新規なポリ（エチレンオキサイド）−ブロックーポリ（エステル）ブロック共重合体
【解決手段】
本発明は、ポリエステルブロック上に反応基を持つ、ミセルを生成するポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体に関連する。これらの共重合体は、その生分解性および多数の生物活性剤との生体適合性のために、種々の生物活性剤の適切なキャリヤーになる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、薬物などのような生物活性剤は、共重合体のポリエステル・ブロック上の反応基と結合できる。
本発明は、ポリエステルブロック上に反応基を持つ、ミセルを生成するポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体に関連する。これらの共重合体は、その生分解性および多数の生物活性剤との生体適合性のために、種々の生物活性剤の適切なキャリヤーになる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、薬物などのような生物活性剤は、共重合体のポリエステル・ブロック上の反応基と結合できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年３月２１日付で出願された米国特許仮出願番号第６０／７８３，８３７号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、新規のポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体、特にポリエステルブロック上に反応性グループおよび／または生物活性化合物を持つポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体に関連する。本発明は、さらに、生物活性剤送達（デリバリー）用の前記組成物およびその使用法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
両親媒性のブロック共重合体は、ナノ規模のコア（内核）／シェル（外殻）構造に自己会合ができ、その疎水性コアが医薬、タンパク質、またはＤＮＡのカプセル化用のミクロ貯蔵庫の役割を果たし、該親水性シェルは媒体と相互作用する。薬物送達用に設計された種々のブロック共重合体の中で、ポリエチレンオキサイド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ：ＰＥＯ）をシェル生成ブロックとし、ポリエステルまたはポリアミノ酸（ｐｏｌｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：ＰＬＡＡ）をコア生成ブロックとするものが注目を浴びている。これは、ＰＥＯが生体適合性であり、更にポリエステルおよびＰＬＡＡの生分解性であるため、それによってヒト投与用に安全となる。
【０００４】
ポリアミノ酸（ＰＬＡＡ）は、薬物、薬物適合成分、遺伝子、または知的ベクトルとアミノ酸鎖上のアミンまたはカルボン酸のような遊離官能基を通して共有または静電気的結合生成の可能性があるので、ポリアミノ酸（ＰＬＡＡ）構造は、ポリエステル類より有利であることが知られている。したがって、疎水性／親水性ブロックの長さ、側鎖の化学構造および置換の程度を変えることを利用して、所望の安定性、生物分解、薬物担持、放出、または活性化特性を達成できる。
【０００５】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡに基づくミセルのコア構造の化学操作によって、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ、メトトレキサート、シスプラチンおよびパクリタクセルの所望送達特性が達成された。例えば、ＰＥＯ−ｂ−ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）とＤＯＸとの結合物（コンジュゲート）から生成するミセルの安定性を向上させるのに、ＤＯＸ置換４０〜５０％で、ＰＥＯに対するＰ（Ａｓｐ）ＤＯＸの割合を減少させることを利用した。後にＤＯＸを物理的にカプセル化するのに、ＰＥＯ−ｂ−ＰＡｓｐ−ＤＯＸミセルを用いた。化学的に結合した薬物と物理的にカプセル化された薬物との強い相互作用を利用して、ドキソルビシンに対して効率的な可溶化と放出特性とを備えた新規の製剤が開発され、現在日本で臨床試験中である（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｙ，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｕｒａ Ｔら、「ミセルにカプセル化（内包）されたドキソルビシンであるＮＫ９１１のフェーズＩ臨床試験および薬物動態学の評価」を参照）。（Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ９１１，ａ ｍｉｃｅｌｌｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．）Ｂｒ Ｊ ＣａＮＣｅｒ（２００４）９１（１０）：１７７５−１７８１）。
【０００６】
本発明者もまた、以前に、脂肪族系薬物、アンフォテリシンＢ（ＡｍＢ）をカプセル化するのにコア中に飽和脂肪酸エステル類を持つＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡに基づくミセルのシステムを調製した。これがＡｍＢ放出速度を有効に保持できるように、ミセルのコアを化学的に微調整した（参照、Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ Ａ，Ｓａｍｕｅｌ Ｊ，Ｋｗｏｎ ＧＳ：ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（Ｎ−アルキルステアレートＬ−アスパルトアミド（ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ））のミセル： 薬物送達用リポタンパク質の合成類似体（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ Ａ，Ｓａｍｕｅｌ Ｊ，Ｋｗｏｎ ＧＳ：Ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（Ｎ−ａｌｋｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ Ｌ−ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ （２０００））。理論によって限定されることを望まないが、例えば、エステル結合のようなより加水分解性結合の生成によって、薬物放出特性が十分なミセルを生成するのに、ミセル生成ブロック共重合体−薬物複合体が使用可能であると思われる。この手法を利用してＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡにメトトレキサート（ＭＴＸ）を付加させた。ＭＴＸの付加量で重合体ミセルの安定性および薬物放出速度を規制するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新規の重合体であるポリアミノ酸の設計、合成および発見で進歩があった一方、これらの種々の構造物の生分解性は完全には追求されていない。ポリエステル類は、一般に、ヒトに安全に応用した歴史があったとはいえ、該重合体の主鎖上に官能基を欠くために化学操作にはそれほど適していない。したがって、依然として生分解性があり、多数の生物活性剤と生体適合性であるＰＥＯ−ｂ−ポリエステルブロック共重合体を継続して設計し、開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリエステルブロック上に反応性または機能的な側鎖グループを内に持つポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体であって、生分解性があり、多数の生物活性剤と生体適合性である、かかる共重合体を提供する。本発明は、さらに本発明の機能化されたポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体が、生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成を提供する。さらに、本発明は、機能化された本発明のポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体を生物活性剤を送達用に使用する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明は化学式Ｉの化合物に関連し、
【００１０】
【化３】
【００１１】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖとｗは、互いに独立し、１〜４から独立に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または複環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００１２】
本発明の機能化ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体のカプロラクトン残渣は、ランダムまたはブロック状に組み立てることができる。例えば、ランダムに組み立てたコアでは、置換および非置換カプロラクトン残渣は共にコア・ブロックの長さ方向にランダムに配置される。ブロックに組み立てた場合、置換カプロラクトンのブロックは、非置換カプロラクトンのブロックに続いていても（または逆でも）よい。別の場合では、カプロラクトン残渣はすべて置換されている。
【００１３】
発明の別の態様では、本発明の機能化ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体生成に有用な機能化カプロラクトン単量体を提供する。従って、本発明は式ＩＩの化合物に関連する。
【００１４】
【化４】
【００１５】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の基３個が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、さらに式Ｉと生物活性剤であって、化学式Ｉの化合物が生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成に関連する。該発明のより特別な態様では、式Ｉの化合物が、化学的結合、静電気的結合、および物理的カプセル化のうち１若しくはそれ以上によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。該発明の別の態様では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００１７】
有効量の生物活性剤の周囲にミセル生成可能な化学式Ｉの化合物を被検者に投与することを含む、生物活性剤を被検者に送達する方法も、本発明の範囲内にある。より具体的には、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００１８】
本発明、及び先行技術に勝って達成された利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を上述した。当然ながら、当該発明のいかなる具体的なの態様によってでも、そのような目的または利点が必ずしもすべて達成されなくても良いことは理解される。したがって、例えば、本願明細書に教示されるような１つの利点または幾つかの利点のグループを達成または最適化するように、当業者であれば、本願明細書に教示または提案されているような他の目的または利点を必ずしも達成せずに、当該発明を具体化または実行できることが判るであろう。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかし、発明の要旨の範囲内の種々の変更および修飾が、この詳細なる説明から当業者に明白になるため、当該詳細な説明および特定の実施形態は、発明の好ましい態様を示す一方、説明の為だけに記載されていることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
次の定義は、別記のない限り、本発明のすべての実施形態および態様に該当する。
【００２１】
本願明細書で使用される用語「Ｃ１−２０アルキル」は、炭素原子を１〜２０個含む直鎖および／または分岐アルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含む。
【００２２】
本願明細書で使用される用語「Ｃ３−２０シクロアルキル」は、炭素原子を３〜２０個含む飽和環式アルキル基を意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等を含む。
【００２３】
本願明細書にて使用される用語「アリール」は、１個または２個の芳香環および炭素原子を６〜１４個含む、単環式または二環式炭素環式システムを意味し、フェニル、ナフチル、アンスラセニル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニイル、インダニル、インデニルなどを含む。
【００２４】
本願明細書にて使用される用語「Ｃ２−６アルケニル」は、炭素原子２〜６個および二重結合を１〜３個含む直鎖および／または分岐鎖アルケニル基を意味し、ビニール、アリル、１−ブテニル、２−ヘキセニルなどを含む。
【００２５】
本願明細書にて使用される用語「Ｃ２−６アルケニルオキシ」は、炭素原子２〜６個および二重結合を１〜３個含む直鎖および／または分岐鎖アルケニルオキシ基を意味し、ビニールオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ヘキセニルオキシなどを含む。
【００２６】
本願明細書にて使用される用語「アルキニレン」は、特定の数の炭素を含む二官能直鎖および／または分岐アルキル基を意味する。
【００２７】
本願明細書にて使用する用語「ハロ」はハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、アイオド等を含む。
【００２８】
本願明細書にて使用される用語、「有効量の」薬剤は、有益または所望の、臨床結果を含む結果を得るのに十分な量を意味するが、このようなものとして、「有効量」は、用語が適用されている情況に依存する。例えば、薬物の役割をする薬剤を投与する情況では、有効量の薬剤は、例えば、当該薬剤の投与なしで得られた応答と比較して、治療上の応答を達成するのに十分な量である。
【００２９】
本願明細書にて使用される用語「対象」は、ヒトを含む動物界の全員を含む。被験者は、好ましくはヒトである。
【００３０】
本願明細書にて使用される用語「生分解性」は、物質を、可溶化、加水分解、または、酵素および他の有機体の生成物でもよい生物形成体の作用によってより簡単な中間体または最終生産物へ転化することを意味する。
【００３１】
本願明細書にて使用される用語「生体適合性」は、物質、または物質の可溶化、加水分解、または、酵素および他の有機体の生成物でもよい生物形成体の作用によって生成し、体に悪影響をもたらさない中間体または最終生産物を意味する。
【００３２】
記載
生物活性剤を組み入れるために、ＰＣＬブロック上に官能基を備えた生分解性ミセルを生成するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬブロック共重合体を調製した。ＰＥＯ−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）のようなＰＥＯ−ｂ−ポリエステルブロック共重合体のポリエステルセグメントへ官能基を導入すると、種々の反応性化合物をコアを形成する構造体に付着させ得る能力があり、生分解性の自己集合性生物材料の生成に繋がることが判明した。したがって、本発明は、さらに疎水性の特性のある生物活性剤をカプセル化するためのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに関連する。ポリカプロラクトンは、ガラス転移温度が低い疎水性、半結晶の重合体である。ＰＣＬの化学構造を変化させて、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルの熱力学的および速度論的安定性、生分解、薬物可溶化および放出特性を修正するのに使用してもよい。本発明は、化学式Ｉの化合物を含み、
【００３３】
【化５】
【００３４】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖとｗは、互いに独立し、１〜４から独立に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の実施形態では、Ｌ１は、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）−である。本発明のさらなる実施形態では、Ｒ１は、アルキル、シクロアルキル、またはアリール基の１またはそれ以上の炭素をＯ、Ｓ、またはＮで選択的に置換してもよい、選択的に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルまたはアリール基および生物活性剤とから成る群から選択される。本発明のさらなる実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。本発明のある実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質および薬物から成る群から選択される。
【００３６】
本発明のある実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される。より具体的には、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロールから成る群から選択される。さらにより具体的には、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロール、シクロスポリンＡ、およびエルゴステロールから成る群から選択される。なおさらに特定すれば、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）である。本発明の別の実施形態では、該タンパク質はワクチンである。
【００３７】
本発明のある実施形態では、任意に選択される置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルケニルオキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）（Ｃ１−４アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−４ルキル、ＳＯ２Ｃ１−４アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−４アルキル、フェニル、およびＣ１−４アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００３８】
更に本発明の別の実施形態では、ｖおよびｗは互いに独立的に、２または３である。
【００３９】
更に本発明の別の実施形態では、ｖおよびｗは同じものである。
【００４０】
本発明のある実施形態では、ｘが５０〜２００の整数である。本発明のより具体的な実施形態では、ｘは１００〜１５０の整数である。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、ｙは５〜１００の整数である。本発明のより特別な実施形態では、ｙは５〜５０の整数である。さらにより特別な実施形態では、ｙは１０〜２０の整数である。
【００４２】
本発明のある実施形態では、ｚは、０〜８０、より適切には、０〜４０の整数である。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、化学式ＩＩの化合物が提供される。
【００４４】
【化６】
【００４５】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の基３個が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または複環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の別の態様に従って、本発明の化合物は、例えばスキーム１で示される反応経路によって調製できる。
【００４７】
【化７】
【００４８】
化学式ＩＩのラクトン、およびｚが０〜１００である場合に、Ｌ１、Ｒ１、ｖおよびｗが化学式Ｉにおいて定義される化学式ＩＩＩのラクトンは、加熱および無水の条件下、触媒の存在下、ｘが化学式Ｉにおいて定義される開始剤メトキシポリエチレンオキサイドＩＶと開環重合によって化学式Ｉの化合物を提供するよう反応させることができる。化学式ＩＶの化合物は当該技術で周知の方法を使用して調製できる。化学式ＩＩの化合物は、例えば、スキーム２で示されるように取得できる。
【００４９】
【化８】
【００５０】
化学式ＶＩのエノラート化合物は、無水の条件下、約−６０℃〜約−９０℃の範囲の温度、好ましくは−７８℃で、非求核性の強塩基、例えばリチウム・ジイソプロピルアミン（ＬＤＡ）のようなリチウムアルキルとの反応で調製可能である。次いで、このエノラートは、ＬＧがハロゲンのような任意の適切な脱離基である化学式ＶＩＩ試薬と求電子置換を行ない、対応する化学式ＩＩまたはＩＩＩの化合物を生成する。
【００５１】
Ｒ１が生物活性化合物である場合、該生物活性化合物は重合工程の後に化学式Ｉの化合物に組み入れることができる。この場合、Ｒ１が保護基であって、重合工程後、除去され、官能基、例えばＣ（Ｏ）ＯＨ基を顕在化し、前記生物活性化合物の相補的官能基、例えばＯＨ、ＮＨ２、またはＳＨと反応する化学式Ｉの化合物が使用される。一旦官能基が顕在化されれば、そこで、前記官能基は、当該技術で周知の条件下で生物活性化合物と結合させられる。このように出来た化学式Ｉの化合物のＲ１は、そこで生物活性剤となる。ある場合では、生物活性化合物の添加に先立って官能基を保護する必要がないこともあることが判明している。
【００５２】
