新規環状ペプチド化合物
以下の一般式（Ｉ）の環状ペプチド化合物：
【化】
（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は明細書中に定義される）またはその塩。化合物（Ｉ）はＣ型肝炎の予防的および／または治療的投与に有用である。
【化】
（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は明細書中に定義される）またはその塩。化合物（Ｉ）はＣ型肝炎の予防的および／または治療的投与に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物に関する。より詳細には、本発明はＣ型肝炎ウイルス（これ以降ＨＣＶと表記）レプリコンのＲＮＡ複製に対して阻害活性を有する新規環状ペプチド化合物またはその塩に関する。特に、本発明は新規ペプチド化合物またはその塩、その調製の方法、新規環状ペプチド化合物またはその塩を含む医薬組成物、およびヒトまたは動物におけるＣ型肝炎の予防的および／または治療的処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの推定キャリア数は全世界で約１億７千万人（約３％）、日本国内でも約１５０万人にのぼる。治療法の第一選択肢であるインターフェロン（以下ＩＦＮと表記）−リバビリン（ビラゾール）併用療法においても、有効率は全型のＨＣＶを通じて４０％、特に日本国内で多くみられるＩＦＮ耐性型のウイルス（ｇeｎoｔｙｐe １ｂ）において有効率は１５〜２０％に過ぎず、一方で副作用の頻度も高い。現行療法ではウイルスの完全駆除は困難である。慢性肝炎が根治できない場合には、肝硬変（３０％）、肝細胞癌（２５％）へと確実に進展する。欧米においてＣ型肝炎は、肝臓移植の主要なインディケーションになっている。しかしながら、移植後の肝臓においてもＨＣＶ再発の頻度が少なくない。従って、有効性、安全性共に改善され、より抗ウイルス効果が高く、Ｃ型肝炎を抑制できる新薬ニーズは、社会的に非常に大きい。
【発明の開示】
【０００３】
本発明における目的環状ペプチド化合物は新規化合物であり、以下の一般式（Ｉ）によって表すことができる。
【化４】
（式中、
Ｒ1は水素または水酸基であり、
Ｒ2は水素または水酸基であり、および
Ｒ3は水素または水酸基である。）
Ｒ1が水素である場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方が水酸基、またはその塩である。
【０００４】
本発明における化合物（Ｉ）またはその塩は以下の反応スキームに例示されるような方法によって調製することができる。
【化５】
（プロセス１）
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は上記の定義の通りである。）
【０００５】
目的化合物の適切な塩（Ｉ）は、例えば無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩など）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ’Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩など）、無機酸付加塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩（ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、塩基性または酸性アミノ酸との塩（アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）などの従来の薬学的に許容できかつ無毒性の塩であり、および塩基または酸付加塩であることもある。
【０００６】
化合物（ＩＩ）またはその塩は、例えば日本国特開平５−２７１２６７に記載された方法に従い、真菌類（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ Ｎｏ．１９３９２：預託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３３６４）の発酵によって製造することができる。
【０００７】
本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩を調製する方法は、以下に詳細に説明されている。
【０００８】
（方法１）
目的化合物（Ｉ）またはその塩は、化合物（ＩＩ）またはその塩を、Ｌｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の発酵によって得られる酵素と接触させることによって調製することができる。
【０００９】
発酵方法は以下に詳細に説明される。
【００１０】
（１．微生物）
酵素は、Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７などのＬｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の培養液より得ることができる。
【００１１】
Ｎｏ．７８８７株は、日本の茨城県から採取した土壌サンプルより分離された。Ｎｏ．７８８７株の分類学的研究については、浜田1)によって記載された方法および培地を採用した。
【００１２】
３０℃で１４日間培養した後観察を行った。形態学的観察は、水道水１０００ｍＬ（１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調節した後、滅菌）中、イーストエキス（大五栄養化学、大阪、日本）０．４ｇ、可溶性デンプン２ｇ、および寒天１６ｇを含む１／５イースト・スターチ寒天上での生育について、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて行った。炭素利用性は、ＰｒｉｄｏｈａｍおよびＧｏｔｔｌｉｅｂの培地2)上で判定した。本試験で用いた色調名は、Ｍｅｔｈｕｅｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｌｏｕｒより援用した3)。化学分類学的特性付けは、鈴木ら4)の方法により実施した。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の系統解析は、中川ら5)の方法により実施した。タイプ株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＤＤＢＪデータベース6)より得た。系統樹は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘパッケージ（バージョン１．８）8)の近隣結合法7)によって構築した。
【００１３】
（２．形態学的特性付け）
基底菌糸は良好に発達し、不規則に枝分かれし、寒天内にも伸長し、寒天表面に密なコロニーを形成した。気中菌糸は１／５イースト・スターチ寒天、グリセリン・アスパラギン寒天、チロシン寒天、ツァペック寒天、イースト・スターチ寒天およびグルコース・アスパラギン寒天上で中等度に発育し、桿状に断片化した。硬質顆粒、胞子嚢および運動性胞子または断片は認められなかった。
【００１４】
（３．培養および生理学的特性）
培養および生理学的特性の結果をそれぞれ表１〜表２および表３〜表４に示す。生育の裏面の色調は赤褐色、橙赤色、褐色を帯びた赤色、褐色を帯びた橙色、明橙色、橙色および淡橙色であった。メラノイド色素は、トリプトン・イーストブロスおよびペプトン・イースト・鉄寒天において生成しなかった。可溶性色素は、イースト・麦芽寒天、オートミール寒天、およびスターチ・無機塩寒天、グリセリン・アスパラギン寒天、チロシン寒天、ベネット寒天、ツァペック寒天、イースト・スターチ寒天、グルコース・アスパラギン寒天、シュークロース・硝酸塩寒天において生成した。菌糸体の色調および可溶性色素は、ｐＨ感受性でなかった。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、蔗糖、イノシトール、Ｄ−マンニトール、セロビオース、デキストリン、Ｄ−ガラクトース、グリセロール、Ｄ−マンノース、マルトース、Ｄ−メリビオース、可溶性デンプン、およびトレハロースは炭素源として利用されたが、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、アドニトール、デキストラン、ダルシトール、イヌリン、乳糖、Ｄ−メレジトース、ソルビトール、Ｌ−ソルボース、およびキシリトールは利用されなかった。
【００１５】
Ｎｏ．７８８７株の生育温度範囲は１０．５から３２．５℃で、至適生育温度は３１．０℃であった。
【００１６】
（４．化学分類学的特性付け）
細胞壁はメソ−ジアミノピメリン酸を含有し、特徴的な糖は含有しなかった（細胞壁化学型ＩＩＩ）。
【００１７】
（５．１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析）
表５にＮｏ．７８８７株の部分配列を示す。Ｎｏ．７８８７株とＬｅｔｚｅａ属株の１６Ｓ ｒＤＮＡの相同値は９７．２〜９９．１％であり、またこれらは系統樹上で単独のクラスターを形成する。
【００１８】
（６．分類）
上述の形態学的および化学的特性および系統解析に基づき、Ｎｏ．７８８７株はＬｅｎｔｚｅａ属に属すると考えられる9,10,11)。従って、この株はＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７と命名された。
【００１９】
このように命名されたＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の培養は、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）、日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−１、ＡＩＳＴ つくばセントラル６、２００４年８月３日に、番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７９の下で寄託されている。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
（表５）
Ｎｏ．７８８７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の一部
ＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＡＧＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＣＣＧＧＡＡ
（参照文献）
１） 浜田 雅（２００１）：放線菌の分類と同定 ｐｐ． ３７ − ４７． 日本放線菌学会（日本、東京）編、日本学会事務センター（日本語）
２） Ｐｒｉｄｏｈａｍ，Ｔ．Ｇ． ａｎｄ Ｄ． Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（１９４８）：Ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｂｙ ｓｏｍｅ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ａｓ ａｎ ａｃｉｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ５６：１０７ − １１４．
３） Ｋｏｒｎｅｒｕｐ， Ａ． ａｎｄ Ｊ． Ｈ． Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）：Ｍｅｔｈｕｅｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｌｏｕｒ， Ｍｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ
４） 鈴木 健一朗, 工藤 卓二（２００１）：放線菌の分類と同定 ｐｐ． ４９ − ８２．日本放線菌学会（日本、東京）編、日本学会事務センター（日本語）
５） 中川恭好, 田村朋彦, 川≡浩子（２００１）：放線菌の分類と同定 ｐｐ． ８３ − １１７．日本放線菌学会（日本、東京）編、日本学士会事務センター（日本語）
６） 日本ＤＮＡデータバンク：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／
７） Ｓａｉｔｏｕ， Ｎ． ＆ Ｍ． Ｎｅｉ：Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ６：５１４−５２５， １９８７
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１０） Ｌａｂｅｄａ， Ｄ． Ｐ．， Ｋ． Ｈａｔａｎｏ， Ｒ． Ｍ． Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｍｕｒａ（２００１）：Ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｌｅｎｔｚｅａ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ ｇｅｎ． ｎｏｖ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５１， １０４５−１０５０．
１１） Ｘｉｅ， Ｑ．， Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｙ． Ｈｕａｎｇ， Ｙ． Ｗｕ， Ｆ Ｂａ ａｎｄ Ｚ Ｌｉｕ（２００２）：Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｎｔｚｅａ ｆｌａｖｉｖｅｒｒｕｃｏｓａ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅａ ｔｏ Ｌｅｎｔｚｅａ ａｌｂｉｄａ． ：Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ５０， １３１５−１３２３
【００２０】
（７．化合物（ＩＩ）またはその塩を酵素と接触させることによる目的化合物（Ｉ）またはその塩の調製）
目的化合物（Ｉ）またはその塩は、水性溶媒内で化合物（ＩＩ）またはその塩を、粗または精製酵素溶液と接触させることによって得ることができる。
【００２１】
酵素の適した例は、Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７９）といった、Ｌｅｎｔｚｅａ属などの一定の微生物によって産生されるものを含んでよい。
【００２２】
この反応は、通常、メタノールまたは反応に悪影響を与えない他のあらゆる溶媒などの１つまたはそれ以上の溶媒を含む水溶液において遂行される。
【００２３】
反応温度は重要でなく、反応は室温でも加温下でも遂行することができる。
【００２４】
より具体的には、目的化合物は、本出願の実施例に記載の方法または同様の方法によって調製することができる。
【００２５】
上述の方法１によって得られる化合物は、粉末化、再結晶化、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、再沈殿化および脱イオン樹脂カラムクロマトグラフィなどの従来法によって分離および精製することができる。
【００２６】
本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩の有用性を示すために、本出願の代表的化合物の薬理学試験の例を以下のように示す。
