炭酸塩によるセメント工法
【課題】酸耐性に優れるのみならず、圧縮強度にも優れる炭酸塩を生成することができ、耐久性に優れる炭酸塩によるセメント工法を提供する。
【解決手段】炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法。
【解決手段】炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼ酵素による尿素の加水分解を用いて炭酸塩を沈殿させることによって地盤改良、グラウチング、および有害物質の不動化の技術として有用な炭酸塩によるセメント工法に関し、より詳細には、微生物の出す酵素の触媒作用を用いて炭酸塩を沈殿させるエネルギーコストが低い地盤改良、グラウト工および汚染土壌の固化等の技術として有用な炭酸塩によるセメント工法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、軟弱地盤上に構造物を築造する工事、液状化や斜面災害などの地盤防災工事、建設汚泥の有効利用に地盤改良、グラウト工、地盤安定処理等が行われている。これらには、セメントミルクや高分子の水系エマルジョンなどの固化材注入による方法、セメントや石灰などを混合する方法、または砂杭などを打設して圧密を促進する方法がある。いずれの方法も、基本的には地盤の構成物質である粒子結合を強くするための技術である。
【０００３】
しかしながら、注入材としての固化材は粘度が高く、間隙が小さい場合には注入が難しい。圧密促進工法は基本的に粒子結合を壊した後、圧密を促進させ密度増加によって粒子間の相互作用力を高めるものである。従って、強度回復と圧密沈下に長時間がかかる。また、既存構造物の下の地盤では圧密促進工法は構造物の沈下を引き起こすので、使用不可能である。このような問題点を解決するための技術が種々提案されており、例えば、特許文献１には、「カルシウムを含む地盤中に微生物を投入し、微生物の代謝作用により生成した炭酸ガスとカルシウムが反応して地盤を固結することを特徴とする地盤改良方法」が記載されており、微生物が代謝活動において有機栄養源から二酸化炭素を生じ、土壌中に溶解しているカルシウム、あるいは地盤中に注入したカルシウムと微生物の発生した二酸化炭素が反応し、土粒子間に炭酸カルシウムを析出・沈澱し、地盤を硬化することが記載されている。
【０００４】
しかしながら、炭酸カルシウム（カルサイト）は、酸に弱いという欠点がある。特に、日本各地の観測傾向から、河川中のｐＨで６．６〜７．２、浅層地下水で５．６〜６．６、深層地下水で６．７〜８．０を示すことが言われている。従って、強制的にアルカリ性条件下でカルサイトを沈殿させても、徐々に溶けるおそれが高い。つまり耐久性に問題がある。また、地盤中に含まれるカルシウムイオンの濃度は通常それほど高くは無く、それからカルサイトが生成できたとしても、地盤の効果が期待できるまでは数十年から数百年以上必要と思われ、実用上効果を期待できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−８０２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、酸耐性に優れるのみならず、圧縮強度にも優れる炭酸塩を生成することができ、耐久性に優れる炭酸塩によるセメント工法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、ウレアーゼ産生微生物により尿素を加水分解する反応を利用して炭酸塩を生成する際に、カルシウムイオンと、マグネシウムイオン、鉄イオン及び／又はストロンチウムイオンとを比率を変えて加えることによって異なる炭酸塩の結晶が生成し、酸耐性に優れるのみならず、固体との結合力が強い炭酸塩を生成することができることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法を提供する。ここで、本発明において、「炭酸塩によるセメント工法」とは、ウレアーゼ産生微生物と反応液を混合することによって炭酸塩を生成させ、固体と固体のセメンテーション、固体表面の被覆、固体空隙の充填を行う材料特性の改良又は修復工法である。なお、反応液とは、ウレアーゼ産生微生物、第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、マグネシウムイオン、鉄イオンおよびストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオン、尿素および適宜緩衝剤、更に、ウレアーゼ産生微生物を培養液中で培養した状態で配合する場合は培養液、尿素を水溶液又は懸濁液として配合する場合は尿素水溶液又は懸濁液、第１、第２金属イオンを金属塩の水溶液として配合する場合は金属塩水溶液からなる。本発明においては、上記ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９１）及び／又はスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ｎ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９２）を使用すると、より好適である。また、上記反応液中における上記（２）尿素の濃度が０．５〜２２００ｍＭであり、上記（３）第１金属イオンと上記（４）第２金属イオンの合計濃度が０．５〜２２００ｍＭであると、更に好適である。
【０００９】
そして、本発明のセメント工法は、上記炭酸塩の生成によって地盤中で土壌粒子を結合させたり、岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させたり、汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させたり、土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させたり、岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆したり、土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又は発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させたりするという態様で利用すると、より効果的である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酸耐性に優れるのみならず、圧縮強度にも優れる炭酸塩を生成することができ、耐久性に優れる炭酸塩によるセメント工法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のセメント工法に好適に使用できるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列解析による塩基配列を示す図面である。
【図２】本発明のセメント工法に好適に使用できるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の炭酸カルシウム生成能を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１における炭酸塩の経時的な生成量を示すグラフである。
【図４】上記実施例１により生成された炭酸塩の電子顕微鏡写真である。
【図５】本発明の実験例２の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例の実験方法を説明する生成カラムの概略正面図である。
【図７】本発明の実施例の実験方法を説明する装置の説明図である。
【図８】本発明の実施例及び比較例の測定炭酸カルシウムと推定一軸圧縮強さとの関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明につき更に詳細に説明すると、本発明のセメント工法は、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成するものであり、この生成された炭酸塩によって後述するように地盤中で土壌粒子を結合させたり、岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させたり、汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させたり、土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させたり、岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆したり、土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又はポリウレタンフォーム等の発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させたりすることができる。
【００１３】
ここで、本発明は、ウレアーゼ産生微生物が生成する酵素が触媒作用によって尿素を加水分解し、これによって生じた炭酸イオンと第１金属イオン、第２金属イオンとの反応によって炭酸塩が生成され、炭酸塩の結晶が沈殿するという反応を利用するものである。このような反応系の場合、炭酸イオンに対する第１金属イオンと第２金属イオンの反応速度、反応性の相違により、一方の金属イオンが優先的に反応する場合もあり、例えば、ウレアーゼ酵素そのものを用いたり、他の反応系により炭酸塩を生成するのであれば、ウレアーゼ酵素の失活によって必要量の炭酸イオンが生成されなくなったり、他方の金属イオンが反応するのに必要な炭酸イオン量が一方の金属イオンの優先的な反応によって消費されてしまうというような事態が生じる可能性があるが、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物が反応系の中で生存している限り、又は、産生した酵素が存在する限り、尿素の金属イオンの供給量に合わせて経時的に炭酸イオンが生成されるので、ウレアーゼ産生微生物を利用した炭酸塩の生成法は、本発明のように、異なった金属イオンを併用する場合に、特に好適である。
【００１４】
本発明で使用するウレアーゼ産生微生物は、ウレアーゼ産生能がある微生物であれば、その種類は特に制限されるものではなく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バシラス）属、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ（スポロサルシナ）属等の市販されている微生物、土壌などから抽出できる微生物などを好適に使用することができ、これらを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができるが、本発明のウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株を使用すると、他のウレアーゼ産生微生物に比べて尿素と塩化カルシウムなどの金属イオンを加えたときの炭酸塩の生成能に優れるので、より好適であり、特にスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、後述するように、カルシウムイオンの存在に対する耐性に優れるので、より好適である。
【００１５】
