潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品
【課題】植物食品由来の有効成分で副作用が少なく、長期投与可能な潰瘍性大腸炎予防・治療剤を提供することを目的とする。
【解決手段】アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特に大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体（グルコシノレート）を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品などを提供する。
【解決手段】アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特に大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体（グルコシノレート）を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品などを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特に大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜の粘膜層あるいは粘膜下層にびらんや潰瘍を形成する大腸の疾患であり、クローン病等と共に炎症性腸疾患に分類されるものである。その特徴的症状としては、下血、血便、腹痛および体重減少などであり、病変は直腸から連続的に、そして上行性（口側）に広がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に拡がる。我が国では欧米と比べて少なく比較的稀な病気とされていたが、近年食生活の欧米化等に伴い患者数は年々急増しており、特に２０歳代で発病するヒトが多く、再発を繰り返して難治な病気として、厚生労働省の特定疾患にも指定されている。その原因は明らかでなく、これまでに腸内細菌の関与、自己免疫反応の異常、あるいは食生活の変化の関与など種々の要因が考えられているが、詳細は未だ不明である。現在、潰瘍性大腸炎を完治に導く内科的治療はなく、大腸の炎症を抑える薬物治療が主であり、５−アミノサリチル酸製剤（サラゾスルファピリジンやメサラジンなど）、ステロイド剤（プレドニゾロンなど）、ならびに免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が用いられている。しかし、これら薬物療法は、病勢の鎮静化効果はあるが、難治例も多く、特に、ステロイド剤を減量すると再発して長期投与を余儀なくされ、ステロイド剤の副作用に苦しむ患者が多いのが現状である。従って、薬物療法をサポートするものとして、副作用が少なく安全性が高く、日常的に摂取する食品により、潰瘍性大腸炎を予防し、その症状の進展を抑制し、さらには改善作用を有するような機能性食品も望まれている。
【０００３】
近年、予防的な観点から、ヒトの健康状態や食品機能を科学的に研究する機能性食品、特にその有効成分の研究が盛んになされ、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物及びその配糖体は、そのガン予防効果等様々な生理活性作用にて注目を集めている（非特許文献１）。一方、潰瘍性大腸炎に対する効果を特徴とした食品の機能性成分についても幾つかの特許出願がある（特許文献１、２、３等）が、イソチオシアネート化合物やアブラナ科植物については報告が見当たらなかった。しかし、ごく最近、アメリカンクレス（Ｂａｒｂａｒｅａ ｖｅｒｎａ）由来のフェネチルイソチオシアネートの抗炎症作用に関する特許出願が公開され、炎症性疾患の例の一つとして潰瘍性大腸炎についても言及されているが、腸疾患関係の試験例がなく、その効果については全く不明である（特許文献４）。
【０００４】
【非特許文献１】プロシーディングス・オブ・ザ・ニュートリション・ソサイアティ（Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ．）、第６５巻、６８−７５頁、２００６年
【特許文献１】特開２００５−２３２１７８号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２７６５号公報
【特許文献３】特開２００７−７７１２２号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／０２２４３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、植物食品由来で副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記目的を達成すべく、植物食品由来で安全性が高く潰瘍性大腸炎に効果を示す物質について鋭意検討した結果、大和マナ由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）に潰瘍性大腸炎の予防・治療効果を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アブラナ科アブラナ属植物由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（２）前記アブラナ科アブラナ属植物が大和マナである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（３）前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（４）前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである（３）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（５）前記イソチオシアネート化合物が、アルケニルアルキルイソチオシアネートである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（６）前記アルケニルアルキルイソチオシアネート化合物が３−ブテニルイソチオシアネートである（５）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤を配合してなる医薬品；
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤を配合してなる飲食品；
などに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、植物食品由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することにより、副作用が少なく、経口的に、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎の予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明におけるイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）は、アブラナ科アブラナ属由来のものが利用されるが、そのアブラナ科アブラナ属植物としては、ブロッコリー、ケール、キャベツ、ハクサイ、大和マナ、小松菜、カリフラワー、カブ、チンゲンサイ、ミズナ、ノザワナなどがある。
【００１０】
本発明のイソチオシアネート化合物はアブラナ科アブラナ属由来のものが利用されるが、一方では、イソチオシアネート基を有し、潰瘍性大腸炎予防および治療作用を有する限りその構造は限定されないが、アリールアルキルイソチオシアネートおよびアルケニルアルキルイソチオシアネートが好ましく、特にアリールアルキルイソチオシアネートが好ましい。
【００１１】
アリールアルキルイソチオシアネートとしては、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、４−ハイドロオキシベンジルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特にフェネチルイソチオシアネートが好ましい。
【００１２】
アルケニルアルキルイソチオシアネートとしては、アリルイソチオシアネート、３−ブテニルイソチオシアネート、４−ペンテニルイソチオシアネート、５−ヘキセニルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特に３−ブテニルイソチオシアネートが好ましい。
【００１３】
これらアブラナ科アブラナ属植物由来のイソチオシアネート化合物は、これら植物体において、配糖体（グルコシノレート）として存在しており、そのイソチオシアネート配糖体は細胞内在ミロシナーゼ等の酵素と接触することによりイソチオシアネート化合物へ変換される。また、イソチオシアネート配糖体は、ヒトの腸内細菌によりイソチオシアネート化合物へ変換されることが知られている。
【００１４】
