改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用
【課題】安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素の提供、当該酵素をコードする遺伝子を単離し、目的とする理化学的性質を備えた当該酵素を組換え体として取得し遺伝子工学的手法による当該酵素の大量生産技術の提供、更には当該酵素の特性を活用したバイオセンサー及び燃料電池の提供。
【解決手段】野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【解決手段】野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素を含むバイオセンサー、並びに酵素燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒド脱水素酵素 （EC 1.2.1.46 ）は、ホルムアルデヒドを酸化してギ酸を生成する反応を触媒する。ホルアルデヒド脱水素酵素の基質となるホルムアルデヒドは、シックハウス症候群等の慢性的なアレルギー症状を引き起こす原因物質の１つとして知られている。また、稀薄な溶液でも細胞原形質のタンパク質を不可逆的に凝固させ、全ての細胞機能を停止、死滅させる作用があるために、細胞毒としても知られている。そのため、食品中、大気中などのホルムアルデヒドを測定し、これを分解及び除去することが求められており、ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性の利用が検討されている。例えば、生体試料中のホルムアルデヒドの定量等のホルムアルデヒド測定技術や、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した空気浄化フィルター等のホルムアルデヒドの除去技術等、特に環境技術の分野における応用が期待されている。
【０００３】
例えば、ホルムアルデヒドをはじめとするアルデヒド化合物やアルコール化合物を簡易に検出測定できるバイオセンサー用酵素としての利用が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。詳細には、気相中や液相中のアルデヒド化合物及びアルコール化合物を簡易に検出測定できる酵素固定化バイオセンサーが開示されており、これは、過酸化水素電極の表面にアルコール酸化酵素が固定化されると共に最表面に高分子被覆が配設され、過酸化水素の酸化電流値、またはその変化よりアルデヒド化合物もしくはアルコール化合物の存在を検出するものである。
【０００４】
また、近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、酸化還元酵素が電池の構成部材として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用してギ酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してCO2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることにより構成することができる。これにより、メタノールはCO2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成されることとなる。
【０００５】
そして、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、細菌、酵母から哺乳類に至るまで広く存在していることが知られており、多様な生物由来のホルムアルデヒド脱水素酵素が報告されている。例えば、パン酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae)由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献１を参照。）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献２を参照）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献３を参照）等が挙げられる。そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列が報告されており、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素の配列情報がGenBank Accesslon number：L36327として開示されている（例えば、非特許文献４を参照）。
【０００６】
ホルムアルデヒド脱水素酵素には、反応にグルタチオンを要求するグルタチオン依存性、及びグルタチオンを要求しない非依存性の２つの型がある。一般に広く存在するホルムアルデヒド脱水素酵素はグルタチオン依存性であるのに対して、シュードモナス・プチダ由来のホルムアルデヒド脱水素酵素は、グルタチオン非依存的にホルムアルデヒドの酸化還元反応を触媒する特徴的な酵素であることが知られている。そして、このホルムアルデヒド脱水素酵素は、各サブユニットが376アミノ酸残基からなるホモ4量体酵素であることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）と共に、Ｘ線結晶構造解析の結果をもが報告され活性中心をはじめとした高次構造が明らかとなっている（例えば、非特許文献５を参照）。
【０００７】
ところが、ホルムアルデヒド脱水素酵素に限らず酵素は、触媒作用を選択する性質が非常に強いことが知られている。例えば、酵素は、生体が生存可能な緩和な条件下で最も酵素活性を発揮し、生体内で代謝される機構を有するものであることから、酵素を構成するタンパク質構造に変化を与えるような因子の存在により酵素の活性は影響を受ける。つまり、酵素活性は、温度等の物理的条件、及びpH、塩濃度等の化学的条件の影響を受けることが知られており、これらに対する安定性が低いため用途が限定されるという問題点があった。そして、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。
【０００８】
しかしながら、バイオセンサーや燃料電池への適用に際しては、多様な環境において安定して活性を保持できる酵素が不可欠であり、特に、酵素寿命に対して相関があるといわれる熱安定性の向上が要求される。従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。そのため、バイオセンサーや燃料電池への適用した場合に、酵素の保存安定性が低く、酵素の熱失活により酵素の使用量の増大及び精度の低下が生じることから、市場の要望に十分に対応できるものではなかった。したがって、高温条件下でも安定的に作用できるホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】特開2007-139729号公報
【非特許文献１】Steinman CR. Jakoby WB.著、“Yeast aldehyde dehydrogenase. II. Properties of the homogeneous enzyme preparations.(酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼII )” J Biol Chem.、1968年、第243巻、第730〜734頁
【非特許文献２】Ras J. Van Ophem PW. Reijnders WN. Van Spanning RJ. Duine JA. Stouthamer AH. Harms N.著、“Isolation, sequencing, and mutagenesis of the gene encoding NAD- and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GD-FALDH) from Paracoccus denitrificans, in which GD-FALDH is essential for methylotrophic growth.” J Bacteriol.、1995年、第177巻、第247〜251頁
【非特許文献３】Ito K. Takahashi M. Yoshimoto T. Tsuru D.著、“Cloning and high-level expression of the glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase gene from Pseudomonas putida. ”J Bacteriol. 1994年、第176巻、第2483〜2491頁
【非特許文献４】NCBI、［online］、［平成20年5月31日検索］、インターネット〈URL： HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=548207" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=548207〉
【非特許文献５】Tanaka N. Kusakabe Y. Ito K. Yoshimoto T. Nakamura KT.著、“Crystal structure of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida: the structural origin of the tightly bound cofactor in nicotinoprotein dehydrogenases.”J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素の提供を目的とする。また、本発明は、当該酵素をコードする遺伝子を単離し、目的とする理化学的性質を備えた当該酵素を組換え体として取得し、遺伝子工学的手法による当該酵素の大量生産技術の提供をも目的とする。更に、本発明は、当該酵素の特性を活用したバイオセンサー及び燃料電池の提供をも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素の少なくとも１つの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素と比較して熱安定性及び保存安定性を向上できることを見出した。更に、かかる酵素を利用することにより、従来の酵素の熱安定性に関する欠点を克服し、より実用面において有利なアルデヒド検出用バイオセンサー及び燃料電池を提供できることをも見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１５］に示す発明を提供する。
［１］ 野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［２］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第80位に対応する位置で生じている上記［１］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［３］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置におけるアミノ酸の置換である上記［１］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［４］ 前記アミノ酸置換が、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換からなる群から選択される少なくとも１つである上記［３］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［５］ 前記アミノ酸置換が、以下の（１）又は（２）から選択される上記［４］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
（１）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換
（２）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換
［６］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置におけるアミノ酸の置換である上記［１］〜［５］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［７］ 前記アミノ酸置換が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換である上記［６］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［８］ 前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する上記［１］〜［７］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［９］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
［１０］ 上記［９］の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
［１１］ 上記［１０］の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１２］ 上記［１１］の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【００１３】
上記［１］〜［１２］の構成によれば、新規なホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が可能となる。本発明によって提供されるホルムアルデヒド脱水素酵素は、熱安定性を示す。したがって、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野におけるホルムアルデヒドの脱水素反応を要する技術に適用できる。更に、熱安定性が向上した実用性の高い本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を利用して組換え体として当該酵素を低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
【００１４】
［１３］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【００１５】
上記［１３］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物の検出方法が提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１６】
［１４］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【００１７】
上記［１４］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物検出用の酵素センサーが提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１８】
［１５］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【００１９】
上記［１５］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用した燃料電池が提供できる。特に、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく持続的に発電を行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素（以下、「PFDH」と略する）は、天然に存在する野生型PFDHのアミノ酸配列において、少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変されており、そして、野生型PFDHに比べて熱安定性が向上している。ここで、「少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対して、公知のDNA組換え技術、及び点変異導入方法等によって、欠失、置換、付加或いは挿入することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、付加或いは挿入されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。したがって、改変型PFDHは、これらの改変は１つ有するものであっても、また２つ以上が組み合わされたものであってもよい。このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。したがって、本発明における改変型PFDHには、これら双方の改変型が含まれる。
【００２２】
野生型PFDHとは、自然界より分離された PFDHのアミノ酸配列、及び該酵素をコードする核酸分子の塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２３】
ここで、「PFDH」とは、ホルムアルデヒドを基質としてギ酸を生成する脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質であり、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を要求する。反応式を以下に示す。
ホルムアルデヒド ＋ NAD+（酸化型） → ギ酸 ＋ NADH（還元型） ＋ H+
【００２４】
上記PFDHには、グルタチオン依存性、非依存性の２つの型が存在する。本発明においては何れもが対象となるが、グルタチオン非依存性が好ましい。
【００２５】
そして、改変型の基礎となる野生型PFDHは、上記の性質を有する限り何れの生物由来のものであってよい。具体的には、シュードモナス（Pseudomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）等の細菌由来、及びサッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母由来のPFDH等が例示される。更には、ウシ（Equus caballus）やラット（Rattus norvergicus）等の哺乳動物由来のPFDHをも含む。好ましくは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のPFDHである。しかしながら、これらに限定するものではない。
【００２６】
「安定性が向上」とは、熱、及び保存に対する当該酵素の安定性が向上することであり、一定期間の熱処理及び保存に対して、当該酵素の触媒機能の失活や活性低下が抑制できることを意味する。具体的には、改変型PFDHが、野生型PFDHよりも、一定期間の熱処理又は保存に供した後に維持されている酵素の触媒機能の残存率が高いことを意味する。例えば、野生型PFDHの活性が維持される25℃での酵素の酵素活性値を100%として、加温処理後の活性値を酵素活性の残存率として算出する。この残存率が、野生型PFDHと比較して増大していた場合、当該酵素の熱安定性が向上したと判断できる。また、一定期間の保存に際しての残存率が、野生型PFDHと比較して増大していた場合、当該酵素の保存安定性が向上したと判断できる。一例として、50℃にて30分間の加温により60％以上、特には75％以上の残存活性を維持できる熱安定性が好ましい。また、45℃にて10時間の保存で60〜80％、30時間の保存であっても50〜60％程度の残存活性を維持できる保存安定性が好ましい。
【００２７】
本発明の改変型PFDHは、これに限定されるものではないが、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位、特には第77位〜第80位の少なくとも１つに対応する位置のアミノ酸が改変されたものが、好ましく例示される。特には、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における、第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置における改変が好ましく例示される。
【００２８】
更に、本発明の改変型PFDHとしては、野生型PFDHのアミノ酸配列において、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置における改変が好ましく示めされる。
