歯周病治療用組成物
【課題】 歯周病治療用組成物、歯根膜誘導方法およびそれらに用いられるポリペプチド、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターおよび形質転換体を提供する。
【解決手段】 ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が歯根膜再生工程を制御する因子であることを同定した。これらのタンパク質を含む組成物、これらのタンパク質をコードする遺伝子が導入されている形質転換体を含む組成物、これらのタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換え発現ベクターにより、歯根膜を誘導することができる。その結果、歯周病によって崩壊した組織を修復することができる。
【解決手段】 ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が歯根膜再生工程を制御する因子であることを同定した。これらのタンパク質を含む組成物、これらのタンパク質をコードする遺伝子が導入されている形質転換体を含む組成物、これらのタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換え発現ベクターにより、歯根膜を誘導することができる。その結果、歯周病によって崩壊した組織を修復することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病治療用組成物およびそれに用いられるポリペプチド、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターおよび形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は口腔内常在菌により引き起こされる慢性炎症性疾患である。その病態は、加齢と共に進行する。そして病態が重度に進行した歯周病では、歯を支える歯周組織（歯根膜、歯槽骨、セメント質）は崩壊し、その結果、支持組織を失った歯は抜去される。厚生省歯科疾患実態調査では、５０歳以上の約５０％が歯周病に罹患しており、７５歳以上の高齢者にいたっては、７５％以上が歯牙喪失者であることが報告されている。さらに、歯周病による咀嚼機能喪失の喪失は、単に咀嚼機能の低下をまねくのみならず、全身の健康にも影響を及ぼすことが報告されている。したがって、歯周病再生医療が確立すれば、歯の寿命を延長することができるのみならず、高齢者のquality of lifeにも大きく貢献することが期待できる。
【０００３】
従来から、歯周病の治療には、病原菌に感染した部位を対症療法による手段で対処する方法が広く用いられている。しかしながら、歯周病は大きな組織崩壊を伴う疾患であるため、崩壊した組織の自然修復は難しく、治療後に組織を修復することが必要であった。そのため、従来からさまざまな組織修復方法が開発されてきた。
【０００４】
例えば、ゴアテックス膜もしくはポリ乳酸などの人工材料を用いた再生療法が開発され、一部の臨床ケースではその有効性が示されている（非特許文献１、２参照）。なお、上記人工材料を用いた再生療法の開発過程で、歯周組織修復過程の初期段階に、歯根膜再生工程が必須であることが報告された。その結果、歯根膜再生能力を有する生理活性物質が、歯周組織修復薬剤の候補として注目を集めるに至った。
【０００５】
このような状況下、生理活性物質と人工材料とを併用した歯周組織の再生療法も開発されている（非特許文献３、４参照）。この再生療法は、上記生理活性物質としてサイトカインや増殖因子などを用い、積極的に歯根膜再生工程を促進しようとするものである。具体的には、上記生理活性物質として、骨形成タンパク質であるＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）２、ＢＭＰ７、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が用いられている。これら生理活性物質の中で、ｂＦＧＦは、歯周組織修復能力が高いことが報告されている。
【０００６】
本発明者らが注目したＡＤＡＭＴＳＬ（a disintegrin-like and metalloprotease domain with thrombospondin type I motifs-like）遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ（a disintegrin-like and metalloprotease domain with thrombospondin type I motifs）ファミリーに属する新規遺伝子ファミリーであって、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する遺伝子に特徴的なprometaroprotease domainとdisintegrin-like domainとを欠く新規遺伝子ファミリーである。
【０００７】
現在までにマウスにおいては、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子として、ＡＤＡＭＴＳＬ１〜４遺伝子の4種類の遺伝子が知られている。また、ヒトにおいても、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子として、ＡＤＡＭＴＳＬ１〜３遺伝子の３種類の遺伝子が知られている。
【０００８】
これらＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子のうち、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ１遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ３遺伝子に関しては、ＣＯＳ−１細胞で強制発現すると、ＡＤＡＭＴＳＬ１タンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ３タンパク質が、細胞外に分泌され、しかも細胞接着を制御するｖｉｎｃｕｌｉｎと局在が一致することが確認されていた。このことから、上記タンパク質が細胞接着を制御する細胞外マトリックス因子であることが示唆されている（非特許文献５、６参照）。
【非特許文献１】Minabe M et al. J Periodontol Vol.62,No.3,p171-9(1991)
【非特許文献２】Bartold PM et al. Periodontol Vol.24,No.1,p253-269(2000)
【非特許文献３】Gestrelius S et al. Clin Oral Investig Vol.4,No.2,p120-5(2000)
【非特許文献４】Murakami S et al.J Periodontal Res Vol.38,No.1,p97-103(2003)
【非特許文献５】Hall NG et al. Matrix Biol. Nov;22(6):p501-10(2003)
【非特許文献６】Hirohata S et al. J Biol Chem. Apr5;277(14):12182-9(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の歯周病治療法では、歯周病に伴う組織崩壊を十分に修復することができなかった。
【００１０】
具体的には、上記従来の人工材料を用いる再生療法では、再生能力に限界があるため崩壊した組織を十分に再生することができないという問題を生じる。
【００１１】
また、上記従来の生理活性物質と人工材料とを併用した再生療法も、崩壊の小さな組織の修復には有効性を示すが、崩壊の大きな組織の修復には、十分な有効性を示すまでには至っていない。この原因としては、上記生理活性物質が、直接的ではなく間接的に歯根膜再生工程を誘導している可能性があげられる。つまり、上記生理活性物質は、歯根膜再生工程の一部を誘導するのみであって、その結果、軽度の歯周病には有効性を示すものの、重度の歯周病の再生誘導までには至らないことが示唆されている。
【００１２】
上記の理由から、より効果的な歯周組織修復方法を確立するためには、より広範に歯根膜再生工程を制御する因子を利用した組織工学的な治療方法の開発が必要になる。そのためには、歯根膜再生過程で歯根膜の原基である歯小嚢細胞を歯根膜細胞へ分化誘導する因子、あるいは歯根膜を構成する細胞外マトリックス因子の同定が必要である。そしてこれらの因子と生体吸収性材料とを組み合わせた組成物の開発によって、より効果的な歯周組織再生方法を確立することができる。しかしながら、現在まで、上記因子の同定には至っていなかった。
【００１３】
また、上述したＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子は、細胞外マトリックス因子であることが示唆されてはいたが、その詳細な機能は不明であった。このような状況下、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属するタンパク質が上記歯根膜再生工程を制御する因子に相当するものであることが実証されれば、これらタンパク質を歯周病治療に用いることができる。
【００１４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、歯根膜再生工程を制御する因子を同定するとともに、それを用いた歯周病治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質の機能を検討したところ、上記タンパク質が、歯周組織修復過程の初期に必須である歯根膜の再生を誘導することができることを見出した。さらに、本発明者は、今回、新たにヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングするとともに、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質も、歯根膜を誘導することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
即ち、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１７】
また、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１８】
さらに、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１９】
さらに、本発明の歯周病治療用組成物は、生体吸収材料を含むことが好ましい。
【００２０】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、上記歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことを特徴としている。
【００２１】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２２】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２３】
また、本発明のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドであることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２４】
また、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２５】
また、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかであることを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２６】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２７】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２８】
また、本発明の形質転換体は、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２９】
また、本発明の形質転換体は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の歯周病治療用組成物および歯根膜誘導方法を用いることにより、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができるという効果を奏する。
【００３１】
また、本発明の組織再生薬剤のスクリーニング方法を用いることにより、歯周病などによって崩壊した組織を再生することが可能な組織再生薬剤をスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【００３２】
また、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、歯根膜を誘導する機能を有するため、効率良く歯根膜を再生できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（１）歯周病治療用組成物
本発明は、歯周病などによって崩壊した組織を修復するための歯周病治療用組成物を提供する。
【００３５】
本発明者は、詳細な機能が解明されていなかったマウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が、歯周組織修復過程の初期に必須である歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。また、同様にヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質も、歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。したがって、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質もしくはマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、またはその一部を含むものであればよい。その結果、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。ここで、「歯根膜の再生を誘導する」とは、歯周病などによって失われた歯根膜を再び構築することを意味するが、それに限定されるものではなく、本来歯根膜が存在しなかった組織に、歯根膜を構築することをも意味する。また、本明細書中「歯根膜誘導活性」という表現は「歯根膜の再生を誘導する活性」の意味で使用される。
【００３６】
一実施形態において、本発明の歯周病治療用組成物は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを含むことが好ましい。また、他の実施形態において、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことが好ましい。また、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドまたは形質転換体を含むと同時に、生体吸収材料を併せて含んでもよい。本発明の歯周病治療用組成物中に含まれる上記ポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に関しては後述する。
【００３７】
また、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に加えて、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このキャリアは、薬学的に用いられ得る賦形剤および助剤を含む。本発明の歯周病治療用組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、上記歯周病治療用組成物の投与形態および剤型に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００３８】
本発明の歯周病治療用組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。また、本発明の歯周病治療用組成物が含む上記ポリペプチド、形質転換体、生体吸収材料および薬学的に受容可能なキャリアの各含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該歯周病治療用組成を用いて崩壊した組織を修復できるような量であれば特に限定されない。
【００３９】
また、本発明の歯周病治療用組成物の投与方法に関しては、歯周病によって崩壊した組織部位に当該歯周病治療用組成物を充填することができるものであればよく、特に限定されるものではない。
【００４０】
また、本発明の歯周病治療用組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法および当該歯周病治療用組成物の投与対象である患者の年齢、体重、症状などによって適宜設定されることができる。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回、または数回に分けて行ってもよい。また、１週、１ヶ月あるいは１年内において単回、または数回に分けて行ってもよく、本発明の歯周病治療用組成物の投与頻度は、特に限定されるものではない。
【００４１】
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に関して説明する。
【００４２】
（１−１）ポリペプチド
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドについて説明する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本実施形態のポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００４４】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを含むものであればよい。上記ポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドであることが好ましい。ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。なお、「その一部からなるポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントを意味する。当該フラグメントは歯根膜誘導活性を有するものであればよい。
【００４５】
