎖をコードする、長さ40ｎｔの、30種のオリゴを合成した。相補的なオリゴのオーバーラップは20ｎｔであった。30種のオリゴ溶液のそれぞれから等量を取り出し、最終濃度約250μＭの混合オリゴとなるように混合し、その後、20μｌのGeneamp XL PCR混合液(Perkin Elmer)に250倍に希釈した。増幅過程は３段階で行った。最初の工程はプールされたオリゴで以下の通りに行った：40℃で２分、その後ポリメラーゼを加え、72℃で10秒、その後40サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で10秒)。反応混合物を新鮮なＰＣＲおよびポリメラーゼ混合液で３倍に希釈した。第２段階は25サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で45秒)であった。反応物を完全なＰＣＲ混合液で再度３倍に希釈した。第３段階の条件は：20サイクル(94℃で15秒、40℃で30秒、および72℃で70秒)であった。反応産物を１％アガロースゲル電気泳動で分析し、特定の断片を、さらなるクローニング工程のために、pcrBluntベクターにクローニングした。このプラスミドはpcr-OBと命名した。ＰＣＲ反応の信頼性はジデオキシシークエンシングで確認した。
【００４１】
キメラタンパク質の構築
４組のオリゴをクリチン遺伝子配列に基づいて設計した。遺伝子のキメラ化のためにＥＦハンドIとＥＦハンドIIとの間の領域を選択した。オリゴヌクレオチドプライマーは以下のものであった：
【００４２】
【化１】
【００４３】
アニールしたオリゴを、pcr-OBベクターのＮｄｅＩ/ＭｕｎＩユニークサイトにクローニングした。キメラ遺伝子産物を含むプラスミドをｐｃｒ−フォチンと呼ぶ。フォチンＤＮＡは、Ｔ７プロモーターを含むｐｃＤＮＡ３ベクターにさらにサブクローニングした。
【００４４】
ＰＣＲに基づくコドン使用の変更
オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いてオベリン変異体を作製した。10種の異なるコドン使用の変更をもたらす10種の異なる点突然変異を有する６組のプライマーを設計した。オーバーラップ伸長に用いるＤＮＡ断片を増幅するために、ＰＣＲ反応を、総体積100μｌ中の2.5単位のＰｆｕポリメラーゼ、50ｎｇのＤＮＡテンプレート、250μＭの各ｄＮＴＰ、および50ｐｍｏｌの各プライマーにより行った。用いたサイクルパラメーターは、最初の10サイクルは、94℃で１分、45℃で１分、および72℃で１分30秒であり、その後の20サイクルはアニーリング温度が50℃であった。部位特異的突然変異はPrimm(Milan)で行ったＤＮＡシークエンシングで確認した。すべての分子的手順は標準的なプロトコルを用いて行った。
【００４５】
ＣＨＯ細胞の培養
すべての細胞は、37℃および５％ＣＯ２の標準的な加湿条件で培養した。ＣＨＯ細胞は、ＤＭＥＭ/Ｆ12＋ＦＢＳ 10％＋Ｐｅｎ/Ｓｔｒｅｐ＋Ｇ４１８ 0.5ｍｇ/ｍｌ＋ピルビン酸塩 1.6ｍＭ＋ＮａＨＣＯ3 0.2％中で維持した。すべての試薬はLife Technologiesからのものであった。ＤＮＡトランスフェクションは、これらの細胞がプレート上で70％〜80％コンフルエントまで増殖した時に行った。
【００４６】
引用文献
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】新規に合成された発光タンパク質のカルシウム誘導性生物発光を示す。
【図２】セレンテラジン存在下における発光タンパク質ＤＮＡの翻訳を示す。
【図３】（Ａ）フォチンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞により発現された内在性ＡＴＰ受容体の刺激時におけるＡＴＰ量依存性の光放出、（Ｂ）オベリンＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を陽性対照として用いた。
【図４】エンドセリンＡ受容体およびフォチンの両方でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞のフォチン活性の用量依存曲線を示す。
【図５】発光タンパク質フォチンとラットバニロイド受容体１(ＶＲ１)とを発現する細胞で得られた用量依存曲線を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オベリンタンパク質の第１および第２のカルシウム結合部位の間に含まれる領域を、クリチン、エクオリン、タラシコリン、ミトクロミン、ニミオプシンおよびベロビンから選択される発光タンパク質の対応する領域で置換して得られる、キメラ発光タンパク質。
【請求項２】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも１アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項３】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも５アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項２に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項４】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも１０アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項３に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項５】
前記領域が、オベリンタンパク質配列の残基４２から１２２である、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項６】
前記領域が、オベリンタンパク質配列の残基５０から９４に及ぶ、請求項５に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項７】
オベリンタンパク質の残基５０から９４が、クリチンの配列の残基５３から９７に及ぶ断片と置換された、請求項６に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項８】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項９】
オベリンの配列の位置５５、６６、６７、７３、７４、７５、７８、８３、８４、８７、８９および９４に、１または２個以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の発光タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の発光タンパク質と、分析、診断または治療用途の分子との結合物。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載のキメラ発光タンパク質をコードする、単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項８に記載のタンパク質をコードする、配列番号４および配列番号５から選択される配列を有する、請求項１２に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のキメラ発光タンパク質の、ルシフェリン基質と組み合わせた、カルシウムイオンの検出のための使用。
【請求項１５】
前記ルシフェリン基質がセレンテラジンである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
カルシウムイオンの定量的決定のための、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