さらに本発明の範囲内にあるのは、上に定義のような化学式Ｉの化合物と生物活性剤を含んでおり、化学式Ｉの化合物が、生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成物である。本発明の実施形態で、化学式Ｉの化合物は、化学的結合、静電気的結合、および物理的カプセル化のうち１若しくはそれ以上によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。本発明のより特定の実施形態によると、化学式Ｉの化合物は、化学的結合によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。より特別には、本発明の実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。本発明のある実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質および薬物から成る群から選択される。特定すれば、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ、メトトレキサート、シスプラチン、パクリタクセル、エトポシド、シクロスポリン、ＰＳＣ８３３、アミオダロン、ラパマイシン、コレステロールおよびエルゴステロールから成る群から選択される。より特定すれば、本発明の実施形態では、薬物はドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロールおよびエルゴステロールから選択される。さらに特定すれば，本発明の実施形態では、薬物はドキソルビシン（ＤＯＸ）である。発明の別の実施形態では、タンパク質はワクチンである。
【００５３】
本発明の薬物担持ミセル組成は、経口または非経口的に投与できる。投与される薬物の濃度は、担持した特定の薬物および治療すべき条件または疾病状態に依存するであろう。本発明の化合物は、当業者の技術内で容易に決定できる、適切な治療上有効で且つ安全な投与量で被験者に投与してよい。これらの化合物は、最も好ましくは、一回か分割された投与量として投与されるが、治療中の被験者の体重および状態条件、および選択した特定の投与法によって必然的に変わる。
【００５４】
本発明は、さらに、被験者に上述にて定義した有効量の生物活性剤の周囲にミセルを生成できる化学式Ｉの化合物を投与することを含む、生物活性剤を被験者に送達する方法を包含する。より具体的には、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００５５】
次の非限定的な実施例により、本発明を例証する。
【００５６】
実施例
材料
メトキシポリエチレンオキサイド（平均分子量、５０００ｇｍｏｌ−１）、ジイソプロピルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｍｉｎｅ（９９％））、ベンジルクロロフォーメート（工業用、９５％）（ｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（ｔｅｃｈ．９５％））、ナトリウム（灯油中）、ブチル・リチウム（Ｂｕ−Ｌｉ）のヘキサン溶液（２．５Ｍ溶液）、パラジウム被覆炭（ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｃｏａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Ｎ，Ｎ'−ｄｉｃｙｌｃｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ））、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）、トリエチルアミン、ドキソルビシンを使用した。塩酸とピレンは、シグマ化学薬品会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国ミズリー州セントルイス）から購入した。ε−カプロラクトンは、ランカスター合成社、英国（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＵＫ）から購入した。第一スズ・オクタノエート（ｓｔａｎｎｏｕｓ ｏｃｔａｎｏａｔｅ）は，ＭＰバイオメディカル社、ドイツ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。蛍光性のプローブＤｉＩおよび１，３−（１，１'−ジピレニル）プロパン（１，３−（１，１'−ｄｉｐｙｒｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ）は、モレキュラー・プローブ社、米国）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡ）から購入した。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ２０は、アメルシャム・バイオサイエンスズ、スエーデン）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳｗｅｄｅｎ）から購入した。他の化学薬品はすべて試薬級であった。
【実施例１】
【００５７】
α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの合成
【００５８】
【化９】
【００５９】
三口丸底フラスコ中の無水ジイソプロピルアミン６０．０ｍｍｏｌ（８．４ｍＬ）の無水ＴＨＦ６０ｍＬ溶液にＢｕＬｉ６０．０ｍｍｏｌ（２４ｍＬ）ヘキサン溶液を−３０℃で、アルゴンを絶えず供給しつつ、激しい攪拌下、加えた。該溶液を−７８℃に冷却し、さらに２０分間攪拌し続けた。新たに蒸留したε−カプロラクトン（３０ｍｍｏｌ、すなわち３．４２ｇ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８ｍＬに溶解し、前述の混合物にゆっくり加え、次いで４５分後に、ベンジルクロロフォーメート（３０ｍｍｏｌ、５．１ｇ）を添加した。温度は、１．５時間後０℃まで上昇させ、反応は、飽和塩安溶液５ｍｌで停止させた。反応混合物は水で希釈し、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。合併した抽出液をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。帯黄色の油性の粗製混合物は、ヘキサン：酢酸エチルを３：１、２：１、および１：１の比率で溶離剤として使用して、シリカゲルカラム上で精製した。カラムクロマトグラフィー後、α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（α−ｂｅｎｚｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）が透明な粘性のある油性液体として遊離された。反応収率は５３．８％であった。このものの構造は、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＩＲおよび質量分光法を合わせた分析によって確認した。３００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．６−２．２（ｍ，６Ｈ）；３．７５（ｄｄ、１Ｈ）；４．１３−４．３５（ｍ、２Ｈ）；５．２２６（ｓ、２Ｈ）；７．４（ｓ、５Ｈ）（図１）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２５．８２４、２６．９４、２８．６６３、５０．８８６、６７．３３、６９．３４２、１２８．２３５、１２８．３３６、１２８．４９７、１３５．２３８、１６８．６９５および１７１．６６５ｐｐｍ（図２）。ＩＲデータ（薄膜法）：Ｃ＝Ｃ芳香族変角［振動］：１６２０ｃｍ−１、ラクトンＣ＝Ｏ、１７２５ｃｍ−１、および脂肪族Ｃ＝Ｏ１７６０ｃｍ−１、Ｃ−Ｈ伸縮芳香族：３０２５ｃｍ−１およびＣ−Ｈ伸縮脂肪族の２９７５ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ倍音３４００ｃｍ−１（図３））。質量分析：分子イオン・ピーク：ｍ／ｚ：２４８．９９、Ｍ＋＋Ｎａ：ｍ／ｚ：２７１、Ｍ＋＋Ｋ：ｍ／ｚ：２８７（図４）。
【実施例２】
【００６０】
ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ）ブロック共重合体の合成および特性決定
【００６１】
【化１０】
【００６２】
メトキシポリエチレン（ＭＷ：５０００ｇｍ／ｍｏｌｅ）（３．５ｇ），α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（３．５ｇ）および第一スズ・オクタノエート（単量体当たり０．００２等量）を、予め火焔処理した１０ｍＬアンプルに添加し、窒素でパージし、真空下で封入した。重合反応は、１４０℃で４時間オーブン中で行なった。反応は生成物を室温へ冷却して停止させた。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の調製収率は、９１％であった。α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン単量体のＰＢＣＬへの転化を評価するために、３００ＭＨｚでＣＤＣｌ３中のＰＥＯ−ＰＢＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用い、α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの−Ｏ−ＣＨ２−（δ＝４．２５ｐｐｍ）のピーク強度とＰＢＣＬ（δ＝４．０５ｐｐｍ）の同ピークの強度とを比較した。該ブロック共重合体の数平均分子量も、１ＨＮＭＲスペクトルから、ＰＥＯ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、δ＝３．６５ｐｐｍ）のピーク強度をＰＢＣＬ（−Ｏ−ＣＨ２−、δ＝４．０５ｐｐｍ）（図５）のそれと比較して決定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＯのピーク強度をＰＢＣＬのそれと比較することにより測定した、調製ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の分子量は、９６００ｇ．ｍｏｌ−１（重合度１８）であると計算された。３００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２５−１．９（ｍ、６Ｈ）；３．３−３．４５（ｓ、３Ｈ；ｔｒｉ、１Ｈ）；３．６５；（ｓ、４Ｈ）；４．０５；（ｔｒｉ、２Ｈ）；５．１５；（ｓ、２Ｈ）；７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロックのＩＲスペクトル（薄膜法で調製）は、図６に示す。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロックの特性は表１の中にまとめてある。
【００６３】
【表１】
【実施例３】
【００６４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の合成および特性決定
【００６５】
【化１１】
【００６６】
ＰＥＯ−ＰＢＣＬ１ｇのＴＨＦ溶液２５ｍｌを１００ｍＬ丸底フラスコへ入れた。パラジウム被覆炭（３００ｍｇ）をこの溶液に分散した。その後、フラスコは１０分間真空に引いて排気し、水素ガスを満たした風船を該反応フラスコに接続した。該混合物を磁気撹拌機で激しく攪拌して２４時間水素と反応させた。反応混合物は、触媒を除去するために３０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を集め、減圧下濃縮し、大過剰のジエチルエーテル中で沈殿させ、繰り返し洗浄して副生物のこん跡をすべて除去した。最終生産物を集め、室温で４８時間真空乾燥した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の還元によるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体生成の収率は、６８〜７５％であった。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の３００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ（Ｎ，Ｎジメチルスルホキシド−ｄ６）：δ＝１．２０−１．９（ｍ、６Ｈ）；３．２２−３．３８（ｓ３Ｈ；ｔｒｉ、１Ｈ）；３．５（ｓ、４Ｈ）；４．０３（ｔｒｉ、２Ｈ）（図７）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ（図５）上のベンジルオキシ基に関連する芳香族のピーク（δ＝７．４）およびメチレン基ピーク（δ＝５．１５）は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルにはなかった。（図７）。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＯのピーク強度を、ＰＣＣＬのそれと比較して測定した、調製ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の分子量は、７５３０ｇ・ｍｏｌ−１（重合度、１６）であると計算された。
【００６７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体（図８）のＩＲスペクトル（薄膜法で調製）は、３５００ｃｍ−１から２５００ｃｍ−１までの大きな、幅広いピークを示すが、これは、ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体のＩＲスペクトル中には幅広いピークがないのに比してカルボキシルＯＨの存在を示す（図６および８の比較）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の特性は表１に要約されている。
【実施例４】
【００６８】
ドキソルビシンが結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ（ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ））ブロック共重合体の合成および特性決定
【００６９】
【化１２】
【００７０】
Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（１７．３ｍｇ、０．１５ｍＭ）およびＤＣＣ（３１ｍｇ、０．１５ｍＭ）を、窒素下で、攪拌中のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（２００ｍｇ、０．０３ｍＭ）ブロック共重合体の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物は室温で２時間攪拌した。その後、ＤＯＸ．ＨＣｌ（１７．４ｍｇ、０．０３ｍＭ）およびトリエチルアミン（２１μＬ（０．１５ｍＭ））の無水メタノール（２ｍＬ）溶液を添加、さらに９６時間、反応を継続した。ブタン−１−オール：酢酸：水（４：１：４）を移動相として存在させ、薄層クロマトグラフィーを使用して反応の進行を追跡した。反応混合物を蒸発させて得た残渣は、ＨＰＬＣ級のメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、未反応ドキソルビシンおよび他のすべての副生物も除去するため、ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体を、メタノールを溶離剤として、ｓｅｐｈ ａｄｅｘ ＬＨ ２０カラムを使用して二度精製した。当該ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体を凍結乾燥し、濃厚なオレンジ色の粉末を得た。ＤＯＸ分子とブロック共重合体との結合は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認したが、その際、遊離ドキソルビシンは溶媒で溶出し、Ｒｆ値０．６８のスポットを示した（図９で矢印１を参照）が、重合体と結合したドキソルビシンは、溶出せず、ベースライン（基線）（図９で矢印２を参照）に留まった。ＨＰＬＣクロマトグラムは、さらにＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体に遊離ＤＯＸが存在しないことを示している（図１７）。
【００７１】
ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）の３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（Ｎ，Ｎジメチルスルホキシド−ｄ６）は、ＤＯＸ特有のピーク（図１０）を示す：δ：７．９ｐｐｍ、δ：３．６ｐｐｍ、δ：３．３ｐｐｍ、δ：１．２ｐｐｍ。前記重合体中の結合したＤＯＸの量は、紫外−可視分光法で測定され、５．４％（ｗ／ｗ）であった。調製したブロック共重合体の特性は表２に要約されている。前記重合体中の結合したＤＯＸの量は、４８５ｎｍで紫外分析で測定すると５．４％（ｗ／ｗ）であった。１Ｈ ＮＭＲに基づいて計算された当該数平均分子量は、８８００ｇ／ｍｏｌであることが判明し、ＧＰＣクロマトグラムは、幅広い分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．７）を示した。表２中の結果は、３工程のプロセスの間に、ＰＣＬに基づくブロックの分子量に大きな減少がなかったことを示す。
【００７２】
【表２】
【実施例５】
【００７３】
ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の集合
（ｉ）一般的手法
ミセル化は、調製したブロック共重合体（３０ｍｇ）をアセトン（０．５ｍＬ）に溶解し、２５℃で緩やかな攪拌下、重合体溶液を２回蒸留した水（３ｍＬ）に滴下（〜１滴／１５秒）し、アセトンを真空下蒸発させて行なった。
【００７４】
（ｉｉ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセル粒径の測定
調製したミセルの平均直径および粒度分布は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度でマルバーン・ゼータサイザー３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセルについては、平均直径が２８．４の±４．７６と１９．９±２．２６ｎｍであると測定された。ミセルの母集団の多分散度は、２種のブロック共重合体ミセルについてそれぞれ０．３９と０．９であった（図１１：（Ａ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよび（Ｂ）ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、および表１を参照）。
【００７５】
（ｉｉｉ）透過電子顕微鏡法
１〜１．５ｍｇ／ｍｌの重合体濃度のミセル溶液（２０μＬ）の水滴を、一滴銅被覆グリッドの上に置いた。グリッドは、コロイド性凝集物が沈降できるように２０秒間水平に保持した。次いで、燐タングステン酸（ＰＴＡ）の２％ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）溶液を一滴添加して、ネガティブ染色（ステイン）を得た。１分後余分の液体を濾紙で除いた。次いで、該試料は、自然乾燥させ、日立Ｈ７００型透過型電子顕微鏡に装着した。イメージは、７５ｋＶ、１８０００倍の倍率で得た。図１２はＰＥＯ−ＰＢＣＬミセル（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセル（Ｂ）を示す。図１２に示す縮尺目盛りは２００ｎｍに相当する。ＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルは、６２ｎｍの平均粒径を有し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは、２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００７６】
（ｉｖ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の臨界ミセル濃度およびコア粘性の測定：
種々の濃度のブロック共重合体の存在下、ピレンの蛍光励起スペクトルの変化を用いて、ＣＭＣを測定した。ピレンはアセトンに溶解し、最終溶液が６×１０−７Ｍの濃度になるよう５ｍＬメスフラスコに加えた。次いで、アセトンを蒸発し、０．０５〜５０００μｇ／ｍＬの濃度範囲の重合体のミセル水溶液で置換した。試料は１時間６５℃で加熱し、一夜室温に冷却し、蛍光測定に先立って酸素を窒素ガスで除去した。各試料のピレンの励起スペクトルは室温で、バリアン・キャリー・エクリプス蛍光分光光度計（オーストラリア、ビクトリア）（Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を用いて得た。走査は、中速度（６００ｎｍ／分）、およびＰＭＴ検知器電圧５７５Ｖで行なった。発光波長および励起／発光スリトは，それぞれ３９０ｎｍおよび５ｎｍに設定した。３３４ｎｍ対３３９（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬでは３３７）ｎｍのピークの強度比を共重合体濃度の対数に対してプロットした。ＣＭＣは、ミセル化開始時の強度比（Ｉ３３９／Ｉ３３４）の鋭い立ち上がりから測定した（表３）。
【００７７】
【表３】
【００７８】
ミセルのコアの粘性は、それぞれ３７３および４８０ｎｍでの１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルから、エキシマー対単量体の強度比（Ｉｅ／Ｉｍ）を測定することにより求めた。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンは、２×１０−７Ｍの最終濃度を与えるように既知容量のクロロホルムに溶解した。次いで、クロロホルムを蒸発させ、１０００μｇ／ｍＬの濃度のＰＥＯ−ＰＢＣＬまたはＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬのミセルの溶液５ｍＬで置換した。試料は１時間６５℃に加熱し、一夜室温に冷却した。蛍光測定に先立って、試料から酸素を除去するのに窒素ガス気流を使用した。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルは、室温で３３３ｎｍの励起波長を使用し、励起／発光スリットを５ｎｍにセットして得た。走査は、中速度（６００ｎｍ／分）、およびＰＭＴ検知器電圧６７５Ｖで行なった。発光波長および励起／発光スリトは，それぞれ３９０ｎｍおよび５ｎｍに設定した。ピレンの励起スペクトルから、３３４ｎｍピークに対する３３９ｎｍのピークの強度比の鋭い立ち上がりは、ブロック共重合体に対するミセル化（ＣＭＣ）の開始を示す。この方法を用いてＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の平均ＣＭＣは、それぞれ０．９４および９１．６７μｇ／ｍＬと計算された。調製したミセルに対する１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルから得たＩｅ／Ｉｍ比率（０．０２５〜０．０２８）が非常に低いのは、疎水性コアの高い粘性を反映している。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンは、３９０ｎｍで励起時４８０ｎｍで発光する分子内ピレン・エキシマーを生成する。重合体のミセルのコア内のように非常に粘性の高い環境では、エキシマー生成は制限されるのである。
