本発明は、リノール酸（１８：２、ＬＡ）からα−リノレン酸（１８：３、ＡＬＡ）への転換を触媒できる真菌Δ１５脂肪酸デサチュラーゼに関する。デサチュラーゼをコードする核酸配列、それにハイブリダイズする核酸配列、デサチュラーゼ遺伝子を含んでなるＤＮＡコンストラクト、および増大したレベルのデサチュラーゼを発現する組換え宿主植物および微生物について記載されている。１５脂肪酸デサチュラーゼの過剰発現によって特定のω−３およびω−６脂肪酸の生成の増大方法についてもまた本明細書に記載されている。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸断片、または
（ａ）または（ｂ）と相補である単離された核酸断片
からなる群から選択される、真菌Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする単離された核酸断片。
【請求項２】
配列番号１に記載の請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項３】
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離された請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項４】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも８６％の同一性を有する、少なくとも４０２個のアミノ酸があるΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸断片。
【請求項５】
酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合する請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片によってコードされるポリペプチド。
【請求項６】
適切な制御配列に作動的に結合された請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された核酸断片を含んでなる、形質転換宿主細胞。
【請求項８】
植物、藻類、細菌、酵母、および真菌からなる群から選択される、請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、ダイズ、コーン、ナタネ、サクラソウ、亜麻、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ、およびヒマワリからなる群から選択される植物である、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される真菌である請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
酵母が油性酵母である請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換酵母。
【請求項１３】
油性酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種である、請求項１２に記載の形質転換酵母。
【請求項１４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される、請求項１３に記載の形質転換されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種。
【請求項１５】
ａ）（ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）リノール酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつリノール酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなるα−リノレン酸の製造方法。
【請求項１６】
ａ）（ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）オレイン酸供給源
を含んでなる宿主細胞を提供工程と、
ｂ）Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸断片が発現し、かつオレイン酸がα−リノレン酸に転換される条件下で、工程（ａ）の宿主細胞を生育させる工程と、
ｃ）場合により工程（ｂ）のα−リノレン酸を回収する工程
を含んでなるα−リノレン酸の製造方法。
【請求項１７】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）からなる群から選択される真菌から単離される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、配列番号２、６、１０、１４、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約５０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約８０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約９０％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、リノール酸から少なくとも約９５％のα−リノレン酸への基質転換百分率を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質が、酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合する請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）ｉ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するΔ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片、および
（ｉｉ）機能的なω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子
を含んでなる、宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）オレイン酸からなるデサチュラーゼ基質源を提供する工程と、
ｃ）ω−３脂肪酸が生成する条件下で工程（ａ）の宿主細胞を工程（ｂ）のデサチュラーゼ基質と共に生育させる工程と、
ｄ）場合により工程（ｃ）のω−３脂肪酸を回収する工程
を含んでなる宿主細胞におけるω−３脂肪酸の製造方法。
【請求項２５】
ａ）ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を生成する宿主細胞を提供する工程と、
ｂ）配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアライメントに基づいて少なくとも４６．２％の同一性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片を（ａ）の宿主細胞に導入する工程
を含んでなり、ここでポリペプチドが酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方に結合し、ω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率が増大する
ω−３脂肪酸からω−６脂肪酸を生成する宿主細胞においてω−３脂肪酸のω−６脂肪酸に対する比率の増大方法。
【請求項２６】
ω−３脂肪酸およびω−６脂肪酸を生成する宿主細胞が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを欠く請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Δ１５デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸断片が、配列番号２、６、１０、１４、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
ω−３脂肪酸がα−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子が、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼからなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、植物、藻類、細菌、酵母、および真菌からなる群から選択される請求項１５、１６、２４、および２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞が、ダイズ、コーン、亜麻、ナタネ、サクラソウ、カノーラ、トウモロコシ、ベニバナ、およびヒマワリからなる群から選択される植物である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）種からなる群から選択される真菌である請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
酵母が油性酵母である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号７６９８２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１５、１６、２４、および２５のいずれか一項に記載の方法によって製造される微生物油。
【請求項３７】
（ａ）請求項１に記載の核酸断片によってゲノムライブラリーをプローブする工程と
（ｂ）請求項１に記載の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する工程と
を含んでなり、かつ、配列決定されたゲノム断片がΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードする、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。
【請求項３８】
（ａ）配列番号１に記載の配列の部分に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入断片を増幅する工程
を含んでなり、かつ、増幅された挿入断片がΔ１５デサチュラーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の部分をコードする、Δ１５デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片を得る方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００７−５１５９５１（Ｐ２００７−５１５９５１Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９８３４（Ｐ２００６−５３９８３４）
【出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７５９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４８０
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】