【００２９】
野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位（第80位）に対応する位置のアミノ酸の改変、及び配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアミノ酸の改変は、これらの位置における何れかの改変を有するもの全てが本発明に含まれる。また、かかる位置における１のアミノ酸が改変したものであっても、複数の位置における複数のアミノ酸が改変したものであってもよい。したがって、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位（第80位）、及び第372位は離間した位置にあるが、双方の位置における改変が組み合わされたものも本発明に含まれる。
【００３０】
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ由来の野生型PFDHのアミノ酸配列であるが、他の生物由来の当該酵素のホモログについても同様の位置が改変されたものは本願発明の改変型PFDHに含まれる。
【００３１】
ここで、改変としては、特に好ましくは、他のアミノ酸への置換である。そして、他のアミノ酸とは、置換前のアミノ酸以外の何れもが含まれる。しかしながら、タンパク質機能改変の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と異なる性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有するが、これら以外のアミノ酸への置換はタンパク質機能へ影響を与えることが考えられる。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内の以外へのアミノ酸置換は、タンパク質の機能が改変されることが特に予想されるが、これに制限されるものではない。
【００３２】
好ましくは、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換、及び第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換からなる群から選択される少なくとも１の置換が例示される。特に、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するものが例示される。一例として、シュードモナス・プチダ由来のPFDHの場合を例にとって、各改変型のアミノ酸配列について配列番号４、６、及び８に示す。
【００３３】
更に、前述の改変型PFDHの性質を保持している限り、更に特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の改変型PFDHの酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる、具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にHisタグペプチド、FLAGタグペプチド等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、本発明の酵素活性の喪失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００３４】
本発明の改変型PFDHは公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる野生型PFDHをコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変型遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から上記活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３５】
改変の基礎となる野生型PFDHをコードする遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、GenBank等の公知のデータベースを検索することによって取得することができる遺伝子情報を基にしてプライマーを設計し、PFDHを産生し得る生物体から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより取得することができる。また公知の遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法等の核酸合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適なPFDHの配列情報として、野生型のシュードモナス・プチダ由来のPFDHのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、当該PFDHをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３６】
野生型PFDHをコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、PCR法等を利用して変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。
【００３７】
特には、野生型PFDHをコードするDNAを鋳型として、所望の改変（欠失又は置換）を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、本発明の改変型PFDHの調製において、PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、野性型PFDHをコードする核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の改変が生じるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３８】
また、目的とする改変型PFDHのアミノ酸配列が定めることにより、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成技術を利用して本発明の改変型PFDHをコードするDNAを化学的に合成することができる。
【００３９】
また、このような本発明の改変型PFDH改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から前述の理化学的性質を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。
【００４０】
（本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子）
本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子は、前述の理化学的性質を有するすべての改変型PFDHをコードするものを包含する。例えば、配列番号４、６及び８に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする全てのポリヌクレオチドであり、一具体例としては、配列番号３、５、及び７に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定するものではない。ここで、本発明におけるポリヌクレオチドにはDNA及びRNAの双方が含まれ、DNAである場合には、１本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４１】
本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子は、本明細書においてその塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して化学的に合成することができる。また、改変の基礎となる野生型PFDHをコードするDNAに対して改変を施すことによっても製造することができる。なお、詳細については前述した。
【００４２】
（本発明の組換えベクター）
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を組み込ことによって構築することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（pEX系、pUC系、及びpBR系等）、ファージベクター（λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００４３】
そして、本発明の組換えベクターは、本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。したがって、核酸分子の機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく既知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００４４】
ベクターへの本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、DNAリガーゼを用いる方法等、既知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００４５】
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、適当な細胞を本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を含む組換えベクターで形質転換することによって構築することができる。ここで、宿主となる細胞としては、本発明の改変型PFDHを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Sf９細胞等の昆虫細胞、CHO細胞、COS-7細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００４６】
（本発明の改変型PFDHの製造方法）
本発明の改変型PFDHの製造方法は、前述の本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、前述の本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、低コストで本発明の改変型PFDHの大量生産が可能となる。
【００４７】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。
【００４８】
例えば、炭素源として、ホルムアルデヒド、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００４９】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００５０】
精製工程は、前述の培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の改変型PFDHを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本発明の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明のPFDHが宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、既知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の酵素を単離精製することができる。
【００５１】
例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDS-PAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の既知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィを利用する場合、本発明の酵素をHis Tag等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、本発明の改変型PFDHが宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。
【００５２】
続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。ここで、本発明で得られる改変型PFDHは、熱安定性が高いことから、前述の単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して、本発明の酵素は、改変型を有するため変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。また、培養液をそのまま、若しくは粗抽出液を使用する場合においても、熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活することから、実質的に本発明の改変型PFDHのみの酵素液として使用することができる。したがって、本発明の改変型PFDHを遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。したがって、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００５３】
そして、精製されたPFDHが所望の改変が生じている改変部位を有する本発明の改変型PFDHであるか否かの確認は、その理化学的性質や配列の分析によって行うことができる。理化学的性質の分析による場合、一定期間、熱処理に付した後、酵素の酵素活性を公知方法により測定し改変部位を有しない野生型PFDHと比較して、活性の残存率が高いか否かを確認することによって行うことができる。したがって、基質であるアルデヒド化合物に対してNAD+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。
【００５４】
酵素の活性は、NAD+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、NAD+の存在下で、本発明の酵素をアルデヒド化合物と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するNADH量の変化を340 nmの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができる。したがって、PFDH活性は、ホルムアルデヒド及びNAD+から、ギ酸及びNADHを生成する触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定できる。つまり、酵素反応によりホルムアルデヒドが酸化されギ酸となり、このときNADが還元されNADHが生成する（反応式：HCHO ＋ NAD+ ＋ H2O → HCOOH ＋ NADH ＋ H+）。このNADからNADHの生成を340nmの吸光度変化を測定して酵素活性とした。この配列分析による場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。
【００５５】
（アルデヒド化合物の検出方法）
本発明の改変型PFDHは、試料中のアルデヒド化合物の検出のために利用することができる。アルデヒド化合物の検出は、例えば、基質であるアルデヒド化合物に対してNAD+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。酵素の活性は、NAD+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、NAD+の存在下で、本発明の酵素を測定対象となる試料と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するNADH量の変化を340 nmの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができ、ひいてはNADH量の変化によりアルデヒド化合物の存在を検出することができる。したがって、PFDH活性は、その触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定できる。反応液としては、例えば、ホルムアルデヒド等のアルデヒド基質、2 mM のNAD+、25 mM のMgCl2、１MのNaCl及び本発明の酵素溶液を、50 mMリン酸緩衝液（pH 8.8）中にて混合して200μlとすることにより調製することができる。しかしながら、これは標準条件であり、適宜変更することができる。この反応液を、37 ℃で波長340 nmにおける吸光度を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行うことができ、吸光度の測定は、既知のマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いることができる。そして、適当な試験条件が選択されていれば、この変化は、測定しようとする酵素活性に直線的に比例する。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた吸光度変化値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００５６】
ここで、試料としては、アルデヒド化合物等、PFDHの基質となり得る化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。また、必要に応じて、これらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。特に、本発明の改変型PFDHは、優れた熱安定性を示すことから、温度が高い試料の分析に際して好適に利用できる。そして、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００５７】
（アルデヒド化合物検出用のバイオセンサー）
本発明は、本発明の改変型PFDHを利用するアルデヒド化合物検出用のバイオセンサーを提供する。当該検出センサーは、電極材上に本発明の改変型PFDHが固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は、既知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。そして、本発明のPFDHの酵素活性に際して要求される補酵素NAD+、NAD+の還元体であるNADHを酸化する能力を有する酸化酵素（ジアホラーゼ等）、電子メディエーター（フェロセン、ジクロロインドフェノール等）も、必要に応じて電極材上に固定化して構成される。
【００５８】
アルデヒド化合物の測定は、例えば、測定対象となる試料を接触させると試料中のアルデヒド化合物が作用極上に固定された本発明の改変型PFDHと反応し、続いて電子メディエーターが還元される。そして、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸化し、得られる酸化電流値の変化により試料中のアルデヒド化合物を検出することができる。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた酸化電流値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００５９】
ここで、試料としては、本発明の改変型PFDHの基質となり得るアルデヒド化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。詳細については前述した。特には、前述の通り、本発明の改変型PFDHは、熱安定性が高いことからバイオセンサー製作時における劣化をも防止することができ、また、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６０】
（本発明の燃料電池）
