核酸の配列決定のための方法および組成物
本発明が提供するヌクレオチド・アナログ群は、例えば、二つ以上の塩基の反復を有したホモポリマー領域を含む核酸配列に有用であり、本発明は、このヌクレオチド・アナログを利用した配列法に関する。本発明が提供する方法および組成物は、テンプレート依存型の配列反応に単一の塩基を一回ずつ導入することが可能である。本発明により、標的核酸のホモポリマー領域を含む全領域についてテンプレート依存型の合成配列が可能になる。このため、さらに本発明により、ホモポリマー領域に存在するヌクレオチドの数が測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第１１／２８６，６２６号、および２００５年１２月５日に出願された米国仮特許出願第１１／２９５，４０６号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第１１／２８６，６２６号および米国仮特許出願第１１／２９５，４０６号の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヌクレオチド・アナログおよびこれを利用した核酸配列法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
合成による核酸配列解読によって、生物組織および生物機能に対する理解に変革をもたらすことが可能である。従来の配列法では、サンプル・ベース核酸の増幅および／または電気泳動ゲルの利用によって配列情報を得てきたが、最近では、増幅バイアスに影響されない高密度配列情報を得る方法として、単一分子配列法が提供されている。非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
合成による配列解読は、担体結合テンプレート−プライマー・デュープレクスにヌクレオチドをテンプレートに依存して付加する方法である。付加されるヌクレオチドは、プライマーへの組み込みが検知されるように標識化される。単一分子の配列解読を行う際の問題は、ホモポリマー領域（すなわち、連続同一ヌクレオチドを含むテンプレート部分）にかかわる配列が可能かどうかという点にある。遺伝子機能という点ではしばしば、ホモポリマー領域に存在する塩基数が問題になる。すなわち、合成配列反応に利用されるほとんどのポリメラーゼは、連続移動性に優れているので、ホモポリマー領域を横切る場合、ポリメラーゼは連続して塩基を加えようとする。このため、配列反応に利用される検知し易い標識のほとんどが、二つ以上で連続的に組み込まれ、区別がつかない。したがって、ホモポリマー領域は、単一組み込みもしくはときに二重組み込みとして報告され、ホモポリマーに存在する正確な塩基数を測定するために必要な分析が行われない。
【０００５】
ホモポリマーに存在する塩基数を測定するという問題を解決する一つの方法は、同権利者の所有する同時係属中の特許文献１中で提案されている。すなわち、この方法は、組み込み反応速度をコントロールする方法であり、通常、所定の数の塩基が任意の反応周期で組み込まれる。本発明は、この問題に対する別の解決法を提供している。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１００９３２号明細書
【非特許文献１】Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：３９６０−６４，２００３年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明が提供する方法および組成物は、テンプレート依存型の配列反応に単一の塩基を一回ずつ導入することが可能である。本発明により、標的核酸のホモポリマー領域を含む全領域についてテンプレート依存型の合成配列が可能になる。このため、さらに本発明により、ホモポリマー領域に存在するヌクレオチドの数が測定される。
【０００７】
本発明は、第一ヌクレオチド組み込み活性部位に近接した領域に、第二ヌクレオチド組み込みの阻害体を導入することを意図している。このため、本発明による近接阻害では、阻害体の濃度がポリメラーゼの活性部位に近接した領域で濃くなることによって、単一ヌクレオチドが組み込まれると阻害が除去されるまで、後続の組み込みが阻害される。本発明は、以下で詳述されるように、近接阻害を生成する複数のメカニズムを意図している。その一つのメカニズムは、塩基組み込み部位に近接した領域でハイブリダイズする核酸マルチマーに阻害体を連結することによって、テンプレート／プライマー・デュープレックスのプライマー部分における第一塩基配列の組み込みを可能にし、阻害が除去されるまで後続の組み込みをすべて阻害する。さらに、この阻害体は、酵素、タンパク質（例、抗体あるいは配位子）に連結されてもよく、組み込まれるヌクレオチドに連結されるか「テザー」されてもよい。
【０００８】
一面では、本発明は、ヌクレオチド・アナログのファミリーを提供し、それぞれが、可逆阻害体もしくはブロッカーを有しており、これらによって、テンプレート依存型の合成配列反応の各付加周期において、一つのヌクレオチド組み込みだけが可能になる。ここで説明されている組成物は、任意の配列反応においても有用であるが、特に、単一分子の合成配列反応において有用である。この単一分子反応とは、ヌクレオチドが付加されるデユープレクスが個々に、光学的に分解されうる反応である。
【０００９】
通常、本発明のヌクレオチド・アナログには、テンプレート依存型の合成配列反応において組み込まれるヌクレオチドにテザーされるブロッカーが含まれる。組み込まれるヌクレオチドとブロッカーとの間の連結は開裂可能であり、適正な塩基対ヌクレオチドの組み込み後、ブロッカーを除去することができる。このブロッカー部分は、第二ヌクレオチド組み込みの特定阻害体もしくは非特定阻害体である。非特定阻害では、合成配列反応において組み込まれるヌクレオチドが、後続ヌクレオチドの組み込みを立体的に阻害する部分と連結される。特定阻害では、阻害体そのものが、ポリメラーゼ触媒ヌクレオチド付加に対する拮抗阻害体である。実施形態によっては、この阻害体がヌクレオチドであり、これ自体は組み込まれず、次の相補的ヌクレオチドの下流組み込みを阻害する。好ましい一実施形態では、組み込まれるヌクレオチド、親油部分、一、二、または三リン酸塩、および、非組み込みデオキシリボースまたはリボース部分が、特定阻害体に含まれる。
【００１０】
組み込まれるヌクレオチドと阻害体との間のテザーもしくはリンカーは、約４〜約５０原子の長さである。好ましくは、リンカーには親油部分が含まれている。さらに、リンカーには、組み込まれる塩基の近位に三重結合もしくはトランス二重結合を含めることができる。最終的には開裂連結が含まれることによって分子のブロック部分の除去が可能になる。
【００１１】
組み込まれるヌクレオチドの塩基部分は、標準ワトソン−クリック塩基、および、これらのアナログおよび変異体から選択される。特定阻害体の場合、ブロック・ヌクレオチドの塩基も、標準ワトソン−クリック塩基およびこれらのアナログおよび変異体から選択される。組み込まれるヌクレオチドおよびブロック・ヌクレオチドは、同じものでも異なるものでもよい。以下に説明されるように、ブロック・ヌクレオチドは、理論的にはヌクレオチド一リン酸塩もしくはヌクレオチド二リン酸塩のような、ポリメラーゼによって通常組み込まれないものであるか、もしくは、糖のＣ５’炭素に通常付着しているリン酸塩部分が欠けているものである。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明はヌクレオチド・アナログを提供し、これに含まれる組み込み用ヌクレオチドは、従来のワトソン−クリック塩基（アデニン、グアノシン、シトシン、チミジン、もしくは、ウリジン）、糖、例えば、リボースあるいはデオキシリボース糖、および、一つ以上のリン酸塩を含むブロック・ヌクレオチドと連結されている。
【００１３】
本発明の好ましいアナログには、蛍光標識のような光学検知可能な標識が含まれている。これらの標識は、組み込まれる塩基から開裂可能リンカーの開裂によって除去されるように、従来の化学的方法を利用してヌクレオチド・アナログの任意の位置に付着することができる。以下で、有用な標識の例が詳しく説明される。
【００１４】
本発明はさらに、核酸配列法を提供する。方法によっては、テンプレートおよびプライマーを含む核酸デュープレクスが表面に配置されて、このデュープレクスが光学的に、個々に分解可能となっている。合成配列反応が実行されるのは、標識ヌクレオチド・アナログのプライマーへの付加が可能であるが他のヌクレオチドもしくはヌクレオチド・アナログが即座に下流に付加されないようになっている状況においてである。この配列が検知された後は、阻害が除去されて他のヌクレオチドがプライマーに付加されることが可能になる。本発明の方法によれば、テンプレート・ホモポリマー領域における連続ヌクレオチドの検知およびカウントが可能になる。
【００１５】
特定構造および合成経路については、以下に示す本発明の詳細な説明に示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、テンプレート／プライマー・デュープレクスのプライマー部分に対する第二ヌクレオチド（Ｎ＋１；Ｎは第一塩基付加）付加を阻害する、合成による配列解読である。実施形態によっては、阻害体の局所濃度を濃くすることによって（Ｎ＋１）組み込み阻害が実行され、この阻害体全体の濃度は、組み込み阻害全般を実行するには不十分とすればよい。一面で本発明は、核酸アナログを提供し、テンプレート依存型の合成配列においてこのアナログを利用する方法を提供している。本発明のアナログにはブロック基が含まれており、これによりテンプレート依存反応において、テンプレート−プライマー・デュープレクスのプライマー部分に単一ヌクレオチドを付加することが可能になる。本発明のアナログには開裂可能リンカーが含まれており、これによってブロック基の除去が可能になりプライマーへ後続の（Ｎ＋１）塩基を付加することが可能になる。本発明のヌクレオチド・アナログを利用することによってホモポリマー領域の高精度配列が可能になり、この領域に存在するヌクレオチドの数の測定が可能になる。
【００１７】
本発明の好ましいアナログには、ブロッカーに連結されて組み込まれるヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログが含まれている。このブロッカーは、大型立体阻害体、あるいは組み込まれていないヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログであり、これらは、例えば親油もしくは親水領域を含む開裂可能リンカーによって連結されている。これらのアナログの特定の実施形態は、例示として合成法を説明するために以下に示されるが、当業者にとっては当然のことであるが、添付の請求項の範囲に適うかぎり種々の変更が可能である。
【００１８】
Ｉ．ヌクレオチド・アナログ
本発明のヌクレオチド・アナログは、式Ｉまたは式ＩＩの汎用構造を有している。
【００１９】
【化２１】
塩基Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立してプリン、ピリミジン、プリンもしくはピリミジン・アナログ、大型基（例えば、染料、ビオチン、ビード、もしくは、その他の大型分子）である。好ましい実施形態ではＢ１およびＢ２が、それぞれ独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、またはヒポキサンチンから選択される。Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立の例えば塩基の天然および合成の誘導体とすることもでき、ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン類、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他アルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン、イミダゾ[１，５−ａ］１，３，５トリアジノン類、９−デアザプリン類、イミダゾ[４，５−ｄ]ピラジン類、チアゾロ[４，５−ｄ]ピリミジン類、ピラジン−２−オン類、１，２，４−トリアジン、ピリダジン、１，３，５トリアジンなどがある。
【００２０】
本明細書に記載のヌクレオチド・アナログは、単一ヌクレオチドのテンプレート依存型の組み込みを可能にする。用語塩基対は、標準ＡＴ，ＡＵもしくはＧＣ塩基対を包含するだけではなく、特殊なまたは修飾された塩基を含むヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド・アナログの間に形成された塩基対も包含する。ここでは、水素結合供与体および水素結合受容体の配列によって、特殊塩基と標準塩基との間の、または、二つの相補的特殊塩基構造間の水素結合が可能になる。このような特殊塩基対の一例には、ヌクレオチドアナログであるイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対がある。
【００２１】
特定の実施形態では、式IIにおける二重結合がトランス型である。
【００２２】
【化２２】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＯＨ、Ｈ、Ｉ、ＮＨ２およびＮ３からなる群から選択される。
【００２３】
数ｎはそれぞれ独立して、０〜５０の整数である。好ましい実施形態では数ｎが１〜４である。
【００２４】
Ｙは、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２および結合からなる群から選択され、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択される。アルキル部分には飽和脂肪族基が含まれており、これには直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基が含まれている。実施形態によっては、直鎖もしくは分岐鎖アルキルがバックボーンに約３０以下（例、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ３０）あるいは、約２０以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキル類が環構造において、約３〜約１０の炭素原子を有するか、あるいは、環構造において、約５、６、または７の炭素を有する。用語「アルキル」には、ハロ置換アルキルも含まれる。さらに、用語「アルキル」（または「低アルキル」）には「置換アルキル類」が含まれ、これは、炭化水素バックボーンの一つ以上の炭素上の水素と置換する置換基を有するアルキル部分を指している。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、既述のアルキル類と同程度の長さの不飽和脂肪族基および可能な置換物を指しているが、それぞれが一つ以上の二重結合または三重結合を含んでいる。
【００２５】
Ｙが酸素の場合、生成したリンカーが開裂すると、組み込まれた塩基に特別短い「スカー」もしくは化学修飾が残る。生成したスカーは不活性であるために化学的に中和される必要がない。このために後続塩基の組み込みが容易になる。このようなアナログ（Ｃｙ５ブロッカー利用による）および「短スカー」脱離の例が、以下に示されている。
【００２６】
キャップ無しｄＵＴＰ−Ｃｙ５
【００２７】
【化２３】
短スカー脱離の例が、以下に示されている。
【００２８】
【化２４】
部分Ａは、−Ｓ−Ｓ−、エステル、アミド基からなる群から選択される。「アミド」は、当該分野で知られているように、アミノ置換カルボニル基である。
【００２９】
Ｒ３は、
【００３０】
【化２５】
アルキルおよび結合からなる群から選択される。
【００３１】
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、エーテル、および結合からなる群から選択されるが、「エーテル」には、酸素によって共有結合された二つの炭化水素が含まれていればよい。実施形態によってはＲ４が親油部分である。Ｒ４はグリコール・エーテルがよい。
【００３２】
Ｒ５は、
【００３３】
【化２６】
アルキル、アルケニル、および結合からなる群から選択され、ｐは、それぞれ独立して０〜５０の整数である。
【００３４】
Ａｒはアリール部分である。用語「アリール」は、５−，６−，７−員の単一環状芳香族基であり、これらには例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、その他のような、０〜４つのヘテロ原子を含めることができる。環構造においてヘテロ原子を有するこのようなアリール基は、また「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」とも呼ばれる。芳香環は、一つ以上の環位置において既述のような置換基と置換されてもよく、この例としては、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３，−ＣＮ、その他がある。用語「アリール」には、二つ以上の環状環を有する多環式環系も含まれており、二つ以上の炭素が二つの隣接環（これらの環は「縮合環」である）に共通であり、一つ以上の環は芳香族で、他の環状環は、例えばシクロアルキル類、シクロアルケニル類、シクロアルキニル類、アリール、および／または、ヘテロシクリル類である。好ましい実施形態では、Ａｒがフェニルあるいは芳香族酸とすることもできる。
【００３５】
Ｒ６は、ホスホリル部分のような任意の部分であればよい。いくつかの実施形態では、Ｒ６が以下からなる群から選択される。
【００３６】
【化２７】
式中、Ｚは、それぞれ独立してＯまたはＳである。Ｘは、Ｈまたはハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素、もしくは、ヨウ素を表す。好ましいハロゲンは、フッ素である。他の実施形態では、Ｒ６が、以下の式ではないという条件を有する任意の部分とすることもできる。
【００３７】
【化２８】
Ｒ７は、アルキルもしくは結合である。Ｒ８は、Ｓ、アルキル、アルケニル、アルキニル、または、ＮＲ’から選択される。Ｒ９は、ＮＲ’、Ｏ、Ｓおよび−（ＣＨ２）ｍ−から選択され、ｍは、独立して０〜５０の整数である。例えばｍは、０，１，２，３または４である。特定の実施形態では、ｎが４でありｍが３である。
【００３８】
Ｌは、例えば、光学検知可能な標識のような標識である。本発明の実行には種々の光学標識を利用することができ、これには以下の例がある。４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体：アクリジン、イソチオシアン酸アクリジン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホ酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３、５ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）；シアニン染料、シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロール・レッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−[ジメチルアミノ]ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンおよび誘導体、エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体、エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアン酸塩、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）、フルオレスカミン、ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６、マラカイト・グリーン・イソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロンオルト・クレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノール・レッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレンおよび誘導体、ピレン、ピレン・ブチラート、スクシンイミジル１−ピレン、ブチラート量子ドット、反応レッド４（シバクロンＴＭブリリアント・レッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢスルホニルクロリドローダルニン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサス・レッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチル・ローダミン、テトラメチル・ローダミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウム・キレート誘導体、シアニン−３（Ｃｙ３）、シアニン−５（Ｃｙ５）、シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、ラ・ホルタ・ブルー（ＬａＪｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）、フタロ・シアニン、ナフタロ・シアニン。