【００７９】
（ｖ）ＤｉＩ（蛍光性プローブ）を担持したＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルの調製
蛍光性ラベルを付した重合体のミセルを調製するのに、疎水性の蛍光性プローブ（ＤｉＩ）をＰＥＯ−ＰＢＣＬミセル中に物理的に取り込ませる方法を使用した。ＤｉＩ（１０μｇ／ｍＬ）および共重合体（１０ｍｇ／ｍＬ）を、アセトン（０．５ｍＬ）に溶解した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体ミセルの存在下、ＤｉＩをＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルによって、前記疎水性色素の沈殿する兆候なく可溶化させるのに成功した。この溶液を水３ｍｌに滴下し、有機溶媒の残りを真空蒸発で除去した。ミセル溶液を５分間１１，６００×ｇで遠心分離にかけＤｉＩ沈殿を除去した。
【実施例６】
【００８０】
α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの合成
【００８１】
【化１３】
【００８２】
６０．０ｍｍｏｌ（２４ｍＬ）のＢｕＬｉヘキサン溶液を、アルゴンの供給を継続下、激しく攪拌しながら−３０℃で、三口丸底フラスコ中の６０．０ｍｍｏｌ（８．４ｍＬ）の無水ジイソプロピルアミンの無水ＴＨＦ溶液４５ｍＬにゆっくり加えた。該溶液を−７８℃に冷却し、さらに２０分間攪拌を続けた。新たに蒸留したε−カプロラクトン（３０ｍｍｏｌ、３．４２ｇ）を無水ＴＨＦ８ｍＬに溶解し、上記の混合物にゆっくり添加し、次いで４５分後に、コレステリルクロロフォーメート（３０ｍｍｏｌ、１３．４７ｇ）を添加した。１．５時間後、温度を０℃に上げ、反応を飽和塩安溶液５ｍｌで停止させた。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。合併した抽出液は、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発した。この帯黄色の固形粗製混合物はヘキサン：酢酸エチルを３：１の比率で溶離剤として使用して、シリカゲルカラム上で精製し、固体の白色粉末を得た。集めた画分は、クロロホルム；ヘキサンとクロロホルム；メタノール溶剤システムを使用して、溶媒−溶媒抽出で再び精製し、純粋な固体の白色粉末を得た。
【００８３】
カラムクロマトグラフィー後、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンを白色固体の粉末として遊離した。反応収率は約５０％であった。その構造は、１Ｈ ＮＭＲ、ＩＲおよび質量分光法を併用した分析で確認した。
３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝６８１（ｓ、３Ｈ）δ：０．８６−１．７；（ｍ、３６Ｈ）δ：１．８−２．１；（ｍ、１２時間）δ：２．３５；（ｍ、２Ｈ）δ：３．６６（ｄｄ、１Ｈ）（δ：４．１３）−４．３５（ｍ、２Ｈ）；δ：４．７（ｍ、１Ｈ）δ：５．３８（ｓ、２Ｈ）（図１３）。
【００８４】
コレステリルクロロフォーメートのＩＲスペクトルが、１７７５ｃｍ−１にわずか１本の鋭いバンドしか示さない（図示せず）ものであるのに比して、ＩＲスペクトル（図１４）は、２本の隣接したバンドを１７２５ｃｍ−１および１７５０ｃｍ−１に示すが、これは、２つのカルボニル基の存在を示す。
質量分析：ピークス：Ｍ＋ｍ／ｚ：５２６．７６；Ｍ＋＋Ｎａ：ｍ／ｚ：５４９．１５；Ｍ＋＋Ｋ＝ｍ／ｚ：５６５．０９（図１５）。
【実施例７】
【００８５】
ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬ）ブロック共重合体の合成および特性決定
【００８６】
【化１４】
【００８７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬは、メトキシポリエチレンオキサイドを開始剤とし、第一スズ・オクタノエートを触媒として使用し、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの開環重合によって合成した。前記ブロック共重合体の調製図式は、上記の図式に示されている。メトキシポリエチレン（ＭＷ：５０００ｇｍ／ｍｏｌｅ）（３．５ｇ），α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（３．５ｇ）および第一スズ・オクタノエート（単量体当たり０．００２等量）を、予め火焔処理した１０ ｍＬアンプルに添加し、窒素でパージし、真空下封入した。重合反応は、１６０℃で３時間オーブン中で行なった。反応は生成物を室温へ冷却して停止させた。
【００８８】
α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン単量体のＰＣｈＣＬへの転化を評価する為、３００ＭＨｚでＣＤＣｌ３中のＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用い、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの−Ｏ−ＣＨ２−（δ＝４．２８ｐｐｍ）のピーク強度とＰＣｈＣＬ（δ＝４．１０ｐｐｍ）の同ピークの強度とを比較した。該ブロック共重合体の数平均分子量も、１ＨＮＭＲスペクトルから、ＰＥＯ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、δ＝３．６５ｐｐｍ）のピーク強度をＰＣｈＣＬ（−Ｏ−ＣＨ２、δ＝４．１０ｐｐｍ）（図１６）のそれと比較して決定した。
【００８９】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の調製収率は、５０％であった。３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６８１（ｓ、３Ｈ）δ：０．８６−１．７；（ｍ、３６Ｈ）δ：１．８−２．１；（ｍ、１２時間）δ：２．３；（ｍ、２Ｈ）δ：３．２８、δ：４．１０（ｍ、２Ｈ）（ｔｒｉ、１Ｈ）；δ：４．６５（ｍ、１Ｈ）δ：５．３８（ｓ、２Ｈ）（図１６）。ＰＥＯのピーク強度を１Ｈ ＮＭＲスペクトル中のＰＢＣＬのそれと比較することにより測定した、調製ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の分子量は、７６３３ｇ．ｍｏｌ−１であると計算された。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体（図１６）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、α‐カプロラクトン環に属するプロトンが単量体の１Ｈ ＮＭＲ（図１３）に比してより高磁場にシフトを示す、つまり、Ｏ−ＣＨ２のδ：４．２８（ｍ、２Ｈ）ピークはδ：４．１０にシフトし、Ｏ＝Ｃ−ＣＨのδ：３．６６（ｄｄ、１Ｈ）は、３．２８ｐｐｍにシフトする。これらのシフトは、α−コレステリル・カルボキシレート−ε−カプロラクトンの開環重合によるＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の生成を示す。
【実施例８】
【００９０】
ＨＰＬＣ測定
ＨＰＬＣは、ウォーターズ６２５ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６２５ ＬＣ）システムを使用して４０℃、１．０ｍＬ／分の流量で、実施した。検出は可変Ｗａｔｅｒｓ４８６吸光度検知器を用い４８５ｎｍの吸収で行なった。逆相クロマトグラフィーは、２０μｌの試料で、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液およびアセトニトリルを使用する勾配溶離剤（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｅｎｔ）で、ウォーターズ１０μｍ Ｃ１８−１２５Åカラム（３．９×３００ｍｍ）を用いて実行した。
【実施例９】
【００９１】
ＤＯＸ担持ミセルの調製および自己集合構造物の特性決定
ＤＯＸを担持したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルを溶媒蒸発法で調製した。簡潔に言えば、ブロック共重合体（１０ｍｇづつ）をＤＯＸ１ｍｇおよびトリエチルアミン２０μｌ含有のＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解した。その後、緩やかな攪拌下、当該溶液を２回蒸留した水（１０ｍＬ）に滴下し、次いでＴＨＦをゆっくりと蒸発させて、ミセルを生成した。室温で４時間攪拌後、真空を引き，確実に有機溶媒を完全に除去した。ＤＯＸが天然において、両親媒性なので、生じたミセル溶液は、大量の取り込まれていないＤＯＸを含んでいるので、これを、さらに使用する前に蒸留水（スペクトラポール（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）、カットオーフ分子量、３，５００ダルトン）に対して徹底的に透析で除去した。
【００９２】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体から調製したミセルの特性は、表４にまとめてある。すべての重合体のＤＯＸ担持量およびカプセル化効率は、表５にまとめてある。コア機能化ミセル中のＤＯＸ担持量は、非機能化ミセルＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬより、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ（２．５倍）およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）（２倍）ミセルにおいて著しく高かった（表５）。
【００９３】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルの計算ドキソルビシン担持量およびカプセル化効率は、それぞれ２．０％［Ｍ（ＤＯＸ）／Ｍ（ＣＬ）比率］および４８．３％であることが判った。芳香族基含有ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬブロック共重合体は、ベンジル・カルボキシレート基の存在によりＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬブロック共重合体より著しく高いＤＯＸ担持量（２．５倍）を示した。カルボキシル基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬでは、担持量が僅かに増加を示した（１．３倍）が、その一方でＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体へのＤＯＸの結合により、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体の担持量を２倍増加させることができた。
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【実施例１０】
【００９６】
粒度分布およびＤＯＸの担持量および担持効率
調製したミセルの平均直径および粒度分布は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度でマルバーン・ゼータサイザー３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した。ＤＯＸの担持量および担持効率は、ミセル水溶液のアリコート（一定分量）（２００μＬ）を採り、ＤＭＳＯで５倍に希釈して自己集合した構造物を崩壊し、紫外−可視分光光度計を使用し、４８５ｎｍの吸収を測定して決定した。検量線は、異なる濃度の遊離ＤＯＸを使用して構築した。ＤＯＸ担持およびカプセル化効率は次の方程式から計算した。
【００９７】
【数１】
【実施例１１】
【００９８】
機能化および非機能化ミセルからのＤＯＸの放出
ＤＯＸ担持ミセル溶液（１５ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）は、上記の方法により、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体から調製した。ミセル試料を透析バッグ（ＭＷカットオーフ：３，５００Ｄａ，米国スペクトラム・ラボラトリーズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）製）へ移した。該透析バッグは、５００ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）または５００ｍＬのアセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）中に入れた。放出試験は３７℃で，ＪｕｌａｂｏＳＷ２２振盪水浴（ドイツ製）中で行なった。紫外−可視分析用に、選択した時間間隔で該透析バッグ内から２００μＬのミセル溶液を抜き取った。ＤＯＸ濃度は４８５ｎｍｄｅの吸光度強度に基づいて計算した。
【００９９】
種々異なる処方からのＤＯＸ放出状況は、７２時間以内に３７℃でリン酸塩（ｐＨ：７．４、０．１Ｍ）および酢酸塩（ｐＨ：５．０、０．１Ｍ）緩衝液中で透析膜を使用して調べた。図１８に示すように、ｐＨ７．４（Ａ）におけるミセルからのＤＯＸ放出は、ｐＨ５．０（Ｂ）での放出に比して、はるかに遅かった。これらの結果は、両ｐＨで、重合体のミセルからのＤＯＸ放出挙動が共重合体の組成によって強く影響されることを示唆する。芳香族基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬは、ｐＨ５．０で、担持ＤＯＸの放出がＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬよりはるかに遅いことを示す（それぞれＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルのＤＯＸで、１２時間後のＤＯＸ放出は、１５対２７％で、４８時間後のＤＯＸ放出は、３２対５０％）。
【０１００】
さらに、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬミセルは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに比べて、生理学的ｐＨで放出を効率よく減少させることができた（それぞれＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬミセルとＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルで、１２時間後のＤＯＸ放出は、１０％対１８％；４８時間後のＤＯＸ放出は、２２％対３０％）。カルボキシル基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは、非機能性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルより放出が速いことを示した。ｐＨ５．０でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセルからのＤＯＸ放出は、１２および４８時間後にそれぞれ３５および５６％であった。ｐＨ７．４で、同一時点でＤＯＸ放出はそれぞれ１９および３２％であった。重合体主鎖ののＤＯＸの結合（コンジュゲーション）で、それぞれｐＨ５．０および７．４で４８時間培養後にそれぞれ、僅か７および８％放出する結果となったが、一方、物理的に担持されたＤＯＸは、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルからより速く放出した。このシステムからのＤＯＸの放出挙動は、両ｐＨでのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルからのＤＯＸ放出に類似していた。
【実施例１２】
【０１０１】
ラット赤血球に対するインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）溶血
スプラーグドーリー・ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ）由来の心臓を穿刺して新たに血液を取得し、無菌、等張ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と混合し、５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液をピペットで取り出し、赤血球を等張無菌のＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で希釈した。適切な希釈比は、赤血球を０．１％のトリトンＸ１００で溶解後上澄液中のヘモグロビンの５７６ｎｍにおける紫外−可視吸光度から求めた。赤血球を適切に希釈した試料は、吸光度が０．４〜０．５であった。種々の重合体濃度の、３種の異なったブロック共重合体、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、並びにＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）のミセルの溶液およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）と結合したＤＯＸの同様の濃度の遊離ＤＯＸ溶液を、希釈した赤血球懸濁液（２．５ｍｌ）と共に３７℃で３０分間培養した。培養後、試料はさらに溶血するのを停止するために氷浴に保持した。完全な赤血球細胞を沈殿させるために、試料は、３０秒間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を分離し、紫外−可視分光光度計によって５７６ｎｍでヘモグロビンを分析した。溶血した赤血球の百分率は次式で計算した：溶血％＝１００（Ａｂｓ−Ａｂｓ０）／（Ａｂｓ１００−Ａｂｓ０）、ここで、Ａｂｓ、Ａｂｓ０およびＡｂｓ１００は、それぞれ、試料、重合体もＤＯＸも不含の対照、および０．１％のトリトンＸ１００を含む対照の吸光度である。
【０１０２】
インビトロ溶血試験は、前記合成重合体の生体適合性を測定する方法として使用した。図１９に示すように、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣｌ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体ミセルをラット赤血球（ＲＢＣ）と行なった培養では、問題となる程度の溶血を示さなかったが、一方、０．１％のトリトン−Ｘ１００では、１００％の溶血が起こった。重合体の最高濃度（５００μｇ／ｍｌ）では、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣｌ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体の溶血％は、それぞれ２．７、２．５、２．４、０．０８および０．５％であった。しかし、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）は、最高重合体濃度（５００μｇ／ｍｌ）である程度の溶血（１３％）を示した。特に、遊離ＤＯＸは、同等なＤＯＸ濃度（２７．５μｇ／ｍｌ）で同程度の溶血（１１％）を示した。
【実施例１３】
【０１０３】
マウス黒色腫Ｂ１６−ＢＬ６細胞に対するインビトロ細胞毒性
Ｂ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対するＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性をＭＴＴアッセイを使用して調べた。細胞は、ウシ胎児血清１０％、Ｌ−グルタミン１％ｗ／ｖ、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０完全成長培地中で成長させ、５％ＣＯ２組織培養器中で３７℃に保持した。対数増殖期に細胞を採取し、９６ウエル・プレートに５×１０３細胞／ウエルの密度で、ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌとして播種した。２４時間後、細胞が付着した時、種々の異なる濃度のＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）、ＤＯＸ担持ＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルおよび遊離ＤＯＸを前記細胞と共に２４および４８時間培養した。次いで、各々のウエルにＭＴＴ溶液（２０μｌ；滅菌−濾過ＰＢＳ）を添加し、該プレートをさらに３時間再培養した。該フォルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解し、その濃度を、パワーウエイブＸ３４０ミクロプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒ ＷａｖｅＸ３４０ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（バイオ−テック機器社、米国、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）により５５０ｎｍで読み取った。
【０１０４】
図２０に示すように、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルのＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する細胞毒性を２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の両培養時間測定した。細胞の５０％を死滅させるＤＯＸ濃度（５０％阻害濃度（ＩＣ５０））は、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルの場合、それぞれ２４および４８時間培養で、４．１５および０．４５μｇ／ｍｌであった。２４時間で、ＤＯＸを結合した重合体（ＩＣ５０：１．５４μｇ／ｍＬ）と比べて、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルに物理的に担持させたＤＯＸは、３倍高い細胞毒性を示した。物理的にカプセル化したＤＯＸと化学的に結合したＤＯＸは、４８時間の培養後に、Ｂ１６―ＢＬ６細胞に対して同等の細胞毒性（ＩＣ５０：０．４４μｇ／ｍＬ）を示した。遊離ＤＯＸのＩＣ５０計算値は、それぞれ２４および４８時間培養で、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルより５０倍および１５倍低かった。重合体ミセルがインビトロで親化合物より高いＩＣ５０値を示したのは、細胞内取り込みおよび継続放出が、遊離薬物の迅速な拡散および即時の作用と比べて、より遅いので驚くべきことではない。