本発明は、本発明の改変型PFDHを利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアソードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。そして、アノード電極側では、本発明の改変型PFDHがアルデヒド化合物を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。アノード極側には本発明の改変型PFDHが供給され、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。このとき、改変型PFDHは、好ましくはNADと共に固定化されることが好ましく、特にはNADと結合したホロ酵素の形態で固定化されることが好ましい。また、アポ酵素の形態で固定化し、NADを適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素を必要に応じて供給してよい。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００６１】
以上のように構成することにより、燃料であるアルデヒド化合物を酸化する際に生じた電子がアノード極に電子を受け渡す。そして、アノード極に渡された電子は、外部回路を経てカソード極に到達することで電流が発生する。燃料となるアルデヒド化合物としては、本発明の改変型PFDHの基質となり得るアルデヒド化合物であれば制限はない。
【００６２】
また、メタノールを燃料とした酵素燃料電池においても本発明の改変型PFDHを利用できる。その場合には、触媒として、本発明の改変型PFDHに加え、必要に応じてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してCO2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼを併用することにより構成することができる。
【００６３】
本発明の燃料電池は、熱安定性が高い本発明の改変型PFDHの触媒能力を利用することから、持続的に発電を行なうでき、高性能の燃料電池として構築することができる。また、本発明の改変型PFDHは、熱安定性が高いことから燃料電池製作時における劣化をも防止することができ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）本発明の改変型PFDH遺伝子のクローニング
分子進化工学的手法と称される酵素改変手法を利用して、本発明の改変型PFDH遺伝子のクローニングを行った。
【００６５】
かかる分子進化工学的手法とは、生物進化の原理をタンパク質に応用する技術である。そのステップとしては、まずランダムに改変の基礎となる遺伝子に変異を導入し、可能な限り多様な改変型遺伝子を作り出す。そして、改変型遺伝子から改変型タンパク質を作製して、その中から所望の性質を保持するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。このようにして、設計原理が未知であっても所望の機能や性質を保持する高分子を取得することができ、取得した遺伝子の変異箇所及び変異様式を調べることによって、高分子設計原理の研究においても威力を発揮することができる。
【００６６】
（方法）
分子進化工学的手法による酵素改変工程は、以下の５工程から構成される。以下に、その詳細について説明する。
工程１：野生型PFDH遺伝子の取得
工程２：野生型PFDH遺伝子を保持する発現ベクターの構築
工程３：改変型PFDH遺伝子ライブラリーの作製
工程４：改変型PFDHの無細胞タンパク質合成
工程５：改変型PFDHの活性測定
【００６７】
工程１：野生型PFDH遺伝子の取得
野生型PFDH遺伝子のクローニングは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによりPFDH遺伝子を増幅することにより行った。ゲノムDNAは、シュードモナス・プチダ株の菌体から、ゲノムDNA抽出キット（プロメガ社製）を使って抽出及び精製を行うことにより調製した。なお、シュードモナス・プチダ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（国内の微生物・遺伝子バンク：NITE）から分譲を受け、分譲業者の指示に従って菌体培養を行った。
【００６８】
PCR反応は、PCRキット、PrimeStar（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM、上記で調製した鋳型DNAを50 ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、98℃にて10秒間の熱変性、55℃にて５秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、30サイクルの増幅反応を行った。
【００６９】
ここで使用したプライマーの配列情報を示す。
シュードモナス・プチダ用プライマー
5'- GAGCA TATGT CTGGT AATCG TGGTG T - 3'(配列番号９)
5'- CTAAA GCTTA GGCCG CGCTG AGGTC T - 3'（配列番号10）
下線はクローニング用の制限酵素認識部位を示す。
【００７０】
PCR増幅反応後の反応液を、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）により精製し、PCR増幅産物を確認した。その結果、予想される増幅産物（約1.2 kbp）の取得が確認できた。
【００７１】
工程２：野生型PFDH遺伝子を保持する発現ベクターの構築
PCR増幅で得られたDNA断片（約1.2 kbp）を、制限酵素Nde-IとHind-IIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後の各DNA断片を、タンパク質発現用プラスミドのpET22bベクターとpET23bベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位（Nde-I及びHind-III）にライゲーション反応より組み込み、PFDH遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。当該発現ベクターは、T7プロモーター、リポソーム結合部位の下流、T７ターミネーターの上流にPFDH遺伝子を組み込むように構築した。
【００７２】
また、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成の際の鋳型とする直鎖状DNAを調製するため、上記で得られたPFDH遺伝子を組み込んだ発現ベクター鋳型にして、T7プロモーターとターミネーター配列との間の領域をPCRにて増幅した。PCR反応は、PCRキット、PrimeStar（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM 、鋳型DNAを10ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、98℃にて10秒間の熱変性、55℃にて５秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、3０サイクルの増幅反応を行った。PCR産物の精製には、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）を用いた。
【００７３】
ここで使用したプライマーの配列情報を示す。
5'- TAATA CGACT CACTA TAGGG - 3'（配列番号11）
5'- TAGTT ATTGC TCAGC GGTGG - 3'（配列番号12）。
【００７４】
PCR増幅反応後の反応液から、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）によりPCR増幅産物を精製した。
【００７５】
工程３：改変型PFDH遺伝子ライブラリーの作製
野生型PFDH遺伝子にランダム変異を導入した変異遺伝子ライブラリーを調製した。ここでは、変異導入のための手法として、エラープローンPCR法を用いた。
【００７６】
まず、エラープローンPCR法の条件検討を行った。ここでは、変異導入の基礎としたPFDH分子内に1〜2箇所の変異導入が得られる条件、つまり、エラー率が0.5％前後となる条件、の設定のための検討を行った。具体的には、マグネシウム濃度、マンガン濃度を変化させ、所望のDNAポリメラーゼのヌクレオチドの取り込み間違い頻度を算出することによりエラー率を確認した。マグネシウム濃度とマンガン濃度を、夫々、[Mg, Mn]=[3.0, 0.3] mM、[Mg, Mn]=[5.0, 0.5] mM、[Mg, Mn]=[6.0, 0.6] mMの3種類を組み合わせて行った。PCR後に、得られた増幅産物の塩基配列を確認することによりエラー率を算出したところ、夫々、0%, 0.2%, 0.5%であった。かかる結果に基づき、[Mg, Mn]=[6.0, 0.6] mMにてエラープローンRCRを行うことにより、改変型PFDH遺伝子ライブラリーを作製した。
【００７７】
PCR反応液は、50 μlの反応系中に、2.5 unitのTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、各0.5 μMのプライマー、10 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl、3.0〜6.0 mM MgCl2、0.3〜0.6 mM MnCl2を含んで調製した。プライマーとしては、pET22bベクターのマルチクローニングサイトの両端にあるT7プロモーター配列、及びT7ターミネーター配列を使用した。
【００７８】
以下に、具体的な配列情報を示す。
T7プロモータープライマー：5'-TAATA CGACT CACTA TAGGG-3'（配列番号13）
T7ターミネータープライマー：5'-GCTAG TTATT GCTCA GCGG-3'（配列番号14）
【００７９】
そして、PCR温度プログラムは、94℃にて30秒間の熱変性、55℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、30サイクルの増幅反応を行った。
【００８０】
上記エラープローンPCRにて得られた増幅断片に、１分子PCR用プライマー配列（Homo primer）を付加するために、Homo-tail プライマーを用いたPCR増幅を行った。上記で得られた変異導入DNA断片を鋳型とし、PCRキット、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM 、鋳型DNAを10 ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、94℃にて30秒間の熱変性、55℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、20サイクルの増幅反応を行った。
【００８１】
ここで、使用したプライマーの配列情報を示す。
5'- GGA GCT AGG GTT TAC GAG TGG AAT GAT CTC GAT CCC GCG AAATTA ATA C -3'
（配列番号15）
5'- GGA GCT AGG GTT TAC GAG TGG AAT GTC CGG ATA TAG TTC CTCCTT TCA G -3'
（配列番号16）
【００８２】
PCR増幅反応後の反応液から、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）によりPCR増幅産物を精製した。
【００８３】
工程４：改変型PFDHの無細胞タンパク質合成
上記工程３で得られた改変型PFDH遺伝子から、無細胞タンパク質合成システムを利用してタンパク質を合成した。無細胞タンパク質合成システムとして、市販の無細胞タンパク質合成系（ラピッドトランスレーションシステム：RTSシステム：ロシュ社製）を用い、製造業者のプロトコールに従い、反応時間4時間、反応温度30℃を基本条件としてタンパク質を合成した。
【００８４】
なお、合成に先立って、合成反応を最適化するために、分子シャペロンであるGroE（ロッシュ社製）とDnaK（ロッシュ社製）の添加による効果を検討した。ここで、上記工程２で得られた発現ベクター 1μgを鋳型として、GroE、DnaK、GroE及びDnaKを添加した場合、また何れの分子シャペロンをも添加しない場合について、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質を試験管内で合成した。
【００８５】
結果を図１に示す。
レーン１は、何れの分子シャペロンも添加しない場合、レーン２は、GroEを添加した場合、レーン３は、DnaKを添加した場合、レーン４は、GroEとDnaKを両方添加した場合の結果を示す。
【００８６】
図１より、DnaKでは合成阻害が生じたが、GroEでは合成量が増加することが確認された。以上の結果より、GroEを添加して合成を行うことが好ましいことが導かれ、本実施例の無細胞タンパク質合成系でのタンパク質合成の際には、分子シャペロンGroEを添加して合成を行った。
【００８７】
工程５：改変型PFDHの活性測定
工程４にて得られた改変型PFDHの酵素活性を測定した。酵素活性は、PFDHの触媒反応で生成するNADHを波長340 nmの吸光度を測定することに定量し、これを指標として、ホルムアルデヒド分解活性を求めることにより測定した。つまり、PFDHの酵素活性は、ホルムアルデヒド及びNAD+から、ギ酸及びNADHを生成する触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定した。
【００８８】
詳細には、適量の酵素溶液を、1 mM ホルムアルデヒド、1 mM NAD+、0.01% BSAを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中で混合することにより調製した。続いて、この反応液中のNAD+からNADH変化に伴う340 nmの吸光度変化を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行った。吸光度は、UV-240分光光度計又はプレートリーダにより測定した。なお、UV-240分光光度計での測定に際しては、80 μlの反応液に、2.0μlの合成反応終了液（酵素溶液）を添加して、NADH量の変化に伴う340 nmの吸光度変化を測定した。プレートリーダでの測定に際しては、200μlの反応液に、10μlの合成反応終了液（酵素溶液）を添加して、同じく340 nmの吸光度変化を測定することにより行った。
【００８９】
そして、酵素溶液を50℃にて20分間の熱処理に供し、熱処理後の残存活性が野生型PFDHより向上した酵素活性を発現するクローンを選択した。これにより、熱処理後にも高い残存活性を有するPFDHを発現する多数のクローンを得た。
【００９０】
（実施例２）改変型PFDH遺伝子配列の解析
実施例１で得られた改変型を有するクローンについて遺伝子配列を解析した。
【００９１】
実施例１で得られた改変型を有するクローンのうち３つのクローンについて、その塩基配列を解析した。その塩基配列について、配列表に、配列番号３、５、及び７として、また、推定アミノ酸配列を配列番号４、６及び８に表す。
【００９２】
これら３つのクローンは、公知のシュードモナス・プチダのPFDHのアミノ酸配列（配列番号２）において、NAD結合ドメイン上の第372位のアスパラギン酸がバリン（D372V）に置換されたクローン（以下、「PFDH/D372V」と称する：配列番号４）、基質結合ドメイン上の第79位のアルギニンがセリン（R79S）に、第84位のロイシンがメチオニン（L84M）に置換されたクローン（以下「PFDH/R79S/L84M」と称する：配列番号６）、基質結合ドメイン上の第77位のリシンがメチオニン（K77M）に置換されているクローン（以下、「PFDH/K77M」と称する：配列番号８）であることが判明した。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けした。
【００９３】
（実施例３）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析
本発明の改変型PFDHの高次構造を、Ｘ線結晶構造解析に基づいて解析した。
【００９４】
野生型PFDHのアミノ酸構造解析について記載された文献（Tanaka N.他著、J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁（上述）、Tanaka N.他著、“Crystal structure of glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase.”Chem Biol Interact.、2003年、第143〜144巻、第211〜218頁）により、３つのクローンの変異位置について解析した。その結果、PFDH/D372Vのアミノ酸変異部位であるD372Vは、補酵素（NAD）結合ドメイン内に存在することが導かれた。一方、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77Mの各アミノ酸変異部位であるK77M、R79S、L84Mについては、すべて基質（ホルムアルデヒド）結合ドメイン内に存在することが導かれた。
【００９５】
さらに、詳細に上述のPFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の報告を検討した。その結果、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77Mの各アミノ酸変異部位のうち、K77M、R79S、L84Mは、PFDHの４量体構造を構成する各サブユニットの界面付近に位置するループ構造領域（K77〜D80）近辺に存在していることが判明した。ここで、一例として、アミノ酸残基K77についての解析結果を図２（Ａ）に示す。
【００９６】
図２（Ａ）より、４量体酵素のサブユニットの界面付近に位置するループ構造領域は、高次構造におけるサブユニット間相互作に影響を及ぼし、タンパク質の熱安定性を支配していることが示唆された。
【００９７】
また、PFDH/D372Vの高次構造解析結果を図２（Ｂ）に示す。
【００９８】
図２（Ｂ）より、アミノ酸変異部位（D372V）については、酵素表面に近いヘリックス構造領域内に存在していることが判明した。これにより、かかる酵素表面に近いヘリックス構造領域が、当該酵素の立体構造の安定化を支配している可能性が示唆された。
【００９９】
（実施例４）改変型PFDH大腸菌細胞内での組換え発現、及び精製
実施例２で確認された所望の改変を有する本発明の改変型PFDHを大腸菌細胞内で組換え生産させた。
【０１００】
まず、実施例１で取得され、実施例２で確認された所望の改変型PFDHをコードする遺伝子を、大腸菌用の発現ベクターであるpET22b DNA（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイトにＣ末端Hisタグ融合タンパク質として発現するように挿入した。得られたプラスミドにより、大腸菌BL21(DE3)株（ノバジェン社製）の形質転換を行った。大腸菌の培養は、アンピシリン(50 mg/l)を含むLuria-Bertani（LB）培地中にて37℃で行った。なお、形質転換は、Sambrook 及び Russell著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法に従って行なった。続いて、得られた形質転換体を、アンピシリン（50 mg/l）を含むLB培地中で、培養液の吸光度がOD600=0.6になるまで培養した。そして、組換えタンパク質の合成誘導のため終濃度0.5 mM のイソプロピル−β−D-チオガラクトピラノシド（isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside：IPTG）を添加して更に4時間培養した。
【０１０１】
培養液1 mlを遠心分離して回収した菌体を、200μlの可溶化液中に懸濁した。続いて、超音波破砕処理（30-s pulses; maximum power; high intensity; 0.5-s repeating duty cycle）により菌体を破砕した後、菌体破砕液を15,000×g で10分間遠心して上清を得た。この上清を3分間95℃で熱処理した後、12.5％アクリルアミドゲル（アトー社製）電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（以下、「CBB」と略する）染色（和光純薬社製）によりタンパク質を可視化することにより、組換えタンパク質の発現を確認した。
【０１０２】
また、このときコントロールとして、野生型PFDHについても同様に処理を行い、タンパク質の発現を確認した。
【０１０３】
結果を図３（Ａ）に示す。