【００３９】
好ましい標識はＣｙ５およびＣｙ３のような蛍光染料であり、蛍光標識以外の標識が、他の光学検知可能な標識を含めて本発明により提供されている。標識については、標準的化学法を利用して、本発明のヌクレオチド・アナログの任意の位置に付加され、開裂可能リンカーの開裂によって、組み込まれた塩基から除去することができる。
【００４０】
例えば、式Ｉもしくは式ＩＩのＲ３がアルキルまたは結合である場合、ＬはＲ１，Ｒ２，Ｒ５，Ｒ６またはＢ２と共有結合している。Ｌは、例えばアミド結合によってＲ１もしくはＲ２と共有結合し、この例としては−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯがある。あるいはＬは、アミド結合によってＲ５またはＲ６と共有結合することもできる。
【００４１】
本発明の代表的ヌクレオチド・アナログは、以下のとおりである。
【００４２】
【化２９】
式中、ＰＰＰＯ−は、
【００４３】
【化３０】
であり、各発生におけるＺは、独立した酸素あるいは硫黄とすることができる。
【００４４】
本発明のヌクレオチド・アナログはさらに、式ＩＩＩによってあらわすこともできる。
【００４５】
【化３１】
式ＩＩＩのＲ１１は、以下からなる群から選択される。
【００４６】
【化３２】
および
【００４７】
【化３３】
式ＩＩＩの部分Ｂ1、Ｂ2、Ｙ、Ｒ’、Ｚ、Ｌ、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、ｍおよびｎは、上のように規定される。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明のヌクレオチド・アナログが、以下からなる群から選択される。
【００４９】
【化３４】
【００５０】
【化３５】
各実施形態において、ＰＰＰＯ−は
【００５１】
【化３６】
であり、各発生におけるＺは、独立した酸素もしくは硫黄であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ６およびＬは上に規定されているとおりであり、ｑは１〜５０の整数である。
【００５２】
本発明の別の代表的なヌクレオチドは、式ＩＶもしくは式Ｖのヌクレオチド・アナログである。
【００５３】
【化３７】
式中、Ｂ１，Ｂ２，Ｒ１，Ｒ２は、上のように規定され、Ｒ１２は、開裂可能リンカーを含む部分である。実施形態によっては、Ｒ６は、以下の式ではないという条件を有する任意の部分とすることもできる。
【００５４】
【化３８】
他の実施形態では、Ｒ６が上で規定されたとおりとすることもできる。Ｒ１２にはＢ１と結合されたアルキニル部分が含まれればよい。実施形態によっては、Ｒ１２にはＢ２と結合されたアルキニル部分を含めてもよい。Ｒ１２は、−Ｓ−Ｓ−、エステル、および、アミド基からなる群から選択される部分を含んでもよい。
【００５５】
ＩＩ．テンプレート指向合成配列
既述のように本発明による方法は、ホモポリマー領域を含む核酸配列法を改良したものである。この方法は、核酸テンプレート−プライマー・デュープレクスを、（ｉ）プライマ−へのヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼと、（ｉｉ）リンカーによってブロッカーと共有結合した第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログとに曝露することを含む。このときの条件は、ポリメラーゼがテンプレートの第一塩基に相補的である位置で、標識ヌクレオチド・アナログをプライマーに加えることが可能であり、次の下流塩基に相補的である位置では、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログをプライマーに加えられないという条件である。この曝露ステップの後に、プライマーに組み込まれるヌクレオチド・アナログが検知される。ブロッカーが除去されると、他のヌクレオチドがプライマーに組み込まれることが可能になる。標識、例えば、本明細書に記載の光学検知可能な標識の一つも、ブロッカーと同時に除去することができる。
【００５６】
本明細書に記載のヌクレオチド・アナログはどれも、このタイプの配列プロトコルに利用されるが、実施形態によっては、リンカーは、第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログの塩基、および、ブロック・ヌクレオチドもしくはブロック・ヌクレオチド・アナログの塩基と共有結合する。他の実施形態によっては、リンカーが約４〜５０原子の長さか、あるいは、約１５〜約１５原子の長さである。他の実施形態では、リンカーは、トランス型において二重結合を含むアルキニル基またはアルケニル基を通じて、第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログと共有結合する。
【００５７】
以下のセクションでは、核酸配列について一般的な検討がなされ、例えば、テンプレート、合成配列に有用なポリメラーゼ、表面選択、反応条件、信号検知および分析について検討がなされる。
【００５８】
核酸テンプレート
核酸テンプレートは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸テンプレートは合成することもできるし、天然源から誘導することもできる。実施形態によっては、核酸テンプレート分子が、タンパク質、脂質、および、非テンプレート核酸のような種々の他の成分を含む生物サンプルから単離される。核酸テンプレート分子は、動物、植物、バクテリア、菌類、または、その他の細胞生物から得られる細胞物質から得ることも可能である。本発明において利用される生物サンプルには、ウイルス粒子もしくは調製物が含まれる。核酸テンプレート分子は、有機体から直接得ることもできるし、例えば血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞、および、組織などの有機体から得られる生物サンプルから直接得ることもできる。いずれの組織もしくは体液標本も、本発明における核酸用のソースとして利用することができる。核酸テンプレート分子もまた、一次細胞培養もしくは細胞系のような培養細胞から単離可能である。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたはその他の細胞内病原体によって感染させることもできる。サンプルは、生物標本、ＤＮＡライブラリ、ウイルスＤＮＡ、または、ゲノムＤＮＡから抽出される全ＲＮＡとすることもできる。
【００５９】
生物サンプルから得られた核酸は通常、断片化されることによって、分析用の適正断片が生成される。実施形態によっては、生物サンプルから得られる核酸が超音波処理によって断片化される。核酸テンプレート分子は、２００３年１０月９日公開の米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３Ａ１号に記載されている方法によって得ることができる。通常は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、その他著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２年、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）２８０〜２８１頁に記載されているような種々の方法によって、核酸を生物サンプルから抽出すことができる。通常、個々の核酸テンプレート分子は、約５塩基から約２０ｋｂまでとすることができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または、一本鎖領域を有する二本鎖（例、ステムおよびループ構造）であればよい。
【００６０】
本明細書に記載の生物サンプルは、洗剤もしくは界面活性剤によって均質化または、断片化される。バッファの洗剤濃度は、約０．０５％〜約１０．０％とすればよいが、洗剤が溶液に溶けるの濃度まで可能である。好ましい実施形態における洗剤濃度は、０．１％〜約２％である。特に非変性質のマイルド洗剤は、サンプルを溶け易くするように作用することができる。洗剤は、イオン性あるいは非イオン性とすればよい。非イオン性洗剤の実施形態としては、以下の例がある。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ系列（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ＸＯＨ，ｘ＝９〜１０，Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ,Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４ ｘ＝７〜８ ）のようなトリトン、オクチル・グルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシル・エーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０オクチルフェニル・ポリエチレン・グリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレン・グリコール・ソルビタン・モノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレン・グリコール・ソルビタン・モノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシル・ベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニル・ポリエチレン・グリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレン・グリコールｎ−ドデシル・モノエーテル）、へクサエチレングリコール・モノ−ｎ−テトラデシル・エーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチル・チオグルコシド、ＯＴＧ）、エマルゲン（Ｅｍｕｌｇｅｎ）、およびポリオキシエチレン１０ラウリル・エーテル（Ｃ１２Ｅ１０）。イオン性洗剤（陰イオンもしくは陽イオン）の例には、デオキシコレート、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）がある。さらに、両性イオン試薬も本発明の精製スキームにおいて利用され、この例にはチャップス（Ｃｈａｐｓ）、両性イオン３−１４、および３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネートがある。さらに、尿素が、他の洗剤または界面活性剤の有無とは関係なく加えられてもよい。
【００６１】
溶解あるいは均質化の溶液にはさらに、還元剤のような薬品が含まれてもよい。このような還元剤の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ，ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチル・ホスフィン（ＴＣＥＰ）、あるいは、亜硫酸の塩がある。
【００６２】
核酸ポリメラーゼ
本発明に有用な核酸ポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および、以上の突然変異体もしくは変更型が含まれている。ＤＮＡポリメラーゼおよびその特性については、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、Ｂａｋｅｒ共著、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第二版、１９９１年、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク州、ニューヨーク市、において詳述されている。本発明に有用な既知のおよび従来のＤＮＡポリメラーゼには、限定的ではないが以下の例がある。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、他著Ｇｅｎｅ、１０８：１，１９９１年、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓ、他著Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６−８，１９９６年、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ共著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：７６６１，１９９１年）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ、ＭｃＧｏｗａｎ共著、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、４７５：３２，１９７７年）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、他著Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ、１９：４１９３，１９９１年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、９０Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴｈｅｒｍｏＳｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、イギリス）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｄｉａｚ、Ｓａｂｉｎｏ共著、Ｂｒａｚ Ｊ. Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９，１９９８年）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ他著Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０，１９７６年）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（タカギ他著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：４５０４，１９９７年）、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ−３、国際公開第０１３２８８７）、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ他著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０，１９９４年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵＩＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（好熱性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａより得られる、Ｄｉａｚ、Ｓａｂｉｎｏ共著、Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９，１９９８年、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓより得られる、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ、Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ共著、ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＲｅｓ、１１：７５０５，１９８３年）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ他著、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５６：３１１２，１９８１年）、古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎ）、他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９５：１４２５０，１９９８年、アメリカ）。
【００６３】
中温性ポリメラーゼも好熱性ポリメラーゼも対象となる。限定的ではないが、好熱性ＤＮＡポリメラーゼには、サーモシークエナーゼ（登録商標）、９０Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、ストッフェル断片、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、および、これらの突然変異体、変異体および誘導体が含まる。各ポリメラーゼの最も好まれる型は、３’エキソヌクレアーゼ欠陥突然変異体である。
【００６４】
本発明に有用な逆転写酵素には、限定的ではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、およびその他のレトロウイルスからの逆転写酵素が含まれる（Ｌｅｖｉｎ著Ｃｅｌｌ、８８：５〜８、１９９７年、Ｖｅｒｍａ著Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、４７３：１−３８，１９７７年、Ｗｕ他著、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、３：２８９〜３４７、１９７５年参照）。
【００６５】
表面
好ましい実施形態では、核酸テンプレート分子が、基板（本明細書では表面ともよばれる）に付着され、ここで説明される単一分子配列によって分析される。核酸テンプレート分子が表面に付着されると、テンプレート−プライマー・デュープレクスが光学的に個々に分解可能となる。本発明に利用される基板は、二次元もしくは三次元とすることができ、平面（例、ガラス・スライド）を含むことができ、あるいはこのように形成することができる。基板には、ガラス（例、制御細孔ガラス（ＣＰＧ））、石英、プラスチック（例、ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ（メチメタクリレート））、アクリル共重合体、ポリアミド、シリコン、金属（例、アルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲル・マトリクス（例、シリカ・ゲル）、ポリアクロレイン、または、複合体が含まれる。
【００６６】
適正な三次元基板には、例えば、球、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微小チップ、管（例、毛細管）、マイクロウェル、マイクロ流体デバイス、チャネル、フィルタ、または、その他、核酸定着に適した構造が含まれる。基板には、テンプレート核酸もしくはプライマーの集団を含む領域を有することが可能な平面アレイあるいはマトリクスが含まれる。これらの例には、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレン・スライド、誘導体化磁気スライド、ポリエチレン・グリコールとグラフトしたポリスチレン、その他が含まれる。
【００６７】
基板は、好ましくは、最適の光学処理および核酸付着が可能となるようコーティングされている。さらに、バックグラウンドを削減するように、本発明に利用される基板を処理することも可能である。代表的なコーティングには、エポキシドおよび誘導体化エポキシド（例、オリゴヌクレオチドもしくはストレプタビジンのような結合分子を有する）が含まれる。
【００６８】