このようにアブラナ科アブラナ属植物においては、イソチオシアネート配糖体として存在しているため、イソチオシアネート化合物に変換して用いてもよいが、その配糖体（グルコシノレート）を潰瘍性大腸炎予防・治療剤として用いてもよい。さらにイソチオシアネート配糖体を用いる場合に、外在性のミロシナーゼを添加して用いてもよい。さらにはアブラナ科アブラナ属植物体、特に大和マナそのものを用いてもよい。
【００１５】
アブラナ科アブラナ属植物、特に大和マナからのイソチオシアネート化合物の抽出は、例えば、植物体をすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、植物内在性のミロシナーゼにより、イソチオシアネート配糖体からイソチオシアネート化合物を十分に生成させてから、適当な溶媒にて抽出することにより行うことができる。抽出溶媒としては、イソチオシアネート化合物の性質にもよるが、酢酸エチル、酢酸メチルなどのエステル類、ジエチルエーテル、エチルイソプロピルエーテルなどのエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系炭化水素、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類などの溶媒が用いられる。好ましくは、酢酸エチルが用いられる。
【００１６】
イソチオシアネート化合物は、試薬として市販されているものは購入により入手可能であるが、種々の化学合成によっても得られる。例えば、アミン化合物やシリルアミン化合物等から容易に得られる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６，１６６−４（１９８５），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５３９（１９７０）等）。
【００１７】
一方、アブラナ科アブラナ属植物、特に大和マナからイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）の抽出は、例えば、あらかじめ植物体の内在性ミロシナーゼを加熱等により不活化し、続いてすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、ろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーなどにより分離精製することにより、目的とするイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）が得られる。他方、イソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）は、種々の化学的方法によっても得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３６，７７９−７８３（１９８０）等）。
【００１８】
かくして得られたイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。また、イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体は、単独で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。具体的には、菓子、パン類、麺類の固形食品あるいはジュースや健康茶等の飲料品に添加して、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。なお、各種飲食品に添加する場合、アブラナ科植物自体、特に大和マナ自体を用いても良い。即ち、大和マナをそのまま用いても良いが、細断あるいは粉末化したもの、ペースト状化したもの、ホモジナイズ化して不溶物をろ過したろ液、又はそのろ液を濃縮したもの等種々の形態のものが用いられる。
【００１９】
本発明のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２０】
一方、イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体、ならびにそれを含有するアブラナ科植物体を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２２】
実施例１ （大和マナからフェネチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）の単離）
収穫した大和マナ４０ｇを細断後、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を加えて、５秒間ホモジナイズし１０分放置した後に、ガーゼろ過を行なった。ろ液をクロロホルムにて抽出し、抽出液を乾燥後減圧濃縮すると油状物が得られた。得られた油状物（１．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）にて精製するとフェネチルイソチオシアネートが１６ｍｇ得られた。本品は、ＨＰＬＣ分析（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ ＡＱ−３０２カラム、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２４４ ｎｍ）及び１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果、共に標品（東京化成より購入のフェネチルイソチオシアネート）と完全に一致した。
【００２３】
実施例２ （フェネチルグルコシノレート（ＰＥＧＬＳ）の単離・精製）
収穫した大和マナ１１９ｇを８０℃に熱した１００ｍＬの蒸留水で２０分間処理し、ミロシナーゼを失活させた。その後、常温に戻したマナを蒸留水ごと、３０秒間ホモジナイズ、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの熱水抽出液と残渣を得た。また、残渣はもう一度、熱水抽出を行い、得られた熱水抽出液も１回目の熱水抽出液と合わせた。続いて、熱水抽出液に１Ｍ酢酸亜鉛を５ｍＬ添加し、攪拌することでタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行うことで、除タンパクを行った。得られた上清は、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５）、続いて分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｈｉｌｉｃ，ＣＨ３ＣＮ：１０ｍｍｏｌ／ｍＬ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．６）＝１：１，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）により精製すると、フェネチルグルコシノレート（フェネチルイソチオシアネート配糖体）が黄色不定形粉末として得られた。本品は、高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより得られた分子イオンピークの値［ｍ／ｚ ４２２．０５８５０ （Ｍ−Ｈ）−、Δ−０．０ｍｍｕ］より、分子式がＣ１５Ｈ２１ＮＯ９Ｓ２であり、フェネチルグルコシノレートの分子式と一致した。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを以下に示すが、これらのデータは文献値（Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，７２巻７６０−７６４頁２００１年）と良く一致した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：７．３８（４Ｈ，ｍ，Ｈ１１ ａｎｄ Ｈ１２），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，Ｈ１３），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７１Ｈｚ，Ｈ１），３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１０＆１２．８０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．４７（４Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４ ａｎｄ Ｈ５），３．０５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−８ ａｎｄ ＣＨ２−９）.
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：１６６．２（Ｃ７），１４３．４（Ｃ１０），１３１．６（Ｃ１１ ａｎｄ Ｃ１２），１２９．５（Ｃ１３），８４．５（Ｃ１），８２．９（Ｃ５），７９．９（Ｃ３），７４．７（Ｃ２），７１．９（Ｃ４），６３．４（Ｃ６），３６．８ ａｎｄ ３５．４（Ｃ８ ａｎｄ Ｃ９）.