カルシウム耐性については、石灰水（Ｃａ（ＯＨ）２）または２０ｍＭのＣａＣｌ２溶液中で生存でき、かつウレアーゼ活性を有するかどうかを調べる。この段階でＣａに耐性がない微生物はたとえウレアーゼ産生微生物であっても除外される。したがって、ウレアーゼ活性そのものは炭酸塩生成にとって必要十分条件ではなく、あくまでもカルシウム存在のもとでウレアーゼ活性を調べる必要がある。そのためには、微生物が生存できる条件下で、所定の濃度の尿素および例えば塩化カルシウムを加え、尿素の加水分解によって生成する炭酸イオンとカルシウムとの反応によって炭酸塩が生成できるかどうかを調べる。例えば、図２に示した結果はスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株はカルシウム濃度が高くなるにつれ、曲線のこう配は下がることなく、むしろ高くなっている。これはカルシウムがウレアーゼ活性に対して全く影響されないことを示している。むしろ、カルシウムイオンがウレアーゼ活性を促進させているように見える。したがって、１Ｍのカルシウムイオンからは１Ｍの炭酸カルシウム、１．５Ｍのカルシウムイオンから１．５Ｍの炭酸カルシウムが生成している。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００９年８月６日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７９１（スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ． ＮＯ−Ａ１０株）、ＮＩＴＥ Ｐ−７９２（スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ． ＮＯ−Ｎ１０株）として寄託されている。
【００１６】
以下、本発明において好適に使用することができる新規ウレアーゼ産生微生物について説明する。本発明者らは、炭酸塩を生成させるための強いウレアーゼ活性を有するバクテリアを次のように抽出、また新株を開発した。我が国各地で行ったボーリングで得たコアサンプルを観察しながら、１ｍごとに約１０ｇの土壌をガラス瓶に取り、それぞれ約２０ミリリットルの石灰水（Ｃａ（ＯＨ）２）および濃度の異なる（０．５〜２０ｇ／リットル）ＣａＣｌ２溶液を加えて２日間放置した。これは炭酸塩の生成に使用するカルシウムイオンの耐性バクテリアを抽出するためである。これらのガラス瓶中で生存しているバクテリアを抽出し、そのうちで特に培養速度の速いバクテリアをコロニーの大きさで判断し、１サンプルから１０株の菌を得た。この段階でおよそ１５０株が得られた。それぞれの菌株を２０ミリリットルのペプトン液（濃度１０ｇ／リットル）で培養し、それを遠心分離してバクテリアを採取した。得られたバクテリアを試験管に移し、その中に１Ｍの尿素２０ミリリットルを入れてウレアーゼ活性を次の簡易方法によって調べた。菌がウレアーゼ活性を示す場合には、尿素の加水分解に伴うアンモニア発生によってｐＨが上昇する。従って、ｐＨが上昇するかどうかを調べることによってウレアーゼ活性が起こるかどうか調べることが可能である。
【００１７】
ｐＨが上昇したものについては、１ＭのＣａＣｌ２溶液を加えて炭酸塩が生成されるか（白濁するか）調べた。その結果、いずれもグラム陽性菌である３つの菌株が顕著なウレアーゼ活性を起こすことが分かった。これらの菌を再度培養して、それに１Ｍの尿素と１Ｍの塩化カルシウムを混合した液を加えて、実際に炭酸塩が生成するかどうかを調べた。その結果から最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株としてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の優位性が分かった。酸性土壌の場合、炭酸塩は生成しないので、アルカリ条件で反応時のｐＨを一定に保つため緩衝液（１００ｍＭの水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム、ｐＨ９．２５）を１０分の１に薄めて使用した。１．０Ｍ尿素と１．０Ｍ塩化カルシウム溶液を１０ｍＭアンモニウムバッファーでｐＨを９．２前後に上げてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株でタンカル生成量の実験をしていた際、短時間（３０分ほど）で沈殿が起こる試験管があり、これからスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株菌が再分離できた。このようにして、菌の変質が起こりアルカリ条件で培養可能な菌株として、新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株が現れた。バクテリアの培養に一般的に使われるペプトンやポリペプトンは高価で、大量の菌を生産するには不適である。そこで安価なＥＤＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）が使用可能かどうか調べたところ、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は問題なく、また、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株についても培養可能であることが分かった。
【００１８】
スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の同定を細菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列解析により行った。即ち、菌体サンプルを０．５ｍｌの滅菌水に懸濁し、ビーズビーディング法により破砕処理し、タンパク質を除去した後、磁性ビーズを用いて精製を行い、５０μｌのＤＮＡを得た。この精製ＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いた。ＰＣＲ増幅のＰＣＲ反応条件は、反応液組成は、１０Ｆ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、８００Ｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、×１０ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）５μｌ、２ｍＭ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）２μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌ、（Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μｌ）、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水３４μｌ、計５０μｌ、反応温度サイクルは、９４℃２分 １サイクル、９４℃１５秒 ６２℃３０秒 ７２℃５０秒 ２５サイクル、７２℃５分 １サイクルとした。ＰＣＲプライマー配列は、１０Ｆ（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’、配列番号１）、８００Ｒ（５’−ＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’、配列番号２）であり、使用装置は、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。
【００１９】
そして、下記の試薬及び機器を使用して、精製・シークエンス解析を行った。
＜ＰＣＲ産物精製＞
Ｍｏｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）
＜シークエンス試薬＞
ＢｉｏＤｙｅＲ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｖｌ．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンス反応物精製＞
ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ ＡｕｔｏＳｅｑ Ｇ−５０ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
＜シークエンサー＞
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンスプライマー＞
ＰＣＲプライマーをシークエンスプライマーとして用いて両鎖解析した。
【００２０】
得られたＤＮＡ配列を公共のデーターベースと照合して相同性検索（Ｂｌａｓｔ検索）を行い、近縁種を予測した。その結果、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に分類されるが、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に属する他の菌種とは配列を異にし、これらの新菌種に最も近縁な種は、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｉｌであるが、塩基配列の一部を異にすることが認められた。なお、図１にＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株の塩基配列（配列番号３）及び下記表１に相同性検索結果上位データを示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
以下、本発明において好適に使用されるスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ｎ１０株の菌学的性質を詳述する。
【００２３】
スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．ＮＯ−Ａ１０株（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００２４】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・強いウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
・カルシウムイオンに耐性を有する
・尿素に耐性を有する
【００２５】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地をオートクレイブした後、濾過滅菌した１／１０量の１００ｍＭのアンモニウムバファー（ＮＨ４ＯＨとＮＨ４Ｃｌを最終濃度１０ｍＭ）を無菌的に加えｐＨを８．２に調整して培養する。
・温度は１４〜３７℃で生育（至適温度２５〜３２℃）
・至適ｐＨは８〜９
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス ５ｇ
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
寒天 １５ｇ
【００２６】
スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．ＮＯ−Ｎ１０株（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００２７】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・ウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株と同種
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
【００２８】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地で温度１４〜３２℃で生育（至適温度２０〜２８℃）
・至適ｐＨは６．５〜８
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス ５ｇ
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
寒天 １５ｇ
