有機酸オリゴマーの製造方法
【課題】有機酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを一つの目的とする。
【解決手段】 有機酸オリゴマーの製造方法を、アルキルアミンと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備えるものとする。
【解決手段】 有機酸オリゴマーの製造方法を、アルキルアミンと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備えるものとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸オリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸である乳酸の重合体であるポリ乳酸は手術用糸などの医療用材料、食器・食品容器・包装材、フィルムへの応用から発展し，近年では家電から自動車用材料まで幅広い分野へと広がりを見せている。近年、ポリ乳酸はトウモロコシ、サトウキビなどのバイオマス資源より得られるグルコースを原料にして乳酸菌や酵母などの微生物を用いて乳酸発酵し、乳酸を精製したのち、重合法により製造されるようになってきている。ポリ乳酸を効率的かつ低コストで製造するためには、乳酸発酵液から乳酸を安価な方法で分離回収する方法が必要である。乳酸を分離回収する方法としては、（１）溶媒抽出・逆抽出法による回収、（２）アンモニア中和発酵・エステル蒸留法、（３）乳酸カルシウム沈殿法・溶媒抽出法及び（４）溶媒抽出発酵法が報告されている。
【０００３】
（１）の溶媒抽出・逆抽出法は、乳酸を非水性相（第三級アミン）中で優先的に抽出し、次いでその非水性相中の乳酸を縮合させてオリゴマーを生成させて分離し、乳酸を含有する非水性相から乳酸を蒸留および他の溶媒中へ逆抽出して分離する方法である（特許文献１）。また、（２）のアンモニア中和発酵・エステル蒸留法は、アンモニアで中和しながら乳酸発酵を行い、該発酵により得られた乳酸アンモニウムを加熱濃縮し、ｎ−ブチルアルコールなどのアルコールを添加して加熱することにより乳酸ブチルとし、酸触媒存在下で加熱加水分解して乳酸を得る方法である（特許文献２）。また、（３）の乳酸カルシウム沈殿法・溶媒抽出法は、炭酸カルシウムなどの塩基存在下で乳酸発酵して得られた乳酸カルシウムを硫酸で酸性化して乳酸と硫酸カルシウムとし、該乳酸をアミン抽出剤で溶媒するか又は乳酸含有溶媒の逆抽出により乳酸を精製する方法である（特許文献３，４）。さらに、（４）の溶媒抽出発酵法は、固定化乳酸菌を用いて乳酸発酵させ、発酵液の一部を取り出してオレイルアルコールで希釈したＡｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）と接触させて乳酸を抽出し、乳酸抽出後の発酵液を発酵層に返送するという溶媒抽出発酵法である（非特許文献１）。
【特許文献１】特表２００１−５１９１７８号
【特許文献２】特開平６−３１１８８６号
【特許文献３】特表２００３−５１１３６０号
【特許文献４】特表２００３−５１８４７６号
【非特許文献１】Ｙａｂａｎｎａｖａｒ ＶＭ， Ｗａｎｇ ＤＩ．， １９８７． Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５０６：５２３−３５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記（１）の方法では、第三級アミンを主成分とした抽出溶媒であるため、乳酸の抽出効率が低かった。また、上記（２）の方法では、濃縮、エステル化、蒸留、加水分解などの工程で多量の熱エネルギーを必要とするだけでなく、工程が煩雑で乳酸の回収率が低くなってしまう。さらに、上記（３）の方法では、硫酸の回収再利用が困難であり、廃棄物として硫酸カルシウムが発生してしまう。また、上記（４）の方法では、第三級アミンとオレイルアルコール（第一級アルコール）からなる溶媒を用いると、乳酸の抽出効率は高いが、その抽出溶媒中で乳酸の重合反応を行うと、乳酸とオレイルアルコールがエステル交換し、乳酸オレイルエステル（乳酸アルキルエステル）が生成するために乳酸の重合化が阻害され、抽出溶媒から乳酸を重合体として分離回収することができない。
【０００５】
このように、上記（１）〜（３）によれば、抽出効率、エネルギーコスト等の観点から問題があり、上記（１）〜（４）のいずれも、乳酸を抽出分離後の工程であって、ポリ乳酸の合成のための前段階である乳酸オリゴマーの合成工程が考慮されていないため、乳酸の分離回収から乳酸オリゴマーの合成までの工程を通じて観た場合、工程数の多さや操作の煩雑さは否めなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、有機酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを一つの目的とする。また、有機酸オリゴマーの製造に適した有機酸の抽出方法を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、ポリ乳酸の効率的な製造方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、乳酸などの有機酸の抽出分離及びオリゴマー化の効率化について種々検討したところ、有機酸オリゴマーの合成及び分離に適した媒体を見出した。さらに、この媒体を用いることにより、有機酸含有水性溶液からの有機酸抽出に用いることにより、有機酸の抽出分離と有機酸オリゴマーの製造とを効率的又は連続的に実施できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、有機酸オリゴマーの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える製造方法が提供される。
【０００９】
この発明において、前記アルキルアミンは第３級アミン及び第２級アミンから選択される１種又は２種以上を含んでおり、さらに、前記キャリアはアルキルアミンであり、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン及びトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンから選択される１種又は２種以上を含むことができる。
【００１０】
また、この発明において前記キャリアはトリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されてもよい。
【００１１】
また、この発明において、前記第３級アルコールは、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノールからなる群から選択される１種又は２種以上を含むことができる。さらに、前記第３級アルコールは、テルピネオール及びイソフィトールのいずれかを含むことができる。
【００１２】
また、この発明において、前記非アルコール類は、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上であるとすることができる。
【００１３】
この発明においては、前記反応溶媒は、２０ｖｏｌ％以上の前記アルキルアミンを含有することができる。
【００１４】
この発明においては、前記有機酸オリゴマーを前記反応溶媒から分離する工程を備えることができる。
【００１５】
この発明においては、前記有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて前記有機酸を抽出する抽出工程を備えることもできる。前記抽出工程における前記有機酸含有水性溶液は有機酸生産酵母による有機酸発酵液を含有することができるし、前記有機酸発酵液は、有機酸を発酵生産中の培養液を含んだものであってもよい。さらに、前記抽出工程は、前記培養液と前記反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する培養工程を含むことができる。前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程としてもよい。
【００１６】
この発明においては、前記有機酸は乳酸とすることができる。また、前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母としてもよく、前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択されていてもよい。
【００１７】
本発明によれば、有機酸の抽出方法であって、有機酸含有水性溶液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有さない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法が提供される。また、本発明によれば、有機酸の生産方法であって、有機酸を発酵生産する工程と、前記有機酸発酵生産工程で得られる有機酸を含有する有機酸発酵液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法も提供される。さらに本発明によれば、脂肪族ポリエステルの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程と、該乳酸オリゴマーを用いて脂肪族ポリエステルを合成する工程と、を備える、製造方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、アルキルアミンと、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上を含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える有機酸オリゴマーの製造方法に関する。本発明の有機酸オリゴマーの製造方法によれば、上記反応溶媒に有機酸が溶解でき、上記反応溶媒内で有機酸のオリゴマー化反応を実施できるため、有機酸オリゴマーの製造を効率的に行うことができる。さらに、上記反応溶媒において、有機酸オリゴマーは不溶性となる傾向があるため、沈殿物として容易に分離回収することも可能である。
【００１９】
さらに、このオリゴマー合成工程の前段側において、有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて有機酸を抽出する抽出工程を備える、有機酸含有水性溶液からの有機酸の分離回収を前記反応溶媒を用いて行うことで、分離回収からオリゴマー合成までを効率的に実施できる。さらに、こうしたオリゴマー合成工程を備える脂肪族ポリエステルの製造方法によれば、効率的にポリ乳酸などの脂肪族ポリエステルを製造できる。
【００２０】
本発明は、また、有機酸含有水性溶液に、上記反応溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程を備える方法に関する。この抽出方法によれば、有機酸含有水性溶液から有機酸を容易に抽出できるとともに、有機酸を含有する上記反応溶媒内においてそのまま有機酸オリゴマーの合成工程を実施できる。このため、オリゴマー合成ひいてはポリマー合成に好ましい有機酸の抽出方法となっている。
【００２１】
以下、本発明の実施形態である、有機酸オリゴマーの製造方法、有機酸の抽出方法、有機酸の製造方法及び脂肪族ポリエステルの製造方法について適宜図面を参照しながら説明する。
【００２２】
（有機酸オリゴマーの製造方法）
（有機酸）
本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸、グリコール酸、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ吉草酸が挙げられる。なかでも、乳酸、ポリグリコール酸等のα−ヒドロキシ酸が好ましい。特に好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【００２３】
（有機酸オリゴマー）
有機酸オリゴマーとしては、上記各種有機酸のオリゴマーを意味する。有機酸オリゴマーは、水酸基とカルボキシル基とを備える有機酸のオリゴマーであればよいが、好ましくはα−ヒドロキシ酸のオリゴマーである。こうした有機酸オリゴマーとしては、例えば、乳酸オリゴマー、グリコール酸オリゴマー、３−ヒドロキシ酪酸オリゴマー、４−ヒドロキシ酪酸オリゴマー、４−ヒドロキシ吉草酸オリゴマーなどが挙げられる。なかでも、工業的に利用されているポリ乳酸の前駆体である乳酸オリゴマーやグリコール酸オリゴマーが挙げられる。なお、ここでオリゴマーとは、単量体ユニットとしての上記有機酸が２個以上３０個以下重合したものを含んでいる。有機酸オリゴマーは、通常有機酸が１０個以上３０個以下の範囲の重合体であることが多い。
【００２４】
（脂肪族ポリエステル）
なお、本発明における脂肪族ポリエステルとしては、上記有機酸ポリマーが挙げられる。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（４−ヒドロキシ吉草酸）などである。なかでも、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリ（α−ヒドロキシ酸）が好ましく、ポリ乳酸が特に好ましい。
【００２５】
（有機酸オリゴマーの反応溶媒）
本発明の有機酸オリゴマーの製造方法において用いる反応溶媒は、アルキルアミンと、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。反応溶媒は、好ましくは、含有することが不可避である不純物以外はキャリアとこれらのアルコール類及び非アルコール類とからなる。
【００２６】
アルキルアミンは、特に有機酸を捕捉して反応溶媒側に分配させるためのキャリアである。アルキルアミンとしては、オリゴマー化しようとする有機溶媒に対してこうしたキャリア機能を発揮できるものを１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。こうしたアルキルアミンとしては、有機溶媒に可溶な第二級アミン又は第三級アミンが好ましく、より好ましくは第三級アミンである。こうしたキャリアとしては、ジ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（商品名、コグニス社製））、トリラウリルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３０４（商品名、コグニス社製））等が挙げられる。また、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＬＡ−１（各アルキル連鎖に１２個の炭素原子を有するジアルキルアミンの混合物）等の第二級アミンも挙げられる。
【００２７】
これらのアルキルアミンは、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドであり、より好ましくは、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（商品名、コグニス社製））である。なお、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンは、アルキル基として、オクチル基、ノニル基及びデシル基から選択される１種又は２種以上のアルキル基を全体として３個備えることができる。また、オクチル基及び／またはデシル基のみを備えることもできる。トリ−ｎ−デシルアミンを用いることも好ましい。例えば、Alamine３３６は、トリ−ｎ−オクチルアミン、ジ−ｎ−オクチル−モノ−ｎ−デシル−アミンなどのトリ-ｎ-Ｃ８〜Ｃ１０アミンを含むことができるほか、ジ−ｎ−デシル−モノ−ｎ−ドデシルアミン、トリ−ｎ−ドデシルアミン等を含有することができる。
【００２８】
また、他のキャリアとしては、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドが挙げられる。
【００２９】
この反応溶媒において、第３級アルコール及びエステル基を含まない非アルコール類は、有機酸を溶解し抽出するのを補足するとともに、有機酸含有水性溶液が有機酸生産性菌体を培養液である場合には、こうした菌体に対するアルキルアミンの毒性を低減するための希釈剤として機能する場合もある。これらの各種の溶媒は、こうした機能を発揮できる範囲で１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なお、第１級アルコールを使用しないのは、第１級アルコールを用いると、有機酸オリゴマー合成が大きく阻害されるからである。また、エステル基を含有しない非アルコール類を用いるのは、エステル基を含んでいると、生成したオリゴヌクレオチドとエステル交換反応を生じて、結果として有機酸オリゴマーの生成を阻害するからである。なお、第３級アルコールは、エステル基を含有しない化合物を意味している。
【００３０】
第３級アルコールとしては、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノール等が挙げられる。なかでも、テルピネオール、イソフィトール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタールを好ましく用いることができる。さらに好ましくは、テルピネオール、イソフィトールである。
【００３１】
また、エステル基を含有しない非アルコール類としては、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、ドデカン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイル等が挙げられる。
【００３２】
オリゴマー化反応溶媒には、好ましくは、第３級アルコールを用い、より好ましくは第３級アルコールのみを用いる。第３級アルコールを用いることで、アルキルアミンとともに有機酸の溶解性を高めることができるほか、有機酸生産菌体を含有する培養液と接触させた場合に、菌体に対する毒性を低くする場合もあるからである。また、第３級アルコールは、乳酸のオリゴマー化阻害を防ぐ効果もある。
【００３３】
反応溶媒においては、アルキルアミンを２０ｖｏｌ％以上含有することが好ましい。この範囲のキャリア濃度を有していると、良好な反応効率を得ることができる。また反応溶媒を有機酸含有水性溶液からの有機酸の抽出溶媒として用いる際、良好な抽出効率と菌体への低毒性を確保することが容易である。抽出効率や反応効率の観点からは、より好ましくは２５ｖｏｌ％以上であり、さらに好ましくは３０ｖｏｌ％以上であり、一層好ましくは４０ｖｏｌ％以上である。なお、反応溶媒においては、残部が上記した希釈剤であることが好ましい。
【００３４】