レーン１は分子量マーカー、レーン２はPFDH/K77M、レーン３はPFDH/R79S/L84M、レーン４は野生型PFDH（コントロール）、レーン５はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１０４】
図３（Ａ）より、いずれも47kDaの位置にタンパク質のバンドを確認することができた。
【０１０５】
また、上記で発現させたタンパク質はHisタグ融合タンパク質であり、これをアフィニティークロマトグラフィーにより分離、及び精製した。具体的には、遠心分離により回収した菌体を、リン酸緩衝液 (20mM リン酸緩衝液、0.5M NaCl pH 7.4)に懸濁した。続いて、菌体を超音波破砕処理（超音波処理30秒、氷冷 30秒を10セット)し、以下の精製工程を示す手順でタンパク質の精製を行った。精製後のタンパク質を、アクリルアミドゲル電気泳動に供し、CCB染色によりタンパク質を可視化した。
【０１０６】
アフィニティークロマトグラフィーによる精製の詳細は以下の通りである。
１．クロマトグラフィー担体（Ni Sepharose：GE Healthcare社製）を25mlの純水で洗浄
２．クロマトグラフィー担体を2.5ml の0.1M NiSO4 で洗浄
３．クロマトグラフィー担体を25mlの純水で洗浄
４．50mlの10mMイミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液でクロマトグラフィー担体を平衡化
５．サンプルの添加
６．50mlの10mMイミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液でクロマトグラフィー担体を洗浄
７．30mlの20mM リン酸緩衝液、0.5M NaCl（pH 7.4）に100〜500mMのイミダゾールを添加した溶出バッファーで、タンパク質を溶出
８．脱塩クロマトグラフィー担体で脱塩
【０１０７】
また、このときコントロールとして、野生型PFDH遺伝子についても同様に処理を行い、タンパク質の精製を確認した。
【０１０８】
結果を図３（Ｂ）に示す。
レーン１は分子量マーカー、レーン２はPFDH/K77M、レーン３はPFDH/R79S/L84M、レーン４は野生型PFDH（コントロール）、レーン５はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１０９】
図３（Ｂ）より、いずれも47kDaの位置にタンパク質のシングルバンドを確認することができ、良好な精製結果を得ることができた。
【０１１０】
（実施例５）HisタグペプチドのPFDH活性への影響確認
実施例４にて発現させたタンパク質のＣ末端側に融合しているHisタグペプチドのPFDH活性への影響を検討した。
【０１１１】
実施例４にて発現させたタンパク質は、Ｃ末端側にHisタグペプチド（酵素-Lys-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Glu-(His)6）が融合している。かかるHisタグペプチドの当該酵素活性への影響を検討した。Hisタグペプチドが融合、又は融合していない野生型PFDH発現用pET23bベクターを鋳型にして、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質を試験管内で合成した。タンパク質合成後、酵素活性を実施例１の記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡し、当該吸光度の増加を比較した。
【０１１２】
結果を図４に示す。
図４は、Hisタグペプチドが融合したPFDH、及びHisタグペプチドが融合していないPFDHの酵素活性を比較した結果を示す。
【０１１３】
図４より、Hisタグペプチドの有無によって酵素活性に差は無いことが理解される。したがって、本明細書において対象としているPFDHについては、その酵素活性はHisタグペプチドの付加によっては影響を受けないことが確認された。
【０１１４】
（実施例６）改変型PFDHの無細胞タンパク質合成系による合成及び活性確認
上記実施例１で取得され、実施例２で確認された所望の改変型PFDHをコードする遺伝子のDNA断片を、制限酵素Nde-IとHind-IIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後の各DNA断片を、タンパク質発現用プラスミドのpET23bベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位（Nde-I及びHind-III）にライゲーション反応より組み込み、PFDH遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。このようにして得られた改変型PFDH発現用pET23bベクターを鋳型に用いて、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従って合成を行った。続いて、FluoroTect（登録商標） GreenLys in vitro Translation Labeling System（プロメガ社製）を用いて、製造業者の指示に従って蛍光標識して酵素合成の成否を確認した。そして、電気泳動により合成物の確認を行うと共に、酵素活性を実施例１の工程４に記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡した。
【０１１５】
また、このとき比較例として、野生型PFDH発現用pET23bベクターについても同様に処理を行い、酵素合成及び酵素活性を比較した。
【０１１６】
結果を図５（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
図５（Ａ）は、４種類の改変型PFDH及び比較例としての野生型PFDHの合成について電気泳動により確認した結果を示し、レーン１はPFDH/K77M、レーン２はPFDH/R79S/L84M、レーン３は野生型PFDH（比較例）、レーン４はPFDH/D372Vの結果を示す。
図５（Ｂ）は、合成した４種類の改変型PFDH及び比較例としての野生型PFDHの酵素活性の経時変化を示す。
【０１１７】
また、改変型PFDHのうち、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77M、PFDH/D372V、及び野生型PFDHの酵素カイネティクスを表１にまとめる。
【０１１８】
酵素活性は、分子活性を、Uotila L.他著、“Formaldehyde dehydrogenase”、Methods Enzymol.、1981年、第77巻、第:314-20頁を参照にして算出することにより求めた。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
図５（Ａ）〜（Ｂ）、及び、表１の結果より、無細胞タンパク質合成系でも、活性を維持する改変型PFDHを合成することが可能であることが確認された。しかしながら、酵素量を揃えることができないため、活性度合いを比較することはできかったが、Km値及びKcat値に大きな差は認められなかった。
【０１２１】
（実施例７）改変型PFDHの熱安定性の確認
改変型PFDHについて、熱処理後の残存活性を検討することにより熱安定性をを確認した。
【０１２２】
実施例４で精製した100ngの４種類の改変型PFDH（PFDH/D372V、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77M）をリン酸緩衝液（20mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH 7.4)中で、様々な温度条件（25、45、50、55、60℃）下で20分間熱処理し、氷中に30分間置いた後の残存活性を確認した。酵素活性は、酵素活性を実施例１の工程４に記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡した。その吸光度の増加速度を酵素の反応速度とした。そして、25℃での処理における活性を100として、その他の温度における保温後の残存活性を相対活性として算出した。
【０１２３】
比較例として、野生型PFDHについても同様に処理を行い、酵素活性を求めた。
【０１２４】
結果を図６（Ａ）〜（Ｄ）、及び、図７に示す。
図６（Ａ）は野生型PFDH（比較例）、図６（Ｂ）はPFDH/D372V、図６（Ｃ）はPFDH/R79S/L84M、図６（Ｄ）はPFDH/K77Mの結果を示す。
図７は、今回検討した４種類の改変型PFDH、及び野生型PFDH（比較例）について、50℃での熱処理での残存活性を比較した結果を示す。最も残存活性の高かったPFDH/D372Vの残存活性を100%として、他の改変型及び野生型PFDHの残存活性を相対活性として算出した。
【０１２５】
図６（Ａ）〜（Ｄ）、及び、図７より、野生型PFDHでは、50℃熱処理での残存活性がほぼ０％であるのに対し、PFDH/D372Vは残存活性が約80％、PFDH/R79S/L84Mは残存活性が約60％、PFDH/K77Mは残存活性が約75％を示した。改変型PFDHは、熱安定性が野生型PFDHに比べて格段に向上していることが確認された。
【０１２６】
（実施例８）改変型PFDHの耐久性確認
改変型PFDHについて、45℃での保存安定性を検討することにより耐久性を確認した。
【０１２７】
実施例４で精製した４種類の改変型PFDHのうち、実施例８にて最も熱安定性が高いことが確認されたPFDH/D372Vについて45℃での保存安定性を検討した。PFDH/D372Vをリン酸緩衝液（20mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH 7.4)中で、45℃にて、０、10、30、及び50時間保温した。続いて、氷中に30分間置いた後の残存活性を確認した。酵素活性は、実施例１の工程４に記載の方法により、NADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡し、その吸光度の増加速度を酵素の反応速度とした。そして、各酵素につき、保存前（０時間）における活性を100として、保存後の残存活性を相対活性として算出した。
【０１２８】
比較例として、野生型PFDHについても同様に処理を行い、残存活性を求めた。
【０１２９】
結果を図８（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
図８（Ａ）は野生型PFDH（比較例）、図８（Ｂ）はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１３０】
図８より、野生型PFDHでは、45℃での10時間保存すると残存活性が30％程度であるのに対し、PFDH/D372Vは10時間保存で約80％、30時間保存で約60％、50時間保存であっても約40％の活性が残存することが確認された。改変型PFDHは、熱安定性に加え保存安定性が野生型PFDHに比べて格段に向上していることが確認された。
【０１３１】
（実施例９）PFDHの分離、精製
大腸菌タンパク質を含む酵素合成液から、PFDHの分離、精製を行った。ここでは、当該改変型PFDHのアミノ酸配列を解析して、その等電点等の物性情報から精製に適した３種類の精製担体を選択した。
【０１３２】
具体的には、精製担体として、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過を選択し、実施例４の手順で当該野生型PFDHを組み換え発現させた大腸菌培養物に対して実施した。このように、３種類の精製担体を使用して順次処理することにより、酵素活性を保持しつつ、かつ、高純度、及び高収率で精製することができた。精製工程の概要を下記に示すと共に、工程の詳細及び緩衝液につき、夫々、表２及び３に要約する。
【０１３３】
PFDH精製工程の概要
工程１：大腸菌の培養：PFDH産生能を有する大腸菌を培養
工程２：大腸菌の回収：遠心分離により菌体を回収し液体窒素で急速に凍結
工程３：菌体の溶解：菌体を緩衝液中に懸濁し、菌体分解液及び界面活性剤を添加して氷中で反応
工程４：菌体の破壊：菌体を超音波破砕処理（OUT PUT 10、DUTY 50、90秒×3回）で破砕
工程５：遠心分離：酵素は可溶性であるため遠心分離により上清を分取
工程６：クロマトグラフィー精製：疎水性クロマトグラフィー（ブチルトヨパール）にて精製
工程７：脱塩：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて脱塩
工程８：クロマトグラフィー精製：陰イオンクロマトグラフィー（DE52）にて精製
工程９：脱塩・濃縮：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて脱塩、並びに濃縮
工程10：クロマトグラフィー精製：ゲルろ過クロマトグラフィー（セファクリルS-200）にて精製
工程11：緩衝液置換：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて緩衝液置換
工程12：保存：ろ過滅菌し、−20℃で保存
工程13：純度測定：蛋白質濃度測定、及び酵素活性測定
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
精製結果を図９に示す。
図９は、レーン１は、上記工程４後のタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動で確認した結果を示す。レーン２は、工程８後のカラム溶出液に含まれるタンパク質を確認した結果を示す。レーン３は、工程１０後のカラム溶出液に含まれるタンパク質を確認した結果を示す。それぞれ、PFDHのバンドを矢印で示す。
図９より、３つの精製担体を使用して順次処理することで、高純度かつ高収量の酵素が精製することができることが確認できた。
【０１３７】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用方法に関し、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】PFDHの無細胞タンパク質合成系における合成条件を検討した結果を示す図
【図２】（Ａ）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析結果（アミノ酸残基：K77）を示す図、（Ｂ）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析結果（アミノ酸残基：D372）を示す図
【図３】（Ａ）改変型PFDHの大腸菌細胞内での組換え発現を確認した実施例４の結果を示す電気泳動図、（Ｂ）改変型PFDHの大腸菌細胞内での組換え発現を確認した実施例４の結果を示す電気泳動図
【図４】Hisタグペプチドの酵素活性への影響確認した実施例５の結果を示すグラフ
【図５】（Ａ）改変型PFDHの無細胞タンパク質合成系による合成を確認した実施例６の結果を示す図、（Ｂ）無細胞タンパク質合成系により合成した改変型PFDHの活性を確認した実施例６の結果を示す図
【図６】（Ａ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（比較例）を示すグラフ、（Ｂ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/D372V）を示すグラフ、（Ｃ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/R79S/L84M）を示すグラフ、（Ｄ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/K77M）を示すグラフ
【図７】改変型PFDHの熱安定性を確認した実施例７の結果（50℃での熱安定性）を示すグラフ
【図８】（Ａ）改変型PFDHの耐久性を確認した実施例８の結果（比較例）を示すグラフ、（Ｂ）改変型PFDHの耐久性を確認した実施例８の結果（PFDH/D372V）を示すグラフ
【図９】改変型PFDHの分離、精製を確認した実施例９の結果を示す図
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素を含むバイオセンサー、並びに酵素燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒド脱水素酵素 （EC 1.2.1.46 ）は、ホルムアルデヒドを酸化してギ酸を生成する反応を触媒する。ホルアルデヒド脱水素酵素の基質となるホルムアルデヒドは、シックハウス症候群等の慢性的なアレルギー症状を引き起こす原因物質の１つとして知られている。また、稀薄な溶液でも細胞原形質のタンパク質を不可逆的に凝固させ、全ての細胞機能を停止、死滅させる作用があるために、細胞毒としても知られている。そのため、食品中、大気中などのホルムアルデヒドを測定し、これを分解及び除去することが求められており、ホルムアルデヒド脱水素酵素の酵素活性の利用が検討されている。例えば、生体試料中のホルムアルデヒドの定量等のホルムアルデヒド測定技術や、ホルムアルデヒド脱水素酵素を固定化した空気浄化フィルター等のホルムアルデヒドの除去技術等、特に環境技術の分野における応用が期待されている。
【０００３】
例えば、ホルムアルデヒドをはじめとするアルデヒド化合物やアルコール化合物を簡易に検出測定できるバイオセンサー用酵素としての利用が報告されている（例えば、特許文献１を参照）。詳細には、気相中や液相中のアルデヒド化合物及びアルコール化合物を簡易に検出測定できる酵素固定化バイオセンサーが開示されており、これは、過酸化水素電極の表面にアルコール酸化酵素が固定化されると共に最表面に高分子被覆が配設され、過酸化水素の酸化電流値、またはその変化よりアルデヒド化合物もしくはアルコール化合物の存在を検出するものである。
【０００４】
また、近年、クリーンエネルギー技術として、アルコールなどのバイオマスを燃料とした酵素燃料電池が考案されており、酸化還元酵素が電池の構成部材として利用されている。一例として、メタノールを燃料とした酵素燃料電池の場合、触媒としてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ホルムアルデヒドに作用してギ酸に酸化するホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してCO2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼとを用いることにより構成することができる。これにより、メタノールはCO2まで分解され、メタノール１分子につき３段階の酸化反応により合計６電子が生成されることとなる。
【０００５】
そして、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、細菌、酵母から哺乳類に至るまで広く存在していることが知られており、多様な生物由来のホルムアルデヒド脱水素酵素が報告されている。例えば、パン酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae)由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献１を参照。）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献２を参照）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素（例えば、非特許文献３を参照）等が挙げられる。そのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列が報告されており、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のホルムアルデヒド脱水素酵素の配列情報がGenBank Accesslon number：L36327として開示されている（例えば、非特許文献４を参照）。
【０００６】
ホルムアルデヒド脱水素酵素には、反応にグルタチオンを要求するグルタチオン依存性、及びグルタチオンを要求しない非依存性の２つの型がある。一般に広く存在するホルムアルデヒド脱水素酵素はグルタチオン依存性であるのに対して、シュードモナス・プチダ由来のホルムアルデヒド脱水素酵素は、グルタチオン非依存的にホルムアルデヒドの酸化還元反応を触媒する特徴的な酵素であることが知られている。そして、このホルムアルデヒド脱水素酵素は、各サブユニットが376アミノ酸残基からなるホモ4量体酵素であることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）と共に、Ｘ線結晶構造解析の結果をもが報告され活性中心をはじめとした高次構造が明らかとなっている（例えば、非特許文献５を参照）。