【００２４】
実施例３ （潰瘍性大腸炎抑制効果試験）
（１）（試薬およびサンプルの調製）
ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）３０ｇを水道水１０００ｍＬに溶解し、３％ＤＳＳ溶液を調整した。ＰＥＩＴＣは、０．４ｍｇ／ｋｇ体重および２ｍｇ／ｋｇ体重、ＰＥＧＬＳは、２ｍｇ／ｋｇ体重および２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量になるようにコーン油に溶かして試験用サンプルとした。
【００２５】
（２）（試験方法）
雌５週齢ＩＣＲマウス４頭（清水実験材料より購入）を１群とし、コントロール群（ＣＴＬ）、対照群（ＤＳＳ）、ＰＥＩＴＣ投与群（０．４、２ｍｇ／ｋｇ体重）およびＰＥＧＬＳ投与群（２、２０ｍｇ／ｋｇ体重）の計６群に分けた。マウスへの投与スケジュールは図１（マウス大腸炎実験プロトコール）に示す。即ち、コントロール群には水道水を、対照群、ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳ投与群には７日目から３％ＤＳＳ水溶液を投与し大腸炎を誘導した。ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳ投与群には、２日に１回ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳのコーン油溶液を腹腔内投与した。ＤＳＳ投与開始から７日目に解剖をおこない、大腸は摘出後直ちに肛門から盲腸までの長さを測定した。結果は、図２に示す。
【００２６】
（３）（試験結果）
図２から、ＰＥＩＴＣの腹腔内投与群においては、ＤＳＳ投与によって引き起こされる大腸の萎縮が有意差を持って抑制され、潰瘍性大腸炎の予防・治療効果が判明した。また、ＰＥＧＬＳ投与群においても、大腸の萎縮に抑制傾向が見られた。一方、肝臓、腎臓、脾臓重量については特に各群で有意差はなかった（データは示さず）。
【００２７】
実施例４ （潰瘍性大腸炎抑制効果試験２）
（１）（試験用飼料の調製）
ＰＥＩＴＣ（０．２４，２．４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）、あるいはＰＥＧＬＳ（０．２４，２．４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）をメタノールに溶解してからＭＦ粉末飼料（基本飼料；オリエンタル酵母社製）に混ぜて試験用飼料とした。
【００２８】
（２）（試験方法）
雌５週齢ＩＣＲマウス５頭を１群とし、コントロール群（ＣＴＬ）、対照群（ＤＳＳ）、ＰＥＩＴＣ投与群（２．４、０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）およびＰＥＧＬＳ投与群（２．４、０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）の計６群に分け、２日間予備飼育してから実験に用いた。試験スケジュールは図３に示す。即ちコントロール群には、飲料水及び餌料（ＭＦペレット；オリエンタル酵母社製）を自由に与え、対照群には、最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、飼料は自由に与えた。ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＧＬＳ投与群は、最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、（１）で調製した試験用飼料を最初から試験終了（１４日間）まで与えた。実験開始後１４日目に解剖を行い、大腸は摘出後直ちに肛門から盲腸までの長さを測定した。結果は図４に示す。
【００２９】
（３）（試験結果）
図４から、ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＧＬＳ投与群ともに対照群より大腸の長さが長く、ともに大腸炎の抑制傾向を示した。即ち、ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳは経口投与でも大腸炎抑制効果を示した。
【００３０】
実施例５ （大腸粘膜におけるＩＬ−１β産生量測定）
（１）（試験サンプルの調整）
実施例４で長さを測定した大腸を外科用はさみで開き、内容物を取り出した。大腸粘膜を外科用はさみで細かく刻み、粘膜１５〜２０ｍｇをＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μＬに懸濁し、ホモジナイザーを使用してさらに細かく粉砕し、ＰＢＳをさらに５００μＬ加えた後、混合物を遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）した。上清をＰＢＳで２０倍に希釈し試験溶液とした。
【００３１】
（２）（ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１βの濃度測定）
ＩＬ−１βの濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．社製のＥｎｄｏｇｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＥＭＩＬ１Ｂ２）のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。即ち、ＩＬ−１β抗体がウェルの底についたプレートを用い、そこへ第１抗体５０μＬと試験溶液５０μＬを入れ、ウェルにシールでフタをし、２時間室温で放置した。次にウォッシングバッファーでウェルを３度洗い、第２抗体１００μＬを入れ、ウェルにシールでフタをし、３０分間室温で放置した。ウォッシングバッファーでウェルを３度洗い、ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質１００μＬを添加し、暗所で３０分間放置し、ストップバッファーを入れて反応をとめ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。同時にＩＬ−１βの検量線を作製し、試験溶液のＩＬ−１β濃度を算出した。また大腸粘膜のタンパク量も定量し、結果をタンパク質量当たりの値として補正した。結果を図５に示す。
【００３２】
（３）（試験結果）
図５から、大腸粘膜におけるＩＬ−１βの産生量は、ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＩＬＳ投与群ともに対照群よりも少なく、ＰＥＩＴＣやＰＥＩＬＳがｉｎ ｖｉｖｏ試験でもＩＬ−１βの大腸粘膜における炎症性サイトカイン産生抑制効果を示すことがわかった。
【００３３】
実施例６ （３−ブテニルグルコシノレート（ＢＵＧＬＳ）の単離・精製）