例えば、上記フラグメントとは、ＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質のＰＬＡＣ（protease and lacunin）ドメインおよび／またはＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質のＮ末端領域のポリペプチドとを含むポリペプチドであることが好ましい。ここで上記ＰＬＡＣドメインとは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるポリペプチド中の、それぞれ９７５〜１００４位、６１５〜６４４位、９７５〜１００４位および６１５〜６４４位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、上記Ｎ末端領域のポリペプチドとは、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質に特異的な配列であって、配列番号２および配列番号６に示されるポリペプチド中の、それぞれ１〜３４８位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４６】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、上記ポリペプチドの変異体であって歯根膜誘導活性を有するものでもよい。このような変異体としては、配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００４７】
このような変異体は、人為的に作製されたものでもよく、天然に存在するものでもよい。当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００４８】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、天然の精製産物であってもよく、原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物であってもよい。また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、アミノ酸以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。さらに、本実施形態のポリペプチドはまた、組み換え技術などを用いて製造された場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４９】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００５０】
（１−２）形質転換体
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み換え発現ベクターに挿入し、当該組み換え発現ベクターを導入することによって作製される。なお、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターについては、後述する。
【００５１】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる細胞は、特に限定されるものではないが、適用対象動物と同一の動物種由来細胞であることが好ましい。例えば、ヒトを対象とする場合には、ヒト由来の各種培養細胞を好適に用いることができる。例えば、ヒト生体由来の細胞であって、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、骨芽細胞、歯根膜細胞、歯小嚢細胞、歯胚細胞、線維芽細胞を用いることが好ましい。
【００５２】
組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５３】
（１−２−１）ポリヌクレオチド
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドについて説明する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００５５】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体であってもよい。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。また、天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。このような変異体としては、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５６】
具体的には、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
であることが好ましい。ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡ、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡである。
【００５７】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００５８】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００５９】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６０】
あるいは、上記ポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、上記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６１】
本実施形態のポリヌクレオチドを取得するための供給源は、特に限定されるものではないが、ヒト歯根膜組織を好適に用いることができる。
【００６２】
（１−２−２）組み換え発現ベクター
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられる組み換え発現ベクターについて説明する。
【００６３】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる組み換え発現ベクターは、上述した歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＥＦ６（invitorgen社製）、ｐＳｅｃＴａｇ２（invitrogen社製）、ｐ３Ｘ ＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Sigma社製）など）が好ましい。例えば、上記ベクターに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組み換え発現ベクターなどが挙げられる。また、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いることもできる。組み換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００６４】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６５】
本発明の組み換え発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００６６】
組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００６７】
上記組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６８】
このように、上記組み換え発現ベクターは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターであればよいといえる。
【００６９】
（１−３）生体吸収材料
本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドまたは形質転換体を含むと同時に、生体吸収材料を併せて含むことが好ましい。以下に生体吸収材料について説明する。
【００７０】
生体吸収材料とは、生分解性および生体親和性という性質を有する物質を意味する。上記生体吸収材料には、ポリ乳酸化合物、ハイドロキシアパタイト、キトサン化合物、異種動物由来コラーゲンなどを含む。それゆえ、本発明の歯周病治療用組成物の構成成分として好適である。
【００７１】
本発明の歯周病治療用組成物に使用される生体吸収材料としては、有機材料として、例えば、乳酸、グリコール酸、ラクトンの重合体もしくは共重合体、コラーゲン、アルブミン、デキストラン、脂肪酸エチルエステル、ゼラチン、キチン、キトサン、フィブロイン等を挙げることが出来る。なお、天然由来材料も、抗原性の無い材料を用いることができる。
【００７２】
また、セラミックスとして、生体適合性および骨伝導性に優れたリン酸カルシウム系セラミックス材料を用いることができる。水酸化アパタイトセラミックス（ＨＡＰ）やβ−リン酸三カルシウムセラミックス（β−ＴＣＰ）は、その代表的な材料である。これらセラミックス材料は、公知の手法により作製することができる。以下、水酸化アパタイトセラミックスおよびβ−リン酸三カルシウムセラミックスを、それぞれＨＡＰおよびβ−ＴＣＰと称する。本発明で細胞浮遊液に添加される担体粉末は、担体であるセラミックスを公知の手法で粉砕することにより得ることができる。
【００７３】
ＨＡＰは、優れた骨伝導性を有し、骨組織と直接結合するが、非吸収性で長期的に生体内に残存してしまう。一方、β−ＴＣＰは、優れた骨伝導能を有し、骨組織と直接結合する上、骨組織中で経時的に吸収され、自家骨に置換されるという性質を有する。これらの材料は、骨補填の用途に応じて使い分けることが出来る。
【００７４】
特に、β−ＴＣＰは、生体適合性、骨形成に優れている上、生体吸収性にも優れ、骨欠損部などに充填する場合、経時的に自家骨に置換するという特徴を有する。そのため、本発明に使用されるリン酸カルシウム系セラミックス材料としては、β−ＴＣＰが最も好ましい。
【００７５】
β−ＴＣＰは、メカノケミカル法で作製したβ−ＴＣＰであって、気孔率５０〜９０％、連通する気孔径５０〜１０００μｍと５μｍ以下の気孔を有するものであることが好ましい。なお、β−ＴＣＰは、一般的に骨伝導能と生体吸収性の性質を併せ有するが、その合成プロセスによりその性能は左右され、メカノケミカル法により合成されたβ−ＴＣＰが最も骨補填材として優れている。
【００７６】
また、多孔質の気孔性状は、β−ＴＣＰ内部への細胞の進入などに寄与する５０〜１０００μｍの気孔と、生体内での吸収を効率良くさせる５μｍ以下の気孔とを有することが望ましい。
【００７７】
（２）歯根膜誘導方法
本発明は、歯根膜誘導方法を提供する。本発明の歯根膜誘導方法は、上述した歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程、または上述した組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むものであればよい。
【００７８】
本発明の歯根膜誘導方法は、上記充填工程または遺伝子導入工程によって歯周病罹患部位に歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを投与することができる。その結果、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。以下に充填工程および遺伝子導入工程について説明する。
【００７９】
（２−１）充填工程
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上記歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことが好ましい。
【００８０】
歯周病罹患部位は、患者によって様々な形状をなす。したがって、歯周病罹患部位へ充填される上記歯周病治療用組成物の形状および量は、特に限定されるものではなく、歯周病罹患部位の形状にあわせて、適宜変更すればよい。
【００８１】
また、上記歯周病治療用組成物を患部へ充填する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜用いることができる。公知の方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に直接塗布する方法、注射針を用いて罹患部位へ充填する方法、インプラント治療において、インプラント担体に治療用組成物を塗布したものを歯槽骨内に埋入する方法などを挙げることができる。また、本発明の歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位に塗布する場合、プロピレングリコールアルジネート（ＰＧＡ）、ゼラチンあるいはハイドロキシアパタイトを担体として用いることができる。
【００８２】
（２−２）遺伝子導入工程
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入した組み換え遺伝子発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことが好ましい。ここで用いる組み換え発現ベクターとしては、上述した組み換え発現ベクターを用いることができる。また、ベクターの導入方法に関しても特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８３】
また、上記組み換え遺伝子発現ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたは非ウイルスベクター等を用いて作製した組み換え発現ベクターを用いることもできる。これらベクターに、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することによって組み換え遺伝子発現ベクターを作製することができる。なお、上記非ウイルスベクターとしては、例えば、ＨＶＪ（センダイウイルス）エンベロープベクターなどを用いることができる。
【００８４】
上記レトロウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法は、特に限定されるものではない。例えば、Shimada等の方法（Shimada T et al. J Clin Invest. 1991 88(3):1043-1047 参照）を用いることができる。また、ウイルスを標的細胞に感染させる方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に注射液を注入することによって行うことができる。
【００８５】
また、上記アデノウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Engelhardt等の方法（Engelhardt JF et al. Nat Genet. 1993 4(1),27-34 参照）を用いることができる。また、ウイルスを標的細胞に感染させる方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に注射液を注入することによって行うことができる。
【００８６】
また、上記レンチウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Nakajima等の方法（Nakajima T et al. Hum Gene Ther. 11,1863-1874,2000）を用いることができる。
【００８７】
また、上記アデノ随伴ベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Muzyczka等の方法（Muzyczka N et al. Hum Gene Ther. Apr;16(4):408-416,2005）を用いることができる。
【００８８】
また、上記非ウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、および標的細胞への導入も、特に限定されるものではない。例えば、Nabel GJ等の方法（Nabel GJ et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 90(23):11307-11311 参照）、Kaneda等の方法（Kaneda Y et al. Exp Cell Res. 1987 Nov;173(1):56-69 参照）およびWellsの方法（Gene Ther. 2004 11(18):1363-1369 参照）を用いることができる。また、非ウイルスベクターを標的細胞に導入する場合には、例えば、リポソーム法、センダイウイルス膜エンベロープベクターを用いる方法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００８９】
また、歯周病罹患部位の細胞へ各ベクターが導入されたか否かを判定する方法としては、例えば、ベクターを導入してから所定の時間が経過したあと、歯周病罹患部位から組織を採取し、その組織を用いてウエスタンブロティング法、蛍光染色法、ノザンブロティング法などの公知の方法によって判定することができる。
【００９０】
（３）ポリペプチド
本発明者は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡと相同性の高いヒトｃＤＮＡをＮＣＢＩデータベースであるＢＬＡＳＴを用いて検索し、その配列に基づいて、ヒト歯根膜より精製したＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡをクローニングした。上記ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬβｃＤＮＡは、それぞれ配列番号１および配列番号３によって示される。また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質は、それぞれ配列番号２および配列番号４によって示される。
【００９１】
さらに本発明者は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が、歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の歯周病治療用組成物に含まれることによって、歯周病などによって崩壊した組織を再生することができる。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明のポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００９３】
本発明は、歯根膜を誘導することのできるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドである。ここで、配列番号２または配列弁号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。なお、「その一部からなるポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントを意味する。当該フラグメントは歯根膜誘導活性を有するものであればよい。
【００９４】
例えば、上記フラグメントとは、ＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質のＰＬＡＣ（protease and lacunin）ドメインおよび／またはＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質のＮ末端領域のポリペプチドとを含むポリペプチドであることが好ましい。ここで上記ＰＬＡＣドメインとは、配列番号２または配列番号４に示されるポリペプチド中の、それぞれ９７５〜１００４位および６１５〜６４４位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、上記Ｎ末端領域のポリペプチドとは、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質に特異的な配列であって、配列番号２に示されるポリペプチド中の、１〜３４８位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００９５】