【００２７】
（試験の例）
（ＨＣＶレプリコン定量）
Ｔａｑ−Ｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、細胞溶解産物より従来のカラム法で精製したレプリコンＲＮＡの量を測定することにより、ＨＣＶレプリコンの複製に対する阻害活性を評価した。Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１００（１９９９）およびＴａｋｅｕｃｈｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に報告された変法によって分析を実施した。その詳細を以下に記載する。
【００２８】
（１．細胞への薬剤の添加）
ＨＣＶレプリコン細胞（Ｋｉｓｈｉｎｅら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． ２９３：９９３−９９９（２００２））をウシ胎児血清を５％およびＧ４１８を３００μｇ／ｍＬ含有するＤ−ＭＥＭ培地０．１ｍＬ中に７．５×１０3個になるよう調製し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウェルに播種した。プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で１６時間インキュベートした後、培地を、被験化合物を溶解した上述の培地と置換した。
【００２９】
（２．細胞からのＲＮＡの抽出）
さらに２日間培養した後、ＲＮＡ抽出カラムＲＮｅａｓｙ９６（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）のプロトコルに従って、細胞より全ＲＮＡを抽出した。
【００３０】
（３．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるレプリコンＲＮＡ量の測定）
適切なプライマーセットを添加してＨＣＶ遺伝子配列の一部および相補プローブ（これらはいずれも宝酒造株式会社によって製造された）を増幅することにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００３１】
２．で抽出したＲＮＡを、ＲＮアーゼ阻害剤を含有しヌクレアーゼを含有しない水で希釈して２５ｎｇ／μＬとし、３８４ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに２μＬ分注した。ＲＴ−ＰＣＲ用反応溶液として、ＴａｑＭａｎ Ｅｚ ＲＴ−ＰＣＲコア試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をプロトコルに従って混合し、各ウェルに８μＬ加えた。
【００３２】
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いることによりＲＴ−ＰＣＲを実施し、各細胞のＨＣＶレプリコンＲＮＡのコピー数を測定した。
【００３３】
連続１０倍希釈した各種濃度のＨＣＶ ＲＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。陰性対照については、ＲＮＡを用いずに反応を実施した。
【００３４】
（４．内因性対照ＲＮＡの測定）
各分析ウェルにおけるＲＮＡ回収量についてのさらなる対照として、上述のように（３．の項）、特異的プライマーセットおよびプローブ（これらはいずれも宝酒造株式会社により製造された）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、細胞グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのコピー数を定量した。
【００３５】
（細胞毒性試験）
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ代謝分析（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を用いてＨＣＶレプリコン細胞における細胞毒性を測定した。レプリコン阻害活性の評価系と同じ条件でＨＣＶレプリコン細胞を培養した後、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ５μＬを各ウェルに加え、細胞を５％ＣＯ2中、３７℃でさらに２時間インキュベートした。蛍光分光計（励起波長５４４ｎｍ、発光波長５９５ｎｍ）により各ウェルの蛍光を測定した。
【００３６】
（試験法）
各時点における内因性対照ＧＡＰＤＨ値で補正し、各濃度の化合物で処理したレプリコン細胞におけるレプリコンＲＮＡのコピー数を用いて、対照（非薬物群、ＤＭＳＯのみを含有する）に対して５０％のＲＮＡレベルを示す化合物濃度を表す化合物のＥＣ５０値を算出した。同様に、各濃度の化合物で処理した細胞の蛍光値を用いて、対照（非薬物群、ＤＭＳＯのみを含有する）の５０％レベルを示す化合物濃度を表すＣＣ５０値を算出した。
【００３７】
（試験結果）
（試験化合物）
実施例３の化合物（２）。
【表６】
【００３８】
上述の試験例の結果より、本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有することが認識される。
【００３９】
本発明における、有効成分として化合物（Ｉ）またはその塩を含有する抗ＨＣＶ薬は、例えば固形、半固形または液状形態の、経口；舌下；バッカル；鼻腔内；呼吸器；非経口（皮内、臓器内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、中心静脈、肝静脈、末梢静脈、リンパ、心血管、動脈、眼周囲への注射または眼周囲の静脈内点滴を含む眼）；眼球、眼球構造または眼球層静脈内点滴；耳道、乳頭房、外耳道および内耳道、鼓膜、鼓室、らせん神経節、迷路などの内耳などの耳；腸；直腸；膣；尿管；および膀胱投与に適した有機または無機担体または賦形剤と混合した医薬組成物の形態で用いることができる。子宮内および周産期適応疾患については、母親の血管内、または空孔（子宮、子宮頚部および膣を含む母親の臓器など）；胎芽、胎児、新生児および複合組織；および羊膜、臍帯、臍動脈および細静脈；胎盤などで投与が実施されるので、非経口投与が好ましい。これらの経路の使用は各患者の状態によって変更する。
【００４０】
化合物（Ｉ）またはその塩は、治療薬として独立して投与することができ、または処方薬の一部として用いることが望まれることがある。本発明による「抗ＨＣＶ薬」は、例えば固形、半固形または液状の形態の、少なくとも１つまたはそれ以上の適した有機または無機担体または賦形剤、または他の薬理学的治療薬と混合した医薬組成物の形態で使用することができる。有効成分は、例えば、顆粒剤、錠剤、植込錠、トローチ、カプセル、または坐剤；クリーム；軟膏；エアロゾル；吸入用の粉末などの固形形態；注射用溶液、乳剤または懸濁剤；経口摂取；点眼；および使用に適した他のあらゆる形態などの液状形態で、通常の薬理学的に許容できかつ無毒性の担体と混合することができる。また、必要であれば、上述の製剤に安定化剤、増粘剤、湿潤剤、硬化剤および着色料；着香料または緩衝剤；または一般的に使用される他のあらゆる添加剤などの助剤が含まれることもある。
【００４１】
化合物（Ｉ）または薬学的に許容できるその塩は、疾患の過程または状態に対し、所望の抗Ｃ型肝炎効果をもたらすのに充分な量で医薬組成物に含まれる。
【００４２】
ＩＦＮおよび／またはリバビリンと化合物（Ｉ）またはその塩との複合使用は、Ｃ型肝炎に対して有効である。
【００４３】
組成物をヒトに投与するためには、静脈内、筋肉内、肺、経口投与、点眼投与または吸入によって投与することが好ましい。治療的に有効な量の化合物（Ｉ）の用量は、年齢および治療される各患者の状態により異なりおよびこれに依存するが、Ｃ型肝炎の治療または予防のために、静脈投与の場合、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．００１〜４００ｍｇの１日用量筋肉内投与の場合は、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．１〜２０ｍｇの１日用量、経口投与の場合、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．５〜５０ｍｇの１日用量を一般に投与する。しかし、これらの用量は、治療的結果を得るためにその限界を超えることを求められることもある。
【００４４】
本発明の単回の単位用量のための組成物に含有される化合物（Ｉ）または薬学的に許容できるその塩の量は、０．１から４００ｍｇ、より好ましくは１から２００ｍｇ、より好ましくは５から１００ｍｇ、具体的には５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００ｍｇである。
【００４５】
包装材料および前記包装材料に収容される上に定められた化合物（Ｉ）を含有する製造品であって、前記化合物（Ｉ）がＣ型肝炎の予防または治療について治療的に有効であり、および前記包装材料が前記化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであることを表示するラベルまたは文書を含む製造品。
【００４６】
上に定められた化合物（Ｉ）を含有する医薬組成物およびこれに関する文書を含む商品包装であって、文書が化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであると述べている商品包装。
【００４７】
化合物（Ｉ）またはその塩は、不斉炭素原子および二重結合による光学異性体および幾何異性体などの立体異性体を１つまたはそれ以上含んでよいこと、および全てのこのような異性体およびその混合物が本発明の範囲に含まれることに留意しなければならない。
【００４８】
化合物（Ｉ）またはその塩は、溶媒和化合物（例：水和物、エタノール溶媒和物など）を含んでよい。
【００４９】
化合物（Ｉ）またはその塩は、結晶型および非結晶型の両者を含んでよい。
【００５０】
化合物（Ｉ）またはその塩は、プロドラッグ型を含んでよい。
【００５１】
さらに、目的化合物（Ｉ）は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有する化合物を調製するための中間体として有用である。
【００５２】
本報に引用した特許明細書および刊行物は、本明細書に参照文献として援用される。
【００５３】
以下の実施例は本発明を例示することを目的として示される。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例１】
【００５４】
（１．Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の発酵）
Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の保存培養を調製し、斜面寒天培地上で維持する。ループ１杯の斜面培養を、２２５ｍＬ三角フラスコ内のコーンフラワー１．０％、変性デンプン６．０％、ファーマメディア１．２％、乾燥酵母０．８％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％およびＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３％およびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ６．５に調節）から構成される種培地６０ｍＬに播種し、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）上で、３０℃で約７２時間振盪した。また、種培養３．２ｍＬを、５００ｍＬ三角フラスコ内の蔗糖０．５％、グルコース０．５％、オートミール０．５％、酵母抽出物０．２％、ペプトン０．５％、ピーナツパウダー０．５％、フミン酸として０．０１％の「ＨＵＭＡＳ」（Ａｉａｉｓｉ株式会社、大阪、日本）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン０．１％およびＣａＣＯ3 ０．２％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節）より構成される無菌種培地１６０ｍＬに移した。フラスコをロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）上で３０℃、約７２時間振盪し、二次培養７．２Ｌ（フラスコ４５本）を、コーンフラワー１．０％、変性デンプン６．０％、ファーマメディア１．２％、乾燥酵母０．８％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、およびＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、アデカノールＬＧ−１０９ ０．０５％およびシリコンＫＭ−７０ ０．０５％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ６．５に調節）より構成される無菌製造培地（１６０Ｌおよび２００Ｌ）に播種した。播種した製造培地は、２００Ｌおよび３００Ｌジャーファーメンター中で、２００ｒｐｍで撹拌され、毎分１６０Ｌ（２００Ｌジャーファーメンター）または２００Ｌ（３００Ｌジャーファーメンター）で通気され、温度３０℃、約７２時間発酵された。培養ブロスを酵素として用い、化合物（ＩＩ）から化合物（Ｉ）を製造した。
【００５５】
（２．反応条件）
下記に開示された化合物（ＩＩｂ）（１８０ｇ）のメタノール（７．２Ｌ）溶液を、上述の発酵によって得られた３６０Ｌの培養ブロスに加えた。３０℃で１３時間撹拌して混合を実施し、反応混合物（Ａ）を得た。以下に示す分析ＨＰＬＣにより、化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）、化合物（４）、化合物（５）、化合物（６）および化合物（７）の増加を観察した。
【化６】
（化合物（ＩＩｂ））
【００５６】
化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）および化合物（４）についての分析ＨＰＬＣ条件
カラム Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−８ ＧＰ １５０−４．６
（長さ１５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、関東化学株式会社）
溶離液 ＴＦＡを０．１％含有する６０％アセトニトリル水溶液
流速 １ｍＬ／分
検出 波長２１０ｎｍの紫外線
保持時間 化合物（１） ７．６分
化合物（２） ４．９分
化合物（３） ６．４分
化合物（４） ５．６分
【００５７】
化合物（５）、化合物（６）および化合物（７）についての分析ＨＰＬＣ条件
カラム Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−４．６
（長さ２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、関東化学株式会社）
溶離液 ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液
流速 １ｍＬ／分
検出 波長２１０ｎｍの紫外線
保持時間 化合物（５） ９．４分
化合物（６） ７．６分
化合物（７） ８．３分
【実施例２】