収穫した大和マナ１１９ｇを８０℃に熱した１００ｍＬの蒸留水で２０分間処理し、ミロシナーゼを失活させた。その後、常温に戻したマナを蒸留水ごと、３０秒間ホモジナイズ、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの熱水抽出液と残渣を得た。また、残渣はもう一度、熱水抽出を行い、得られた熱水抽出液も１回目の熱水抽出液と合わせた。続いて、熱水抽出液に１Ｍ酢酸亜鉛を５ｍＬ添加し、攪拌することでタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行うことで、除タンパクを行った。得られた上清は、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５）により精製を行い、最終的には分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｈｉｌｉｃ，ＣＨ３ＣＮ：１０ｍｍｏｌ／ｍＬ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．６）＝１：１，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）を行うことにより、３−ブテニルイソチオシアネート配糖体（３−ブテニルグルコシノレート）を単離した。本品は、黄色不定形粉末として得られ、水に可溶であった。高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより得られた分子イオンピークの値［ｍ／ｚ ３７２．０４２８５ （Ｍ−Ｈ）−Δ−０．０４ｍｍｕ］より、分子式がＣ１１Ｈ１９ＮＯ９Ｓ２であり、３−ブテニルイソチオシアネート配糖体の分子式と一致した。
本品の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。そして、これらのスペクトルの解析から、本品は３−ブテニルイソチオシアネート配糖体であると決定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：５．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ１０），５．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２５＆１７．２４Ｈｚ，Ｈ−１１ａ），５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２５＆１０．５０Ｈｚ，Ｈ−１１ｂ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８３Ｈｚ，Ｈ１），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５９Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６３＆１２．５９，Ｈ−６ｂ），３．５７−３．４７（４Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４ ａｎｄ Ｈ５），２．８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２−９），２．４９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２−８）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：１６６．６（Ｃ７），１３９．６（Ｃ１０），１１８．８（Ｃ１１），８４．６（Ｃ１），８２．９（Ｃ５），７９．９（Ｃ３），７４．８（Ｃ２），７２．０（Ｃ４），６３．４（Ｃ６），３６．８ ａｎｄ ３５．４（Ｃ８ ａｎｄ Ｃ９）．
また、本品のミロシナーゼ（シグマ社より購入）反応生成物のＨＰＬＣ分析（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳＩＩ，ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４／６−（５ｍｉｎ）−４／６−（５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−１０／０−（５ｍｉｎ）−１０／０−（１０ｍｉｎ）−１０／０，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）の結果が標品の３−ブテニルイソチオシアネート（東京化成より購入）の結果と完全に一致した。
【００３４】
実施例７ （３−ブテニルイソチオシアネート（ＢＵＩＴＣ）の検出）
収穫した大和マナ１７ｇに１００ｍｌの蒸留水を添加し、３０秒間ホモジナイズし、３７℃で２時間放置し、生体内ミロシナーゼで反応させた。その後、ホモジナイズ液を、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの水抽出液を得た。続いて、水抽出液を等量の酢酸エチルで分配することにより、酢酸エチル画分を得、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。上記サンプルを用いたＨＰＬＣ分析（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳＩＩ，ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４／６−（５ｍｉｎ）−４／６−（５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−１０／０−（５ｍｉｎ）−１０／０−（１０ｍｉｎ）−１０／０，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）の結果、３−ブテニルイソチオシアネートの存在を確認した。
【００３５】
実施例８ （マウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−β産生抑制試験）
常法に従って用意したマウス腹腔マクロファージを、ＤＳＳ（１０μｇ／ｍＬ）で刺激を与え、ＩＬ−１β産生を誘発し、それに種々の濃度の３−ブテニルイソチオシアネート（ＢＵＩＴＣは東京化成より購入）および３−ブテニルグルコシノレート（ＢＵＧＬＳ）のＤＭＳＯ溶液（０．５％、ｖ／ｖ）を添加し、２４時間処理した後、遠心分離し、上清を実施例４と同様にＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１β濃度を測定した。ＢＵＩＴＣおよびＢＵＧＬＳのＩＬ−１β産生抑制作用を調べた結果、ＢＵＩＴＣは２μＭ、１０μＭでそれぞれ約５０％、１００％抑制した。一方、ＢＵＧＬＳは５０μＭで約９０％抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、植物食品由来のイソチオシアネートまたはその配糖体を含有することにより、副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎予防・治療剤、さらにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例３のマウス大腸炎実験プロトコールを示す。
【図２】実施例３の各群のマウスの大腸長を示す。
【図３】実施例４のマウス大腸炎実験プロトコールを示す
【図４】実施例４の各群のマウスの大腸長を示す
【図５】実施例５の各群のマウス大腸粘膜のＩＬ−１β産生量を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物、特に大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜の粘膜層あるいは粘膜下層にびらんや潰瘍を形成する大腸の疾患であり、クローン病等と共に炎症性腸疾患に分類されるものである。その特徴的症状としては、下血、血便、腹痛および体重減少などであり、病変は直腸から連続的に、そして上行性（口側）に広がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に拡がる。我が国では欧米と比べて少なく比較的稀な病気とされていたが、近年食生活の欧米化等に伴い患者数は年々急増しており、特に２０歳代で発病するヒトが多く、再発を繰り返して難治な病気として、厚生労働省の特定疾患にも指定されている。その原因は明らかでなく、これまでに腸内細菌の関与、自己免疫反応の異常、あるいは食生活の変化の関与など種々の要因が考えられているが、詳細は未だ不明である。現在、潰瘍性大腸炎を完治に導く内科的治療はなく、大腸の炎症を抑える薬物治療が主であり、５−アミノサリチル酸製剤（サラゾスルファピリジンやメサラジンなど）、ステロイド剤（プレドニゾロンなど）、ならびに免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が用いられている。しかし、これら薬物療法は、病勢の鎮静化効果はあるが、難治例も多く、特に、ステロイド剤を減量すると再発して長期投与を余儀なくされ、ステロイド剤の副作用に苦しむ患者が多いのが現状である。従って、薬物療法をサポートするものとして、副作用が少なく安全性が高く、日常的に摂取する食品により、潰瘍性大腸炎を予防し、その症状の進展を抑制し、さらには改善作用を有するような機能性食品も望まれている。
