検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット
【課題】被検出物質の量を検出する検出方法において、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することができ、かつ高いＳ／Ｎ比を実現する。
【解決手段】センサチップ１０上のセンサ部１４に試料Ｓを供給し、励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを発生せしめ、蛍光標識Ｆを励起し、この励起に起因して生じる光Ｌｆの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、センサ部１４上をブロッキングするための、蛍光物質Ｆに性質が類似するブロッキング物質Ｒと、複数の蛍光色素分子ｆを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質（蛍光標識）Ｆとを用いる。そして、ブロッキング物質Ｒによって、蛍光物質Ｆのセンサ部１４への非特異的な吸着を防止する。
【解決手段】センサチップ１０上のセンサ部１４に試料Ｓを供給し、励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを発生せしめ、蛍光標識Ｆを励起し、この励起に起因して生じる光Ｌｆの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、センサ部１４上をブロッキングするための、蛍光物質Ｆに性質が類似するブロッキング物質Ｒと、複数の蛍光色素分子ｆを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質（蛍光標識）Ｆとを用いる。そして、ブロッキング物質Ｒによって、蛍光物質Ｆのセンサ部１４への非特異的な吸着を防止する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
上記蛍光法において、試料を流しながら特定の被検出物質のみを効率よく検出できる等の理由から、以下に示す２つの方法により被検出物質をセンサ部表面に固定し、その後蛍光検出を行う手法が一般的である。このような手法の１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原を特異的に結合させ、次いで、蛍光標識が付与されかつ抗原と特異的に結合する２次抗体を、さらに上記抗原に結合させることにより、１次抗体―抗原―２次抗体という結合状態を形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂サンドイッチ法である。また、もう１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原と蛍光標識が付与された２次抗体（前述の２次抗体と異なり、１次抗体と特異的に結合する）とを、競合的に１次抗体と結合させ、競合的に結合した２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂競合法である。
【０００４】
また、蛍光検出においてＳ／Ｎ比を向上できる等の理由から、上記のような方法によって間接的にセンサ部に固定された蛍光標識を、エバネッセント光により励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、励起光をセンサ部裏面から入射し、センサ部表面に染み出すエバネッセント光により蛍光標識を励起して、その蛍光標識から生じる蛍光を検出するものである。
【０００５】
一方、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるためプラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が、特許文献１、非特許文献１などに提案されている。この表面プラズモン増強蛍光法は、センサ部に金属層を設け、この金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎ比を向上させるものである。
【０００６】
また、エバネッセント蛍光法において、表面プラズモン増強蛍光法と同様に、センサ部の電場を増強する効果を有する方法として、光導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、センサ部に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、この光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、上記に示した蛍光法のように蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)を検出する方法が提案されている。
【０００８】
以上のように、バイオ測定等においては、被検出物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、この蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する種々の方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、表面プラズモン共鳴や光導波モードによる電場増強の効果は、金属層や光導波層表面から離れるに従って急激に減衰するため、この表面から蛍光標識までの距離が僅かに変化するだけで、信号に差が生じ、信号のばらつきが生じてしまうという問題がある。
【００１０】
例えば、表面プラズモン共鳴による電場増強効果による蛍光を検出する装置のセンサ部近傍の模式図を図１９に示す。プリズム（基板）１０１の表面に金膜１０２が設けられており、この金膜１０２上に１次抗体Ｂ１が固定されている。サンドイッチアッセイを行う場合、前述のように、１次抗体Ｂ１−抗原Ａ−標識２次抗体ＢＦの結合状態を形成する。ここで、標識２次抗体ＢＦは、蛍光標識（ここでは、蛍光色素分子ｆ）が付与された２次抗体である。そして、プリズム１０１と金膜１０２との界面に全反射角度以上の角度で励起光を入射することにより、金膜表面に表面プラズモンを励起して金膜表面の電場を増強する。この結果、蛍光標識ｆは、増強された電場において励起され、蛍光を発する。
【００１１】
図１９中のグラフは、電場強度のセンサ部表面（金膜表面）からの距離依存性を示している。グラフに示すように、電場強度は表面から離れるにつれ急激に減衰する。このとき、センサ部表面から標識２次抗体ＢＦの蛍光標識ｆまでの距離は、最大で５０ｎｍ程度も離れることがあり、このような場合には、蛍光強度は３０％以上減衰してしまう。また、１次抗体Ｂ１は、常にセンサ部表面に直立に固定されるものではなく、液の流れや立体障害等により表面に沿って倒れる場合もある。したがって、これに応じて蛍光標識ｆの表面からの距離にばらつきが生じ、このばらつきが信号強度のばらつきに繋がる。
【００１２】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することができ、かつ高いＳ／Ｎ比を実現することが可能な、蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する検出方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は上記検出方法に用いられる検出用試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明による検出方法は、
誘電体プレートの一面に、この誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
センサ部に試料を接触させることにより、この試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識とこの蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、
センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
増強した光電場により、蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する検出方法において、
蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用い、
センサ部に対する蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により蛍光標識結合物質がセンサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いることを特徴とするものである。
【００１５】
ここで、「金属層を含む積層構造」とは、金属層を含み少なくとも１以上の層からなる構造を意味するものとする。つまり、上記積層構造は、金属層のみでもよい。なお、ここで言う「層」とは、必ずしも一面を覆うものである必要はなく、例えば、微小開孔を有するものや粗密のあるものであってもよい。
【００１６】
「結合物質」とは、ある特定の対象物質と特異的に結合する物質を意味するものとする。例えば、特定の対象物質として抗原を考える場合には、結合物質としてこの抗原と特異的に結合する抗体が挙げられる。そして、上記の場合において、抗原と競合して上記抗体と特異的に結合する別の抗体も結合物質である。
【００１７】
「蛍光標識結合物質」とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する、蛍光標識によって標識された結合物質を意味するものとする。すなわち、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識結合物質は、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質と、この第２の結合物質を標識する蛍光標識とから構成される。これにより、第１の結合物質−被検出物質−第２の結合物質のサンドイッチ構造が作られ、蛍光標識結合物質がセンサ部上に結合する。ここで、被検出物質の第１の結合物質に対する結合部位と第２の結合物質に対する結合部位とは異なる。一方、競合法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識結合物質は、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この第３の結合物質を標識する蛍光標識とから構成される。これにより、第１の結合物質−第３の結合物質の結合が作られ、蛍光標識結合物質がセンサ部上に結合する。
【００１８】
「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場を意味するものとする。
【００１９】
「増強した光電場」を発生せしめるとは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものとする。なお、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴の励起による増強であってもよいし、光導波モードの励起による増強であってもよい。
【００２０】
蛍光標識の「励起に起因して生じる光」とは、蛍光標識が励起することにより直接的または間接的に生じる光であって、その光の発生量と励起した蛍光標識の数量との間に相関性を有するものを意味するものとする。
【００２１】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無の検出を含み、定性的な量のみならず、定量的な量を検出することも意味するものとする。
【００２２】
センサ部に対して有する「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性」とは、蛍光標識結合物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、センサ部上の任意の場所に蛍光標識結合物質が吸着しうる性質を意味するものとする。ここで、「相互作用」とは、例えば水素結合、静電気力や親疎水性等による作用である。
【００２３】
蛍光標識結合物質を構成する「結合物質の特異的結合性」とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、結合物質（蛍光標識結合物質）がセンサ部上に特異的に結合しうる性質を意味するものとする。すなわち、結合物質の特異的結合性は、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質の特異的結合性を意味し、一方競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質の特異的結合性を意味するものである。
【００２４】
ブロッキング物質の「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性」とは、ブロッキング物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、蛍光標識結合物質が吸着しうるセンサ部上の場所と同一または近傍の場所にブロッキング物質が吸着しうる性質を意味するものとする。すなわち、ブロッキング物質の非特異的吸着性が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等であるとは、それぞれの物質が吸着するセンサ部上の「場所」が同一となる、または近傍に位置することを意味するものである。
【００２５】
蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は、１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００２６】
さらに、本発明に係る検出方法において、ブロッキング物質は、少なくとも表面が透光材料と同等な材料により構成されている第２の粒子を有するものであることが好ましい。ここで、「同等な材料」とは、透光材料と同一の材料、またはブロッキング物質が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有する範囲で、分子構造、側鎖、官能基および帯電状態等の観点から類似する材料を意味するものとする。この場合、ブロッキング物質は第２の粒子の表面に表面修飾されかつ上記特異的結合性を有さない修飾物質を有するものであることが好ましい。また、第２の粒子は第１の粒子の粒経よりも小さい粒径を有するものであることが好ましく、この場合ブロッキング物質と蛍光標識結合物質とを同時にセンサ部上に流下することが好ましい。
【００２７】
そして、第２の粒子は、第２の粒子内に、第１の蛍光色素分子が発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものであることが好ましく、或いは、第２の粒子は、第２の粒子内に、蛍光を発する物質を含まないものであることが好ましい。
【００２８】
さらに、「蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を検出するものであってもよいし、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光を検出するものであってもよい。具体的には、以下の方法（１）〜（４）が挙げられる。
（１）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（２）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
（３）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（４）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
【００２９】
なお、（１）および（２）において、プラズモンの励起は、金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度で励起光を入射し、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよい。一方、金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体、あるいは励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、プラズモンの励起は、励起光の照射により金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。また、プラズモンの励起は、金属膜の微小開口を利用したものであってもよい。
【００３０】
さらに、本発明に係る検出用試料セルは、上記に記載の検出方法においてセンサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつセンサ部の表面にブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであることを特徴とするものである。
【００３１】
そして、本発明に係る検出用試料セルにおいて、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定されているものを備えることが好ましい。
【００３２】
また、センサ部より上流側の流路内に配置された蛍光標識結合物質を備えることが好ましい。
【００３３】
そして、積層構造は、光導波層を備えることが好ましい。
【００３４】
なお、本発明に係る検出用試料セルは、上記の蛍光標識結合物質が第２の結合物質とこれを標識する蛍光標識とからなる場合には、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、一方第３の結合物質とこれを標識する蛍光標識とからなる場合には、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３５】
さらに、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつセンサ部の表面にブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３６】
なお、本発明に係る検出用キットは、標識用溶液に含まれる蛍光標識結合物質が、第２の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合にはサンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、第３の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３７】
或いは、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質を含む標識用溶液、および
標識用溶液と同時もしくは標識用溶液の流下前に流路内に流下される、ブロッキング物質を含むブロッキング用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３８】
或いは、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質とブロッキング物質とを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３９】