また、本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドの変異体である。
【００９６】
即ち、本実施形態のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００９７】
上記（ｂ）に示されるポリペプチドは、上記（ａ）に示されるポリペプチドの変異体である。このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００９８】
ポリペプチドのアミノ酸配列中におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００９９】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明のポリペプチドの歯根膜誘導活性を変化させない。
【０１００】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中の１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１０１】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に見出され得る。
【０１０２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【０１０３】
また、本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、原核生物宿主および真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。また、本発明のポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、アミノ酸以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。さらに、本発明のポリペプチドはまた、組み換え技術などを用いて製造された場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【０１０４】
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。
【０１０５】
また、本発明のポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【０１０６】
また、本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドのような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明のポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【０１０７】
本実施形態のポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）を、当該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合ポリペプチドの簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合ポリペプチドは、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態のポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１０８】
このように、本発明のポリペプチドは、少なくとも、上記（ａ）または（ｂ）に示されるポリペプチドを含んでいればよいといえる。すなわち、上記（ａ）または（ｂ）に示されるポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１０９】
また、本発明の目的は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される歯根膜誘導活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１０】
（４）ポリヌクレオチド
本発明は、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１１３】
また本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【０１１４】
本発明はさらに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【０１１５】
このような変異体としては、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【０１１６】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下に示す（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【０１１８】
ここで、配列番号２または配列弁号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。
【０１１９】
また、他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、下記の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１２０】
ここで、配列番号１または配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡである。
【０１２１】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【０１２２】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【０１２３】
本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【０１２５】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドを取得するための供給源は、特に限定されるものではないが、ヒト歯根膜組織を用いることができる。
【０１２７】
本発明の目的は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１２８】
（５）組み換え発現ベクター
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを提供する。本発明のベクターを用いれば、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を作製することができる。上記形質転換体は、本発明の歯周病治療用組成物中に含まれてもよいし、本発明のポリヌクレオチドの精製原料として用いることもできる。
【０１２９】
本発明のベクターは、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＥＦ６（invitorgen社製）、ｐＳｅｃＴａｇ２（invitrogen社製）またはｐ３Ｘ ＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Sigma社製）など）を用いて作製されることが好ましい。また、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたは非ウイルスベクター等を用いて作製することもできる。例えば、上記ベクターに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組み換え発現ベクターなどが挙げられる。アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター等を用いれば、培養細胞のみならず、生体中で、本発明のポリペプチドを発現させることができる。例えば、歯周病罹患部位の細胞へ導入することによって、歯周病によって崩壊した組織を修復することができる。組み換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１３０】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１３１】
本発明の組み換え発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１３２】
本発明のベクターを用いて形質転換された宿主を培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のポリペプチドを回収、精製することができる。精製された上記ポリペプチドは、本発明の歯根膜誘導用組成物中に含まれ得る。また、本発明のベクターを用いて形質転換された形質転換体もまた、本発明の歯根膜誘導用組成物中に含まれ得る。あるいは、上記組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入することによって、歯根膜を誘導することができ、その結果、歯周病などによって崩壊した組織を再生することができる。
【０１３３】
組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１３４】
あるいは、本発明のポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用い、本発明のポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１３５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞）および各種ヒト培養細胞などが挙げられる。
【０１３６】
本発明の組み換え発現ベクターを培養細胞に導入した場合、当該細胞を本発明のポリペプチドの供給源として利用することができる。また、本発明の組み換え発現ベクターを、歯周病罹患部位の細胞に導入した場合には、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。
【０１３７】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１３８】
本発明のベクターを使用すれば、上記ポリペプチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中に歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【０１３９】
このように、本発明のベクターは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターであればよいといえる。
【０１４０】
つまり、本発明の目的は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１４１】
（６）形質転換体
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。上記形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されているので、本発明のポリペプチドを精製するための原材料として使用することができる。または、上記形質転換体を本発明の歯周病治療用組成物に混合し、当該歯周病治療用組成物を用いることによって、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。
【０１４２】
本発明の形質転換体に導入されるベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを導入すればよい。その場合に用いるベクターは、上述した本発明の組み換え発現ベクターを用いればよい。
【０１４３】
細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などが挙げられる。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。
【０１４４】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１４５】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、上述したようにマーカー遺伝子を有するので、マーカー遺伝子の発現を指標として、上記形質転換体を選択採取することができる。
【０１４６】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【０１４７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１４９】
〔実施例１：ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のクローニング〕
米国national institute of the health（ＮＩＨ）のＮＣＢＩデータベースであるＢＬＡＳＴを用いて、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子（配列番号５）およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子（配列番号７）に相同性の高いヒトｃＤＮＡの検索を試みた。
【０１５０】
まず、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子に相同性の高いヒト遺伝子をデータベース検索したところ、FLJ13710（weakly similar to F-SPONDIN PRECURSOR）およびFLJ16791（weakly similar to ADAM-TS 6 precursor）の二つのヒトｃＤＮＡが、登録されていることが判明した。上記二つのｃＤＮＡをつなぎ合わせたｃＤＮＡは、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子と相同性の高い遺伝子を含んでおり、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ遺伝子（ｃＤＮＡ）であると推測された。
【０１５１】
次に、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子に相同性の高いヒト遺伝子をデータベース検索したところ、DFKZp686A1457およびFLJ13710（weakly similar to F-SPONDIN PRECURSOR）の二つのヒトｃＤＮＡが、登録されていることが判明した。このうちFLJ13710は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のオルソログであることが判明した。一方、DFKZp686A1457は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子中の５８６番目のチミジンが欠損しているため、アミノ酸配列のまったく異なる蛋白質をコードしているものと推量された。
【０１５２】
データベース上で同定されたヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のｃＤＮＡ配列を確認するために、同遺伝子の５’末端側および３’末端側に相当するプライマーを設計し、ヒト歯根膜より精製したＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングした。
【０１５３】
ヒトＡＤＭＴＳＬ４α遺伝子をクローニングする場合、ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて３分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行った。また、ヒトＡＤＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングする場合、ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行った。
【０１５４】
以下に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーを示す。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、制限酵素認識配列（NotI認識配列またはBamHI認識配列）を有している。
【０１５５】
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子をクローニングするためのプライマーとしては、
５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１５）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１６）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１５６】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングするためのプライマーとしては、
５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１７）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１８）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１５７】
得られたＰＣＲ産物をNotIおよびBamHIで消化後、ｐＣＭＶ１４（Sigma社製）にサブクローニングした。その後、業者の定める方法に従い、ＣＥＱ２００ＸＬ（Beckman Coulter社製）を用いてＤＮＡ配列を確認した。ＤＮＡ配列を確認したところ、データベース上で確認された配列と同一であった。
【０１５８】
〔実施例２：マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在〕
生後４週のマウス下顎臼歯を採取し、川本テープ法（Kawamoto T. J Histochem Cytochem, 38(12),1805-1814,1990参照）に従い凍結標本を作製後、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０（Leica社製）を用いて厚さ５μｍの非脱灰凍結切片を作製した。まず、凍結切片を、１０％ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングした後に抗ＡＤＡＭＴＳＬ４抗体であるＲ１−１抗体と反応させた。