【００２９】
これらの菌株のウレアーゼ活性を以下のようにして調べた。ウレアーゼ活性は尿素の加水分解のみでことは足りるが、ウレアーゼ産生微生物の中にはカルシウムイオンによってウレアーゼ活性が阻害されるものも少なくない。なお、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株はもともと２０ｍＭ塩化カルシウム溶液中で生存できるかどうか調べて、生き残った微生物である。従って、本発明では尿素と同じモル濃度の塩化カルシウムの存在下でウレアーゼ活性を調べた。この条件下では微生物のカルシウム耐性が同時に調べられる。またカルシウム耐性のみを調べるには、例えば、種々の濃度の塩化カルシウムで微生物の増殖が可能かどうか調べるとわかる。Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株は少なくとも１．５Ｍの塩化カルシウムのもとで培養可能である。なお、１Ｍの尿素が加水分解されると１Ｍの炭酸カルシウムが生成するので、炭酸カルシウム(カルサイト)の生成量がウレアーゼ活性を示すことになる。ここでは、尿素と塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を２Ｍの水溶液に調整し、それを適宜薄めて所定の濃度に調整した。また、同量の培養液から遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分間）したＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株またはＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ｎ１０株を同量の０．５％ＮａＣｌ溶液中に入れ、ｐＨ９になるようにアンモニア緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）を加えて全量を５ｍｌとして、室温２０℃で試験管の中で炭酸塩の沈殿量を測定した。なお、以下の実施例及び実験例では、全実験を通してウレアーゼ産生微生物は最終溶液の半分の体積の培養液で培養した量を使った。
【００３０】
なお、この場合の実験では、試験体を複数本準備しておいて、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩をろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に着いたものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着および底へ沈殿した。
【００３１】
結果を下記表２及び図２に示す。表２は、各反応時間における炭酸カルシウムの沈殿量（Ｍ）を記載したものである。図２のグラフの横軸は時間、縦軸は生成した炭酸塩の質量から変換した濃度を示している。なお、表２の濃度及び図２に示した凡例中の濃度は加えた塩化カルシウムの濃度を示す。すなわち、１Ｍの塩化カルシウム液を使用した場合、最終的には縦軸（炭酸カルシウム）が約１Ｍになるまで反応が進んでいる（反応式で１ＭのＣａＣｌ２から１ＭのＣａＣＯ３が生成）。この実験から明らかなように加えた尿素の全てが加水分解され、尿素の分解によって生成されたＣＯ３は、加えたＣａ全てと反応していることが分かる。その反応が終了するには、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株ではおよそ１０〜２５時間、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株では１２５時間以上要すると思われる。また、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株については、塩化カルシウム、尿素の濃度が１．５Ｍというように、高濃度の塩化カルシウム、尿素の存在下においても反応が短期間に起こるのは、炭酸塩生成時間の短縮化においてきわめて優位であると言える。更に、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は、上述したように、サンプリングした多数の土壌菌の中で特に顕著なウレアーゼ活性を起こす３つの菌株の中で最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株として優位性を示したものであり、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、このスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株と比較すると、更に、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められた。従って、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、従来のウレアーゼ産生微生物と比較すると、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められる。
【００３２】
【表２】
【００３３】
なお、この場合の実験では、試験体を複数本準備しておいて、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩をろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に着いたものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着および底へ沈殿した。
【００３４】
本発明のウレアーゼ産生微生物の配合割合は、特に制限されるものではないが、例えば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株を培養液中で培養した状態又は懸濁液とした状態で反応系に配合する場合、該培養液（又は懸濁液）を反応液全量に対して５０％（体積比）となる標準状態に配合するのであれば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株においては、培養液濃度０．４Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上が好ましく、より好適には培養液濃度０．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上、更に好適には培養液濃度０．８Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上である。一方、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株においては、培養液濃度１．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上が好ましく、より好適には培養液濃度１．８Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上、更に好適には培養液濃度２．０Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上である。なお、他のウレアーゼ産生微生物を利用する場合は、これらのウレアーゼ活性能と同等となるような濃度で配合すると、好適である。ウレアーゼ産生微生物の配合割合が小さすぎると、ウレアーゼ産生が少なすぎる場合がある。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の配合割合の上限は、特に制限されるものではないが、大きすぎると１個体当たりのウレアーゼ活性が低くなる場合があることを考慮すれば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株では１．６Ｏ．Ｄ６００（ｎｍ）以下、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株では２．２Ｏ．Ｄ６００（ｎｍ）以下であることが望ましい。
【００３５】
本発明で使用する尿素としては、市販の尿素を使用することができる。尿素の上記反応液中における濃度は、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。尿素の濃度が低すぎると加水分解が不足し、ｐＨが減少したり、炭酸イオンが不足する場合があり、高すぎるとアンモニアが過剰に発生してアンモニア臭が出る場合がある。
【００３６】
本発明は金属イオンとして、第１金属イオンであるカルシウムイオンと、第２金属イオンであるマグネシウムイオン、鉄イオン及び／又はストロンチウムイオンとを添加するものである。例えば、ウレアーゼ産生微生物と尿素を用いてカルサイトの沈殿を形成させると同様の方法を用いて、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２を加えることによりカルサイトとは異なる結晶鉱物を生成させる。
【００３７】
本発明の第１金属イオンであるカルシウムイオン、第二金属イオンであるマグネシウムイオン、鉄イオン、ストロンチウムイオンは、それぞれ、これらの金属イオンを含む金属イオン源を後述するように液中に配合することによって好適に供給される。このような金属イオン源は、その種類が特に制限されるものではないが、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、ストロンチウムの酸化物、水酸化物および塩化物で、特に塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００３８】
本発明は、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように配合するものであるが、多孔体中でセメント効果より止水効果を目的とする場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が９／１〜６／４となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは９／１〜７／３、更に好ましくは９／１〜８／２である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、加えたモル濃度に対して沈殿するモル濃度が低くなる場合があり、大きすぎると、結晶形状が単純で土粒子などの固体との結合が無くなる場合がある。一方、止水効果よりセメント効果を目的とする場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が７／３〜２／８となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは６／４〜３／７、更に好ましくは５／５〜４／６である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、水和炭酸カルシウムが生成する場合があり、大きすぎるとセメント効果が小さくなり、透水性が悪くなる場合がある。また、耐酸性被覆として使用する場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が８／２〜４／６となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは７／３〜５／５、更に好ましくは６／４〜４／６である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、水和炭酸カルシウムが生成する場合があり、大きすぎるとセメント効果が小さくなり、透水性が悪くなる場合がある。なお、これらとは別に、例えば、１回目の浸透で９／１〜８／２で、２回目以降に５／５〜４／６というふうに、適宜選択して使うこともできる。