そして、本発明に係る検出用キットにおいて、積層構造は、金属層上に光導波層を備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明に係る検出方法では、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出方法では、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【００４１】
また、本発明の検出用試料セルあるいは検出用キットを用いれば、本発明の検出方法を容易に実施することができ、増強された電場を有効に利用し、信号強度のばらつきを抑制し、かつ高いＳ／Ｎ比をもって被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００４３】
「検出方法および検出装置」
＜第１の実施形態＞
本発明に係る検出方法は、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１の一面に金属層１２を含むセンサ部１４であって、ブロッキング物質（図示略）によってブロッキング処理を施されたセンサ部１４を有してなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを該センサ部１４上に結合させ、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射し、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上の光電場を増強させ、該増強された光電場Ｄ内における、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識である蛍光物質Ｆの励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法である。
【００４４】
本検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に金属層１２が設けられてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用いる。
【００４５】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属層１２として金属膜が成膜されたものである。誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより好ましい。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることができる。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。なお、「主成分」とは、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００４６】
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質である。蛍光標識結合物質ＢＦは、図１に示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と蛍光標識とから構成されるものである。また、蛍光標識結合物質ＢＦは、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光標識とから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０としてセンサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定されてなるものを用いた場合、サンドイッチ法における蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この第２の結合物質Ｂ２を標識する蛍光標識Ｆとからなるものである。一方同様の場合、競合法における蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと競合して第１の結合物質Ｂ１と特異的に結合する第３の結合物質と、この第３の結合物質を標識する蛍光標識とからなるものである。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、蛍光標識結合物質として２次抗体を標識した所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００４７】
また、蛍光標識は、図１の一部に拡大して示すように、複数の第１の蛍光色素分子ｆを、該複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆである。蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
【００４８】
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％Ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％Ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、第１の蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
【００４９】
以上の工程により、第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより第１の蛍光色素分子ｆを内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順でポリスチレン粒子に第１の蛍光色素分子を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径は、ポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００５０】
蛍光物質Ｆは、複数の第１の蛍光色素分子ｆを内包するものであるため、従来の蛍光色素分子ｆ単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。また、蛍光物質Ｆは、拡散時間の点から粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましい。また、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などが挙げられるが、第１の蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００５１】
ブロッキング物質Ｒは、蛍光標識結合物質ＢＦとセンサ部との間に生じる相互作用によって、センサ部上の任意の場所に蛍光標識結合物質が吸着することを防止するためのブロッキング剤である。ブロッキング物質は、上記第１の蛍光色素分子を含まず、蛍光標識結合物質を構成する結合物質の特異的結合性を有さず、かつ蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するものである。ここで、蛍光標識結合物質を構成する結合物質の特異的結合性とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、結合物質（蛍光標識結合物質）がセンサ部上に特異的に結合しうる性質を意味するものとする。すなわち、結合物質の特異的結合性は、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質の特異的結合性を意味し、一方競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質の特異的結合性を意味するものである。また、ブロッキング物質の「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性」とは、ブロッキング物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、蛍光標識結合物質が吸着しうるセンサ部上の場所と同一または近傍の場所にブロッキング物質が吸着しうる性質を意味するものとする。すなわち、ブロッキング物質の非特異的吸着性が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等であるとは、それぞれの物質が吸着するセンサ部上の「場所」が同一となる、または近傍に位置することを意味するものである。
【００５２】
標識物の付いた生体物質のセンサ部への非特異的な吸着に起因するノイズは、バイオ測定法において検出限界を左右する大きな問題である。この問題に対して従来は、生体物質（核酸、ビオチン、ＢＳＡ、カゼイン等）や生体物質に類似した物質（親水性ポリマー等）をブロッキング剤としてブロッキング処理することにより、上記のような非特異的な吸着を防止している。この方法は、標識物が生体物質（被検出物質や結合物質等）に比して略同じ大きさである場合には、一定の効果を奏する。しかしながら、本発明に係る検出方法では、蛍光標識として生体物質に比して１０倍以上の大きさを有する蛍光物質Ｆを用いている。図２Ａは、蛍光物質Ｆと生体物質との大小関係を示した概略図である。図２Ａに示すように、生体物質はせいぜい１０ｎｍ程度であるのに対し、第１の粒子１６は例えば１００〜５００ｎｍである。このように、蛍光物質Ｆが生体物質よりも格段に大きい場合、蛍光物質Ｆの非特異的吸着性においては、結合物質Ｂ２とセンサ部１４との相互作用よりも第１の粒子１６とセンサ部１４との相互作用が支配的となる。この場合、図３Ａに示すように、生体物質等のブロッキング剤ｒを用いてブロッキング処理するだけでは、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着を防止することは困難である（図中のＢＦ’は、非特異的に吸着した蛍光標識結合物質を示す。）。
【００５３】
そこで本実施形態に係るブロッキング物質Ｒは、本実施形態では図２Ｂに示すように、第２の粒子１６’とこの第２の粒子１６’を修飾する修飾物質Ｂ２’とから構成される。
【００５４】
第２の粒子１６’は、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を実現するため、蛍光物質Ｆの第１の粒子１６を構成する透光材料と同等の材料によって構成されることが好ましい。ここで、「同等な材料」とは、透光材料と同一の材料、またはブロッキング物質が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有する範囲で、分子構造、側鎖、官能基および帯電状態等の観点から類似する材料を意味するものとする。上記を踏まえ、第２の粒子１６’の材料としては、ポリスチレンやポリ乳酸、アクリル、ポリエチレンイミン、ＳｉＯ２などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、第２の粒子１６’の粒径は、蛍光標識結合物質ＢＦよりも移動・吸着速度を高めるため、第１の粒子１６よりも小さいことが好ましい。こうすることにより、蛍光標識結合物質ＢＦとブロッキング物質Ｒとをセンサ部１４上に同時に供給しても、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着を防止することができる。
【００５６】
そして、図２Ｂには第２の粒子１６’が内部に他の物質として何も含まない構成の場合について示しているが、第２の粒子１６’は、第１の蛍光色素分子ｆが発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものとしてもよい。このようにすれば、ブロッキング物質Ｒからの蛍光信号と蛍光物質Ｆからの蛍光信号とを分離して検出することができる。したがって、ブロッキング物質Ｒからの蛍光信号をデータ補正用のリファレンス信号として、同時に検出する等の測定も行うことができる。
【００５７】
修飾物質Ｂ２’は、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を実現するため、例えば蛍光標識結合物質ＢＦを構成する結合物質とは認識抗原が異なる抗体や電荷を付与する官能基等である。ただし、修飾物質Ｂ２’は必ずしも必須のものではない。
【００５８】
ブロッキング処理は、図３Ｂに示すように、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着を防止するために、蛍光標識結合物質ＢＦが非特異的に吸着しうる場所に、ブロッキング剤（生体物質等のブロッキング剤ｒ、或いはブロッキング物質Ｒ）を供給し吸着させる処理である。通常ブロッキング物質Ｒの供給は、蛍光標識結合物質ＢＦの供給の前に行うことが好ましい。ただし、第２の粒子１６’の粒径が第１の粒子の粒径よりも小さい場合には、蛍光標識結合物質ＢＦよりもブロッキング物質Ｒの方が移動・吸着速度が高いため、ブロッキング物質Ｒと蛍光標識結合物質ＢＦとを同時に供給しても構わない。なお、予めブロッキング物質Ｒによりブロッキング処理が施されたセンサチップ１０を用いてもよい。
【００５９】
また、本発明の検出装置は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１９と、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射により生じる、被検出物質Ａに応じた量の光を検出する光検出手段３０とを備えている。
【００６０】
本発明は、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、その増強した光電場において蛍光標識が励起されることによって生じる光を検出するものである。しかしながら、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を検出してもよいし、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光を検出してもよい。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。なお、本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【００６１】
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料Ｓを保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部１３を備えない態様であってもよい。
【００６２】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面で励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
【００６３】
光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
【００６４】
収容部１９は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップのセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出器３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１９に対しセンサチップ１０は、図中矢印Ｘ方向に出し入れすることができる。
【００６５】
以下、本実施形態における検出方法および検出装置の作用を説明する。
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００６６】
センサチップ１０として、センサ部１４である金属膜１２上に抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾され、その後金属膜１２に対して上記のブロッキング物質Ｒによるブロッキング処理が施されたものを用意する。
【００６７】
まず、試料保持部１３中に検査対象である試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と、上記の蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と、蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２とは、抗原Ａに対してそれぞれ別の結合部位（エピトープ）に結合するものを用いる。試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、サンドイッチが形成される。その後、サンドイッチが形成されなかった結合物と未反応の蛍光標識結合物質ＢＦとを分離するため、バッファ溶液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
【００６８】
以上の工程はセンサチップ１０を検出装置１の収容部１９にセットする前に行ってもよいし、セット後に行ってもよい。また、被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光物質を添加しておいてもよい。
【００６９】
本実施形態に係る検出方法では、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。すなわち、この蛍光物質Ｆを用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子ｆのまとまりとして被検出物質Ａを標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出方法では、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【００７０】
さらに、本実施形態のように、センサ部１４の表面に金属層１２を有している場合には、この金属層１２による第１の蛍光色素分子の金属消光の影響が強くなるため、金属層１２と第１の蛍光色素分子との距離を精密に制御する必要がある。金属消光の影響の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と第１の蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが好ましい。このような制御は、一般的にはポリマー膜、ＳｉＯ２膜、ＳＡＭ膜もしくはＣＭＤ膜のようなバリア層を金属層上に設けることにより行われているが、面倒かつ煩雑であり実用にはあまり向いていない。しかしながら、本発明において、蛍光物質が、第１の蛍光色素分子を充分多く含有する場合には、金属層１２上に金属消光防止のための膜を設けなくても、必然的に金属層１２と多くの第１の蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。これにより従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
【００７１】
＜第１の実施形態の設計変更例＞
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、例えば界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズムとプリズム上の金属膜との界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の溶媒の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００７２】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図４を参照して説明する。図４は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および検出装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。なお、以下においては、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００７３】