反応溶媒は、具体的には、２０ｖｏｌ％以上のトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン又はトリ−ｎ−デシルアミンを含有する第３アルコールを用いることが好ましく、より好ましくは２５ｖｏｌ％以上である。２０ｖｏｌ％以上であれば、それよりも少ない場合に比して顕著に高い乳酸の溶解ないし抽出が可能であるからである。また、２５ｖｏｌ％以上であれば、ほぼ安定した有機酸の溶解性や抽出性が得られるからである。一方、これらのキャリアについては上限は８０ｖｏｌ％以下とすることできる。また、有機酸培養液から有機酸を抽出することを考慮すると、上限は、７５ｖｏｌ％以下であることが好ましい。したがって、有機酸生産微生物培養液から有機酸を抽出するなどするときには、このキャリアを２５ｖｏｌ％以上７５ｖｏｌ％以下を含むテルピネオール及び／又はイソフィトールを好ましく用いることができる。
【００３５】
（有機酸オリゴマーの合成）
こうした反応溶媒中で有機酸から有機酸オリゴマーを合成するには、反応溶媒を加熱すればよい。加熱により有機酸が脱水して縮合し有機酸オリゴマーが生成する。加熱温度は、有機酸からオリゴマーが生成できる範囲であれば特に限定しないが、好ましくは１３０℃以上２００℃以下である。この範囲であるとイソフィトールなどの第３級アルコールからの第１級アルコールの生成を防止でき、第１級アルコールによって有機酸オリゴマーの合成が阻害されにくいからである。
【００３６】
（有機酸オリゴマーの分離）有機酸オリゴマーは、この反応溶媒への溶解性が高くないため、反応の進行に伴い、反応溶媒中に沈殿する。したがって、反応後、固液分離工程を実施すれば、容易に有機酸オリゴマーを分離回収することができる。なお、反応終了後には、有機酸オリゴマーの反応溶媒への溶解性を調節するため適宜反応溶媒組成を調製したり、温度を調整したりすることもできる。
【００３７】
（脂肪族ポリエステルの製造）
こうして得られた有機酸オリゴマーを用いて所定の方法で重合工程を実施することで、ポリ乳酸を始めとする脂肪族ポリエステルを製造することができる。本発明の有機酸オリゴマーの製造方法によれば、有機酸オリゴマーが効率的に得られるため、結果として、脂肪族ポリエステルも効率的に製造できる。
【００３８】
（有機酸の抽出）
以上説明した有機酸オリゴマーの合成に先立って、有機酸含有水性溶液から前記反応溶媒を用いて有機酸を抽出することができる。前記反応溶媒は、有機酸含有水性溶液からの有機酸の抽出にも適しているため都合がよい。また、有機酸オリゴマー合成工程に、本反応溶媒による有機酸抽出工程を実施することにより、有機酸オリゴマー合成後に不要となった本反応溶媒成分を有機酸の抽出工程で還流させて用いることで、溶媒の排出量の低減と炭素化合物の循環使用により地球環境に適した系を構築できる。
【００３９】
なお、有機酸の抽出工程に用いる反応溶媒と有機酸オリゴマーの合成工程に用いる反応溶媒の組成は、上記した本発明の反応溶媒に包含されるものであれば同一であってもよいが異なっていてもよい。これらの工程で同一組成の反応溶媒を用いることは組成の調整を簡略化できる点において好ましいが、本発明の反応溶媒に包含される範囲内であれば、それぞれの工程の必要に応じて適宜変更を加えることができる。好ましくは、成分を同一としてこれらの組成を変更する範囲とする。例えば、同一アルキルアミンと同一のアルコール等を用いるが、抽出工程における抽出効率や微生物への影響及び合成工程における合成効率や分離効率等を考慮して、それぞれの工程においてそれぞれ比率を変更することができる。
【００４０】
（有機酸含有水性溶液）
有機酸含有水性溶液は、有機酸を溶解して含有する水性溶液であれば、特に限定されない。ｐＨも特に限定されないし、また、有機酸は塩の形態であってもよい。媒体は、水を含んだ水性媒体であればよく、特に限定されない。
【００４１】
有機酸含有水性溶液は、他の材料から取得した乳酸の溶液であってもよいし、また、微生物により発酵生産された発酵液からの乳酸抽出液であってもよい。好ましくは、有機酸生産微生物が発酵によって有機酸を生成した有機酸発酵液である。有機酸発酵液から直接有機酸を抽出することで、一層、有機酸オリゴマーを効率的に合成することができる。有機酸発酵液は、発酵終了後において菌体等を除去した発酵上清であってもよいし、菌体等を含んだままのものであってもよい。こうした発酵終了後の発酵液から有機酸を抽出する場合には、抽出溶媒として用いる反応溶媒の有機酸生産微生物に対する毒性を考慮する必要がない点において効率的な有機酸抽出と有機酸オリゴマー合成が可能となる。
【００４２】
こうした有機酸抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの一例を図１に例示する。図１に示す形態においては、有機酸発酵工程における有機酸発酵液を連続式、半連続式又はバッチ式で取り出して、反応溶媒と接触させて、有機酸抽出工程を実施する。図１に示すように、オリゴマー合成及び分離後の反応溶媒の少なくとも一部を有機酸抽出工程に還流させることにより、反応溶媒を有効利用できる。また、図１には、発酵液に残存した炭素源などの発酵原料を分離して発酵原料として再利用する形態も含まれている。
【００４３】
また、有機酸含有水性溶液としての有機酸発酵液は、有機酸生産微生物が炭素源から有機酸を発酵している最中の有機酸生産微生物の培養液であってもよい。こうした培養液を対象とすることで、培養液中の乳酸濃度の調整が可能となるとともに、連続的に乳酸を抽出し、ひいては連続的にオリゴマー化も可能となる点において好ましい。
【００４４】
発酵中の培養液に反応溶媒（抽出溶媒）を接触させて、発酵生産物を抽出しつつ発酵させる溶媒抽出発酵の場合、反応溶媒は、培養液を構成する培地と二相分離可能である溶媒を選択する。培地との二相分離状態をおおよそ維持して発酵させることにより、発酵用微生物への細胞毒性を抑制して微生物の増殖活性を維持しつつ、同時に効率的な有機酸抽出が可能となり、さらに、発酵後に抽出溶媒の分離を容易に実現できる。なお、こうした抽出溶媒を構成する有機溶媒としては、有機酸生産酵母が耐性のある有機溶媒であることが好ましいが、本反応溶媒として用いることができる第３級アルコール及び非アルコール類のうち、既に例示したものをいずれも用いることができる。
【００４５】
図２及び図３には、こうした抽出形態と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせを例示する。図２には、本反応溶媒を用いて溶媒抽出発酵する工程を実施するとともに、培養液と接触する反応溶媒を連続式、半連続式又はバッチ式で有機酸オリゴマー合成工程に送液し、送液された反応溶媒中で有機酸オリゴマーを合成する形態である。この形態において、反応溶媒を培養液と分離するには、例えば、特開２００４−２１７７２５号に記載の疎水性多孔質膜を発酵槽に設置した溶媒分離器を用いることができる。この形態においては、オリゴマー合成及びオリゴマー分離後の反応溶媒を溶媒抽出発酵工程に還流することで、反応溶媒を有効利用できる。
【００４６】
また、図３には、本反応溶媒を用いて溶媒抽出発酵する工程から、反応溶媒と培養液との混合液を連続式、半連続式又はバッチ式で溶媒分離工程に送液し、培養液と反応溶媒とを分離して、この分離した反応溶媒について有機酸オリゴマー合成工程を実施する形態である。この形態においても、オリゴマー分離後の反応溶媒や溶媒分離後の培養液を溶媒抽出発酵工程に還流させることができる。
【００４７】
本発明における溶媒抽出発酵では、培地と反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する工程とすることが好ましい。既に説明したように、反応溶媒として培地と二相分離可能なものを用いるが、こうした混合液の攪拌混合程度によって二相分離状態を維持して培養することもできるし、懸濁状態で培養することもできる。細胞毒性をできるだけ低減する観点からは、おおよそ上下に二相分離状態を維持して培養することが好ましい。こうした培養状態は、下相に培地、上相に抽出溶媒を有する二相液体を静置培養するか、緩やかに旋回培養、攪拌培養又は回転培養することにより得ることができる。なお、こうした二相分離状態を維持した培養工程に対して、培地と反応溶媒とを振とうなどにより強く攪拌して二相分離しない状態とする培養工程を組み合わせることもできる。
【００４８】
なお、本発明における有機酸発酵では、反応溶媒を培養液に添加する時期は特に限定されない。例えば、培養工程の全体を通じて反応溶媒を添加して抽出培養することもできるし、培養工程の一部においてのみ反応溶媒を添加して二相系を構成して反応溶媒を実施することができる。後者の例としては、培養工程の途中までは、反応溶媒を添加せずに培養し、その後反応溶媒を添加して培養する、培養工程を実施することもできる。
【００４９】
培養工程は、有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程とすることが好ましい。こうすることで、培地中で炭素源を枯渇させることなく有機酸発酵を継続させることができる。この場合、生産物である有機酸による阻害がないため、効率的に有機酸を連続的に発酵させることができる。なお、制限基質である炭素源のほか、各種の栄養成分も適宜添加することができる。こうした有機酸発酵は、例えば、バイオプロセスシステムエンジニアリング、清水浩、シーエムシー出版、Ｐ１１５−１２５に記載の流加培養法を参照することができる。
【００５０】
培地のｐＨは５．０以下であることが好ましい。ｐＨが５．０以下であると、上記キャリアによる有機酸の抽出溶媒側への分配効率が確保されるからである。好ましくは、ｐＨは、乳酸のｐＫａである４．８以下であり、より好ましくは４．５以下である。
【００５１】
本発明における有機酸発酵における各種の培養条件は適宜設定することができる。例えば、温度は、２５℃〜３５℃程度とすることができる。培養時間は、おおよそ２４〜７２時間程度とすることができる。
【００５２】
なお、こうした有機酸の発酵生産には有機酸発酵用微生物を用い、用いる微生物に適した培地を用いることによって行うことができる。こうした微生物としては、有機酸生産が活性化された酵母を用いることができ、こうした酵母は、自然界からのスクリーニング、人工突然変異及び遺伝子工学的改変などのいずれの手法によって得られた酵母であってもよい。好ましくは、遺伝子工学的に改変された酵母である。有機酸の生産が促進されるよう遺伝子工学的に改変された酵母としては、好ましくは、酵母染色体上において有機酸合成酵素が導入された組換え酵母であることが好ましい。こうした組換え酵母の宿主酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などの酵母が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株を例示できる。
【００５３】
遺伝子組換え酵母においては適当なプロモーターの制御下に有機酸合成酵素をコードするコード領域を発現可能に保持している。高効率で有機酸を生産するには、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、ＡＤＨ１遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターなどが挙げられる。なお、これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。こうしたプロモーター群から選択されるプロモーターとしては、少なくともＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。ＰＤＣ１プロモーターの制御下で有機酸を合成する酵素を発現させることにより、高効率で有機酸を発酵することが期待でき、こうした酵母が本発明の微生物として有効だからである。
【００５４】
有機酸合成酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素等が挙げられる。例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。なお、有機酸合成酵素をコードするコード領域は、酵母において複数コピー導入されていることが好ましい。
【００５５】
このような有機酸生産酵母としては、例えば、特開２００３−９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３９２７０、特開２００６−７５１３３に記載の乳酸生産酵母等を好ましく用いることができる。
【００５６】
なお、以上説明した有機酸の抽出及び有機酸発酵液からの有機酸の抽出は、必ずしも有機酸オリゴマーの製造方法と連続して行うことはなく、有機酸の抽出方法及び有機酸発酵生産工程を伴う有機酸の製造方法として実施することができる。さらには、こうした有機酸オリゴマー合成工程のほか、必要に応じて、有機酸抽出工程や有機酸の発酵生産工程を伴う脂肪族ポリエステルの製造方法としても実施できる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【００５８】
（発酵からオリゴマー化分離までの検討）〈乳酸の抽出溶媒の検討〉
【００５９】
（実施例１） トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンとして１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）［コグニス社製］を用い、この第３級アミンをテルピネオール（第三級アルコール）で希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層し、室温で二分間振盪したのちに静置した。静置後、乳酸アナライザー（酵素法）を用いて水相中の乳酸濃度を測定し、「数１」に従って抽出度（Ｅ）を求めた。
【数１】
［ＨＬ］ｏ；溶媒中の乳酸濃度［ＨＬ］ｉｎｉｔ；水相中に仕込んだ乳酸濃度［ＨＬ］ＡＴ；溶媒抽出操作後に測定した水相中の乳酸濃度ＶＡ；水相の容積Ｖｏ；溶媒相の容積
【００６０】
その結果、図４に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のテルピネオール（第三級アルコール）を添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）（後述する比較例１）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。
【００６１】
（実施例２）
イソフィトール（第三級アルコール）で希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図５に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のイソフィトール（第三級アルコール）を添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。
【００６２】
（比較例１）
１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）［コグニス社製］溶液の１ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、乳酸抽出度は３０％であった。Ａｌａｍｉｎｅ３３６の単独溶媒では全乳酸量の３割程度しか抽出されないことがわかる。
【００６３】
（比較例２）
オレイルアルコールで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図６に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のオレイルアルコールを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。これまで、オレイルアルコールは菌体毒性を低減する目的で用いられていたが、本結果により、乳酸の抽出効率を高める効果があることを新たに確認した。
【００６４】
（比較例３）
ドデカンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図７に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にドデカンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６５】
（比較例４）
ピネンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図８に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にピネンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６６】
（比較例５） リモネンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図９に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にリモネンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６７】
（比較例６）
デカリンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図１０に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にデカリンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６８】
実施例１〜２及び比較例１〜６より、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）にドデカンなどのアルカン系、デカリンなどのシクロアルカン系、及びピネンやリモネンなどのテルペン系炭化水素を添加すると、乳酸の抽出度は低下するが、２５％〜７５％のオレイルアルコール（第一級アルコール）、テルポネオール（第三級アルコール）及びイソフィトール（第三級アルコール）を添加すると、乳酸の抽出度は２倍以上に向上することを明らかにした。
【００６９】
〈抽出溶媒中での乳酸のオリゴマー化分離の検討〉
【００７０】
（実施例３）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０１ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．９１ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：８６．３％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法、装置：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製 ａｕｔｏｆｌｅｘ、マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸）により下層画分を分析した結果、図１１に示すように、５〜２３量体の乳酸オリゴマーが検出された。実施例１の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にテルピネオールを添加した抽出溶媒はＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が高く、かつその抽出溶媒中でオリゴマー化分離ができる抽出溶媒であることがわかる。