【０００７】
ところが、ホルムアルデヒド脱水素酵素に限らず酵素は、触媒作用を選択する性質が非常に強いことが知られている。例えば、酵素は、生体が生存可能な緩和な条件下で最も酵素活性を発揮し、生体内で代謝される機構を有するものであることから、酵素を構成するタンパク質構造に変化を与えるような因子の存在により酵素の活性は影響を受ける。つまり、酵素活性は、温度等の物理的条件、及びpH、塩濃度等の化学的条件の影響を受けることが知られており、これらに対する安定性が低いため用途が限定されるという問題点があった。そして、従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。
【０００８】
しかしながら、バイオセンサーや燃料電池への適用に際しては、多様な環境において安定して活性を保持できる酵素が不可欠であり、特に、酵素寿命に対して相関があるといわれる熱安定性の向上が要求される。従来公知のホルムアルデヒド脱水素酵素は、何れも天然に存在する野生型の酵素であることから、熱に対する安定性が低かった。そのため、バイオセンサーや燃料電池への適用した場合に、酵素の保存安定性が低く、酵素の熱失活により酵素の使用量の増大及び精度の低下が生じることから、市場の要望に十分に対応できるものではなかった。したがって、高温条件下でも安定的に作用できるホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】特開2007-139729号公報
【非特許文献１】Steinman CR. Jakoby WB.著、“Yeast aldehyde dehydrogenase. II. Properties of the homogeneous enzyme preparations.(酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼII )” J Biol Chem.、1968年、第243巻、第730〜734頁
【非特許文献２】Ras J. Van Ophem PW. Reijnders WN. Van Spanning RJ. Duine JA. Stouthamer AH. Harms N.著、“Isolation, sequencing, and mutagenesis of the gene encoding NAD- and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GD-FALDH) from Paracoccus denitrificans, in which GD-FALDH is essential for methylotrophic growth.” J Bacteriol.、1995年、第177巻、第247〜251頁
【非特許文献３】Ito K. Takahashi M. Yoshimoto T. Tsuru D.著、“Cloning and high-level expression of the glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase gene from Pseudomonas putida. ”J Bacteriol. 1994年、第176巻、第2483〜2491頁
【非特許文献４】NCBI、［online］、［平成20年5月31日検索］、インターネット〈URL： HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=548207" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=548207〉
【非特許文献５】Tanaka N. Kusakabe Y. Ito K. Yoshimoto T. Nakamura KT.著、“Crystal structure of formaldehyde dehydrogenase from Pseudomonas putida: the structural origin of the tightly bound cofactor in nicotinoprotein dehydrogenases.”J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、安定性に優れたホルムアルデヒド脱水素酵素の提供を目的とする。また、本発明は、当該酵素をコードする遺伝子を単離し、目的とする理化学的性質を備えた当該酵素を組換え体として取得し、遺伝子工学的手法による当該酵素の大量生産技術の提供をも目的とする。更に、本発明は、当該酵素の特性を活用したバイオセンサー及び燃料電池の提供をも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素の少なくとも１つの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することにより、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素と比較して熱安定性及び保存安定性を向上できることを見出した。更に、かかる酵素を利用することにより、従来の酵素の熱安定性に関する欠点を克服し、より実用面において有利なアルデヒド検出用バイオセンサー及び燃料電池を提供できることをも見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１５］に示す発明を提供する。
［１］ 野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［２］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第80位に対応する位置で生じている上記［１］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［３］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置におけるアミノ酸の置換である上記［１］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［４］ 前記アミノ酸置換が、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換からなる群から選択される少なくとも１つである上記［３］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［５］ 前記アミノ酸置換が、以下の（１）又は（２）から選択される上記［４］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
（１）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換
（２）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換
［６］ 前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置におけるアミノ酸の置換である上記［１］〜［５］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［７］ 前記アミノ酸置換が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換である上記［６］の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［８］ 前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する上記［１］〜［７］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
［９］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
［１０］ 上記［９］の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
［１１］ 上記［１０］の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１２］ 上記［１１］の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【００１３】
上記［１］〜［１２］の構成によれば、新規なホルムアルデヒド脱水素酵素の提供が可能となる。本発明によって提供されるホルムアルデヒド脱水素酵素は、熱安定性を示す。したがって、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野におけるホルムアルデヒドの脱水素反応を要する技術に適用できる。更に、熱安定性が向上した実用性の高い本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列、並びに塩基配列が明確になったことから、遺伝子工学的手法を利用して組換え体として当該酵素を低コストかつ工業的に大量生産することが可能となった。
【００１４】
［１３］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【００１５】
上記［１３］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物の検出方法が提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１６】
［１４］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【００１７】
上記［１４］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用したアルデヒド化合物検出用の酵素センサーが提供でき、医療、食品、環境分野等、様々な分野に利用することができる。特には、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく測定精度の向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【００１８】
［１５］ 上記［１］〜［８］のいずれかの改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【００１９】
上記［１５］の構成によれば、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒能力を利用した燃料電池が提供できる。特に、本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素は熱安定性が高いことから、酵素の触媒能力の劣化を招くことなく持続的に発電を行なうことが可能となり、燃料電池の性能向上を図れる。更には、酵素使用量をも低減できることからコスト削減効果をも奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素（以下、「PFDH」と略する）は、天然に存在する野生型PFDHのアミノ酸配列において、少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変されており、そして、野生型PFDHに比べて熱安定性が向上している。ここで、「少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入により改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対して、公知のDNA組換え技術、及び点変異導入方法等によって、欠失、置換、付加或いは挿入することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、付加或いは挿入されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。したがって、改変型PFDHは、これらの改変は１つ有するものであっても、また２つ以上が組み合わされたものであってもよい。このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。したがって、本発明における改変型PFDHには、これら双方の改変型が含まれる。
【００２２】
野生型PFDHとは、自然界より分離された PFDHのアミノ酸配列、及び該酵素をコードする核酸分子の塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２３】
ここで、「PFDH」とは、ホルムアルデヒドを基質としてギ酸を生成する脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質であり、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を要求する。反応式を以下に示す。
ホルムアルデヒド ＋ NAD+（酸化型） → ギ酸 ＋ NADH（還元型） ＋ H+
【００２４】
上記PFDHには、グルタチオン依存性、非依存性の２つの型が存在する。本発明においては何れもが対象となるが、グルタチオン非依存性が好ましい。
【００２５】
そして、改変型の基礎となる野生型PFDHは、上記の性質を有する限り何れの生物由来のものであってよい。具体的には、シュードモナス（Pseudomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）等の細菌由来、及びサッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母由来のPFDH等が例示される。更には、ウシ（Equus caballus）やラット（Rattus norvergicus）等の哺乳動物由来のPFDHをも含む。好ましくは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）由来のPFDHである。しかしながら、これらに限定するものではない。
【００２６】
「安定性が向上」とは、熱、及び保存に対する当該酵素の安定性が向上することであり、一定期間の熱処理及び保存に対して、当該酵素の触媒機能の失活や活性低下が抑制できることを意味する。具体的には、改変型PFDHが、野生型PFDHよりも、一定期間の熱処理又は保存に供した後に維持されている酵素の触媒機能の残存率が高いことを意味する。例えば、野生型PFDHの活性が維持される25℃での酵素の酵素活性値を100%として、加温処理後の活性値を酵素活性の残存率として算出する。この残存率が、野生型PFDHと比較して増大していた場合、当該酵素の熱安定性が向上したと判断できる。また、一定期間の保存に際しての残存率が、野生型PFDHと比較して増大していた場合、当該酵素の保存安定性が向上したと判断できる。一例として、50℃にて30分間の加温により60％以上、特には75％以上の残存活性を維持できる熱安定性が好ましい。また、45℃にて10時間の保存で60〜80％、30時間の保存であっても50〜60％程度の残存活性を維持できる保存安定性が好ましい。
【００２７】
本発明の改変型PFDHは、これに限定されるものではないが、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位、特には第77位〜第80位の少なくとも１つに対応する位置のアミノ酸が改変されたものが、好ましく例示される。特には、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における、第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置における改変が好ましく例示される。
【００２８】
更に、本発明の改変型PFDHとしては、野生型PFDHのアミノ酸配列において、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置における改変が好ましく示めされる。
【００２９】
野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位（第80位）に対応する位置のアミノ酸の改変、及び配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアミノ酸の改変は、これらの位置における何れかの改変を有するもの全てが本発明に含まれる。また、かかる位置における１のアミノ酸が改変したものであっても、複数の位置における複数のアミノ酸が改変したものであってもよい。したがって、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第84位（第80位）、及び第372位は離間した位置にあるが、双方の位置における改変が組み合わされたものも本発明に含まれる。
【００３０】
ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列は、シュードモナス・プチダ由来の野生型PFDHのアミノ酸配列であるが、他の生物由来の当該酵素のホモログについても同様の位置が改変されたものは本願発明の改変型PFDHに含まれる。
【００３１】
ここで、改変としては、特に好ましくは、他のアミノ酸への置換である。そして、他のアミノ酸とは、置換前のアミノ酸以外の何れもが含まれる。しかしながら、タンパク質機能改変の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と異なる性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有するが、これら以外のアミノ酸への置換はタンパク質機能へ影響を与えることが考えられる。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内の以外へのアミノ酸置換は、タンパク質の機能が改変されることが特に予想されるが、これに制限されるものではない。
【００３２】
好ましくは、野生型PFDHのアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換、及び第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換からなる群から選択される少なくとも１の置換が例示される。特に、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換されたアミノ酸配列を有するものが例示される。一例として、シュードモナス・プチダ由来のPFDHの場合を例にとって、各改変型のアミノ酸配列について配列番号４、６、及び８に示す。
【００３３】
更に、前述の改変型PFDHの性質を保持している限り、更に特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。当業者はアミノ酸配列の改変に際して本発明の改変型PFDHの酵素活性を保持する改変を容易に予測することができる、具体的には、例えばアミノ酸置換の場合には、タンパク質構造保持の観点から極性、電荷、親水性、若しくは疎水性等の点で置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。このような置換は保守的置換として当業者には周知である。具体例を挙げると、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は、タンパク質の機能が維持されるとして許容される。また、その後の精製、固相への固定化等の便宜のため、アミノ酸配列のＮ、又はＣ末端にHisタグペプチド、FLAGタグペプチド等を付加したものも好適に例示される。このようなタグペプチドの導入は常法により行なうことができる。また、本発明の酵素活性の喪失を引き起こさない範囲内で、Ｃ末端側若しくはＮ末端側のアミノ酸残基を切断した切断型でもよい。更に、グルコシル化等の化学修飾を付加してもよい。
【００３４】
本発明の改変型PFDHは公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる野生型PFDHをコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変型遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から上記活性を有するタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３５】