【００５８】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することにより抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（１２〜２４Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（７．５Ｌ）。有効成分分画（５．１〜７．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（１４Ｌ）。有効成分分画（５．８〜８．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。ＴＦＡを０．１％含有する７０％アセトニトリル水溶液（６．４Ｌ）でカラムを溶離した。有効成分分画（２．８〜３．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する３５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（４Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチルで溶離した（１．８Ｌ）。有効成分分画（０〜０．８Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、１２０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルム−メタノール（９８：２）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９７：３）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を収集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（１）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、３．７ｇの白色粉末として化合物（１）を得た。
【００５９】
化合物（１）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１５７〜１６０℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２１４°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．３４
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０、３３３０、２９６０、１６３０、１５２０、１４１０、１１００ｃｍ-1
【００６０】
化合物（１）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（１）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００６１】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７４．９（ｄ），６９．６（ｄ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．６（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３６．７（ｔ），３４．１（ｑ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２５．３（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．６（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．５（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１５．４（ｑ）
【００６２】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（１）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化７】
【実施例３】
【００６３】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（１５．８〜２０．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（５Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチルで溶離した（３．５Ｌ）。有効成分分画（１〜３Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を酢酸エチル（８０ｍＬ）に溶解し、ｎ−ヘキサン（２．４Ｌ）に滴下した。その後、化合物（２）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、３２．８ｇの白色粉末として化合物（２）を得た。
【００６４】
化合物（２）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１７０〜１７３℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２２２°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５５
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６４０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００６５】
化合物（２）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（２）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００６６】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．３（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．５（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６７．９（ｔ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．３（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．０（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３３．５（ｄ），３１．５（ｔ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．６（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１６．１（ｑ），１５．４（ｑ）
【００６７】
化合物（２）に由来するｐ−ニトロフェニルカーボネートの２−トレオニン残基の水酸基は、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルに変換された。さらに１Ｎ ＮａＯＨで加水分解して化合物（２ａ）を得た。化合物（２ａ）を酢酸エチルより結晶化し、Ｘ線分析により絶対構造を決定した。
【化８】
【００６８】
上述の物理的および化学的性質の分析より、立体化学を含む化合物（２）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化９】
【実施例４】
【００６９】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することにより抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（２０．７〜２４．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（９Ｌ）。有効成分分画（６．７〜８．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（４Ｌ）。有効成分分画（３．０〜３．７Ｌ）を減圧濃縮し、淡黄色粉末として化合物（３）３２２ｍｇを得た。
【００７０】
化合物（３）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６２〜１６５℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２００°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＤＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５０
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６４０，１５３０，１４１０，１２８０，１１００ｃｍ-1
【００７１】
化合物（３）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（３）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００７２】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７４．７（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．３（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．１（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６９．１（ｓ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．０（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．９（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．３（ｔ），４１．０（ｔ），３９．１（ｑ），３８．６（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３１．８（ｑ），３１．０（ｑ），３０．４（ｑ），２９．９（ｑ），２９．８（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．６（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．１（ｑ），１５．０（ｑ）
【００７３】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（３）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化１０】
【実施例５】
【００７４】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（２０．７〜２４．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（９Ｌ）。有効成分分画（５．１〜６．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（４．７Ｌ）。有効成分分画（２．７〜２．９Ｌ）を減圧濃縮し、淡黄色粉末として化合物（４）７４０ｍｇを得た。
【００７５】
化合物（４）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６２〜１６５℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２１５°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＤＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１８８０，１６４０，１５２０，１４１０，１２８０，１１００ｃｍ-1
【００７６】
化合物（４）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（４）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００７７】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６６．１（ｔ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．７（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．２（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３４．０（ｄ），３１．６（ｔ），３１．１（ｑ），３１．０（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．３（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．４（ｑ），１８．１（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．１（ｑ），１５．３（ｑ）
【００７８】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（４）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００７９】
さらに、13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（２）のそれと比較することにより、化合物（４）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１１】
【実施例６】
【００８０】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で溶離した。有効成分分画（１５〜２８Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液で溶離した。有効成分分画（１８．８〜２０．８Ｌ）を減圧下で濃縮してアセトンを除去し、酢酸エチル１Ｌで抽出した。溶媒抽出物（上層）を減圧下で濃縮して油状残渣とした。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、５０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルム−メタノール（９７：３）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９６：４）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を捕集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−２０（５ｍｍ）、関東化学株式会社）にかけた。ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液を用いて流速１０ｍＬ／分でカラムを展開した。有効成分分画を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１９ｍＬ）を通過させた。カラムを水（５０ｍＬ）で洗浄した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶離した。溶離液を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（５）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で乾燥し、白色粉末として化合物（５）２０５ｍｇを得た。