図４に示す蛍光検出装置２は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
【００７４】
センサチップ１０’は、誘電体プレート１１上に設けられかつブロッキング物質（図示略）によってブロッキング処理を施された金属層１２’として、励起光の照射を受けて所謂局在プラズモンを生じる、金属微細構造体或いは複数の金属ナノロッドを備えている。ここで、金属微細構造体は、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有するものである。一方、金属ナノロッドは、励起光の波長よりも小さいサイズ有するものである。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
【００７５】
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
【００７６】
センサチップ１０’の具体例を図５Ａ〜Ｃに斜視図で示し説明する。なお、以下で説明されるセンサチップにおいて、ブロッキング物質によるブロッキング処理についての記載を便宜上省略しているが、これらのセンサチップにおいてもブロッキング処理が施される。
【００７７】
図５Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００７８】
図５Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００７９】
図５Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。
【００８０】
図５Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００８１】
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００８２】
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
【００８３】
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００８４】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００８５】
さらに、本実施形態に係る検出方法では、励起光の照射を受けて所謂局在プラズモンを生じる、金属微細構造体或いは複数の金属ナノロッドを備えている。このような場合、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はない。したがって、簡易的な光学系によって低コストの検出方法を行うことが可能となる。
【００８６】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図６を参照して説明する。図６は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
【００８７】
図６に示す放射光検出装置３は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置３においては、光検出器３０が、蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように配置されている。
【００８８】
検出装置３を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００８９】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【００９０】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９１】
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【００９２】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。
【００９３】
図７に示す検出装置４の構成は、第１の実施形態の検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、電場増強のメカニズムが異なる。
【００９４】
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。そして、この光導波層１２ｂ上に、ブロッキング物質（図示略）によるブロッキング処理が施されている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【００９５】
蛍光検出装置４を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上の電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９６】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９７】
さらに、光導波モードの励起により生じる電界分布は、通常の表面プラズモン蛍光法により生じる電界分布と比較して表面からの距離に伴う電界減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として複数の第１の蛍光色素分子を内包する径の大きな蛍光物質を用いた場合、通常の表面プラズモン蛍光法による電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
【００９８】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
【００９９】
図８に示す本実施形態の検出装置５は、第３の実施形態の検出装置３と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
【０１００】
検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上の電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０”の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【０１０１】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０２】
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０３】
さらに、光導波モードの励起による電場増強を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
【０１０４】
（第１から５の実施形態における設計変更例）
なお、第１から第５の実施形態においては、蛍光標識として、図９に示すように、さらに、透光材料１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属被膜Ｍｃが設けられたものを用いてもよい。金属被膜Ｍｃは、透光材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜Ｍｃの材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。この場合、ブロッキング物質についても同様の金属被膜を設けることが好ましい。
【０１０５】
蛍光物質の表面に金属被膜Ｍｃを備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光物質Ｆの金属被膜Ｍｃのウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【０１０６】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により消光防止性蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【０１０７】
「検出用試料セル」
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
＜第１の実施形態の検出用試料セル＞
図１０Ａは、第１の実施形態の検出用試料セル５０の構成を示す平面図、図１０Ｂは検出用試料セル５０の側断面図である。
【０１０８】
検出用試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられた金属層５８ａ、５９ａからなるセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
【０１０９】
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。
【０１１０】
検出用試料セル５０は、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法におけるセンサチップとして、同様に使用することができる。
【０１１１】
検出用試料セル５０は、センサ部上をブロッキング物質によってブロッキング処理することができる。
【０１１２】
検出用試料セル５０は、被検出物質に応じて、この被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質をセンサ部に適宜固定して使用することができる。
【０１１３】
さらに、検出用試料セル５０は、センサ部より上流側の流路内に配置されている蛍光標識結合物質ＢＦを備えることができる。
【０１１４】
＜第２実施形態の検出用試料セル＞
図１１は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第２の実施形態の検出用試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ａにおいては、基台５１上に流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＢＦ（蛍光標識結合物質）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。また、この第１および第２の測定エリア５８，５９は、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理されている。本例では、センサ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【０１１５】
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、Ａｕ（金）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。そして、Ａｕ膜５８ａおよびＡｕ膜５９ａの表面には、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理が施されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＢＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＢＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的および方法によって適宜定めればよい。
【０１１６】
検出用試料セル５０Ａは、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてもセンサチップに代えて同様に使用することができる。検出用試料セル５０は、収容部１９において、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光の検出測定の後、第２の測定エリア５９を検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光もしくは放射光の検出を行うように構成されている。
【０１１７】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１２を参照して説明する。
【０１１８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１２中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が付与された蛍光物質とが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。このとき、標識２次抗体ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
【０１１９】
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号或いは放射光信号（以下、検出信号）を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの検出信号は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することができる。
【０１２０】
本実施形態に係る検出用試料セルでは、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。すなわち、この蛍光物質を用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子のまとまりとして被検出物質を標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出用試料セルでは、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【０１２１】
＜第３実施形態の検出用試料セル＞
図１３は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の検出用試料セルを示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ｂにおいては、基台５１上には流路５２上流側から、抗原Ａとは結合せず後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＣＦ（蛍光標識結合物質）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と競合して特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８’、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＣＦと特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。また、この第１および第２の測定エリア５８’，５９’は、ブロッキング物質によってブロッキング処理されている。本例では、センサ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【０１２２】
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。そして、Ａｕ膜５８ａおよびＡｕ膜５９ａの表面には、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理が施されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＣＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＣＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的および方法によって適宜、選択することができる。
【０１２３】
検出用試料セル５０Ｂは、既述の検出用試料セル５０Ａと同様に、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてセンサチップに代えて同様に使用することができる。
【０１２４】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ｂを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
【０１２５】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＣＦが付与された蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。このとき、標識２次抗体ＣＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体ＣＦの一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体ＣＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＣＦを洗い流す。
【０１２６】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように検出用試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出し、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。
【０１２７】
競合法においては、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属層上の消光防止性蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の消光防止性蛍光物質の数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１２８】
本実施形態に係る検出用試料セルでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用試料セルでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１２９】
（検出用試料セルの設計変更例）
光導波モードによる電場増強を利用する検出方法および装置に用いる検出用試料セルの断面図を図１５に示す。図１０に示した第１の実施形態の検出用試料セルの構成と略同一であるが、センサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備えている。この場合、ブロッキング物質によるブロッキング処理は、光導波層５８ｂ、５９ｂの上に施される。
【０１３０】
この検出用試料セルも適宜、センサ部に第１の結合物質を、センサ部上流側に蛍光標識結合物質を固定し使用することができる。
【０１３１】
「検出用キット」
＜第１の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第１の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１３２】
図１６Ａは検出用キット６０ａの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ａは、センサ部がブロッキング物質によるブロッキング処理を施された検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦを含む標識用溶液６３とを備えている。ここで、例えば図１６Ａでは、標識用溶液６３はアンプル６２に入れられ密閉されている。