【００３９】
本発明の反応液中における第１金属イオンを第２金属イオンの合計濃度は、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。金属イオンの合計濃度が低すぎると、生成炭酸塩の量が不足する場合があり、高すぎると、ウレアーゼ産生微生物の失活が起こる場合がある。
【００４０】
本発明において、ウレアーゼ産生微生物、尿素、第１金属イオン、第２金属イオンを反応液中に添加する手段、手順は、特に制限されず、例えば、適宜緩衝液、尿素、第１金属イオン、第２金属イオンを所定の濃度になるように加え、それに遠心分離したウレアーゼ産生微生物を加えて反応させる。遠心分離せずにウレアーゼ産生微生物の懸濁液を加える場合には、懸濁液の分を加えても尿素、第１金属イオン、第２金属イオンが初期の濃度になるように計算した量を予め加えておく。又は、ウレアーゼ産生微生物を前もって注入、または固着させておき、後から尿素、第１金属イオン、第２金属イオン、緩衝剤の混合液を浸透又は塗布してもよいし、一度にすべてを混合して浸透又は塗布してもよい。さらにはセメントのように土壌なとど混合してもよい。但し、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物と尿素との混合によって、反応が開始することを考慮すると、ウレアーゼ産生微生物の配合は、尿素と第１金属イオン、第２金属イオンとの混合後、又は同時とすることが好ましい。
【００４１】
本発明において炭酸塩を生成する際の反応条件は、温度及びｐＨに制限されるが、ｐＨは緩衝剤によって管理することができる。好適なｐＨはＭｇ／Ｃａ比によって異なると思われるが、アンモニア緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）を使用することで特に問題はない。また、反応温度も特に制限されないが、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物が反応系の中で生存している限り、尿素の供給量に合わせて経時的に炭酸イオンが生成されることを考慮すれば、使用するウレアーゼ産生微生物の生育温度、より好ましくは至適温度、至適ｐＨで反応させると、より効果的である。なお、一般に微生物の生存の適温はやや高温であることが多いが、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株のウレアーゼ活性の適温はおよそ少なくとも１４℃〜３２℃の範囲で生存又は培養可能である。温度管理が難しい地中の場合を考えると、わが国では高山を除いて土壌深さが数ｍになれば地温は１９〜２０℃であるので、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株はわが国のように温帯域に適している。
【００４２】
本発明の炭酸塩によるセメント工法において、その施工方法などは特に制限されるものではなく、例えば、培養したバクテリア液（Ｂ液）と、尿素、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの第１金属イオン源、第２金属イオン源および緩衝液を適量だけ混合した反応液（Ｒ液）を土壌に注入、又は土壌と混合し、反応によって沈殿する炭酸塩によって土粒子を結合させることができる。この場合、触媒作用による反応なので、Ｒ液を加える限り反応が進む。なお、炭酸塩のセメント効果や透水性は注入されたＲ液の濃度と量で管理し、粒子質量に対する炭酸塩の量で評価する。地盤の場合、Ｂ液およびＲ液の注入はボーリング孔を利用して、地盤の透水係数や地下水位を加味して行う。地下へ注入した溶液の管理には隣接した井戸またはボーリング孔からの揚水または汲み上げによって行う。固体の亀裂や穴を埋めるには、その中にＢ液およびＲ液またはそれらの混合液を注入して、反応させて炭酸塩を沈殿させる。亀裂や穴が大きい場合には、あらかじめ砂、ガラス玉または繊維等を充填しておき、Ｂ液およびＲ液、またはそれらを混合させたものを注入して炭酸塩を沈殿させる。固体表面で炭酸塩を沈殿させるには、不織布などの表面張力を利用してＢ液およびＲ液を保持させた状態で固体表面における炭酸塩の沈殿を促す。Ｂ液を汚泥に混合して、それをＲ液中で養生することによって汚泥粒子表面で炭酸塩を沈殿させて、汚泥粒子を粒状化させる。掘削土を盛土に使う際に、強度が必要とされる場合にＢ液とＲ液を混合し、炭酸塩の沈殿によって土を固化させる。強い固化が必要な場合にはＲ液を散布または表面に溜めて土中に浸透させる。汚染物質の不動化には、汚染土壌にＢ液を混合させ、それにＲ液を加えて炭酸塩が沈殿する際に汚染物質を取り込む作用を利用する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００４４】
［実験例１及び比較例１］
ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を用いて、以下の実験例１を行った。１Ｍ尿素−０．５ＭＣａＣｌ２−０．５ＭＭｇＣｌ２−緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）１００ミリリットルを作成した。また、１００ミリリットルのスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を培養液（ＥＤＣ １０ｇ／リットル）から遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分間）した微生物を１００ミリリットルの０．５％ＮａＣｌ水溶液に薄めた。その１０ミリリットルをピペットで取り、尿素−ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２−緩衝液からなる水溶液１０ミリリットルに加えた。室温２０℃で試験管を振盪させて所定の時間後に試験管の中の炭酸塩の沈殿量を測定した。なお、すべての実施例、実験例、比較例では、全実験を通してウレアーゼ産生微生物は最終溶液の半分の体積の培養液で培養した量を使った。なお、実験例１では１０本の試験管の検体を準備して、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩はろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に付着したものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着または底へ沈殿した。
【００４５】
次に、実験例１において、１Ｍ尿素水溶液に代えて０．５Ｍ尿素水溶液を使用し、０．５ＭＣａＣｌ２−０．５ＭＭｇＣｌ２水溶液に代えて０．５ＭＭｇＣｌ２水溶液を加えた以外は、実験例１と同様にして比較例１の炭酸塩を生成し、その生成量を実験例１と同様にして調べた。また、各時間における反応液のｐＨを測定した。これらの結果を下記表３及び図３に示す。実験例１の場合、およそ２０時間後には加えた量の約６５％の沈殿が生成した。その後徐々に沈殿量は増えて最終的には８０％程度まで増加すると思われる。約９時間後の電子顕微鏡写真を図４に示す。一方、比較例１の場合、約１５時間で８０％の沈殿が起こった。比較例１では、マグネサイトが生成した。
【００４６】
【表３】
【００４７】
［実験例２］
次に、Ｃａイオン／Ｍｇイオン（モル比）の割合を表４及び表５に示すように変えて、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素を加えて炭酸塩を以下のように生成し、得られた炭酸塩の量を以下の実験方法、評価方法によって評価した。結果を下記表４及び表５に併記すると共に、図５に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
＜実験方法＞
緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）をベースに１ＭＣａＣｌ２と１Ｍ尿素を加えて２００ミリリットル（Ｃａ液）を準備した。また、緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）に１Ｍ ＭｇＣｌ２と１Ｍ尿素を加えた混合溶液２００ミリリットル （Ｍｇ液）を準備した。Ｃａ液とＭｇ液を所定の割合で混ぜて１０ミリリットルに分取した。その割合はＭｇ／Ｃａ比で１０：０，９：１，８：２，７：３，５：５，４：６，３：７，２：８，１：９，０：１０である。また、培養した菌体溶液２００ミリリットルを５０ミリリットルずつ分けて、４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み溶液を除き、沈殿した菌体に０．５％ＮａＣｌ溶液をそれぞれ５０ミリリットル加えた。これらから１０ミリリットルをメスピペットで取り、ＣａとＭｇの混合液１０ミリリットルに加えた。これから５ミリリットルをメスピペットで取り試験体とした。その後、約２０℃で振盪させて、７２時間及び１週間後に沈殿物の質量を測った。沈殿物は溶液中と試験管ガラス壁に付着したものに分けて測定した。溶液中の沈殿はろ過して乾燥質量を、試験管に付着したものは乾燥して試験管と沈殿物の質量を測定した。ろ紙および試験管の質量をそれぞれの測定値から差し引いて、それらを加えたものを全沈殿物とした。
【００５１】
図５から、つぎのことがわかる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）が０．２以下の場合、炭酸マグネシウム（マグネサイト）又は炭酸マグネシウム又はＣａ−炭酸マグネシウムが生成し、７２時間以降も沈殿が起こり続ける。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．３のとき、沈殿は７２時間で終了していると思われ、そのときの沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は１：１である。沈殿速度の点からは安定していると考えられる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．５のとき、１週間後に沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は０．５となっている。上記実験例２では沈殿量を時間で示してあるが、この場合も１６９時間後に０．７４３Ｍの沈殿が起こっており、この結果と一致する。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＞０．７ではＭｇの沈殿量は相対的に少なく、基本的にＭｇはＭｇ−カルサイトの生成に寄与するものと考えられる。沈殿速度は比較的速く、７２時間でほぼ安定している。
【００５２】
［実施例１〜５及び比較例２、３］
上記実験例２ではＭｇ／Ｃａ比＝１．０で行った実験結果から沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は０．５であった。このことは、加えたカルシウムはほぼ全部（全体の５０％）、マグネシウムが加えた量の５０％（全体の約２５％）が沈殿したことを示している。また、Ｍｇ／Ｃａ比が０の場合には、カルシウムのほぼ１００％がカルサイトとして沈殿した。したがって、Ｍｇ／Ｃａ比が異なることによる沈殿鉱物の違いによる影響を調べるために、カラム生成実験行った。この実験では砂（密度：１．４２ｇ／ｃｍ３、間隙比：０．８６）に反応液（Ｍｇ／Ｃａ比が１と０）をそれぞれ浸透させ、針貫入試験（株式会社丸東製作所の軟岩ぺネトロ計）を行って、その結果より一軸圧縮強さを推定して比較した。得られた結果を下記表６に示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
＜実験方法＞