【００７１】
（実施例４）
４口フラスコにトリ−ｎ−オクチルアミン／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（５．６４ｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１２に示すように、６〜１９量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７２】
（実施例５） ４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／イソフィトール（３：１ｖ／ｖ）７５ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液２５ｍｌ（２７．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分はデカンテーションにより容易に除去でき、残渣の下層画分（２１．６６ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：）を得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を直接分析した結果、図１３に示すように、９〜１８量体の乳酸オリゴマーが検出された。実施例２の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にイソフィトールを添加した抽出溶媒はＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸抽出効率が高く、さらには、その抽出溶媒中でオリゴマー化分離もできる抽出溶媒であることがわかる。
【００７３】
（実施例６）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／イソフィトール（３：１ｖ／ｖ）７５ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液１０ｍｌ（１０．０７ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分はデカンテーションにより容易に除去することができ、残渣の下層画分（３．３１ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：３６．８％）を得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１４に示すように、６〜１９量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７４】
実施例４と比較して下層画分の回収率が低いのは、熱によりイソフィトール（第三級アルコール）の一部がフィトール（第一級アルコール）に変化し、乳酸のオリゴマー化を阻害することがわかっている。第一級アルコールの生成を防ぐためには、オリゴマー化反応が可能な温度〜２００℃までの温度に設定することが好ましい。
【００７５】
（比較例７） ４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６（１００ｍｌ）と９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を６０ｍｍＨｇ（８ｋＰａ）にセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、圧力を７０ｍｍＨｇ（９．３ｋＰａ）にセットし、４５分間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は上層画分（７３．４２ｇ）と下層画分（１２．４２ｇ）の二相に液々分離され、赤外吸光分析計を用いて上層画分と下層画分を分析した結果、上層画分よりＡｌａｍｉｎｅ３３６、下層画分よりエステル化合物とＡｌａｍｉｎｅ３３６が検出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法、装置：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製 ａｕｔｏｆｌｅｘ、マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸）により下層画分を分析した結果、図１５に示すように、２〜１２量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７６】
比較例１の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独の抽出溶媒ではオリゴマー化分離は可能であるが、乳酸の抽出効率が低いという問題点がある。
【００７７】
（比較例８）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／オレイルアルコール（４：６ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例７と同様にしてオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は二相に分離されず、ＧＣ−ＭＳ法により反応液を分析した結果、乳酸オレイルエステルと２量体の乳酸オリゴマーオレイルエステルが検出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を用いても、図１６の中段に示すように、３量体以上の乳酸オリゴマーオレイルエステルは検出されなかった。Ａｌａｍｉｎｅ３３６とオレイルアルコールからなる抽出溶媒中ではオリゴマー化分離ができないという問題点がある。
【００７８】
（比較例９）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／オレイルアルコール（８：２ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例７と同様にしてオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は二相に分離されず、その反応液を分析した結果、ＧＣ−ＭＳ法により乳酸オレイルエステルが検出され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により、図１６の上段に示すように、２〜４量体の乳酸オリゴマーオレイルエステルが検出された。比較例８で用いたオレイルアルコール量を１／３に少なくしても乳酸のオリゴマー化分離ができないことがわかる。
【００７９】
（比較例１０）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６（１００ｍｌ）と９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．２２ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１７に示すように、５〜１６量体の乳酸オリゴマーが検出された。比較例７の結果とあわせると、オリゴマー化反応時間を長くすると、乳酸モノマー重合度が高くなることがわかり、以下の実施例では本条件でオリゴマー化反応を実施した。
【００８０】
（比較例１１）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／ドデカン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．１２ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（５．７９ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ａに示すように、１９量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８１】
（比較例１２）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／ピネン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０５ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（４．１２ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｂに示すように、２３量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８２】
（比較例１３）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／リモネン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．５ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（８．５７ｇ）を得た。この下層画分は流動性の高い物質であった。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｄに示すように、１８量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８３】
（比較例１４）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／デカリン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．７４ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｃに示すように、１９量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８４】
以上の実施例（１〜３）と比較例（１〜９）の結果よりＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒中では乳酸のオリゴマー化分離が可能あるが、乳酸の抽出効率が低いという問題点があることがわかった。反対に、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にオレイルアルコールを添加した抽出溶媒は、乳酸の抽出効率が高いが、乳酸のオリゴマー化分離ができないという問題点があることがわかった。
【００８５】
比較例３〜６、１１〜１４の結果より、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にドデカン等のアルカン系炭化水素、ピネンやリモネンなどのテルペン系炭化水素、デカリン等のシクロアルカン系炭化水素を添加した抽出溶媒ではＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が低いがオリゴマー化分離が可能であった。
【００８６】
以上の比較例と実施例から明らかなように、第三級アミンに２５％〜７５％の第一級アルコール又は第三級アルコールを添加した抽出溶媒は、第三級アミン単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が２倍以上に向上することがわかる。しかしながら、第三級アミンにオレイルアルコールなどの第一級アルコールが含まれていると、重合化（オリゴマー化）が阻害されるのに対し、第三級アミンと第三級アルコールからなる抽出溶媒を用いれば、オリゴマー化（重合化）が進み、抽出溶媒中の乳酸をオリゴマー（有機酸重合体）として分離回収することができる。
【００８７】
〈培養液からの乳酸抽出とオリゴマー化分離の検討〉（実施例７）乳酸生産酵母ＴＣ２０株を１５％ＹＰＤ培地５００ｍｌで３日間培養した結果、４．７８％乳酸を含む発酵液を得た。該乳酸発酵液２００ｍｌに抽出溶媒としてＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌを加え、２分間振盪した。上層画分（溶媒画分）７５ｍｌを４口フラスコに入れ、比較例１０と同様に、常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。その結果、水分とテルピネオールは蒸留画分に移行し、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分（Ａｌａｍｉｎｅ３３６）はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（４．４９ｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１９に示すように、６〜１１量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００８８】
なお、ＴＣ２０株は次のようにして取得した。
(１) 大腸菌Ｋ１２株をテンプレートとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、ＨＰＨ遺伝子）のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＨＰＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＶ０１４９９で登録されており、ＨＰＨ遺伝子の両末端のプライマーＨＰＨ−Ｕ（5’ -ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3’ （配列番号１））とＨＰＨ−Ｄ（5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3’ （配列番号２））を使用した。
【００８９】
（２）酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されている菌株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＴＤＨ３プロモーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＴＤＨ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ７２９７７で登録されており、プライマーＴＤＨ３Ｐ−Ｕ（5’ -ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCAAC-3’ ；ＴＤＨ３プロモーター配列にＢａｍＨＩサイトを付加（配列番号３））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3’；ＴＤＨ３プロモーター配列にＳｍａＩサイトを付加（配列番号４））を使用した。
【００９０】
（３）酵母ＩＦＯ２２６０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ４９５４８で登録されており、プライマーＣＹＣＴ−Ｕ（5’ -ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3’ ；ＣＹＣ１ターミネーター配列にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加（配列番号５））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3’； ＣＹＣ１ターミネーター配列にＳａIＩサイトを付加（配列番号６））を使用した。
【００９１】
（４）ＨＰＨ遺伝子断片を大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（プロメガ製）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このプラスミドをｐＢｈｐｈと命名した。本プラスミドをＢａｍＨＩとＳｍａＩ部位で切断後、ＴＤＨ３プロモーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−Ｐと命名した。さらに本プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａＩＩ部位で切断後、ＣＹＣ１ターミネーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−ＰＴと命名した。ｐＢｈｐｈ−ＰＴをテンプレートとしてＴＤＨ３プロモーター領域、ＣＹＣ１ターミネーター領域を付加したＨＰＨ遺伝子カセットの両末端にＧＰＤ１遺伝子の一部（７７ｂｐ）が付加したＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。付加したＧＰＤ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ２４４５４で登録されており、プライマーはＨＰＨ遺伝子の外側にＧＰＤ１遺伝子の−１２７〜−５１領域を付加したＧＰＤ１−ＣＹＣ１−Ｒ（5’ -TTA CGT TAC CTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACT CTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcgtac acg cgtttg t-3’；大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号７））と、同じくＧＰＤ１遺伝子の＋１１００〜＋１１７６領域を付加したＧＰＤ１−ＴＤＨ３−Ｆ（5’ -CTA ATC TTC ATG TAG ATC TAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTA GTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aatgtt agc gtcaac a-3’； 大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号８））を使用した。このＰＣＲ産物を用いて、ＫＣＢ２７−７株を酢酸リチウム法（Ito et al.,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)）にて形質転換した。形質転換後、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により挿入ＤＮＡ断片の外側のプライマーであるＧＰＤ１−２９５Ｆ（5’ -TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3’（配列番号９））、ＧＰＤ１＋１４７２Ｒ（5’ -CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3’（配列番号１０））を用いて、ＨＰＨ遺伝子がＧＰＤ１遺伝子領域の染色体に組み込まれていることを確認した。