【０１３３】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点でのみ上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１３４】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用キット６０ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
【０１３５】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１７において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、標識２次抗体ＢＦが抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Ａと結合しなかった２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。このとき、標識２次抗体ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体（蛍光物質）が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体を洗い流す。
【０１３６】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、検出装置において、静電気的な相互作用により、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第１の測定エリア５８からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように検出用試料セル６１をＸ方向に移動させ、同様に、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの検出信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した検出信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの検出信号を補正してもよい。
【０１３７】
蛍光物質Ｆへの２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
【０１３８】
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径φ５００ｎｍ、励起波長７８０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【０１３９】
本実施形態に係る検出用キットでは、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からかつなり複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。すなわち、この蛍光物質を用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子のまとまりとして被検出物質を標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出用キットでは、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【０１４０】
＜第２の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第２の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１４１】
図１６Ｂは検出用キット６０ｂの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ｂは、ブロッキング処理されていない検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦを含む標識用溶液６３と、標識用溶液６３と同時もしくは標識用溶液の流下前に流路内に流下される、ブロッキング物質Ｒを含むブロッキング用溶液６５を備えている。ここで、例えば図１６Ｂでは、標識用溶液６３はアンプル６２に入れられ、ブロッキング用溶液６５はアンプル６４に入れられ密閉されている。
【０１４２】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点、ブロッキング物質によるブロッキング処理が施されていない点で上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１４３】
本実施形態の係る検出用キットで６０ｂでは、センサ部上に予めブロッキング処理が施されていないため、ブロッキング用溶液６５を標識用溶液６３よりも先に流下する、或いはブロッキング用溶液６５と標識用溶液６３とを同時に流下することにより測定が行われる。ここで、同時に流下する場合には、ブロッキング物質を構成する第２の粒子の粒径が、蛍光物質を構成する第１の粒子の粒径よりも小さいことが好ましい。
【０１４４】
本実施形態に係る検出用キットでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用キットでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１４５】
＜第３の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第３の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１４６】
図１６Ｃは検出用キット６０ｃの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ｃは、ブロッキング処理されていない検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦとブロッキング物質Ｒとを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液６７とを備えている。ここで、例えば図１６Ｃでは、兼用溶液６７はアンプル６６に入れられ密閉されている。
【０１４７】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点、ブロッキング物質によるブロッキング処理が施されていない点で上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１４８】
本実施形態の係る検出用キット６０ｃでは、センサ部上に予めブロッキング処理が施されていないため、兼用溶液６７を流下することにより測定が行われる。ここで、ブロッキング物質を構成する第２の粒子の粒径が、蛍光物質を構成する第１の粒子の粒径よりも小さいことが好ましい。
【０１４９】
本実施形態に係る検出用キットでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用キットでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１５０】
（検出用キットの設計変更例）
本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１３に示す検出用試料セルを用いることにより、競合法によるアッセイを行う検出装置および方法に好適なものとなる。
【０１５１】
また、本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１５に示す検出用試料セルを用いることにより、光導波モードによる電場増強を利用する検出装置および方法に好適なものとなる。
【０１５２】
＜実施例＞
図１８Ａは、ブロッキング物質によるブロッキング処理がない場合の、蛍光標識結合物質の金膜上への非特異的吸着の様子を表す図である。一方、図１８Ｂは、ブロッキング物質によるブロッキング処理がある場合の、蛍光標識結合物質の金膜上への非特異的吸着の様子を表す図である。図からわかるようにノイズが１桁改善された。これらの図より、ブロッキング物質によるブロッキング処理を施すことにより、蛍光標識結合物質のセンサ部上への非特異的な吸着による影響を低減可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の第１の実施形態による検出装置を示す概略構成図（ＳＰＦ）
【図２Ａ】蛍光標識結合物質と生体物質との大小関係を示す概略図
【図２Ｂ】本発明に用いられるブロッキング物質を示す概略図
【図３Ａ】蛍光標識結合物質のセンサ部への非特異的吸着の様子を示す図
【図３Ｂ】蛍光標識結合物質の非特異的吸着をブロッキングする様子を示す図
【図４】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図（ＬＰＦ）
【図５】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６】本発明の第３実施形態による検出装置を示す概略構成図（ＳＰＣＥ）
【図７】本発明の第４実施形態による検出装置を示す概略構成図（導波―蛍光）
【図８】本発明の第５実施形態による検出装置を示す概略構成図（導波―放射光）
【図９】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１０】本発明の第１の実施形態の検出用試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図１１】本発明の第２の実施形態の検出用試料セルを示す側断面図
【図１２】第２の実施形態の検出用試料セルを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１３】本発明の第３の実施形態の検出用試料セルを示す側断面図
【図１４】第３の実施形態の検出用試料セルを用いた競合法によるアッセイ手順を示す図
【図１５】検出用試料セルの設計変更例を示す側断面図
【図１６Ａ】本発明に係る蛍光検出用キットの構成を示す模式図
【図１６Ｂ】他の実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図（その１）
【図１６Ｃ】他の実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図（その２）
【図１７】蛍光検出用キットを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１８Ａ】ブロッキング処理をしない場合の非特異的吸着の量を示す図
【図１８Ｂ】ブロッキング処理をした場合の非特異的吸着の量を示す図
【図１９】従来例における検出方法を示す概念図
【符号の説明】
【０１５４】
１、２、３、４、５ 検出装置
１０、１０’、１０” センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属層（金属膜）
１２’ 金属層（金属微細構造体）
１６ 第１の粒子（透光材料）
１６’ 第２の粒子
２０、２０’ 励起光照射光学系
３０ 光検出器
３５ 磁界印加手段
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１ 検出用試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
６０ 検出用キット
６３ 検出用標識溶液
ＢＦ、ＣＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｐ 放射光
Ｍｃ 金属被膜
Ｒ ブロッキング物質
ｒ 生体物質によるブロッキング剤
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
上記蛍光法において、試料を流しながら特定の被検出物質のみを効率よく検出できる等の理由から、以下に示す２つの方法により被検出物質をセンサ部表面に固定し、その後蛍光検出を行う手法が一般的である。このような手法の１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原を特異的に結合させ、次いで、蛍光標識が付与されかつ抗原と特異的に結合する２次抗体を、さらに上記抗原に結合させることにより、１次抗体―抗原―２次抗体という結合状態を形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂サンドイッチ法である。また、もう１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原と蛍光標識が付与された２次抗体（前述の２次抗体と異なり、１次抗体と特異的に結合する）とを、競合的に１次抗体と結合させ、競合的に結合した２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂競合法である。
【０００４】
また、蛍光検出においてＳ／Ｎ比を向上できる等の理由から、上記のような方法によって間接的にセンサ部に固定された蛍光標識を、エバネッセント光により励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、励起光をセンサ部裏面から入射し、センサ部表面に染み出すエバネッセント光により蛍光標識を励起して、その蛍光標識から生じる蛍光を検出するものである。
【０００５】
一方、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるためプラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が、特許文献１、非特許文献１などに提案されている。この表面プラズモン増強蛍光法は、センサ部に金属層を設け、この金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎ比を向上させるものである。
【０００６】
また、エバネッセント蛍光法において、表面プラズモン増強蛍光法と同様に、センサ部の電場を増強する効果を有する方法として、光導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、センサ部に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、この光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、上記に示した蛍光法のように蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)を検出する方法が提案されている。
【０００８】
以上のように、バイオ測定等においては、被検出物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、この蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する種々の方法が提案されている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、表面プラズモン共鳴や光導波モードによる電場増強の効果は、金属層や光導波層表面から離れるに従って急激に減衰するため、この表面から蛍光標識までの距離が僅かに変化するだけで、信号に差が生じ、信号のばらつきが生じてしまうという問題がある。
【００１０】
例えば、表面プラズモン共鳴による電場増強効果による蛍光を検出する装置のセンサ部近傍の模式図を図１９に示す。プリズム（基板）１０１の表面に金膜１０２が設けられており、この金膜１０２上に１次抗体Ｂ１が固定されている。サンドイッチアッセイを行う場合、前述のように、１次抗体Ｂ１−抗原Ａ−標識２次抗体ＢＦの結合状態を形成する。ここで、標識２次抗体ＢＦは、蛍光標識（ここでは、蛍光色素分子ｆ）が付与された２次抗体である。そして、プリズム１０１と金膜１０２との界面に全反射角度以上の角度で励起光を入射することにより、金膜表面に表面プラズモンを励起して金膜表面の電場を増強する。この結果、蛍光標識ｆは、増強された電場において励起され、蛍光を発する。
【００１１】
図１９中のグラフは、電場強度のセンサ部表面（金膜表面）からの距離依存性を示している。グラフに示すように、電場強度は表面から離れるにつれ急激に減衰する。このとき、センサ部表面から標識２次抗体ＢＦの蛍光標識ｆまでの距離は、最大で５０ｎｍ程度も離れることがあり、このような場合には、蛍光強度は３０％以上減衰してしまう。また、１次抗体Ｂ１は、常にセンサ部表面に直立に固定されるものではなく、液の流れや立体障害等により表面に沿って倒れる場合もある。したがって、これに応じて蛍光標識ｆの表面からの距離にばらつきが生じ、このばらつきが信号強度のばらつきに繋がる。
【００１２】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することができ、かつ高いＳ／Ｎ比を実現することが可能な、蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する検出方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は上記検出方法に用いられる検出用試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するため、本発明による検出方法は、
誘電体プレートの一面に、この誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
センサ部に試料を接触させることにより、この試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識とこの蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、
センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
増強した光電場により、蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する検出方法において、
蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用い、
センサ部に対する蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により蛍光標識結合物質がセンサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いることを特徴とするものである。
【００１５】
ここで、「金属層を含む積層構造」とは、金属層を含み少なくとも１以上の層からなる構造を意味するものとする。つまり、上記積層構造は、金属層のみでもよい。なお、ここで言う「層」とは、必ずしも一面を覆うものである必要はなく、例えば、微小開孔を有するものや粗密のあるものであってもよい。
【００１６】
「結合物質」とは、ある特定の対象物質と特異的に結合する物質を意味するものとする。例えば、特定の対象物質として抗原を考える場合には、結合物質としてこの抗原と特異的に結合する抗体が挙げられる。そして、上記の場合において、抗原と競合して上記抗体と特異的に結合する別の抗体も結合物質である。
【００１７】