改変の基礎となる野生型PFDHをコードする遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。例えば、GenBank等の公知のデータベースを検索することによって取得することができる遺伝子情報を基にしてプライマーを設計し、PFDHを産生し得る生物体から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより取得することができる。また公知の遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法等の核酸合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適なPFDHの配列情報として、野生型のシュードモナス・プチダ由来のPFDHのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、当該PFDHをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３６】
野生型PFDHをコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、PCR法等を利用して変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。
【００３７】
特には、野生型PFDHをコードするDNAを鋳型として、所望の改変（欠失又は置換）を施した配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことによって取得することが、好ましく例示される。ここで、本発明の改変型PFDHの調製において、PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、野性型PFDHをコードする核酸分子と相補的な配列を含み、かつ所望の改変が生じるように設計されたものであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーの設計は、所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等を利用して設計することができる。プライマーは合成後、HPLC等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。このようなプライマーとしては、10以上、好ましくは15以上、更に好ましくは約20〜50の塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３８】
また、目的とする改変型PFDHのアミノ酸配列が定めることにより、それをコードする適当な塩基配列を決定でき、常法のホスホルアミダイト法等の核酸合成技術を利用して本発明の改変型PFDHをコードするDNAを化学的に合成することができる。
【００３９】
また、このような本発明の改変型PFDH改変体は自然又は人工の突然変異により生じた突然変異体の中から前述の理化学的性質を有するタンパク質をスクリーニングすることにより取得できる。
【００４０】
（本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子）
本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子は、前述の理化学的性質を有するすべての改変型PFDHをコードするものを包含する。例えば、配列番号４、６及び８に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする全てのポリヌクレオチドであり、一具体例としては、配列番号３、５、及び７に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定するものではない。ここで、本発明におけるポリヌクレオチドにはDNA及びRNAの双方が含まれ、DNAである場合には、１本鎖であると、二本鎖であるとは問わない。
【００４１】
本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子は、本明細書においてその塩基配列が明確になったことから、かかる配列情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して化学的に合成することができる。また、改変の基礎となる野生型PFDHをコードするDNAに対して改変を施すことによっても製造することができる。なお、詳細については前述した。
【００４２】
（本発明の組換えベクター）
そして、本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を組み込ことによって構築することができる。利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。したがって、ベクターは、本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素部位の配列を含むものである。例えば、プラスミドベクター（pEX系、pUC系、及びpBR系等）、ファージベクター（λgt10、λgt11、及びλZAP等）、コスミドベクター、ウイルスベクター（ワクシニアウイルス、及びバキュロウイルス等）等が包含される。
【００４３】
そして、本発明の組換えベクターは、本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子がその機能を発現できるように組み込まれている。したがって、核酸分子の機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。プロモータ配列としては、例えば、宿主が大腸菌の場合にはlacプロモータ、trpプロモータ等が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではなく既知のプロモータ配列を利用できる。更に、本発明の組換えベクターには、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。このようなマーキング配列としては、薬剤耐性、栄養要求性などの遺伝子をコードする配列等が例示される。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が例示される。
【００４４】
ベクターへの本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子等の挿入は、例えば、適当な制限酵素で本発明の遺伝子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。連結に際しては、DNAリガーゼを用いる方法等、既知の方法を利用できる。また、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社）等の市販のライゲーションキットを利用することもできる。
【００４５】
（本発明の形質転換体）
本発明の形質転換体は、適当な細胞を本発明の改変型PFDHをコードする核酸分子を含む組換えベクターで形質転換することによって構築することができる。ここで、宿主となる細胞としては、本発明の改変型PFDHを効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。大腸菌としては、例えば、E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli JM109等を利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母、Sf９細胞等の昆虫細胞、CHO細胞、COS-7細胞等の動物細胞等を利用することも可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００４６】
（本発明の改変型PFDHの製造方法）
本発明の改変型PFDHの製造方法は、前述の本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する活性を有するタンパク質を採取することにより行なう。即ち、前述の本発明の形質転換体を培養する培養工程と、前記培養工程で発現した前記タンパク質を回収する回収工程とを備える。このように、適当な宿主で発現させることによって、低コストで本発明の改変型PFDHの大量生産が可能となる。
【００４７】
培養工程は、本発明の形質転換体を適当な培地に接種し、常法に準じて培養することにより行なわれる。本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。したがって、宿主細胞の生育に必要な炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地であることが好ましく、天然培地、合成培地の別を問わない。
【００４８】
例えば、炭素源として、ホルムアルデヒド、デキストラン、デンプン等が、また、窒素源としては、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、ペプトン、カゼイン等が挙げられる。他の栄養素としては、所望により、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等とを含ませることができる。宿主細胞が大腸菌の場合には、LB培地、M9培地等が好適利用できる。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００４９】
本発明の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００５０】
精製工程は、前述の培養工程において得られた形質転換体の培養物からの本発明の改変型PFDHを回収、即ち、単離精製することによって行えばよい。本発明の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、本発明のPFDHが宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、既知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、本発明の酵素を単離精製することができる。
【００５１】
例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、SDS-PAGE電気泳動、ゲル濾過、疎水、陰イオン、陽イオン、アフィニティークロマトグラフィ等の各種クロマトグラフィ等の既知の単離精製技術を単独、又は適宜組み合わせて適用することができる。特にアフィニティークロマトグラフィを利用する場合、本発明の酵素をHis Tag等のタグペプチドとの融合タンパク質として発現させて、かかるタグペプチドに対する親和性を利用することが好ましい。また、本発明の改変型PFDHが宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。
【００５２】
続いて、リゾチーム処理などの酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。ここで、本発明で得られる改変型PFDHは、熱安定性が高いことから、前述の単離、精製工程において熱処理を併用することが有用かつ便利である。培養物から得られた宿主細胞及び培養上清には、当該宿主細胞由来の様々なタンパク質を含有する。しかし、熱処理を行なうことにより、宿主細胞由来の夾雑タンパク質は変性し凝縮沈殿する。これに対して、本発明の酵素は、改変型を有するため変性を生じないことから、遠心分離等により宿主由来の夾雑タンパク質と容易に分離できる。また、培養液をそのまま、若しくは粗抽出液を使用する場合においても、熱処理を行なうことにより、他のタンパク質が失活することから、実質的に本発明の改変型PFDHのみの酵素液として使用することができる。したがって、本発明の改変型PFDHを遺伝子工学的手法により製造する場合においても、宿主由来のその他のタンパク質を容易に除去することができる。したがって、精製度を向上させることができ、信頼性の高い酵素を製造できるという利点がある。
【００５３】
そして、精製されたPFDHが所望の改変が生じている改変部位を有する本発明の改変型PFDHであるか否かの確認は、その理化学的性質や配列の分析によって行うことができる。理化学的性質の分析による場合、一定期間、熱処理に付した後、酵素の酵素活性を公知方法により測定し改変部位を有しない野生型PFDHと比較して、活性の残存率が高いか否かを確認することによって行うことができる。したがって、基質であるアルデヒド化合物に対してNAD+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。
【００５４】
酵素の活性は、NAD+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、NAD+の存在下で、本発明の酵素をアルデヒド化合物と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するNADH量の変化を340 nmの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができる。したがって、PFDH活性は、ホルムアルデヒド及びNAD+から、ギ酸及びNADHを生成する触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定できる。つまり、酵素反応によりホルムアルデヒドが酸化されギ酸となり、このときNADが還元されNADHが生成する（反応式：HCHO ＋ NAD+ ＋ H2O → HCOOH ＋ NADH ＋ H+）。このNADからNADHの生成を340nmの吸光度変化を測定して酵素活性とした。この配列分析による場合には、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。
【００５５】
（アルデヒド化合物の検出方法）
本発明の改変型PFDHは、試料中のアルデヒド化合物の検出のために利用することができる。アルデヒド化合物の検出は、例えば、基質であるアルデヒド化合物に対してNAD+依存的に脱水素反応をする酵素活性を測定することにより行うことができる。酵素の活性は、NAD+依存的にアルデヒド化合物の脱水素反応を触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、NAD+の存在下で、本発明の酵素を測定対象となる試料と反応させ、当該酵素の触媒反応で生成するNADH量の変化を340 nmの吸光度変化もって検出する。かかる吸光度変化をもって当該酵素の活性とすることができ、ひいてはNADH量の変化によりアルデヒド化合物の存在を検出することができる。したがって、PFDH活性は、その触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定できる。反応液としては、例えば、ホルムアルデヒド等のアルデヒド基質、2 mM のNAD+、25 mM のMgCl2、１MのNaCl及び本発明の酵素溶液を、50 mMリン酸緩衝液（pH 8.8）中にて混合して200μlとすることにより調製することができる。しかしながら、これは標準条件であり、適宜変更することができる。この反応液を、37 ℃で波長340 nmにおける吸光度を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行うことができ、吸光度の測定は、既知のマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いることができる。そして、適当な試験条件が選択されていれば、この変化は、測定しようとする酵素活性に直線的に比例する。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた吸光度変化値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００５６】
ここで、試料としては、アルデヒド化合物等、PFDHの基質となり得る化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。例えば、血液、尿、唾液等の生物体由来の生物試料、食品試料、環境試料等が例示されるがこれに限定されるものではない。また、必要に応じて、これらの試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。特に、本発明の改変型PFDHは、優れた熱安定性を示すことから、温度が高い試料の分析に際して好適に利用できる。そして、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００５７】
（アルデヒド化合物検出用のバイオセンサー）
本発明は、本発明の改変型PFDHを利用するアルデヒド化合物検出用のバイオセンサーを提供する。当該検出センサーは、電極材上に本発明の改変型PFDHが固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は、既知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。そして、本発明のPFDHの酵素活性に際して要求される補酵素NAD+、NAD+の還元体であるNADHを酸化する能力を有する酸化酵素（ジアホラーゼ等）、電子メディエーター（フェロセン、ジクロロインドフェノール等）も、必要に応じて電極材上に固定化して構成される。
【００５８】
アルデヒド化合物の測定は、例えば、測定対象となる試料を接触させると試料中のアルデヒド化合物が作用極上に固定された本発明の改変型PFDHと反応し、続いて電子メディエーターが還元される。そして、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸化し、得られる酸化電流値の変化により試料中のアルデヒド化合物を検出することができる。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルデヒド化合物溶液により標準曲線を作成することにより、得られた酸化電流値に基づいてアルデヒド化合物濃度を求めることができる。
【００５９】
ここで、試料としては、本発明の改変型PFDHの基質となり得るアルデヒド化合物の存在が予想されるすべての試料を対象とすることができる。詳細については前述した。特には、前述の通り、本発明の改変型PFDHは、熱安定性が高いことからバイオセンサー製作時における劣化をも防止することができ、また、保存性も高いことから酵素の酵素活性の劣化を招くことなく、測定精度の向上を図れ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【００６０】
（本発明の燃料電池）
本発明は、本発明の改変型PFDHを利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアソードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。そして、アノード電極側では、本発明の改変型PFDHがアルデヒド化合物を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。アノード極側には本発明の改変型PFDHが供給され、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。このとき、改変型PFDHは、好ましくはNADと共に固定化されることが好ましく、特にはNADと結合したホロ酵素の形態で固定化されることが好ましい。また、アポ酵素の形態で固定化し、NADを適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素を必要に応じて供給してよい。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合，共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸，カラギーナン等の多アルデヒド化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
【００６１】
以上のように構成することにより、燃料であるアルデヒド化合物を酸化する際に生じた電子がアノード極に電子を受け渡す。そして、アノード極に渡された電子は、外部回路を経てカソード極に到達することで電流が発生する。燃料となるアルデヒド化合物としては、本発明の改変型PFDHの基質となり得るアルデヒド化合物であれば制限はない。
【００６２】