【０１５９】
なお、上記Ｒ１−１抗体は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質に共通して存在するspacer regionに対する組み換えタンパク質を作製し、当該組み換えタンパク質をウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体である。なお、上記spacer regionは、配列番号２および配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの４１２位〜５２５位のポリペプチドである。また、配列番号４および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの５２位〜１６８位のポリペプチドである。したがって、上記Ｒ１−１抗体は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質のいずれをも検出することのできる抗体である。
【０１６０】
次いで、リン酸緩衝液で洗浄した後、上記凍結切片を抗ウサギ２次抗体であるalexa488 anti-rabbit secondary antibody（Invitrogen社製）と反応させた。その後、リン酸緩衝液にて洗浄し、ＩＸ７１蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて観察した。またオキシタラン線維を染色するため、同じく生後４週のマウス下顎臼歯を採取し、蟻酸を用いて脱灰した後にパラフィン包埋し、厚さ５μｍの標本を作製した。その後、１０％ｏｘｓｏｎ（Merck社製）を用いて酸化処理を施した後に、酸性フクシン溶液で染色した。
【０１６１】
図１（ａ）にマウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の免疫染色像を示し、図１（ｂ）にフクシン染色像（オキシタラン繊維が染色される）を示した。図１（ａ）および（ｂ）から明らかなように、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質はオキシタラン繊維と同じ局在を示した。以上の結果から、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質は、オキシタラン繊維の構成成分であることが明らかとなった。
【０１６２】
〔実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現解析〕
ヒト歯根膜組織は、神奈川歯科大学倫理委員会の定めたプロトコールに従い同意を得られた患者から抜歯した歯の歯根中央部分から採取した。ヒト歯根膜細胞の採取には、得られた歯根膜組織片を培養皿上でカバースリップで固定後、７２時間後に組織片よりoutgrowthしてきた細胞を継代培養した。尚、培地はDulbecco's Modified Eagle's Medium に１０％ウシ胎児血清を含むものを調整し使用した。
【０１６３】
次いで、上記ヒト歯根膜培養細胞およびヒト歯根膜組織から、Isogen（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、M-MLV reverse transcriptase（Invitrogen社製）およびランダムプライマー（Takara社製）を用いて、１μｇの上記Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで下記のプライマーおよびEX taq polymerase（Takara社製）を用いたＰＣＲ法によって、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現の有無を検討した。
【０１６４】
上記ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを２５サイクル行った。なお、以下に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーを示す。
【０１６５】
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子の発現を特異的に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号９）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６６】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現を特異的に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１２）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６７】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現を同時に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号１３）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１４）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６８】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動した。そして、電気泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムによって染色し、バンドを確認した。
【０１６９】
図２に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２では、上から順に、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子、並びにＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示している。図２から明らかなように、ヒト歯根細胞およびヒト歯根膜組織は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の両方を発現していることが判明した。
【０１７０】
〔実施例４：ヒト歯根膜におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在〕
神奈川歯科大学の倫理委員会に承認されたプロトコールに従い、同意の得られた患者よりヒト智歯を抜歯後、川本テープ法に従いヒト智歯の凍結標本を作製した。その後、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０を用いて、上記凍結標本から、厚さ５μｍの非脱灰凍結切片を作製した。上記凍結切片に対して、１０％ヤギ血清を用い、１時間のブロッキング処理を行った。ブロッキングの後、抗ＡＤＡＭＴＳＬ４抗体であるＲ１−１抗体と反応させた。このとき、対照実験として、Ｒ１−１抗体の代わりに、正常ウサギ血清と反応させる凍結切片を用意した。
【０１７１】
Ｒ１−１抗体と反応させた後、リン酸緩衝液を用いて洗浄した。洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識した抗ウサギ二次抗体（Dako enbision system labeled polymer社製）と反応させ、その後、再びリン酸緩衝液によって洗浄した。洗浄後、diaminobenzidine（ＤＡＢ）を用いて可視化した。
【０１７２】
図３（ａ）および（ｂ）は、Ｒ１−１抗体を用いて染色したときの染色像を示す。また、図３（ｃ）および（ｄ）は、対照実験として正常ウサギ血清を用いて染色したときの染色像を示す。ここで図３（ｂ）は、図３（ａ）を拡大した染色像であって、図３（ｄ）は、図３（ｃ）を拡大した染色像である。図３（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質は、象牙質やセメント質中には局在せず、ヒト歯根膜中に弾性繊維状の構造物として局在することが明らかとなった。
【０１７３】
〔実施例５：マウス歯小嚢細胞による、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を含む歯根膜様構造物の形成〕
マウス歯小嚢細胞（将来歯根膜になる細胞）を生後1日齢のマウス切歯根尖部分より採取した。採取した細胞は、ウシ胎児血清（最終濃度１０％）、アスコルビン酸（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（最終濃度１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）およびペニシリン（最終濃度１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ培地（Sigma社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。その後、上記マウス歯小嚢細胞を、ヒトパピローマウイルスＥ６のＰＤＺドメイン欠失変異体を用いて形質転換し、その結果、安定した不死化細胞を得ることができた。なお、上記不死化細胞を作製するにあたっては、Kiyonoらの方法（Kiyono T et al, Nature. 1998 Nov 5;396(6706):84-88）に従った。
【０１７４】
次に、１ｍｌのＭＥＭ培地に対して１×１０６個の上記不死化細胞を懸濁し、生分解性ハイドロキシアパタイト（β−ＴＣＰ：osferion、オリンパス社製）の存在下で９０分間の培養を行った。その後、上記不死化細胞と生分解性ハイドロキシアパタイトとの混合物をマウスフィブリン粉（マウス fibrinogen とマウスthrombinの混合物、Sigma社製）によって固め、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。移植して１ヶ月後に移植片を取り出し、川本テープ法に従い凍結標本を作製した。当該凍結標本について、上述の実施例２に記載の方法と同様の方法でＲ１−１抗体を用いて免疫染色を行った。
【０１７５】
図４に、移植片の免疫染色像を示す。図４から明らかなように、マウス歯小嚢細胞は歯根膜細胞へ分化し、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質陽性の歯根膜弾性線維を形成することが確認された。
【０１７６】
〔実施例６：ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質の過剰発現による歯根膜の形成〕
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡをそれぞれレトロウイルスベクターであるｐＣＸＳＨ（Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照）に組み込み、２９３ＦＴ細胞を用いてＶ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスを作製した。ここで、Ｖ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスとは、vesicular stomatitis virus由来のG proteinを有し、かつpseudotype virusのエンベロ−プを有する感染効率の高いレトロウイルスである。なお、上記ウイルスを作製するにあたっては、Saito等の方法（Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照）に従った。
【０１７７】
また、対照実験に用いるために、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡを組み込まないｐＣＸＳＨ（コントロールベクター）と２９３ＦＴ細胞とを用いてＶ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスを作製した。
【０１７８】
次に、ポリブレン（Sigma社製）を６μｇ／ｍｌの濃度で含むＤＭＥＭ培地（Sigma社製）中で培養し、２０％コンフルエントに増殖したヒト骨肉種細胞（ＭＧ６３細胞）に、
各ウイルスをそれぞれ感染させ、遺伝子導入を行った。上記レトロウイルスベクターは、マーカー遺伝子としてハイグロマイシン遺伝子を備えているので、ハイグロマイシンを５００μｇ／ｍｌの濃度で含むＤＭＥＭ培地中で、それぞれのレトロウイルスベクターが導入されたＭＧ６３細胞を選択した。
【０１７９】
次に、上述の実施例５と同様の方法で移植実験を行った。すなわち、１ｍｌのＭＥＭ培地に対して、１×１０６個の上記各ウイルスベクター導入細胞をそれぞれ懸濁し、生分解性ハイドロキシアパタイトの存在下で９０分間の培養を行った。その後、各細胞と生分解性ハイドロキシアパタイトとの混合物をマウスフィブリン粉で固め、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。また、対照として、生分解性ハイドロキシアパタイトのみをマウスフィブリン粉によって固めたものを、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。
【０１８０】
上記組成物を移植して１ヶ月後に移植片を取り出し、川本テープ法に従い凍結標本を作製した。免疫染色を行った。当該凍結標本について、上述の実施例２と同様の方法でＲ１−１抗体を用いて免疫染色を行った。
【０１８１】
また、移植片がドナー由来であるか確認するために、抗ヒトvimentin抗体であるＶ９抗体（Dako、Carpinteria社製）を用いた免疫染色を同時に行った。免疫染色は、Ｍ．Ｏ．Ｍ． ｋｉｔ（Vector、Burlingame社製）を用い、使用説明書に従って行った。
【０１８２】
解析の結果を図５（ａ）〜（ｈ）に示す。図５（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β導入細胞、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のみを移植した移植片を、Ｒ１−１抗体を用いて免疫染色を行った染色像を示す。また、図５（ｅ）〜（ｈ）はそれぞれ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β導入細胞、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のみを移植した移植片を、抗ヒトvimentin抗体を用いて免疫染色を行った染色像を示す。
【０１８３】
図５（ｅ）〜（ｈ）から明らかなように、各移植片にはヒト由来組織が含まれていた。
図５（ａ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞を移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。また、図５（ｂ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β組成物を移植した場合にも、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。一方、図５（ｃ）および（ｄ）から明らかなように、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイトのみを移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察されなかった。
【０１８４】
これらの結果から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質は、歯根膜中のオキシタラン線維の形成に関わる細胞外マトリックス因子であり、これらの分子を用いて人工歯根膜シートの形成が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
本発明は、歯周病治療用組成物を提供するものであり、医薬品産業、医療機器産業などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】実施例において、マウス下顎臼歯のマウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を染色した染色像である。
【図２】実施例において、ヒト歯根膜細胞およびヒト歯根膜組織におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果を示す電気泳動の画像である。
【図３】実施例において、ヒト歯根膜におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在を示した染色像である。
【図４】実施例において、マウス歯小嚢細胞による、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を含む歯根膜様構造物の形成を示す染色像である。
【図５】実施例において、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の過剰発現による歯根膜の形成を示す染色像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病治療用組成物およびそれに用いられるポリペプチド、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターおよび形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は口腔内常在菌により引き起こされる慢性炎症性疾患である。その病態は、加齢と共に進行する。そして病態が重度に進行した歯周病では、歯を支える歯周組織（歯根膜、歯槽骨、セメント質）は崩壊し、その結果、支持組織を失った歯は抜去される。厚生省歯科疾患実態調査では、５０歳以上の約５０％が歯周病に罹患しており、７５歳以上の高齢者にいたっては、７５％以上が歯牙喪失者であることが報告されている。さらに、歯周病による咀嚼機能喪失の喪失は、単に咀嚼機能の低下をまねくのみならず、全身の健康にも影響を及ぼすことが報告されている。したがって、歯周病再生医療が確立すれば、歯の寿命を延長することができるのみならず、高齢者のquality of lifeにも大きく貢献することが期待できる。
【０００３】
従来から、歯周病の治療には、病原菌に感染した部位を対症療法による手段で対処する方法が広く用いられている。しかしながら、歯周病は大きな組織崩壊を伴う疾患であるため、崩壊した組織の自然修復は難しく、治療後に組織を修復することが必要であった。そのため、従来からさまざまな組織修復方法が開発されてきた。
【０００４】
例えば、ゴアテックス膜もしくはポリ乳酸などの人工材料を用いた再生療法が開発され、一部の臨床ケースではその有効性が示されている（非特許文献１、２参照）。なお、上記人工材料を用いた再生療法の開発過程で、歯周組織修復過程の初期段階に、歯根膜再生工程が必須であることが報告された。その結果、歯根膜再生能力を有する生理活性物質が、歯周組織修復薬剤の候補として注目を集めるに至った。
【０００５】