【実施例１４】
【０１０５】
繊維芽細胞に対するインビトロ細胞毒性
上記の方法により、ＭＴＴアッセイを使用して、ヒトの繊維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体のインビトロ細胞毒性活性を２４時間調査した。
【０１０６】
調製した前記重合体の生体適合性を評価するために、ヒトの繊維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体のインビトロ細胞毒性を、正常な細胞のモデルとして調べた。図２１に示すように、共重合体の存在下での繊維芽細胞の培養では、すべての共重合体濃度（５〜５００μｇ／ｍＬの範囲）において、９０％を超過する相対的な細胞生存率という非常に低い細胞毒性の結果を得た。すべてのブロック共重合体の最高共重合体濃度でさえ、対象に比して２４時間の培養期間後の細胞生存率は、著しく減少することはなかった。
【実施例１５】
【０１０７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体による、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）のカプセル化
ＣｓＡの重合体ミセル中のカプセル化は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（１０ｍｇ）およびＣｓＡ（３ｍｇ）を、アセトン（０．１６７ ｍＬ）に溶解する共溶媒蒸発法で達成した。当該有機溶媒溶液を攪拌中の蒸留水（１ ｍＬ）へ滴下（１滴／１５秒）した。残留アセトンは、室温で真空下蒸発して除去した。カプセル化工程の終了後、該コロイド溶液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ＣｓＡの沈殿物を除去した。
【０１０８】
調製した重合体ミセルの水媒質中の平均直径および多分散度は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度で動的光散乱（３０００ＨＳＡゼータサイザー・マルバーン、マルバーン・インストルメント株式会社、英国）（３０００ＨＳＡ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｍａｌｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって測定した。
【０１０９】
ブロック共重合体ミセル中のＣｓＡのカプセル化レベルは、下記のように測定した。ミセルの水中の一定量を３倍量のアセトニトリルで希釈して自己集合型構造を分解した。ＣｙＡのカプセル封入量は、逆相ＨＰＬＣを使用して測定した。該ＨＰＬＣ機器は、ケムメイト（Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅ）ポンプおよび自動試料採取器から成り立っていた。ＨＰＬＣシステムは、ＫＨ２ＰＯ４（０．０１Ｍ）、メタノールおよびアセトニトリル（２５：５０：２５）の移動相を備えたＬＣ１カラム（サプレコ（Ｓｕｐｌｅｃｏ））を装備していた。流量およびカラム温度は、それぞれ１ｍＬ／分および６５℃（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ＣＨ３０カラム・ヒーター）に設定した。ＣｙＡ濃度は１００μＬ注入後に２０５ｎｍ（ウォーターズ４８１（Ｗａｔｅｒｓ４８１））で、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）を内部標準料として用いて測定した。検量用試料は０．１−１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で調製した。各実験は三回繰り返し行なった。ＣｙＡ担持率およびカプセル化効率は次の方程式から計算した。
【０１１０】
【数２】
【０１１１】
ＣｓＡ担持ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬの特性を表６に示す。５０００−５０００ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコロイド分散物は、平均直径４３．９ｎｍと中程度の多分散指数（０．３８）示した。５０００−２５３０ ＰＥＯ―ｂ−ＰＣＣＬの集合で形成したナノ構造の直径は、６６ｎｍで，その多分散指数は０．２５であった。ＣｓＡは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルによって水媒体中１．３０７ｍｇ／ｍＬのレベル（ＣｓＡ対重合体重量の比率、０．１３０７ｍｇ／ｍｇ）に達した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは，ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに比して（対応のないスチューデントｔ−検定で、ｐ<０．０５）、より著しく高い量のＣｓＡを担持した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセル中のＣｓＡの担持レベルは、２．１３１ｍｇ／ｍＬ（ＣｓＡ：重合体重量比率、０．２１３１ｍｇ／ｍＬ）に達した（表６）。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
本発明は、現在好ましい例と考えられる実施例に就いて記載したが、当該発明は開示した実施例に限定されないことを理解されるものとする。それに反して、本発明は、別記の特許請求の精神および範囲内に含まれる種々の変更および等価な構成を包含することを意図するものである。
【０１１４】
本明細書においては、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照によってその全体を特定して個別に組み入れるよう示されている場合と同程度に、刊行物、特許および特許出願はすべて参照によってそれらの全体を組み入れるものである。本出願中の用語が、参照によってここに組み入れた文書では異なって定義されていると判明した場合は、本明細書に提供した定義をその用語の定義とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
以下に、本発明を図面を参照して記載する。
【図１】図１は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンのＩＲスペクトルである。矢印は、特性基の存在を示す。
【図４】図４は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの質量スペクトルである。
【図５】図５は、ポリ（エチレンオキサイド）ーブロック−ポリ（α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ＰＢＣＬ）ブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトルである。
【図６】図６は、ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体のＩＲスペクトルである。
【図７】図７は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６）スペクトルである。矢印は、芳香族のピークの欠如を示す。
【図８】図８は、ポリ（エチレンオキサイド）ーブロック−ポリ（α−カルボン酸塩−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ）ブロック共重合体のＩＲスペクトルである。矢印は、広幅のピークの存在を示す。
【図９】図９は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）分子とＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体との結合体の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）である。スポット１は対照としての遊離ドキソルビシンであり、スポットは２は、ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体である。
【図１０】図１０は、メチルスルホキシドｄ６中のＤＯＸが結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。矢印は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体担持のＤＯＸ特有ピークを示したものである。
【図１１】図１１は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ｂ）ブロック共重合体ミセルの粒度分布を示したものである。
【図１２】図１２は、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ｂ）ブロック共重合体から調製されたミセルのＴＥＭイメージを示したものである。イメージは７５ｋＶの電圧設定で１８０００倍で撮影した。図示スケールの線は２００ｎｍに相当する。ＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルの平均粒度は、６２ｎｍ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルの平均粒度は、２０ｎｍである。
【図１３】図１３は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１４】図１４は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンのＩＲスペクトルである。矢印は、特性基の存在を示す。
【図１５】図１５は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの質量スペクトルである。
【図１６】図１６は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１７】図１７は、メタノールに溶解した遊離ＤＯＸ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）（Ｂ）の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムである。ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体中遊離ＤＯＸの欠如を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、異なるｐＨでの遊離ＤＯＸおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくミセル中にカプセル化したＤＯＸのインビトロ放出プロフィールを示したものである。（Ａ）ｐＨ５．０。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、異なるｐＨでの遊離ＤＯＸおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくミセル中にカプセル化したＤＯＸのインビトロ放出プロフィールを示したものである。（Ｂ）ｐＨ７．４。
【図１９】図１９は、ラット赤血球に対して、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０によって引き起こされた溶血を示したものである。各実験は三回繰り返され、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２０Ａ】図２０は、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）培養後のＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２０Ｂ】図２０は、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）培養後のＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２１】図２１は、ヒト線維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ＣＯ−ＰＣＣＬ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ＣＯ−ＰＣＣＬ１０のインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年３月２１日付で出願された米国特許仮出願番号第６０／７８３，８３７号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、新規のポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体、特にポリエステルブロック上に反応性グループおよび／または生物活性化合物を持つポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体に関連する。本発明は、さらに、生物活性剤送達（デリバリー）用の前記組成物およびその使用法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
両親媒性のブロック共重合体は、ナノ規模のコア（内核）／シェル（外殻）構造に自己会合ができ、その疎水性コアが医薬、タンパク質、またはＤＮＡのカプセル化用のミクロ貯蔵庫の役割を果たし、該親水性シェルは媒体と相互作用する。薬物送達用に設計された種々のブロック共重合体の中で、ポリエチレンオキサイド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ：ＰＥＯ）をシェル生成ブロックとし、ポリエステルまたはポリアミノ酸（ｐｏｌｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：ＰＬＡＡ）をコア生成ブロックとするものが注目を浴びている。これは、ＰＥＯが生体適合性であり、更にポリエステルおよびＰＬＡＡの生分解性であるため、それによってヒト投与用に安全となる。
【０００４】
ポリアミノ酸（ＰＬＡＡ）は、薬物、薬物適合成分、遺伝子、または知的ベクトルとアミノ酸鎖上のアミンまたはカルボン酸のような遊離官能基を通して共有または静電気的結合生成の可能性があるので、ポリアミノ酸（ＰＬＡＡ）構造は、ポリエステル類より有利であることが知られている。したがって、疎水性／親水性ブロックの長さ、側鎖の化学構造および置換の程度を変えることを利用して、所望の安定性、生物分解、薬物担持、放出、または活性化特性を達成できる。
【０００５】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡに基づくミセルのコア構造の化学操作によって、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ、メトトレキサート、シスプラチンおよびパクリタクセルの所望送達特性が達成された。例えば、ＰＥＯ−ｂ−ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）とＤＯＸとの結合物（コンジュゲート）から生成するミセルの安定性を向上させるのに、ＤＯＸ置換４０〜５０％で、ＰＥＯに対するＰ（Ａｓｐ）ＤＯＸの割合を減少させることを利用した。後にＤＯＸを物理的にカプセル化するのに、ＰＥＯ−ｂ−ＰＡｓｐ−ＤＯＸミセルを用いた。化学的に結合した薬物と物理的にカプセル化された薬物との強い相互作用を利用して、ドキソルビシンに対して効率的な可溶化と放出特性とを備えた新規の製剤が開発され、現在日本で臨床試験中である（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｙ，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｕｒａ Ｔら、「ミセルにカプセル化（内包）されたドキソルビシンであるＮＫ９１１のフェーズＩ臨床試験および薬物動態学の評価」を参照）。（Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ９１１，ａ ｍｉｃｅｌｌｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ．）Ｂｒ Ｊ ＣａＮＣｅｒ（２００４）９１（１０）：１７７５−１７８１）。
【０００６】
本発明者もまた、以前に、脂肪族系薬物、アンフォテリシンＢ（ＡｍＢ）をカプセル化するのにコア中に飽和脂肪酸エステル類を持つＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡに基づくミセルのシステムを調製した。これがＡｍＢ放出速度を有効に保持できるように、ミセルのコアを化学的に微調整した（参照、Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ Ａ，Ｓａｍｕｅｌ Ｊ，Ｋｗｏｎ ＧＳ：ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（Ｎ−アルキルステアレートＬ−アスパルトアミド（ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ））のミセル： 薬物送達用リポタンパク質の合成類似体（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ Ａ，Ｓａｍｕｅｌ Ｊ，Ｋｗｏｎ ＧＳ：Ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（Ｎ−ａｌｋｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ Ｌ−ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）：ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ （２０００））。理論によって限定されることを望まないが、例えば、エステル結合のようなより加水分解性結合の生成によって、薬物放出特性が十分なミセルを生成するのに、ミセル生成ブロック共重合体−薬物複合体が使用可能であると思われる。この手法を利用してＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡＡにメトトレキサート（ＭＴＸ）を付加させた。ＭＴＸの付加量で重合体ミセルの安定性および薬物放出速度を規制するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新規の重合体であるポリアミノ酸の設計、合成および発見で進歩があった一方、これらの種々の構造物の生分解性は完全には追求されていない。ポリエステル類は、一般に、ヒトに安全に応用した歴史があったとはいえ、該重合体の主鎖上に官能基を欠くために化学操作にはそれほど適していない。したがって、依然として生分解性があり、多数の生物活性剤と生体適合性であるＰＥＯ−ｂ−ポリエステルブロック共重合体を継続して設計し、開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリエステルブロック上に反応性または機能的な側鎖グループを内に持つポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体であって、生分解性があり、多数の生物活性剤と生体適合性である、かかる共重合体を提供する。本発明は、さらに本発明の機能化されたポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体が、生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成を提供する。さらに、本発明は、機能化された本発明のポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体を生物活性剤を送達用に使用する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明は化学式Ｉの化合物に関連し、
【００１０】
【化３】
【００１１】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖとｗは、互いに独立し、１〜４から独立に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または複環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００１２】
本発明の機能化ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体のカプロラクトン残渣は、ランダムまたはブロック状に組み立てることができる。例えば、ランダムに組み立てたコアでは、置換および非置換カプロラクトン残渣は共にコア・ブロックの長さ方向にランダムに配置される。ブロックに組み立てた場合、置換カプロラクトンのブロックは、非置換カプロラクトンのブロックに続いていても（または逆でも）よい。別の場合では、カプロラクトン残渣はすべて置換されている。
【００１３】
発明の別の態様では、本発明の機能化ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（エステル）ブロック共重合体生成に有用な機能化カプロラクトン単量体を提供する。従って、本発明は式ＩＩの化合物に関連する。
【００１４】
【化４】
【００１５】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の基３個が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は、さらに式Ｉと生物活性剤であって、化学式Ｉの化合物が生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成に関連する。該発明のより特別な態様では、式Ｉの化合物が、化学的結合、静電気的結合、および物理的カプセル化のうち１若しくはそれ以上によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。該発明の別の態様では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００１７】