【００９２】
（５）この株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ１遺伝子領域の両方にＨＰＨ遺伝子が組み込まれＧＰＤ１遺伝子が破壊されている株を取得した。これをＴＣ２０株とした。
【００９３】
（実施例８）
乳酸生産酵母ＴＣ２０株を１５％糖蜜培地５００ｍｌで３日間培養した結果、３．７９％乳酸を含む発酵液を得た。該乳酸発酵液２００ｍｌに抽出溶媒としてＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌを加え、２分間振盪した。上層画分（乳酸抽出された溶媒画分）８０ｍｌを４口フラスコに入れ、実施例６と同様に、オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。その結果、水分とテルピネオールは蒸留画分に移行し、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分（Ａｌａｍｉｎｅ３３６）はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（３．２７ｇ）を得た。赤外吸光分析計を用いて上層画分を分析した結果、主成分としてＡｌａｍｉｎｅ３３６が検出され、下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図２０に示すように、６〜１１量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９４】
（実施例９）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（２７ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液１０．４ｍｌ（１２．０８ｇ）を加えて室温で５分間撹拌し、１０ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃で昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）３．２７ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）２．６９ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２１と図２２に示すように、８〜１７量体の乳酸オリゴマーと８〜１８量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９５】
（実施例１０）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（２９ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液１７ｍｌ（１９．６１ｇ）を加えて室温で５分間撹拌し、１５ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した他は、実施例９と同様にオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）４．１５ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）４．１２ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２３と図２４に示すように、８〜１８量体の乳酸オリゴマーと８〜１４量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９６】
（実施例１１）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（３１．５ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液２４．１ｍｌ（２８．４３ｇ）を加えて室温で５分間撹拌して２０ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した他は、実施例９と同様にオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）１１．１６ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）１．４９ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２５と図２６に示すように、８〜１６量体の乳酸オリゴマーと８〜１７量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９７】
（実施例１２）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）（和光純薬株式会社製）30ml（28.68g)、イソフィトール水添物（クラレ製イソフィトール溶液に水素ガスを添加して合成したもの）60ml（48.53g）及び90％Ｌ−乳酸溶液（和光純薬株式会社製）9.7ml(11.40g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30v/v％ＴＢＰ／イソフィトール水添物を調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、4℃まで冷却した。冷却後、反応液は二相に液々分離され、下層画分（オリゴマー画分）をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２７に示すように、2〜14量体の遊離型乳酸オリゴマーと６〜10量体の環状型乳酸オリゴマーが検出された。
【００９８】
（実施例１３）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）[和光純薬]30ml（28.70g)、イソフィトール[和光純薬]60ml（48.57g）及び90％Ｌ−乳酸溶液[和光純薬]9.7ml(11.40g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30％v/vＴＢＰ／イソフィトールを調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、4℃まで冷却した。冷却後、反応液は二相に液々分離され、下層画分（オリゴマー画分）をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２８に示すように、5〜8量体の環状型乳酸オリゴマーと非遊離型乳酸オリゴマー（3〜19量体の遊離型乳酸オリゴマーに相当）が検出された。
【００９９】
（実施例１４）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）[和光純薬]30ml（29.10g)、テルピネオール[和光純薬]60ml（54.74g）及び90％Ｌ−乳酸溶液[和光純薬]9.7ml(11.27g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30v/v％ＴＢＰ／テルピネオールを調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。テルピネオールは蒸留除去され、残渣の反応液をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２９に示すように、5〜8量体の環状型乳酸オリゴマーと非遊離型乳酸オリゴマー（3〜19量体の遊離型乳酸オリゴマーに相当）が検出された。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１〜１０：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの一例を示す図。
【図２】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの他の一例を示す図。
【図３】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの他の一例を示す図。
【図４】テルピネオールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図５】イソフィトールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図６】オレイルアルコールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図７】ドデカンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図８】ピネンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図９】リモネンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図１０】デカリンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図１１】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液／テルピネオールの下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１２】トリ−ｎ−オクチルアミン／テルピネオール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１３】Ａｌａｍｉｎ３３６／イソフィトール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１４】Ａｌａｍｉｎ３３６／イソフィトール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１５】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１６】Ａｌａｍｉｎ３３６／オレイルアルコール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１７】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ａ】Ａｌａｍｉｎ３３６／ドデカンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｂ】Ａｌａｍｉｎ３３６／ピネンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｃ】Ａｌａｍｉｎ３３６／デカリンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｄ】Ａｌａｍｉｎ３３６／リモネンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１９】ＹＰＤ乳酸発酵培養液からの溶媒抽出液からオリゴマー化分離した画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２０】ＹＰＤ乳酸発酵培養液からの溶媒抽出液からオリゴマー化分離した画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２１】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１０ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２２】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２３】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１５ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２４】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１５ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２５】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、２０ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２６】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、２０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２７】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール水添物、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２８】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２９】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸オリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸である乳酸の重合体であるポリ乳酸は手術用糸などの医療用材料、食器・食品容器・包装材、フィルムへの応用から発展し，近年では家電から自動車用材料まで幅広い分野へと広がりを見せている。近年、ポリ乳酸はトウモロコシ、サトウキビなどのバイオマス資源より得られるグルコースを原料にして乳酸菌や酵母などの微生物を用いて乳酸発酵し、乳酸を精製したのち、重合法により製造されるようになってきている。ポリ乳酸を効率的かつ低コストで製造するためには、乳酸発酵液から乳酸を安価な方法で分離回収する方法が必要である。乳酸を分離回収する方法としては、（１）溶媒抽出・逆抽出法による回収、（２）アンモニア中和発酵・エステル蒸留法、（３）乳酸カルシウム沈殿法・溶媒抽出法及び（４）溶媒抽出発酵法が報告されている。
【０００３】
（１）の溶媒抽出・逆抽出法は、乳酸を非水性相（第三級アミン）中で優先的に抽出し、次いでその非水性相中の乳酸を縮合させてオリゴマーを生成させて分離し、乳酸を含有する非水性相から乳酸を蒸留および他の溶媒中へ逆抽出して分離する方法である（特許文献１）。また、（２）のアンモニア中和発酵・エステル蒸留法は、アンモニアで中和しながら乳酸発酵を行い、該発酵により得られた乳酸アンモニウムを加熱濃縮し、ｎ−ブチルアルコールなどのアルコールを添加して加熱することにより乳酸ブチルとし、酸触媒存在下で加熱加水分解して乳酸を得る方法である（特許文献２）。また、（３）の乳酸カルシウム沈殿法・溶媒抽出法は、炭酸カルシウムなどの塩基存在下で乳酸発酵して得られた乳酸カルシウムを硫酸で酸性化して乳酸と硫酸カルシウムとし、該乳酸をアミン抽出剤で溶媒するか又は乳酸含有溶媒の逆抽出により乳酸を精製する方法である（特許文献３，４）。さらに、（４）の溶媒抽出発酵法は、固定化乳酸菌を用いて乳酸発酵させ、発酵液の一部を取り出してオレイルアルコールで希釈したＡｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）と接触させて乳酸を抽出し、乳酸抽出後の発酵液を発酵層に返送するという溶媒抽出発酵法である（非特許文献１）。
【特許文献１】特表２００１−５１９１７８号
【特許文献２】特開平６−３１１８８６号
【特許文献３】特表２００３−５１１３６０号
【特許文献４】特表２００３−５１８４７６号
【非特許文献１】Ｙａｂａｎｎａｖａｒ ＶＭ， Ｗａｎｇ ＤＩ．， １９８７． Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５０６：５２３−３５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記（１）の方法では、第三級アミンを主成分とした抽出溶媒であるため、乳酸の抽出効率が低かった。また、上記（２）の方法では、濃縮、エステル化、蒸留、加水分解などの工程で多量の熱エネルギーを必要とするだけでなく、工程が煩雑で乳酸の回収率が低くなってしまう。さらに、上記（３）の方法では、硫酸の回収再利用が困難であり、廃棄物として硫酸カルシウムが発生してしまう。また、上記（４）の方法では、第三級アミンとオレイルアルコール（第一級アルコール）からなる溶媒を用いると、乳酸の抽出効率は高いが、その抽出溶媒中で乳酸の重合反応を行うと、乳酸とオレイルアルコールがエステル交換し、乳酸オレイルエステル（乳酸アルキルエステル）が生成するために乳酸の重合化が阻害され、抽出溶媒から乳酸を重合体として分離回収することができない。
【０００５】
このように、上記（１）〜（３）によれば、抽出効率、エネルギーコスト等の観点から問題があり、上記（１）〜（４）のいずれも、乳酸を抽出分離後の工程であって、ポリ乳酸の合成のための前段階である乳酸オリゴマーの合成工程が考慮されていないため、乳酸の分離回収から乳酸オリゴマーの合成までの工程を通じて観た場合、工程数の多さや操作の煩雑さは否めなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、有機酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを一つの目的とする。また、有機酸オリゴマーの製造に適した有機酸の抽出方法を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、ポリ乳酸の効率的な製造方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、乳酸などの有機酸の抽出分離及びオリゴマー化の効率化について種々検討したところ、有機酸オリゴマーの合成及び分離に適した媒体を見出した。さらに、この媒体を用いることにより、有機酸含有水性溶液からの有機酸抽出に用いることにより、有機酸の抽出分離と有機酸オリゴマーの製造とを効率的又は連続的に実施できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、有機酸オリゴマーの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える製造方法が提供される。