「蛍光標識結合物質」とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する、蛍光標識によって標識された結合物質を意味するものとする。すなわち、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識結合物質は、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質と、この第２の結合物質を標識する蛍光標識とから構成される。これにより、第１の結合物質−被検出物質−第２の結合物質のサンドイッチ構造が作られ、蛍光標識結合物質がセンサ部上に結合する。ここで、被検出物質の第１の結合物質に対する結合部位と第２の結合物質に対する結合部位とは異なる。一方、競合法によるアッセイを行う場合には、蛍光標識結合物質は、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この第３の結合物質を標識する蛍光標識とから構成される。これにより、第１の結合物質−第３の結合物質の結合が作られ、蛍光標識結合物質がセンサ部上に結合する。
【００１８】
「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場を意味するものとする。
【００１９】
「増強した光電場」を発生せしめるとは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものとする。なお、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴の励起による増強であってもよいし、光導波モードの励起による増強であってもよい。
【００２０】
蛍光標識の「励起に起因して生じる光」とは、蛍光標識が励起することにより直接的または間接的に生じる光であって、その光の発生量と励起した蛍光標識の数量との間に相関性を有するものを意味するものとする。
【００２１】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無の検出を含み、定性的な量のみならず、定量的な量を検出することも意味するものとする。
【００２２】
センサ部に対して有する「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性」とは、蛍光標識結合物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、センサ部上の任意の場所に蛍光標識結合物質が吸着しうる性質を意味するものとする。ここで、「相互作用」とは、例えば水素結合、静電気力や親疎水性等による作用である。
【００２３】
蛍光標識結合物質を構成する「結合物質の特異的結合性」とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、結合物質（蛍光標識結合物質）がセンサ部上に特異的に結合しうる性質を意味するものとする。すなわち、結合物質の特異的結合性は、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質の特異的結合性を意味し、一方競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質の特異的結合性を意味するものである。
【００２４】
ブロッキング物質の「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性」とは、ブロッキング物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、蛍光標識結合物質が吸着しうるセンサ部上の場所と同一または近傍の場所にブロッキング物質が吸着しうる性質を意味するものとする。すなわち、ブロッキング物質の非特異的吸着性が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等であるとは、それぞれの物質が吸着するセンサ部上の「場所」が同一となる、または近傍に位置することを意味するものである。
【００２５】
蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は、１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
【００２６】
さらに、本発明に係る検出方法において、ブロッキング物質は、少なくとも表面が透光材料と同等な材料により構成されている第２の粒子を有するものであることが好ましい。ここで、「同等な材料」とは、透光材料と同一の材料、またはブロッキング物質が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有する範囲で、分子構造、側鎖、官能基および帯電状態等の観点から類似する材料を意味するものとする。この場合、ブロッキング物質は第２の粒子の表面に表面修飾されかつ上記特異的結合性を有さない修飾物質を有するものであることが好ましい。また、第２の粒子は第１の粒子の粒経よりも小さい粒径を有するものであることが好ましく、この場合ブロッキング物質と蛍光標識結合物質とを同時にセンサ部上に流下することが好ましい。
【００２７】
そして、第２の粒子は、第２の粒子内に、第１の蛍光色素分子が発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものであることが好ましく、或いは、第２の粒子は、第２の粒子内に、蛍光を発する物質を含まないものであることが好ましい。
【００２８】
さらに、「蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を検出するものであってもよいし、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光を検出するものであってもよい。具体的には、以下の方法（１）〜（４）が挙げられる。
（１）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（２）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
（３）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（４）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
【００２９】
なお、（１）および（２）において、プラズモンの励起は、金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度で励起光を入射し、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよい。一方、金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体、あるいは励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、プラズモンの励起は、励起光の照射により金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。また、プラズモンの励起は、金属膜の微小開口を利用したものであってもよい。
【００３０】
さらに、本発明に係る検出用試料セルは、上記に記載の検出方法においてセンサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつセンサ部の表面にブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであることを特徴とするものである。
【００３１】
そして、本発明に係る検出用試料セルにおいて、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定されているものを備えることが好ましい。
【００３２】
また、センサ部より上流側の流路内に配置された蛍光標識結合物質を備えることが好ましい。
【００３３】
そして、積層構造は、光導波層を備えることが好ましい。
【００３４】
なお、本発明に係る検出用試料セルは、上記の蛍光標識結合物質が第２の結合物質とこれを標識する蛍光標識とからなる場合には、サンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、一方第３の結合物質とこれを標識する蛍光標識とからなる場合には、競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３５】
さらに、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつセンサ部の表面にブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３６】
なお、本発明に係る検出用キットは、標識用溶液に含まれる蛍光標識結合物質が、第２の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合にはサンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、第３の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
【００３７】
或いは、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質を含む標識用溶液、および
標識用溶液と同時もしくは標識用溶液の流下前に流路内に流下される、ブロッキング物質を含むブロッキング用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３８】
或いは、本発明に係る検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられたこの流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質とブロッキング物質とを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
【００３９】
そして、本発明に係る検出用キットにおいて、積層構造は、金属層上に光導波層を備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明に係る検出方法では、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出方法では、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【００４１】
また、本発明の検出用試料セルあるいは検出用キットを用いれば、本発明の検出方法を容易に実施することができ、増強された電場を有効に利用し、信号強度のばらつきを抑制し、かつ高いＳ／Ｎ比をもって被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００４３】
「検出方法および検出装置」
＜第１の実施形態＞
本発明に係る検出方法は、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１の一面に金属層１２を含むセンサ部１４であって、ブロッキング物質（図示略）によってブロッキング処理を施されたセンサ部１４を有してなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを該センサ部１４上に結合させ、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射し、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上の光電場を増強させ、該増強された光電場Ｄ内における、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識である蛍光物質Ｆの励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法である。
【００４４】
本検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に金属層１２が設けられてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用いる。
【００４５】
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属層１２として金属膜が成膜されたものである。誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより好ましい。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることができる。例えば、励起光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。なお、「主成分」とは、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００４６】
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質である。蛍光標識結合物質ＢＦは、図１に示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と蛍光標識とから構成されるものである。また、蛍光標識結合物質ＢＦは、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光標識とから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０としてセンサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定されてなるものを用いた場合、サンドイッチ法における蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この第２の結合物質Ｂ２を標識する蛍光標識Ｆとからなるものである。一方同様の場合、競合法における蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａと競合して第１の結合物質Ｂ１と特異的に結合する第３の結合物質と、この第３の結合物質を標識する蛍光標識とからなるものである。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、蛍光標識結合物質として２次抗体を標識した所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００４７】
また、蛍光標識は、図１の一部に拡大して示すように、複数の第１の蛍光色素分子ｆを、該複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆである。蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
【００４８】
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％Ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％Ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、第１の蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
【００４９】
以上の工程により、第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより第１の蛍光色素分子ｆを内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順でポリスチレン粒子に第１の蛍光色素分子を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径は、ポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００５０】
蛍光物質Ｆは、複数の第１の蛍光色素分子ｆを内包するものであるため、従来の蛍光色素分子ｆ単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。また、蛍光物質Ｆは、拡散時間の点から粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましい。また、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などが挙げられるが、第１の蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００５１】
ブロッキング物質Ｒは、蛍光標識結合物質ＢＦとセンサ部との間に生じる相互作用によって、センサ部上の任意の場所に蛍光標識結合物質が吸着することを防止するためのブロッキング剤である。ブロッキング物質は、上記第１の蛍光色素分子を含まず、蛍光標識結合物質を構成する結合物質の特異的結合性を有さず、かつ蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するものである。ここで、蛍光標識結合物質を構成する結合物質の特異的結合性とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質を介して、結合物質（蛍光標識結合物質）がセンサ部上に特異的に結合しうる性質を意味するものとする。すなわち、結合物質の特異的結合性は、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質の特異的結合性を意味し、一方競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合して上記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質の特異的結合性を意味するものである。また、ブロッキング物質の「蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性」とは、ブロッキング物質とセンサ部との間に生じる相互作用によって、蛍光標識結合物質が吸着しうるセンサ部上の場所と同一または近傍の場所にブロッキング物質が吸着しうる性質を意味するものとする。すなわち、ブロッキング物質の非特異的吸着性が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等であるとは、それぞれの物質が吸着するセンサ部上の「場所」が同一となる、または近傍に位置することを意味するものである。
【００５２】
標識物の付いた生体物質のセンサ部への非特異的な吸着に起因するノイズは、バイオ測定法において検出限界を左右する大きな問題である。この問題に対して従来は、生体物質（核酸、ビオチン、ＢＳＡ、カゼイン等）や生体物質に類似した物質（親水性ポリマー等）をブロッキング剤としてブロッキング処理することにより、上記のような非特異的な吸着を防止している。この方法は、標識物が生体物質（被検出物質や結合物質等）に比して略同じ大きさである場合には、一定の効果を奏する。しかしながら、本発明に係る検出方法では、蛍光標識として生体物質に比して１０倍以上の大きさを有する蛍光物質Ｆを用いている。図２Ａは、蛍光物質Ｆと生体物質との大小関係を示した概略図である。図２Ａに示すように、生体物質はせいぜい１０ｎｍ程度であるのに対し、第１の粒子１６は例えば１００〜５００ｎｍである。このように、蛍光物質Ｆが生体物質よりも格段に大きい場合、蛍光物質Ｆの非特異的吸着性においては、結合物質Ｂ２とセンサ部１４との相互作用よりも第１の粒子１６とセンサ部１４との相互作用が支配的となる。この場合、図３Ａに示すように、生体物質等のブロッキング剤ｒを用いてブロッキング処理するだけでは、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着を防止することは困難である（図中のＢＦ’は、非特異的に吸着した蛍光標識結合物質を示す。）。