また、メタノールを燃料とした酵素燃料電池においても本発明の改変型PFDHを利用できる。その場合には、触媒として、本発明の改変型PFDHに加え、必要に応じてメタノールに作用してホルムアルデヒドに酸化するアルコールデヒドロゲナーゼと、ギ酸に作用してCO2に酸化する蟻酸デヒドロゲナーゼを併用することにより構成することができる。
【００６３】
本発明の燃料電池は、熱安定性が高い本発明の改変型PFDHの触媒能力を利用することから、持続的に発電を行なうでき、高性能の燃料電池として構築することができる。また、本発明の改変型PFDHは、熱安定性が高いことから燃料電池製作時における劣化をも防止することができ、ひいては、酵素使用量を軽減できることからコスト削減効果をも奏することができる。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）本発明の改変型PFDH遺伝子のクローニング
分子進化工学的手法と称される酵素改変手法を利用して、本発明の改変型PFDH遺伝子のクローニングを行った。
【００６５】
かかる分子進化工学的手法とは、生物進化の原理をタンパク質に応用する技術である。そのステップとしては、まずランダムに改変の基礎となる遺伝子に変異を導入し、可能な限り多様な改変型遺伝子を作り出す。そして、改変型遺伝子から改変型タンパク質を作製して、その中から所望の性質を保持するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。このようにして、設計原理が未知であっても所望の機能や性質を保持する高分子を取得することができ、取得した遺伝子の変異箇所及び変異様式を調べることによって、高分子設計原理の研究においても威力を発揮することができる。
【００６６】
（方法）
分子進化工学的手法による酵素改変工程は、以下の５工程から構成される。以下に、その詳細について説明する。
工程１：野生型PFDH遺伝子の取得
工程２：野生型PFDH遺伝子を保持する発現ベクターの構築
工程３：改変型PFDH遺伝子ライブラリーの作製
工程４：改変型PFDHの無細胞タンパク質合成
工程５：改変型PFDHの活性測定
【００６７】
工程１：野生型PFDH遺伝子の取得
野生型PFDH遺伝子のクローニングは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）株のゲノムDNAを鋳型とし、PCRによりPFDH遺伝子を増幅することにより行った。ゲノムDNAは、シュードモナス・プチダ株の菌体から、ゲノムDNA抽出キット（プロメガ社製）を使って抽出及び精製を行うことにより調製した。なお、シュードモナス・プチダ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（国内の微生物・遺伝子バンク：NITE）から分譲を受け、分譲業者の指示に従って菌体培養を行った。
【００６８】
PCR反応は、PCRキット、PrimeStar（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM、上記で調製した鋳型DNAを50 ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、98℃にて10秒間の熱変性、55℃にて５秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、30サイクルの増幅反応を行った。
【００６９】
ここで使用したプライマーの配列情報を示す。
シュードモナス・プチダ用プライマー
5'- GAGCA TATGT CTGGT AATCG TGGTG T - 3'(配列番号９)
5'- CTAAA GCTTA GGCCG CGCTG AGGTC T - 3'（配列番号10）
下線はクローニング用の制限酵素認識部位を示す。
【００７０】
PCR増幅反応後の反応液を、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）により精製し、PCR増幅産物を確認した。その結果、予想される増幅産物（約1.2 kbp）の取得が確認できた。
【００７１】
工程２：野生型PFDH遺伝子を保持する発現ベクターの構築
PCR増幅で得られたDNA断片（約1.2 kbp）を、制限酵素Nde-IとHind-IIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後の各DNA断片を、タンパク質発現用プラスミドのpET22bベクターとpET23bベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位（Nde-I及びHind-III）にライゲーション反応より組み込み、PFDH遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。当該発現ベクターは、T7プロモーター、リポソーム結合部位の下流、T７ターミネーターの上流にPFDH遺伝子を組み込むように構築した。
【００７２】
また、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成の際の鋳型とする直鎖状DNAを調製するため、上記で得られたPFDH遺伝子を組み込んだ発現ベクター鋳型にして、T7プロモーターとターミネーター配列との間の領域をPCRにて増幅した。PCR反応は、PCRキット、PrimeStar（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM 、鋳型DNAを10ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、98℃にて10秒間の熱変性、55℃にて５秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、3０サイクルの増幅反応を行った。PCR産物の精製には、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）を用いた。
【００７３】
ここで使用したプライマーの配列情報を示す。
5'- TAATA CGACT CACTA TAGGG - 3'（配列番号11）
5'- TAGTT ATTGC TCAGC GGTGG - 3'（配列番号12）。
【００７４】
PCR増幅反応後の反応液から、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）によりPCR増幅産物を精製した。
【００７５】
工程３：改変型PFDH遺伝子ライブラリーの作製
野生型PFDH遺伝子にランダム変異を導入した変異遺伝子ライブラリーを調製した。ここでは、変異導入のための手法として、エラープローンPCR法を用いた。
【００７６】
まず、エラープローンPCR法の条件検討を行った。ここでは、変異導入の基礎としたPFDH分子内に1〜2箇所の変異導入が得られる条件、つまり、エラー率が0.5％前後となる条件、の設定のための検討を行った。具体的には、マグネシウム濃度、マンガン濃度を変化させ、所望のDNAポリメラーゼのヌクレオチドの取り込み間違い頻度を算出することによりエラー率を確認した。マグネシウム濃度とマンガン濃度を、夫々、[Mg, Mn]=[3.0, 0.3] mM、[Mg, Mn]=[5.0, 0.5] mM、[Mg, Mn]=[6.0, 0.6] mMの3種類を組み合わせて行った。PCR後に、得られた増幅産物の塩基配列を確認することによりエラー率を算出したところ、夫々、0%, 0.2%, 0.5%であった。かかる結果に基づき、[Mg, Mn]=[6.0, 0.6] mMにてエラープローンRCRを行うことにより、改変型PFDH遺伝子ライブラリーを作製した。
【００７７】
PCR反応液は、50 μlの反応系中に、2.5 unitのTaq DNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、各0.5 μMのプライマー、10 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl、3.0〜6.0 mM MgCl2、0.3〜0.6 mM MnCl2を含んで調製した。プライマーとしては、pET22bベクターのマルチクローニングサイトの両端にあるT7プロモーター配列、及びT7ターミネーター配列を使用した。
【００７８】
以下に、具体的な配列情報を示す。
T7プロモータープライマー：5'-TAATA CGACT CACTA TAGGG-3'（配列番号13）
T7ターミネータープライマー：5'-GCTAG TTATT GCTCA GCGG-3'（配列番号14）
【００７９】
そして、PCR温度プログラムは、94℃にて30秒間の熱変性、55℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、30サイクルの増幅反応を行った。
【００８０】
上記エラープローンPCRにて得られた増幅断片に、１分子PCR用プライマー配列（Homo primer）を付加するために、Homo-tail プライマーを用いたPCR増幅を行った。上記で得られた変異導入DNA断片を鋳型とし、PCRキット、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ社製）にて製造業者の指示に従って実行した。PCR反応液は、プライマーを各0.3μM 、鋳型DNAを10 ng含んで調製した。そして、PCR温度プログラムは、94℃にて30秒間の熱変性、55℃にて30秒間のアニーリング、72℃にて60秒間の伸長反応を１サイクルとした、20サイクルの増幅反応を行った。
【００８１】
ここで、使用したプライマーの配列情報を示す。
5'- GGA GCT AGG GTT TAC GAG TGG AAT GAT CTC GAT CCC GCG AAATTA ATA C -3'
（配列番号15）
5'- GGA GCT AGG GTT TAC GAG TGG AAT GTC CGG ATA TAG TTC CTCCTT TCA G -3'
（配列番号16）
【００８２】
PCR増幅反応後の反応液から、DNA精製キット（GEヘルスケア社製）によりPCR増幅産物を精製した。
【００８３】
工程４：改変型PFDHの無細胞タンパク質合成
上記工程３で得られた改変型PFDH遺伝子から、無細胞タンパク質合成システムを利用してタンパク質を合成した。無細胞タンパク質合成システムとして、市販の無細胞タンパク質合成系（ラピッドトランスレーションシステム：RTSシステム：ロシュ社製）を用い、製造業者のプロトコールに従い、反応時間4時間、反応温度30℃を基本条件としてタンパク質を合成した。
【００８４】
なお、合成に先立って、合成反応を最適化するために、分子シャペロンであるGroE（ロッシュ社製）とDnaK（ロッシュ社製）の添加による効果を検討した。ここで、上記工程２で得られた発現ベクター 1μgを鋳型として、GroE、DnaK、GroE及びDnaKを添加した場合、また何れの分子シャペロンをも添加しない場合について、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質を試験管内で合成した。
【００８５】
結果を図１に示す。
レーン１は、何れの分子シャペロンも添加しない場合、レーン２は、GroEを添加した場合、レーン３は、DnaKを添加した場合、レーン４は、GroEとDnaKを両方添加した場合の結果を示す。
【００８６】
図１より、DnaKでは合成阻害が生じたが、GroEでは合成量が増加することが確認された。以上の結果より、GroEを添加して合成を行うことが好ましいことが導かれ、本実施例の無細胞タンパク質合成系でのタンパク質合成の際には、分子シャペロンGroEを添加して合成を行った。
【００８７】
工程５：改変型PFDHの活性測定
工程４にて得られた改変型PFDHの酵素活性を測定した。酵素活性は、PFDHの触媒反応で生成するNADHを波長340 nmの吸光度を測定することに定量し、これを指標として、ホルムアルデヒド分解活性を求めることにより測定した。つまり、PFDHの酵素活性は、ホルムアルデヒド及びNAD+から、ギ酸及びNADHを生成する触媒反応において、生成したNADHを直接定量することによって測定した。
【００８８】
詳細には、適量の酵素溶液を、1 mM ホルムアルデヒド、1 mM NAD+、0.01% BSAを含む50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）中で混合することにより調製した。続いて、この反応液中のNAD+からNADH変化に伴う340 nmの吸光度変化を測定し、吸光度の増加を求めることにより活性評価試験を行った。吸光度は、UV-240分光光度計又はプレートリーダにより測定した。なお、UV-240分光光度計での測定に際しては、80 μlの反応液に、2.0μlの合成反応終了液（酵素溶液）を添加して、NADH量の変化に伴う340 nmの吸光度変化を測定した。プレートリーダでの測定に際しては、200μlの反応液に、10μlの合成反応終了液（酵素溶液）を添加して、同じく340 nmの吸光度変化を測定することにより行った。
【００８９】
そして、酵素溶液を50℃にて20分間の熱処理に供し、熱処理後の残存活性が野生型PFDHより向上した酵素活性を発現するクローンを選択した。これにより、熱処理後にも高い残存活性を有するPFDHを発現する多数のクローンを得た。
【００９０】
（実施例２）改変型PFDH遺伝子配列の解析
実施例１で得られた改変型を有するクローンについて遺伝子配列を解析した。
【００９１】
実施例１で得られた改変型を有するクローンのうち３つのクローンについて、その塩基配列を解析した。その塩基配列について、配列表に、配列番号３、５、及び７として、また、推定アミノ酸配列を配列番号４、６及び８に表す。
【００９２】
これら３つのクローンは、公知のシュードモナス・プチダのPFDHのアミノ酸配列（配列番号２）において、NAD結合ドメイン上の第372位のアスパラギン酸がバリン（D372V）に置換されたクローン（以下、「PFDH/D372V」と称する：配列番号４）、基質結合ドメイン上の第79位のアルギニンがセリン（R79S）に、第84位のロイシンがメチオニン（L84M）に置換されたクローン（以下「PFDH/R79S/L84M」と称する：配列番号６）、基質結合ドメイン上の第77位のリシンがメチオニン（K77M）に置換されているクローン（以下、「PFDH/K77M」と称する：配列番号８）であることが判明した。なお、本明細書においては、アミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けした。
【００９３】
（実施例３）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析
本発明の改変型PFDHの高次構造を、Ｘ線結晶構造解析に基づいて解析した。
【００９４】
野生型PFDHのアミノ酸構造解析について記載された文献（Tanaka N.他著、J. Mol. Biol.、2002年、第324巻、第519〜533頁（上述）、Tanaka N.他著、“Crystal structure of glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase.”Chem Biol Interact.、2003年、第143〜144巻、第211〜218頁）により、３つのクローンの変異位置について解析した。その結果、PFDH/D372Vのアミノ酸変異部位であるD372Vは、補酵素（NAD）結合ドメイン内に存在することが導かれた。一方、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77Mの各アミノ酸変異部位であるK77M、R79S、L84Mについては、すべて基質（ホルムアルデヒド）結合ドメイン内に存在することが導かれた。
【００９５】
さらに、詳細に上述のPFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の報告を検討した。その結果、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77Mの各アミノ酸変異部位のうち、K77M、R79S、L84Mは、PFDHの４量体構造を構成する各サブユニットの界面付近に位置するループ構造領域（K77〜D80）近辺に存在していることが判明した。ここで、一例として、アミノ酸残基K77についての解析結果を図２（Ａ）に示す。
【００９６】
図２（Ａ）より、４量体酵素のサブユニットの界面付近に位置するループ構造領域は、高次構造におけるサブユニット間相互作に影響を及ぼし、タンパク質の熱安定性を支配していることが示唆された。
【００９７】
また、PFDH/D372Vの高次構造解析結果を図２（Ｂ）に示す。
【００９８】
図２（Ｂ）より、アミノ酸変異部位（D372V）については、酵素表面に近いヘリックス構造領域内に存在していることが判明した。これにより、かかる酵素表面に近いヘリックス構造領域が、当該酵素の立体構造の安定化を支配している可能性が示唆された。
【００９９】
（実施例４）改変型PFDH大腸菌細胞内での組換え発現、及び精製
実施例２で確認された所望の改変を有する本発明の改変型PFDHを大腸菌細胞内で組換え生産させた。
【０１００】
まず、実施例１で取得され、実施例２で確認された所望の改変型PFDHをコードする遺伝子を、大腸菌用の発現ベクターであるpET22b DNA（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイトにＣ末端Hisタグ融合タンパク質として発現するように挿入した。得られたプラスミドにより、大腸菌BL21(DE3)株（ノバジェン社製）の形質転換を行った。大腸菌の培養は、アンピシリン(50 mg/l)を含むLuria-Bertani（LB）培地中にて37℃で行った。なお、形質転換は、Sambrook 及び Russell著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法に従って行なった。続いて、得られた形質転換体を、アンピシリン（50 mg/l）を含むLB培地中で、培養液の吸光度がOD600=0.6になるまで培養した。そして、組換えタンパク質の合成誘導のため終濃度0.5 mM のイソプロピル−β−D-チオガラクトピラノシド（isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside：IPTG）を添加して更に4時間培養した。
【０１０１】
培養液1 mlを遠心分離して回収した菌体を、200μlの可溶化液中に懸濁した。続いて、超音波破砕処理（30-s pulses; maximum power; high intensity; 0.5-s repeating duty cycle）により菌体を破砕した後、菌体破砕液を15,000×g で10分間遠心して上清を得た。この上清を3分間95℃で熱処理した後、12.5％アクリルアミドゲル（アトー社製）電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（以下、「CBB」と略する）染色（和光純薬社製）によりタンパク質を可視化することにより、組換えタンパク質の発現を確認した。
【０１０２】
また、このときコントロールとして、野生型PFDHについても同様に処理を行い、タンパク質の発現を確認した。
【０１０３】
結果を図３（Ａ）に示す。
レーン１は分子量マーカー、レーン２はPFDH/K77M、レーン３はPFDH/R79S/L84M、レーン４は野生型PFDH（コントロール）、レーン５はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１０４】
図３（Ａ）より、いずれも47kDaの位置にタンパク質のバンドを確認することができた。
【０１０５】
また、上記で発現させたタンパク質はHisタグ融合タンパク質であり、これをアフィニティークロマトグラフィーにより分離、及び精製した。具体的には、遠心分離により回収した菌体を、リン酸緩衝液 (20mM リン酸緩衝液、0.5M NaCl pH 7.4)に懸濁した。続いて、菌体を超音波破砕処理（超音波処理30秒、氷冷 30秒を10セット)し、以下の精製工程を示す手順でタンパク質の精製を行った。精製後のタンパク質を、アクリルアミドゲル電気泳動に供し、CCB染色によりタンパク質を可視化した。
【０１０６】
アフィニティークロマトグラフィーによる精製の詳細は以下の通りである。
１．クロマトグラフィー担体（Ni Sepharose：GE Healthcare社製）を25mlの純水で洗浄
２．クロマトグラフィー担体を2.5ml の0.1M NiSO4 で洗浄
３．クロマトグラフィー担体を25mlの純水で洗浄