【０００９】
この発明において、前記アルキルアミンは第３級アミン及び第２級アミンから選択される１種又は２種以上を含んでおり、さらに、前記キャリアはアルキルアミンであり、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン及びトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンから選択される１種又は２種以上を含むことができる。
【００１０】
また、この発明において前記キャリアはトリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されてもよい。
【００１１】
また、この発明において、前記第３級アルコールは、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノールからなる群から選択される１種又は２種以上を含むことができる。さらに、前記第３級アルコールは、テルピネオール及びイソフィトールのいずれかを含むことができる。
【００１２】
また、この発明において、前記非アルコール類は、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上であるとすることができる。
【００１３】
この発明においては、前記反応溶媒は、２０ｖｏｌ％以上の前記アルキルアミンを含有することができる。
【００１４】
この発明においては、前記有機酸オリゴマーを前記反応溶媒から分離する工程を備えることができる。
【００１５】
この発明においては、前記有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて前記有機酸を抽出する抽出工程を備えることもできる。前記抽出工程における前記有機酸含有水性溶液は有機酸生産酵母による有機酸発酵液を含有することができるし、前記有機酸発酵液は、有機酸を発酵生産中の培養液を含んだものであってもよい。さらに、前記抽出工程は、前記培養液と前記反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する培養工程を含むことができる。前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程としてもよい。
【００１６】
この発明においては、前記有機酸は乳酸とすることができる。また、前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母としてもよく、前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択されていてもよい。
【００１７】
本発明によれば、有機酸の抽出方法であって、有機酸含有水性溶液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有さない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法が提供される。また、本発明によれば、有機酸の生産方法であって、有機酸を発酵生産する工程と、前記有機酸発酵生産工程で得られる有機酸を含有する有機酸発酵液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法も提供される。さらに本発明によれば、脂肪族ポリエステルの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程と、該乳酸オリゴマーを用いて脂肪族ポリエステルを合成する工程と、を備える、製造方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、アルキルアミンと、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上を含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える有機酸オリゴマーの製造方法に関する。本発明の有機酸オリゴマーの製造方法によれば、上記反応溶媒に有機酸が溶解でき、上記反応溶媒内で有機酸のオリゴマー化反応を実施できるため、有機酸オリゴマーの製造を効率的に行うことができる。さらに、上記反応溶媒において、有機酸オリゴマーは不溶性となる傾向があるため、沈殿物として容易に分離回収することも可能である。
【００１９】
さらに、このオリゴマー合成工程の前段側において、有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて有機酸を抽出する抽出工程を備える、有機酸含有水性溶液からの有機酸の分離回収を前記反応溶媒を用いて行うことで、分離回収からオリゴマー合成までを効率的に実施できる。さらに、こうしたオリゴマー合成工程を備える脂肪族ポリエステルの製造方法によれば、効率的にポリ乳酸などの脂肪族ポリエステルを製造できる。
【００２０】
本発明は、また、有機酸含有水性溶液に、上記反応溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程を備える方法に関する。この抽出方法によれば、有機酸含有水性溶液から有機酸を容易に抽出できるとともに、有機酸を含有する上記反応溶媒内においてそのまま有機酸オリゴマーの合成工程を実施できる。このため、オリゴマー合成ひいてはポリマー合成に好ましい有機酸の抽出方法となっている。
【００２１】
以下、本発明の実施形態である、有機酸オリゴマーの製造方法、有機酸の抽出方法、有機酸の製造方法及び脂肪族ポリエステルの製造方法について適宜図面を参照しながら説明する。
【００２２】
（有機酸オリゴマーの製造方法）
（有機酸）
本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸、グリコール酸、３−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ吉草酸が挙げられる。なかでも、乳酸、ポリグリコール酸等のα−ヒドロキシ酸が好ましい。特に好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【００２３】
（有機酸オリゴマー）
有機酸オリゴマーとしては、上記各種有機酸のオリゴマーを意味する。有機酸オリゴマーは、水酸基とカルボキシル基とを備える有機酸のオリゴマーであればよいが、好ましくはα−ヒドロキシ酸のオリゴマーである。こうした有機酸オリゴマーとしては、例えば、乳酸オリゴマー、グリコール酸オリゴマー、３−ヒドロキシ酪酸オリゴマー、４−ヒドロキシ酪酸オリゴマー、４−ヒドロキシ吉草酸オリゴマーなどが挙げられる。なかでも、工業的に利用されているポリ乳酸の前駆体である乳酸オリゴマーやグリコール酸オリゴマーが挙げられる。なお、ここでオリゴマーとは、単量体ユニットとしての上記有機酸が２個以上３０個以下重合したものを含んでいる。有機酸オリゴマーは、通常有機酸が１０個以上３０個以下の範囲の重合体であることが多い。
【００２４】
（脂肪族ポリエステル）
なお、本発明における脂肪族ポリエステルとしては、上記有機酸ポリマーが挙げられる。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（４−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（４−ヒドロキシ吉草酸）などである。なかでも、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリ（α−ヒドロキシ酸）が好ましく、ポリ乳酸が特に好ましい。
【００２５】
（有機酸オリゴマーの反応溶媒）
本発明の有機酸オリゴマーの製造方法において用いる反応溶媒は、アルキルアミンと、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。反応溶媒は、好ましくは、含有することが不可避である不純物以外はキャリアとこれらのアルコール類及び非アルコール類とからなる。
【００２６】
アルキルアミンは、特に有機酸を捕捉して反応溶媒側に分配させるためのキャリアである。アルキルアミンとしては、オリゴマー化しようとする有機溶媒に対してこうしたキャリア機能を発揮できるものを１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。こうしたアルキルアミンとしては、有機溶媒に可溶な第二級アミン又は第三級アミンが好ましく、より好ましくは第三級アミンである。こうしたキャリアとしては、ジ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（商品名、コグニス社製））、トリラウリルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３０４（商品名、コグニス社製））等が挙げられる。また、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＬＡ−１（各アルキル連鎖に１２個の炭素原子を有するジアルキルアミンの混合物）等の第二級アミンも挙げられる。
【００２７】
これらのアルキルアミンは、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドであり、より好ましくは、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（例えば、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（商品名、コグニス社製））である。なお、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンは、アルキル基として、オクチル基、ノニル基及びデシル基から選択される１種又は２種以上のアルキル基を全体として３個備えることができる。また、オクチル基及び／またはデシル基のみを備えることもできる。トリ−ｎ−デシルアミンを用いることも好ましい。例えば、Alamine３３６は、トリ−ｎ−オクチルアミン、ジ−ｎ−オクチル−モノ−ｎ−デシル−アミンなどのトリ-ｎ-Ｃ８〜Ｃ１０アミンを含むことができるほか、ジ−ｎ−デシル−モノ−ｎ−ドデシルアミン、トリ−ｎ−ドデシルアミン等を含有することができる。
【００２８】
また、他のキャリアとしては、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドが挙げられる。
【００２９】
この反応溶媒において、第３級アルコール及びエステル基を含まない非アルコール類は、有機酸を溶解し抽出するのを補足するとともに、有機酸含有水性溶液が有機酸生産性菌体を培養液である場合には、こうした菌体に対するアルキルアミンの毒性を低減するための希釈剤として機能する場合もある。これらの各種の溶媒は、こうした機能を発揮できる範囲で１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なお、第１級アルコールを使用しないのは、第１級アルコールを用いると、有機酸オリゴマー合成が大きく阻害されるからである。また、エステル基を含有しない非アルコール類を用いるのは、エステル基を含んでいると、生成したオリゴヌクレオチドとエステル交換反応を生じて、結果として有機酸オリゴマーの生成を阻害するからである。なお、第３級アルコールは、エステル基を含有しない化合物を意味している。
【００３０】
第３級アルコールとしては、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノール等が挙げられる。なかでも、テルピネオール、イソフィトール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタールを好ましく用いることができる。さらに好ましくは、テルピネオール、イソフィトールである。
【００３１】
また、エステル基を含有しない非アルコール類としては、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、ドデカン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイル等が挙げられる。
【００３２】
オリゴマー化反応溶媒には、好ましくは、第３級アルコールを用い、より好ましくは第３級アルコールのみを用いる。第３級アルコールを用いることで、アルキルアミンとともに有機酸の溶解性を高めることができるほか、有機酸生産菌体を含有する培養液と接触させた場合に、菌体に対する毒性を低くする場合もあるからである。また、第３級アルコールは、乳酸のオリゴマー化阻害を防ぐ効果もある。
【００３３】
反応溶媒においては、アルキルアミンを２０ｖｏｌ％以上含有することが好ましい。この範囲のキャリア濃度を有していると、良好な反応効率を得ることができる。また反応溶媒を有機酸含有水性溶液からの有機酸の抽出溶媒として用いる際、良好な抽出効率と菌体への低毒性を確保することが容易である。抽出効率や反応効率の観点からは、より好ましくは２５ｖｏｌ％以上であり、さらに好ましくは３０ｖｏｌ％以上であり、一層好ましくは４０ｖｏｌ％以上である。なお、反応溶媒においては、残部が上記した希釈剤であることが好ましい。
【００３４】
反応溶媒は、具体的には、２０ｖｏｌ％以上のトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン又はトリ−ｎ−デシルアミンを含有する第３アルコールを用いることが好ましく、より好ましくは２５ｖｏｌ％以上である。２０ｖｏｌ％以上であれば、それよりも少ない場合に比して顕著に高い乳酸の溶解ないし抽出が可能であるからである。また、２５ｖｏｌ％以上であれば、ほぼ安定した有機酸の溶解性や抽出性が得られるからである。一方、これらのキャリアについては上限は８０ｖｏｌ％以下とすることできる。また、有機酸培養液から有機酸を抽出することを考慮すると、上限は、７５ｖｏｌ％以下であることが好ましい。したがって、有機酸生産微生物培養液から有機酸を抽出するなどするときには、このキャリアを２５ｖｏｌ％以上７５ｖｏｌ％以下を含むテルピネオール及び／又はイソフィトールを好ましく用いることができる。
【００３５】
（有機酸オリゴマーの合成）
こうした反応溶媒中で有機酸から有機酸オリゴマーを合成するには、反応溶媒を加熱すればよい。加熱により有機酸が脱水して縮合し有機酸オリゴマーが生成する。加熱温度は、有機酸からオリゴマーが生成できる範囲であれば特に限定しないが、好ましくは１３０℃以上２００℃以下である。この範囲であるとイソフィトールなどの第３級アルコールからの第１級アルコールの生成を防止でき、第１級アルコールによって有機酸オリゴマーの合成が阻害されにくいからである。
【００３６】
（有機酸オリゴマーの分離）有機酸オリゴマーは、この反応溶媒への溶解性が高くないため、反応の進行に伴い、反応溶媒中に沈殿する。したがって、反応後、固液分離工程を実施すれば、容易に有機酸オリゴマーを分離回収することができる。なお、反応終了後には、有機酸オリゴマーの反応溶媒への溶解性を調節するため適宜反応溶媒組成を調製したり、温度を調整したりすることもできる。
【００３７】
（脂肪族ポリエステルの製造）
こうして得られた有機酸オリゴマーを用いて所定の方法で重合工程を実施することで、ポリ乳酸を始めとする脂肪族ポリエステルを製造することができる。本発明の有機酸オリゴマーの製造方法によれば、有機酸オリゴマーが効率的に得られるため、結果として、脂肪族ポリエステルも効率的に製造できる。
【００３８】
（有機酸の抽出）
以上説明した有機酸オリゴマーの合成に先立って、有機酸含有水性溶液から前記反応溶媒を用いて有機酸を抽出することができる。前記反応溶媒は、有機酸含有水性溶液からの有機酸の抽出にも適しているため都合がよい。また、有機酸オリゴマー合成工程に、本反応溶媒による有機酸抽出工程を実施することにより、有機酸オリゴマー合成後に不要となった本反応溶媒成分を有機酸の抽出工程で還流させて用いることで、溶媒の排出量の低減と炭素化合物の循環使用により地球環境に適した系を構築できる。
【００３９】
なお、有機酸の抽出工程に用いる反応溶媒と有機酸オリゴマーの合成工程に用いる反応溶媒の組成は、上記した本発明の反応溶媒に包含されるものであれば同一であってもよいが異なっていてもよい。これらの工程で同一組成の反応溶媒を用いることは組成の調整を簡略化できる点において好ましいが、本発明の反応溶媒に包含される範囲内であれば、それぞれの工程の必要に応じて適宜変更を加えることができる。好ましくは、成分を同一としてこれらの組成を変更する範囲とする。例えば、同一アルキルアミンと同一のアルコール等を用いるが、抽出工程における抽出効率や微生物への影響及び合成工程における合成効率や分離効率等を考慮して、それぞれの工程においてそれぞれ比率を変更することができる。
【００４０】
（有機酸含有水性溶液）
有機酸含有水性溶液は、有機酸を溶解して含有する水性溶液であれば、特に限定されない。ｐＨも特に限定されないし、また、有機酸は塩の形態であってもよい。媒体は、水を含んだ水性媒体であればよく、特に限定されない。
【００４１】
有機酸含有水性溶液は、他の材料から取得した乳酸の溶液であってもよいし、また、微生物により発酵生産された発酵液からの乳酸抽出液であってもよい。好ましくは、有機酸生産微生物が発酵によって有機酸を生成した有機酸発酵液である。有機酸発酵液から直接有機酸を抽出することで、一層、有機酸オリゴマーを効率的に合成することができる。有機酸発酵液は、発酵終了後において菌体等を除去した発酵上清であってもよいし、菌体等を含んだままのものであってもよい。こうした発酵終了後の発酵液から有機酸を抽出する場合には、抽出溶媒として用いる反応溶媒の有機酸生産微生物に対する毒性を考慮する必要がない点において効率的な有機酸抽出と有機酸オリゴマー合成が可能となる。
【００４２】
こうした有機酸抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの一例を図１に例示する。図１に示す形態においては、有機酸発酵工程における有機酸発酵液を連続式、半連続式又はバッチ式で取り出して、反応溶媒と接触させて、有機酸抽出工程を実施する。図１に示すように、オリゴマー合成及び分離後の反応溶媒の少なくとも一部を有機酸抽出工程に還流させることにより、反応溶媒を有効利用できる。また、図１には、発酵液に残存した炭素源などの発酵原料を分離して発酵原料として再利用する形態も含まれている。
【００４３】
また、有機酸含有水性溶液としての有機酸発酵液は、有機酸生産微生物が炭素源から有機酸を発酵している最中の有機酸生産微生物の培養液であってもよい。こうした培養液を対象とすることで、培養液中の乳酸濃度の調整が可能となるとともに、連続的に乳酸を抽出し、ひいては連続的にオリゴマー化も可能となる点において好ましい。
【００４４】