このような状況下、生理活性物質と人工材料とを併用した歯周組織の再生療法も開発されている（非特許文献３、４参照）。この再生療法は、上記生理活性物質としてサイトカインや増殖因子などを用い、積極的に歯根膜再生工程を促進しようとするものである。具体的には、上記生理活性物質として、骨形成タンパク質であるＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）２、ＢＭＰ７、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が用いられている。これら生理活性物質の中で、ｂＦＧＦは、歯周組織修復能力が高いことが報告されている。
【０００６】
本発明者らが注目したＡＤＡＭＴＳＬ（a disintegrin-like and metalloprotease domain with thrombospondin type I motifs-like）遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ（a disintegrin-like and metalloprotease domain with thrombospondin type I motifs）ファミリーに属する新規遺伝子ファミリーであって、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する遺伝子に特徴的なprometaroprotease domainとdisintegrin-like domainとを欠く新規遺伝子ファミリーである。
【０００７】
現在までにマウスにおいては、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子として、ＡＤＡＭＴＳＬ１〜４遺伝子の4種類の遺伝子が知られている。また、ヒトにおいても、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子として、ＡＤＡＭＴＳＬ１〜３遺伝子の３種類の遺伝子が知られている。
【０００８】
これらＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子のうち、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ１遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ３遺伝子に関しては、ＣＯＳ−１細胞で強制発現すると、ＡＤＡＭＴＳＬ１タンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ３タンパク質が、細胞外に分泌され、しかも細胞接着を制御するｖｉｎｃｕｌｉｎと局在が一致することが確認されていた。このことから、上記タンパク質が細胞接着を制御する細胞外マトリックス因子であることが示唆されている（非特許文献５、６参照）。
【非特許文献１】Minabe M et al. J Periodontol Vol.62,No.3,p171-9(1991)
【非特許文献２】Bartold PM et al. Periodontol Vol.24,No.1,p253-269(2000)
【非特許文献３】Gestrelius S et al. Clin Oral Investig Vol.4,No.2,p120-5(2000)
【非特許文献４】Murakami S et al.J Periodontal Res Vol.38,No.1,p97-103(2003)
【非特許文献５】Hall NG et al. Matrix Biol. Nov;22(6):p501-10(2003)
【非特許文献６】Hirohata S et al. J Biol Chem. Apr5;277(14):12182-9(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の歯周病治療法では、歯周病に伴う組織崩壊を十分に修復することができなかった。
【００１０】
具体的には、上記従来の人工材料を用いる再生療法では、再生能力に限界があるため崩壊した組織を十分に再生することができないという問題を生じる。
【００１１】
また、上記従来の生理活性物質と人工材料とを併用した再生療法も、崩壊の小さな組織の修復には有効性を示すが、崩壊の大きな組織の修復には、十分な有効性を示すまでには至っていない。この原因としては、上記生理活性物質が、直接的ではなく間接的に歯根膜再生工程を誘導している可能性があげられる。つまり、上記生理活性物質は、歯根膜再生工程の一部を誘導するのみであって、その結果、軽度の歯周病には有効性を示すものの、重度の歯周病の再生誘導までには至らないことが示唆されている。
【００１２】
上記の理由から、より効果的な歯周組織修復方法を確立するためには、より広範に歯根膜再生工程を制御する因子を利用した組織工学的な治療方法の開発が必要になる。そのためには、歯根膜再生過程で歯根膜の原基である歯小嚢細胞を歯根膜細胞へ分化誘導する因子、あるいは歯根膜を構成する細胞外マトリックス因子の同定が必要である。そしてこれらの因子と生体吸収性材料とを組み合わせた組成物の開発によって、より効果的な歯周組織再生方法を確立することができる。しかしながら、現在まで、上記因子の同定には至っていなかった。
【００１３】
また、上述したＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属する遺伝子は、細胞外マトリックス因子であることが示唆されてはいたが、その詳細な機能は不明であった。このような状況下、ＡＤＡＭＴＳＬファミリーに属するタンパク質が上記歯根膜再生工程を制御する因子に相当するものであることが実証されれば、これらタンパク質を歯周病治療に用いることができる。
【００１４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、歯根膜再生工程を制御する因子を同定するとともに、それを用いた歯周病治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質の機能を検討したところ、上記タンパク質が、歯周組織修復過程の初期に必須である歯根膜の再生を誘導することができることを見出した。さらに、本発明者は、今回、新たにヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングするとともに、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質も、歯根膜を誘導することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
即ち、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１７】
また、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１８】
さらに、本発明の歯周病治療用組成物は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１９】
さらに、本発明の歯周病治療用組成物は、生体吸収材料を含むことが好ましい。
【００２０】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、上記歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことを特徴としている。
【００２１】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２２】
また、本発明の歯根膜誘導方法は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２３】
また、本発明のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドであることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２４】
また、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２５】
また、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかであることを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２６】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２７】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２８】
また、本発明の形質転換体は、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【００２９】
また、本発明の形質転換体は、以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の歯周病治療用組成物および歯根膜誘導方法を用いることにより、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができるという効果を奏する。
【００３１】
また、本発明の組織再生薬剤のスクリーニング方法を用いることにより、歯周病などによって崩壊した組織を再生することが可能な組織再生薬剤をスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【００３２】
また、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、歯根膜を誘導する機能を有するため、効率良く歯根膜を再生できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
（１）歯周病治療用組成物
本発明は、歯周病などによって崩壊した組織を修復するための歯周病治療用組成物を提供する。
【００３５】
本発明者は、詳細な機能が解明されていなかったマウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が、歯周組織修復過程の初期に必須である歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。また、同様にヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質も、歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。したがって、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質もしくはマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、またはその一部を含むものであればよい。その結果、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。ここで、「歯根膜の再生を誘導する」とは、歯周病などによって失われた歯根膜を再び構築することを意味するが、それに限定されるものではなく、本来歯根膜が存在しなかった組織に、歯根膜を構築することをも意味する。また、本明細書中「歯根膜誘導活性」という表現は「歯根膜の再生を誘導する活性」の意味で使用される。
【００３６】
一実施形態において、本発明の歯周病治療用組成物は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを含むことが好ましい。また、他の実施形態において、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含むことが好ましい。また、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドまたは形質転換体を含むと同時に、生体吸収材料を併せて含んでもよい。本発明の歯周病治療用組成物中に含まれる上記ポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に関しては後述する。
【００３７】
また、本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に加えて、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。このキャリアは、薬学的に用いられ得る賦形剤および助剤を含む。本発明の歯周病治療用組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、上記歯周病治療用組成物の投与形態および剤型に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００３８】
本発明の歯周病治療用組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。また、本発明の歯周病治療用組成物が含む上記ポリペプチド、形質転換体、生体吸収材料および薬学的に受容可能なキャリアの各含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該歯周病治療用組成を用いて崩壊した組織を修復できるような量であれば特に限定されない。
【００３９】
また、本発明の歯周病治療用組成物の投与方法に関しては、歯周病によって崩壊した組織部位に当該歯周病治療用組成物を充填することができるものであればよく、特に限定されるものではない。
【００４０】
また、本発明の歯周病治療用組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法および当該歯周病治療用組成物の投与対象である患者の年齢、体重、症状などによって適宜設定されることができる。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回、または数回に分けて行ってもよい。また、１週、１ヶ月あるいは１年内において単回、または数回に分けて行ってもよく、本発明の歯周病治療用組成物の投与頻度は、特に限定されるものではない。
【００４１】
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチド、形質転換体および生体吸収材料に関して説明する。
【００４２】
（１−１）ポリペプチド
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドについて説明する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本実施形態のポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００４４】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを含むものであればよい。上記ポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドであることが好ましい。ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。なお、「その一部からなるポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントを意味する。当該フラグメントは歯根膜誘導活性を有するものであればよい。
【００４５】
例えば、上記フラグメントとは、ＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質のＰＬＡＣ（protease and lacunin）ドメインおよび／またはＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質のＮ末端領域のポリペプチドとを含むポリペプチドであることが好ましい。ここで上記ＰＬＡＣドメインとは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるポリペプチド中の、それぞれ９７５〜１００４位、６１５〜６４４位、９７５〜１００４位および６１５〜６４４位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、上記Ｎ末端領域のポリペプチドとは、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質に特異的な配列であって、配列番号２および配列番号６に示されるポリペプチド中の、それぞれ１〜３４８位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４６】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、上記ポリペプチドの変異体であって歯根膜誘導活性を有するものでもよい。このような変異体としては、配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００４７】
このような変異体は、人為的に作製されたものでもよく、天然に存在するものでもよい。当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００４８】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、天然の精製産物であってもよく、原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物であってもよい。また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、アミノ酸以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。さらに、本実施形態のポリペプチドはまた、組み換え技術などを用いて製造された場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４９】
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれるポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００５０】
（１−２）形質転換体
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み換え発現ベクターに挿入し、当該組み換え発現ベクターを導入することによって作製される。なお、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる、ポリヌクレオチド、組み換え発現ベクターについては、後述する。
【００５１】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる細胞は、特に限定されるものではないが、適用対象動物と同一の動物種由来細胞であることが好ましい。例えば、ヒトを対象とする場合には、ヒト由来の各種培養細胞を好適に用いることができる。例えば、ヒト生体由来の細胞であって、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、骨芽細胞、歯根膜細胞、歯小嚢細胞、歯胚細胞、線維芽細胞を用いることが好ましい。
【００５２】
組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５３】
