新規なトリペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤
【課題】アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する新規なトリペプチド及びそのトリペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規なアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供することを課題とする。
【解決手段】次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチド、及びそのトリペプチドを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。このトリペプチドは鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から精製分離するか又は合成法によって製することができる。
【解決手段】次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチド、及びそのトリペプチドを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。このトリペプチドは鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から精製分離するか又は合成法によって製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬としての有用性を有し、新規なアミノ酸配列によるペプチド構造を有するトリペプチド及びそのトリペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。本発明に係るトリペプチドは、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができ、又、合成法によって製することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
一般に、食品由来のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤としての利点を有する。即ち、従来、天然物又は天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害物質に関しては、以下の文献に開示されている。
【特許文献１】 特開平０６−２５６３８７号公報
【特許文献２】 特開平０６−３４０６９２号公報
【特許文献３】 特開平０７−１８８２８２号公報
【特許文献４】 特開平０７−１８８２８３号公報
【特許文献５】 特開平０８−２２５５９３号公報
【特許文献６】 特開平０９−０５９２９６号公報
【特許文献７】 特開平１０−０３６３９１号公報
【特許文献８】 特開平１１−３３５３９３号公報
【特許文献９】 特開平１１−３４３２９８号公報
【特許文献１０】 特開２００１−０６４２９９号公報
【特許文献１１】 特開２００１−１０６６９８号公報
【特許文献１２】 特開２００１−１０６６９９号公報
【特許文献１３】 特開２００１−１０６７００号公報
【特許文献１４】 特開２００３−１２８６９５号公報
【非特許文献１】 Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）
【非特許文献２】 Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）
【非特許文献３】 Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）
【非特許文献４】 鈴木健夫等：日本農芸化学会誌，５７，１１４３（１９８３）
【非特許文献５】 山本節子等：日胸疾会誌，１８，２９７−３０２（１９８９）
【０００３】
レニンーアンジオテンシン系（ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ）が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果していることは、よく知られている。このレニンーアンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下「ＡＣＥ」と略記する。）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず、中枢神経系並びに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは、生体内降圧物質であるプラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のため、プロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は、高血圧症については本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、また、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多くの優れた点を有することが見いだされている。
【０００４】
一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄をさらに促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。
【０００５】
ところで、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に、天然物又は天然物由来の物質として、蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ：非特許文献１）、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ：非特許文献２）、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ：非特許文献３）等に始まり、本発明者によるイワシ筋肉由来の５種のヘクサペプチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ：特許文献２）、ニンニク由来の１６種のペプチド（特許文献１）、イワシ筋肉由来の２３種のトリペプチドと大豆由来の２７種のトリペプチド（特許文献３）、ブタ血祭由来の４種のトリペプチド（特許文献４）、大豆由来の３種のテトラペプチドと５種のペンタペプチド（特許文献５）、更に、海苔由来のテトラペプチド（Ｎ末端がＰｒｏ：特許文献６）、海苔由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＡｌａ又はＣｙｓ：特許文献７）、高麗人参由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＩｌｅ：特許文献８）、クロレラ由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＶａｌ：特許文献９）、ワカメ由来のテトラペプチド（Ｎ末端がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｌａ：特許文献１０）、ワカメ由来のトリプチド（Ｎ末端がＴｙｒ：特許文献１４）、スピルリナ由来のテトラペプチド（Ｎ末端がｌｌｅ：特許文献１１）、アコヤ貝由来のヘクサペプチド（Ｎ末端がＩｌｅ：特許文献１２）、アサリ貝由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＡｌａ：特許文献１３）、サンマウロコ由来のペプチド（特許文献１７）等の数多くの特許文献が挙げられ、いずれも、ＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤となり得ることが開示されている。
【０００６】