【００５３】
そこで本実施形態に係るブロッキング物質Ｒは、本実施形態では図２Ｂに示すように、第２の粒子１６’とこの第２の粒子１６’を修飾する修飾物質Ｂ２’とから構成される。
【００５４】
第２の粒子１６’は、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を実現するため、蛍光物質Ｆの第１の粒子１６を構成する透光材料と同等の材料によって構成されることが好ましい。ここで、「同等な材料」とは、透光材料と同一の材料、またはブロッキング物質が蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有する範囲で、分子構造、側鎖、官能基および帯電状態等の観点から類似する材料を意味するものとする。上記を踏まえ、第２の粒子１６’の材料としては、ポリスチレンやポリ乳酸、アクリル、ポリエチレンイミン、ＳｉＯ２などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、第２の粒子１６’の粒径は、蛍光標識結合物質ＢＦよりも移動・吸着速度を高めるため、第１の粒子１６よりも小さいことが好ましい。こうすることにより、蛍光標識結合物質ＢＦとブロッキング物質Ｒとをセンサ部１４上に同時に供給しても、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着を防止することができる。
【００５６】
そして、図２Ｂには第２の粒子１６’が内部に他の物質として何も含まない構成の場合について示しているが、第２の粒子１６’は、第１の蛍光色素分子ｆが発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものとしてもよい。このようにすれば、ブロッキング物質Ｒからの蛍光信号と蛍光物質Ｆからの蛍光信号とを分離して検出することができる。したがって、ブロッキング物質Ｒからの蛍光信号をデータ補正用のリファレンス信号として、同時に検出する等の測定も行うことができる。
【００５７】
修飾物質Ｂ２’は、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を実現するため、例えば蛍光標識結合物質ＢＦを構成する結合物質とは認識抗原が異なる抗体や電荷を付与する官能基等である。ただし、修飾物質Ｂ２’は必ずしも必須のものではない。
【００５８】
ブロッキング処理は、図３Ｂに示すように、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着を防止するために、蛍光標識結合物質ＢＦが非特異的に吸着しうる場所に、ブロッキング剤（生体物質等のブロッキング剤ｒ、或いはブロッキング物質Ｒ）を供給し吸着させる処理である。通常ブロッキング物質Ｒの供給は、蛍光標識結合物質ＢＦの供給の前に行うことが好ましい。ただし、第２の粒子１６’の粒径が第１の粒子の粒径よりも小さい場合には、蛍光標識結合物質ＢＦよりもブロッキング物質Ｒの方が移動・吸着速度が高いため、ブロッキング物質Ｒと蛍光標識結合物質ＢＦとを同時に供給しても構わない。なお、予めブロッキング物質Ｒによりブロッキング処理が施されたセンサチップ１０を用いてもよい。
【００５９】
また、本発明の検出装置は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１９と、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射により生じる、被検出物質Ａに応じた量の光を検出する光検出手段３０とを備えている。
【００６０】
本発明は、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、その増強した光電場において蛍光標識が励起されることによって生じる光を検出するものである。しかしながら、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を検出してもよいし、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光を検出してもよい。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。なお、本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【００６１】
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料Ｓを保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部１３を備えない態様であってもよい。
【００６２】
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面で励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
【００６３】
光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
【００６４】
収容部１９は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップのセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出器３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１９に対しセンサチップ１０は、図中矢印Ｘ方向に出し入れすることができる。
【００６５】
以下、本実施形態における検出方法および検出装置の作用を説明する。
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００６６】
センサチップ１０として、センサ部１４である金属膜１２上に抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾され、その後金属膜１２に対して上記のブロッキング物質Ｒによるブロッキング処理が施されたものを用意する。
【００６７】
まず、試料保持部１３中に検査対象である試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と、上記の蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と、蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２とは、抗原Ａに対してそれぞれ別の結合部位（エピトープ）に結合するものを用いる。試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、サンドイッチが形成される。その後、サンドイッチが形成されなかった結合物と未反応の蛍光標識結合物質ＢＦとを分離するため、バッファ溶液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
【００６８】
以上の工程はセンサチップ１０を検出装置１の収容部１９にセットする前に行ってもよいし、セット後に行ってもよい。また、被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光物質を添加しておいてもよい。
【００６９】
本実施形態に係る検出方法では、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。すなわち、この蛍光物質Ｆを用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子ｆのまとまりとして被検出物質Ａを標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出方法では、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【００７０】
さらに、本実施形態のように、センサ部１４の表面に金属層１２を有している場合には、この金属層１２による第１の蛍光色素分子の金属消光の影響が強くなるため、金属層１２と第１の蛍光色素分子との距離を精密に制御する必要がある。金属消光の影響の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と第１の蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが好ましい。このような制御は、一般的にはポリマー膜、ＳｉＯ２膜、ＳＡＭ膜もしくはＣＭＤ膜のようなバリア層を金属層上に設けることにより行われているが、面倒かつ煩雑であり実用にはあまり向いていない。しかしながら、本発明において、蛍光物質が、第１の蛍光色素分子を充分多く含有する場合には、金属層１２上に金属消光防止のための膜を設けなくても、必然的に金属層１２と多くの第１の蛍光色素分子との距離をある程度離間させることができる。これにより従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
【００７１】
＜第１の実施形態の設計変更例＞
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、例えば界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズムとプリズム上の金属膜との界面に対して、角度θ−Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の溶媒の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００７２】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図４を参照して説明する。図４は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および検出装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。なお、以下においては、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００７３】
図４に示す蛍光検出装置２は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
【００７４】
センサチップ１０’は、誘電体プレート１１上に設けられかつブロッキング物質（図示略）によってブロッキング処理を施された金属層１２’として、励起光の照射を受けて所謂局在プラズモンを生じる、金属微細構造体或いは複数の金属ナノロッドを備えている。ここで、金属微細構造体は、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有するものである。一方、金属ナノロッドは、励起光の波長よりも小さいサイズ有するものである。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
【００７５】
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
【００７６】
センサチップ１０’の具体例を図５Ａ〜Ｃに斜視図で示し説明する。なお、以下で説明されるセンサチップにおいて、ブロッキング物質によるブロッキング処理についての記載を便宜上省略しているが、これらのセンサチップにおいてもブロッキング処理が施される。
【００７７】
図５Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００７８】
図５Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００７９】
図５Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。
【００８０】
図５Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが測定光Ｌの波長よりも小さく設計される。
【００８１】
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００８２】
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
【００８３】
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００８４】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００８５】
さらに、本実施形態に係る検出方法では、励起光の照射を受けて所謂局在プラズモンを生じる、金属微細構造体或いは複数の金属ナノロッドを備えている。このような場合、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はない。したがって、簡易的な光学系によって低コストの検出方法を行うことが可能となる。
【００８６】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図６を参照して説明する。図６は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
【００８７】
図６に示す放射光検出装置３は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置３においては、光検出器３０が、蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように配置されている。
【００８８】
検出装置３を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００８９】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【００９０】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９１】
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【００９２】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。
【００９３】
図７に示す検出装置４の構成は、第１の実施形態の検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、電場増強のメカニズムが異なる。
【００９４】
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。そして、この光導波層１２ｂ上に、ブロッキング物質（図示略）によるブロッキング処理が施されている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【００９５】
蛍光検出装置４を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上の電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９６】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９７】
さらに、光導波モードの励起により生じる電界分布は、通常の表面プラズモン蛍光法により生じる電界分布と比較して表面からの距離に伴う電界減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として複数の第１の蛍光色素分子を内包する径の大きな蛍光物質を用いた場合、通常の表面プラズモン蛍光法による電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
【００９８】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
【００９９】
図８に示す本実施形態の検出装置５は、第３の実施形態の検出装置３と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
【０１００】
検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、センサ部１４の表面がブロッキング物質（図示略）によりブロッキング処理されている。これにより、蛍光標識結合物質ＢＦのセンサ部１４への非特異的な吸着が防止される。このように、蛍光標識結合物質ＢＦの非特異的な吸着の影響を低減した状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上の電界分布が生じ、電場増強領域Ｄが形成される。そして、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０”の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【０１０１】
本実施形態に係る検出方法でも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子ｆと、複数の第１の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子ｆを包含する第１の粒子１６とから構成される蛍光物質Ｆを用いている。さらに、本発明に係る検出方法でも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０２】
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０３】
さらに、光導波モードの励起による電場増強を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
【０１０４】
（第１から５の実施形態における設計変更例）
なお、第１から第５の実施形態においては、蛍光標識として、図９に示すように、さらに、透光材料１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属被膜Ｍｃが設けられたものを用いてもよい。金属被膜Ｍｃは、透光材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜Ｍｃの材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。この場合、ブロッキング物質についても同様の金属被膜を設けることが好ましい。
【０１０５】
蛍光物質の表面に金属被膜Ｍｃを備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光物質Ｆの金属被膜Ｍｃのウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【０１０６】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。
まず、前述手順により消光防止性蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【０１０７】
「検出用試料セル」
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
＜第１の実施形態の検出用試料セル＞
図１０Ａは、第１の実施形態の検出用試料セル５０の構成を示す平面図、図１０Ｂは検出用試料セル５０の側断面図である。