有効量の生物活性剤の周囲にミセル生成可能な化学式Ｉの化合物を被検者に投与することを含む、生物活性剤を被検者に送達する方法も、本発明の範囲内にある。より具体的には、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００１８】
本発明、及び先行技術に勝って達成された利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を上述した。当然ながら、当該発明のいかなる具体的なの態様によってでも、そのような目的または利点が必ずしもすべて達成されなくても良いことは理解される。したがって、例えば、本願明細書に教示されるような１つの利点または幾つかの利点のグループを達成または最適化するように、当業者であれば、本願明細書に教示または提案されているような他の目的または利点を必ずしも達成せずに、当該発明を具体化または実行できることが判るであろう。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかし、発明の要旨の範囲内の種々の変更および修飾が、この詳細なる説明から当業者に明白になるため、当該詳細な説明および特定の実施形態は、発明の好ましい態様を示す一方、説明の為だけに記載されていることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
次の定義は、別記のない限り、本発明のすべての実施形態および態様に該当する。
【００２１】
本願明細書で使用される用語「Ｃ１−２０アルキル」は、炭素原子を１〜２０個含む直鎖および／または分岐アルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含む。
【００２２】
本願明細書で使用される用語「Ｃ３−２０シクロアルキル」は、炭素原子を３〜２０個含む飽和環式アルキル基を意味し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等を含む。
【００２３】
本願明細書にて使用される用語「アリール」は、１個または２個の芳香環および炭素原子を６〜１４個含む、単環式または二環式炭素環式システムを意味し、フェニル、ナフチル、アンスラセニル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニイル、インダニル、インデニルなどを含む。
【００２４】
本願明細書にて使用される用語「Ｃ２−６アルケニル」は、炭素原子２〜６個および二重結合を１〜３個含む直鎖および／または分岐鎖アルケニル基を意味し、ビニール、アリル、１−ブテニル、２−ヘキセニルなどを含む。
【００２５】
本願明細書にて使用される用語「Ｃ２−６アルケニルオキシ」は、炭素原子２〜６個および二重結合を１〜３個含む直鎖および／または分岐鎖アルケニルオキシ基を意味し、ビニールオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ヘキセニルオキシなどを含む。
【００２６】
本願明細書にて使用される用語「アルキニレン」は、特定の数の炭素を含む二官能直鎖および／または分岐アルキル基を意味する。
【００２７】
本願明細書にて使用する用語「ハロ」はハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、アイオド等を含む。
【００２８】
本願明細書にて使用される用語、「有効量の」薬剤は、有益または所望の、臨床結果を含む結果を得るのに十分な量を意味するが、このようなものとして、「有効量」は、用語が適用されている情況に依存する。例えば、薬物の役割をする薬剤を投与する情況では、有効量の薬剤は、例えば、当該薬剤の投与なしで得られた応答と比較して、治療上の応答を達成するのに十分な量である。
【００２９】
本願明細書にて使用される用語「対象」は、ヒトを含む動物界の全員を含む。被験者は、好ましくはヒトである。
【００３０】
本願明細書にて使用される用語「生分解性」は、物質を、可溶化、加水分解、または、酵素および他の有機体の生成物でもよい生物形成体の作用によってより簡単な中間体または最終生産物へ転化することを意味する。
【００３１】
本願明細書にて使用される用語「生体適合性」は、物質、または物質の可溶化、加水分解、または、酵素および他の有機体の生成物でもよい生物形成体の作用によって生成し、体に悪影響をもたらさない中間体または最終生産物を意味する。
【００３２】
記載
生物活性剤を組み入れるために、ＰＣＬブロック上に官能基を備えた生分解性ミセルを生成するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬブロック共重合体を調製した。ＰＥＯ−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ）のようなＰＥＯ−ｂ−ポリエステルブロック共重合体のポリエステルセグメントへ官能基を導入すると、種々の反応性化合物をコアを形成する構造体に付着させ得る能力があり、生分解性の自己集合性生物材料の生成に繋がることが判明した。したがって、本発明は、さらに疎水性の特性のある生物活性剤をカプセル化するためのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに関連する。ポリカプロラクトンは、ガラス転移温度が低い疎水性、半結晶の重合体である。ＰＣＬの化学構造を変化させて、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルの熱力学的および速度論的安定性、生分解、薬物可溶化および放出特性を修正するのに使用してもよい。本発明は、化学式Ｉの化合物を含み、
【００３３】
【化５】
【００３４】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖとｗは、互いに独立し、１〜４から独立に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の実施形態では、Ｌ１は、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）−である。本発明のさらなる実施形態では、Ｒ１は、アルキル、シクロアルキル、またはアリール基の１またはそれ以上の炭素をＯ、Ｓ、またはＮで選択的に置換してもよい、選択的に置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルまたはアリール基および生物活性剤とから成る群から選択される。本発明のさらなる実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。本発明のある実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質および薬物から成る群から選択される。
【００３６】
本発明のある実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される。より具体的には、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロールから成る群から選択される。さらにより具体的には、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロール、シクロスポリンＡ、およびエルゴステロールから成る群から選択される。なおさらに特定すれば、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）である。本発明の別の実施形態では、該タンパク質はワクチンである。
【００３７】
本発明のある実施形態では、任意に選択される置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルケニルオキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）（Ｃ１−４アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−４ルキル、ＳＯ２Ｃ１−４アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−４アルキル、フェニル、およびＣ１−４アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００３８】
更に本発明の別の実施形態では、ｖおよびｗは互いに独立的に、２または３である。
【００３９】
更に本発明の別の実施形態では、ｖおよびｗは同じものである。
【００４０】
本発明のある実施形態では、ｘが５０〜２００の整数である。本発明のより具体的な実施形態では、ｘは１００〜１５０の整数である。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、ｙは５〜１００の整数である。本発明のより特別な実施形態では、ｙは５〜５０の整数である。さらにより特別な実施形態では、ｙは１０〜２０の整数である。
【００４２】
本発明のある実施形態では、ｚは、０〜８０、より適切には、０〜４０の整数である。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、化学式ＩＩの化合物が提供される。
【００４４】
【化６】
【００４５】
ここで、Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択された結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の基３個が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または複環式芳香族であり、また、選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニル基からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の別の態様に従って、本発明の化合物は、例えばスキーム１で示される反応経路によって調製できる。
【００４７】
【化７】
【００４８】
化学式ＩＩのラクトン、およびｚが０〜１００である場合に、Ｌ１、Ｒ１、ｖおよびｗが化学式Ｉにおいて定義される化学式ＩＩＩのラクトンは、加熱および無水の条件下、触媒の存在下、ｘが化学式Ｉにおいて定義される開始剤メトキシポリエチレンオキサイドＩＶと開環重合によって化学式Ｉの化合物を提供するよう反応させることができる。化学式ＩＶの化合物は当該技術で周知の方法を使用して調製できる。化学式ＩＩの化合物は、例えば、スキーム２で示されるように取得できる。
【００４９】
【化８】
【００５０】
化学式ＶＩのエノラート化合物は、無水の条件下、約−６０℃〜約−９０℃の範囲の温度、好ましくは−７８℃で、非求核性の強塩基、例えばリチウム・ジイソプロピルアミン（ＬＤＡ）のようなリチウムアルキルとの反応で調製可能である。次いで、このエノラートは、ＬＧがハロゲンのような任意の適切な脱離基である化学式ＶＩＩ試薬と求電子置換を行ない、対応する化学式ＩＩまたはＩＩＩの化合物を生成する。
【００５１】
Ｒ１が生物活性化合物である場合、該生物活性化合物は重合工程の後に化学式Ｉの化合物に組み入れることができる。この場合、Ｒ１が保護基であって、重合工程後、除去され、官能基、例えばＣ（Ｏ）ＯＨ基を顕在化し、前記生物活性化合物の相補的官能基、例えばＯＨ、ＮＨ２、またはＳＨと反応する化学式Ｉの化合物が使用される。一旦官能基が顕在化されれば、そこで、前記官能基は、当該技術で周知の条件下で生物活性化合物と結合させられる。このように出来た化学式Ｉの化合物のＲ１は、そこで生物活性剤となる。ある場合では、生物活性化合物の添加に先立って官能基を保護する必要がないこともあることが判明している。
【００５２】
さらに本発明の範囲内にあるのは、上に定義のような化学式Ｉの化合物と生物活性剤を含んでおり、化学式Ｉの化合物が、生物活性剤の周囲にミセルを生成する組成物である。本発明の実施形態で、化学式Ｉの化合物は、化学的結合、静電気的結合、および物理的カプセル化のうち１若しくはそれ以上によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。本発明のより特定の実施形態によると、化学式Ｉの化合物は、化学的結合によって生物活性剤の周囲にミセルを生成する。より特別には、本発明の実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。本発明のある実施形態では、生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質および薬物から成る群から選択される。特定すれば、本発明の実施形態では、薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ、メトトレキサート、シスプラチン、パクリタクセル、エトポシド、シクロスポリン、ＰＳＣ８３３、アミオダロン、ラパマイシン、コレステロールおよびエルゴステロールから成る群から選択される。より特定すれば、本発明の実施形態では、薬物はドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロールおよびエルゴステロールから選択される。さらに特定すれば，本発明の実施形態では、薬物はドキソルビシン（ＤＯＸ）である。発明の別の実施形態では、タンパク質はワクチンである。
【００５３】
本発明の薬物担持ミセル組成は、経口または非経口的に投与できる。投与される薬物の濃度は、担持した特定の薬物および治療すべき条件または疾病状態に依存するであろう。本発明の化合物は、当業者の技術内で容易に決定できる、適切な治療上有効で且つ安全な投与量で被験者に投与してよい。これらの化合物は、最も好ましくは、一回か分割された投与量として投与されるが、治療中の被験者の体重および状態条件、および選択した特定の投与法によって必然的に変わる。
【００５４】
本発明は、さらに、被験者に上述にて定義した有効量の生物活性剤の周囲にミセルを生成できる化学式Ｉの化合物を投与することを含む、生物活性剤を被験者に送達する方法を包含する。より具体的には、生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択される。
【００５５】
次の非限定的な実施例により、本発明を例証する。
【００５６】
実施例
材料
メトキシポリエチレンオキサイド（平均分子量、５０００ｇｍｏｌ−１）、ジイソプロピルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｍｉｎｅ（９９％））、ベンジルクロロフォーメート（工業用、９５％）（ｂｅｎｚｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（ｔｅｃｈ．９５％））、ナトリウム（灯油中）、ブチル・リチウム（Ｂｕ−Ｌｉ）のヘキサン溶液（２．５Ｍ溶液）、パラジウム被覆炭（ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｃｏａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Ｎ，Ｎ'−ｄｉｃｙｌｃｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ））、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）、トリエチルアミン、ドキソルビシンを使用した。塩酸とピレンは、シグマ化学薬品会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国ミズリー州セントルイス）から購入した。ε−カプロラクトンは、ランカスター合成社、英国（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＵＫ）から購入した。第一スズ・オクタノエート（ｓｔａｎｎｏｕｓ ｏｃｔａｎｏａｔｅ）は，ＭＰバイオメディカル社、ドイツ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。蛍光性のプローブＤｉＩおよび１，３−（１，１'−ジピレニル）プロパン（１，３−（１，１'−ｄｉｐｙｒｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ）は、モレキュラー・プローブ社、米国）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡ）から購入した。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ２０は、アメルシャム・バイオサイエンスズ、スエーデン）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳｗｅｄｅｎ）から購入した。他の化学薬品はすべて試薬級であった。
【実施例１】
【００５７】
α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの合成
【００５８】
【化９】
【００５９】
三口丸底フラスコ中の無水ジイソプロピルアミン６０．０ｍｍｏｌ（８．４ｍＬ）の無水ＴＨＦ６０ｍＬ溶液にＢｕＬｉ６０．０ｍｍｏｌ（２４ｍＬ）ヘキサン溶液を−３０℃で、アルゴンを絶えず供給しつつ、激しい攪拌下、加えた。該溶液を−７８℃に冷却し、さらに２０分間攪拌し続けた。新たに蒸留したε−カプロラクトン（３０ｍｍｏｌ、すなわち３．４２ｇ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８ｍＬに溶解し、前述の混合物にゆっくり加え、次いで４５分後に、ベンジルクロロフォーメート（３０ｍｍｏｌ、５．１ｇ）を添加した。温度は、１．５時間後０℃まで上昇させ、反応は、飽和塩安溶液５ｍｌで停止させた。反応混合物は水で希釈し、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。合併した抽出液をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。帯黄色の油性の粗製混合物は、ヘキサン：酢酸エチルを３：１、２：１、および１：１の比率で溶離剤として使用して、シリカゲルカラム上で精製した。カラムクロマトグラフィー後、α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（α−ｂｅｎｚｙｌｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）が透明な粘性のある油性液体として遊離された。反応収率は５３．８％であった。このものの構造は、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ、ＩＲおよび質量分光法を合わせた分析によって確認した。３００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．６−２．２（ｍ，６Ｈ）；３．７５（ｄｄ、１Ｈ）；４．１３−４．３５（ｍ、２Ｈ）；５．２２６（ｓ、２Ｈ）；７．４（ｓ、５Ｈ）（図１）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２５．８２４、２６．９４、２８．６６３、５０．８８６、６７．３３、６９．３４２、１２８．２３５、１２８．３３６、１２８．４９７、１３５．２３８、１６８．６９５および１７１．６６５ｐｐｍ（図２）。ＩＲデータ（薄膜法）：Ｃ＝Ｃ芳香族変角［振動］：１６２０ｃｍ−１、ラクトンＣ＝Ｏ、１７２５ｃｍ−１、および脂肪族Ｃ＝Ｏ１７６０ｃｍ−１、Ｃ−Ｈ伸縮芳香族：３０２５ｃｍ−１およびＣ−Ｈ伸縮脂肪族の２９７５ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ倍音３４００ｃｍ−１（図３））。質量分析：分子イオン・ピーク：ｍ／ｚ：２４８．９９、Ｍ＋＋Ｎａ：ｍ／ｚ：２７１、Ｍ＋＋Ｋ：ｍ／ｚ：２８７（図４）。
【実施例２】
【００６０】
ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ）ブロック共重合体の合成および特性決定
【００６１】
【化１０】
【００６２】
メトキシポリエチレン（ＭＷ：５０００ｇｍ／ｍｏｌｅ）（３．５ｇ），α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（３．５ｇ）および第一スズ・オクタノエート（単量体当たり０．００２等量）を、予め火焔処理した１０ｍＬアンプルに添加し、窒素でパージし、真空下で封入した。重合反応は、１４０℃で４時間オーブン中で行なった。反応は生成物を室温へ冷却して停止させた。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の調製収率は、９１％であった。α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン単量体のＰＢＣＬへの転化を評価するために、３００ＭＨｚでＣＤＣｌ３中のＰＥＯ−ＰＢＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用い、α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの−Ｏ−ＣＨ２−（δ＝４．２５ｐｐｍ）のピーク強度とＰＢＣＬ（δ＝４．０５ｐｐｍ）の同ピークの強度とを比較した。該ブロック共重合体の数平均分子量も、１ＨＮＭＲスペクトルから、ＰＥＯ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、δ＝３．６５ｐｐｍ）のピーク強度をＰＢＣＬ（−Ｏ−ＣＨ２−、δ＝４．０５ｐｐｍ）（図５）のそれと比較して決定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＯのピーク強度をＰＢＣＬのそれと比較することにより測定した、調製ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の分子量は、９６００ｇ．ｍｏｌ−１（重合度１８）であると計算された。３００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２５−１．９（ｍ、６Ｈ）；３．３−３．４５（ｓ、３Ｈ；ｔｒｉ、１Ｈ）；３．６５；（ｓ、４Ｈ）；４．０５；（ｔｒｉ、２Ｈ）；５．１５；（ｓ、２Ｈ）；７．３５（ｓ、５Ｈ）。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロックのＩＲスペクトル（薄膜法で調製）は、図６に示す。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロックの特性は表１の中にまとめてある。
【００６３】
【表１】
【実施例３】
【００６４】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の合成および特性決定
【００６５】
【化１１】