このように、ＡＣＥ阻害剤としての食品タンパク質由来の血圧降下ペプチドに関して数多くの提案がなされてきたが、規則性を持ったアミノ酸配列を有する鎖長の短いペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による降圧降下（薬理効果）については、未だ不明であり、発見されてから長期間が経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はなく、食品の場合には、鈴木等が、大豆、茶類、貝類、果実類等でＡＣＥ阻害活性を認めている（非特許文献４）。しかし、これまでに水産加工残さいとして処理されてきた魚介類の骨にＡＣＥ阻害物質があることは知られていない。
【０００７】
上記の状況に鑑み、本発明者は、血圧効果作用を有すると共に、安全で、実用に供し得る新規ペプチドについて鋭意研究した結果、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から得られた特定アミノ酸配列構造のトリペプチドがＡＣＥ阻害用を奏することを見いだした。
又、この鰻骨由来のトリペプチドと同じアミノ酸配列のトリペプチドを合成法によって製したところ、鰻骨由来のトリペプチドと同様、血圧効果作用を奏することが判明した。よって、特定のアミノ酸配列構造を有するトリペプチドは血圧効果作用を有することが解明されたので、これを有効成分とするＡＣＥ阻害剤を開発することができ、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＡＣＥ阻害作用を有する新規なトリペプチド及びそのトリペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規なＡＣＥ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するための本発明のうち、請求項１に記載する発明は、
次式； Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドである。（式中、アミノ残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
又、本発明のうち、請求項２に記載する発明は、
次式； Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有するトリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。（式中、アミノ残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載のトリペプチド（以下「本発明のトリペプチド」という。）は、優れたＡＣＥ阻害作用を有し、血圧降下作用、プラジキニン不活化抑制作用を示す。そのため、本発明のトリペプチドは、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防・治療作用並びにこれらのうつ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善作用（延命効果）を示す。従って、本発明に係る請求項２に記載のＡＣＥ阻害剤（以下「本発明のＡＣＥ阻害剤」という。）は、これら高血圧症の予防剤・治療剤として、又、これらうっ血性心不全の治療剤として有用である。
尚、この新規なトリペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【００１１】
又、本発明のトリペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフイラキシーショックを起こさせない。更に、本発明のトリペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解されるため、毒性はきわめて低く、安全性はきわめて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のトリペプチドは、次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドであり、常温における性状は、白色の粉末である。
本発明のトリペプチドは、化学的に合成する方法又は魚介類の骨、特に鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製する方法によって得ることができる。
【００１３】
本発明のトリペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記トリペプチドのカルポキシル末端側（グルタミン）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を、順次ペプチド結合によって結合して行くのがよい。そして、そのようにして得られた合成トリペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略記する。）等を用いた通常の方法で精製することができる。
【００１４】
また、本発明のトリペプチドは、上記のとおり、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、鰻骨を用いて加水分解する。加水分解の方法は常法にしたがって行うことでよい。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、鰻骨のホモジネイトを必要に応じて更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベイトする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ、アンバーライト社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０等）にかけ、その吸着溶出画分からＡＣＥ阻害活性を有する成分を含有する画分を得、その得られたＡＣＥ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、フアルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、バイオラッド社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、フアルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、生化学工業社製のＳＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ等）によって分画し、最終的に得られたＡＣＥ阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画することによって単離精製を行うことができる。
【００１５】
本発明のトリペプチドの製法においては、魚介類骨としては、本発明の課題を達成できる限り、いかなる魚介類の骨を用いてもよいが、好ましくは鰻骨を用いるのがよい。
【００１６】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤等に調製することができる。これらの各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤に用いられるものを使用することができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等、結合剤としては、デンプン類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等を、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカルシウム塩類を、潤滑剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要に応じ、メントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明のトリペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明のトリペプチドを含有する製剤は、凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩水に溶解して用いることもできる。