【０１０８】
検出用試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられた金属層５８ａ、５９ａからなるセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
【０１０９】
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。
【０１１０】
検出用試料セル５０は、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法におけるセンサチップとして、同様に使用することができる。
【０１１１】
検出用試料セル５０は、センサ部上をブロッキング物質によってブロッキング処理することができる。
【０１１２】
検出用試料セル５０は、被検出物質に応じて、この被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質をセンサ部に適宜固定して使用することができる。
【０１１３】
さらに、検出用試料セル５０は、センサ部より上流側の流路内に配置されている蛍光標識結合物質ＢＦを備えることができる。
【０１１４】
＜第２実施形態の検出用試料セル＞
図１１は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第２の実施形態の検出用試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ａにおいては、基台５１上に流路５２上流側から、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＢＦ（蛍光標識結合物質）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定された第１の測定エリア５８、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定された第２の測定エリア５９が順に設けられている。また、この第１および第２の測定エリア５８，５９は、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理されている。本例では、センサ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【０１１５】
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、Ａｕ（金）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２の測定エリア５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。そして、Ａｕ膜５８ａおよびＡｕ膜５９ａの表面には、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理が施されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８と第２の測定エリア５９は同一の構成である。第２の測定エリア５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＢＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＢＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的および方法によって適宜定めればよい。
【０１１６】
検出用試料セル５０Ａは、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてもセンサチップに代えて同様に使用することができる。検出用試料セル５０は、収容部１９において、励起光照射光学系２０および検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１の測定エリア５８からの蛍光もしくは放射光の検出測定の後、第２の測定エリア５９を検出位置に移動させて第２の測定エリア５９からの蛍光もしくは放射光の検出を行うように構成されている。
【０１１７】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１２を参照して説明する。
【０１１８】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１２中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと２次抗体Ｂ２が付与された蛍光物質とが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。このとき、標識２次抗体ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
【０１１９】
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８からの蛍光信号或いは放射光信号（以下、検出信号）を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの検出信号は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することができる。
【０１２０】
本実施形態に係る検出用試料セルでは、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。すなわち、この蛍光物質を用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子のまとまりとして被検出物質を標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出用試料セルでは、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【０１２１】
＜第３実施形態の検出用試料セル＞
図１３は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の検出用試料セルを示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ｂにおいては、基台５１上には流路５２上流側から、抗原Ａとは結合せず後述の１次抗体と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＣＦ（蛍光標識結合物質）を物理吸着させてある標識２次抗体吸着エリア５７’、被検出物質である抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３と競合して特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定された第１の測定エリア５８’、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＣＦと特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定された第２の測定エリア５９’が順に設けられている。また、この第１および第２の測定エリア５８’，５９’は、ブロッキング物質によってブロッキング処理されている。本例では、センサ部に２つの測定エリアを設けた例を挙げているが、測定エリアは１つのみであってもよい。
【０１２２】
基台５１上の第１の測定エリア５８および第２の測定エリア５９にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１の測定エリア５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２の測定エリア５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。そして、Ａｕ膜５８ａおよびＡｕ膜５９ａの表面には、ブロッキング物質Ｒによってブロッキング処理が施されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は第１の測定エリア５８’と第２の測定エリア５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとは、第１の測定エリア５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２の測定エリア５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＣＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体の量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２の測定エリアには１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２の測定エリア５９に標識２次抗体ＣＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的および方法によって適宜、選択することができる。
【０１２３】
検出用試料セル５０Ｂは、既述の検出用試料セル５０Ａと同様に、上述した第１〜第５のいずれの実施形態の検出装置および方法においてセンサチップに代えて同様に使用することができる。
【０１２４】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ｂを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
【０１２５】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと標識２次抗体ＣＦが付与された蛍光物質Ｆとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとが競合して、第１の測定エリア５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。このとき、標識２次抗体ＣＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。
ｓｔｅｐ６：第１の測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体ＣＦの一部は、第２の測定エリア５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体ＣＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＣＦを洗い流す。
【０１２６】
このように、血液を注入口から注入し、測定エリア５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび２次抗体Ｃ３が競合結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１の測定エリア５８’および第２の測定エリア５９’からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように検出用試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出し、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。
【０１２７】
競合法においては、被検出物質Ａの濃度が高ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が少なく、すなわち金属層上の消光防止性蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなり、一方、被検出物質Ａの濃度が低ければ、第１の結合物質Ｃ１と結合する第３の結合物質Ｃ３の量が多く、すなわち金属膜上の消光防止性蛍光物質の数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
【０１２８】
本実施形態に係る検出用試料セルでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用試料セルでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１２９】
（検出用試料セルの設計変更例）
光導波モードによる電場増強を利用する検出方法および装置に用いる検出用試料セルの断面図を図１５に示す。図１０に示した第１の実施形態の検出用試料セルの構成と略同一であるが、センサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備えている。この場合、ブロッキング物質によるブロッキング処理は、光導波層５８ｂ、５９ｂの上に施される。
【０１３０】
この検出用試料セルも適宜、センサ部に第１の結合物質を、センサ部上流側に蛍光標識結合物質を固定し使用することができる。
【０１３１】
「検出用キット」
＜第１の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第１の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１３２】
図１６Ａは検出用キット６０ａの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ａは、センサ部がブロッキング物質によるブロッキング処理を施された検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦを含む標識用溶液６３とを備えている。ここで、例えば図１６Ａでは、標識用溶液６３はアンプル６２に入れられ密閉されている。
【０１３３】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点でのみ上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１３４】
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用キット６０ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
【０１３５】
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１７において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆを含む標識用溶液６３を供給口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：蛍光物質Ｆは徐々に下流側に流れ、標識２次抗体ＢＦが抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Ａと結合しなかった２次抗体Ｂ２の一部は第２の測定エリア５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。このとき、標識２次抗体ＢＦのセンサ部への非特異的な吸着の影響は、ブロッキング物質Ｒによって低減される。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体（蛍光物質）が測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体を洗い流す。
【０１３６】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、検出装置において、静電気的な相互作用により、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第１の測定エリア５８からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように検出用試料セル６１をＸ方向に移動させ、同様に、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの検出信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した検出信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリアからの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２の測定エリア５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１の測定エリアからの検出信号を補正してもよい。
【０１３７】
蛍光物質Ｆへの２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
【０１３８】
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径φ５００ｎｍ、励起波長７８０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
【０１３９】
本実施形態に係る検出用キットでは、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からかつなり複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。すなわち、この蛍光物質を用いることにより、複数の第１の蛍光色素分子のまとまりとして被検出物質を標識することができる。したがって、信号強度をより稼ぐことができるため、信号強度のばらつきを抑え、増強された電場を効率よく利用することが可能となる。さらに、本発明に係る検出用キットでは、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、蛍光標識結合物質が非特異的に吸着しうる場所をこのブロッキング物質によってブロッキングすることによって、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着を防止することができる。この結果、蛍光標識結合物質の非特異的な吸着に起因するノイズを抑制することが可能となる。すなわち、Ｓ／Ｎ比のよい信号を検出することが可能となる。以上より、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
【０１４０】
＜第２の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第２の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１４１】
図１６Ｂは検出用キット６０ｂの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ｂは、ブロッキング処理されていない検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦを含む標識用溶液６３と、標識用溶液６３と同時もしくは標識用溶液の流下前に流路内に流下される、ブロッキング物質Ｒを含むブロッキング用溶液６５を備えている。ここで、例えば図１６Ｂでは、標識用溶液６３はアンプル６２に入れられ、ブロッキング用溶液６５はアンプル６４に入れられ密閉されている。
【０１４２】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点、ブロッキング物質によるブロッキング処理が施されていない点で上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１４３】