発酵中の培養液に反応溶媒（抽出溶媒）を接触させて、発酵生産物を抽出しつつ発酵させる溶媒抽出発酵の場合、反応溶媒は、培養液を構成する培地と二相分離可能である溶媒を選択する。培地との二相分離状態をおおよそ維持して発酵させることにより、発酵用微生物への細胞毒性を抑制して微生物の増殖活性を維持しつつ、同時に効率的な有機酸抽出が可能となり、さらに、発酵後に抽出溶媒の分離を容易に実現できる。なお、こうした抽出溶媒を構成する有機溶媒としては、有機酸生産酵母が耐性のある有機溶媒であることが好ましいが、本反応溶媒として用いることができる第３級アルコール及び非アルコール類のうち、既に例示したものをいずれも用いることができる。
【００４５】
図２及び図３には、こうした抽出形態と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせを例示する。図２には、本反応溶媒を用いて溶媒抽出発酵する工程を実施するとともに、培養液と接触する反応溶媒を連続式、半連続式又はバッチ式で有機酸オリゴマー合成工程に送液し、送液された反応溶媒中で有機酸オリゴマーを合成する形態である。この形態において、反応溶媒を培養液と分離するには、例えば、特開２００４−２１７７２５号に記載の疎水性多孔質膜を発酵槽に設置した溶媒分離器を用いることができる。この形態においては、オリゴマー合成及びオリゴマー分離後の反応溶媒を溶媒抽出発酵工程に還流することで、反応溶媒を有効利用できる。
【００４６】
また、図３には、本反応溶媒を用いて溶媒抽出発酵する工程から、反応溶媒と培養液との混合液を連続式、半連続式又はバッチ式で溶媒分離工程に送液し、培養液と反応溶媒とを分離して、この分離した反応溶媒について有機酸オリゴマー合成工程を実施する形態である。この形態においても、オリゴマー分離後の反応溶媒や溶媒分離後の培養液を溶媒抽出発酵工程に還流させることができる。
【００４７】
本発明における溶媒抽出発酵では、培地と反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する工程とすることが好ましい。既に説明したように、反応溶媒として培地と二相分離可能なものを用いるが、こうした混合液の攪拌混合程度によって二相分離状態を維持して培養することもできるし、懸濁状態で培養することもできる。細胞毒性をできるだけ低減する観点からは、おおよそ上下に二相分離状態を維持して培養することが好ましい。こうした培養状態は、下相に培地、上相に抽出溶媒を有する二相液体を静置培養するか、緩やかに旋回培養、攪拌培養又は回転培養することにより得ることができる。なお、こうした二相分離状態を維持した培養工程に対して、培地と反応溶媒とを振とうなどにより強く攪拌して二相分離しない状態とする培養工程を組み合わせることもできる。
【００４８】
なお、本発明における有機酸発酵では、反応溶媒を培養液に添加する時期は特に限定されない。例えば、培養工程の全体を通じて反応溶媒を添加して抽出培養することもできるし、培養工程の一部においてのみ反応溶媒を添加して二相系を構成して反応溶媒を実施することができる。後者の例としては、培養工程の途中までは、反応溶媒を添加せずに培養し、その後反応溶媒を添加して培養する、培養工程を実施することもできる。
【００４９】
培養工程は、有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程とすることが好ましい。こうすることで、培地中で炭素源を枯渇させることなく有機酸発酵を継続させることができる。この場合、生産物である有機酸による阻害がないため、効率的に有機酸を連続的に発酵させることができる。なお、制限基質である炭素源のほか、各種の栄養成分も適宜添加することができる。こうした有機酸発酵は、例えば、バイオプロセスシステムエンジニアリング、清水浩、シーエムシー出版、Ｐ１１５−１２５に記載の流加培養法を参照することができる。
【００５０】
培地のｐＨは５．０以下であることが好ましい。ｐＨが５．０以下であると、上記キャリアによる有機酸の抽出溶媒側への分配効率が確保されるからである。好ましくは、ｐＨは、乳酸のｐＫａである４．８以下であり、より好ましくは４．５以下である。
【００５１】
本発明における有機酸発酵における各種の培養条件は適宜設定することができる。例えば、温度は、２５℃〜３５℃程度とすることができる。培養時間は、おおよそ２４〜７２時間程度とすることができる。
【００５２】
なお、こうした有機酸の発酵生産には有機酸発酵用微生物を用い、用いる微生物に適した培地を用いることによって行うことができる。こうした微生物としては、有機酸生産が活性化された酵母を用いることができ、こうした酵母は、自然界からのスクリーニング、人工突然変異及び遺伝子工学的改変などのいずれの手法によって得られた酵母であってもよい。好ましくは、遺伝子工学的に改変された酵母である。有機酸の生産が促進されるよう遺伝子工学的に改変された酵母としては、好ましくは、酵母染色体上において有機酸合成酵素が導入された組換え酵母であることが好ましい。こうした組換え酵母の宿主酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などの酵母が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株を例示できる。
【００５３】
遺伝子組換え酵母においては適当なプロモーターの制御下に有機酸合成酵素をコードするコード領域を発現可能に保持している。高効率で有機酸を生産するには、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、ＡＤＨ１遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターなどが挙げられる。なお、これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。こうしたプロモーター群から選択されるプロモーターとしては、少なくともＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。ＰＤＣ１プロモーターの制御下で有機酸を合成する酵素を発現させることにより、高効率で有機酸を発酵することが期待でき、こうした酵母が本発明の微生物として有効だからである。
【００５４】
有機酸合成酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素等が挙げられる。例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。なお、有機酸合成酵素をコードするコード領域は、酵母において複数コピー導入されていることが好ましい。
【００５５】
このような有機酸生産酵母としては、例えば、特開２００３−９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３９２７０、特開２００６−７５１３３に記載の乳酸生産酵母等を好ましく用いることができる。
【００５６】
なお、以上説明した有機酸の抽出及び有機酸発酵液からの有機酸の抽出は、必ずしも有機酸オリゴマーの製造方法と連続して行うことはなく、有機酸の抽出方法及び有機酸発酵生産工程を伴う有機酸の製造方法として実施することができる。さらには、こうした有機酸オリゴマー合成工程のほか、必要に応じて、有機酸抽出工程や有機酸の発酵生産工程を伴う脂肪族ポリエステルの製造方法としても実施できる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【００５８】
（発酵からオリゴマー化分離までの検討）〈乳酸の抽出溶媒の検討〉
【００５９】
（実施例１） トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンとして１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）［コグニス社製］を用い、この第３級アミンをテルピネオール（第三級アルコール）で希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層し、室温で二分間振盪したのちに静置した。静置後、乳酸アナライザー（酵素法）を用いて水相中の乳酸濃度を測定し、「数１」に従って抽出度（Ｅ）を求めた。
【数１】
［ＨＬ］ｏ；溶媒中の乳酸濃度［ＨＬ］ｉｎｉｔ；水相中に仕込んだ乳酸濃度［ＨＬ］ＡＴ；溶媒抽出操作後に測定した水相中の乳酸濃度ＶＡ；水相の容積Ｖｏ；溶媒相の容積
【００６０】
その結果、図４に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のテルピネオール（第三級アルコール）を添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）（後述する比較例１）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。
【００６１】
（実施例２）
イソフィトール（第三級アルコール）で希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図５に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のイソフィトール（第三級アルコール）を添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。
【００６２】
（比較例１）
１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）［コグニス社製］溶液の１ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、乳酸抽出度は３０％であった。Ａｌａｍｉｎｅ３３６の単独溶媒では全乳酸量の３割程度しか抽出されないことがわかる。
【００６３】
（比較例２）
オレイルアルコールで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図６に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６に２５〜７５％のオレイルアルコールを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が２倍以上に高いことがわかる。これまで、オレイルアルコールは菌体毒性を低減する目的で用いられていたが、本結果により、乳酸の抽出効率を高める効果があることを新たに確認した。
【００６４】
（比較例３）
ドデカンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図７に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にドデカンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６５】
（比較例４）
ピネンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図８に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にピネンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６６】
（比較例５） リモネンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図９に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にリモネンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６７】
（比較例６）
デカリンで希釈した０〜１００％のＡｌａｍｉｎｅ３３６溶液の１ｍｌを１．２％乳酸溶液２ｍｌに重層した他は、実施例１と同様にして抽出度（Ｅ）を求めた。その結果、図１０に示すように、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にデカリンを添加した抽出溶媒は、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒（１００％Ａｌａｍｉｎｅ３３６）よりも乳酸抽出度が低いことがわかる。
【００６８】
実施例１〜２及び比較例１〜６より、Ａｌａｍｉｎｅ３３６（第三級アミン）にドデカンなどのアルカン系、デカリンなどのシクロアルカン系、及びピネンやリモネンなどのテルペン系炭化水素を添加すると、乳酸の抽出度は低下するが、２５％〜７５％のオレイルアルコール（第一級アルコール）、テルポネオール（第三級アルコール）及びイソフィトール（第三級アルコール）を添加すると、乳酸の抽出度は２倍以上に向上することを明らかにした。
【００６９】
〈抽出溶媒中での乳酸のオリゴマー化分離の検討〉
【００７０】
（実施例３）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０１ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．９１ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：８６．３％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法、装置：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製 ａｕｔｏｆｌｅｘ、マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸）により下層画分を分析した結果、図１１に示すように、５〜２３量体の乳酸オリゴマーが検出された。実施例１の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にテルピネオールを添加した抽出溶媒はＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が高く、かつその抽出溶媒中でオリゴマー化分離ができる抽出溶媒であることがわかる。
【００７１】
（実施例４）
４口フラスコにトリ−ｎ−オクチルアミン／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（５．６４ｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１２に示すように、６〜１９量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７２】
（実施例５） ４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／イソフィトール（３：１ｖ／ｖ）７５ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液２５ｍｌ（２７．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分はデカンテーションにより容易に除去でき、残渣の下層画分（２１．６６ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：）を得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を直接分析した結果、図１３に示すように、９〜１８量体の乳酸オリゴマーが検出された。実施例２の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にイソフィトールを添加した抽出溶媒はＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸抽出効率が高く、さらには、その抽出溶媒中でオリゴマー化分離もできる抽出溶媒であることがわかる。
【００７３】
（実施例６）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／イソフィトール（３：１ｖ／ｖ）７５ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液１０ｍｌ（１０．０７ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、実施例３と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分はデカンテーションにより容易に除去することができ、残渣の下層画分（３．３１ｇ、乳酸の重量を１００としたときの回収率：３６．８％）を得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１４に示すように、６〜１９量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７４】
実施例４と比較して下層画分の回収率が低いのは、熱によりイソフィトール（第三級アルコール）の一部がフィトール（第一級アルコール）に変化し、乳酸のオリゴマー化を阻害することがわかっている。第一級アルコールの生成を防ぐためには、オリゴマー化反応が可能な温度〜２００℃までの温度に設定することが好ましい。
【００７５】
（比較例７） ４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６（１００ｍｌ）と９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を６０ｍｍＨｇ（８ｋＰａ）にセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、圧力を７０ｍｍＨｇ（９．３ｋＰａ）にセットし、４５分間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は上層画分（７３．４２ｇ）と下層画分（１２．４２ｇ）の二相に液々分離され、赤外吸光分析計を用いて上層画分と下層画分を分析した結果、上層画分よりＡｌａｍｉｎｅ３３６、下層画分よりエステル化合物とＡｌａｍｉｎｅ３３６が検出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法、装置：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製 ａｕｔｏｆｌｅｘ、マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸）により下層画分を分析した結果、図１５に示すように、２〜１２量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００７６】
比較例１の結果と合わせると、Ａｌａｍｉｎｅ３３６単独の抽出溶媒ではオリゴマー化分離は可能であるが、乳酸の抽出効率が低いという問題点がある。
【００７７】