【０００３】
近年、予防的な観点から、ヒトの健康状態や食品機能を科学的に研究する機能性食品、特にその有効成分の研究が盛んになされ、アブラナ科植物由来のイソチオシアネート化合物及びその配糖体は、そのガン予防効果等様々な生理活性作用にて注目を集めている（非特許文献１）。一方、潰瘍性大腸炎に対する効果を特徴とした食品の機能性成分についても幾つかの特許出願がある（特許文献１、２、３等）が、イソチオシアネート化合物やアブラナ科植物については報告が見当たらなかった。しかし、ごく最近、アメリカンクレス（Ｂａｒｂａｒｅａ ｖｅｒｎａ）由来のフェネチルイソチオシアネートの抗炎症作用に関する特許出願が公開され、炎症性疾患の例の一つとして潰瘍性大腸炎についても言及されているが、腸疾患関係の試験例がなく、その効果については全く不明である（特許文献４）。
【０００４】
【非特許文献１】プロシーディングス・オブ・ザ・ニュートリション・ソサイアティ（Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ．）、第６５巻、６８−７５頁、２００６年
【特許文献１】特開２００５−２３２１７８号公報
【特許文献２】特開２００６−２３２７６５号公報
【特許文献３】特開２００７−７７１２２号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／０２２４３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、植物食品由来で副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記目的を達成すべく、植物食品由来で安全性が高く潰瘍性大腸炎に効果を示す物質について鋭意検討した結果、大和マナ由来のイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）に潰瘍性大腸炎の予防・治療効果を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アブラナ科アブラナ属植物由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（２）前記アブラナ科アブラナ属植物が大和マナである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（３）前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（４）前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである（３）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（５）前記イソチオシアネート化合物が、アルケニルアルキルイソチオシアネートである（１）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（６）前記アルケニルアルキルイソチオシアネート化合物が３−ブテニルイソチオシアネートである（５）記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤；
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤を配合してなる医薬品；
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎予防および治療剤を配合してなる飲食品；
などに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、植物食品由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することにより、副作用が少なく、経口的に、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎の予防・治療剤、ならびにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明におけるイソチオシアネート化合物またはその配糖体（グルコシノレート）は、アブラナ科アブラナ属由来のものが利用されるが、そのアブラナ科アブラナ属植物としては、ブロッコリー、ケール、キャベツ、ハクサイ、大和マナ、小松菜、カリフラワー、カブ、チンゲンサイ、ミズナ、ノザワナなどがある。
【００１０】
本発明のイソチオシアネート化合物はアブラナ科アブラナ属由来のものが利用されるが、一方では、イソチオシアネート基を有し、潰瘍性大腸炎予防および治療作用を有する限りその構造は限定されないが、アリールアルキルイソチオシアネートおよびアルケニルアルキルイソチオシアネートが好ましく、特にアリールアルキルイソチオシアネートが好ましい。
【００１１】
アリールアルキルイソチオシアネートとしては、ベンジルイソチオシアネート、フェネチルイソチオシアネート、４−ハイドロオキシベンジルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特にフェネチルイソチオシアネートが好ましい。
【００１２】
アルケニルアルキルイソチオシアネートとしては、アリルイソチオシアネート、３−ブテニルイソチオシアネート、４−ペンテニルイソチオシアネート、５−ヘキセニルイソチオシアネートなどが挙げられるが、特に３−ブテニルイソチオシアネートが好ましい。
【００１３】
これらアブラナ科アブラナ属植物由来のイソチオシアネート化合物は、これら植物体において、配糖体（グルコシノレート）として存在しており、そのイソチオシアネート配糖体は細胞内在ミロシナーゼ等の酵素と接触することによりイソチオシアネート化合物へ変換される。また、イソチオシアネート配糖体は、ヒトの腸内細菌によりイソチオシアネート化合物へ変換されることが知られている。
【００１４】
このようにアブラナ科アブラナ属植物においては、イソチオシアネート配糖体として存在しているため、イソチオシアネート化合物に変換して用いてもよいが、その配糖体（グルコシノレート）を潰瘍性大腸炎予防・治療剤として用いてもよい。さらにイソチオシアネート配糖体を用いる場合に、外在性のミロシナーゼを添加して用いてもよい。さらにはアブラナ科アブラナ属植物体、特に大和マナそのものを用いてもよい。
【００１５】
アブラナ科アブラナ属植物、特に大和マナからのイソチオシアネート化合物の抽出は、例えば、植物体をすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、植物内在性のミロシナーゼにより、イソチオシアネート配糖体からイソチオシアネート化合物を十分に生成させてから、適当な溶媒にて抽出することにより行うことができる。抽出溶媒としては、イソチオシアネート化合物の性質にもよるが、酢酸エチル、酢酸メチルなどのエステル類、ジエチルエーテル、エチルイソプロピルエーテルなどのエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系炭化水素、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類などの溶媒が用いられる。好ましくは、酢酸エチルが用いられる。