【００６６】
ＰＥＯ−ＰＢＣＬ１ｇのＴＨＦ溶液２５ｍｌを１００ｍＬ丸底フラスコへ入れた。パラジウム被覆炭（３００ｍｇ）をこの溶液に分散した。その後、フラスコは１０分間真空に引いて排気し、水素ガスを満たした風船を該反応フラスコに接続した。該混合物を磁気撹拌機で激しく攪拌して２４時間水素と反応させた。反応混合物は、触媒を除去するために３０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を集め、減圧下濃縮し、大過剰のジエチルエーテル中で沈殿させ、繰り返し洗浄して副生物のこん跡をすべて除去した。最終生産物を集め、室温で４８時間真空乾燥した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体の還元によるＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体生成の収率は、６８〜７５％であった。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の３００ＭＨｚでの１Ｈ ＮＭＲ（Ｎ，Ｎジメチルスルホキシド−ｄ６）：δ＝１．２０−１．９（ｍ、６Ｈ）；３．２２−３．３８（ｓ３Ｈ；ｔｒｉ、１Ｈ）；３．５（ｓ、４Ｈ）；４．０３（ｔｒｉ、２Ｈ）（図７）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ（図５）上のベンジルオキシ基に関連する芳香族のピーク（δ＝７．４）およびメチレン基ピーク（δ＝５．１５）は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルにはなかった。（図７）。１Ｈ ＮＭＲスペクトルのＰＥＯのピーク強度を、ＰＣＣＬのそれと比較して測定した、調製ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の分子量は、７５３０ｇ・ｍｏｌ−１（重合度、１６）であると計算された。
【００６７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体（図８）のＩＲスペクトル（薄膜法で調製）は、３５００ｃｍ−１から２５００ｃｍ−１までの大きな、幅広いピークを示すが、これは、ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体のＩＲスペクトル中には幅広いピークがないのに比してカルボキシルＯＨの存在を示す（図６および８の比較）。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の特性は表１に要約されている。
【実施例４】
【００６８】
ドキソルビシンが結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ（ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ））ブロック共重合体の合成および特性決定
【００６９】
【化１２】
【００７０】
Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（１７．３ｍｇ、０．１５ｍＭ）およびＤＣＣ（３１ｍｇ、０．１５ｍＭ）を、窒素下で、攪拌中のＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（２００ｍｇ、０．０３ｍＭ）ブロック共重合体の無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物は室温で２時間攪拌した。その後、ＤＯＸ．ＨＣｌ（１７．４ｍｇ、０．０３ｍＭ）およびトリエチルアミン（２１μＬ（０．１５ｍＭ））の無水メタノール（２ｍＬ）溶液を添加、さらに９６時間、反応を継続した。ブタン−１−オール：酢酸：水（４：１：４）を移動相として存在させ、薄層クロマトグラフィーを使用して反応の進行を追跡した。反応混合物を蒸発させて得た残渣は、ＨＰＬＣ級のメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、未反応ドキソルビシンおよび他のすべての副生物も除去するため、ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体を、メタノールを溶離剤として、ｓｅｐｈ ａｄｅｘ ＬＨ ２０カラムを使用して二度精製した。当該ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体を凍結乾燥し、濃厚なオレンジ色の粉末を得た。ＤＯＸ分子とブロック共重合体との結合は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認したが、その際、遊離ドキソルビシンは溶媒で溶出し、Ｒｆ値０．６８のスポットを示した（図９で矢印１を参照）が、重合体と結合したドキソルビシンは、溶出せず、ベースライン（基線）（図９で矢印２を参照）に留まった。ＨＰＬＣクロマトグラムは、さらにＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体に遊離ＤＯＸが存在しないことを示している（図１７）。
【００７１】
ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）の３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（Ｎ，Ｎジメチルスルホキシド−ｄ６）は、ＤＯＸ特有のピーク（図１０）を示す：δ：７．９ｐｐｍ、δ：３．６ｐｐｍ、δ：３．３ｐｐｍ、δ：１．２ｐｐｍ。前記重合体中の結合したＤＯＸの量は、紫外−可視分光法で測定され、５．４％（ｗ／ｗ）であった。調製したブロック共重合体の特性は表２に要約されている。前記重合体中の結合したＤＯＸの量は、４８５ｎｍで紫外分析で測定すると５．４％（ｗ／ｗ）であった。１Ｈ ＮＭＲに基づいて計算された当該数平均分子量は、８８００ｇ／ｍｏｌであることが判明し、ＧＰＣクロマトグラムは、幅広い分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．７）を示した。表２中の結果は、３工程のプロセスの間に、ＰＣＬに基づくブロックの分子量に大きな減少がなかったことを示す。
【００７２】
【表２】
【実施例５】
【００７３】
ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の集合
（ｉ）一般的手法
ミセル化は、調製したブロック共重合体（３０ｍｇ）をアセトン（０．５ｍＬ）に溶解し、２５℃で緩やかな攪拌下、重合体溶液を２回蒸留した水（３ｍＬ）に滴下（〜１滴／１５秒）し、アセトンを真空下蒸発させて行なった。
【００７４】
（ｉｉ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセル粒径の測定
調製したミセルの平均直径および粒度分布は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度でマルバーン・ゼータサイザー３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセルについては、平均直径が２８．４の±４．７６と１９．９±２．２６ｎｍであると測定された。ミセルの母集団の多分散度は、２種のブロック共重合体ミセルについてそれぞれ０．３９と０．９であった（図１１：（Ａ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよび（Ｂ）ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、および表１を参照）。
【００７５】
（ｉｉｉ）透過電子顕微鏡法
１〜１．５ｍｇ／ｍｌの重合体濃度のミセル溶液（２０μＬ）の水滴を、一滴銅被覆グリッドの上に置いた。グリッドは、コロイド性凝集物が沈降できるように２０秒間水平に保持した。次いで、燐タングステン酸（ＰＴＡ）の２％ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）溶液を一滴添加して、ネガティブ染色（ステイン）を得た。１分後余分の液体を濾紙で除いた。次いで、該試料は、自然乾燥させ、日立Ｈ７００型透過型電子顕微鏡に装着した。イメージは、７５ｋＶ、１８０００倍の倍率で得た。図１２はＰＥＯ−ＰＢＣＬミセル（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセル（Ｂ）を示す。図１２に示す縮尺目盛りは２００ｎｍに相当する。ＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルは、６２ｎｍの平均粒径を有し、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは、２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００７６】
（ｉｖ）ＰＥＯ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の臨界ミセル濃度およびコア粘性の測定：
種々の濃度のブロック共重合体の存在下、ピレンの蛍光励起スペクトルの変化を用いて、ＣＭＣを測定した。ピレンはアセトンに溶解し、最終溶液が６×１０−７Ｍの濃度になるよう５ｍＬメスフラスコに加えた。次いで、アセトンを蒸発し、０．０５〜５０００μｇ／ｍＬの濃度範囲の重合体のミセル水溶液で置換した。試料は１時間６５℃で加熱し、一夜室温に冷却し、蛍光測定に先立って酸素を窒素ガスで除去した。各試料のピレンの励起スペクトルは室温で、バリアン・キャリー・エクリプス蛍光分光光度計（オーストラリア、ビクトリア）（Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を用いて得た。走査は、中速度（６００ｎｍ／分）、およびＰＭＴ検知器電圧５７５Ｖで行なった。発光波長および励起／発光スリトは，それぞれ３９０ｎｍおよび５ｎｍに設定した。３３４ｎｍ対３３９（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬでは３３７）ｎｍのピークの強度比を共重合体濃度の対数に対してプロットした。ＣＭＣは、ミセル化開始時の強度比（Ｉ３３９／Ｉ３３４）の鋭い立ち上がりから測定した（表３）。
【００７７】
【表３】
【００７８】
ミセルのコアの粘性は、それぞれ３７３および４８０ｎｍでの１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルから、エキシマー対単量体の強度比（Ｉｅ／Ｉｍ）を測定することにより求めた。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンは、２×１０−７Ｍの最終濃度を与えるように既知容量のクロロホルムに溶解した。次いで、クロロホルムを蒸発させ、１０００μｇ／ｍＬの濃度のＰＥＯ−ＰＢＣＬまたはＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬのミセルの溶液５ｍＬで置換した。試料は１時間６５℃に加熱し、一夜室温に冷却した。蛍光測定に先立って、試料から酸素を除去するのに窒素ガス気流を使用した。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルは、室温で３３３ｎｍの励起波長を使用し、励起／発光スリットを５ｎｍにセットして得た。走査は、中速度（６００ｎｍ／分）、およびＰＭＴ検知器電圧６７５Ｖで行なった。発光波長および励起／発光スリトは，それぞれ３９０ｎｍおよび５ｎｍに設定した。ピレンの励起スペクトルから、３３４ｎｍピークに対する３３９ｎｍのピークの強度比の鋭い立ち上がりは、ブロック共重合体に対するミセル化（ＣＭＣ）の開始を示す。この方法を用いてＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の平均ＣＭＣは、それぞれ０．９４および９１．６７μｇ／ｍＬと計算された。調製したミセルに対する１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンの発光スペクトルから得たＩｅ／Ｉｍ比率（０．０２５〜０．０２８）が非常に低いのは、疎水性コアの高い粘性を反映している。１，３−（１，１'ジピレニル）プロパンは、３９０ｎｍで励起時４８０ｎｍで発光する分子内ピレン・エキシマーを生成する。重合体のミセルのコア内のように非常に粘性の高い環境では、エキシマー生成は制限されるのである。
【００７９】
（ｖ）ＤｉＩ（蛍光性プローブ）を担持したＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルの調製
蛍光性ラベルを付した重合体のミセルを調製するのに、疎水性の蛍光性プローブ（ＤｉＩ）をＰＥＯ−ＰＢＣＬミセル中に物理的に取り込ませる方法を使用した。ＤｉＩ（１０μｇ／ｍＬ）および共重合体（１０ｍｇ／ｍＬ）を、アセトン（０．５ｍＬ）に溶解した。ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体ミセルの存在下、ＤｉＩをＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルによって、前記疎水性色素の沈殿する兆候なく可溶化させるのに成功した。この溶液を水３ｍｌに滴下し、有機溶媒の残りを真空蒸発で除去した。ミセル溶液を５分間１１，６００×ｇで遠心分離にかけＤｉＩ沈殿を除去した。
【実施例６】
【００８０】
α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの合成
【００８１】
【化１３】
【００８２】
６０．０ｍｍｏｌ（２４ｍＬ）のＢｕＬｉヘキサン溶液を、アルゴンの供給を継続下、激しく攪拌しながら−３０℃で、三口丸底フラスコ中の６０．０ｍｍｏｌ（８．４ｍＬ）の無水ジイソプロピルアミンの無水ＴＨＦ溶液４５ｍＬにゆっくり加えた。該溶液を−７８℃に冷却し、さらに２０分間攪拌を続けた。新たに蒸留したε−カプロラクトン（３０ｍｍｏｌ、３．４２ｇ）を無水ＴＨＦ８ｍＬに溶解し、上記の混合物にゆっくり添加し、次いで４５分後に、コレステリルクロロフォーメート（３０ｍｍｏｌ、１３．４７ｇ）を添加した。１．５時間後、温度を０℃に上げ、反応を飽和塩安溶液５ｍｌで停止させた。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出した。合併した抽出液は、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発した。この帯黄色の固形粗製混合物はヘキサン：酢酸エチルを３：１の比率で溶離剤として使用して、シリカゲルカラム上で精製し、固体の白色粉末を得た。集めた画分は、クロロホルム；ヘキサンとクロロホルム；メタノール溶剤システムを使用して、溶媒−溶媒抽出で再び精製し、純粋な固体の白色粉末を得た。
【００８３】
カラムクロマトグラフィー後、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンを白色固体の粉末として遊離した。反応収率は約５０％であった。その構造は、１Ｈ ＮＭＲ、ＩＲおよび質量分光法を併用した分析で確認した。
３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝６８１（ｓ、３Ｈ）δ：０．８６−１．７；（ｍ、３６Ｈ）δ：１．８−２．１；（ｍ、１２時間）δ：２．３５；（ｍ、２Ｈ）δ：３．６６（ｄｄ、１Ｈ）（δ：４．１３）−４．３５（ｍ、２Ｈ）；δ：４．７（ｍ、１Ｈ）δ：５．３８（ｓ、２Ｈ）（図１３）。
【００８４】
コレステリルクロロフォーメートのＩＲスペクトルが、１７７５ｃｍ−１にわずか１本の鋭いバンドしか示さない（図示せず）ものであるのに比して、ＩＲスペクトル（図１４）は、２本の隣接したバンドを１７２５ｃｍ−１および１７５０ｃｍ−１に示すが、これは、２つのカルボニル基の存在を示す。
質量分析：ピークス：Ｍ＋ｍ／ｚ：５２６．７６；Ｍ＋＋Ｎａ：ｍ／ｚ：５４９．１５；Ｍ＋＋Ｋ＝ｍ／ｚ：５６５．０９（図１５）。
【実施例７】
【００８５】
ポリ（エチレンオキサイド）−ブロック−ポリ（α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬ）ブロック共重合体の合成および特性決定
【００８６】
【化１４】
【００８７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬは、メトキシポリエチレンオキサイドを開始剤とし、第一スズ・オクタノエートを触媒として使用し、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの開環重合によって合成した。前記ブロック共重合体の調製図式は、上記の図式に示されている。メトキシポリエチレン（ＭＷ：５０００ｇｍ／ｍｏｌｅ）（３．５ｇ），α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン（３．５ｇ）および第一スズ・オクタノエート（単量体当たり０．００２等量）を、予め火焔処理した１０ ｍＬアンプルに添加し、窒素でパージし、真空下封入した。重合反応は、１６０℃で３時間オーブン中で行なった。反応は生成物を室温へ冷却して停止させた。
【００８８】
α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン単量体のＰＣｈＣＬへの転化を評価する為、３００ＭＨｚでＣＤＣｌ３中のＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用い、α−コレステリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの−Ｏ−ＣＨ２−（δ＝４．２８ｐｐｍ）のピーク強度とＰＣｈＣＬ（δ＝４．１０ｐｐｍ）の同ピークの強度とを比較した。該ブロック共重合体の数平均分子量も、１ＨＮＭＲスペクトルから、ＰＥＯ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、δ＝３．６５ｐｐｍ）のピーク強度をＰＣｈＣＬ（−Ｏ−ＣＨ２、δ＝４．１０ｐｐｍ）（図１６）のそれと比較して決定した。
【００８９】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の調製収率は、５０％であった。３００ＭＨｚにおける１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６８１（ｓ、３Ｈ）δ：０．８６−１．７；（ｍ、３６Ｈ）δ：１．８−２．１；（ｍ、１２時間）δ：２．３；（ｍ、２Ｈ）δ：３．２８、δ：４．１０（ｍ、２Ｈ）（ｔｒｉ、１Ｈ）；δ：４．６５（ｍ、１Ｈ）δ：５．３８（ｓ、２Ｈ）（図１６）。ＰＥＯのピーク強度を１Ｈ ＮＭＲスペクトル中のＰＢＣＬのそれと比較することにより測定した、調製ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の分子量は、７６３３ｇ．ｍｏｌ−１であると計算された。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体（図１６）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、α‐カプロラクトン環に属するプロトンが単量体の１Ｈ ＮＭＲ（図１３）に比してより高磁場にシフトを示す、つまり、Ｏ−ＣＨ２のδ：４．２８（ｍ、２Ｈ）ピークはδ：４．１０にシフトし、Ｏ＝Ｃ−ＣＨのδ：３．６６（ｄｄ、１Ｈ）は、３．２８ｐｐｍにシフトする。これらのシフトは、α−コレステリル・カルボキシレート−ε−カプロラクトンの開環重合によるＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の生成を示す。
【実施例８】
【００９０】
ＨＰＬＣ測定
ＨＰＬＣは、ウォーターズ６２５ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６２５ ＬＣ）システムを使用して４０℃、１．０ｍＬ／分の流量で、実施した。検出は可変Ｗａｔｅｒｓ４８６吸光度検知器を用い４８５ｎｍの吸収で行なった。逆相クロマトグラフィーは、２０μｌの試料で、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液およびアセトニトリルを使用する勾配溶離剤（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｅｎｔ）で、ウォーターズ１０μｍ Ｃ１８−１２５Åカラム（３．９×３００ｍｍ）を用いて実行した。
【実施例９】
【００９１】
ＤＯＸ担持ミセルの調製および自己集合構造物の特性決定
ＤＯＸを担持したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルを溶媒蒸発法で調製した。簡潔に言えば、ブロック共重合体（１０ｍｇづつ）をＤＯＸ１ｍｇおよびトリエチルアミン２０μｌ含有のＴＨＦ（２ｍｌ）に溶解した。その後、緩やかな攪拌下、当該溶液を２回蒸留した水（１０ｍＬ）に滴下し、次いでＴＨＦをゆっくりと蒸発させて、ミセルを生成した。室温で４時間攪拌後、真空を引き，確実に有機溶媒を完全に除去した。ＤＯＸが天然において、両親媒性なので、生じたミセル溶液は、大量の取り込まれていないＤＯＸを含んでいるので、これを、さらに使用する前に蒸留水（スペクトラポール（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）、カットオーフ分子量、３，５００ダルトン）に対して徹底的に透析で除去した。
【００９２】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体から調製したミセルの特性は、表４にまとめてある。すべての重合体のＤＯＸ担持量およびカプセル化効率は、表５にまとめてある。コア機能化ミセル中のＤＯＸ担持量は、非機能化ミセルＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬより、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ（２．５倍）およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）（２倍）ミセルにおいて著しく高かった（表５）。
【００９３】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルの計算ドキソルビシン担持量およびカプセル化効率は、それぞれ２．０％［Ｍ（ＤＯＸ）／Ｍ（ＣＬ）比率］および４８．３％であることが判った。芳香族基含有ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬブロック共重合体は、ベンジル・カルボキシレート基の存在によりＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬブロック共重合体より著しく高いＤＯＸ担持量（２．５倍）を示した。カルボキシル基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬでは、担持量が僅かに増加を示した（１．３倍）が、その一方でＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体へのＤＯＸの結合により、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体の担持量を２倍増加させることができた。