（１−２−１）ポリヌクレオチド
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドについて説明する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００５５】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体であってもよい。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。また、天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。このような変異体としては、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【００５６】
具体的には、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられるポリヌクレオチドは、
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
であることが好ましい。ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡ、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡである。
【００５７】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００５８】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。
【００５９】
上記ポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６０】
あるいは、上記ポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、上記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６１】
本実施形態のポリヌクレオチドを取得するための供給源は、特に限定されるものではないが、ヒト歯根膜組織を好適に用いることができる。
【００６２】
（１−２−２）組み換え発現ベクター
以下に、本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いられる組み換え発現ベクターについて説明する。
【００６３】
本発明の歯周病治療用組成物に含まれる形質転換体を作製するために用いる組み換え発現ベクターは、上述した歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＥＦ６（invitorgen社製）、ｐＳｅｃＴａｇ２（invitrogen社製）、ｐ３Ｘ ＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Sigma社製）など）が好ましい。例えば、上記ベクターに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組み換え発現ベクターなどが挙げられる。また、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いることもできる。組み換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００６４】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６５】
本発明の組み換え発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００６６】
組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００６７】
上記組み換え発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６８】
このように、上記組み換え発現ベクターは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターであればよいといえる。
【００６９】
（１−３）生体吸収材料
本発明の歯周病治療用組成物は、上記ポリペプチドまたは形質転換体を含むと同時に、生体吸収材料を併せて含むことが好ましい。以下に生体吸収材料について説明する。
【００７０】
生体吸収材料とは、生分解性および生体親和性という性質を有する物質を意味する。上記生体吸収材料には、ポリ乳酸化合物、ハイドロキシアパタイト、キトサン化合物、異種動物由来コラーゲンなどを含む。それゆえ、本発明の歯周病治療用組成物の構成成分として好適である。
【００７１】
本発明の歯周病治療用組成物に使用される生体吸収材料としては、有機材料として、例えば、乳酸、グリコール酸、ラクトンの重合体もしくは共重合体、コラーゲン、アルブミン、デキストラン、脂肪酸エチルエステル、ゼラチン、キチン、キトサン、フィブロイン等を挙げることが出来る。なお、天然由来材料も、抗原性の無い材料を用いることができる。
【００７２】
また、セラミックスとして、生体適合性および骨伝導性に優れたリン酸カルシウム系セラミックス材料を用いることができる。水酸化アパタイトセラミックス（ＨＡＰ）やβ−リン酸三カルシウムセラミックス（β−ＴＣＰ）は、その代表的な材料である。これらセラミックス材料は、公知の手法により作製することができる。以下、水酸化アパタイトセラミックスおよびβ−リン酸三カルシウムセラミックスを、それぞれＨＡＰおよびβ−ＴＣＰと称する。本発明で細胞浮遊液に添加される担体粉末は、担体であるセラミックスを公知の手法で粉砕することにより得ることができる。
【００７３】
ＨＡＰは、優れた骨伝導性を有し、骨組織と直接結合するが、非吸収性で長期的に生体内に残存してしまう。一方、β−ＴＣＰは、優れた骨伝導能を有し、骨組織と直接結合する上、骨組織中で経時的に吸収され、自家骨に置換されるという性質を有する。これらの材料は、骨補填の用途に応じて使い分けることが出来る。
【００７４】
特に、β−ＴＣＰは、生体適合性、骨形成に優れている上、生体吸収性にも優れ、骨欠損部などに充填する場合、経時的に自家骨に置換するという特徴を有する。そのため、本発明に使用されるリン酸カルシウム系セラミックス材料としては、β−ＴＣＰが最も好ましい。
【００７５】
β−ＴＣＰは、メカノケミカル法で作製したβ−ＴＣＰであって、気孔率５０〜９０％、連通する気孔径５０〜１０００μｍと５μｍ以下の気孔を有するものであることが好ましい。なお、β−ＴＣＰは、一般的に骨伝導能と生体吸収性の性質を併せ有するが、その合成プロセスによりその性能は左右され、メカノケミカル法により合成されたβ−ＴＣＰが最も骨補填材として優れている。
【００７６】
また、多孔質の気孔性状は、β−ＴＣＰ内部への細胞の進入などに寄与する５０〜１０００μｍの気孔と、生体内での吸収を効率良くさせる５μｍ以下の気孔とを有することが望ましい。
【００７７】
（２）歯根膜誘導方法
本発明は、歯根膜誘導方法を提供する。本発明の歯根膜誘導方法は、上述した歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程、または上述した組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むものであればよい。
【００７８】
本発明の歯根膜誘導方法は、上記充填工程または遺伝子導入工程によって歯周病罹患部位に歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを投与することができる。その結果、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。以下に充填工程および遺伝子導入工程について説明する。
【００７９】
（２−１）充填工程
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上記歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことが好ましい。
【００８０】
歯周病罹患部位は、患者によって様々な形状をなす。したがって、歯周病罹患部位へ充填される上記歯周病治療用組成物の形状および量は、特に限定されるものではなく、歯周病罹患部位の形状にあわせて、適宜変更すればよい。
【００８１】
また、上記歯周病治療用組成物を患部へ充填する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜用いることができる。公知の方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に直接塗布する方法、注射針を用いて罹患部位へ充填する方法、インプラント治療において、インプラント担体に治療用組成物を塗布したものを歯槽骨内に埋入する方法などを挙げることができる。また、本発明の歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位に塗布する場合、プロピレングリコールアルジネート（ＰＧＡ）、ゼラチンあるいはハイドロキシアパタイトを担体として用いることができる。
【００８２】
（２−２）遺伝子導入工程
本実施形態の歯根膜誘導方法は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入した組み換え遺伝子発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことが好ましい。ここで用いる組み換え発現ベクターとしては、上述した組み換え発現ベクターを用いることができる。また、ベクターの導入方法に関しても特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８３】
また、上記組み換え遺伝子発現ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたは非ウイルスベクター等を用いて作製した組み換え発現ベクターを用いることもできる。これらベクターに、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することによって組み換え遺伝子発現ベクターを作製することができる。なお、上記非ウイルスベクターとしては、例えば、ＨＶＪ（センダイウイルス）エンベロープベクターなどを用いることができる。
【００８４】
上記レトロウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法は、特に限定されるものではない。例えば、Shimada等の方法（Shimada T et al. J Clin Invest. 1991 88(3):1043-1047 参照）を用いることができる。また、ウイルスを標的細胞に感染させる方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に注射液を注入することによって行うことができる。
【００８５】
また、上記アデノウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Engelhardt等の方法（Engelhardt JF et al. Nat Genet. 1993 4(1),27-34 参照）を用いることができる。また、ウイルスを標的細胞に感染させる方法としては、例えば、歯周外科手術時に歯周病罹患部位に注射液を注入することによって行うことができる。
【００８６】
また、上記レンチウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Nakajima等の方法（Nakajima T et al. Hum Gene Ther. 11,1863-1874,2000）を用いることができる。
【００８７】
また、上記アデノ随伴ベクターの作製、ウイルスの作製、およびウイルスの標的細胞への感染方法も、特に限定されるものではない。例えば、Muzyczka等の方法（Muzyczka N et al. Hum Gene Ther. Apr;16(4):408-416,2005）を用いることができる。
【００８８】
また、上記非ウイルスベクターの作製、ウイルスの作製、および標的細胞への導入も、特に限定されるものではない。例えば、Nabel GJ等の方法（Nabel GJ et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 90(23):11307-11311 参照）、Kaneda等の方法（Kaneda Y et al. Exp Cell Res. 1987 Nov;173(1):56-69 参照）およびWellsの方法（Gene Ther. 2004 11(18):1363-1369 参照）を用いることができる。また、非ウイルスベクターを標的細胞に導入する場合には、例えば、リポソーム法、センダイウイルス膜エンベロープベクターを用いる方法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００８９】
また、歯周病罹患部位の細胞へ各ベクターが導入されたか否かを判定する方法としては、例えば、ベクターを導入してから所定の時間が経過したあと、歯周病罹患部位から組織を採取し、その組織を用いてウエスタンブロティング法、蛍光染色法、ノザンブロティング法などの公知の方法によって判定することができる。
【００９０】
（３）ポリペプチド
本発明者は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡと相同性の高いヒトｃＤＮＡをＮＣＢＩデータベースであるＢＬＡＳＴを用いて検索し、その配列に基づいて、ヒト歯根膜より精製したＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡをクローニングした。上記ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬβｃＤＮＡは、それぞれ配列番号１および配列番号３によって示される。また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質は、それぞれ配列番号２および配列番号４によって示される。
【００９１】
さらに本発明者は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質が、歯根膜の再生を誘導することができることを見出した（後述の実施例参照）。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の歯周病治療用組成物に含まれることによって、歯周病などによって崩壊した組織を再生することができる。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明のポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。
【００９３】
本発明は、歯根膜を誘導することのできるポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドである。ここで、配列番号２または配列弁号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。なお、「その一部からなるポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントを意味する。当該フラグメントは歯根膜誘導活性を有するものであればよい。
【００９４】
例えば、上記フラグメントとは、ＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質のＰＬＡＣ（protease and lacunin）ドメインおよび／またはＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質のＮ末端領域のポリペプチドとを含むポリペプチドであることが好ましい。ここで上記ＰＬＡＣドメインとは、配列番号２または配列番号４に示されるポリペプチド中の、それぞれ９７５〜１００４位および６１５〜６４４位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、上記Ｎ末端領域のポリペプチドとは、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質に特異的な配列であって、配列番号２に示されるポリペプチド中の、１〜３４８位に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００９５】
また、本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドの変異体である。
【００９６】
即ち、本実施形態のポリペプチドは、歯根膜を誘導するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００９７】
上記（ｂ）に示されるポリペプチドは、上記（ａ）に示されるポリペプチドの変異体である。このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００９８】
ポリペプチドのアミノ酸配列中におけるいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００９９】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明のポリペプチドの歯根膜誘導活性を変化させない。
【０１００】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中の１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１０１】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に見出され得る。
【０１０２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【０１０３】
また、本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、原核生物宿主および真核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。また、本発明のポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、アミノ酸以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。さらに、本発明のポリペプチドはまた、組み換え技術などを用いて製造された場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【０１０４】
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよい。
【０１０５】
また、本発明のポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【０１０６】