【００１６】
イソチオシアネート化合物は、試薬として市販されているものは購入により入手可能であるが、種々の化学合成によっても得られる。例えば、アミン化合物やシリルアミン化合物等から容易に得られる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６，１６６−４（１９８５），Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５３９（１９７０）等）。
【００１７】
一方、アブラナ科アブラナ属植物、特に大和マナからイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）の抽出は、例えば、あらかじめ植物体の内在性ミロシナーゼを加熱等により不活化し、続いてすりおろしなどによる粉砕ないし細断した後、ろ過し、ろ液をカラムクロマトグラフィーなどにより分離精製することにより、目的とするイソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）が得られる。他方、イソチオシアネート配糖体（グルコシノレート）は、種々の化学的方法によっても得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３６，７７９−７８３（１９８０）等）。
【００１８】
かくして得られたイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。また、イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体は、単独で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。具体的には、菓子、パン類、麺類の固形食品あるいはジュースや健康茶等の飲料品に添加して、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。なお、各種飲食品に添加する場合、アブラナ科植物自体、特に大和マナ自体を用いても良い。即ち、大和マナをそのまま用いても良いが、細断あるいは粉末化したもの、ペースト状化したもの、ホモジナイズ化して不溶物をろ過したろ液、又はそのろ液を濃縮したもの等種々の形態のものが用いられる。
【００１９】
本発明のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２０】
一方、イソチオシアネート化合物および／またはその配糖体、ならびにそれを含有するアブラナ科植物体を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２２】
実施例１ （大和マナからフェネチルイソチオシアネート（ＰＥＩＴＣ）の単離）
収穫した大和マナ４０ｇを細断後、ＰＢＳ（２００ｍＬ）を加えて、５秒間ホモジナイズし１０分放置した後に、ガーゼろ過を行なった。ろ液をクロロホルムにて抽出し、抽出液を乾燥後減圧濃縮すると油状物が得られた。得られた油状物（１．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）にて精製するとフェネチルイソチオシアネートが１６ｍｇ得られた。本品は、ＨＰＬＣ分析（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ ＡＱ−３０２カラム、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、２４４ ｎｍ）及び１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果、共に標品（東京化成より購入のフェネチルイソチオシアネート）と完全に一致した。
【００２３】
実施例２ （フェネチルグルコシノレート（ＰＥＧＬＳ）の単離・精製）
収穫した大和マナ１１９ｇを８０℃に熱した１００ｍＬの蒸留水で２０分間処理し、ミロシナーゼを失活させた。その後、常温に戻したマナを蒸留水ごと、３０秒間ホモジナイズ、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの熱水抽出液と残渣を得た。また、残渣はもう一度、熱水抽出を行い、得られた熱水抽出液も１回目の熱水抽出液と合わせた。続いて、熱水抽出液に１Ｍ酢酸亜鉛を５ｍＬ添加し、攪拌することでタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行うことで、除タンパクを行った。得られた上清は、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５）、続いて分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｈｉｌｉｃ，ＣＨ３ＣＮ：１０ｍｍｏｌ／ｍＬ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．６）＝１：１，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）により精製すると、フェネチルグルコシノレート（フェネチルイソチオシアネート配糖体）が黄色不定形粉末として得られた。本品は、高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより得られた分子イオンピークの値［ｍ／ｚ ４２２．０５８５０ （Ｍ−Ｈ）−、Δ−０．０ｍｍｕ］より、分子式がＣ１５Ｈ２１ＮＯ９Ｓ２であり、フェネチルグルコシノレートの分子式と一致した。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを以下に示すが、これらのデータは文献値（Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，７２巻７６０−７６４頁２００１年）と良く一致した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：７．３８（４Ｈ，ｍ，Ｈ１１ ａｎｄ Ｈ１２），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ，Ｈ１３），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７１Ｈｚ，Ｈ１），３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１０＆１２．８０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．４７（４Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４ ａｎｄ Ｈ５），３．０５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−８ ａｎｄ ＣＨ２−９）.
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：１６６．２（Ｃ７），１４３．４（Ｃ１０），１３１．６（Ｃ１１ ａｎｄ Ｃ１２），１２９．５（Ｃ１３），８４．５（Ｃ１），８２．９（Ｃ５），７９．９（Ｃ３），７４．７（Ｃ２），７１．９（Ｃ４），６３．４（Ｃ６），３６．８ ａｎｄ ３５．４（Ｃ８ ａｎｄ Ｃ９）.