【００８１】
化合物（５）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−１９９°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．４２
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００８２】
化合物（５）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（５）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００８３】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７４．７（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．３（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．１（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７４．９（ｄ），６９．６（ｄ），６９．０（ｓ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．０（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．９（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．３（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．６（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３１．７（ｑ），３１．０（ｑ），３０．４（ｑ），２９．９（ｑ），２９．８（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．５（ｑ），１６．２（ｑ），１５．０（ｑ）
【００８４】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（５）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化１２】
【実施例７】
【００８５】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液の一部を等体積の水で希釈し、２５％アセトンで平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（１０Ｌ）で溶離した。有効成分分画（２．６〜４．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。ＴＦＡを０．１％含有する４５％アセトニトリル水溶液（１３Ｌ）でカラムを溶離した。有効成分分画（８．６〜９．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２２．５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（５Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチル（２Ｌ）で溶離した。有効成分分画（０〜０．５Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（６）を沈殿させた。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、１．３ｇの淡黄色粉末として化合物（６）を得た。
【００８６】
化合物（６）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２０７°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．２９
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００８７】
化合物（６）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（６）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００８８】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．２（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．５（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７５．０（ｄ），６９．６（ｄ），６７．９（ｔ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．３（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３３．５（ｄ），３１．５（ｔ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１６．２（ｑ），１５．４（ｑ）
【００８９】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（６）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００９０】
13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（２）のそれと比較することにより、化合物（６）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１３】
【実施例８】
【００９１】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で溶離した。有効成分分画（１５〜２８Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液で溶離した。有効成分分画（１７．８〜１８．８Ｌ）を減圧下で濃縮してアセトンを除去し、酢酸エチル５００ｍＬで抽出した。溶媒抽出物（上層）を減圧下で濃縮して油状残渣とした。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、５０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルムーメタノール（９７：３）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９６：４）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を捕集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−２０（５ｍｍ）、関東化学株式会社）にかけた。ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液を用いて流速１０ｍＬ／分でカラムを展開した。有効成分分画を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１９ｍＬ）を通過させた。カラムを水（５０ｍＬ）で洗浄した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶離した。溶離液を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（７）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、２２７ｍｇの白色粉末として化合物（７）を得た。
【００９２】
化合物（７）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−１９９°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．４１
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５２０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００９３】
化合物（７）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（７）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００９４】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７２．９（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７５．０（ｄ），６９．６（ｄ），６６．１（ｔ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．７（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．２（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３４．０（ｄ），３１．６（ｔ），３１．１（ｑ），３１．０（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．４（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１５．３（ｑ）
【００９５】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（７）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００９６】
13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（４）のそれと比較することにより、化合物（７）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物に関する。より詳細には、本発明はＣ型肝炎ウイルス（これ以降ＨＣＶと表記）レプリコンのＲＮＡ複製に対して阻害活性を有する新規環状ペプチド化合物またはその塩に関する。特に、本発明は新規ペプチド化合物またはその塩、その調製の方法、新規環状ペプチド化合物またはその塩を含む医薬組成物、およびヒトまたは動物におけるＣ型肝炎の予防的および／または治療的処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの推定キャリア数は全世界で約１億７千万人（約３％）、日本国内でも約１５０万人にのぼる。治療法の第一選択肢であるインターフェロン（以下ＩＦＮと表記）−リバビリン（ビラゾール）併用療法においても、有効率は全型のＨＣＶを通じて４０％、特に日本国内で多くみられるＩＦＮ耐性型のウイルス（ｇeｎoｔｙｐe １ｂ）において有効率は１５〜２０％に過ぎず、一方で副作用の頻度も高い。現行療法ではウイルスの完全駆除は困難である。慢性肝炎が根治できない場合には、肝硬変（３０％）、肝細胞癌（２５％）へと確実に進展する。欧米においてＣ型肝炎は、肝臓移植の主要なインディケーションになっている。しかしながら、移植後の肝臓においてもＨＣＶ再発の頻度が少なくない。従って、有効性、安全性共に改善され、より抗ウイルス効果が高く、Ｃ型肝炎を抑制できる新薬ニーズは、社会的に非常に大きい。
【発明の開示】
【０００３】
本発明における目的環状ペプチド化合物は新規化合物であり、以下の一般式（Ｉ）によって表すことができる。
【化４】
（式中、
Ｒ1は水素または水酸基であり、
Ｒ2は水素または水酸基であり、および
Ｒ3は水素または水酸基である。）
Ｒ1が水素である場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方が水酸基、またはその塩である。
【０００４】
本発明における化合物（Ｉ）またはその塩は以下の反応スキームに例示されるような方法によって調製することができる。
【化５】
（プロセス１）
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は上記の定義の通りである。）
【０００５】
目的化合物の適切な塩（Ｉ）は、例えば無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩など）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ’Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩など）、無機酸付加塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩（ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩など）、塩基性または酸性アミノ酸との塩（アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など）などの従来の薬学的に許容できかつ無毒性の塩であり、および塩基または酸付加塩であることもある。
【０００６】
化合物（ＩＩ）またはその塩は、例えば日本国特開平５−２７１２６７に記載された方法に従い、真菌類（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ Ｎｏ．１９３９２：預託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３３６４）の発酵によって製造することができる。
【０００７】
本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩を調製する方法は、以下に詳細に説明されている。
【０００８】
（方法１）
目的化合物（Ｉ）またはその塩は、化合物（ＩＩ）またはその塩を、Ｌｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の発酵によって得られる酵素と接触させることによって調製することができる。
【０００９】
発酵方法は以下に詳細に説明される。
【００１０】
（１．微生物）
酵素は、Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７などのＬｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の培養液より得ることができる。
【００１１】
Ｎｏ．７８８７株は、日本の茨城県から採取した土壌サンプルより分離された。Ｎｏ．７８８７株の分類学的研究については、浜田1)によって記載された方法および培地を採用した。
【００１２】