【００１７】
本発明のＡＣＥ阻害剤の投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること又は経口投与することが挙げられる。投与量は、例えば、動物体重Ｋｇ当たり本発明のＡＣＥ阻害剤を０．０１〜１０ｍｇの量が適当である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜調整することができる。
【００１８】
以下、実施例及び試験例をもって本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
＜本発明のトリペプチドの鰻骨からの製造例＞
鰻骨５００ｇに２規定の酢酸水５Ｌを加え、ホモジナイズ後、室温で１週間撹拌しながら、鰻骨由来のタンパク質、所謂、鰻骨コラーゲンの抽出を行った。１週間後、ホモジネイト液を濾過助剤；ラジオライト♯１００による珪藻土濾過を行い、得られた清澄濾液を透析チューブ（３６ｉｎｃｈ、和光純薬工業製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い、透析内液を得た。この透析内液を凍結乾燥して、９３ｇの鰻骨コラーゲンを得た。この鰻骨コラーゲン粉末に脱イオン水６００ｍＬを加えて溶解し、１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整した後、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）２．７９ｇを添加し、３７℃で２４時間撹拌しながら酵素分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、¢７６ｍｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４［Ｈ＋］カラム（¢４．５×２０ｃｍ）に負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、２規定のアンモニア水８００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液６０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（¢２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速２０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過を繰り返し、大量分取したＡＣＥ阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥し、鰻骨コラーゲン由来のペプチド粉末（以下「鰻骨ペプチド」と略記する。）とした。この鰻骨ペプチド粉末４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５〔Ｈ＋〕カラム（¢１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水１０００ｍＬから３％塩化ナトリウム水１０００ｍＬの濃度勾配を行い、溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５クロマトグラフ中のＡＣＥ阻害活性画分を集めて凍結乾燥し、精製鰻骨ペプチド粉末を得た。この精製鰻骨ペプチド粉末２０ｍｇを６０ｍＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ Ｘ ２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」と略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／分、波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った
結果、溶出時間；６４．７分にＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。この逆相ＨＰＬＣ分析の結果は図１に示す。
【００２０】
再度、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのアミン酸分析を行ったところ、Ｌｅｕ；１．０９、Ａｌａ；０．９３、Ｔｙｒ；１．０１であった。さらに、ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；０３２μＭであった。このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本実施例に係る新規なペプチドは、次式、
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表されるトリペプチドであることが確認された。
この新規なトリペプチドの常温における性状は、白色の粉末である。
【００２１】
本実施例に係る新規なトリペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法にしたがって、例えば次のように処理すればよい。▲１▼ペプチド１２ｇ、▲２▼乳糖９４ｇ、▲３▼コーンスターチ３４ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１４ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に４．３ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【実施例２】
【００２２】
＜本発明のトリペプチドの合成法による製造例＞
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって、本発明のペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、本発明のトリペプチドのアミノ酸配列にしたがって、常法どおり、そのＣ末端側のチロシンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下「ｔ−Ｂｏｃ」と略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、水冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さらに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈殿させて分離し、その沈殿物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が８２分間で６８％→１７％の濃度勾配法により流速１．４ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１９ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成トリペプチドを得た。
【００２３】
この合成トリペプチドをマススペクトル分析により分析した結果、アミノ酸配列が前記で示したアミノ酸配列構造を有するトリペプチドであることが確認された。このマススペクトル分析の結果は、図２に示す。さらに、この合成トリペプチドのＡＣＥ阻害活性を試験例１の方法によって測定したところ、ＩＣ５０値；０．１７μＭであった。
【試験例１】
【００２４】
＜ＡＣＥ阻害活性測定法＞
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３・４・１５・１）２．５ｍＵ、合成基質ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用い、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法（非特許文献５）に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し、２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度の値をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えたときの値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させたときの値をＥｂとして、次式から阻害率を求めた。