また、本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドのような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明のポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【０１０７】
本実施形態のポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）を、当該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合ポリペプチドの簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合ポリペプチドは、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態のポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１０８】
このように、本発明のポリペプチドは、少なくとも、上記（ａ）または（ｂ）に示されるポリペプチドを含んでいればよいといえる。すなわち、上記（ａ）または（ｂ）に示されるポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１０９】
また、本発明の目的は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される歯根膜誘導活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１０】
（４）ポリヌクレオチド
本発明は、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１１３】
また本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【０１１４】
本発明はさらに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【０１１５】
このような変異体としては、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
【０１１６】
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下に示す（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド。
【０１１８】
ここで、配列番号２または配列弁号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質である。
【０１１９】
また、他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、下記の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドであることが好ましい。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１２０】
ここで、配列番号１または配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、それぞれヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡである。
【０１２１】
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【０１２２】
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ 塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
【０１２３】
本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【０１２５】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドを取得するための供給源は、特に限定されるものではないが、ヒト歯根膜組織を用いることができる。
【０１２７】
本発明の目的は、歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される歯根膜誘導活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１２８】
（５）組み換え発現ベクター
本発明は、本発明のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを提供する。本発明のベクターを用いれば、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を作製することができる。上記形質転換体は、本発明の歯周病治療用組成物中に含まれてもよいし、本発明のポリヌクレオチドの精製原料として用いることもできる。
【０１２９】
本発明のベクターは、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＥＦ６（invitorgen社製）、ｐＳｅｃＴａｇ２（invitrogen社製）またはｐ３Ｘ ＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Sigma社製）など）を用いて作製されることが好ましい。また、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたは非ウイルスベクター等を用いて作製することもできる。例えば、上記ベクターに、歯根膜誘導活性を有するポリペプチド（シグナル配列を含んでも含まなくてもよい）をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組み換え発現ベクターなどが挙げられる。アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター等を用いれば、培養細胞のみならず、生体中で、本発明のポリペプチドを発現させることができる。例えば、歯周病罹患部位の細胞へ導入することによって、歯周病によって崩壊した組織を修復することができる。組み換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１３０】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１３１】
本発明の組み換え発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１３２】
本発明のベクターを用いて形質転換された宿主を培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のポリペプチドを回収、精製することができる。精製された上記ポリペプチドは、本発明の歯根膜誘導用組成物中に含まれ得る。また、本発明のベクターを用いて形質転換された形質転換体もまた、本発明の歯根膜誘導用組成物中に含まれ得る。あるいは、上記組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入することによって、歯根膜を誘導することができ、その結果、歯周病などによって崩壊した組織を再生することができる。
【０１３３】
組み換え発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１３４】
あるいは、本発明のポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用い、本発明のポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１３５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞）および各種ヒト培養細胞などが挙げられる。
【０１３６】
本発明の組み換え発現ベクターを培養細胞に導入した場合、当該細胞を本発明のポリペプチドの供給源として利用することができる。また、本発明の組み換え発現ベクターを、歯周病罹患部位の細胞に導入した場合には、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。
【０１３７】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１３８】
本発明のベクターを使用すれば、上記ポリペプチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中に歯根膜誘導活性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【０１３９】
このように、本発明のベクターは、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現用ベクターであればよいといえる。
【０１４０】
つまり、本発明の目的は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得した発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１４１】
（６）形質転換体
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。上記形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されているので、本発明のポリペプチドを精製するための原材料として使用することができる。または、上記形質転換体を本発明の歯周病治療用組成物に混合し、当該歯周病治療用組成物を用いることによって、歯周病などによって崩壊した組織を修復することができる。
【０１４２】
本発明の形質転換体に導入されるベクターは、上述した本発明のポリヌクレオチドを導入すればよい。その場合に用いるベクターは、上述した本発明の組み換え発現ベクターを用いればよい。
【０１４３】
細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などが挙げられる。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。
【０１４４】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１４５】
また、本発明の組み換え発現ベクターは、上述したようにマーカー遺伝子を有するので、マーカー遺伝子の発現を指標として、上記形質転換体を選択採取することができる。
【０１４６】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【０１４７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１４９】
〔実施例１：ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のクローニング〕
米国national institute of the health（ＮＩＨ）のＮＣＢＩデータベースであるＢＬＡＳＴを用いて、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子（配列番号５）およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子（配列番号７）に相同性の高いヒトｃＤＮＡの検索を試みた。
【０１５０】
まず、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子に相同性の高いヒト遺伝子をデータベース検索したところ、FLJ13710（weakly similar to F-SPONDIN PRECURSOR）およびFLJ16791（weakly similar to ADAM-TS 6 precursor）の二つのヒトｃＤＮＡが、登録されていることが判明した。上記二つのｃＤＮＡをつなぎ合わせたｃＤＮＡは、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子と相同性の高い遺伝子を含んでおり、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ遺伝子（ｃＤＮＡ）であると推測された。
【０１５１】
次に、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子に相同性の高いヒト遺伝子をデータベース検索したところ、DFKZp686A1457およびFLJ13710（weakly similar to F-SPONDIN PRECURSOR）の二つのヒトｃＤＮＡが、登録されていることが判明した。このうちFLJ13710は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のオルソログであることが判明した。一方、DFKZp686A1457は、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子中の５８６番目のチミジンが欠損しているため、アミノ酸配列のまったく異なる蛋白質をコードしているものと推量された。
【０１５２】
データベース上で同定されたヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子のｃＤＮＡ配列を確認するために、同遺伝子の５’末端側および３’末端側に相当するプライマーを設計し、ヒト歯根膜より精製したＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングした。
【０１５３】
ヒトＡＤＭＴＳＬ４α遺伝子をクローニングする場合、ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて３分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行った。また、ヒトＡＤＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングする場合、ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行った。
【０１５４】
以下に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーを示す。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、制限酵素認識配列（NotI認識配列またはBamHI認識配列）を有している。
【０１５５】
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子をクローニングするためのプライマーとしては、
５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１５）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１６）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１５６】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子をクローニングするためのプライマーとしては、
５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１７）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号１８）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１５７】
得られたＰＣＲ産物をNotIおよびBamHIで消化後、ｐＣＭＶ１４（Sigma社製）にサブクローニングした。その後、業者の定める方法に従い、ＣＥＱ２００ＸＬ（Beckman Coulter社製）を用いてＤＮＡ配列を確認した。ＤＮＡ配列を確認したところ、データベース上で確認された配列と同一であった。
【０１５８】
〔実施例２：マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在〕
生後４週のマウス下顎臼歯を採取し、川本テープ法（Kawamoto T. J Histochem Cytochem, 38(12),1805-1814,1990参照）に従い凍結標本を作製後、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０（Leica社製）を用いて厚さ５μｍの非脱灰凍結切片を作製した。まず、凍結切片を、１０％ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングした後に抗ＡＤＡＭＴＳＬ４抗体であるＲ１−１抗体と反応させた。
【０１５９】
なお、上記Ｒ１−１抗体は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質に共通して存在するspacer regionに対する組み換えタンパク質を作製し、当該組み換えタンパク質をウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体である。なお、上記spacer regionは、配列番号２および配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの４１２位〜５２５位のポリペプチドである。また、配列番号４および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの５２位〜１６８位のポリペプチドである。したがって、上記Ｒ１−１抗体は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびマウスＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質のいずれをも検出することのできる抗体である。
【０１６０】
次いで、リン酸緩衝液で洗浄した後、上記凍結切片を抗ウサギ２次抗体であるalexa488 anti-rabbit secondary antibody（Invitrogen社製）と反応させた。その後、リン酸緩衝液にて洗浄し、ＩＸ７１蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて観察した。またオキシタラン線維を染色するため、同じく生後４週のマウス下顎臼歯を採取し、蟻酸を用いて脱灰した後にパラフィン包埋し、厚さ５μｍの標本を作製した。その後、１０％ｏｘｓｏｎ（Merck社製）を用いて酸化処理を施した後に、酸性フクシン溶液で染色した。
【０１６１】
図１（ａ）にマウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の免疫染色像を示し、図１（ｂ）にフクシン染色像（オキシタラン繊維が染色される）を示した。図１（ａ）および（ｂ）から明らかなように、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質はオキシタラン繊維と同じ局在を示した。以上の結果から、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質は、オキシタラン繊維の構成成分であることが明らかとなった。