３０℃で１４日間培養した後観察を行った。形態学的観察は、水道水１０００ｍＬ（１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調節した後、滅菌）中、イーストエキス（大五栄養化学、大阪、日本）０．４ｇ、可溶性デンプン２ｇ、および寒天１６ｇを含む１／５イースト・スターチ寒天上での生育について、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて行った。炭素利用性は、ＰｒｉｄｏｈａｍおよびＧｏｔｔｌｉｅｂの培地2)上で判定した。本試験で用いた色調名は、Ｍｅｔｈｕｅｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｌｏｕｒより援用した3)。化学分類学的特性付けは、鈴木ら4)の方法により実施した。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の系統解析は、中川ら5)の方法により実施した。タイプ株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列はＤＤＢＪデータベース6)より得た。系統樹は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘパッケージ（バージョン１．８）8)の近隣結合法7)によって構築した。
【００１３】
（２．形態学的特性付け）
基底菌糸は良好に発達し、不規則に枝分かれし、寒天内にも伸長し、寒天表面に密なコロニーを形成した。気中菌糸は１／５イースト・スターチ寒天、グリセリン・アスパラギン寒天、チロシン寒天、ツァペック寒天、イースト・スターチ寒天およびグルコース・アスパラギン寒天上で中等度に発育し、桿状に断片化した。硬質顆粒、胞子嚢および運動性胞子または断片は認められなかった。
【００１４】
（３．培養および生理学的特性）
培養および生理学的特性の結果をそれぞれ表１〜表２および表３〜表４に示す。生育の裏面の色調は赤褐色、橙赤色、褐色を帯びた赤色、褐色を帯びた橙色、明橙色、橙色および淡橙色であった。メラノイド色素は、トリプトン・イーストブロスおよびペプトン・イースト・鉄寒天において生成しなかった。可溶性色素は、イースト・麦芽寒天、オートミール寒天、およびスターチ・無機塩寒天、グリセリン・アスパラギン寒天、チロシン寒天、ベネット寒天、ツァペック寒天、イースト・スターチ寒天、グルコース・アスパラギン寒天、シュークロース・硝酸塩寒天において生成した。菌糸体の色調および可溶性色素は、ｐＨ感受性でなかった。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、蔗糖、イノシトール、Ｄ−マンニトール、セロビオース、デキストリン、Ｄ−ガラクトース、グリセロール、Ｄ−マンノース、マルトース、Ｄ−メリビオース、可溶性デンプン、およびトレハロースは炭素源として利用されたが、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、アドニトール、デキストラン、ダルシトール、イヌリン、乳糖、Ｄ−メレジトース、ソルビトール、Ｌ−ソルボース、およびキシリトールは利用されなかった。
【００１５】
Ｎｏ．７８８７株の生育温度範囲は１０．５から３２．５℃で、至適生育温度は３１．０℃であった。
【００１６】
（４．化学分類学的特性付け）
細胞壁はメソ−ジアミノピメリン酸を含有し、特徴的な糖は含有しなかった（細胞壁化学型ＩＩＩ）。
【００１７】
（５．１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析）
表５にＮｏ．７８８７株の部分配列を示す。Ｎｏ．７８８７株とＬｅｔｚｅａ属株の１６Ｓ ｒＤＮＡの相同値は９７．２〜９９．１％であり、またこれらは系統樹上で単独のクラスターを形成する。
【００１８】
（６．分類）
上述の形態学的および化学的特性および系統解析に基づき、Ｎｏ．７８８７株はＬｅｎｔｚｅａ属に属すると考えられる9,10,11)。従って、この株はＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７と命名された。
【００１９】
このように命名されたＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の培養は、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）、日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１−１、ＡＩＳＴ つくばセントラル６、２００４年８月３日に、番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７９の下で寄託されている。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
（表５）
Ｎｏ．７８８７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の一部
ＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＡＧＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧＴＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＣＧＧＣＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧＣＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＧＴＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＣＣＧＧＡＡ
（参照文献）
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３） Ｋｏｒｎｅｒｕｐ， Ａ． ａｎｄ Ｊ． Ｈ． Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）：Ｍｅｔｈｕｅｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｌｏｕｒ， Ｍｅｔｈｕｅｎ， Ｌｏｎｄｏｎ
４） 鈴木 健一朗, 工藤 卓二（２００１）：放線菌の分類と同定 ｐｐ． ４９ − ８２．日本放線菌学会（日本、東京）編、日本学会事務センター（日本語）
５） 中川恭好, 田村朋彦, 川≡浩子（２００１）：放線菌の分類と同定 ｐｐ． ８３ − １１７．日本放線菌学会（日本、東京）編、日本学士会事務センター（日本語）
６） 日本ＤＮＡデータバンク：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／
７） Ｓａｉｔｏｕ， Ｎ． ＆ Ｍ． Ｎｅｉ：Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ６：５１４−５２５， １９８７
８） Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｄ．； Ｔ． Ｊ． Ｇｉｂｓｏｎ， Ｆ． Ｐｌｅｗｎｉａｋ， Ｆ． Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ ＆ Ｄ． Ｇ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９７）：Ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：４８７６−４８８２
９） Ｙａｓｓｉｎ， Ａ．Ｆ．， Ｆ． Ａ． Ｒａｉｎｅｙ， Ｈ． Ｂｒｚｅｚｉｎｋａ， Ｋ． Ｄ． Ｊａｈｎｋｅ， Ｈ． Ｗｅｉｓｓｂｒｏｄｔ， Ｈ． Ｂｕｄｚｉｋｉｅｗｉｃｚ， Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ， ａｎｄ Ｋ． Ｐ． Ｓｃｈａａｌ（１９９５）：Ｌｅｎｔｚｅａ ｇｅｎ． ｎｏｖ．， ａ ｎｅｗ ｇｅｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ． ：Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４５， ３５７−３６３．
１０） Ｌａｂｅｄａ， Ｄ． Ｐ．， Ｋ． Ｈａｔａｎｏ， Ｒ． Ｍ． Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ， ａｎｄ Ｔ． Ｔａｍｕｒａ（２００１）：Ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｌｅｎｔｚｅａ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒｉａ ｇｅｎ． ｎｏｖ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５１， １０４５−１０５０．
１１） Ｘｉｅ， Ｑ．， Ｙ． Ｗａｎｇ， Ｙ． Ｈｕａｎｇ， Ｙ． Ｗｕ， Ｆ Ｂａ ａｎｄ Ｚ Ｌｉｕ（２００２）：Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｎｔｚｅａ ｆｌａｖｉｖｅｒｒｕｃｏｓａ ｓｐ． ｎｏｖ． ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅａ ｔｏ Ｌｅｎｔｚｅａ ａｌｂｉｄａ． ：Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ５０， １３１５−１３２３
【００２０】
（７．化合物（ＩＩ）またはその塩を酵素と接触させることによる目的化合物（Ｉ）またはその塩の調製）
目的化合物（Ｉ）またはその塩は、水性溶媒内で化合物（ＩＩ）またはその塩を、粗または精製酵素溶液と接触させることによって得ることができる。
【００２１】
酵素の適した例は、Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００７９）といった、Ｌｅｎｔｚｅａ属などの一定の微生物によって産生されるものを含んでよい。
【００２２】
この反応は、通常、メタノールまたは反応に悪影響を与えない他のあらゆる溶媒などの１つまたはそれ以上の溶媒を含む水溶液において遂行される。
【００２３】
反応温度は重要でなく、反応は室温でも加温下でも遂行することができる。
【００２４】
より具体的には、目的化合物は、本出願の実施例に記載の方法または同様の方法によって調製することができる。
【００２５】
上述の方法１によって得られる化合物は、粉末化、再結晶化、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、再沈殿化および脱イオン樹脂カラムクロマトグラフィなどの従来法によって分離および精製することができる。
【００２６】
本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩の有用性を示すために、本出願の代表的化合物の薬理学試験の例を以下のように示す。
【００２７】
（試験の例）
（ＨＣＶレプリコン定量）
Ｔａｑ−Ｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、細胞溶解産物より従来のカラム法で精製したレプリコンＲＮＡの量を測定することにより、ＨＣＶレプリコンの複製に対する阻害活性を評価した。Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１００（１９９９）およびＴａｋｅｕｃｈｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に報告された変法によって分析を実施した。その詳細を以下に記載する。
【００２８】
（１．細胞への薬剤の添加）
ＨＣＶレプリコン細胞（Ｋｉｓｈｉｎｅら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． ２９３：９９３−９９９（２００２））をウシ胎児血清を５％およびＧ４１８を３００μｇ／ｍＬ含有するＤ−ＭＥＭ培地０．１ｍＬ中に７．５×１０3個になるよう調製し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウェルに播種した。プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で１６時間インキュベートした後、培地を、被験化合物を溶解した上述の培地と置換した。
【００２９】
（２．細胞からのＲＮＡの抽出）
さらに２日間培養した後、ＲＮＡ抽出カラムＲＮｅａｓｙ９６（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）のプロトコルに従って、細胞より全ＲＮＡを抽出した。
【００３０】
（３．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるレプリコンＲＮＡ量の測定）
適切なプライマーセットを添加してＨＣＶ遺伝子配列の一部および相補プローブ（これらはいずれも宝酒造株式会社によって製造された）を増幅することにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００３１】
２．で抽出したＲＮＡを、ＲＮアーゼ阻害剤を含有しヌクレアーゼを含有しない水で希釈して２５ｎｇ／μＬとし、３８４ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに２μＬ分注した。ＲＴ−ＰＣＲ用反応溶液として、ＴａｑＭａｎ Ｅｚ ＲＴ−ＰＣＲコア試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をプロトコルに従って混合し、各ウェルに８μＬ加えた。
【００３２】
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いることによりＲＴ−ＰＣＲを実施し、各細胞のＨＣＶレプリコンＲＮＡのコピー数を測定した。
【００３３】
連続１０倍希釈した各種濃度のＨＣＶ ＲＮＡ標準液を用いて検量線を作成した。陰性対照については、ＲＮＡを用いずに反応を実施した。
【００３４】
（４．内因性対照ＲＮＡの測定）
各分析ウェルにおけるＲＮＡ回収量についてのさらなる対照として、上述のように（３．の項）、特異的プライマーセットおよびプローブ（これらはいずれも宝酒造株式会社により製造された）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、細胞グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのコピー数を定量した。
【００３５】
（細胞毒性試験）
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ代謝分析（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を用いてＨＣＶレプリコン細胞における細胞毒性を測定した。レプリコン阻害活性の評価系と同じ条件でＨＣＶレプリコン細胞を培養した後、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ５μＬを各ウェルに加え、細胞を５％ＣＯ2中、３７℃でさらに２時間インキュベートした。蛍光分光計（励起波長５４４ｎｍ、発光波長５９５ｎｍ）により各ウェルの蛍光を測定した。