細胞内カルシウム濃度の決定のための、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載の核酸分子を有する宿主細胞。
【請求項１９】
細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および動物細胞から選択される、請求項１８に記載の細胞性宿主。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の宿主細胞を、発光タンパク質の発現に適した条件で増殖させること、および発現されたタンパク質を回収することを含む、発光タンパク質を作製する方法。
【請求項２１】
生物学的に活性な分子をスクリーニングする方法であって、請求項１８または１９に記載の細胞性宿主を、所定量の該分子に暴露すること、および細胞内カルシウム濃度の任意の変動を検出することを含む、前記方法。
【請求項２２】
宿主細胞は、異種のＧタンパク質共役型受容体またはイオンチャンネルがトランスフェクトされたものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載の結合物の、生物学的試料中の前記分子の量を決定するための競合固相イムノアッセイにおける使用。
【請求項２４】
蛍光タンパク質と請求項８に記載の発光タンパク質とを含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【請求項１】
オベリンタンパク質の第１および第２のカルシウム結合部位の間に含まれる領域を、クリチン、エクオリン、タラシコリン、ミトクロミン、ニミオプシンおよびベロビンから選択される発光タンパク質の対応する領域で置換して得られる、キメラ発光タンパク質。
【請求項２】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも１アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項３】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも５アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項２に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項４】
選択された発光タンパク質内の前記対応する領域が、少なくとも１０アミノ酸残基を除き、それぞれの配列アラインメントにおいてオベリンの配列とマッチしている、請求項３に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項５】
前記領域が、オベリンタンパク質配列の残基４２から１２２である、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項６】
前記領域が、オベリンタンパク質配列の残基５０から９４に及ぶ、請求項５に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項７】
オベリンタンパク質の残基５０から９４が、クリチンの配列の残基５３から９７に及ぶ断片と置換された、請求項６に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項８】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項９】
オベリンの配列の位置５５、６６、６７、７３、７４、７５、７８、８３、８４、８７、８９および９４に、１または２個以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載のキメラ発光タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の発光タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の発光タンパク質と、分析、診断または治療用途の分子との結合物。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載のキメラ発光タンパク質をコードする、単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項８に記載のタンパク質をコードする、配列番号４および配列番号５から選択される配列を有する、請求項１２に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載のキメラ発光タンパク質の、ルシフェリン基質と組み合わせた、カルシウムイオンの検出のための使用。
【請求項１５】
前記ルシフェリン基質がセレンテラジンである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
カルシウムイオンの定量的決定のための、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
細胞内カルシウム濃度の決定のための、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載の核酸分子を有する宿主細胞。
【請求項１９】
細菌、酵母、真菌、植物、昆虫および動物細胞から選択される、請求項１８に記載の細胞性宿主。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の宿主細胞を、発光タンパク質の発現に適した条件で増殖させること、および発現されたタンパク質を回収することを含む、発光タンパク質を作製する方法。
【請求項２１】
生物学的に活性な分子をスクリーニングする方法であって、請求項１８または１９に記載の細胞性宿主を、所定量の該分子に暴露すること、および細胞内カルシウム濃度の任意の変動を検出することを含む、前記方法。
【請求項２２】
宿主細胞は、異種のＧタンパク質共役型受容体またはイオンチャンネルがトランスフェクトされたものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載の結合物の、生物学的試料中の前記分子の量を決定するための競合固相イムノアッセイにおける使用。
【請求項２４】
蛍光タンパク質と請求項８に記載の発光タンパク質とを含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１７７８４（Ｐ２００６−５１７７８４Ａ）
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４４２７８（Ｐ２００４−５４４２７８）
【出願日】平成１５年１０月２１日（２００３．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５６２０
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０４１３２０８７）アクザム ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＸＸＡＭ Ｓ．ｒ．ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月２１日（２００３．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１１６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５６２０
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０４１３２０８７）アクザム ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＡＸＸＡＭ Ｓ．ｒ．ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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