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【実施例１０】
【００９６】
粒度分布およびＤＯＸの担持量および担持効率
調製したミセルの平均直径および粒度分布は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度でマルバーン・ゼータサイザー３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した。ＤＯＸの担持量および担持効率は、ミセル水溶液のアリコート（一定分量）（２００μＬ）を採り、ＤＭＳＯで５倍に希釈して自己集合した構造物を崩壊し、紫外−可視分光光度計を使用し、４８５ｎｍの吸収を測定して決定した。検量線は、異なる濃度の遊離ＤＯＸを使用して構築した。ＤＯＸ担持およびカプセル化効率は次の方程式から計算した。
【００９７】
【数１】
【実施例１１】
【００９８】
機能化および非機能化ミセルからのＤＯＸの放出
ＤＯＸ担持ミセル溶液（１５ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ）は、上記の方法により、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体から調製した。ミセル試料を透析バッグ（ＭＷカットオーフ：３，５００Ｄａ，米国スペクトラム・ラボラトリーズ社（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）製）へ移した。該透析バッグは、５００ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）または５００ｍＬのアセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）中に入れた。放出試験は３７℃で，ＪｕｌａｂｏＳＷ２２振盪水浴（ドイツ製）中で行なった。紫外−可視分析用に、選択した時間間隔で該透析バッグ内から２００μＬのミセル溶液を抜き取った。ＤＯＸ濃度は４８５ｎｍｄｅの吸光度強度に基づいて計算した。
【００９９】
種々異なる処方からのＤＯＸ放出状況は、７２時間以内に３７℃でリン酸塩（ｐＨ：７．４、０．１Ｍ）および酢酸塩（ｐＨ：５．０、０．１Ｍ）緩衝液中で透析膜を使用して調べた。図１８に示すように、ｐＨ７．４（Ａ）におけるミセルからのＤＯＸ放出は、ｐＨ５．０（Ｂ）での放出に比して、はるかに遅かった。これらの結果は、両ｐＨで、重合体のミセルからのＤＯＸ放出挙動が共重合体の組成によって強く影響されることを示唆する。芳香族基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬは、ｐＨ５．０で、担持ＤＯＸの放出がＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬよりはるかに遅いことを示す（それぞれＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルのＤＯＸで、１２時間後のＤＯＸ放出は、１５対２７％で、４８時間後のＤＯＸ放出は、３２対５０％）。
【０１００】
さらに、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬミセルは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに比べて、生理学的ｐＨで放出を効率よく減少させることができた（それぞれＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬミセルとＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルで、１２時間後のＤＯＸ放出は、１０％対１８％；４８時間後のＤＯＸ放出は、２２％対３０％）。カルボキシル基含有ブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは、非機能性ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルより放出が速いことを示した。ｐＨ５．０でのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体ミセルからのＤＯＸ放出は、１２および４８時間後にそれぞれ３５および５６％であった。ｐＨ７．４で、同一時点でＤＯＸ放出はそれぞれ１９および３２％であった。重合体主鎖ののＤＯＸの結合（コンジュゲーション）で、それぞれｐＨ５．０および７．４で４８時間培養後にそれぞれ、僅か７および８％放出する結果となったが、一方、物理的に担持されたＤＯＸは、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルからより速く放出した。このシステムからのＤＯＸの放出挙動は、両ｐＨでのＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルからのＤＯＸ放出に類似していた。
【実施例１２】
【０１０１】
ラット赤血球に対するインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）溶血
スプラーグドーリー・ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ）由来の心臓を穿刺して新たに血液を取得し、無菌、等張ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）と混合し、５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液をピペットで取り出し、赤血球を等張無菌のＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で希釈した。適切な希釈比は、赤血球を０．１％のトリトンＸ１００で溶解後上澄液中のヘモグロビンの５７６ｎｍにおける紫外−可視吸光度から求めた。赤血球を適切に希釈した試料は、吸光度が０．４〜０．５であった。種々の重合体濃度の、３種の異なったブロック共重合体、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、並びにＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）のミセルの溶液およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）と結合したＤＯＸの同様の濃度の遊離ＤＯＸ溶液を、希釈した赤血球懸濁液（２．５ｍｌ）と共に３７℃で３０分間培養した。培養後、試料はさらに溶血するのを停止するために氷浴に保持した。完全な赤血球細胞を沈殿させるために、試料は、３０秒間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を分離し、紫外−可視分光光度計によって５７６ｎｍでヘモグロビンを分析した。溶血した赤血球の百分率は次式で計算した：溶血％＝１００（Ａｂｓ−Ａｂｓ０）／（Ａｂｓ１００−Ａｂｓ０）、ここで、Ａｂｓ、Ａｂｓ０およびＡｂｓ１００は、それぞれ、試料、重合体もＤＯＸも不含の対照、および０．１％のトリトンＸ１００を含む対照の吸光度である。
【０１０２】
インビトロ溶血試験は、前記合成重合体の生体適合性を測定する方法として使用した。図１９に示すように、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣｌ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体ミセルをラット赤血球（ＲＢＣ）と行なった培養では、問題となる程度の溶血を示さなかったが、一方、０．１％のトリトン−Ｘ１００では、１００％の溶血が起こった。重合体の最高濃度（５００μｇ／ｍｌ）では、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣｌ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体の溶血％は、それぞれ２．７、２．５、２．４、０．０８および０．５％であった。しかし、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）は、最高重合体濃度（５００μｇ／ｍｌ）である程度の溶血（１３％）を示した。特に、遊離ＤＯＸは、同等なＤＯＸ濃度（２７．５μｇ／ｍｌ）で同程度の溶血（１１％）を示した。
【実施例１３】
【０１０３】
マウス黒色腫Ｂ１６−ＢＬ６細胞に対するインビトロ細胞毒性
Ｂ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対するＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性をＭＴＴアッセイを使用して調べた。細胞は、ウシ胎児血清１０％、Ｌ−グルタミン１％ｗ／ｖ、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０完全成長培地中で成長させ、５％ＣＯ２組織培養器中で３７℃に保持した。対数増殖期に細胞を採取し、９６ウエル・プレートに５×１０３細胞／ウエルの密度で、ＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌとして播種した。２４時間後、細胞が付着した時、種々の異なる濃度のＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）、ＤＯＸ担持ＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルおよび遊離ＤＯＸを前記細胞と共に２４および４８時間培養した。次いで、各々のウエルにＭＴＴ溶液（２０μｌ；滅菌−濾過ＰＢＳ）を添加し、該プレートをさらに３時間再培養した。該フォルマザン結晶をＤＭＳＯに溶解し、その濃度を、パワーウエイブＸ３４０ミクロプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒ ＷａｖｅＸ３４０ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（バイオ−テック機器社、米国、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）により５５０ｎｍで読み取った。
【０１０４】
図２０に示すように、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルのＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する細胞毒性を２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の両培養時間測定した。細胞の５０％を死滅させるＤＯＸ濃度（５０％阻害濃度（ＩＣ５０））は、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルの場合、それぞれ２４および４８時間培養で、４．１５および０．４５μｇ／ｍｌであった。２４時間で、ＤＯＸを結合した重合体（ＩＣ５０：１．５４μｇ／ｍＬ）と比べて、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルに物理的に担持させたＤＯＸは、３倍高い細胞毒性を示した。物理的にカプセル化したＤＯＸと化学的に結合したＤＯＸは、４８時間の培養後に、Ｂ１６―ＢＬ６細胞に対して同等の細胞毒性（ＩＣ５０：０．４４μｇ／ｍＬ）を示した。遊離ＤＯＸのＩＣ５０計算値は、それぞれ２４および４８時間培養で、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ミセルより５０倍および１５倍低かった。重合体ミセルがインビトロで親化合物より高いＩＣ５０値を示したのは、細胞内取り込みおよび継続放出が、遊離薬物の迅速な拡散および即時の作用と比べて、より遅いので驚くべきことではない。
【実施例１４】
【０１０５】
繊維芽細胞に対するインビトロ細胞毒性
上記の方法により、ＭＴＴアッセイを使用して、ヒトの繊維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体のインビトロ細胞毒性活性を２４時間調査した。
【０１０６】
調製した前記重合体の生体適合性を評価するために、ヒトの繊維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５ブロック共重合体のインビトロ細胞毒性を、正常な細胞のモデルとして調べた。図２１に示すように、共重合体の存在下での繊維芽細胞の培養では、すべての共重合体濃度（５〜５００μｇ／ｍＬの範囲）において、９０％を超過する相対的な細胞生存率という非常に低い細胞毒性の結果を得た。すべてのブロック共重合体の最高共重合体濃度でさえ、対象に比して２４時間の培養期間後の細胞生存率は、著しく減少することはなかった。
【実施例１５】
【０１０７】
ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体による、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）のカプセル化
ＣｓＡの重合体ミセル中のカプセル化は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（１０ｍｇ）およびＣｓＡ（３ｍｇ）を、アセトン（０．１６７ ｍＬ）に溶解する共溶媒蒸発法で達成した。当該有機溶媒溶液を攪拌中の蒸留水（１ ｍＬ）へ滴下（１滴／１５秒）した。残留アセトンは、室温で真空下蒸発して除去した。カプセル化工程の終了後、該コロイド溶液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ＣｓＡの沈殿物を除去した。
【０１０８】
調製した重合体ミセルの水媒質中の平均直径および多分散度は、１０ｍｇ／ｍＬの重合体濃度で動的光散乱（３０００ＨＳＡゼータサイザー・マルバーン、マルバーン・インストルメント株式会社、英国）（３０００ＨＳＡ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｍａｌｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって測定した。
【０１０９】
ブロック共重合体ミセル中のＣｓＡのカプセル化レベルは、下記のように測定した。ミセルの水中の一定量を３倍量のアセトニトリルで希釈して自己集合型構造を分解した。ＣｙＡのカプセル封入量は、逆相ＨＰＬＣを使用して測定した。該ＨＰＬＣ機器は、ケムメイト（Ｃｈｅｍ Ｍａｔｅ）ポンプおよび自動試料採取器から成り立っていた。ＨＰＬＣシステムは、ＫＨ２ＰＯ４（０．０１Ｍ）、メタノールおよびアセトニトリル（２５：５０：２５）の移動相を備えたＬＣ１カラム（サプレコ（Ｓｕｐｌｅｃｏ））を装備していた。流量およびカラム温度は、それぞれ１ｍＬ／分および６５℃（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ＣＨ３０カラム・ヒーター）に設定した。ＣｙＡ濃度は１００μＬ注入後に２０５ｎｍ（ウォーターズ４８１（Ｗａｔｅｒｓ４８１））で、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）を内部標準料として用いて測定した。検量用試料は０．１−１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で調製した。各実験は三回繰り返し行なった。ＣｙＡ担持率およびカプセル化効率は次の方程式から計算した。
【０１１０】
【数２】
【０１１１】
ＣｓＡ担持ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬの特性を表６に示す。５０００−５０００ＭｅＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬコロイド分散物は、平均直径４３．９ｎｍと中程度の多分散指数（０．３８）示した。５０００−２５３０ ＰＥＯ―ｂ−ＰＣＣＬの集合で形成したナノ構造の直径は、６６ｎｍで，その多分散指数は０．２５であった。ＣｓＡは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルによって水媒体中１．３０７ｍｇ／ｍＬのレベル（ＣｓＡ対重合体重量の比率、０．１３０７ｍｇ／ｍｇ）に達した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルは，ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬミセルに比して（対応のないスチューデントｔ−検定で、ｐ<０．０５）、より著しく高い量のＣｓＡを担持した。ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセル中のＣｓＡの担持レベルは、２．１３１ｍｇ／ｍＬ（ＣｓＡ：重合体重量比率、０．２１３１ｍｇ／ｍＬ）に達した（表６）。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
本発明は、現在好ましい例と考えられる実施例に就いて記載したが、当該発明は開示した実施例に限定されないことを理解されるものとする。それに反して、本発明は、別記の特許請求の精神および範囲内に含まれる種々の変更および等価な構成を包含することを意図するものである。
【０１１４】
本明細書においては、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照によってその全体を特定して個別に組み入れるよう示されている場合と同程度に、刊行物、特許および特許出願はすべて参照によってそれらの全体を組み入れるものである。本出願中の用語が、参照によってここに組み入れた文書では異なって定義されていると判明した場合は、本明細書に提供した定義をその用語の定義とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
以下に、本発明を図面を参照して記載する。
【図１】図１は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３は本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンのＩＲスペクトルである。矢印は、特性基の存在を示す。
【図４】図４は、本発明の機能化単量体、α‐ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの質量スペクトルである。
【図５】図５は、ポリ（エチレンオキサイド）ーブロック−ポリ（α−ベンジルカルボキシレート−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ＰＢＣＬ）ブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）スペクトルである。
【図６】図６は、ＰＥＯ−ＰＢＣＬブロック共重合体のＩＲスペクトルである。
【図７】図７は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６）スペクトルである。矢印は、芳香族のピークの欠如を示す。
【図８】図８は、ポリ（エチレンオキサイド）ーブロック−ポリ（α−カルボン酸塩−ε−カプロラクトン）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ）ブロック共重合体のＩＲスペクトルである。矢印は、広幅のピークの存在を示す。
【図９】図９は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）分子とＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体との結合体の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）である。スポット１は対照としての遊離ドキソルビシンであり、スポットは２は、ドキソルビシンを結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体である。
【図１０】図１０は、メチルスルホキシドｄ６中のＤＯＸが結合したＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。矢印は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬブロック共重合体担持のＤＯＸ特有ピークを示したものである。
【図１１】図１１は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ｂ）ブロック共重合体ミセルの粒度分布を示したものである。
【図１２】図１２は、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ（Ｂ）ブロック共重合体から調製されたミセルのＴＥＭイメージを示したものである。イメージは７５ｋＶの電圧設定で１８０００倍で撮影した。図示スケールの線は２００ｎｍに相当する。ＰＥＯ−ＰＢＣＬミセルの平均粒度は、６２ｎｍ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬミセルの平均粒度は、２０ｎｍである。
【図１３】図１３は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトン の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１４】図１４は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンのＩＲスペクトルである。矢印は、特性基の存在を示す。
【図１５】図１５は、本発明の機能化単量体、α−コレスチリルカルボキシレート−ε−カプロラクトンの質量スペクトルである。