【００３６】
（試験法）
各時点における内因性対照ＧＡＰＤＨ値で補正し、各濃度の化合物で処理したレプリコン細胞におけるレプリコンＲＮＡのコピー数を用いて、対照（非薬物群、ＤＭＳＯのみを含有する）に対して５０％のＲＮＡレベルを示す化合物濃度を表す化合物のＥＣ５０値を算出した。同様に、各濃度の化合物で処理した細胞の蛍光値を用いて、対照（非薬物群、ＤＭＳＯのみを含有する）の５０％レベルを示す化合物濃度を表すＣＣ５０値を算出した。
【００３７】
（試験結果）
（試験化合物）
実施例３の化合物（２）。
【表６】
【００３８】
上述の試験例の結果より、本発明の目的化合物（Ｉ）またはその塩は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有することが認識される。
【００３９】
本発明における、有効成分として化合物（Ｉ）またはその塩を含有する抗ＨＣＶ薬は、例えば固形、半固形または液状形態の、経口；舌下；バッカル；鼻腔内；呼吸器；非経口（皮内、臓器内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、中心静脈、肝静脈、末梢静脈、リンパ、心血管、動脈、眼周囲への注射または眼周囲の静脈内点滴を含む眼）；眼球、眼球構造または眼球層静脈内点滴；耳道、乳頭房、外耳道および内耳道、鼓膜、鼓室、らせん神経節、迷路などの内耳などの耳；腸；直腸；膣；尿管；および膀胱投与に適した有機または無機担体または賦形剤と混合した医薬組成物の形態で用いることができる。子宮内および周産期適応疾患については、母親の血管内、または空孔（子宮、子宮頚部および膣を含む母親の臓器など）；胎芽、胎児、新生児および複合組織；および羊膜、臍帯、臍動脈および細静脈；胎盤などで投与が実施されるので、非経口投与が好ましい。これらの経路の使用は各患者の状態によって変更する。
【００４０】
化合物（Ｉ）またはその塩は、治療薬として独立して投与することができ、または処方薬の一部として用いることが望まれることがある。本発明による「抗ＨＣＶ薬」は、例えば固形、半固形または液状の形態の、少なくとも１つまたはそれ以上の適した有機または無機担体または賦形剤、または他の薬理学的治療薬と混合した医薬組成物の形態で使用することができる。有効成分は、例えば、顆粒剤、錠剤、植込錠、トローチ、カプセル、または坐剤；クリーム；軟膏；エアロゾル；吸入用の粉末などの固形形態；注射用溶液、乳剤または懸濁剤；経口摂取；点眼；および使用に適した他のあらゆる形態などの液状形態で、通常の薬理学的に許容できかつ無毒性の担体と混合することができる。また、必要であれば、上述の製剤に安定化剤、増粘剤、湿潤剤、硬化剤および着色料；着香料または緩衝剤；または一般的に使用される他のあらゆる添加剤などの助剤が含まれることもある。
【００４１】
化合物（Ｉ）または薬学的に許容できるその塩は、疾患の過程または状態に対し、所望の抗Ｃ型肝炎効果をもたらすのに充分な量で医薬組成物に含まれる。
【００４２】
ＩＦＮおよび／またはリバビリンと化合物（Ｉ）またはその塩との複合使用は、Ｃ型肝炎に対して有効である。
【００４３】
組成物をヒトに投与するためには、静脈内、筋肉内、肺、経口投与、点眼投与または吸入によって投与することが好ましい。治療的に有効な量の化合物（Ｉ）の用量は、年齢および治療される各患者の状態により異なりおよびこれに依存するが、Ｃ型肝炎の治療または予防のために、静脈投与の場合、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．００１〜４００ｍｇの１日用量筋肉内投与の場合は、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．１〜２０ｍｇの１日用量、経口投与の場合、ヒト体重１ｋｇにつき化合物（Ｉ）０．５〜５０ｍｇの１日用量を一般に投与する。しかし、これらの用量は、治療的結果を得るためにその限界を超えることを求められることもある。
【００４４】
本発明の単回の単位用量のための組成物に含有される化合物（Ｉ）または薬学的に許容できるその塩の量は、０．１から４００ｍｇ、より好ましくは１から２００ｍｇ、より好ましくは５から１００ｍｇ、具体的には５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００ｍｇである。
【００４５】
包装材料および前記包装材料に収容される上に定められた化合物（Ｉ）を含有する製造品であって、前記化合物（Ｉ）がＣ型肝炎の予防または治療について治療的に有効であり、および前記包装材料が前記化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであることを表示するラベルまたは文書を含む製造品。
【００４６】
上に定められた化合物（Ｉ）を含有する医薬組成物およびこれに関する文書を含む商品包装であって、文書が化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであると述べている商品包装。
【００４７】
化合物（Ｉ）またはその塩は、不斉炭素原子および二重結合による光学異性体および幾何異性体などの立体異性体を１つまたはそれ以上含んでよいこと、および全てのこのような異性体およびその混合物が本発明の範囲に含まれることに留意しなければならない。
【００４８】
化合物（Ｉ）またはその塩は、溶媒和化合物（例：水和物、エタノール溶媒和物など）を含んでよい。
【００４９】
化合物（Ｉ）またはその塩は、結晶型および非結晶型の両者を含んでよい。
【００５０】
化合物（Ｉ）またはその塩は、プロドラッグ型を含んでよい。
【００５１】
さらに、目的化合物（Ｉ）は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有する化合物を調製するための中間体として有用である。
【００５２】
本報に引用した特許明細書および刊行物は、本明細書に参照文献として援用される。
【００５３】
以下の実施例は本発明を例示することを目的として示される。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例１】
【００５４】
（１．Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の発酵）
Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７の保存培養を調製し、斜面寒天培地上で維持する。ループ１杯の斜面培養を、２２５ｍＬ三角フラスコ内のコーンフラワー１．０％、変性デンプン６．０％、ファーマメディア１．２％、乾燥酵母０．８％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％およびＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３％およびＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ６．５に調節）から構成される種培地６０ｍＬに播種し、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）上で、３０℃で約７２時間振盪した。また、種培養３．２ｍＬを、５００ｍＬ三角フラスコ内の蔗糖０．５％、グルコース０．５％、オートミール０．５％、酵母抽出物０．２％、ペプトン０．５％、ピーナツパウダー０．５％、フミン酸として０．０１％の「ＨＵＭＡＳ」（Ａｉａｉｓｉ株式会社、大阪、日本）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン０．１％およびＣａＣＯ3 ０．２％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節）より構成される無菌種培地１６０ｍＬに移した。フラスコをロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）上で３０℃、約７２時間振盪し、二次培養７．２Ｌ（フラスコ４５本）を、コーンフラワー１．０％、変性デンプン６．０％、ファーマメディア１．２％、乾燥酵母０．８％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．３％、およびＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２％、アデカノールＬＧ−１０９ ０．０５％およびシリコンＫＭ−７０ ０．０５％（６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ６．５に調節）より構成される無菌製造培地（１６０Ｌおよび２００Ｌ）に播種した。播種した製造培地は、２００Ｌおよび３００Ｌジャーファーメンター中で、２００ｒｐｍで撹拌され、毎分１６０Ｌ（２００Ｌジャーファーメンター）または２００Ｌ（３００Ｌジャーファーメンター）で通気され、温度３０℃、約７２時間発酵された。培養ブロスを酵素として用い、化合物（ＩＩ）から化合物（Ｉ）を製造した。
【００５５】
（２．反応条件）
下記に開示された化合物（ＩＩｂ）（１８０ｇ）のメタノール（７．２Ｌ）溶液を、上述の発酵によって得られた３６０Ｌの培養ブロスに加えた。３０℃で１３時間撹拌して混合を実施し、反応混合物（Ａ）を得た。以下に示す分析ＨＰＬＣにより、化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）、化合物（４）、化合物（５）、化合物（６）および化合物（７）の増加を観察した。
【化６】
（化合物（ＩＩｂ））
【００５６】
化合物（１）、化合物（２）、化合物（３）および化合物（４）についての分析ＨＰＬＣ条件
カラム Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−８ ＧＰ １５０−４．６
（長さ１５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、関東化学株式会社）
溶離液 ＴＦＡを０．１％含有する６０％アセトニトリル水溶液
流速 １ｍＬ／分
検出 波長２１０ｎｍの紫外線
保持時間 化合物（１） ７．６分
化合物（２） ４．９分
化合物（３） ６．４分
化合物（４） ５．６分
【００５７】
化合物（５）、化合物（６）および化合物（７）についての分析ＨＰＬＣ条件
カラム Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−４．６
（長さ２５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ、関東化学株式会社）
溶離液 ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液
流速 １ｍＬ／分
検出 波長２１０ｎｍの紫外線
保持時間 化合物（５） ９．４分
化合物（６） ７．６分
化合物（７） ８．３分
【実施例２】
【００５８】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することにより抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（１２〜２４Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（７．５Ｌ）。有効成分分画（５．１〜７．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（１４Ｌ）。有効成分分画（５．８〜８．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。ＴＦＡを０．１％含有する７０％アセトニトリル水溶液（６．４Ｌ）でカラムを溶離した。有効成分分画（２．８〜３．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する３５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（４Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチルで溶離した（１．８Ｌ）。有効成分分画（０〜０．８Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、１２０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルム−メタノール（９８：２）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９７：３）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を収集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（１）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、３．７ｇの白色粉末として化合物（１）を得た。
【００５９】
化合物（１）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１５７〜１６０℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２１４°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．３４
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０、３３３０、２９６０、１６３０、１５２０、１４１０、１１００ｃｍ-1
【００６０】
化合物（１）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（１）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００６１】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７４．９（ｄ），６９．６（ｄ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．６（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３６．７（ｔ），３４．１（ｑ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２５．３（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．６（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．５（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１５．４（ｑ）
【００６２】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（１）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化７】
【実施例３】