核酸分子を基板表面に定着または、固定化させるためには種々の方法を利用することができる。表面との直接結合もしくは間接結合によって固定化を実行することができる。これは共有結合によって結合することができる。Ｊｏｏｓ、他著Ａｎｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４７：９６〜１０１、１９９７年、Ｏｒｏｓｋａｒ、他著Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、４２：１５４７〜１５５５、１９９６年、Ｋｈａｎｄｊｉａｎ著、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ、１１：１０７〜１１５、１９８６年参照。好ましい付着は、表面に取り込まれたエポキシドに、テンプレートの末端ヌクレオチドまたはプライマーの５’末端を結合する直接アミン結合である。この結合はまた、非共有結合によっても可能である。例えば、ビオチンストレプタビジン（Ｔａｙｌｏｒ他著、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ、２４：１４４３，１９９１年）ならびにジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈ、他著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１１２２，１９９２年）は、核酸を表面およびこれに類するものに定着させる一般的なツールである。あるいは、疎水鎖を脂質単分子層もしくは二重層に定着させることによって付着を実行することもできる核酸分子を基板に定着させる他の既知の方法も利用可能である。
【００６９】
検知
利用される標識のタイプに対して適正な任意の検知法を利用することができる。よって、代表的な検知法としては、放射性検知、吸光検知、例えばＵＶ可視吸光検知、発光検知、例えば蛍光または化学発光、が含まれる。例えば、利用される走査法に基づいて、各基板のすべてもしくは一部を同時にあるいは連続して走査することによって、基板上の伸長プライマーを検知することができる。蛍光標識については、フォーダー（Ｆｏｄｏｒ）、他（米国特許番号５，４４５，９３４）およびマシーズ（Ｍａｔｈｉｅｓ）、他（米国特許番号５，０９１，６５２）によって説明されている蛍光顕微鏡装置を利用して、選択された領域が、一つ一つあるいは一行ごとに連続して走査される。単一分子から蛍光物質を感知することが可能なデバイスには、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）がある。ハイブリダイゼーションのパターンの走査には、Ｙｅｒｓｈｏｖ他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９３：４９１３、１９９６年に説明されているような、適正光学系（Ｐｌｏｅｍ著、Ｔ．Ｇ．Ｍａｓｏｎ編、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ｐｐ．１〜１１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９９３年）が装備されたＣＣＤカメラ（例、モデルＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州、トレントン市）が使われてもよいし、ＴＶモニタリングによって画像化されてもよい。放射性信号についてはホスホイメージャ・デバイスを利用することができる。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ他著、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６，１９９０年、Ｄｒｍａｎａｃ他著、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６，１９９２年、１９９３年）。画像化装置の他の民間納入業者には、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ウォータタウン市、ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ、Ｇｅｎｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、オンタリオ州、ウォータールー市、ｗｗｗ．ｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．がある。このような検知法は特に、複数の付着テンプレート核酸を同時走査するために利用される。
【００７０】
蛍光標識ヌクレオチドの単一核酸分子への組み込みを検知するには複数の方法を利用することができる。光学セットアップには、近視野走査顕微鏡検査、遠視野共焦顕微鏡検査、広視野落射照明、光散乱、暗視野顕微鏡検査、光変換、単一および／または複数光子励起、スペクトル波長判別、蛍光体識別、エバネセント波照射、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査が含まれる。通常、いくつかの方法には、カメラ装備顕微鏡を利用したレーザ活性蛍光検知が含まれる。適正な光子検知システムには、限定的ではないが、光ダイオードおよび増強ＣＤＤカメラが含まれる。例えば、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラの利用が可能である。表面に近い流体の個々の蛍光染料分子を画像化するためにＩＣＣＤを利用することには多くの長所がある。例えばＩＣＣＤ光学セットアップによって蛍光体の連続画像（動画）を取り込むことが可能である。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態では画像化のためにＴＩＲＦ顕微鏡検査を利用する。このＴＩＲＦ顕微鏡検査は、完全内部反射励起光を利用した既知の方法である。ｗｗｗ．ｎｉｋｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘ参照。実施形態によっては、エバネセント波照射および全内部反射蛍光顕微鏡検査を利用して検知が行われる。減衰光照射では、野を例えば表面にセットアップし、蛍光標識核酸分子を画像化することができる。レーザ・ビームが、液体と固体基板（例、ガラス）との間の界面で全反射すると、励起光が極めて短距離で液体に透過する。光学視野は、反射界面で突然、終了するわけではなく、強度が距離によって指数関数的に低下する。この表面電磁気場は、「エバネセント波」と呼ばれ、界面に近接している液体中の蛍光分子を選択的に励起する。界面の薄いエバネセント光学視野によって低バックグラウンドが可能になり、可視波長の高信号対ノイズ比による単一分子検知が容易になる。
【００７２】
エバネセント場は、さらにポリメラーゼ存在下の付着テンプレート−プライマー複合体への蛍光標識ヌクレオチドの組み込みを画像化することが可能である。さらに全内部反射蛍光顕微鏡検査が利用されることによって、単一分子分解能で付着テンプレート−プライマー・デュープレクスおよび／または組み込みヌクレオチドが視覚化される。
【００７３】
分析
上述に大まかに記載されているように、生成される画像スタックから得られた配列結果を、整列および／または編集するには、可能な配列変更（例、エラー、変異、その他による）を考慮した参照表が利用される。本来、本明細書に記載されているようにして得られた配列結果は、一つもしくは二つの塩基エラーを加えたあらゆる可能な基準配列を含む参照表と比較される。
【実施例】
【００７４】
本発明はさらに以下の限定されない実施例によって説明される。これらの実施例は、本発明の代表的な複数のヌクレオチド・アナログの合成（実施例１〜３）、および、核酸配列におけるこれらの利用（実施例４）について説明している。
【００７５】
（実施例１）
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ５と記される以下のヌクレオチド・アナログの合成について説明している。
【００７６】
【化３９】
本実施例では、両方の塩基がウラシルであるが、当業者には当然のことながら、同様の化学作用で他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ５を合成する反応スキームが、図１で説明されており、特に、図１Ａはヌクレオチド・アナログ５を示し、図１Ｂは化合物２（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｃは化合物３（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｄは化合物１および４（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｅはヌクレオチド・アナログ５の合成を示している。
【００７７】
（実施例２）
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ７であるヌクレオチド・アナログの合成を示している。
【００７８】
【化４０】
この実施例では、両方の塩基がウラシルであるが、当業者は、同様の化学作用を利用して他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ７を合成する反応スキームは、図２に示されている。特に、図２Ａはヌクレオチド・アナログ７を示し、図２Ｂは化合物６（ヌクレオチド・アナログ７の合成の中間体）の合成を示し、図２Ｃはヌクレオチド７の合成段階を示している。
【００７９】
（実施例３）
この実施例ではヌクレオチド・アナログ９であるヌクレオチド・アナログの合成が示されており、ｎは３である。
【００８０】
【化４１】
この実施例では一つの塩基がアデニンで、他の塩基はウラシルである。当然のことながら、当業者であれば、同様の化学作用を利用して他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ９を合成する反応スキームが、図３で示されており、特に、図３Ａはヌクレオチド・アナログ９を示し、図３Ｂはヌクレオチド・アナログ９の合成ステップを示している。
【００８１】
（実施例４）
本実施例は、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログを利用したテンプレート核酸の配列法を示している。
【００８２】
バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の７２４９ヌクレオチド・ゲノムは、本発明のアナログおよび方法を利用して配列される。精製された一本鎖ウイルスＭ１３ｍｐ１８ゲノムＤＮＡは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂから得た。Ｍ１３ＤＮＡの約２５μｇを、３７℃で１０分間、０．１ＵのＤＮアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）によって４０〜１００ｂｐの平均断片サイズに消化した。これらの消化ＤＮＡ断片サイズは、プレキャスト変性（ＴＢＥ−Ｕｒｅａ）１０％ポリアクリルアミド・ゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に消化混合物のアリコートを加え、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ）で染色することによって測定された。ＤＮアーゼＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＹＭ１０限外ろ過スピン・カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってろ過し、約１０ヌクレオチド未満の小さい消化生成物を除去した。約２０ｐｍｏｌのろ過済みＤＮアーゼＩ消化液を、既知の方法（Ｒ．ロイチョードリ（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）、Ｒ．ウー（Ｗｕ）共著「ＤＮＡ３’末端へのヌクレオチド末端転移酵素−触媒付加」『酵素学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）』６５（１）：４３〜６２，１９８０年）に基づき、末端転移酵素によってポリアデニル化した。平均ｄＡテール長は、５０＋／−５ヌクレオチドであった。次に、末端転移酵素を利用して、Ｃｙ３−ｄＵＴＰにより断片を標識化した。断片を、ジデオキシＴＴＰ（末端転移酵素を利用して付加）によって終端した。次に、生成した断片を再度、ＹＭ１０限外ろ過スピン・カラムによってろ過して遊離ヌクレオチドを除去し、−２０℃でｄｄＨ２Ｏに保存した。
【００８３】
オリゴ付着用にエポキシド被覆ガラスを調製した。Ｅｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュー・ハンプシャー州、セーラムのエポキシド官能化の直径４０ｍｍ＃１．５ガラス・カバー・スリップ（スライド）が調達され、３７℃で１５分間、３×ＳＳＣに液浸して前処理された。次に、既述の５’アミノ化テンプレート断片の５００ｐＭアリコートで、８０ｍＬ、室温で３０分間各スライドを定温放置した。得られたスライドにはポリ（ｄＴ５０）テンプレート断片が、エポキシドとの直接アミン連結によって付着した。次に、スライドを、室温で４時間、リン酸塩（１Ｍ）によって処理し、表面を不活性化させる。さらに、配列に利用されるまでバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８．０）に保存する。
【００８４】
配列の場合は、これらのスライドを、５０μｍ厚ガスケットを利用して改良型ＦＣＳ２フローセル（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、ペンシルベニア州、バトラー）のなかに置く。このフローセルを可動ステージに配置する。この可動ステージは、全内部反射（ＴＩＲ）対物レンズ装備のニコンＴＥ−２０００倒立顕微鏡に対して構築された高性能蛍光画像化システムのパーツである。スライドは、この後１００ｍＭ ＮａＣｌのＨＥＰＥＳバッファによって洗浄され５０℃に平衡化される。ポリ（ｄＴ５０）プライマーのアリコートは、フローセルのなかに配置され、１５分間、スライド上で定温放置する。定温放置後は１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳで、その後はＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌで洗浄される。フローセルの液体は受動真空装置によって吸引する。得られるスライドにはＭ１３テンプレート／オリゴ（ｄＴ）プライマー・デュープレクスが含まれる。配列のためにフローセルの温度を３７℃に下げ、対物レンズによってフローセルを捉える。
【００８５】
それぞれがシアニン−５標識を有する本発明のアナログ（組み込み可能塩基として、シトシン三リン酸塩、グアニジン三リン酸塩、アデニン三リン酸塩、または、ウラシル三リン酸塩を含む四種）は、配列に備えて個別に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、５０μＭのＭｎＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＨＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ＵのＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含むバッファに保存する。配列が以下のように実行される。
【００８６】
最初、初期画像化によって表面上のデュープレクス位置が測定される。Ｍ１３テンプレートに付加されたＣｙ３標識を、５３２ｎｍ放射に合わせたレーザ（Ｖｅｒｄｉ Ｖ−２Ｌａｓｅｒ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、カリフォルニア州、サンタ・クララ）を利用した励起により画像化し、デュープレクス位置を規定する。各スライドについて、この段階で画像化される単一の分離可能蛍光分子だけをカウントする。以下で述べられるような組み込みヌクレオチドの画像化は、６３５ｎｍ放射線レーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を利用したシアニン−５染料の励起によって実行される。図１において示された１００ｎＭ Ｃｙ５ＣＴＰアナログは、フローセルのなかに配置されて２分間、スライドに曝露される。定温放置後、スライドを、１×ＳＳＣ／１５ｍＭＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ／ｐＨ７．０（「ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ」）のなかで洗浄し(６０μＬで１５回)、この後、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ７．０（「ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ」）のなかで洗浄する（６０μＬで１０回）。次に、３０％アセトニトリルを含む酸素スカベンジャーおよびスカベンジャー・バッファ（ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌを１３４μl、１００ｍＭ ＴｒｏｌｏｘのＭＥＳ溶液２４μＬ、ｐＨ６．１、１００ｎＭ ＤＡＢＣＯのＭＥＳ溶液１０μＬ、ｐＨ６．１、２Ｍグルコースを８μＬ、５０ｍＭのＮａＩを２０μＬ（５０ｍＭ水溶液ストック）、および、グルコース酸化酵素４μＬ）を加える。次に、スライドを、６４７ｎｍのＩｎｏｖａ３０１Ｋレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を利用して０．２秒間画像化し（５００フレーム）、この後、２秒間５３２ｎｍのＶｅｒｄｉＶ−２レーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）によって緑色で画像化しデュープレクス位置を確認する。検知可能な蛍光物質のある位置が記録される。画像化後、各フローセルを、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ(６０μＬ)によって５回ずつ洗浄する。次に、５分間５０ｍＭのＴＣＥＰのフローセルのなかに導入することによって、シアニン−５標識を組み込まれたＣＴＰアナログから開裂し、この後、各フローセルを、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μＬ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μＬ）によって５回ずつ洗浄する。
【００８７】
以上の手順は、１００ｎＭのＣｙ５ｄＡＴＰアナログについて実行し、この後、１００ｎＭのＣｙ５ｄＧＴＰアナログ、最後に５００ｎＭのＣｙｄＵＴＰアナログについて実行する。この手順（ヌクレオチドへの曝露、ポリメラーゼへの曝露、洗浄、スカベンジャー、画像化、洗浄、開裂、洗浄）を、既述のように反復する。ＵＴＰアナログは、２分間ではなく５分間、定温放置する。
【００８８】
このサイクルを所定の回数終えたあと、画像スタック・データ（種々の表面結合デュープレクスから得られた単一分子配列）をＭ１３基準配列に整列させる。この整列アルゴリズムによって既述のように得られた配列が、実際のＭ１３線形配列と整合される。得られた配列をＭ１３に配置するには、０、１あるいは２つのエラーの可能性を考慮しつつ、得られた配列および同じ長さのＭ１３の一部の間の最良の整合に基づいて実行する。得られた０エラーの９−ｍｅｒ（すなわち、Ｍ１３基準配列の９−ｍｅｒと正確に整合している）をすべて、最初にＭ１３と整列する。その後、０あるいは１エラーの１０−、１１−、１２−ｍｅｒを整列する。最終的に、０，１，２エラーの１３−ｍｅｒ以上を整列する。以上が完了すると、ホモポリマー数を含めて配列が知られる。
【００８９】
（実施例５）
本実施例では、本発明の三種のヌクレオチド・アナログについて、ホモポリマー領域での配列時のテンプレート依存型の配列反応における組み込み機能、および、次の塩基（もしくはＮ＋１）の組み込みを阻害する機能をテストした。これらのヌクレオチド・アナログについて、テンプレート依存型の法によるプライマーへの組み込み機能、および、「非ブロック」アナログと同程度の速度でプライマーの３’末端に組み込まれる機能を分析した。さらに、これらのヌクレオチド・アナログについて、組み込まれた後のプライマーへのさらなる塩基付加に対する阻害機能を分析した。その後、ブロック基の除去によって阻害が可逆であるかどうかが判定するためにヌクレオチド・アナログを分析した。
【００９０】
本実施例においてテストされる三種のヌクレオチド・アナログには、ヌクレオチド・アナログ５（実施例１において説明されている）、ヌクレオチド・アナログ１０（以下で示される）、ヌクレオチド・アナログ１１（以下で示される）が含まれている。
【００９１】
ヌクレオチド・アナログ１０を以下に示す。
【００９２】
【化４２】
ヌクレオチド・アナログ１１を以下に示す。
【００９３】
【化４３】