上記実施例１〜４及び比較例２、３の作成方法を図６の生成カラムの概略正面図を用いて説明する。図６において１は、生成カラムである。この生成カラム１は、内径４３ｍｍの透明のアクリルパイプであり、その下端側にゴム栓２をつけ、内壁にはポリピレンの薄いシートを張り付け、その中に粗砂３（高さ約２ｃｍ）、細砂４（９ｃｍ）、粗砂３（約２ｃｍ）の順に水中堆積させた。このとき、余り緩くならないように適度に振動を与えながら堆積をさせた。なお、図中の数字は、アクリルパイプ１の長さ（１８０ｍｍ）、細砂４の高さ（９０ｍｍ）を示す。粗砂３と細砂４、細砂４と粗砂３との間には、ろ紙５，５を敷いた。底のゴム栓２には排液口６を取り付けた。供試体は６本準備（実施例１〜４、比較例２、３）した。その概要は、上記表６のとおりである。供試体内の水を排水した後、表６に示すような金属イオンで作成した反応液１５０ミリリットルを上部から流し入れて、最終的に溶液表面が上部粗砂の表面に来たとき排液を止めた。なお、ウレアーゼ産生微生物は、流し入れる直前に混合したが、培養液をそのまま使用したので、金属イオン、尿素等は２倍の濃度にしておいて、培養液で薄まって所定の濃度になるようにした。反応は１日間として、次の日には実施例１を除いて、上から新しい反応液を入れて同じ操作を繰り返した。以降、浸透回数を上記表６のようにした。
【００５５】
表６には炭酸塩含有量は計算によるものと、実際に測定したものを示した。計算に依る方法は次のように行った。実施例１〜４はＭｇ／Ｃａ比が１で行ったので、沈殿量は０．７５Ｍとなる。また、ＭｇとＣａの沈殿割合は１：２であるので、実際の沈殿物の分子量は１／２（１／３Ｍｇ＋２／３Ｃａ＋２ＣＯ３）であり、０．５（０．３３３×２４＋０．６６７×４０＋１２０）＝７７．３３となる。従って、その０．７５Ｍは０．７５×７７．３３＝５８．０ｇ。一方、砂の間隙比は０．８６であるので、間隙と固体粒子の体積比は０．８６：１となる。即ち、間隙中が反応液で満たされているので、固体の体積を１ｃｍ３とすると、間隙の体積は０．８６ｃｍ３となる。したがって、この間隙中沈殿物の量は、５８ｇ×０．８６／１０００＝０．０５０ｇとなる。炭酸塩含有量の定義は、質量比で炭酸塩／（炭酸塩＋他の固体）であるので、１間隙体積による沈殿量は次のように表せる。Ｍｇ／Ｃａ＝０．５において、砂の密度を２．６５ｇ／ｃｍ３とすると、ドロマイト沈殿量＝０．０５／（０．０５＋２．６５×１）×１００（％）＝１．８５２％、すなわち、実施例１〜４において、１間隙体積（浸透中の沈殿はごく少量で無視）では１．８５２％の炭酸塩が生成する。従って、これに浸透回数分だけ乗じればその場合の炭酸塩含有量が得られる。カルサイトに対しては１ＭのＣａを加えると１Ｍのカルシウムが生成するので、分子量１００で計算すると、１間隙体積に対して沈殿量は１００×０．８６／１０００＝０．０８６ｇとなる。従って、１間隙体積に対してカルサイトの沈殿量は、カルサイト沈殿量＝０．０８６／（０．０８６＋２．６５×１）＝３．１４％となる。２間隙体積では６．２８％、３間隙体積では９．４％となる。
【００５６】
炭酸塩の含有量は、強塩酸によって溶かし、発生するＣＯ２ガス圧を測定して決定できる。これには図７のような装置と市販の炭酸カルシウムを使って得たキャリブレーションが必要である。図７において１０はガス圧測定器であり、このガス圧測定器１０は、反応容器１１内で、試料１２を強塩酸１３によって溶かし、発生するＣＯ２ガス圧を測定するものである。即ち、各供試体の上部粗砂をドライバーなどで削り取って、針貫入試験を行った後、細砂試料を数ｇ取り出し、１１０℃で炉乾燥する。反応容器１１内で、炉乾燥した試料約０．５ｇ（試料１２）を３ＮのＨＣｌ（強塩酸１３）で溶かし、ガス圧測定器１０で発生するＣＯ２ガス圧を測定して、キャリブレーション図から炭酸カルシウムの量を決定し、それを乾燥試料質量で除して百分率で表すと炭酸カルシウム含有量となる。なお、図７において反応容器１１は、内部の様子を説明するために透明容器として示した。沈殿物のＭｇ／Ｃａ比が０．５の場合には、まず炭酸カルシウムと同様に炭酸カルシウム含有量を求めて、それにドロマイトとカルサイトの分子量の比（７７／１００）を乗じて炭酸塩の含有量とする。炭酸塩の計算値と実測値はやや誤差はあるが、ノジュールの生成や、粒子集合体における不均一性から考えると満足できる範囲にあると考えられる。
【００５７】
反応液浸透実験後、そのまま１ヶ月放置しておいて、反応液を排出して自然乾燥後に針貫入試験を行った。針貫入は上部粗砂を取り除き細砂の表面部を露出させた状態で行った。場所を変えて数回貫入抵抗と貫入量を測定し、針貫入抵抗を貫入量で除して貫入勾配を求めた。それを平均したものを表７に示した。推定一軸圧縮強さは次の関係式から推定した。なお、この方法は、これまで土木学会の岩盤力学委員会で指針が作られている。
ｙ＝０．９７８ｘ＋２．５９９
ここに、ｙ：一軸圧縮強さの対数値、ｙ：貫入勾配の対数値である。ある報告によると、天然岩石１１４個、セメント処理試料５０個で調べた結果、上式の相関係数は０．９１４である。
【００５８】
図８は、測定炭酸塩と推定一軸圧縮強さの関係を示す。これより、同じ炭酸塩含有量では、ドロマイト（実施例１〜４）のセメント効果がカルサイト（比較例１、２）の約３倍あることがわかる。また、１Ｍ以下の炭酸塩濃度では炭酸塩は一軸圧縮強さにほとんど寄与しないことがわかる。ただし、観察からは粒子相互の結合は部分的に見られ、また炭酸塩のノジュール（純度の高い球形の塊）が形成されている。ドロマイトの炭酸塩含有率に対する強度増加率は０．４５（ＭＰａ／％）、またカルサイトの強度増加率は０．３３（ＭＰａ／％）であり、どちらも極めて高いといえる。
【００５９】
＜耐酸性に対する実験方法＞
針貫入試験で用いた実施例３と比較例３の共試体を用いて耐酸性の実験を行った。酸として酢酸を用いた。純度９９．７％、比重１．０４９の酢酸３０ミリリットルを１リットルの蒸留水に溶かし．約０．５Ｍの酢酸を準備した。この溶液のｐＨは２．６８であった。実施例３と比較例３の供試体の上下を逆にして、酢酸７０ミリリットルを流した。どちらの試料も気泡を生じた。しばらくして、それぞれ上から７０ミリリットルの水を流したあと、１時間放置した。実施例３及び比較例３の供試体のパイプ中の粗砂を取り除き、細砂の表面を露出させて、針貫入面とした。
【００６０】
測定結果を下記表７に示す。実施例３の供試体では酢酸による洗浄で一軸圧縮強さが３９％減少したのに対し、比較例３の供試体では６６％減少した。このことから、次のことが考えられる。
Ｍｇの影響で耐酸性が増大する。
実施例３の沈殿物のかなりの部分が溶けたことから、全てがドロマイトではなくカルサイトまたはＭｇ−カルサイトである可能性が高い。
比較例３の沈殿物の全てが純粋なカルサイトではなく、砂の中に混入していた他のイオンの影響を受けて沈殿したものと思われる。従って、耐酸性が少し高い可能性がある。
【００６１】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のセメント工法の応用可能な土木技術としては、例えば、地震時の液状化対策、盛土の補強、構造物下の地盤補強、宅地の地盤改良、岩盤クラックおよびコンクリートひび割れの充填(グラウト)、砂杭の補強または固化、高レベル放射性廃棄物処分場におけるバッファ材料および岩盤の止水、道路の路床および路盤の補強、河川堤防の補強、地すべり対策、がけ崩れ対策、アースダムの止水、土壌中の重金属の不動化、廃棄物最終処分場の止水対策、土石流対策等である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼ酵素による尿素の加水分解を用いて炭酸塩を沈殿させることによって地盤改良、グラウチング、および有害物質の不動化の技術として有用な炭酸塩によるセメント工法に関し、より詳細には、微生物の出す酵素の触媒作用を用いて炭酸塩を沈殿させるエネルギーコストが低い地盤改良、グラウト工および汚染土壌の固化等の技術として有用な炭酸塩によるセメント工法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、軟弱地盤上に構造物を築造する工事、液状化や斜面災害などの地盤防災工事、建設汚泥の有効利用に地盤改良、グラウト工、地盤安定処理等が行われている。これらには、セメントミルクや高分子の水系エマルジョンなどの固化材注入による方法、セメントや石灰などを混合する方法、または砂杭などを打設して圧密を促進する方法がある。いずれの方法も、基本的には地盤の構成物質である粒子結合を強くするための技術である。
【０００３】
しかしながら、注入材としての固化材は粘度が高く、間隙が小さい場合には注入が難しい。圧密促進工法は基本的に粒子結合を壊した後、圧密を促進させ密度増加によって粒子間の相互作用力を高めるものである。従って、強度回復と圧密沈下に長時間がかかる。また、既存構造物の下の地盤では圧密促進工法は構造物の沈下を引き起こすので、使用不可能である。このような問題点を解決するための技術が種々提案されており、例えば、特許文献１には、「カルシウムを含む地盤中に微生物を投入し、微生物の代謝作用により生成した炭酸ガスとカルシウムが反応して地盤を固結することを特徴とする地盤改良方法」が記載されており、微生物が代謝活動において有機栄養源から二酸化炭素を生じ、土壌中に溶解しているカルシウム、あるいは地盤中に注入したカルシウムと微生物の発生した二酸化炭素が反応し、土粒子間に炭酸カルシウムを析出・沈澱し、地盤を硬化することが記載されている。
【０００４】
しかしながら、炭酸カルシウム（カルサイト）は、酸に弱いという欠点がある。特に、日本各地の観測傾向から、河川中のｐＨで６．６〜７．２、浅層地下水で５．６〜６．６、深層地下水で６．７〜８．０を示すことが言われている。従って、強制的にアルカリ性条件下でカルサイトを沈殿させても、徐々に溶けるおそれが高い。つまり耐久性に問題がある。また、地盤中に含まれるカルシウムイオンの濃度は通常それほど高くは無く、それからカルサイトが生成できたとしても、地盤の効果が期待できるまでは数十年から数百年以上必要と思われ、実用上効果を期待できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−８０２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、酸耐性に優れるのみならず、圧縮強度にも優れる炭酸塩を生成することができ、耐久性に優れる炭酸塩によるセメント工法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を行った結果、ウレアーゼ産生微生物により尿素を加水分解する反応を利用して炭酸塩を生成する際に、カルシウムイオンと、マグネシウムイオン、鉄イオン及び／又はストロンチウムイオンとを比率を変えて加えることによって異なる炭酸塩の結晶が生成し、酸耐性に優れるのみならず、固体との結合力が強い炭酸塩を生成することができることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法を提供する。ここで、本発明において、「炭酸塩によるセメント工法」とは、ウレアーゼ産生微生物と反応液を混合することによって炭酸塩を生成させ、固体と固体のセメンテーション、固体表面の被覆、固体空隙の充填を行う材料特性の改良又は修復工法である。なお、反応液とは、ウレアーゼ産生微生物、第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、マグネシウムイオン、鉄イオンおよびストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオン、尿素および適宜緩衝剤、更に、ウレアーゼ産生微生物を培養液中で培養した状態で配合する場合は培養液、尿素を水溶液又は懸濁液として配合する場合は尿素水溶液又は懸濁液、第１、第２金属イオンを金属塩の水溶液として配合する場合は金属塩水溶液からなる。本発明においては、上記ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９１）及び／又はスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ｎ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９２）を使用すると、より好適である。また、上記反応液中における上記（２）尿素の濃度が０．５〜２２００ｍＭであり、上記（３）第１金属イオンと上記（４）第２金属イオンの合計濃度が０．５〜２２００ｍＭであると、更に好適である。