本実施形態の係る検出用キットで６０ｂでは、センサ部上に予めブロッキング処理が施されていないため、ブロッキング用溶液６５を標識用溶液６３よりも先に流下する、或いはブロッキング用溶液６５と標識用溶液６３とを同時に流下することにより測定が行われる。ここで、同時に流下する場合には、ブロッキング物質を構成する第２の粒子の粒径が、蛍光物質を構成する第１の粒子の粒径よりも小さいことが好ましい。
【０１４４】
本実施形態に係る検出用キットでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用キットでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１４５】
＜第３の実施形態＞
本発明の検出方法に使用される第３の実施形態の検出用キットについて説明する。
【０１４６】
図１６Ｃは検出用キット６０ｃの構成を示す模式図である。
検出用キット６０ｃは、ブロッキング処理されていない検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される、蛍光標識結合物質ＢＦとブロッキング物質Ｒとを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液６７とを備えている。ここで、例えば図１６Ｃでは、兼用溶液６７はアンプル６６に入れられ密閉されている。
【０１４７】
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光標識結合物質ＢＦを物理吸着した物理吸着エリアを備えていない点、ブロッキング物質によるブロッキング処理が施されていない点で上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
【０１４８】
本実施形態の係る検出用キット６０ｃでは、センサ部上に予めブロッキング処理が施されていないため、兼用溶液６７を流下することにより測定が行われる。ここで、ブロッキング物質を構成する第２の粒子の粒径が、蛍光物質を構成する第１の粒子の粒径よりも小さいことが好ましい。
【０１４９】
本実施形態に係る検出用キットでも、蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。さらに、本発明に係る検出用キットでも、ブロッキング剤として、第１の蛍光色素分子を含まずかつ上記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１５０】
（検出用キットの設計変更例）
本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１３に示す検出用試料セルを用いることにより、競合法によるアッセイを行う検出装置および方法に好適なものとなる。
【０１５１】
また、本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１５に示す検出用試料セルを用いることにより、光導波モードによる電場増強を利用する検出装置および方法に好適なものとなる。
【０１５２】
＜実施例＞
図１８Ａは、ブロッキング物質によるブロッキング処理がない場合の、蛍光標識結合物質の金膜上への非特異的吸着の様子を表す図である。一方、図１８Ｂは、ブロッキング物質によるブロッキング処理がある場合の、蛍光標識結合物質の金膜上への非特異的吸着の様子を表す図である。図からわかるようにノイズが１桁改善された。これらの図より、ブロッキング物質によるブロッキング処理を施すことにより、蛍光標識結合物質のセンサ部上への非特異的な吸着による影響を低減可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の第１の実施形態による検出装置を示す概略構成図（ＳＰＦ）
【図２Ａ】蛍光標識結合物質と生体物質との大小関係を示す概略図
【図２Ｂ】本発明に用いられるブロッキング物質を示す概略図
【図３Ａ】蛍光標識結合物質のセンサ部への非特異的吸着の様子を示す図
【図３Ｂ】蛍光標識結合物質の非特異的吸着をブロッキングする様子を示す図
【図４】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図（ＬＰＦ）
【図５】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６】本発明の第３実施形態による検出装置を示す概略構成図（ＳＰＣＥ）
【図７】本発明の第４実施形態による検出装置を示す概略構成図（導波―蛍光）
【図８】本発明の第５実施形態による検出装置を示す概略構成図（導波―放射光）
【図９】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１０】本発明の第１の実施形態の検出用試料セルを示す（Ａ）平面図および（Ｂ）側断面図
【図１１】本発明の第２の実施形態の検出用試料セルを示す側断面図
【図１２】第２の実施形態の検出用試料セルを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１３】本発明の第３の実施形態の検出用試料セルを示す側断面図
【図１４】第３の実施形態の検出用試料セルを用いた競合法によるアッセイ手順を示す図
【図１５】検出用試料セルの設計変更例を示す側断面図
【図１６Ａ】本発明に係る蛍光検出用キットの構成を示す模式図
【図１６Ｂ】他の実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図（その１）
【図１６Ｃ】他の実施形態の蛍光検出用キットの構成を示す模式図（その２）
【図１７】蛍光検出用キットを用いたサンドイッチ法によるアッセイ手順を示す図
【図１８Ａ】ブロッキング処理をしない場合の非特異的吸着の量を示す図
【図１８Ｂ】ブロッキング処理をした場合の非特異的吸着の量を示す図
【図１９】従来例における検出方法を示す概念図
【符号の説明】
【０１５４】
１、２、３、４、５ 検出装置
１０、１０’、１０” センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属層（金属膜）
１２’ 金属層（金属微細構造体）
１６ 第１の粒子（透光材料）
１６’ 第２の粒子
２０、２０’ 励起光照射光学系
３０ 光検出器
３５ 磁界印加手段
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１ 検出用試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５７ 蛍光物質吸着エリア
５８、５９ 検出エリア
６０ 検出用キット
６３ 検出用標識溶液
ＢＦ、ＣＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｐ 放射光
Ｍｃ 金属被膜
Ｒ ブロッキング物質
ｒ 生体物質によるブロッキング剤
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートの一面に、該誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
前記センサ部に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識と該蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、前記センサ部上に結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
該増強した光電場により、前記蛍光標識を励起し、該励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、該複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ該複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用い、
前記センサ部に対する前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により該蛍光標識結合物質が前記センサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、前記第１の蛍光色素分子を含まずかつ前記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記ブロッキング物質が、少なくとも表面が前記透光材料と同等な材料により構成されている第２の粒子を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ブロッキング物質が、前記第２の粒子の表面に表面修飾されかつ前記特異的結合性を有さない修飾物質を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記第２の粒子が、前記第１の粒子の粒経よりも小さい粒径を有するものであることを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ブロッキング物質と前記蛍光標識結合物質とを同時に前記センサ部上に流下することを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記第２の粒子が、該第２の粒子内に、前記第１の蛍光色素分子が発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものであることを特徴とする請求項２から５いずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記第２の粒子が、該第２の粒子内に、蛍光を発する物質を含まないものであることを特徴とする請求項２から５いずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備える前記センサチップを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備えるも前記センサチップを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１から４、６から１１いずれかに記載の検出方法において前記センサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつ該センサ部の表面に前記ブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであることを特徴とする検出用試料セル。
【請求項１３】
前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定されているものを備えることを特徴とする請求項１２に記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記センサ部より上流側の前記流路内に配置された前記蛍光標識結合物質を備えることを特徴とする請求項１３に記載の検出用試料セル。
【請求項１５】
前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１２から１４いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１６】
請求項１から４、６から１１いずれかに記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつ該センサ部の表面に前記ブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１７】
請求項１から１１いずれかに記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質を含む標識用溶液、および
前記標識用溶液と同時もしくは前記標識用溶液の流下前に前記流路内に流下される、前記ブロッキング物質を含むブロッキング用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１８】
請求項５に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質と前記ブロッキング物質とを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１９】
前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１６から１８いずれかに記載の検出用キット。
【請求項１】
誘電体プレートの一面に、該誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
前記センサ部に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識と該蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、前記センサ部上に結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
該増強した光電場により、前記蛍光標識を励起し、該励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の第１の蛍光色素分子と、該複数の第１の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ該複数の第１の蛍光色素分子を包含する第１の粒子とから構成される蛍光物質を用い、
前記センサ部に対する前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により該蛍光標識結合物質が前記センサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、前記第１の蛍光色素分子を含まずかつ前記結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、前記蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記ブロッキング物質が、少なくとも表面が前記透光材料と同等な材料により構成されている第２の粒子を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ブロッキング物質が、前記第２の粒子の表面に表面修飾されかつ前記特異的結合性を有さない修飾物質を有するものであることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記第２の粒子が、前記第１の粒子の粒経よりも小さい粒径を有するものであることを特徴とする請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記ブロッキング物質と前記蛍光標識結合物質とを同時に前記センサ部上に流下することを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記第２の粒子が、該第２の粒子内に、前記第１の蛍光色素分子が発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する複数の第２の蛍光色素分子を有するものであることを特徴とする請求項２から５いずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記第２の粒子が、該第２の粒子内に、蛍光を発する物質を含まないものであることを特徴とする請求項２から５いずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備える前記センサチップを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備えるも前記センサチップを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
請求項１から４、６から１１いずれかに記載の検出方法において前記センサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつ該センサ部の表面に前記ブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであることを特徴とする検出用試料セル。
【請求項１３】
前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定されているものを備えることを特徴とする請求項１２に記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記センサ部より上流側の前記流路内に配置された前記蛍光標識結合物質を備えることを特徴とする請求項１３に記載の検出用試料セル。
【請求項１５】
前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１２から１４いずれかに記載の検出用試料セル。
【請求項１６】
請求項１から４、６から１１いずれかに記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなり、かつ該センサ部の表面に前記ブロッキング物質によるブロッキング処理を施されたものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１７】
請求項１から１１いずれかに記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質を含む標識用溶液、および
前記標識用溶液と同時もしくは前記標識用溶液の流下前に前記流路内に流下される、前記ブロッキング物質を含むブロッキング用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１８】
請求項５に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定された前記第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるものであり、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される、前記蛍光標識結合物質と前記ブロッキング物質とを含む標識用およびブロッキング用の兼用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。
【請求項１９】
前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１６から１８いずれかに記載の検出用キット。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１９】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１９】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【公開番号】特開２０１０−１１２７４８（Ｐ２０１０−１１２７４８Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８３３９５（Ｐ２００８−２８３３９５）
【出願日】平成２０年１１月４日（２００８．１１．４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月４日（２００８．１１．４）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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