【００２５】
阻害率（％）＝ （Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
尚、本発明のＡＣＥ阻害剤の上記の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示したものである。
【試験例２】
【００２６】
＜高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果＞
（１）試験方法
実験動物として日本チャールズ・リバー社より１５週令雄性高血圧自然発症ラット（以下「ＳＨＲ」と略記する。）を購入し、１週間の予備飼育後、収縮期血圧（以下「ＳＢＰ」と略記する。）が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０〜３３０ｇ）のラットを６匹１群として、「コントロール群」と「トリペプチド群」とに分けて用いた。
ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％及び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容して飼育した。トリペプチド群には、被験剤としてのトリペプチド（実施例１で製したもの）を体重１ｋｇ当たり１０ｍｇを生理食塩水に溶解して、強制経口投与した。コントロール群には、被験剤の代わりに生理食塩水のみを投与した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。
血圧は、非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用い、ｔａｉｌ ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後６時間後のＳＨＲ尾動脈の収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）の測定を測定時間ごとに５回行い、得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均値をもって各時間の測定値とした。本発明のトリペプチド１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与したときの収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）への作用の結果については、表１に示す。
（２）試験結果
表１に示すとおりである。
（３）所見
以上の試験の結果、本発明のトリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてＡＣＥ阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。
従って、本発明のトリペプチドは、高血圧症の治療又は予防薬として有用である。
【００２７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のトリペプチド及びそれを有効成分とするＡＣＥ阻害剤は、生体内の血圧降下作用を有し、しかも、毒性はきわめて低く、安全性はきわめて高い上、静脈内へ繰り返し投与を行った場合でも抗体産生を惹起せず、アナフイラキシーショックを起こさせないので、高血圧症の予防剤・治療剤として、また、うっ血性心不全の治療剤として大いに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のトリペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離精製の結果を示すグラフ（実施例１）
【図２】本発明のトリペプチドのマススペクトルを示すグラフ（実施例２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬としての有用性を有し、新規なアミノ酸配列によるペプチド構造を有するトリペプチド及びそのトリペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。本発明に係るトリペプチドは、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができ、又、合成法によって製することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
一般に、食品由来のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤としての利点を有する。即ち、従来、天然物又は天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害物質に関しては、以下の文献に開示されている。
【特許文献１】 特開平０６−２５６３８７号公報
【特許文献２】 特開平０６−３４０６９２号公報
【特許文献３】 特開平０７−１８８２８２号公報
【特許文献４】 特開平０７−１８８２８３号公報
【特許文献５】 特開平０８−２２５５９３号公報
【特許文献６】 特開平０９−０５９２９６号公報
【特許文献７】 特開平１０−０３６３９１号公報
【特許文献８】 特開平１１−３３５３９３号公報
【特許文献９】 特開平１１−３４３２９８号公報
【特許文献１０】 特開２００１−０６４２９９号公報
【特許文献１１】 特開２００１−１０６６９８号公報
【特許文献１２】 特開２００１−１０６６９９号公報
【特許文献１３】 特開２００１−１０６７００号公報
【特許文献１４】 特開２００３−１２８６９５号公報
【非特許文献１】 Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）
【非特許文献２】 Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）
【非特許文献３】 Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）
【非特許文献４】 鈴木健夫等：日本農芸化学会誌，５７，１１４３（１９８３）
【非特許文献５】 山本節子等：日胸疾会誌，１８，２９７−３０２（１９８９）
【０００３】
レニンーアンジオテンシン系（ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ）が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果していることは、よく知られている。このレニンーアンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下「ＡＣＥ」と略記する。）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず、中枢神経系並びに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは、生体内降圧物質であるプラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のため、プロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は、高血圧症については本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、また、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多くの優れた点を有することが見いだされている。
【０００４】