【０００９】
そして、本発明のセメント工法は、上記炭酸塩の生成によって地盤中で土壌粒子を結合させたり、岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させたり、汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させたり、土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させたり、岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆したり、土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又は発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させたりするという態様で利用すると、より効果的である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酸耐性に優れるのみならず、圧縮強度にも優れる炭酸塩を生成することができ、耐久性に優れる炭酸塩によるセメント工法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のセメント工法に好適に使用できるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列解析による塩基配列を示す図面である。
【図２】本発明のセメント工法に好適に使用できるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の炭酸カルシウム生成能を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１における炭酸塩の経時的な生成量を示すグラフである。
【図４】上記実施例１により生成された炭酸塩の電子顕微鏡写真である。
【図５】本発明の実験例２の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例の実験方法を説明する生成カラムの概略正面図である。
【図７】本発明の実施例の実験方法を説明する装置の説明図である。
【図８】本発明の実施例及び比較例の測定炭酸カルシウムと推定一軸圧縮強さとの関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明につき更に詳細に説明すると、本発明のセメント工法は、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成するものであり、この生成された炭酸塩によって後述するように地盤中で土壌粒子を結合させたり、岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させたり、汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させたり、土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させたり、岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆したり、土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又はポリウレタンフォーム等の発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させたりすることができる。
【００１３】
ここで、本発明は、ウレアーゼ産生微生物が生成する酵素が触媒作用によって尿素を加水分解し、これによって生じた炭酸イオンと第１金属イオン、第２金属イオンとの反応によって炭酸塩が生成され、炭酸塩の結晶が沈殿するという反応を利用するものである。このような反応系の場合、炭酸イオンに対する第１金属イオンと第２金属イオンの反応速度、反応性の相違により、一方の金属イオンが優先的に反応する場合もあり、例えば、ウレアーゼ酵素そのものを用いたり、他の反応系により炭酸塩を生成するのであれば、ウレアーゼ酵素の失活によって必要量の炭酸イオンが生成されなくなったり、他方の金属イオンが反応するのに必要な炭酸イオン量が一方の金属イオンの優先的な反応によって消費されてしまうというような事態が生じる可能性があるが、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物が反応系の中で生存している限り、又は、産生した酵素が存在する限り、尿素の金属イオンの供給量に合わせて経時的に炭酸イオンが生成されるので、ウレアーゼ産生微生物を利用した炭酸塩の生成法は、本発明のように、異なった金属イオンを併用する場合に、特に好適である。
【００１４】
本発明で使用するウレアーゼ産生微生物は、ウレアーゼ産生能がある微生物であれば、その種類は特に制限されるものではなく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バシラス）属、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ（スポロサルシナ）属等の市販されている微生物、土壌などから抽出できる微生物などを好適に使用することができ、これらを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができるが、本発明のウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株を使用すると、他のウレアーゼ産生微生物に比べて尿素と塩化カルシウムなどの金属イオンを加えたときの炭酸塩の生成能に優れるので、より好適であり、特にスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、後述するように、カルシウムイオンの存在に対する耐性に優れるので、より好適である。
【００１５】
カルシウム耐性については、石灰水（Ｃａ（ＯＨ）２）または２０ｍＭのＣａＣｌ２溶液中で生存でき、かつウレアーゼ活性を有するかどうかを調べる。この段階でＣａに耐性がない微生物はたとえウレアーゼ産生微生物であっても除外される。したがって、ウレアーゼ活性そのものは炭酸塩生成にとって必要十分条件ではなく、あくまでもカルシウム存在のもとでウレアーゼ活性を調べる必要がある。そのためには、微生物が生存できる条件下で、所定の濃度の尿素および例えば塩化カルシウムを加え、尿素の加水分解によって生成する炭酸イオンとカルシウムとの反応によって炭酸塩が生成できるかどうかを調べる。例えば、図２に示した結果はスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株はカルシウム濃度が高くなるにつれ、曲線のこう配は下がることなく、むしろ高くなっている。これはカルシウムがウレアーゼ活性に対して全く影響されないことを示している。むしろ、カルシウムイオンがウレアーゼ活性を促進させているように見える。したがって、１Ｍのカルシウムイオンからは１Ｍの炭酸カルシウム、１．５Ｍのカルシウムイオンから１．５Ｍの炭酸カルシウムが生成している。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００９年８月６日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７９１（スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ． ＮＯ−Ａ１０株）、ＮＩＴＥ Ｐ−７９２（スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ． ＮＯ−Ｎ１０株）として寄託されている。
【００１６】
以下、本発明において好適に使用することができる新規ウレアーゼ産生微生物について説明する。本発明者らは、炭酸塩を生成させるための強いウレアーゼ活性を有するバクテリアを次のように抽出、また新株を開発した。我が国各地で行ったボーリングで得たコアサンプルを観察しながら、１ｍごとに約１０ｇの土壌をガラス瓶に取り、それぞれ約２０ミリリットルの石灰水（Ｃａ（ＯＨ）２）および濃度の異なる（０．５〜２０ｇ／リットル）ＣａＣｌ２溶液を加えて２日間放置した。これは炭酸塩の生成に使用するカルシウムイオンの耐性バクテリアを抽出するためである。これらのガラス瓶中で生存しているバクテリアを抽出し、そのうちで特に培養速度の速いバクテリアをコロニーの大きさで判断し、１サンプルから１０株の菌を得た。この段階でおよそ１５０株が得られた。それぞれの菌株を２０ミリリットルのペプトン液（濃度１０ｇ／リットル）で培養し、それを遠心分離してバクテリアを採取した。得られたバクテリアを試験管に移し、その中に１Ｍの尿素２０ミリリットルを入れてウレアーゼ活性を次の簡易方法によって調べた。菌がウレアーゼ活性を示す場合には、尿素の加水分解に伴うアンモニア発生によってｐＨが上昇する。従って、ｐＨが上昇するかどうかを調べることによってウレアーゼ活性が起こるかどうか調べることが可能である。
【００１７】
ｐＨが上昇したものについては、１ＭのＣａＣｌ２溶液を加えて炭酸塩が生成されるか（白濁するか）調べた。その結果、いずれもグラム陽性菌である３つの菌株が顕著なウレアーゼ活性を起こすことが分かった。これらの菌を再度培養して、それに１Ｍの尿素と１Ｍの塩化カルシウムを混合した液を加えて、実際に炭酸塩が生成するかどうかを調べた。その結果から最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株としてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の優位性が分かった。酸性土壌の場合、炭酸塩は生成しないので、アルカリ条件で反応時のｐＨを一定に保つため緩衝液（１００ｍＭの水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム、ｐＨ９．２５）を１０分の１に薄めて使用した。１．０Ｍ尿素と１．０Ｍ塩化カルシウム溶液を１０ｍＭアンモニウムバッファーでｐＨを９．２前後に上げてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株でタンカル生成量の実験をしていた際、短時間（３０分ほど）で沈殿が起こる試験管があり、これからスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株菌が再分離できた。このようにして、菌の変質が起こりアルカリ条件で培養可能な菌株として、新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株が現れた。バクテリアの培養に一般的に使われるペプトンやポリペプトンは高価で、大量の菌を生産するには不適である。そこで安価なＥＤＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）が使用可能かどうか調べたところ、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は問題なく、また、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株についても培養可能であることが分かった。