【００２４】
実施例３ （潰瘍性大腸炎抑制効果試験）
（１）（試薬およびサンプルの調製）
ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）３０ｇを水道水１０００ｍＬに溶解し、３％ＤＳＳ溶液を調整した。ＰＥＩＴＣは、０．４ｍｇ／ｋｇ体重および２ｍｇ／ｋｇ体重、ＰＥＧＬＳは、２ｍｇ／ｋｇ体重および２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量になるようにコーン油に溶かして試験用サンプルとした。
【００２５】
（２）（試験方法）
雌５週齢ＩＣＲマウス４頭（清水実験材料より購入）を１群とし、コントロール群（ＣＴＬ）、対照群（ＤＳＳ）、ＰＥＩＴＣ投与群（０．４、２ｍｇ／ｋｇ体重）およびＰＥＧＬＳ投与群（２、２０ｍｇ／ｋｇ体重）の計６群に分けた。マウスへの投与スケジュールは図１（マウス大腸炎実験プロトコール）に示す。即ち、コントロール群には水道水を、対照群、ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳ投与群には７日目から３％ＤＳＳ水溶液を投与し大腸炎を誘導した。ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳ投与群には、２日に１回ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳのコーン油溶液を腹腔内投与した。ＤＳＳ投与開始から７日目に解剖をおこない、大腸は摘出後直ちに肛門から盲腸までの長さを測定した。結果は、図２に示す。
【００２６】
（３）（試験結果）
図２から、ＰＥＩＴＣの腹腔内投与群においては、ＤＳＳ投与によって引き起こされる大腸の萎縮が有意差を持って抑制され、潰瘍性大腸炎の予防・治療効果が判明した。また、ＰＥＧＬＳ投与群においても、大腸の萎縮に抑制傾向が見られた。一方、肝臓、腎臓、脾臓重量については特に各群で有意差はなかった（データは示さず）。
【００２７】
実施例４ （潰瘍性大腸炎抑制効果試験２）
（１）（試験用飼料の調製）
ＰＥＩＴＣ（０．２４，２．４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）、あるいはＰＥＧＬＳ（０．２４，２．４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）をメタノールに溶解してからＭＦ粉末飼料（基本飼料；オリエンタル酵母社製）に混ぜて試験用飼料とした。
【００２８】
（２）（試験方法）
雌５週齢ＩＣＲマウス５頭を１群とし、コントロール群（ＣＴＬ）、対照群（ＤＳＳ）、ＰＥＩＴＣ投与群（２．４、０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）およびＰＥＧＬＳ投与群（２．４、０．２４ｍｍｏｌ／ｋｇ飼料重量）の計６群に分け、２日間予備飼育してから実験に用いた。試験スケジュールは図３に示す。即ちコントロール群には、飲料水及び餌料（ＭＦペレット；オリエンタル酵母社製）を自由に与え、対照群には、最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、飼料は自由に与えた。ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＧＬＳ投与群は、最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（ｗ／ｖ）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、（１）で調製した試験用飼料を最初から試験終了（１４日間）まで与えた。実験開始後１４日目に解剖を行い、大腸は摘出後直ちに肛門から盲腸までの長さを測定した。結果は図４に示す。
【００２９】
（３）（試験結果）
図４から、ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＧＬＳ投与群ともに対照群より大腸の長さが長く、ともに大腸炎の抑制傾向を示した。即ち、ＰＥＩＴＣおよびＰＥＧＬＳは経口投与でも大腸炎抑制効果を示した。
【００３０】
実施例５ （大腸粘膜におけるＩＬ−１β産生量測定）
（１）（試験サンプルの調整）
実施例４で長さを測定した大腸を外科用はさみで開き、内容物を取り出した。大腸粘膜を外科用はさみで細かく刻み、粘膜１５〜２０ｍｇをＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μＬに懸濁し、ホモジナイザーを使用してさらに細かく粉砕し、ＰＢＳをさらに５００μＬ加えた後、混合物を遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）した。上清をＰＢＳで２０倍に希釈し試験溶液とした。
【００３１】
（２）（ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−１βの濃度測定）
ＩＬ−１βの濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．社製のＥｎｄｏｇｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＥＭＩＬ１Ｂ２）のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。即ち、ＩＬ−１β抗体がウェルの底についたプレートを用い、そこへ第１抗体５０μＬと試験溶液５０μＬを入れ、ウェルにシールでフタをし、２時間室温で放置した。次にウォッシングバッファーでウェルを３度洗い、第２抗体１００μＬを入れ、ウェルにシールでフタをし、３０分間室温で放置した。ウォッシングバッファーでウェルを３度洗い、ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質１００μＬを添加し、暗所で３０分間放置し、ストップバッファーを入れて反応をとめ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。同時にＩＬ−１βの検量線を作製し、試験溶液のＩＬ−１β濃度を算出した。また大腸粘膜のタンパク量も定量し、結果をタンパク質量当たりの値として補正した。結果を図５に示す。
【００３２】
（３）（試験結果）
図５から、大腸粘膜におけるＩＬ−１βの産生量は、ＰＥＩＴＣ投与群およびＰＥＩＬＳ投与群ともに対照群よりも少なく、ＰＥＩＴＣやＰＥＩＬＳがｉｎ ｖｉｖｏ試験でもＩＬ−１βの大腸粘膜における炎症性サイトカイン産生抑制効果を示すことがわかった。
【００３３】
実施例６ （３−ブテニルグルコシノレート（ＢＵＧＬＳ）の単離・精製）
収穫した大和マナ１１９ｇを８０℃に熱した１００ｍＬの蒸留水で２０分間処理し、ミロシナーゼを失活させた。その後、常温に戻したマナを蒸留水ごと、３０秒間ホモジナイズ、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの熱水抽出液と残渣を得た。また、残渣はもう一度、熱水抽出を行い、得られた熱水抽出液も１回目の熱水抽出液と合わせた。続いて、熱水抽出液に１Ｍ酢酸亜鉛を５ｍＬ添加し、攪拌することでタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行うことで、除タンパクを行った。得られた上清は、陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５）により精製を行い、最終的には分取ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｈｉｌｉｃ，ＣＨ３ＣＮ：１０ｍｍｏｌ／ｍＬ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．６）＝１：１，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）を行うことにより、３−ブテニルイソチオシアネート配糖体（３−ブテニルグルコシノレート）を単離した。本品は、黄色不定形粉末として得られ、水に可溶であった。高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより得られた分子イオンピークの値［ｍ／ｚ ３７２．０４２８５ （Ｍ−Ｈ）−Δ−０．０４ｍｍｕ］より、分子式がＣ１１Ｈ１９ＮＯ９Ｓ２であり、３−ブテニルイソチオシアネート配糖体の分子式と一致した。