４．50mlの10mMイミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液でクロマトグラフィー担体を平衡化
５．サンプルの添加
６．50mlの10mMイミダゾールを含む20mMリン酸緩衝液でクロマトグラフィー担体を洗浄
７．30mlの20mM リン酸緩衝液、0.5M NaCl（pH 7.4）に100〜500mMのイミダゾールを添加した溶出バッファーで、タンパク質を溶出
８．脱塩クロマトグラフィー担体で脱塩
【０１０７】
また、このときコントロールとして、野生型PFDH遺伝子についても同様に処理を行い、タンパク質の精製を確認した。
【０１０８】
結果を図３（Ｂ）に示す。
レーン１は分子量マーカー、レーン２はPFDH/K77M、レーン３はPFDH/R79S/L84M、レーン４は野生型PFDH（コントロール）、レーン５はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１０９】
図３（Ｂ）より、いずれも47kDaの位置にタンパク質のシングルバンドを確認することができ、良好な精製結果を得ることができた。
【０１１０】
（実施例５）HisタグペプチドのPFDH活性への影響確認
実施例４にて発現させたタンパク質のＣ末端側に融合しているHisタグペプチドのPFDH活性への影響を検討した。
【０１１１】
実施例４にて発現させたタンパク質は、Ｃ末端側にHisタグペプチド（酵素-Lys-Leu-Ala-Ala-Ala-Leu-Glu-(His)6）が融合している。かかるHisタグペプチドの当該酵素活性への影響を検討した。Hisタグペプチドが融合、又は融合していない野生型PFDH発現用pET23bベクターを鋳型にして、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質を試験管内で合成した。タンパク質合成後、酵素活性を実施例１の記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡し、当該吸光度の増加を比較した。
【０１１２】
結果を図４に示す。
図４は、Hisタグペプチドが融合したPFDH、及びHisタグペプチドが融合していないPFDHの酵素活性を比較した結果を示す。
【０１１３】
図４より、Hisタグペプチドの有無によって酵素活性に差は無いことが理解される。したがって、本明細書において対象としているPFDHについては、その酵素活性はHisタグペプチドの付加によっては影響を受けないことが確認された。
【０１１４】
（実施例６）改変型PFDHの無細胞タンパク質合成系による合成及び活性確認
上記実施例１で取得され、実施例２で確認された所望の改変型PFDHをコードする遺伝子のDNA断片を、制限酵素Nde-IとHind-IIIで切断し、アガロースゲル電気流動で分離後、ゲルから抽出及び精製を行った。制限酵素処理後の各DNA断片を、タンパク質発現用プラスミドのpET23bベクター（ノバジェン社製）の制限酵素部位（Nde-I及びHind-III）にライゲーション反応より組み込み、PFDH遺伝子を保持する発現ベクターを構築した。このようにして得られた改変型PFDH発現用pET23bベクターを鋳型に用いて、無細胞タンパク質合成系（RTSシステム：ロシュ社製）を用いて、製造業者の指示に従って合成を行った。続いて、FluoroTect（登録商標） GreenLys in vitro Translation Labeling System（プロメガ社製）を用いて、製造業者の指示に従って蛍光標識して酵素合成の成否を確認した。そして、電気泳動により合成物の確認を行うと共に、酵素活性を実施例１の工程４に記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡した。
【０１１５】
また、このとき比較例として、野生型PFDH発現用pET23bベクターについても同様に処理を行い、酵素合成及び酵素活性を比較した。
【０１１６】
結果を図５（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
図５（Ａ）は、４種類の改変型PFDH及び比較例としての野生型PFDHの合成について電気泳動により確認した結果を示し、レーン１はPFDH/K77M、レーン２はPFDH/R79S/L84M、レーン３は野生型PFDH（比較例）、レーン４はPFDH/D372Vの結果を示す。
図５（Ｂ）は、合成した４種類の改変型PFDH及び比較例としての野生型PFDHの酵素活性の経時変化を示す。
【０１１７】
また、改変型PFDHのうち、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77M、PFDH/D372V、及び野生型PFDHの酵素カイネティクスを表１にまとめる。
【０１１８】
酵素活性は、分子活性を、Uotila L.他著、“Formaldehyde dehydrogenase”、Methods Enzymol.、1981年、第77巻、第:314-20頁を参照にして算出することにより求めた。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
図５（Ａ）〜（Ｂ）、及び、表１の結果より、無細胞タンパク質合成系でも、活性を維持する改変型PFDHを合成することが可能であることが確認された。しかしながら、酵素量を揃えることができないため、活性度合いを比較することはできかったが、Km値及びKcat値に大きな差は認められなかった。
【０１２１】
（実施例７）改変型PFDHの熱安定性の確認
改変型PFDHについて、熱処理後の残存活性を検討することにより熱安定性をを確認した。
【０１２２】
実施例４で精製した100ngの４種類の改変型PFDH（PFDH/D372V、PFDH/R79S/L84M、PFDH/K77M）をリン酸緩衝液（20mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH 7.4)中で、様々な温度条件（25、45、50、55、60℃）下で20分間熱処理し、氷中に30分間置いた後の残存活性を確認した。酵素活性は、酵素活性を実施例１の工程４に記載の方法でNADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡した。その吸光度の増加速度を酵素の反応速度とした。そして、25℃での処理における活性を100として、その他の温度における保温後の残存活性を相対活性として算出した。
【０１２３】
比較例として、野生型PFDHについても同様に処理を行い、酵素活性を求めた。
【０１２４】
結果を図６（Ａ）〜（Ｄ）、及び、図７に示す。
図６（Ａ）は野生型PFDH（比較例）、図６（Ｂ）はPFDH/D372V、図６（Ｃ）はPFDH/R79S/L84M、図６（Ｄ）はPFDH/K77Mの結果を示す。
図７は、今回検討した４種類の改変型PFDH、及び野生型PFDH（比較例）について、50℃での熱処理での残存活性を比較した結果を示す。最も残存活性の高かったPFDH/D372Vの残存活性を100%として、他の改変型及び野生型PFDHの残存活性を相対活性として算出した。
【０１２５】
図６（Ａ）〜（Ｄ）、及び、図７より、野生型PFDHでは、50℃熱処理での残存活性がほぼ０％であるのに対し、PFDH/D372Vは残存活性が約80％、PFDH/R79S/L84Mは残存活性が約60％、PFDH/K77Mは残存活性が約75％を示した。改変型PFDHは、熱安定性が野生型PFDHに比べて格段に向上していることが確認された。
【０１２６】
（実施例８）改変型PFDHの耐久性確認
改変型PFDHについて、45℃での保存安定性を検討することにより耐久性を確認した。
【０１２７】
実施例４で精製した４種類の改変型PFDHのうち、実施例８にて最も熱安定性が高いことが確認されたPFDH/D372Vについて45℃での保存安定性を検討した。PFDH/D372Vをリン酸緩衝液（20mM リン酸ナトリウム緩衝液、0.5M NaCl、pH 7.4)中で、45℃にて、０、10、30、及び50時間保温した。続いて、氷中に30分間置いた後の残存活性を確認した。酵素活性は、実施例１の工程４に記載の方法により、NADHの340nmの吸光度変化を分光光度計により追跡し、その吸光度の増加速度を酵素の反応速度とした。そして、各酵素につき、保存前（０時間）における活性を100として、保存後の残存活性を相対活性として算出した。
【０１２８】
比較例として、野生型PFDHについても同様に処理を行い、残存活性を求めた。
【０１２９】
結果を図８（Ａ）〜（Ｂ）に示す。
図８（Ａ）は野生型PFDH（比較例）、図８（Ｂ）はPFDH/D372Vの結果を示す。
【０１３０】
図８より、野生型PFDHでは、45℃での10時間保存すると残存活性が30％程度であるのに対し、PFDH/D372Vは10時間保存で約80％、30時間保存で約60％、50時間保存であっても約40％の活性が残存することが確認された。改変型PFDHは、熱安定性に加え保存安定性が野生型PFDHに比べて格段に向上していることが確認された。
【０１３１】
（実施例９）PFDHの分離、精製
大腸菌タンパク質を含む酵素合成液から、PFDHの分離、精製を行った。ここでは、当該改変型PFDHのアミノ酸配列を解析して、その等電点等の物性情報から精製に適した３種類の精製担体を選択した。
【０１３２】
具体的には、精製担体として、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過を選択し、実施例４の手順で当該野生型PFDHを組み換え発現させた大腸菌培養物に対して実施した。このように、３種類の精製担体を使用して順次処理することにより、酵素活性を保持しつつ、かつ、高純度、及び高収率で精製することができた。精製工程の概要を下記に示すと共に、工程の詳細及び緩衝液につき、夫々、表２及び３に要約する。
【０１３３】
PFDH精製工程の概要
工程１：大腸菌の培養：PFDH産生能を有する大腸菌を培養
工程２：大腸菌の回収：遠心分離により菌体を回収し液体窒素で急速に凍結
工程３：菌体の溶解：菌体を緩衝液中に懸濁し、菌体分解液及び界面活性剤を添加して氷中で反応
工程４：菌体の破壊：菌体を超音波破砕処理（OUT PUT 10、DUTY 50、90秒×3回）で破砕
工程５：遠心分離：酵素は可溶性であるため遠心分離により上清を分取
工程６：クロマトグラフィー精製：疎水性クロマトグラフィー（ブチルトヨパール）にて精製
工程７：脱塩：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて脱塩
工程８：クロマトグラフィー精製：陰イオンクロマトグラフィー（DE52）にて精製
工程９：脱塩・濃縮：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて脱塩、並びに濃縮
工程10：クロマトグラフィー精製：ゲルろ過クロマトグラフィー（セファクリルS-200）にて精製
工程11：緩衝液置換：透析チューブ（分画分子量：10,000）にて緩衝液置換
工程12：保存：ろ過滅菌し、−20℃で保存
工程13：純度測定：蛋白質濃度測定、及び酵素活性測定
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
精製結果を図９に示す。
図９は、レーン１は、上記工程４後のタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動で確認した結果を示す。レーン２は、工程８後のカラム溶出液に含まれるタンパク質を確認した結果を示す。レーン３は、工程１０後のカラム溶出液に含まれるタンパク質を確認した結果を示す。それぞれ、PFDHのバンドを矢印で示す。
図９より、３つの精製担体を使用して順次処理することで、高純度かつ高収量の酵素が精製することができることが確認できた。
【０１３７】
本発明は、改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素及びその利用方法に関し、医療、食品、環境分野等の様々な産業分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】PFDHの無細胞タンパク質合成系における合成条件を検討した結果を示す図
【図２】（Ａ）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析結果（アミノ酸残基：K77）を示す図、（Ｂ）改変型PFDHのＸ線結晶構造解析に基づく高次構造の解析結果（アミノ酸残基：D372）を示す図
【図３】（Ａ）改変型PFDHの大腸菌細胞内での組換え発現を確認した実施例４の結果を示す電気泳動図、（Ｂ）改変型PFDHの大腸菌細胞内での組換え発現を確認した実施例４の結果を示す電気泳動図
【図４】Hisタグペプチドの酵素活性への影響確認した実施例５の結果を示すグラフ
【図５】（Ａ）改変型PFDHの無細胞タンパク質合成系による合成を確認した実施例６の結果を示す図、（Ｂ）無細胞タンパク質合成系により合成した改変型PFDHの活性を確認した実施例６の結果を示す図
【図６】（Ａ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（比較例）を示すグラフ、（Ｂ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/D372V）を示すグラフ、（Ｃ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/R79S/L84M）を示すグラフ、（Ｄ）改変型PFDHの改変型を確認した実施例７の結果（PFDH/K77M）を示すグラフ
【図７】改変型PFDHの熱安定性を確認した実施例７の結果（50℃での熱安定性）を示すグラフ
【図８】（Ａ）改変型PFDHの耐久性を確認した実施例８の結果（比較例）を示すグラフ、（Ｂ）改変型PFDHの耐久性を確認した実施例８の結果（PFDH/D372V）を示すグラフ
【図９】改変型PFDHの分離、精製を確認した実施例９の結果を示す図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項２】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第80位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項３】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置におけるアミノ酸の置換である請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換からなる群から選択される少なくとも１つである請求項３に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、以下の（１）又は（２）から選択される請求項４に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
（１）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換
（２）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換
【請求項６】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置におけるアミノ酸の置換である請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換である請求項６に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項８】
前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【請求項１】
野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列中の少なくとも１つの位置のアミノ酸の欠失、置換、付加或いは挿入による改変により得られる改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素であって、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項２】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位〜第80位に対応する位置で生じている請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項３】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第77位のリシン、第79位のアルギニン、及び第84位のロイシンからなる群から選択される少なくとも１つに対応する位置におけるアミノ酸の置換である請求項１に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換、第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換からなる群から選択される少なくとも１つである請求項３に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、以下の（１）又は（２）から選択される請求項４に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
（１）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第77位に対応する位置におけるリシンのメチオニンへの置換
（２）前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の第79位に対応する位置におけるアルギニンのセリンへの置換、及び第84位に対応する位置におけるロイシンのメチオニンへの置換
【請求項６】
前記改変が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位のアスパラギンに対応する位置におけるアミノ酸の置換である請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における第372位に対応する位置におけるアスパラギンのバリンへの置換である請求項６に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項８】
前記野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離核酸分子を含有する組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からホルムアルデヒドの脱水素反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、野生型ホルムアルデヒド脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素の触媒活性を利用してアルデヒド化合物を検出する、アルデヒド化合物の検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を電極上に固定化した酵素センサー。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素を含み、前記改変型ホルムアルデヒド脱水素酵素のアルデヒド化合物の酸化反応に伴って生成する電子を受け取るアノード極、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極を備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されている燃料電池。
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図９】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２９０９４（Ｐ２０１０−２９０９４Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９４０１１（Ｐ２００８−１９４０１１）
【出願日】平成２０年７月２８日（２００８．７．２８）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２８日（２００８．７．２８）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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