【００１８】
スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の同定を細菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ部分配列解析により行った。即ち、菌体サンプルを０．５ｍｌの滅菌水に懸濁し、ビーズビーディング法により破砕処理し、タンパク質を除去した後、磁性ビーズを用いて精製を行い、５０μｌのＤＮＡを得た。この精製ＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いた。ＰＣＲ増幅のＰＣＲ反応条件は、反応液組成は、１０Ｆ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、８００Ｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、×１０ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）５μｌ、２ｍＭ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）２μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌ、（Ｔｅｍｐｌａｔｅ １μｌ）、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水３４μｌ、計５０μｌ、反応温度サイクルは、９４℃２分 １サイクル、９４℃１５秒 ６２℃３０秒 ７２℃５０秒 ２５サイクル、７２℃５分 １サイクルとした。ＰＣＲプライマー配列は、１０Ｆ（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’、配列番号１）、８００Ｒ（５’−ＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’、配列番号２）であり、使用装置は、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。
【００１９】
そして、下記の試薬及び機器を使用して、精製・シークエンス解析を行った。
＜ＰＣＲ産物精製＞
Ｍｏｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）
＜シークエンス試薬＞
ＢｉｏＤｙｅＲ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｖｌ．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンス反応物精製＞
ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ ＡｕｔｏＳｅｑ Ｇ−５０ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
＜シークエンサー＞
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンスプライマー＞
ＰＣＲプライマーをシークエンスプライマーとして用いて両鎖解析した。
【００２０】
得られたＤＮＡ配列を公共のデーターベースと照合して相同性検索（Ｂｌａｓｔ検索）を行い、近縁種を予測した。その結果、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に分類されるが、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に属する他の菌種とは配列を異にし、これらの新菌種に最も近縁な種は、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｉｌであるが、塩基配列の一部を異にすることが認められた。なお、図１にＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株の塩基配列（配列番号３）及び下記表１に相同性検索結果上位データを示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
以下、本発明において好適に使用されるスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ｎ１０株の菌学的性質を詳述する。
【００２３】
スポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．ＮＯ−Ａ１０株（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００２４】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・強いウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
・カルシウムイオンに耐性を有する
・尿素に耐性を有する
【００２５】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地をオートクレイブした後、濾過滅菌した１／１０量の１００ｍＭのアンモニウムバファー（ＮＨ４ＯＨとＮＨ４Ｃｌを最終濃度１０ｍＭ）を無菌的に加えｐＨを８．２に調整して培養する。
・温度は１４〜３７℃で生育（至適温度２５〜３２℃）
・至適ｐＨは８〜９
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス ５ｇ
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
寒天 １５ｇ
【００２６】
スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．ＮＯ−Ｎ１０株（１６Ｓ ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００２７】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・ウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株と同種
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
【００２８】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地で温度１４〜３２℃で生育（至適温度２０〜２８℃）
・至適ｐＨは６．５〜８
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス ５ｇ
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
寒天 １５ｇ
【００２９】
これらの菌株のウレアーゼ活性を以下のようにして調べた。ウレアーゼ活性は尿素の加水分解のみでことは足りるが、ウレアーゼ産生微生物の中にはカルシウムイオンによってウレアーゼ活性が阻害されるものも少なくない。なお、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株はもともと２０ｍＭ塩化カルシウム溶液中で生存できるかどうか調べて、生き残った微生物である。従って、本発明では尿素と同じモル濃度の塩化カルシウムの存在下でウレアーゼ活性を調べた。この条件下では微生物のカルシウム耐性が同時に調べられる。またカルシウム耐性のみを調べるには、例えば、種々の濃度の塩化カルシウムで微生物の増殖が可能かどうか調べるとわかる。Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株は少なくとも１．５Ｍの塩化カルシウムのもとで培養可能である。なお、１Ｍの尿素が加水分解されると１Ｍの炭酸カルシウムが生成するので、炭酸カルシウム(カルサイト)の生成量がウレアーゼ活性を示すことになる。ここでは、尿素と塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を２Ｍの水溶液に調整し、それを適宜薄めて所定の濃度に調整した。また、同量の培養液から遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分間）したＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０株またはＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ｎ１０株を同量の０．５％ＮａＣｌ溶液中に入れ、ｐＨ９になるようにアンモニア緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）を加えて全量を５ｍｌとして、室温２０℃で試験管の中で炭酸塩の沈殿量を測定した。なお、以下の実施例及び実験例では、全実験を通してウレアーゼ産生微生物は最終溶液の半分の体積の培養液で培養した量を使った。
【００３０】
なお、この場合の実験では、試験体を複数本準備しておいて、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩をろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に着いたものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着および底へ沈殿した。
【００３１】
結果を下記表２及び図２に示す。表２は、各反応時間における炭酸カルシウムの沈殿量（Ｍ）を記載したものである。図２のグラフの横軸は時間、縦軸は生成した炭酸塩の質量から変換した濃度を示している。なお、表２の濃度及び図２に示した凡例中の濃度は加えた塩化カルシウムの濃度を示す。すなわち、１Ｍの塩化カルシウム液を使用した場合、最終的には縦軸（炭酸カルシウム）が約１Ｍになるまで反応が進んでいる（反応式で１ＭのＣａＣｌ２から１ＭのＣａＣＯ３が生成）。この実験から明らかなように加えた尿素の全てが加水分解され、尿素の分解によって生成されたＣＯ３は、加えたＣａ全てと反応していることが分かる。その反応が終了するには、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株ではおよそ１０〜２５時間、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株では１２５時間以上要すると思われる。また、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株については、塩化カルシウム、尿素の濃度が１．５Ｍというように、高濃度の塩化カルシウム、尿素の存在下においても反応が短期間に起こるのは、炭酸塩生成時間の短縮化においてきわめて優位であると言える。更に、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は、上述したように、サンプリングした多数の土壌菌の中で特に顕著なウレアーゼ活性を起こす３つの菌株の中で最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株として優位性を示したものであり、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、このスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株と比較すると、更に、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められた。従って、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、従来のウレアーゼ産生微生物と比較すると、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められる。