【００６３】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（１５．８〜２０．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（５Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチルで溶離した（３．５Ｌ）。有効成分分画（１〜３Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を酢酸エチル（８０ｍＬ）に溶解し、ｎ−ヘキサン（２．４Ｌ）に滴下した。その後、化合物（２）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、３２．８ｇの白色粉末として化合物（２）を得た。
【００６４】
化合物（２）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１７０〜１７３℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２２２°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５５
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６４０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００６５】
化合物（２）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（２）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００６６】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．３（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．５（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６７．９（ｔ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．３（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．０（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３３．５（ｄ），３１．５（ｔ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．６（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１６．１（ｑ），１５．４（ｑ）
【００６７】
化合物（２）に由来するｐ−ニトロフェニルカーボネートの２−トレオニン残基の水酸基は、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルに変換された。さらに１Ｎ ＮａＯＨで加水分解して化合物（２ａ）を得た。化合物（２ａ）を酢酸エチルより結晶化し、Ｘ線分析により絶対構造を決定した。
【化８】
【００６８】
上述の物理的および化学的性質の分析より、立体化学を含む化合物（２）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化９】
【実施例４】
【００６９】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することにより抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（２０．７〜２４．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（９Ｌ）。有効成分分画（６．７〜８．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（４Ｌ）。有効成分分画（３．０〜３．７Ｌ）を減圧濃縮し、淡黄色粉末として化合物（３）３２２ｍｇを得た。
【００７０】
化合物（３）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６２〜１６５℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２００°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＤＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５０
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６４０，１５３０，１４１０，１２８０，１１００ｃｍ-1
【００７１】
化合物（３）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（３）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００７２】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７４．７（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．３（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．１（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６９．１（ｓ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．０（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．９（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．３（ｔ），４１．０（ｔ），３９．１（ｑ），３８．６（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３１．８（ｑ），３１．０（ｑ），３０．４（ｑ），２９．９（ｑ），２９．８（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．６（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．１（ｑ），１５．０（ｑ）
【００７３】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（３）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化１０】
【実施例５】
【００７４】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で洗浄した後、６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（２４Ｌ）。有効成分分画（０〜１２Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（３１Ｌ）。有効成分分画（２０．７〜２４．７Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（９Ｌ）。有効成分分画（５．１〜６．１Ｌ）を等体積の水で希釈し、３０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１Ｌ）を通過させた。カラムを６０％アセトニトリル水溶液で溶離した（４．７Ｌ）。有効成分分画（２．７〜２．９Ｌ）を減圧濃縮し、淡黄色粉末として化合物（４）７４０ｍｇを得た。
【００７５】
化合物（４）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６２〜１６５℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２１５°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ14
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２３５（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＤＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．５
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１８８０，１６４０，１５２０，１４１０，１２８０，１１００ｃｍ-1
【００７６】
化合物（４）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（４）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００７７】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１２９．８（ｄ），１２７．１（ｄ），７５．２（ｄ），６９．６（ｄ），６６．１（ｔ），６１．５（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．７（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．２（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．６（ｄ），３７．３（ｔ），３４．１（ｑ），３４．０（ｄ），３１．６（ｔ），３１．１（ｑ），３１．０（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．３（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．４（ｑ），１８．１（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．１（ｑ），１５．３（ｑ）
【００７８】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（４）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００７９】
さらに、13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（２）のそれと比較することにより、化合物（４）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１１】
【実施例６】
【００８０】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で溶離した。有効成分分画（１５〜２８Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液で溶離した。有効成分分画（１８．８〜２０．８Ｌ）を減圧下で濃縮してアセトンを除去し、酢酸エチル１Ｌで抽出した。溶媒抽出物（上層）を減圧下で濃縮して油状残渣とした。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、５０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルム−メタノール（９７：３）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９６：４）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を捕集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−２０（５ｍｍ）、関東化学株式会社）にかけた。ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液を用いて流速１０ｍＬ／分でカラムを展開した。有効成分分画を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１９ｍＬ）を通過させた。カラムを水（５０ｍＬ）で洗浄した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶離した。溶離液を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（５）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で乾燥し、白色粉末として化合物（５）２０５ｍｇを得た。
【００８１】
化合物（５）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−１９９°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．４２
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００８２】
化合物（５）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（５）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００８３】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７４．７（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．３（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．１（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７４．９（ｄ），６９．６（ｄ），６９．０（ｓ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．０（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．９（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．３（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．６（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３１．７（ｑ），３１．０（ｑ），３０．４（ｑ），２９．９（ｑ），２９．８（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．５（ｑ），１６．２（ｑ），１５．０（ｑ）
【００８４】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（５）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【化１２】
【実施例７】