三種の各ヌクレオチド・アナログを、Ｔ１４８テンプレートに曝露した。このテンプレートは、ホモポリマー複製の開始位置の近位においてテンプレートにハイブリダイズされたプライマーを有する、ＡＡＡホモポリマーの反復を含んでいる。各アナログの濃度は、既述の標準組み込み条件下およびＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏーの存在下で１００または５００ｎＭとした。これらの組み込み速度を、１２原子ジスルフィド開裂可能リンカーによってＣｙ５染色と連結された標準ｄＵＴＰアナログ（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５と呼ぶ）の組み込みと比較した。この反応の生成物を、毛管電気泳動を利用して分析した。この検査結果を下の表１に示す。
【００９４】
【表１】
表１のように、代表的な各ヌクレオチド・アナログは、ｄＵＴＰ−Ｃｙアナログとほぼ同じ速度で組み込まれたが、第二塩基の組み込み速度はかなり遅かった（７０〜１５０倍遅い）。第三塩基の組み込みは、どのアナログについても検知されなかった。
【００９５】
ＴＣＥＰに曝露してジスルフィド結合を開裂し、ブロック基を開裂すると（アナログ５の左部分（実施例１参照）ならびにアナログ１０および１１の右部分（上記参照））、新しいアナログが、第一塩基付加と同程度の速度で付加された。これらの結果によって、本発明のヌクレオチド・アナログは、テンプレート依存型の配列反応中に組み込まれて、ブロック基の除去以前に第二塩基の後続組み込みを阻害することが可能である、ということがわかる。
【００９６】
参照資料の引用
ここに引用されているあらゆる刊行物、特許、特許出願は、それら全体がそれぞれの個々に表示されている目的に応じて、特に参照資料によって引用されている。
【００９７】
均等論
本発明の特定の実施形態について説明してきたが、上記は、代表的な例であり限定的な例ではない。本明細書を検討することによって本発明の多くの変更が、当業者に明らかになるであろう。本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの考えられる均等物には、下記以外の転では該アナログに対応し該アナログと同様の一般的特性を有し、置換基または成分について一つ以上の単純な変形があり、これによって、対象のヌクレオチド・アナログの特性に悪影響を及ぼさない化合物が含まれる。通常、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの成分は、容易に入手可能な開始材料、試薬、従来の合成法を利用し、さらに、本明細書に記載の一般反応スキームにおいて例示された方法またはそれを変更した方法を利用して調製すればよい。本発明の範囲は、請求項および均等物の全範囲ならびに本明細書およびその変更を参照することにより決まる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｂ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｃ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｄ−Ａ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｄ−Ｂ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｅ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図２Ａ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｂ−Ａ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｂ−Ｂ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｃ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ａ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ａ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｂ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｃ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｄ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第１１／２８６，６２６号、および２００５年１２月５日に出願された米国仮特許出願第１１／２９５，４０６号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第１１／２８６，６２６号および米国仮特許出願第１１／２９５，４０６号の全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヌクレオチド・アナログおよびこれを利用した核酸配列法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
合成による核酸配列解読によって、生物組織および生物機能に対する理解に変革をもたらすことが可能である。従来の配列法では、サンプル・ベース核酸の増幅および／または電気泳動ゲルの利用によって配列情報を得てきたが、最近では、増幅バイアスに影響されない高密度配列情報を得る方法として、単一分子配列法が提供されている。非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
合成による配列解読は、担体結合テンプレート−プライマー・デュープレクスにヌクレオチドをテンプレートに依存して付加する方法である。付加されるヌクレオチドは、プライマーへの組み込みが検知されるように標識化される。単一分子の配列解読を行う際の問題は、ホモポリマー領域（すなわち、連続同一ヌクレオチドを含むテンプレート部分）にかかわる配列が可能かどうかという点にある。遺伝子機能という点ではしばしば、ホモポリマー領域に存在する塩基数が問題になる。すなわち、合成配列反応に利用されるほとんどのポリメラーゼは、連続移動性に優れているので、ホモポリマー領域を横切る場合、ポリメラーゼは連続して塩基を加えようとする。このため、配列反応に利用される検知し易い標識のほとんどが、二つ以上で連続的に組み込まれ、区別がつかない。したがって、ホモポリマー領域は、単一組み込みもしくはときに二重組み込みとして報告され、ホモポリマーに存在する正確な塩基数を測定するために必要な分析が行われない。
【０００５】
ホモポリマーに存在する塩基数を測定するという問題を解決する一つの方法は、同権利者の所有する同時係属中の特許文献１中で提案されている。すなわち、この方法は、組み込み反応速度をコントロールする方法であり、通常、所定の数の塩基が任意の反応周期で組み込まれる。本発明は、この問題に対する別の解決法を提供している。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１００９３２号明細書
【非特許文献１】Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：３９６０−６４，２００３年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明が提供する方法および組成物は、テンプレート依存型の配列反応に単一の塩基を一回ずつ導入することが可能である。本発明により、標的核酸のホモポリマー領域を含む全領域についてテンプレート依存型の合成配列が可能になる。このため、さらに本発明により、ホモポリマー領域に存在するヌクレオチドの数が測定される。
【０００７】
本発明は、第一ヌクレオチド組み込み活性部位に近接した領域に、第二ヌクレオチド組み込みの阻害体を導入することを意図している。このため、本発明による近接阻害では、阻害体の濃度がポリメラーゼの活性部位に近接した領域で濃くなることによって、単一ヌクレオチドが組み込まれると阻害が除去されるまで、後続の組み込みが阻害される。本発明は、以下で詳述されるように、近接阻害を生成する複数のメカニズムを意図している。その一つのメカニズムは、塩基組み込み部位に近接した領域でハイブリダイズする核酸マルチマーに阻害体を連結することによって、テンプレート／プライマー・デュープレックスのプライマー部分における第一塩基配列の組み込みを可能にし、阻害が除去されるまで後続の組み込みをすべて阻害する。さらに、この阻害体は、酵素、タンパク質（例、抗体あるいは配位子）に連結されてもよく、組み込まれるヌクレオチドに連結されるか「テザー」されてもよい。
【０００８】
一面では、本発明は、ヌクレオチド・アナログのファミリーを提供し、それぞれが、可逆阻害体もしくはブロッカーを有しており、これらによって、テンプレート依存型の合成配列反応の各付加周期において、一つのヌクレオチド組み込みだけが可能になる。ここで説明されている組成物は、任意の配列反応においても有用であるが、特に、単一分子の合成配列反応において有用である。この単一分子反応とは、ヌクレオチドが付加されるデユープレクスが個々に、光学的に分解されうる反応である。
【０００９】
通常、本発明のヌクレオチド・アナログには、テンプレート依存型の合成配列反応において組み込まれるヌクレオチドにテザーされるブロッカーが含まれる。組み込まれるヌクレオチドとブロッカーとの間の連結は開裂可能であり、適正な塩基対ヌクレオチドの組み込み後、ブロッカーを除去することができる。このブロッカー部分は、第二ヌクレオチド組み込みの特定阻害体もしくは非特定阻害体である。非特定阻害では、合成配列反応において組み込まれるヌクレオチドが、後続ヌクレオチドの組み込みを立体的に阻害する部分と連結される。特定阻害では、阻害体そのものが、ポリメラーゼ触媒ヌクレオチド付加に対する拮抗阻害体である。実施形態によっては、この阻害体がヌクレオチドであり、これ自体は組み込まれず、次の相補的ヌクレオチドの下流組み込みを阻害する。好ましい一実施形態では、組み込まれるヌクレオチド、親油部分、一、二、または三リン酸塩、および、非組み込みデオキシリボースまたはリボース部分が、特定阻害体に含まれる。
【００１０】
組み込まれるヌクレオチドと阻害体との間のテザーもしくはリンカーは、約４〜約５０原子の長さである。好ましくは、リンカーには親油部分が含まれている。さらに、リンカーには、組み込まれる塩基の近位に三重結合もしくはトランス二重結合を含めることができる。最終的には開裂連結が含まれることによって分子のブロック部分の除去が可能になる。
【００１１】
組み込まれるヌクレオチドの塩基部分は、標準ワトソン−クリック塩基、および、これらのアナログおよび変異体から選択される。特定阻害体の場合、ブロック・ヌクレオチドの塩基も、標準ワトソン−クリック塩基およびこれらのアナログおよび変異体から選択される。組み込まれるヌクレオチドおよびブロック・ヌクレオチドは、同じものでも異なるものでもよい。以下に説明されるように、ブロック・ヌクレオチドは、理論的にはヌクレオチド一リン酸塩もしくはヌクレオチド二リン酸塩のような、ポリメラーゼによって通常組み込まれないものであるか、もしくは、糖のＣ５’炭素に通常付着しているリン酸塩部分が欠けているものである。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明はヌクレオチド・アナログを提供し、これに含まれる組み込み用ヌクレオチドは、従来のワトソン−クリック塩基（アデニン、グアノシン、シトシン、チミジン、もしくは、ウリジン）、糖、例えば、リボースあるいはデオキシリボース糖、および、一つ以上のリン酸塩を含むブロック・ヌクレオチドと連結されている。
【００１３】
本発明の好ましいアナログには、蛍光標識のような光学検知可能な標識が含まれている。これらの標識は、組み込まれる塩基から開裂可能リンカーの開裂によって除去されるように、従来の化学的方法を利用してヌクレオチド・アナログの任意の位置に付着することができる。以下で、有用な標識の例が詳しく説明される。
【００１４】
本発明はさらに、核酸配列法を提供する。方法によっては、テンプレートおよびプライマーを含む核酸デュープレクスが表面に配置されて、このデュープレクスが光学的に、個々に分解可能となっている。合成配列反応が実行されるのは、標識ヌクレオチド・アナログのプライマーへの付加が可能であるが他のヌクレオチドもしくはヌクレオチド・アナログが即座に下流に付加されないようになっている状況においてである。この配列が検知された後は、阻害が除去されて他のヌクレオチドがプライマーに付加されることが可能になる。本発明の方法によれば、テンプレート・ホモポリマー領域における連続ヌクレオチドの検知およびカウントが可能になる。
【００１５】
特定構造および合成経路については、以下に示す本発明の詳細な説明に示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、テンプレート／プライマー・デュープレクスのプライマー部分に対する第二ヌクレオチド（Ｎ＋１；Ｎは第一塩基付加）付加を阻害する、合成による配列解読である。実施形態によっては、阻害体の局所濃度を濃くすることによって（Ｎ＋１）組み込み阻害が実行され、この阻害体全体の濃度は、組み込み阻害全般を実行するには不十分とすればよい。一面で本発明は、核酸アナログを提供し、テンプレート依存型の合成配列においてこのアナログを利用する方法を提供している。本発明のアナログにはブロック基が含まれており、これによりテンプレート依存反応において、テンプレート−プライマー・デュープレクスのプライマー部分に単一ヌクレオチドを付加することが可能になる。本発明のアナログには開裂可能リンカーが含まれており、これによってブロック基の除去が可能になりプライマーへ後続の（Ｎ＋１）塩基を付加することが可能になる。本発明のヌクレオチド・アナログを利用することによってホモポリマー領域の高精度配列が可能になり、この領域に存在するヌクレオチドの数の測定が可能になる。
【００１７】
本発明の好ましいアナログには、ブロッカーに連結されて組み込まれるヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログが含まれている。このブロッカーは、大型立体阻害体、あるいは組み込まれていないヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログであり、これらは、例えば親油もしくは親水領域を含む開裂可能リンカーによって連結されている。これらのアナログの特定の実施形態は、例示として合成法を説明するために以下に示されるが、当業者にとっては当然のことであるが、添付の請求項の範囲に適うかぎり種々の変更が可能である。
【００１８】
Ｉ．ヌクレオチド・アナログ
本発明のヌクレオチド・アナログは、式Ｉまたは式ＩＩの汎用構造を有している。
【００１９】
【化２１】
塩基Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立してプリン、ピリミジン、プリンもしくはピリミジン・アナログ、大型基（例えば、染料、ビオチン、ビード、もしくは、その他の大型分子）である。好ましい実施形態ではＢ１およびＢ２が、それぞれ独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、またはヒポキサンチンから選択される。Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立の例えば塩基の天然および合成の誘導体とすることもでき、ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン類、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他アルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ[３，４−ｄ]ピリミジン、イミダゾ[１，５−ａ］１，３，５トリアジノン類、９−デアザプリン類、イミダゾ[４，５−ｄ]ピラジン類、チアゾロ[４，５−ｄ]ピリミジン類、ピラジン−２−オン類、１，２，４−トリアジン、ピリダジン、１，３，５トリアジンなどがある。
【００２０】
本明細書に記載のヌクレオチド・アナログは、単一ヌクレオチドのテンプレート依存型の組み込みを可能にする。用語塩基対は、標準ＡＴ，ＡＵもしくはＧＣ塩基対を包含するだけではなく、特殊なまたは修飾された塩基を含むヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド・アナログの間に形成された塩基対も包含する。ここでは、水素結合供与体および水素結合受容体の配列によって、特殊塩基と標準塩基との間の、または、二つの相補的特殊塩基構造間の水素結合が可能になる。このような特殊塩基対の一例には、ヌクレオチドアナログであるイノシンと、アデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対がある。
【００２１】
特定の実施形態では、式IIにおける二重結合がトランス型である。
【００２２】
【化２２】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、ＯＨ、Ｈ、Ｉ、ＮＨ２およびＮ３からなる群から選択される。
【００２３】
数ｎはそれぞれ独立して、０〜５０の整数である。好ましい実施形態では数ｎが１〜４である。
【００２４】
Ｙは、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２および結合からなる群から選択され、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択される。アルキル部分には飽和脂肪族基が含まれており、これには直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基が含まれている。実施形態によっては、直鎖もしくは分岐鎖アルキルがバックボーンに約３０以下（例、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ３０）あるいは、約２０以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキル類が環構造において、約３〜約１０の炭素原子を有するか、あるいは、環構造において、約５、６、または７の炭素を有する。用語「アルキル」には、ハロ置換アルキルも含まれる。さらに、用語「アルキル」（または「低アルキル」）には「置換アルキル類」が含まれ、これは、炭化水素バックボーンの一つ以上の炭素上の水素と置換する置換基を有するアルキル部分を指している。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、既述のアルキル類と同程度の長さの不飽和脂肪族基および可能な置換物を指しているが、それぞれが一つ以上の二重結合または三重結合を含んでいる。
【００２５】
Ｙが酸素の場合、生成したリンカーが開裂すると、組み込まれた塩基に特別短い「スカー」もしくは化学修飾が残る。生成したスカーは不活性であるために化学的に中和される必要がない。このために後続塩基の組み込みが容易になる。このようなアナログ（Ｃｙ５ブロッカー利用による）および「短スカー」脱離の例が、以下に示されている。
【００２６】
キャップ無しｄＵＴＰ−Ｃｙ５
【００２７】
【化２３】
短スカー脱離の例が、以下に示されている。
【００２８】
【化２４】
部分Ａは、−Ｓ−Ｓ−、エステル、アミド基からなる群から選択される。「アミド」は、当該分野で知られているように、アミノ置換カルボニル基である。
【００２９】
Ｒ３は、
【００３０】
【化２５】
アルキルおよび結合からなる群から選択される。
【００３１】
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、エーテル、および結合からなる群から選択されるが、「エーテル」には、酸素によって共有結合された二つの炭化水素が含まれていればよい。実施形態によってはＲ４が親油部分である。Ｒ４はグリコール・エーテルがよい。
【００３２】
Ｒ５は、
【００３３】
【化２６】
アルキル、アルケニル、および結合からなる群から選択され、ｐは、それぞれ独立して０〜５０の整数である。
【００３４】
Ａｒはアリール部分である。用語「アリール」は、５−，６−，７−員の単一環状芳香族基であり、これらには例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、その他のような、０〜４つのヘテロ原子を含めることができる。環構造においてヘテロ原子を有するこのようなアリール基は、また「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」とも呼ばれる。芳香環は、一つ以上の環位置において既述のような置換基と置換されてもよく、この例としては、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３，−ＣＮ、その他がある。用語「アリール」には、二つ以上の環状環を有する多環式環系も含まれており、二つ以上の炭素が二つの隣接環（これらの環は「縮合環」である）に共通であり、一つ以上の環は芳香族で、他の環状環は、例えばシクロアルキル類、シクロアルケニル類、シクロアルキニル類、アリール、および／または、ヘテロシクリル類である。好ましい実施形態では、Ａｒがフェニルあるいは芳香族酸とすることもできる。