【図１６】図１６は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣｈＣＬブロック共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１７】図１７は、メタノールに溶解した遊離ＤＯＸ（Ａ）およびＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）（Ｂ）の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムである。ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体中遊離ＤＯＸの欠如を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、異なるｐＨでの遊離ＤＯＸおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくミセル中にカプセル化したＤＯＸのインビトロ放出プロフィールを示したものである。（Ａ）ｐＨ５．０。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、異なるｐＨでの遊離ＤＯＸおよびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくミセル中にカプセル化したＤＯＸのインビトロ放出プロフィールを示したものである。（Ｂ）ｐＨ７．４。
【図１９】図１９は、ラット赤血球に対して、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ｃｏ−ＰＣＣＬ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ｃｏ−ＰＣＣＬ１０によって引き起こされた溶血を示したものである。各実験は三回繰り返され、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２０Ａ】図２０は、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）培養後のＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２０Ｂ】図２０は、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）培養後のＢ１６−ＢＬ６マウス黒色腫細胞に対する、遊離ＤＯＸ、ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）およびＤＯＸ担持ＰＥＯ−ｂ−Ｐ（ＣＬ−ＤＯＸ）ブロック共重合体ミセルのインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【図２１】図２１は、ヒト線維芽細胞に対するＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬに基づくブロック共重合体ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ、ＰＥＯ−ＰＢＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＣＬ、ＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ２５−ＣＯ−ＰＣＣＬ５およびＰＥＯ−ｂ−ＰＣＬ１６−ＣＯ−ＰＣＣＬ１０のインビトロ細胞毒性を示したものである。細胞生存率は、ＤＯＸ濃度の対数の関数して表現されている。各実験は三回繰り返して行なわれ、結果は平均値±ＳＤとしてプロットされている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ｉの化合物であって、
【化１】
Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ３−２０シクロアルキル、およびアリ−ルから成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖ及びｗは、互いに独立し、１〜４から独立的に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
アリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、更に、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニルからなる群から選択されるものである、化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｌ１は、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）-である。
【請求項３】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、アリール基、および生物活性剤から成る群から選択され、前記アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、選択的にＯ、Ｓ、またはＮで置換されていてもよいものである。
【請求項４】
請求項１に記載の化学式Ｉの化合物において、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルケニルオキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）（Ｃ１−４アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−４ルキル、ＳＯ２Ｃ１−４アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−４アルキル、フェニル、およびＣ１−４アルキレンフェニルからなる群から選択されるものである。
【請求項５】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｖ及びｗは、互いに独立して２または３である。
【請求項６】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｖ及びｗは、同じものである。
【請求項７】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｘは、５０〜２００の整数である。
【請求項８】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｘは、１００〜１５０の整数である。
【請求項９】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、５〜１００の整数である。
【請求項１０】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、５〜５０の整数である。
【請求項１１】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、１０〜２０の整数である。
【請求項１２】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｚは、０〜８０の整数である。
【請求項１３】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｚは、０〜４０の整数である。
【請求項１４】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、生物活性剤である。
【請求項１５】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される生物活性剤である。
【請求項１６】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、ドキソルビシンである。
【請求項１７】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、シクロスポリンである。
【請求項１８】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、コレステロールである。
【請求項１９】
請求項１〜１３の何れかに記載の化学式Ｉの化合物と生物活性剤とを含む組成物であって、前記化学式Ｉの化合物は、前記生物活性剤の周囲にミセルを形成するものである、組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載の組成物であって、前記化学式Ｉの化合物は、化学結合、静電気的結合、物理的なカプセル化、またはこれ等の任意の組み合わせによって、前記生物活性剤の周囲にミセルを形成するものである。
【請求項２１】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択されるものである。
【請求項２２】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質、および薬物から成る群から選択されるものである。
【請求項２３】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される薬物である。
【請求項２４】
請求項２３記載の組成物において、前記薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロール、およびシクロスポリンから選択されるものである。
【請求項２５】
請求項２３記載の組成物において、前記薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）である。
【請求項２６】
化学式ＩＩの化合物であって、
【化２】
Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基は選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよいものであり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニルからなる群から選択される、化合物。
【請求項２７】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１はベンジルである。
【請求項２８】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１はα−コレストリルである。
【請求項２９】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１は水素である。
【請求項３０】
対象に生物活性剤を送達する方法であって、この方法は、
前記対象に、有効量の前記生物活性剤の周囲にミセル生成可能な請求項１記載の化学式Ｉの化合物を投与する工程
を有するものである、方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および薬物から成る群から選択されるものである。
【請求項１】
化学式Ｉの化合物であって、
【化１】
Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−Ｏ、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｃ１−２０アルキル、Ｃ３−２０シクロアルキル、およびアリ−ルから成る群から選択され、前記最後の３個の基が選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよく、またはＲ１が、生物活性剤であり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖ及びｗは、互いに独立し、１〜４から独立的に選択される整数であり、
ｘは１０〜３００の整数であり、
ｙは５〜２００の整数であり、
ｚは０〜１００の整数であり、
アリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、更に、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニルからなる群から選択されるものである、化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｌ１は、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）-である。
【請求項３】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、アリール基、および生物活性剤から成る群から選択され、前記アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、選択的にＯ、Ｓ、またはＮで置換されていてもよいものである。
【請求項４】
請求項１に記載の化学式Ｉの化合物において、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルケニルオキシ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、Ｎ（Ｃ１−４アルキル）（Ｃ１−４アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−４アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−４ルキル、ＳＯ２Ｃ１−４アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−４アルキル、フェニル、およびＣ１−４アルキレンフェニルからなる群から選択されるものである。
【請求項５】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｖ及びｗは、互いに独立して２または３である。
【請求項６】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｖ及びｗは、同じものである。
【請求項７】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｘは、５０〜２００の整数である。
【請求項８】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｘは、１００〜１５０の整数である。
【請求項９】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、５〜１００の整数である。
【請求項１０】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、５〜５０の整数である。
【請求項１１】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｙは、１０〜２０の整数である。
【請求項１２】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｚは、０〜８０の整数である。
【請求項１３】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、ｚは、０〜４０の整数である。
【請求項１４】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、生物活性剤である。
【請求項１５】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される生物活性剤である。
【請求項１６】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、ドキソルビシンである。
【請求項１７】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、シクロスポリンである。
【請求項１８】
請求項１記載の化学式Ｉの化合物において、Ｒ１は、コレステロールである。
【請求項１９】
請求項１〜１３の何れかに記載の化学式Ｉの化合物と生物活性剤とを含む組成物であって、前記化学式Ｉの化合物は、前記生物活性剤の周囲にミセルを形成するものである、組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載の組成物であって、前記化学式Ｉの化合物は、化学結合、静電気的結合、物理的なカプセル化、またはこれ等の任意の組み合わせによって、前記生物活性剤の周囲にミセルを形成するものである。
【請求項２１】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドおよび薬物から成る群から選択されるものである。
【請求項２２】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、タンパク質、および薬物から成る群から選択されるものである。
【請求項２３】
請求項１９記載の組成物において、前記生物活性剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、パクリタクセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、シクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）、ＰＳＣ８３３、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎｅ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびエルゴステロール、デクサメタゾーン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲンズ（ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）、プロゲスチンズ（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎｓ）、デュロモスタロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、ヂエチルシルベストロ−ル（ｄｉｅｔｈｅｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、エチニルエストラジオール（ｅｔｈｉｎｙｌ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、ベクロメタソン（ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ）およびビタミンＤから成る群から選択される薬物である。
【請求項２４】
請求項２３記載の組成物において、前記薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、コレステロール、およびシクロスポリンから選択されるものである。
【請求項２５】
請求項２３記載の組成物において、前記薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）である。
【請求項２６】
化学式ＩＩの化合物であって、
【化２】
Ｌ１は、単結合−Ｃ（Ｏ）−（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２から成る群から選択される結合基であり、
Ｒ１はＨ、ＯＨ，Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキルおよびアリ−ル基から成る群から選択され、前記最後の３個の基は選択的に置換されていてもよく、その際、アルキル、シクロアルキルまたはアリール基の炭素のうち１若しくはそれ以上が、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＮＲ２またはＮ（Ｒ２）２で置換されていてもよいものであり、
Ｒ２はＨまたはＣ１−６アルキルであり、
ｖは１〜４の整数であり、
ここでアリール基は、単環または多縮合環を持つ炭素原子を６〜１４個含む単環式または二環式芳香族であり、また、前記選択的な置換基は、ハロ、ＯＨ、ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルケニルオキシ（ａｌｋｅｎｙｌｏｘｙ）、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１−６アルキル、ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキル、フェニル、およびＣ１−６アルキレンフェニルからなる群から選択される、化合物。
【請求項２７】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１はベンジルである。
【請求項２８】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１はα−コレストリルである。
【請求項２９】
請求項２６記載の化学式ＩＩの化合物において、Ｖは１であり、Ｌ１は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−であり、Ｒ１は水素である。
【請求項３０】
対象に生物活性剤を送達する方法であって、この方法は、
前記対象に、有効量の前記生物活性剤の周囲にミセル生成可能な請求項１記載の化学式Ｉの化合物を投与する工程
を有するものである、方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法において、前記生物活性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、および薬物から成る群から選択されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【公表番号】特表２００９−５３０４４７（Ｐ２００９−５３０４４７Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００６７８（Ｐ２００９−５００６７８）
【出願日】平成１９年３月２１日（２００７．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００４５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６９９７
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０７３８８９６０）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２１日（２００７．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００４５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６９９７
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０７３８８９６０）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ (9)
【Ｆターム（参考）】
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