【００８５】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液の一部を等体積の水で希釈し、２５％アセトンで平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（１０Ｌ）で溶離した。有効成分分画（２．６〜４．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。ＴＦＡを０．１％含有する４５％アセトニトリル水溶液（１３Ｌ）でカラムを溶離した。有効成分分画（８．６〜９．６Ｌ）を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２２．５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（２Ｌ）を通過させた。カラムを水（５Ｌ）で洗浄した後、酢酸エチル（２Ｌ）で溶離した。有効成分分画（０〜０．５Ｌ）を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（６）を沈殿させた。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、１．３ｇの淡黄色粉末として化合物（６）を得た。
【００８６】
化合物（６）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：淡黄色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−２０７°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１、Ｒｆ ０．２９
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５３０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００８７】
化合物（６）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（６）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００８８】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．２（ｓ），１７４．５（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７３．０（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．５（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７５．０（ｄ），６９．６（ｄ），６７．９（ｔ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．３（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．２（ｔ），４１．１（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３３．５（ｄ），３１．５（ｔ），３１．０（ｑ），３０．８（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．６（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．３（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．３（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１６．２（ｑ），１５．４（ｑ）
【００８９】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（６）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００９０】
13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（２）のそれと比較することにより、化合物（６）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１３】
【実施例８】
【００９１】
実施例１（２）で得た反応混合物（Ａ）（３６０Ｌ）に、室温で等体積のアセトンを添加することによって抽出した。混合物を珪藻土により濾過した。濾液を等体積の水で希釈し、２５％アセトン水溶液で平衡化したＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学株式会社）カラム（１４Ｌ）を通した。カラムを２５％アセトン水溶液（４２Ｌ）で洗浄した後、メタノールで溶離した（４０Ｌ）。有効成分分画（７〜３７Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液（２８Ｌ）で溶離した。有効成分分画（１５〜２８Ｌ）を等体積の水で希釈し、２５％アセトニトリル水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（８Ｌ）を通過させた。カラムを５０％アセトニトリル水溶液で溶離した。有効成分分画（１７．８〜１８．８Ｌ）を減圧下で濃縮してアセトンを除去し、酢酸エチル５００ｍＬで抽出した。溶媒抽出物（上層）を減圧下で濃縮して油状残渣とした。乾燥した材料を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲル（シリカゲル６０Ｎ、球状、中性、４０〜１００μｍ、関東化学株式会社、５０ｇ）にかけた。カラムをクロロホルムーメタノール（９７：３）で洗浄し、クロロホルム−メタノール（９６：４）およびクロロホルム−メタノール（９５：５）で溶離した。有効成分分画を捕集し、減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ ２５０−２０（５ｍｍ）、関東化学株式会社）にかけた。ＴＦＡを０．１％含有する５０％アセトニトリル水溶液を用いて流速１０ｍＬ／分でカラムを展開した。有効成分分画を等体積の水で希釈し、ＴＦＡを０．０５％含有する２５％メタノール水溶液で平衡化したＤａｉｓｏｇｅｌ ＳＰ−１２０−ＯＤＳ−Ｂ（１５／３０ｍｍ、ダイソー株式会社、日本）カラム（１９ｍＬ）を通過させた。カラムを水（５０ｍＬ）で洗浄した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶離した。溶離液を減圧下で濃縮乾固した。乾燥した材料を少量の酢酸エチルに溶解し、大量のｎ−ヘキサンに加えた。その後、化合物（７）を沈殿させ、ガラスフィルターで濾過した。この沈殿を減圧下で蒸発乾固し、２２７ｍｇの白色粉末として化合物（７）を得た。
【００９２】
化合物（７）は以下の物理化学的特性を有している。
外観：白色粉末
性状：中性物質
融点：１６３〜１６７℃（分解）
比旋光度：［α］23D−１９９°（ｃ１．０，ＣＨ2Ｃｌ2）
分子式：Ｃ62Ｈ111Ｎ11Ｏ15
分子量：ＥＳＩ−ＭＳ（＋）ｍ／Ｚ １２５１（Ｍ＋Ｈ）
溶解度：やや溶けやすい：ＣＨＣｌ3、ＭｅＯＨ、酢酸エチル、アセトン、ＤＭＳＯ、ピリジン
溶けにくい：Ｈ2Ｏ
溶けない：ｎ−ヘキサン
呈色反応：陽性：ヨウ素蒸気反応
陰性：
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）：シリカゲル６０ Ｆ２５４（メルク）ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１０：１、Ｒｆ ０．４１
赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ ３４２０，３３３０，２９６０，１６３０，１５２０，１４１０，１１００ｃｍ-1
【００９３】
化合物（７）は、一般的な有機溶媒中において、数種類の安定したコンホメーションで存在する。一例として、ピリジン−ｄ5中での化合物（７）の主要コンホーマによる13Ｃ−ＮＭＲ化学シフトを以下に挙げる。
【００９４】
13Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ5、１２５ＭＨｚ）
δ：１７５．１（ｓ），１７４．４（ｓ），１７４．４（ｓ），１７３．４（ｓ），１７２．９（ｓ），１７２．９（ｓ），１７１．０（ｓ），１７０．９（ｓ），１７０．４（ｓ），１６９．５（ｓ），１６９．０（ｓ），１３３．９（ｄ），１２８．７（ｄ），７５．０（ｄ），６９．６（ｄ），６６．１（ｔ），６３．１（ｔ），６１．４（ｄ），５９．３（ｄ），５７．３（ｄ），５５．７（ｄ），５５．７（ｄ），５４．６（ｄ），４９．０（ｔ），４８．６（ｄ），４８．１（ｄ），４７．４（ｄ），４６．６（ｄ），４１．３（ｔ），４１．２（ｔ），３９．１（ｑ），３８．５（ｔ），３８．２（ｔ），３７．３（ｄ），３６．８（ｔ），３４．１（ｑ），３４．０（ｄ），３１．６（ｔ），３１．１（ｑ），３１．０（ｑ），２９．９（ｑ），２８．８（ｑ），２７．７（ｄ），２５．９（ｄ），２５．６（ｄ），２４．９（ｄ），２４．８（ｄ），２４．１（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２３．２（ｑ），２２．８（ｑ），２１．２（ｑ），２０．９（ｑ），１９．７（ｑ），１９．３（ｑ），１８．４（ｑ），１８．１（ｑ），１７．４（ｑ），１６．２（ｑ），１５．３（ｑ）
【００９５】
上述の物理的および化学的性質の分析、およびさらなる化学構造同定研究の結果より、化合物（７）の化学構造は以下の通りに同定され、割り当てられた。
【００９６】
13Ｃ−ＮＭＲデータを化合物（４）のそれと比較することにより、化合物（７）中のＮ−メチル−ヒドロキシロイシンの立体化学を決定した。
【化１４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）の環状ペプチド化合物またはその塩。
【化１】
（式中、
Ｒ1は水素または水酸基であり、
Ｒ2は水素または水酸基であり、および
Ｒ3は水素または水酸基である。
Ｒ1が水素である場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方が水酸基である。）
【請求項２】
以下の一般式（Ｉ）の環状ペプチド化合物：
【化２】
（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は上記に定義される）またはその塩を生成する方法であって、以下の式（ＩＩ）の環状ペプチド化合物（ＩＩ）：
【化３】
またはその塩を、Ｌｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の培養により得られる酵素と接触させることを含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記微生物の株がＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７である方法。
【請求項４】
Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７。
【請求項５】
有効成分として、薬学的に許容できる担体または賦形剤と混合した請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項６】
治療薬の製造を目的とした請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩の使用。
【請求項７】
治療薬としての使用を目的とした請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩。
【請求項８】
Ｃ型肝炎の予防的および／または治療的処置のための方法であって、請求項１の化合物または薬学的に許容できるその塩をヒトまたは動物に投与することを含む方法。
【請求項９】
請求項４に記載の医薬組成物およびこれに関する文書を含む商品包装であって、前記文書が前記医薬組成物をＣ型肝炎の予防または治療のために用いることができるまたは用いるべきであると述べている商品包装。
【請求項１０】
包装材料および前記包装材料に収容される請求項１に定義する化合物（Ｉ）を含有する製造品であって、前記化合物（Ｉ）がＣ型肝炎の予防または治療について治療的に有効であり、および前記包装材料が前記化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであることを表示したラベルまたは文書を含む製造品。
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）の環状ペプチド化合物またはその塩。
【化１】
（式中、
Ｒ1は水素または水酸基であり、
Ｒ2は水素または水酸基であり、および
Ｒ3は水素または水酸基である。
Ｒ1が水素である場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方が水酸基である。）
【請求項２】
以下の一般式（Ｉ）の環状ペプチド化合物：
【化２】
（式中Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は上記に定義される）またはその塩を生成する方法であって、以下の式（ＩＩ）の環状ペプチド化合物（ＩＩ）：
【化３】
またはその塩を、Ｌｅｎｔｚｅａ属に属する微生物の酵素産生株の培養により得られる酵素と接触させることを含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記微生物の株がＬｅｎｔｚｅａ ｓｐ．Ｎｏ．７８８７である方法。
【請求項４】
Ｌｅｎｔｚｅａ ｓｐ． Ｎｏ．７８８７。
【請求項５】
有効成分として、薬学的に許容できる担体または賦形剤と混合した請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩を含む医薬組成物。
【請求項６】
治療薬の製造を目的とした請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩の使用。
【請求項７】
治療薬としての使用を目的とした請求項１に記載の化合物または薬学的に許容できるその塩。
【請求項８】
Ｃ型肝炎の予防的および／または治療的処置のための方法であって、請求項１の化合物または薬学的に許容できるその塩をヒトまたは動物に投与することを含む方法。
【請求項９】
請求項４に記載の医薬組成物およびこれに関する文書を含む商品包装であって、前記文書が前記医薬組成物をＣ型肝炎の予防または治療のために用いることができるまたは用いるべきであると述べている商品包装。
【請求項１０】
包装材料および前記包装材料に収容される請求項１に定義する化合物（Ｉ）を含有する製造品であって、前記化合物（Ｉ）がＣ型肝炎の予防または治療について治療的に有効であり、および前記包装材料が前記化合物（Ｉ）をＣ型肝炎の予防または治療に用いることができるまたは用いるべきであることを表示したラベルまたは文書を含む製造品。
【公表番号】特表２００８−５２０５４３（Ｐ２００８−５２０５４３Ａ）
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２３３４（Ｐ２００７−５２２３３４）
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２１７４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５４８０１
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２１７４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５４８０１
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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