一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄をさらに促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。
【０００５】
ところで、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に、天然物又は天然物由来の物質として、蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ：非特許文献１）、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ：非特許文献２）、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ：非特許文献３）等に始まり、本発明者によるイワシ筋肉由来の５種のヘクサペプチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ：特許文献２）、ニンニク由来の１６種のペプチド（特許文献１）、イワシ筋肉由来の２３種のトリペプチドと大豆由来の２７種のトリペプチド（特許文献３）、ブタ血祭由来の４種のトリペプチド（特許文献４）、大豆由来の３種のテトラペプチドと５種のペンタペプチド（特許文献５）、更に、海苔由来のテトラペプチド（Ｎ末端がＰｒｏ：特許文献６）、海苔由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＡｌａ又はＣｙｓ：特許文献７）、高麗人参由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＩｌｅ：特許文献８）、クロレラ由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＶａｌ：特許文献９）、ワカメ由来のテトラペプチド（Ｎ末端がＴｙｒ、Ｌｙｓ又はＡｌａ：特許文献１０）、ワカメ由来のトリプチド（Ｎ末端がＴｙｒ：特許文献１４）、スピルリナ由来のテトラペプチド（Ｎ末端がｌｌｅ：特許文献１１）、アコヤ貝由来のヘクサペプチド（Ｎ末端がＩｌｅ：特許文献１２）、アサリ貝由来のペンタペプチド（Ｎ末端がＡｌａ：特許文献１３）、サンマウロコ由来のペプチド（特許文献１７）等の数多くの特許文献が挙げられ、いずれも、ＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤となり得ることが開示されている。
【０００６】
このように、ＡＣＥ阻害剤としての食品タンパク質由来の血圧降下ペプチドに関して数多くの提案がなされてきたが、規則性を持ったアミノ酸配列を有する鎖長の短いペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による降圧降下（薬理効果）については、未だ不明であり、発見されてから長期間が経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はなく、食品の場合には、鈴木等が、大豆、茶類、貝類、果実類等でＡＣＥ阻害活性を認めている（非特許文献４）。しかし、これまでに水産加工残さいとして処理されてきた魚介類の骨にＡＣＥ阻害物質があることは知られていない。
【０００７】
上記の状況に鑑み、本発明者は、血圧効果作用を有すると共に、安全で、実用に供し得る新規ペプチドについて鋭意研究した結果、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から得られた特定アミノ酸配列構造のトリペプチドがＡＣＥ阻害用を奏することを見いだした。
又、この鰻骨由来のトリペプチドと同じアミノ酸配列のトリペプチドを合成法によって製したところ、鰻骨由来のトリペプチドと同様、血圧効果作用を奏することが判明した。よって、特定のアミノ酸配列構造を有するトリペプチドは血圧効果作用を有することが解明されたので、これを有効成分とするＡＣＥ阻害剤を開発することができ、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＡＣＥ阻害作用を有する新規なトリペプチド及びそのトリペプチドを有効成分として含有し、毒性がきわめて低く、安全性がきわめて高い、新規なＡＣＥ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するための本発明のうち、請求項１に記載する発明は、
次式； Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドである。（式中、アミノ残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
又、本発明のうち、請求項２に記載する発明は、
次式； Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有するトリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤である。（式中、アミノ残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る請求項１に記載のトリペプチド（以下「本発明のトリペプチド」という。）は、優れたＡＣＥ阻害作用を有し、血圧降下作用、プラジキニン不活化抑制作用を示す。そのため、本発明のトリペプチドは、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防・治療作用並びにこれらのうつ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善作用（延命効果）を示す。従って、本発明に係る請求項２に記載のＡＣＥ阻害剤（以下「本発明のＡＣＥ阻害剤」という。）は、これら高血圧症の予防剤・治療剤として、又、これらうっ血性心不全の治療剤として有用である。
尚、この新規なトリペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【００１１】
又、本発明のトリペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフイラキシーショックを起こさせない。更に、本発明のトリペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解されるため、毒性はきわめて低く、安全性はきわめて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ：ラット経口投与）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のトリペプチドは、次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドであり、常温における性状は、白色の粉末である。
本発明のトリペプチドは、化学的に合成する方法又は魚介類の骨、特に鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製する方法によって得ることができる。
【００１３】
本発明のトリペプチドを化学的に合成する場合には、液相法又は固相法等の通常のペプチド合成法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記トリペプチドのカルポキシル末端側（グルタミン）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を、順次ペプチド結合によって結合して行くのがよい。そして、そのようにして得られた合成トリペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」と略記する。）等を用いた通常の方法で精製することができる。
【００１４】