【００３５】
Ｒ６は、ホスホリル部分のような任意の部分であればよい。いくつかの実施形態では、Ｒ６が以下からなる群から選択される。
【００３６】
【化２７】
式中、Ｚは、それぞれ独立してＯまたはＳである。Ｘは、Ｈまたはハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素、もしくは、ヨウ素を表す。好ましいハロゲンは、フッ素である。他の実施形態では、Ｒ６が、以下の式ではないという条件を有する任意の部分とすることもできる。
【００３７】
【化２８】
Ｒ７は、アルキルもしくは結合である。Ｒ８は、Ｓ、アルキル、アルケニル、アルキニル、または、ＮＲ’から選択される。Ｒ９は、ＮＲ’、Ｏ、Ｓおよび−（ＣＨ２）ｍ−から選択され、ｍは、独立して０〜５０の整数である。例えばｍは、０，１，２，３または４である。特定の実施形態では、ｎが４でありｍが３である。
【００３８】
Ｌは、例えば、光学検知可能な標識のような標識である。本発明の実行には種々の光学標識を利用することができ、これには以下の例がある。４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体：アクリジン、イソチオシアン酸アクリジン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホ酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３、５ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアント・イエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）；シアニン染料、シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロール・レッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−[ジメチルアミノ]ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンおよび誘導体、エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体、エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアン酸塩、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）、フルオレスカミン、ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６、マラカイト・グリーン・イソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロンオルト・クレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノール・レッド、Ｂ−フィコエリスリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレンおよび誘導体、ピレン、ピレン・ブチラート、スクシンイミジル１−ピレン、ブチラート量子ドット、反応レッド４（シバクロンＴＭブリリアント・レッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン・ローダミンＢスルホニルクロリドローダルニン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサス・レッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチル・ローダミン、テトラメチル・ローダミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウム・キレート誘導体、シアニン−３（Ｃｙ３）、シアニン−５（Ｃｙ５）、シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００、ラ・ホルタ・ブルー（ＬａＪｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）、フタロ・シアニン、ナフタロ・シアニン。
【００３９】
好ましい標識はＣｙ５およびＣｙ３のような蛍光染料であり、蛍光標識以外の標識が、他の光学検知可能な標識を含めて本発明により提供されている。標識については、標準的化学法を利用して、本発明のヌクレオチド・アナログの任意の位置に付加され、開裂可能リンカーの開裂によって、組み込まれた塩基から除去することができる。
【００４０】
例えば、式Ｉもしくは式ＩＩのＲ３がアルキルまたは結合である場合、ＬはＲ１，Ｒ２，Ｒ５，Ｒ６またはＢ２と共有結合している。Ｌは、例えばアミド結合によってＲ１もしくはＲ２と共有結合し、この例としては−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯがある。あるいはＬは、アミド結合によってＲ５またはＲ６と共有結合することもできる。
【００４１】
本発明の代表的ヌクレオチド・アナログは、以下のとおりである。
【００４２】
【化２９】
式中、ＰＰＰＯ−は、
【００４３】
【化３０】
であり、各発生におけるＺは、独立した酸素あるいは硫黄とすることができる。
【００４４】
本発明のヌクレオチド・アナログはさらに、式ＩＩＩによってあらわすこともできる。
【００４５】
【化３１】
式ＩＩＩのＲ１１は、以下からなる群から選択される。
【００４６】
【化３２】
および
【００４７】
【化３３】
式ＩＩＩの部分Ｂ1、Ｂ2、Ｙ、Ｒ’、Ｚ、Ｌ、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、ｍおよびｎは、上のように規定される。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明のヌクレオチド・アナログが、以下からなる群から選択される。
【００４９】
【化３４】
【００５０】
【化３５】
各実施形態において、ＰＰＰＯ−は
【００５１】
【化３６】
であり、各発生におけるＺは、独立した酸素もしくは硫黄であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ６およびＬは上に規定されているとおりであり、ｑは１〜５０の整数である。
【００５２】
本発明の別の代表的なヌクレオチドは、式ＩＶもしくは式Ｖのヌクレオチド・アナログである。
【００５３】
【化３７】
式中、Ｂ１，Ｂ２，Ｒ１，Ｒ２は、上のように規定され、Ｒ１２は、開裂可能リンカーを含む部分である。実施形態によっては、Ｒ６は、以下の式ではないという条件を有する任意の部分とすることもできる。
【００５４】
【化３８】
他の実施形態では、Ｒ６が上で規定されたとおりとすることもできる。Ｒ１２にはＢ１と結合されたアルキニル部分が含まれればよい。実施形態によっては、Ｒ１２にはＢ２と結合されたアルキニル部分を含めてもよい。Ｒ１２は、−Ｓ−Ｓ−、エステル、および、アミド基からなる群から選択される部分を含んでもよい。
【００５５】
ＩＩ．テンプレート指向合成配列
既述のように本発明による方法は、ホモポリマー領域を含む核酸配列法を改良したものである。この方法は、核酸テンプレート−プライマー・デュープレクスを、（ｉ）プライマ−へのヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼと、（ｉｉ）リンカーによってブロッカーと共有結合した第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログとに曝露することを含む。このときの条件は、ポリメラーゼがテンプレートの第一塩基に相補的である位置で、標識ヌクレオチド・アナログをプライマーに加えることが可能であり、次の下流塩基に相補的である位置では、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログをプライマーに加えられないという条件である。この曝露ステップの後に、プライマーに組み込まれるヌクレオチド・アナログが検知される。ブロッカーが除去されると、他のヌクレオチドがプライマーに組み込まれることが可能になる。標識、例えば、本明細書に記載の光学検知可能な標識の一つも、ブロッカーと同時に除去することができる。
【００５６】
本明細書に記載のヌクレオチド・アナログはどれも、このタイプの配列プロトコルに利用されるが、実施形態によっては、リンカーは、第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログの塩基、および、ブロック・ヌクレオチドもしくはブロック・ヌクレオチド・アナログの塩基と共有結合する。他の実施形態によっては、リンカーが約４〜５０原子の長さか、あるいは、約１５〜約１５原子の長さである。他の実施形態では、リンカーは、トランス型において二重結合を含むアルキニル基またはアルケニル基を通じて、第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログと共有結合する。
【００５７】
以下のセクションでは、核酸配列について一般的な検討がなされ、例えば、テンプレート、合成配列に有用なポリメラーゼ、表面選択、反応条件、信号検知および分析について検討がなされる。
【００５８】
核酸テンプレート
核酸テンプレートは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸テンプレートは合成することもできるし、天然源から誘導することもできる。実施形態によっては、核酸テンプレート分子が、タンパク質、脂質、および、非テンプレート核酸のような種々の他の成分を含む生物サンプルから単離される。核酸テンプレート分子は、動物、植物、バクテリア、菌類、または、その他の細胞生物から得られる細胞物質から得ることも可能である。本発明において利用される生物サンプルには、ウイルス粒子もしくは調製物が含まれる。核酸テンプレート分子は、有機体から直接得ることもできるし、例えば血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞、および、組織などの有機体から得られる生物サンプルから直接得ることもできる。いずれの組織もしくは体液標本も、本発明における核酸用のソースとして利用することができる。核酸テンプレート分子もまた、一次細胞培養もしくは細胞系のような培養細胞から単離可能である。テンプレート核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたはその他の細胞内病原体によって感染させることもできる。サンプルは、生物標本、ＤＮＡライブラリ、ウイルスＤＮＡ、または、ゲノムＤＮＡから抽出される全ＲＮＡとすることもできる。
【００５９】
生物サンプルから得られた核酸は通常、断片化されることによって、分析用の適正断片が生成される。実施形態によっては、生物サンプルから得られる核酸が超音波処理によって断片化される。核酸テンプレート分子は、２００３年１０月９日公開の米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３Ａ１号に記載されている方法によって得ることができる。通常は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、その他著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２年、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）２８０〜２８１頁に記載されているような種々の方法によって、核酸を生物サンプルから抽出すことができる。通常、個々の核酸テンプレート分子は、約５塩基から約２０ｋｂまでとすることができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または、一本鎖領域を有する二本鎖（例、ステムおよびループ構造）であればよい。
【００６０】
本明細書に記載の生物サンプルは、洗剤もしくは界面活性剤によって均質化または、断片化される。バッファの洗剤濃度は、約０．０５％〜約１０．０％とすればよいが、洗剤が溶液に溶けるの濃度まで可能である。好ましい実施形態における洗剤濃度は、０．１％〜約２％である。特に非変性質のマイルド洗剤は、サンプルを溶け易くするように作用することができる。洗剤は、イオン性あるいは非イオン性とすればよい。非イオン性洗剤の実施形態としては、以下の例がある。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ系列（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ＸＯＨ，ｘ＝９〜１０，Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００Ｒ,Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４ ｘ＝７〜８ ）のようなトリトン、オクチル・グルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシル・エーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ６３０オクチルフェニル・ポリエチレン・グリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０ポリエチレン・グリコール・ソルビタン・モノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレン・グリコール・ソルビタン・モノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシル・ベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニル・ポリエチレン・グリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレン・グリコールｎ−ドデシル・モノエーテル）、へクサエチレングリコール・モノ−ｎ−テトラデシル・エーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチル・チオグルコシド、ＯＴＧ）、エマルゲン（Ｅｍｕｌｇｅｎ）、およびポリオキシエチレン１０ラウリル・エーテル（Ｃ１２Ｅ１０）。イオン性洗剤（陰イオンもしくは陽イオン）の例には、デオキシコレート、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）がある。さらに、両性イオン試薬も本発明の精製スキームにおいて利用され、この例にはチャップス（Ｃｈａｐｓ）、両性イオン３−１４、および３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネートがある。さらに、尿素が、他の洗剤または界面活性剤の有無とは関係なく加えられてもよい。
【００６１】
溶解あるいは均質化の溶液にはさらに、還元剤のような薬品が含まれてもよい。このような還元剤の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ，ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチル・ホスフィン（ＴＣＥＰ）、あるいは、亜硫酸の塩がある。
【００６２】
核酸ポリメラーゼ
本発明に有用な核酸ポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および、以上の突然変異体もしくは変更型が含まれている。ＤＮＡポリメラーゼおよびその特性については、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、Ｂａｋｅｒ共著、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第二版、１９９１年、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、ニューヨーク州、ニューヨーク市、において詳述されている。本発明に有用な既知のおよび従来のＤＮＡポリメラーゼには、限定的ではないが以下の例がある。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、他著Ｇｅｎｅ、１０８：１，１９９１年、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓ、他著Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６−８，１９９６年、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ共著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：７６６１，１９９１年）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ、ＭｃＧｏｗａｎ共著、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、４７５：３２，１９７７年）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、他著Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ、１９：４１９３，１９９１年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、９０Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴｈｅｒｍｏＳｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、イギリス）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｄｉａｚ、Ｓａｂｉｎｏ共著、Ｂｒａｚ Ｊ. Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９，１９９８年）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ他著Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０，１９７６年）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（タカギ他著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：４５０４，１９９７年）、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ−３、国際公開第０１３２８８７）、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ他著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０，１９９４年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵＩＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（好熱性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａより得られる、Ｄｉａｚ、Ｓａｂｉｎｏ共著、Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９，１９９８年、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴｇｏＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓより得られる、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ、Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ共著、ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＲｅｓ、１１：７５０５，１９８３年）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ他著、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５６：３１１２，１９８１年）、古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎ）、他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９５：１４２５０，１９９８年、アメリカ）。