（比較例８）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／オレイルアルコール（４：６ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例７と同様にしてオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は二相に分離されず、ＧＣ−ＭＳ法により反応液を分析した結果、乳酸オレイルエステルと２量体の乳酸オリゴマーオレイルエステルが検出された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を用いても、図１６の中段に示すように、３量体以上の乳酸オリゴマーオレイルエステルは検出されなかった。Ａｌａｍｉｎｅ３３６とオレイルアルコールからなる抽出溶媒中ではオリゴマー化分離ができないという問題点がある。
【００７８】
（比較例９）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／オレイルアルコール（８：２ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例７と同様にしてオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却することにより反応液を得た。反応液は二相に分離されず、その反応液を分析した結果、ＧＣ−ＭＳ法により乳酸オレイルエステルが検出され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により、図１６の上段に示すように、２〜４量体の乳酸オリゴマーオレイルエステルが検出された。比較例８で用いたオレイルアルコール量を１／３に少なくしても乳酸のオリゴマー化分離ができないことがわかる。
【００７９】
（比較例１０）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６（１００ｍｌ）と９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０９ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．２２ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１７に示すように、５〜１６量体の乳酸オリゴマーが検出された。比較例７の結果とあわせると、オリゴマー化反応時間を長くすると、乳酸モノマー重合度が高くなることがわかり、以下の実施例では本条件でオリゴマー化反応を実施した。
【００８０】
（比較例１１）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／ドデカン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．１２ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（５．７９ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ａに示すように、１９量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８１】
（比較例１２）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／ピネン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０５ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（４．１２ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｂに示すように、２３量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８２】
（比較例１３）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／リモネン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．５ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（８．５７ｇ）を得た。この下層画分は流動性の高い物質であった。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｄに示すように、１８量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８３】
（比較例１４）
４口フラスコにＡｌａｍｉｎｅ３３６／デカリン（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌと９０％Ｌ−乳酸溶液（１０．０ｇ）とを加えて室温で５分間撹拌した他は、比較例１０と同様にしてオリゴマー化反応を実施した。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（６．７４ｇ）を得た。下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図１８ｃに示すように、１９量体までの乳酸オリゴマーが検出された。
【００８４】
以上の実施例（１〜３）と比較例（１〜９）の結果よりＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒中では乳酸のオリゴマー化分離が可能あるが、乳酸の抽出効率が低いという問題点があることがわかった。反対に、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にオレイルアルコールを添加した抽出溶媒は、乳酸の抽出効率が高いが、乳酸のオリゴマー化分離ができないという問題点があることがわかった。
【００８５】
比較例３〜６、１１〜１４の結果より、Ａｌａｍｉｎｅ３３６にドデカン等のアルカン系炭化水素、ピネンやリモネンなどのテルペン系炭化水素、デカリン等のシクロアルカン系炭化水素を添加した抽出溶媒ではＡｌａｍｉｎｅ３３６単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が低いがオリゴマー化分離が可能であった。
【００８６】
以上の比較例と実施例から明らかなように、第三級アミンに２５％〜７５％の第一級アルコール又は第三級アルコールを添加した抽出溶媒は、第三級アミン単独溶媒よりも乳酸の抽出効率が２倍以上に向上することがわかる。しかしながら、第三級アミンにオレイルアルコールなどの第一級アルコールが含まれていると、重合化（オリゴマー化）が阻害されるのに対し、第三級アミンと第三級アルコールからなる抽出溶媒を用いれば、オリゴマー化（重合化）が進み、抽出溶媒中の乳酸をオリゴマー（有機酸重合体）として分離回収することができる。
【００８７】
〈培養液からの乳酸抽出とオリゴマー化分離の検討〉（実施例７）乳酸生産酵母ＴＣ２０株を１５％ＹＰＤ培地５００ｍｌで３日間培養した結果、４．７８％乳酸を含む発酵液を得た。該乳酸発酵液２００ｍｌに抽出溶媒としてＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌを加え、２分間振盪した。上層画分（溶媒画分）７５ｍｌを４口フラスコに入れ、比較例１０と同様に、常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃に昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。その結果、水分とテルピネオールは蒸留画分に移行し、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分（Ａｌａｍｉｎｅ３３６）はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（４．４９ｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により下層画分を分析した結果、図１９に示すように、６〜１１量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００８８】
なお、ＴＣ２０株は次のようにして取得した。
(１) 大腸菌Ｋ１２株をテンプレートとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子（以下、ＨＰＨ遺伝子）のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＨＰＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＶ０１４９９で登録されており、ＨＰＨ遺伝子の両末端のプライマーＨＰＨ−Ｕ（5’ -ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3’ （配列番号１））とＨＰＨ−Ｄ（5’-CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG-3’ （配列番号２））を使用した。
【００８９】
（２）酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人発酵研究所に登録されている菌株）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＴＤＨ３プロモーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＴＤＨ３遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ７２９７７で登録されており、プライマーＴＤＨ３Ｐ−Ｕ（5’ -ATA TAT GGA TCC TAG CGT TGA ATG TTA GCG TCAAC-3’ ；ＴＤＨ３プロモーター配列にＢａｍＨＩサイトを付加（配列番号３））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT CCC GGG TTT GTT TGT TTA TGT GTG TTT ATT CG-3’；ＴＤＨ３プロモーター配列にＳｍａＩサイトを付加（配列番号４））を使用した。
【００９０】
（３）酵母ＩＦＯ２２６０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＣＹＣ１ターミネーター領域のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ４９５４８で登録されており、プライマーＣＹＣＴ−Ｕ（5’ -ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G-3’ ；ＣＹＣ１ターミネーター配列にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加（配列番号５））、ＴＤＨ−３Ｐ−Ｄ（5’ -ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG-3’； ＣＹＣ１ターミネーター配列にＳａIＩサイトを付加（配列番号６））を使用した。
【００９１】
（４）ＨＰＨ遺伝子断片を大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（プロメガ製）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。このプラスミドをｐＢｈｐｈと命名した。本プラスミドをＢａｍＨＩとＳｍａＩ部位で切断後、ＴＤＨ３プロモーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−Ｐと命名した。さらに本プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａＩＩ部位で切断後、ＣＹＣ１ターミネーター断片を挿入し、このプラスミドをｐＢｈｐｈ−ＰＴと命名した。ｐＢｈｐｈ−ＰＴをテンプレートとしてＴＤＨ３プロモーター領域、ＣＹＣ１ターミネーター領域を付加したＨＰＨ遺伝子カセットの両末端にＧＰＤ１遺伝子の一部（７７ｂｐ）が付加したＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。付加したＧＰＤ１遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＧＥＮＢＡＮＫデータベースにＺ２４４５４で登録されており、プライマーはＨＰＨ遺伝子の外側にＧＰＤ１遺伝子の−１２７〜−５１領域を付加したＧＰＤ１−ＣＹＣ１−Ｒ（5’ -TTA CGT TAC CTT AAA TTC TTT CTC CCT TTA ATT TTC TTT TAT CTT ACT CTC CTA CAT AAG ACA TCA AGA AAC AAT TGg tta cat gcgtac acg cgtttg t-3’；大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号７））と、同じくＧＰＤ１遺伝子の＋１１００〜＋１１７６領域を付加したＧＰＤ１−ＴＤＨ３−Ｆ（5’ -CTA ATC TTC ATG TAG ATC TAA TTC TTC AAT CAT GTC CGG CAG GTT CTT CAT TGG GTA GTT GTT GTA AAC GAT TTG Gta gcg ttg aatgtt agc gtcaac a-3’； 大文字はＧＰＤ１遺伝子配列部分、小文字はＨＰＨ遺伝子配列部分（配列番号８））を使用した。このＰＣＲ産物を用いて、ＫＣＢ２７−７株を酢酸リチウム法（Ito et al.,J.Bacteriol.,153,163-168(1983)）にて形質転換した。形質転換後、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地のプレートにまいて、３０℃で２日間培養し、形質転換体を得た。形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法により挿入ＤＮＡ断片の外側のプライマーであるＧＰＤ１−２９５Ｆ（5’ -TGC TTC TCT CCC CTT CTT-3’（配列番号９））、ＧＰＤ１＋１４７２Ｒ（5’ -CAG CCT CTG AAT GAG TGG T-3’（配列番号１０））を用いて、ＨＰＨ遺伝子がＧＰＤ１遺伝子領域の染色体に組み込まれていることを確認した。
【００９２】
（５）この株を胞子形成培地で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ１遺伝子領域の両方にＨＰＨ遺伝子が組み込まれＧＰＤ１遺伝子が破壊されている株を取得した。これをＴＣ２０株とした。
【００９３】
（実施例８）
乳酸生産酵母ＴＣ２０株を１５％糖蜜培地５００ｍｌで３日間培養した結果、３．７９％乳酸を含む発酵液を得た。該乳酸発酵液２００ｍｌに抽出溶媒としてＡｌａｍｉｎｅ３３６／テルピネオール（１：１ｖ／ｖ）１００ｍｌを加え、２分間振盪した。上層画分（乳酸抽出された溶媒画分）８０ｍｌを４口フラスコに入れ、実施例６と同様に、オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却した。その結果、水分とテルピネオールは蒸留画分に移行し、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離された。上層画分（Ａｌａｍｉｎｅ３３６）はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（３．２７ｇ）を得た。赤外吸光分析計を用いて上層画分を分析した結果、主成分としてＡｌａｍｉｎｅ３３６が検出され、下層画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した結果、図２０に示すように、６〜１１量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９４】
（実施例９）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（２７ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液１０．４ｍｌ（１２．０８ｇ）を加えて室温で５分間撹拌し、１０ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した。常圧下で４５分間かけて４０℃から２００℃で昇温した後、直ちに６４℃まで自然冷却した。圧力を４ｋＰａにセットし、３０分かけて６４℃から２００℃まで昇温した後、６時間２００℃でオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）３．２７ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）２．６９ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２１と図２２に示すように、８〜１７量体の乳酸オリゴマーと８〜１８量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９５】
（実施例１０）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（２９ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液１７ｍｌ（１９．６１ｇ）を加えて室温で５分間撹拌し、１５ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した他は、実施例９と同様にオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）４．１５ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）４．１２ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２３と図２４に示すように、８〜１８量体の乳酸オリゴマーと８〜１４量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９６】
（実施例１１）
４口フラスコにトリ−ｎ−デシルアミン（７０ｍｌ）とイソフィトール（３１．５ｍｌ）の混合液に９０％Ｌ−乳酸溶液２４．１ｍｌ（２８．４３ｇ）を加えて室温で５分間撹拌して２０ｗ／ｖ％のＬ−乳酸を含む２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン溶液を調製した他は、実施例９と同様にオリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、室温まで自然冷却したところ、反応液は上層画分と下層画分の二相に分離され、上層画分はデカンテーションにより除去され、残渣の下層画分（一次沈殿画分という）１１．１６ｇを得た。さらに、上層画分を１００００ｒｐｍで３０分間遠心したところ、沈殿画分（二次沈殿画分という）１．４９ｇを得ることができた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により一次沈殿画分と二次沈殿画分をそれぞれ直接分析した結果、図２５と図２６に示すように、８〜１６量体の乳酸オリゴマーと８〜１７量体の乳酸オリゴマーが検出された。