【０１６２】
〔実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現解析〕
ヒト歯根膜組織は、神奈川歯科大学倫理委員会の定めたプロトコールに従い同意を得られた患者から抜歯した歯の歯根中央部分から採取した。ヒト歯根膜細胞の採取には、得られた歯根膜組織片を培養皿上でカバースリップで固定後、７２時間後に組織片よりoutgrowthしてきた細胞を継代培養した。尚、培地はDulbecco's Modified Eagle's Medium に１０％ウシ胎児血清を含むものを調整し使用した。
【０１６３】
次いで、上記ヒト歯根膜培養細胞およびヒト歯根膜組織から、Isogen（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、M-MLV reverse transcriptase（Invitrogen社製）およびランダムプライマー（Takara社製）を用いて、１μｇの上記Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで下記のプライマーおよびEX taq polymerase（Takara社製）を用いたＰＣＲ法によって、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現の有無を検討した。
【０１６４】
上記ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて１分間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応および７２℃にて３０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを２５サイクル行った。なお、以下に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーを示す。
【０１６５】
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子の発現を特異的に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号９）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６６】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現を特異的に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１１）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１２）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６７】
また、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現を同時に検出するためのプライマーとしては、
５’−ＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＴ−３’（配列番号１３）に示される塩基配列を有するプライマー、および
５’−ＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１４）に示される塩基配列を有するプライマーを用いた。
【０１６８】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動した。そして、電気泳動後のアガロースゲルを臭化エチジウムによって染色し、バンドを確認した。
【０１６９】
図２に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図２では、上から順に、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子、並びにＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示している。図２から明らかなように、ヒト歯根細胞およびヒト歯根膜組織は、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の両方を発現していることが判明した。
【０１７０】
〔実施例４：ヒト歯根膜におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在〕
神奈川歯科大学の倫理委員会に承認されたプロトコールに従い、同意の得られた患者よりヒト智歯を抜歯後、川本テープ法に従いヒト智歯の凍結標本を作製した。その後、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０を用いて、上記凍結標本から、厚さ５μｍの非脱灰凍結切片を作製した。上記凍結切片に対して、１０％ヤギ血清を用い、１時間のブロッキング処理を行った。ブロッキングの後、抗ＡＤＡＭＴＳＬ４抗体であるＲ１−１抗体と反応させた。このとき、対照実験として、Ｒ１−１抗体の代わりに、正常ウサギ血清と反応させる凍結切片を用意した。
【０１７１】
Ｒ１−１抗体と反応させた後、リン酸緩衝液を用いて洗浄した。洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識した抗ウサギ二次抗体（Dako enbision system labeled polymer社製）と反応させ、その後、再びリン酸緩衝液によって洗浄した。洗浄後、diaminobenzidine（ＤＡＢ）を用いて可視化した。
【０１７２】
図３（ａ）および（ｂ）は、Ｒ１−１抗体を用いて染色したときの染色像を示す。また、図３（ｃ）および（ｄ）は、対照実験として正常ウサギ血清を用いて染色したときの染色像を示す。ここで図３（ｂ）は、図３（ａ）を拡大した染色像であって、図３（ｄ）は、図３（ｃ）を拡大した染色像である。図３（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質は、象牙質やセメント質中には局在せず、ヒト歯根膜中に弾性繊維状の構造物として局在することが明らかとなった。
【０１７３】
〔実施例５：マウス歯小嚢細胞による、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を含む歯根膜様構造物の形成〕
マウス歯小嚢細胞（将来歯根膜になる細胞）を生後1日齢のマウス切歯根尖部分より採取した。採取した細胞は、ウシ胎児血清（最終濃度１０％）、アスコルビン酸（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（最終濃度１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）およびペニシリン（最終濃度１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ培地（Sigma社製）中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。その後、上記マウス歯小嚢細胞を、ヒトパピローマウイルスＥ６のＰＤＺドメイン欠失変異体を用いて形質転換し、その結果、安定した不死化細胞を得ることができた。なお、上記不死化細胞を作製するにあたっては、Kiyonoらの方法（Kiyono T et al, Nature. 1998 Nov 5;396(6706):84-88）に従った。
【０１７４】
次に、１ｍｌのＭＥＭ培地に対して１×１０６個の上記不死化細胞を懸濁し、生分解性ハイドロキシアパタイト（β−ＴＣＰ：osferion、オリンパス社製）の存在下で９０分間の培養を行った。その後、上記不死化細胞と生分解性ハイドロキシアパタイトとの混合物をマウスフィブリン粉（マウス fibrinogen とマウスthrombinの混合物、Sigma社製）によって固め、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。移植して１ヶ月後に移植片を取り出し、川本テープ法に従い凍結標本を作製した。当該凍結標本について、上述の実施例２に記載の方法と同様の方法でＲ１−１抗体を用いて免疫染色を行った。
【０１７５】
図４に、移植片の免疫染色像を示す。図４から明らかなように、マウス歯小嚢細胞は歯根膜細胞へ分化し、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質陽性の歯根膜弾性線維を形成することが確認された。
【０１７６】
〔実施例６：ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質の過剰発現による歯根膜の形成〕
ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡをそれぞれレトロウイルスベクターであるｐＣＸＳＨ（Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照）に組み込み、２９３ＦＴ細胞を用いてＶ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスを作製した。ここで、Ｖ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスとは、vesicular stomatitis virus由来のG proteinを有し、かつpseudotype virusのエンベロ−プを有する感染効率の高いレトロウイルスである。なお、上記ウイルスを作製するにあたっては、Saito等の方法（Saito et al. J Bone Miner Res. 2005 Jan;20(1):50-57 参照）に従った。
【０１７７】
また、対照実験に用いるために、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αｃＤＮＡおよびＡＤＡＭＴＳＬ４βｃＤＮＡを組み込まないｐＣＸＳＨ（コントロールベクター）と２９３ＦＴ細胞とを用いてＶ ＳＶ−Ｇシュードタイプ組み換えレトロウイルスを作製した。
【０１７８】
次に、ポリブレン（Sigma社製）を６μｇ／ｍｌの濃度で含むＤＭＥＭ培地（Sigma社製）中で培養し、２０％コンフルエントに増殖したヒト骨肉種細胞（ＭＧ６３細胞）に、
各ウイルスをそれぞれ感染させ、遺伝子導入を行った。上記レトロウイルスベクターは、マーカー遺伝子としてハイグロマイシン遺伝子を備えているので、ハイグロマイシンを５００μｇ／ｍｌの濃度で含むＤＭＥＭ培地中で、それぞれのレトロウイルスベクターが導入されたＭＧ６３細胞を選択した。
【０１７９】
次に、上述の実施例５と同様の方法で移植実験を行った。すなわち、１ｍｌのＭＥＭ培地に対して、１×１０６個の上記各ウイルスベクター導入細胞をそれぞれ懸濁し、生分解性ハイドロキシアパタイトの存在下で９０分間の培養を行った。その後、各細胞と生分解性ハイドロキシアパタイトとの混合物をマウスフィブリン粉で固め、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。また、対照として、生分解性ハイドロキシアパタイトのみをマウスフィブリン粉によって固めたものを、複合性免疫不全症マウスの皮下へ移植した。
【０１８０】
上記組成物を移植して１ヶ月後に移植片を取り出し、川本テープ法に従い凍結標本を作製した。免疫染色を行った。当該凍結標本について、上述の実施例２と同様の方法でＲ１−１抗体を用いて免疫染色を行った。
【０１８１】
また、移植片がドナー由来であるか確認するために、抗ヒトvimentin抗体であるＶ９抗体（Dako、Carpinteria社製）を用いた免疫染色を同時に行った。免疫染色は、Ｍ．Ｏ．Ｍ． ｋｉｔ（Vector、Burlingame社製）を用い、使用説明書に従って行った。
【０１８２】
解析の結果を図５（ａ）〜（ｈ）に示す。図５（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β導入細胞、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のみを移植した移植片を、Ｒ１−１抗体を用いて免疫染色を行った染色像を示す。また、図５（ｅ）〜（ｈ）はそれぞれ、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β導入細胞、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）のみを移植した移植片を、抗ヒトvimentin抗体を用いて免疫染色を行った染色像を示す。
【０１８３】
図５（ｅ）〜（ｈ）から明らかなように、各移植片にはヒト由来組織が含まれていた。
図５（ａ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α導入細胞を移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。また、図５（ｂ）から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β組成物を移植した場合にも、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察された。一方、図５（ｃ）および（ｄ）から明らかなように、コントロールベクター導入細胞およびハイドロキシアパタイトのみを移植した場合、その移植片では、オキタラン線維様構造物の形成が観察されなかった。
【０１８４】
これらの結果から明らかなように、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４αタンパク質およびＡＤＡＭＴＳＬ４βタンパク質は、歯根膜中のオキシタラン線維の形成に関わる細胞外マトリックス因子であり、これらの分子を用いて人工歯根膜シートの形成が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
本発明は、歯周病治療用組成物を提供するものであり、医薬品産業、医療機器産業などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】実施例において、マウス下顎臼歯のマウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を染色した染色像である。
【図２】実施例において、ヒト歯根膜細胞およびヒト歯根膜組織におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果を示す電気泳動の画像である。
【図３】実施例において、ヒト歯根膜におけるヒトＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質の局在を示した染色像である。
【図４】実施例において、マウス歯小嚢細胞による、マウスＡＤＡＭＴＳＬ４タンパク質を含む歯根膜様構造物の形成を示す染色像である。
【図５】実施例において、ヒトＡＤＡＭＴＳＬ４α遺伝子およびヒトＡＤＡＭＴＳＬ４β遺伝子の過剰発現による歯根膜の形成を示す染色像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部を含む歯周病治療用組成物。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項４】
生体吸収材料を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の歯周病治療用組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
【請求項６】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項７】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項８】
歯根膜を誘導するポリペプチドであって、
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかである請求項９に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体。
【請求項１】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部を含む歯周病治療用組成物。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を含む歯周病治療用組成物。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項４】
生体吸収材料を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の歯周病治療用組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の歯周病治療用組成物を歯周病罹患部位へ充填する充填工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
【請求項６】
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド、またはその一部をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項７】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを歯周病罹患部位の細胞へ導入する遺伝子導入工程を含むことを特徴とする歯根膜誘導方法。
（ｃ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項８】
歯根膜を誘導するポリペプチドであって、
以下の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列、またはその一部からなるポリペプチド
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（ｃ）または（ｄ）のいずれかである請求項９に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列、あるいは配列番号１または３に示される塩基配列と相補的な塩基配列のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３３３７９４（Ｐ２００６−３３３７９４Ａ）
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６３３３７（Ｐ２００５−１６３３３７）
【出願日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１２月３日 大阪大学発行の「ＣＯＥオープンシンポジウム２００４『歯と骨の接点に迫る』」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１２月３日 大阪大学発行の「ＣＯＥオープンシンポジウム２００４『歯と骨の接点に迫る』」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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