また、本発明のトリペプチドは、上記のとおり、鰻骨のタンパク質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、鰻骨を用いて加水分解する。加水分解の方法は常法にしたがって行うことでよい。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、鰻骨のホモジネイトを必要に応じて更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベイトする。次いで必要に応じて中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解液を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ、アンバーライト社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０等）にかけ、その吸着溶出画分からＡＣＥ阻害活性を有する成分を含有する画分を得、その得られたＡＣＥ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、フアルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、バイオラッド社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、フアルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、生化学工業社製のＳＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ等）によって分画し、最終的に得られたＡＣＥ阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画することによって単離精製を行うことができる。
【００１５】
本発明のトリペプチドの製法においては、魚介類骨としては、本発明の課題を達成できる限り、いかなる魚介類の骨を用いてもよいが、好ましくは鰻骨を用いるのがよい。
【００１６】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤等に調製することができる。これらの各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤に用いられるものを使用することができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等、結合剤としては、デンプン類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等を、崩壊剤としては、カルボキシメチルセルロース及びそのカルシウム塩類を、潤滑剤としては、ステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要に応じ、メントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明のトリペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明のトリペプチドを含有する製剤は、凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩水に溶解して用いることもできる。
【００１７】
本発明のＡＣＥ阻害剤の投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること又は経口投与することが挙げられる。投与量は、例えば、動物体重Ｋｇ当たり本発明のＡＣＥ阻害剤を０．０１〜１０ｍｇの量が適当である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜調整することができる。
【００１８】
以下、実施例及び試験例をもって本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
＜本発明のトリペプチドの鰻骨からの製造例＞
鰻骨５００ｇに２規定の酢酸水５Ｌを加え、ホモジナイズ後、室温で１週間撹拌しながら、鰻骨由来のタンパク質、所謂、鰻骨コラーゲンの抽出を行った。１週間後、ホモジネイト液を濾過助剤；ラジオライト♯１００による珪藻土濾過を行い、得られた清澄濾液を透析チューブ（３６ｉｎｃｈ、和光純薬工業製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い、透析内液を得た。この透析内液を凍結乾燥して、９３ｇの鰻骨コラーゲンを得た。この鰻骨コラーゲン粉末に脱イオン水６００ｍＬを加えて溶解し、１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整した後、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）２．７９ｇを添加し、３７℃で２４時間撹拌しながら酵素分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、¢７６ｍｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ４［Ｈ＋］カラム（¢４．５×２０ｃｍ）に負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、２規定のアンモニア水８００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液６０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（¢２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速２０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過を繰り返し、大量分取したＡＣＥ阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥し、鰻骨コラーゲン由来のペプチド粉末（以下「鰻骨ペプチド」と略記する。）とした。この鰻骨ペプチド粉末４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５〔Ｈ＋〕カラム（¢１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水１０００ｍＬから３％塩化ナトリウム水１０００ｍＬの濃度勾配を行い、溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５クロマトグラフ中のＡＣＥ阻害活性画分を集めて凍結乾燥し、精製鰻骨ペプチド粉末を得た。この精製鰻骨ペプチド粉末２０ｍｇを６０ｍＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ Ｘ ２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下「ＴＦＡ」と略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／分、波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った
結果、溶出時間；６４．７分にＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。この逆相ＨＰＬＣ分析の結果は図１に示す。
【００２０】
再度、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのアミン酸分析を行ったところ、Ｌｅｕ；１．０９、Ａｌａ；０．９３、Ｔｙｒ；１．０１であった。さらに、ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；０３２μＭであった。このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本実施例に係る新規なペプチドは、次式、
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表されるトリペプチドであることが確認された。
この新規なトリペプチドの常温における性状は、白色の粉末である。
【００２１】