【００６３】
中温性ポリメラーゼも好熱性ポリメラーゼも対象となる。限定的ではないが、好熱性ＤＮＡポリメラーゼには、サーモシークエナーゼ（登録商標）、９０Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、ストッフェル断片、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、および、これらの突然変異体、変異体および誘導体が含まる。各ポリメラーゼの最も好まれる型は、３’エキソヌクレアーゼ欠陥突然変異体である。
【００６４】
本発明に有用な逆転写酵素には、限定的ではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、およびその他のレトロウイルスからの逆転写酵素が含まれる（Ｌｅｖｉｎ著Ｃｅｌｌ、８８：５〜８、１９９７年、Ｖｅｒｍａ著Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、４７３：１−３８，１９７７年、Ｗｕ他著、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、３：２８９〜３４７、１９７５年参照）。
【００６５】
表面
好ましい実施形態では、核酸テンプレート分子が、基板（本明細書では表面ともよばれる）に付着され、ここで説明される単一分子配列によって分析される。核酸テンプレート分子が表面に付着されると、テンプレート−プライマー・デュープレクスが光学的に個々に分解可能となる。本発明に利用される基板は、二次元もしくは三次元とすることができ、平面（例、ガラス・スライド）を含むことができ、あるいはこのように形成することができる。基板には、ガラス（例、制御細孔ガラス（ＣＰＧ））、石英、プラスチック（例、ポリスチレン（低架橋および高架橋ポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ（メチメタクリレート））、アクリル共重合体、ポリアミド、シリコン、金属（例、アルカンチオレート誘導体化金）、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲル・マトリクス（例、シリカ・ゲル）、ポリアクロレイン、または、複合体が含まれる。
【００６６】
適正な三次元基板には、例えば、球、微粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微小チップ、管（例、毛細管）、マイクロウェル、マイクロ流体デバイス、チャネル、フィルタ、または、その他、核酸定着に適した構造が含まれる。基板には、テンプレート核酸もしくはプライマーの集団を含む領域を有することが可能な平面アレイあるいはマトリクスが含まれる。これらの例には、ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧおよびポリスチレン・スライド、誘導体化磁気スライド、ポリエチレン・グリコールとグラフトしたポリスチレン、その他が含まれる。
【００６７】
基板は、好ましくは、最適の光学処理および核酸付着が可能となるようコーティングされている。さらに、バックグラウンドを削減するように、本発明に利用される基板を処理することも可能である。代表的なコーティングには、エポキシドおよび誘導体化エポキシド（例、オリゴヌクレオチドもしくはストレプタビジンのような結合分子を有する）が含まれる。
【００６８】
核酸分子を基板表面に定着または、固定化させるためには種々の方法を利用することができる。表面との直接結合もしくは間接結合によって固定化を実行することができる。これは共有結合によって結合することができる。Ｊｏｏｓ、他著Ａｎｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４７：９６〜１０１、１９９７年、Ｏｒｏｓｋａｒ、他著Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、４２：１５４７〜１５５５、１９９６年、Ｋｈａｎｄｊｉａｎ著、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｐ、１１：１０７〜１１５、１９８６年参照。好ましい付着は、表面に取り込まれたエポキシドに、テンプレートの末端ヌクレオチドまたはプライマーの５’末端を結合する直接アミン結合である。この結合はまた、非共有結合によっても可能である。例えば、ビオチンストレプタビジン（Ｔａｙｌｏｒ他著、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ、２４：１４４３，１９９１年）ならびにジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン（Ｓｍｉｔｈ、他著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１１２２，１９９２年）は、核酸を表面およびこれに類するものに定着させる一般的なツールである。あるいは、疎水鎖を脂質単分子層もしくは二重層に定着させることによって付着を実行することもできる核酸分子を基板に定着させる他の既知の方法も利用可能である。
【００６９】
検知
利用される標識のタイプに対して適正な任意の検知法を利用することができる。よって、代表的な検知法としては、放射性検知、吸光検知、例えばＵＶ可視吸光検知、発光検知、例えば蛍光または化学発光、が含まれる。例えば、利用される走査法に基づいて、各基板のすべてもしくは一部を同時にあるいは連続して走査することによって、基板上の伸長プライマーを検知することができる。蛍光標識については、フォーダー（Ｆｏｄｏｒ）、他（米国特許番号５，４４５，９３４）およびマシーズ（Ｍａｔｈｉｅｓ）、他（米国特許番号５，０９１，６５２）によって説明されている蛍光顕微鏡装置を利用して、選択された領域が、一つ一つあるいは一行ごとに連続して走査される。単一分子から蛍光物質を感知することが可能なデバイスには、走査トンネル顕微鏡（ｓｉＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）がある。ハイブリダイゼーションのパターンの走査には、Ｙｅｒｓｈｏｖ他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９３：４９１３、１９９６年に説明されているような、適正光学系（Ｐｌｏｅｍ著、Ｔ．Ｇ．Ｍａｓｏｎ編、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ｐｐ．１〜１１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９９３年）が装備されたＣＣＤカメラ（例、モデルＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州、トレントン市）が使われてもよいし、ＴＶモニタリングによって画像化されてもよい。放射性信号についてはホスホイメージャ・デバイスを利用することができる。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ他著、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６，１９９０年、Ｄｒｍａｎａｃ他著、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３：５６６，１９９２年、１９９３年）。画像化装置の他の民間納入業者には、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ウォータタウン市、ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ、Ｇｅｎｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、オンタリオ州、ウォータールー市、ｗｗｗ．ｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．がある。このような検知法は特に、複数の付着テンプレート核酸を同時走査するために利用される。
【００７０】
蛍光標識ヌクレオチドの単一核酸分子への組み込みを検知するには複数の方法を利用することができる。光学セットアップには、近視野走査顕微鏡検査、遠視野共焦顕微鏡検査、広視野落射照明、光散乱、暗視野顕微鏡検査、光変換、単一および／または複数光子励起、スペクトル波長判別、蛍光体識別、エバネセント波照射、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査が含まれる。通常、いくつかの方法には、カメラ装備顕微鏡を利用したレーザ活性蛍光検知が含まれる。適正な光子検知システムには、限定的ではないが、光ダイオードおよび増強ＣＤＤカメラが含まれる。例えば、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）カメラの利用が可能である。表面に近い流体の個々の蛍光染料分子を画像化するためにＩＣＣＤを利用することには多くの長所がある。例えばＩＣＣＤ光学セットアップによって蛍光体の連続画像（動画）を取り込むことが可能である。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態では画像化のためにＴＩＲＦ顕微鏡検査を利用する。このＴＩＲＦ顕微鏡検査は、完全内部反射励起光を利用した既知の方法である。ｗｗｗ．ｎｉｋｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｊｐ／ｅｎｇ／ｐａｇｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｉｒｆ．ａｓｐｘ参照。実施形態によっては、エバネセント波照射および全内部反射蛍光顕微鏡検査を利用して検知が行われる。減衰光照射では、野を例えば表面にセットアップし、蛍光標識核酸分子を画像化することができる。レーザ・ビームが、液体と固体基板（例、ガラス）との間の界面で全反射すると、励起光が極めて短距離で液体に透過する。光学視野は、反射界面で突然、終了するわけではなく、強度が距離によって指数関数的に低下する。この表面電磁気場は、「エバネセント波」と呼ばれ、界面に近接している液体中の蛍光分子を選択的に励起する。界面の薄いエバネセント光学視野によって低バックグラウンドが可能になり、可視波長の高信号対ノイズ比による単一分子検知が容易になる。
【００７２】
エバネセント場は、さらにポリメラーゼ存在下の付着テンプレート−プライマー複合体への蛍光標識ヌクレオチドの組み込みを画像化することが可能である。さらに全内部反射蛍光顕微鏡検査が利用されることによって、単一分子分解能で付着テンプレート−プライマー・デュープレクスおよび／または組み込みヌクレオチドが視覚化される。
【００７３】
分析
上述に大まかに記載されているように、生成される画像スタックから得られた配列結果を、整列および／または編集するには、可能な配列変更（例、エラー、変異、その他による）を考慮した参照表が利用される。本来、本明細書に記載されているようにして得られた配列結果は、一つもしくは二つの塩基エラーを加えたあらゆる可能な基準配列を含む参照表と比較される。
【実施例】
【００７４】
本発明はさらに以下の限定されない実施例によって説明される。これらの実施例は、本発明の代表的な複数のヌクレオチド・アナログの合成（実施例１〜３）、および、核酸配列におけるこれらの利用（実施例４）について説明している。
【００７５】
（実施例１）
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ５と記される以下のヌクレオチド・アナログの合成について説明している。
【００７６】
【化３９】
本実施例では、両方の塩基がウラシルであるが、当業者には当然のことながら、同様の化学作用で他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ５を合成する反応スキームが、図１で説明されており、特に、図１Ａはヌクレオチド・アナログ５を示し、図１Ｂは化合物２（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｃは化合物３（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｄは化合物１および４（アナログ５の合成の中間体）の合成を示し、図１Ｅはヌクレオチド・アナログ５の合成を示している。
【００７７】
（実施例２）
この実施例は、ヌクレオチド・アナログ７であるヌクレオチド・アナログの合成を示している。
【００７８】
【化４０】
この実施例では、両方の塩基がウラシルであるが、当業者は、同様の化学作用を利用して他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ７を合成する反応スキームは、図２に示されている。特に、図２Ａはヌクレオチド・アナログ７を示し、図２Ｂは化合物６（ヌクレオチド・アナログ７の合成の中間体）の合成を示し、図２Ｃはヌクレオチド７の合成段階を示している。
【００７９】
（実施例３）
この実施例ではヌクレオチド・アナログ９であるヌクレオチド・アナログの合成が示されており、ｎは３である。
【００８０】
【化４１】
この実施例では一つの塩基がアデニンで、他の塩基はウラシルである。当然のことながら、当業者であれば、同様の化学作用を利用して他の塩基を含む同様のヌクレオチド・アナログを作ることが可能である。ヌクレオチド・アナログ９を合成する反応スキームが、図３で示されており、特に、図３Ａはヌクレオチド・アナログ９を示し、図３Ｂはヌクレオチド・アナログ９の合成ステップを示している。
【００８１】
（実施例４）
本実施例は、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログを利用したテンプレート核酸の配列法を示している。
【００８２】
バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の７２４９ヌクレオチド・ゲノムは、本発明のアナログおよび方法を利用して配列される。精製された一本鎖ウイルスＭ１３ｍｐ１８ゲノムＤＮＡは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂから得た。Ｍ１３ＤＮＡの約２５μｇを、３７℃で１０分間、０．１ＵのＤＮアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）によって４０〜１００ｂｐの平均断片サイズに消化した。これらの消化ＤＮＡ断片サイズは、プレキャスト変性（ＴＢＥ−Ｕｒｅａ）１０％ポリアクリルアミド・ゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に消化混合物のアリコートを加え、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ）で染色することによって測定された。ＤＮアーゼＩ消化ゲノムＤＮＡを、ＹＭ１０限外ろ過スピン・カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってろ過し、約１０ヌクレオチド未満の小さい消化生成物を除去した。約２０ｐｍｏｌのろ過済みＤＮアーゼＩ消化液を、既知の方法（Ｒ．ロイチョードリ（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ）、Ｒ．ウー（Ｗｕ）共著「ＤＮＡ３’末端へのヌクレオチド末端転移酵素−触媒付加」『酵素学法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ）』６５（１）：４３〜６２，１９８０年）に基づき、末端転移酵素によってポリアデニル化した。平均ｄＡテール長は、５０＋／−５ヌクレオチドであった。次に、末端転移酵素を利用して、Ｃｙ３−ｄＵＴＰにより断片を標識化した。断片を、ジデオキシＴＴＰ（末端転移酵素を利用して付加）によって終端した。次に、生成した断片を再度、ＹＭ１０限外ろ過スピン・カラムによってろ過して遊離ヌクレオチドを除去し、−２０℃でｄｄＨ２Ｏに保存した。
【００８３】
オリゴ付着用にエポキシド被覆ガラスを調製した。Ｅｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュー・ハンプシャー州、セーラムのエポキシド官能化の直径４０ｍｍ＃１．５ガラス・カバー・スリップ（スライド）が調達され、３７℃で１５分間、３×ＳＳＣに液浸して前処理された。次に、既述の５’アミノ化テンプレート断片の５００ｐＭアリコートで、８０ｍＬ、室温で３０分間各スライドを定温放置した。得られたスライドにはポリ（ｄＴ５０）テンプレート断片が、エポキシドとの直接アミン連結によって付着した。次に、スライドを、室温で４時間、リン酸塩（１Ｍ）によって処理し、表面を不活性化させる。さらに、配列に利用されるまでバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８．０）に保存する。
【００８４】
配列の場合は、これらのスライドを、５０μｍ厚ガスケットを利用して改良型ＦＣＳ２フローセル（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、ペンシルベニア州、バトラー）のなかに置く。このフローセルを可動ステージに配置する。この可動ステージは、全内部反射（ＴＩＲ）対物レンズ装備のニコンＴＥ−２０００倒立顕微鏡に対して構築された高性能蛍光画像化システムのパーツである。スライドは、この後１００ｍＭ ＮａＣｌのＨＥＰＥＳバッファによって洗浄され５０℃に平衡化される。ポリ（ｄＴ５０）プライマーのアリコートは、フローセルのなかに配置され、１５分間、スライド上で定温放置する。定温放置後は１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳで、その後はＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌで洗浄される。フローセルの液体は受動真空装置によって吸引する。得られるスライドにはＭ１３テンプレート／オリゴ（ｄＴ）プライマー・デュープレクスが含まれる。配列のためにフローセルの温度を３７℃に下げ、対物レンズによってフローセルを捉える。
【００８５】
それぞれがシアニン−５標識を有する本発明のアナログ（組み込み可能塩基として、シトシン三リン酸塩、グアニジン三リン酸塩、アデニン三リン酸塩、または、ウラシル三リン酸塩を含む四種）は、配列に備えて個別に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、５０μＭのＭｎＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＨＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ＵのＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含むバッファに保存する。配列が以下のように実行される。
【００８６】