【００９７】
（実施例１２）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）（和光純薬株式会社製）30ml（28.68g)、イソフィトール水添物（クラレ製イソフィトール溶液に水素ガスを添加して合成したもの）60ml（48.53g）及び90％Ｌ−乳酸溶液（和光純薬株式会社製）9.7ml(11.40g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30v/v％ＴＢＰ／イソフィトール水添物を調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、4℃まで冷却した。冷却後、反応液は二相に液々分離され、下層画分（オリゴマー画分）をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２７に示すように、2〜14量体の遊離型乳酸オリゴマーと６〜10量体の環状型乳酸オリゴマーが検出された。
【００９８】
（実施例１３）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）[和光純薬]30ml（28.70g)、イソフィトール[和光純薬]60ml（48.57g）及び90％Ｌ−乳酸溶液[和光純薬]9.7ml(11.40g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30％v/vＴＢＰ／イソフィトールを調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。反応後、常圧に戻し、4℃まで冷却した。冷却後、反応液は二相に液々分離され、下層画分（オリゴマー画分）をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２８に示すように、5〜8量体の環状型乳酸オリゴマーと非遊離型乳酸オリゴマー（3〜19量体の遊離型乳酸オリゴマーに相当）が検出された。
【００９９】
（実施例１４）
４口フラスコにトリブチルホスフェート（ＴＢＰ）[和光純薬]30ml（29.10g)、テルピネオール[和光純薬]60ml（54.74g）及び90％Ｌ−乳酸溶液[和光純薬]9.7ml(11.27g) を入れ、室温で5分間撹拌して10w/v% Ｌ−乳酸を含む30v/v％ＴＢＰ／テルピネオールを調製した。40hPaの減圧下で45分間かけて40℃から200℃で昇温した後、直ちに64℃まで自然冷却した。冷却後、圧力を4hPaにセットし、30分かけて64℃から200℃まで昇温し、200℃で6時間オリゴマー化反応を行った。テルピネオールは蒸留除去され、残渣の反応液をエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ESI-MS法）で直接分析したところ、図２９に示すように、5〜8量体の環状型乳酸オリゴマーと非遊離型乳酸オリゴマー（3〜19量体の遊離型乳酸オリゴマーに相当）が検出された。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１〜１０：合成プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの一例を示す図。
【図２】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの他の一例を示す図。
【図３】有機酸の抽出工程と有機酸オリゴマーの合成工程との組み合わせの他の一例を示す図。
【図４】テルピネオールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図５】イソフィトールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図６】オレイルアルコールによる乳酸抽出効率を示す図。
【図７】ドデカンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図８】ピネンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図９】リモネンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図１０】デカリンによる乳酸抽出効率を示す図。
【図１１】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液／テルピネオールの下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１２】トリ−ｎ−オクチルアミン／テルピネオール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１３】Ａｌａｍｉｎ３３６／イソフィトール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１４】Ａｌａｍｉｎ３３６／イソフィトール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１５】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１６】Ａｌａｍｉｎ３３６／オレイルアルコール反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１７】Ａｌａｍｉｎ３３６反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ａ】Ａｌａｍｉｎ３３６／ドデカンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｂ】Ａｌａｍｉｎ３３６／ピネンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｃ】Ａｌａｍｉｎ３３６／デカリンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１８ｄ】Ａｌａｍｉｎ３３６／リモネンの反応液の下層画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図１９】ＹＰＤ乳酸発酵培養液からの溶媒抽出液からオリゴマー化分離した画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２０】ＹＰＤ乳酸発酵培養液からの溶媒抽出液からオリゴマー化分離した画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２１】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１０ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２２】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２３】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１５ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２４】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、１５ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２５】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、２０ｗ／ｖ％乳酸の一次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２６】２５ｖ／ｖ％イソフィトール／トリ−ｎ−デシルアミン、２０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２７】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール水添物、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２８】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【図２９】３０ｖ／ｖ％トリブチルホスフェート（ＴＢＰ）／イソフィトール、１０ｗ／ｖ％乳酸の二次沈殿画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸オリゴマーの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える製造方法。
【請求項２】
前記アルキルアミンは第３級アミン及び第２級アミンから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記キャリアはアルキルアミンであり、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン及びトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記キャリアはトリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記第３級アルコールは、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノールからなる群から選択される１種又は２種以上を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記第３級アルコールは、テルピネオール及びイソフィトールを含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記非アルコール類は、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記反応溶媒は、２０ｖｏｌ％以上の前記アルキルアミンを含有している、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
さらに、前記有機酸オリゴマーを前記反応溶媒から分離する工程を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて前記有機酸を抽出する抽出工程を備える、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記抽出工程における前記有機酸含有水性溶液は有機酸生産酵母による有機酸発酵液を含有する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記有機酸発酵液は、有機酸を発酵生産中の培養液を含む、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記抽出工程は、前記培養液と前記反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する培養工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記有機酸は、乳酸である、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母である、請求項１１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択される、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
有機酸の抽出方法であって、
有機酸含有水性溶液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法。
【請求項１９】
有機酸の製造方法であって、
有機酸を発酵生産する工程と、
前記有機酸発酵生産工程で得られる有機酸を含有する有機酸発酵液に、
アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法。
【請求項２０】
脂肪族ポリエステルの製造方法であって、
アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程と、
該乳酸オリゴマーを用いて脂肪族ポリエステルを合成する工程と、を備える、製造方法。
【請求項１】
有機酸オリゴマーの製造方法であって、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程、を備える製造方法。
【請求項２】
前記アルキルアミンは第３級アミン及び第２級アミンから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記キャリアはアルキルアミンであり、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−ノニルアミン、トリ−ｎ−デシルアミン及びトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンから選択される１種又は２種以上を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記キャリアはトリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記第３級アルコールは、テルピネオール、イソフィトール、ゲラニルリナロール、リナロール、テトラヒドロリナロール、ネロリドール、ヒドロキシシトロネラールジエチルアセタール、ヒドロキシシトロネラールジメチルアセタール、４−ツヤノール、３−メチル−３−ペンタノール、オシメノール、スクラレオール、ｐ−メンタン−８−オール、ピリジフロロール、３−メチル−３−オクタノール、エチルリナロール及びアンブリノールからなる群から選択される１種又は２種以上を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記第３級アルコールは、テルピネオール及びイソフィトールを含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記非アルコール類は、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記反応溶媒は、２０ｖｏｌ％以上の前記アルキルアミンを含有している、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
さらに、前記有機酸オリゴマーを前記反応溶媒から分離する工程を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記有機酸を含有する有機酸含有水性溶液に前記反応溶媒を接触させて前記有機酸を抽出する抽出工程を備える、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
前記抽出工程における前記有機酸含有水性溶液は有機酸生産酵母による有機酸発酵液を含有する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記有機酸発酵液は、有機酸を発酵生産中の培養液を含む、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記抽出工程は、前記培養液と前記反応溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する培養工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記有機酸は、乳酸である、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母である、請求項１１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択される、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
有機酸の抽出方法であって、
有機酸含有水性溶液に、アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法。
【請求項１９】
有機酸の製造方法であって、
有機酸を発酵生産する工程と、
前記有機酸発酵生産工程で得られる有機酸を含有する有機酸発酵液に、
アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む抽出溶媒を接触させて有機酸を抽出する工程、を備える、方法。
【請求項２０】
脂肪族ポリエステルの製造方法であって、
アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択されるキャリアと、第３級アルコール及びエステル基を有しない非アルコール類から選択される１種又は２種以上とを含む反応溶媒を用いて、有機酸を重合して有機酸オリゴマーを合成する工程と、
該乳酸オリゴマーを用いて脂肪族ポリエステルを合成する工程と、を備える、製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８ａ】
【図１８ｂ】
【図１８ｃ】
【図１８ｄ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８ａ】
【図１８ｂ】
【図１８ｃ】
【図１８ｄ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【公開番号】特開２００８−５６９１９（Ｐ２００８−５６９１９Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０１９２９（Ｐ２００７−２０１９２９）
【出願日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人新エネルギー産業技術総合開発機構、課題設定型産業技術開発費助成「バイオプロセス実用化開発」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人新エネルギー産業技術総合開発機構、課題設定型産業技術開発費助成「バイオプロセス実用化開発」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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