本品の１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。そして、これらのスペクトルの解析から、本品は３−ブテニルイソチオシアネート配糖体であると決定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：５．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ１０），５．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２５＆１７．２４Ｈｚ，Ｈ−１１ａ），５．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２５＆１０．５０Ｈｚ，Ｈ−１１ｂ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８３Ｈｚ，Ｈ１），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．５９Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６３＆１２．５９，Ｈ−６ｂ），３．５７−３．４７（４Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ３，Ｈ４ ａｎｄ Ｈ５），２．８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２−９），２．４９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２−８）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：１６６．６（Ｃ７），１３９．６（Ｃ１０），１１８．８（Ｃ１１），８４．６（Ｃ１），８２．９（Ｃ５），７９．９（Ｃ３），７４．８（Ｃ２），７２．０（Ｃ４），６３．４（Ｃ６），３６．８ ａｎｄ ３５．４（Ｃ８ ａｎｄ Ｃ９）．
また、本品のミロシナーゼ（シグマ社より購入）反応生成物のＨＰＬＣ分析（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳＩＩ，ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４／６−（５ｍｉｎ）−４／６−（５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−１０／０−（５ｍｉｎ）−１０／０−（１０ｍｉｎ）−１０／０，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）の結果が標品の３−ブテニルイソチオシアネート（東京化成より購入）の結果と完全に一致した。
【００３４】
実施例７ （３−ブテニルイソチオシアネート（ＢＵＩＴＣ）の検出）
収穫した大和マナ１７ｇに１００ｍｌの蒸留水を添加し、３０秒間ホモジナイズし、３７℃で２時間放置し、生体内ミロシナーゼで反応させた。その後、ホモジナイズ液を、遠心分離（３１００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することで、マナの水抽出液を得た。続いて、水抽出液を等量の酢酸エチルで分配することにより、酢酸エチル画分を得、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。上記サンプルを用いたＨＰＬＣ分析（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳＩＩ，ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４／６−（５ｍｉｎ）−４／６−（５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−６／４−（７．５ｍｉｎ）−１０／０−（５ｍｉｎ）−１０／０−（１０ｍｉｎ）−１０／０，１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２５４ｎｍ）の結果、３−ブテニルイソチオシアネートの存在を確認した。
【００３５】
実施例８ （マウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−β産生抑制試験）
常法に従って用意したマウス腹腔マクロファージを、ＤＳＳ（１０μｇ／ｍＬ）で刺激を与え、ＩＬ−１β産生を誘発し、それに種々の濃度の３−ブテニルイソチオシアネート（ＢＵＩＴＣは東京化成より購入）および３−ブテニルグルコシノレート（ＢＵＧＬＳ）のＤＭＳＯ溶液（０．５％、ｖ／ｖ）を添加し、２４時間処理した後、遠心分離し、上清を実施例４と同様にＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１β濃度を測定した。ＢＵＩＴＣおよびＢＵＧＬＳのＩＬ−１β産生抑制作用を調べた結果、ＢＵＩＴＣは２μＭ、１０μＭでそれぞれ約５０％、１００％抑制した。一方、ＢＵＧＬＳは５０μＭで約９０％抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、植物食品由来のイソチオシアネートまたはその配糖体を含有することにより、副作用が少なく、持続的かつ予防的な摂取あるいは投与可能な潰瘍性大腸炎予防・治療剤、さらにそれを配合してなる医薬品および飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例３のマウス大腸炎実験プロトコールを示す。
【図２】実施例３の各群のマウスの大腸長を示す。
【図３】実施例４のマウス大腸炎実験プロトコールを示す
【図４】実施例４の各群のマウスの大腸長を示す
【図５】実施例５の各群のマウス大腸粘膜のＩＬ−１β産生量を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項２】
前記アブラナ科アブラナ属植物が大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）である請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項３】
前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項４】
前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである請求項３記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項５】
前記イソチオシアネート化合物が、アルケニルアルキルイソチオシアネートである請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項６】
前記アルケニルアルキルイソチオシアネート化合物が３−ブテニルイソチオシアネートである請求項５記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤を配合してなる医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤を配合してなる飲食品。
【請求項１】
アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物由来のイソチオシアネート化合物および／またはその配糖体を有効成分として含有することを特徴とする潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項２】
前記アブラナ科アブラナ属植物が大和マナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ．）である請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項３】
前記イソチオシアネート化合物が、アリールアルキルイソチオシアネートである請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項４】
前記アリールアルキルイソチオシアネート化合物がフェネチルイソチオシアネートである請求項３記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項５】
前記イソチオシアネート化合物が、アルケニルアルキルイソチオシアネートである請求項１記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項６】
前記アルケニルアルキルイソチオシアネート化合物が３−ブテニルイソチオシアネートである請求項５記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤を配合してなる医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の潰瘍性大腸炎予防・治療剤を配合してなる飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−７３８０４（Ｐ２００９−７３８０４Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２２７６７（Ｐ２００７−３２２７６７）
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１４日（２００７．１２．１４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【Ｆターム（参考）】
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