最初、初期画像化によって表面上のデュープレクス位置が測定される。Ｍ１３テンプレートに付加されたＣｙ３標識を、５３２ｎｍ放射に合わせたレーザ（Ｖｅｒｄｉ Ｖ−２Ｌａｓｅｒ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、カリフォルニア州、サンタ・クララ）を利用した励起により画像化し、デュープレクス位置を規定する。各スライドについて、この段階で画像化される単一の分離可能蛍光分子だけをカウントする。以下で述べられるような組み込みヌクレオチドの画像化は、６３５ｎｍ放射線レーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を利用したシアニン−５染料の励起によって実行される。図１において示された１００ｎＭ Ｃｙ５ＣＴＰアナログは、フローセルのなかに配置されて２分間、スライドに曝露される。定温放置後、スライドを、１×ＳＳＣ／１５ｍＭＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳ／ｐＨ７．０（「ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ」）のなかで洗浄し(６０μＬで１５回)、この後、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ７．０（「ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ」）のなかで洗浄する（６０μＬで１０回）。次に、３０％アセトニトリルを含む酸素スカベンジャーおよびスカベンジャー・バッファ（ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌを１３４μl、１００ｍＭ ＴｒｏｌｏｘのＭＥＳ溶液２４μＬ、ｐＨ６．１、１００ｎＭ ＤＡＢＣＯのＭＥＳ溶液１０μＬ、ｐＨ６．１、２Ｍグルコースを８μＬ、５０ｍＭのＮａＩを２０μＬ（５０ｍＭ水溶液ストック）、および、グルコース酸化酵素４μＬ）を加える。次に、スライドを、６４７ｎｍのＩｎｏｖａ３０１Ｋレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を利用して０．２秒間画像化し（５００フレーム）、この後、２秒間５３２ｎｍのＶｅｒｄｉＶ−２レーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）によって緑色で画像化しデュープレクス位置を確認する。検知可能な蛍光物質のある位置が記録される。画像化後、各フローセルを、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ(６０μＬ)によって５回ずつ洗浄する。次に、５分間５０ｍＭのＴＣＥＰのフローセルのなかに導入することによって、シアニン−５標識を組み込まれたＣＴＰアナログから開裂し、この後、各フローセルを、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μＬ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μＬ）によって５回ずつ洗浄する。
【００８７】
以上の手順は、１００ｎＭのＣｙ５ｄＡＴＰアナログについて実行し、この後、１００ｎＭのＣｙ５ｄＧＴＰアナログ、最後に５００ｎＭのＣｙｄＵＴＰアナログについて実行する。この手順（ヌクレオチドへの曝露、ポリメラーゼへの曝露、洗浄、スカベンジャー、画像化、洗浄、開裂、洗浄）を、既述のように反復する。ＵＴＰアナログは、２分間ではなく５分間、定温放置する。
【００８８】
このサイクルを所定の回数終えたあと、画像スタック・データ（種々の表面結合デュープレクスから得られた単一分子配列）をＭ１３基準配列に整列させる。この整列アルゴリズムによって既述のように得られた配列が、実際のＭ１３線形配列と整合される。得られた配列をＭ１３に配置するには、０、１あるいは２つのエラーの可能性を考慮しつつ、得られた配列および同じ長さのＭ１３の一部の間の最良の整合に基づいて実行する。得られた０エラーの９−ｍｅｒ（すなわち、Ｍ１３基準配列の９−ｍｅｒと正確に整合している）をすべて、最初にＭ１３と整列する。その後、０あるいは１エラーの１０−、１１−、１２−ｍｅｒを整列する。最終的に、０，１，２エラーの１３−ｍｅｒ以上を整列する。以上が完了すると、ホモポリマー数を含めて配列が知られる。
【００８９】
（実施例５）
本実施例では、本発明の三種のヌクレオチド・アナログについて、ホモポリマー領域での配列時のテンプレート依存型の配列反応における組み込み機能、および、次の塩基（もしくはＮ＋１）の組み込みを阻害する機能をテストした。これらのヌクレオチド・アナログについて、テンプレート依存型の法によるプライマーへの組み込み機能、および、「非ブロック」アナログと同程度の速度でプライマーの３’末端に組み込まれる機能を分析した。さらに、これらのヌクレオチド・アナログについて、組み込まれた後のプライマーへのさらなる塩基付加に対する阻害機能を分析した。その後、ブロック基の除去によって阻害が可逆であるかどうかが判定するためにヌクレオチド・アナログを分析した。
【００９０】
本実施例においてテストされる三種のヌクレオチド・アナログには、ヌクレオチド・アナログ５（実施例１において説明されている）、ヌクレオチド・アナログ１０（以下で示される）、ヌクレオチド・アナログ１１（以下で示される）が含まれている。
【００９１】
ヌクレオチド・アナログ１０を以下に示す。
【００９２】
【化４２】
ヌクレオチド・アナログ１１を以下に示す。
【００９３】
【化４３】
三種の各ヌクレオチド・アナログを、Ｔ１４８テンプレートに曝露した。このテンプレートは、ホモポリマー複製の開始位置の近位においてテンプレートにハイブリダイズされたプライマーを有する、ＡＡＡホモポリマーの反復を含んでいる。各アナログの濃度は、既述の標準組み込み条件下およびＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏーの存在下で１００または５００ｎＭとした。これらの組み込み速度を、１２原子ジスルフィド開裂可能リンカーによってＣｙ５染色と連結された標準ｄＵＴＰアナログ（ｄＵＴＰ−Ｃｙ５と呼ぶ）の組み込みと比較した。この反応の生成物を、毛管電気泳動を利用して分析した。この検査結果を下の表１に示す。
【００９４】
【表１】
表１のように、代表的な各ヌクレオチド・アナログは、ｄＵＴＰ−Ｃｙアナログとほぼ同じ速度で組み込まれたが、第二塩基の組み込み速度はかなり遅かった（７０〜１５０倍遅い）。第三塩基の組み込みは、どのアナログについても検知されなかった。
【００９５】
ＴＣＥＰに曝露してジスルフィド結合を開裂し、ブロック基を開裂すると（アナログ５の左部分（実施例１参照）ならびにアナログ１０および１１の右部分（上記参照））、新しいアナログが、第一塩基付加と同程度の速度で付加された。これらの結果によって、本発明のヌクレオチド・アナログは、テンプレート依存型の配列反応中に組み込まれて、ブロック基の除去以前に第二塩基の後続組み込みを阻害することが可能である、ということがわかる。
【００９６】
参照資料の引用
ここに引用されているあらゆる刊行物、特許、特許出願は、それら全体がそれぞれの個々に表示されている目的に応じて、特に参照資料によって引用されている。
【００９７】
均等論
本発明の特定の実施形態について説明してきたが、上記は、代表的な例であり限定的な例ではない。本明細書を検討することによって本発明の多くの変更が、当業者に明らかになるであろう。本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの考えられる均等物には、下記以外の転では該アナログに対応し該アナログと同様の一般的特性を有し、置換基または成分について一つ以上の単純な変形があり、これによって、対象のヌクレオチド・アナログの特性に悪影響を及ぼさない化合物が含まれる。通常、本明細書に記載のヌクレオチド・アナログの成分は、容易に入手可能な開始材料、試薬、従来の合成法を利用し、さらに、本明細書に記載の一般反応スキームにおいて例示された方法またはそれを変更した方法を利用して調製すればよい。本発明の範囲は、請求項および均等物の全範囲ならびに本明細書およびその変更を参照することにより決まる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｂ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｃ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｄ−Ａ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｄ−Ｂ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図１Ｅ】図１は、本発明の代表的な第一ヌクレオチド・アナログ生成用の反応スキームを示した概略図である。
【図２Ａ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｂ−Ａ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｂ−Ｂ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図２Ｃ】図２は、本発明の代表的な第二ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ａ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ａ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｂ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｃ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【図３Ｂ−Ｄ】図３は、本発明の代表的な第三ヌクレオチド・アナログを生成する反応スキームを示した概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉまたは式ＩＩのヌクレオチド・アナログであって：
【化１】
式中、Ｂ１、Ｂ２はそれぞれ独立して、プリン、ピリミジンおよびこれらのアナログからなる群から選択され、
各発生におけるＲ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｎ３、およびＨからなる群から選択され、
Ｙは、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２および結合からなる群から選択され、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
Ａは、−Ｓ−Ｓ−、エステル、およびアミド基からなる群から選択され、
Ｒ３は、
【化２】
アルキル、および結合からなる群から選択され、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、エーテルおよび結合からなる群から選択され、
Ｒ５は、
【化３】
アルキル、アルケニル、および結合からなる群から選択される。
Ａｒは、アリールであり、
Ｒ６は、
【化４】
からなる群から選択され、
Ｒ７は、アルキルまたは結合であり、
Ｒ８は、Ｓ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＮＲ’からなる群から選択され、
Ｒ９は、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，および−（ＣＨ２）ｍ−からなる群から選択され、
Ｌは、標識であり、
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｚは、それぞれ独立しているＯもしくはＳであり、
ｍは、それぞれ独立している０〜５０の整数であり、
ｎは、それぞれ独立している０〜５０の整数であり、
ｐは、それぞれ独立している０〜５０の整数である、
ヌクレオチド・アナログ
【請求項２】
前記式ＩＩにおいて、
【化５】
で示されている二重結合がｔｒａｎｓ型である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３】
Ｒ６は、
【化６】
ではない請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項４】
Ｒ４はグリコール・エーテルである請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項５】
Ａｒはフェニルまたは芳香酸である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項６】
ｎは１または４である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項７】
Ｒ９は−（ＣＨ２）ｍ−である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項８】
ｎは４であり、ｍは３である請求項７に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項９】
ｍは０、２または３である請求項７に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１０】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨである請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１１】
Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびそれらのアナログからなる群から選択される請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１２】
Ｌは光学検知可能な標識である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１３】
前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項１２のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１４】
前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、Ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項１３のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１５】
前記蛍光標識はＣｙ３またはＣｙ５である請求項１３のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１６】
Ｒ３はアルキルまたは結合であり、ＬはＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６またはＢ２と共有結合している請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１７】
Ｌはアミド結合によってＲ１またはＲ２と共有結合している請求項１６のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１８】
前記アミド結合は−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−である請求項１７のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１９】
Ｌはアミド結合によってＲ５またはＲ６と共有結合している請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２０】
以下で表されるヌクレオチド・アナログであって：
【化７】
式中、Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立してシトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびそれらのアナログからなる群から選択され、
ＰＰＰＯ−は、
【化８】
であり、
Ｚは、それぞれ独立してＯもしくはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２１】
式ＩＩＩによって示されるヌクレオチド・アナログであって：
【化９】
式中、Ｒ１１は、
【化１０】
および
【化１１】
からなる群から選択され、
式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｙ、Ｒ’、Ｚ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、およびｎは請求項１に定義されるとおりである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２２】
Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびこれらのアナログからなる群から選択される請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２３】
Ｌは光学検知可能な標識である請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２４】
前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項２３に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２５】
前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項２４に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２６】
前記蛍光標識はＣｙ３またはＣｙ５である請求項２４に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２７】
Ｒ３がアルキルまたは結合であるとき、ＬはＲ１１と共有結合している請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２８】
以下からなる群から選択されるヌクレオチド・アナログ：
【化１２】
【化１３】
および
【化１４】
式中、各構造において、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ６、およびＬは、請求項１に定義されるとおりであり、ｑは１〜５０の整数であり、ＰＰＰＯ−は、
【化１５】
であり、
Ｚは、それぞれ独立してＯまたはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２９】
Ｌは蛍光標識である請求項２８に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３０】
前記蛍光標識は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項２９に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３１】
式ＩＶまたは式Ｖのヌクレオチド・アナログであって：
【化１６】
【化１７】
式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ１、Ｒ２は、請求項１に定義したとおりであり、
Ｒ１２は切断可能なリンカーを含む部分を示し、
Ｒ６は、
【化１８】
ではないという条件を有する任意の部分である、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項３２】
Ｒ１２は、Ｂ１と結合したアルキニル部分を含む請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３３】
Ｒ１２は、Ｂ２と結合したアルキニル部分を含む請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３４】
Ｒ６は、
【化１９】
【化２０】
からなる群から選択される請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログであって：
式中、ＸはＨまたはハロゲンであり、
Ｚはそれぞれ独立してＯまたはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項３５】
核酸テンプレートの配列を決定するステップであって、
（ａ）ポリメラーゼによってヌクレオチド・アナログをプライマーに付加することが可能であるという条件のもとに、３’−ＯＨ末端を有する前記プライマーにハイブリダイズされた核酸テンプレートを、（ｉ）前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒する前記ポリメラーゼ、および（ｉｉ）請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ、
（ｃ）前記ヌクレオチド・アナログから標識を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ
を含む方法。
【請求項３６】
核酸テンプレートの配列を決定する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼによって標識ヌクレオチド・アナログが第一の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加される一方、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログが第二の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加されることを防ぐという条件のもとに、３’末端を有するプライマーにハイブリダイズされる第一および第二の連続する塩基を含む前記核酸テンプレートを、（ｉ）前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼ、および（ｉｉ）リンカーによってブロック基に共有結合されている第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む前記標識ヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ
（ｃ）前記ブロック・ヌクレオチドまたは前記ブロック・ヌクレオチド・アナログを除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ、
を含む方法。
【請求項３７】
前記ブロック基は第二のヌクレオチドもしくは第二ヌクレオチド・アナログである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカーは、前記第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログの塩基に、および前記第二のヌクレオチドまたは第二ヌクレオチド・アナログの塩基に共有結合される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカーは約４〜約５０原子を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンカーは約１５〜約５０原子を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記リンカーはｔｒａｎｓ型の二重結合を含むアルキニル基またはアルケニル基によって、前記第一のヌクレオチドまたは前記第一ヌクレオチド・アナログに共有結合される請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ａ）において、前記標識ヌクレオチド・アナログは請求項１、２０、２１、２８または３１に記載のヌクレオチド・アナログを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）において、前記標識は前記ブロック基と同時に除去される請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識は光学検知可能な標識である請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記条件は単一の分子を個々に検知して配列するのに充分である請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
テンプレートの少なくとも一部分に対して相補的なプライマーと、ポリメラーゼとを用いてホモポリマー部位を含む核酸テンプレートの配列を決定することの改良方法であって、
前記改良は、前記ポリメラーゼによって単一標識ヌクレオチド・アナログのみが、前記ホモポリマー部位の一つの塩基に対して相補的な位置にある前記プライマーから伸長している鎖に付加される条件において、リンカーによってブロック基に共有結合される第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログの存在下で、配列反応の各サイクルを実施するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
前記ブロック基はヌクレオチドもしくはヌクレオチド・アナログである請求項４６に記載の方法。
【請求項１】
式Ｉまたは式ＩＩのヌクレオチド・アナログであって：
【化１】
式中、Ｂ１、Ｂ２はそれぞれ独立して、プリン、ピリミジンおよびこれらのアナログからなる群から選択され、
各発生におけるＲ１、Ｒ２は、ＯＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｎ３、およびＨからなる群から選択され、
Ｙは、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，ＣＨ２および結合からなる群から選択され、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
Ａは、−Ｓ−Ｓ−、エステル、およびアミド基からなる群から選択され、
Ｒ３は、
【化２】
アルキル、および結合からなる群から選択され、
Ｒ４は、アルキル、アルケニル、アルキニル、エーテルおよび結合からなる群から選択され、
Ｒ５は、
【化３】
アルキル、アルケニル、および結合からなる群から選択される。
Ａｒは、アリールであり、
Ｒ６は、
【化４】
からなる群から選択され、
Ｒ７は、アルキルまたは結合であり、
Ｒ８は、Ｓ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ＮＲ’からなる群から選択され、
Ｒ９は、ＮＲ’，Ｏ，Ｓ，および−（ＣＨ２）ｍ−からなる群から選択され、
Ｌは、標識であり、
Ｘは、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｚは、それぞれ独立しているＯもしくはＳであり、
ｍは、それぞれ独立している０〜５０の整数であり、
ｎは、それぞれ独立している０〜５０の整数であり、
ｐは、それぞれ独立している０〜５０の整数である、
ヌクレオチド・アナログ
【請求項２】
前記式ＩＩにおいて、
【化５】
で示されている二重結合がｔｒａｎｓ型である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３】
Ｒ６は、
【化６】
ではない請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項４】
Ｒ４はグリコール・エーテルである請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項５】
Ａｒはフェニルまたは芳香酸である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項６】
ｎは１または４である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項７】
Ｒ９は−（ＣＨ２）ｍ−である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項８】
ｎは４であり、ｍは３である請求項７に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項９】
ｍは０、２または３である請求項７に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１０】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨである請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１１】
Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびそれらのアナログからなる群から選択される請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１２】
Ｌは光学検知可能な標識である請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１３】
前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項１２のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１４】
前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、Ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項１３のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１５】
前記蛍光標識はＣｙ３またはＣｙ５である請求項１３のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１６】
Ｒ３はアルキルまたは結合であり、ＬはＲ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６またはＢ２と共有結合している請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１７】
Ｌはアミド結合によってＲ１またはＲ２と共有結合している請求項１６のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１８】
前記アミド結合は−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−である請求項１７のヌクレオチド・アナログ。
【請求項１９】
Ｌはアミド結合によってＲ５またはＲ６と共有結合している請求項１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２０】
以下で表されるヌクレオチド・アナログであって：
【化７】
式中、Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立してシトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびそれらのアナログからなる群から選択され、
ＰＰＰＯ−は、
【化８】
であり、
Ｚは、それぞれ独立してＯもしくはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２１】
式ＩＩＩによって示されるヌクレオチド・アナログであって：
【化９】
式中、Ｒ１１は、
【化１０】
および
【化１１】
からなる群から選択され、
式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｙ、Ｒ’、Ｚ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、ｍ、およびｎは請求項１に定義されるとおりである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２２】
Ｂ１およびＢ２はそれぞれ独立して、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン、およびこれらのアナログからなる群から選択される請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２３】
Ｌは光学検知可能な標識である請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２４】
前記光学検知可能な標識は蛍光標識である請求項２３に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２５】
前記光学検知可能な標識は、シアニン、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項２４に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２６】
前記蛍光標識はＣｙ３またはＣｙ５である請求項２４に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２７】
Ｒ３がアルキルまたは結合であるとき、ＬはＲ１１と共有結合している請求項２１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項２８】
以下からなる群から選択されるヌクレオチド・アナログ：
【化１２】
【化１３】
および
【化１４】
式中、各構造において、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ６、およびＬは、請求項１に定義されるとおりであり、ｑは１〜５０の整数であり、ＰＰＰＯ−は、
【化１５】
であり、
Ｚは、それぞれ独立してＯまたはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項２９】
Ｌは蛍光標識である請求項２８に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３０】
前記蛍光標識は、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ローダミン、フルオロセイン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ａｌｅｘａおよび共役マルチ染料からなる群から選択される請求項２９に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３１】
式ＩＶまたは式Ｖのヌクレオチド・アナログであって：
【化１６】
【化１７】
式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｒ１、Ｒ２は、請求項１に定義したとおりであり、
Ｒ１２は切断可能なリンカーを含む部分を示し、
Ｒ６は、
【化１８】
ではないという条件を有する任意の部分である、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項３２】
Ｒ１２は、Ｂ１と結合したアルキニル部分を含む請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３３】
Ｒ１２は、Ｂ２と結合したアルキニル部分を含む請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログ。
【請求項３４】
Ｒ６は、
【化１９】
【化２０】
からなる群から選択される請求項３１に記載のヌクレオチド・アナログであって：
式中、ＸはＨまたはハロゲンであり、
Ｚはそれぞれ独立してＯまたはＳである、ヌクレオチド・アナログ。
【請求項３５】
核酸テンプレートの配列を決定するステップであって、
（ａ）ポリメラーゼによってヌクレオチド・アナログをプライマーに付加することが可能であるという条件のもとに、３’−ＯＨ末端を有する前記プライマーにハイブリダイズされた核酸テンプレートを、（ｉ）前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒する前記ポリメラーゼ、および（ｉｉ）請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ、
（ｃ）前記ヌクレオチド・アナログから標識を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ
を含む方法。
【請求項３６】
核酸テンプレートの配列を決定する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼによって標識ヌクレオチド・アナログが第一の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加される一方、別のヌクレオチドまたはヌクレオチド・アナログが第二の塩基に対して相補的な位置にあるプライマーに付加されることを防ぐという条件のもとに、３’末端を有するプライマーにハイブリダイズされる第一および第二の連続する塩基を含む前記核酸テンプレートを、（ｉ）前記プライマーに対するヌクレオチド付加を触媒するポリメラーゼ、および（ｉｉ）リンカーによってブロック基に共有結合されている第一ヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む前記標識ヌクレオチド・アナログに曝露するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において前記プライマーに付加された前記ヌクレオチド・アナログを検知するステップ
（ｃ）前記ブロック・ヌクレオチドまたは前記ブロック・ヌクレオチド・アナログを除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を反復して前記テンプレートの配列を決定するステップ、
を含む方法。
【請求項３７】
前記ブロック基は第二のヌクレオチドもしくは第二ヌクレオチド・アナログである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカーは、前記第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログの塩基に、および前記第二のヌクレオチドまたは第二ヌクレオチド・アナログの塩基に共有結合される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカーは約４〜約５０原子を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンカーは約１５〜約５０原子を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記リンカーはｔｒａｎｓ型の二重結合を含むアルキニル基またはアルケニル基によって、前記第一のヌクレオチドまたは前記第一ヌクレオチド・アナログに共有結合される請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ａ）において、前記標識ヌクレオチド・アナログは請求項１、２０、２１、２８または３１に記載のヌクレオチド・アナログを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）において、前記標識は前記ブロック基と同時に除去される請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識は光学検知可能な標識である請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記条件は単一の分子を個々に検知して配列するのに充分である請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
テンプレートの少なくとも一部分に対して相補的なプライマーと、ポリメラーゼとを用いてホモポリマー部位を含む核酸テンプレートの配列を決定することの改良方法であって、
前記改良は、前記ポリメラーゼによって単一標識ヌクレオチド・アナログのみが、前記ホモポリマー部位の一つの塩基に対して相補的な位置にある前記プライマーから伸長している鎖に付加される条件において、リンカーによってブロック基に共有結合される第一のヌクレオチドまたは第一ヌクレオチド・アナログを含む標識ヌクレオチド・アナログの存在下で、配列反応の各サイクルを実施するステップ
を含む方法。
【請求項４７】
前記ブロック基はヌクレオチドもしくはヌクレオチド・アナログである請求項４６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ−Ａ】
【図１Ｄ−Ｂ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ−Ａ】
【図２Ｂ−Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−Ａ】
【図３Ｂ−Ｂ】
【図３Ｂ−Ｃ】
【図３Ｂ−Ｄ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ−Ａ】
【図１Ｄ−Ｂ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ−Ａ】
【図２Ｂ−Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−Ａ】
【図３Ｂ−Ｂ】
【図３Ｂ−Ｃ】
【図３Ｂ−Ｄ】
【公表番号】特表２００９−５１６７４９（Ｐ２００９−５１６７４９Ａ）
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４２４４８（Ｐ２００８−５４２４４８）
【出願日】平成１８年１１月２２日（２００６．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５２７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６２１６０
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（５０８１５３８８８）ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２２日（２００６．１１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５２７６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６２１６０
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（５０８１５３８８８）ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション (3)
【Ｆターム（参考）】
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