本実施例に係る新規なトリペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法にしたがって、例えば次のように処理すればよい。▲１▼ペプチド１２ｇ、▲２▼乳糖９４ｇ、▲３▼コーンスターチ３４ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１４ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に４．３ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【実施例２】
【００２２】
＜本発明のトリペプチドの合成法による製造例＞
アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって、本発明のペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、本発明のトリペプチドのアミノ酸配列にしたがって、常法どおり、そのＣ末端側のチロシンからクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下「ｔ−Ｂｏｃ」と略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、水冷下でトリフルオロ酢酸を加え、さらに１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈殿させて分離し、その沈殿物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が８２分間で６８％→１７％の濃度勾配法により流速１．４ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１９ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成トリペプチドを得た。
【００２３】
この合成トリペプチドをマススペクトル分析により分析した結果、アミノ酸配列が前記で示したアミノ酸配列構造を有するトリペプチドであることが確認された。このマススペクトル分析の結果は、図２に示す。さらに、この合成トリペプチドのＡＣＥ阻害活性を試験例１の方法によって測定したところ、ＩＣ５０値；０．１７μＭであった。
【試験例１】
【００２４】
＜ＡＣＥ阻害活性測定法＞
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３・４・１５・１）２．５ｍＵ、合成基質ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用い、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法（非特許文献５）に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し、２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度の値をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えたときの値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させたときの値をＥｂとして、次式から阻害率を求めた。
【００２５】
阻害率（％）＝ （Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
尚、本発明のＡＣＥ阻害剤の上記の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示したものである。
【試験例２】
【００２６】
＜高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果＞
（１）試験方法
実験動物として日本チャールズ・リバー社より１５週令雄性高血圧自然発症ラット（以下「ＳＨＲ」と略記する。）を購入し、１週間の予備飼育後、収縮期血圧（以下「ＳＢＰ」と略記する。）が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０〜３３０ｇ）のラットを６匹１群として、「コントロール群」と「トリペプチド群」とに分けて用いた。
ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％及び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容して飼育した。トリペプチド群には、被験剤としてのトリペプチド（実施例１で製したもの）を体重１ｋｇ当たり１０ｍｇを生理食塩水に溶解して、強制経口投与した。コントロール群には、被験剤の代わりに生理食塩水のみを投与した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。
血圧は、非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用い、ｔａｉｌ ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後６時間後のＳＨＲ尾動脈の収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）の測定を測定時間ごとに５回行い、得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均値をもって各時間の測定値とした。本発明のトリペプチド１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与したときの収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）への作用の結果については、表１に示す。
（２）試験結果
表１に示すとおりである。
（３）所見
以上の試験の結果、本発明のトリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてＡＣＥ阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。
従って、本発明のトリペプチドは、高血圧症の治療又は予防薬として有用である。
【００２７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のトリペプチド及びそれを有効成分とするＡＣＥ阻害剤は、生体内の血圧降下作用を有し、しかも、毒性はきわめて低く、安全性はきわめて高い上、静脈内へ繰り返し投与を行った場合でも抗体産生を惹起せず、アナフイラキシーショックを起こさせないので、高血圧症の予防剤・治療剤として、また、うっ血性心不全の治療剤として大いに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のトリペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離精製の結果を示すグラフ（実施例１）
【図２】本発明のトリペプチドのマススペクトルを示すグラフ（実施例２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項１】
次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチド。
【請求項２】
次式；Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１９９６７２（Ｐ２００６−１９９６７２Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４１２６８（Ｐ２００５−４１２６８）
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【出願人】（５９１１６７１１９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１９日（２００５．１．１９）
【出願人】（５９１１６７１１９）
【Ｆターム（参考）】
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