【００３２】
【表２】
【００３３】
なお、この場合の実験では、試験体を複数本準備しておいて、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩をろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に着いたものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着および底へ沈殿した。
【００３４】
本発明のウレアーゼ産生微生物の配合割合は、特に制限されるものではないが、例えば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株を培養液中で培養した状態又は懸濁液とした状態で反応系に配合する場合、該培養液（又は懸濁液）を反応液全量に対して５０％（体積比）となる標準状態に配合するのであれば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株においては、培養液濃度０．４Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上が好ましく、より好適には培養液濃度０．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上、更に好適には培養液濃度０．８Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上である。一方、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株においては、培養液濃度１．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上が好ましく、より好適には培養液濃度１．８Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上、更に好適には培養液濃度２．０Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上である。なお、他のウレアーゼ産生微生物を利用する場合は、これらのウレアーゼ活性能と同等となるような濃度で配合すると、好適である。ウレアーゼ産生微生物の配合割合が小さすぎると、ウレアーゼ産生が少なすぎる場合がある。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の配合割合の上限は、特に制限されるものではないが、大きすぎると１個体当たりのウレアーゼ活性が低くなる場合があることを考慮すれば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株では１．６Ｏ．Ｄ６００（ｎｍ）以下、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株では２．２Ｏ．Ｄ６００（ｎｍ）以下であることが望ましい。
【００３５】
本発明で使用する尿素としては、市販の尿素を使用することができる。尿素の上記反応液中における濃度は、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。尿素の濃度が低すぎると加水分解が不足し、ｐＨが減少したり、炭酸イオンが不足する場合があり、高すぎるとアンモニアが過剰に発生してアンモニア臭が出る場合がある。
【００３６】
本発明は金属イオンとして、第１金属イオンであるカルシウムイオンと、第２金属イオンであるマグネシウムイオン、鉄イオン及び／又はストロンチウムイオンとを添加するものである。例えば、ウレアーゼ産生微生物と尿素を用いてカルサイトの沈殿を形成させると同様の方法を用いて、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２を加えることによりカルサイトとは異なる結晶鉱物を生成させる。
【００３７】
本発明の第１金属イオンであるカルシウムイオン、第二金属イオンであるマグネシウムイオン、鉄イオン、ストロンチウムイオンは、それぞれ、これらの金属イオンを含む金属イオン源を後述するように液中に配合することによって好適に供給される。このような金属イオン源は、その種類が特に制限されるものではないが、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、ストロンチウムの酸化物、水酸化物および塩化物で、特に塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００３８】
本発明は、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように配合するものであるが、多孔体中でセメント効果より止水効果を目的とする場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が９／１〜６／４となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは９／１〜７／３、更に好ましくは９／１〜８／２である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、加えたモル濃度に対して沈殿するモル濃度が低くなる場合があり、大きすぎると、結晶形状が単純で土粒子などの固体との結合が無くなる場合がある。一方、止水効果よりセメント効果を目的とする場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が７／３〜２／８となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは６／４〜３／７、更に好ましくは５／５〜４／６である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、水和炭酸カルシウムが生成する場合があり、大きすぎるとセメント効果が小さくなり、透水性が悪くなる場合がある。また、耐酸性被覆として使用する場合には、第１金属イオン／第２金属イオン（モル比）が８／２〜４／６となるように配合すると、より好適であり、より好ましくは７／３〜５／５、更に好ましくは６／４〜４／６である。第１金属イオンの割合が小さすぎると、水和炭酸カルシウムが生成する場合があり、大きすぎるとセメント効果が小さくなり、透水性が悪くなる場合がある。なお、これらとは別に、例えば、１回目の浸透で９／１〜８／２で、２回目以降に５／５〜４／６というふうに、適宜選択して使うこともできる。
【００３９】
本発明の反応液中における第１金属イオンを第２金属イオンの合計濃度は、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。金属イオンの合計濃度が低すぎると、生成炭酸塩の量が不足する場合があり、高すぎると、ウレアーゼ産生微生物の失活が起こる場合がある。
【００４０】
本発明において、ウレアーゼ産生微生物、尿素、第１金属イオン、第２金属イオンを反応液中に添加する手段、手順は、特に制限されず、例えば、適宜緩衝液、尿素、第１金属イオン、第２金属イオンを所定の濃度になるように加え、それに遠心分離したウレアーゼ産生微生物を加えて反応させる。遠心分離せずにウレアーゼ産生微生物の懸濁液を加える場合には、懸濁液の分を加えても尿素、第１金属イオン、第２金属イオンが初期の濃度になるように計算した量を予め加えておく。又は、ウレアーゼ産生微生物を前もって注入、または固着させておき、後から尿素、第１金属イオン、第２金属イオン、緩衝剤の混合液を浸透又は塗布してもよいし、一度にすべてを混合して浸透又は塗布してもよい。さらにはセメントのように土壌なとど混合してもよい。但し、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物と尿素との混合によって、反応が開始することを考慮すると、ウレアーゼ産生微生物の配合は、尿素と第１金属イオン、第２金属イオンとの混合後、又は同時とすることが好ましい。
【００４１】
本発明において炭酸塩を生成する際の反応条件は、温度及びｐＨに制限されるが、ｐＨは緩衝剤によって管理することができる。好適なｐＨはＭｇ／Ｃａ比によって異なると思われるが、アンモニア緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）を使用することで特に問題はない。また、反応温度も特に制限されないが、本発明の場合、ウレアーゼ産生微生物が反応系の中で生存している限り、尿素の供給量に合わせて経時的に炭酸イオンが生成されることを考慮すれば、使用するウレアーゼ産生微生物の生育温度、より好ましくは至適温度、至適ｐＨで反応させると、より効果的である。なお、一般に微生物の生存の適温はやや高温であることが多いが、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株のウレアーゼ活性の適温はおよそ少なくとも１４℃〜３２℃の範囲で生存又は培養可能である。温度管理が難しい地中の場合を考えると、わが国では高山を除いて土壌深さが数ｍになれば地温は１９〜２０℃であるので、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株はわが国のように温帯域に適している。
【００４２】
本発明の炭酸塩によるセメント工法において、その施工方法などは特に制限されるものではなく、例えば、培養したバクテリア液（Ｂ液）と、尿素、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの第１金属イオン源、第２金属イオン源および緩衝液を適量だけ混合した反応液（Ｒ液）を土壌に注入、又は土壌と混合し、反応によって沈殿する炭酸塩によって土粒子を結合させることができる。この場合、触媒作用による反応なので、Ｒ液を加える限り反応が進む。なお、炭酸塩のセメント効果や透水性は注入されたＲ液の濃度と量で管理し、粒子質量に対する炭酸塩の量で評価する。地盤の場合、Ｂ液およびＲ液の注入はボーリング孔を利用して、地盤の透水係数や地下水位を加味して行う。地下へ注入した溶液の管理には隣接した井戸またはボーリング孔からの揚水または汲み上げによって行う。固体の亀裂や穴を埋めるには、その中にＢ液およびＲ液またはそれらの混合液を注入して、反応させて炭酸塩を沈殿させる。亀裂や穴が大きい場合には、あらかじめ砂、ガラス玉または繊維等を充填しておき、Ｂ液およびＲ液、またはそれらを混合させたものを注入して炭酸塩を沈殿させる。固体表面で炭酸塩を沈殿させるには、不織布などの表面張力を利用してＢ液およびＲ液を保持させた状態で固体表面における炭酸塩の沈殿を促す。Ｂ液を汚泥に混合して、それをＲ液中で養生することによって汚泥粒子表面で炭酸塩を沈殿させて、汚泥粒子を粒状化させる。掘削土を盛土に使う際に、強度が必要とされる場合にＢ液とＲ液を混合し、炭酸塩の沈殿によって土を固化させる。強い固化が必要な場合にはＲ液を散布または表面に溜めて土中に浸透させる。汚染物質の不動化には、汚染土壌にＢ液を混合させ、それにＲ液を加えて炭酸塩が沈殿する際に汚染物質を取り込む作用を利用する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００４４】
［実験例１及び比較例１］
ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を用いて、以下の実験例１を行った。１Ｍ尿素−０．５ＭＣａＣｌ２−０．５ＭＭｇＣｌ２−緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）１００ミリリットルを作成した。また、１００ミリリットルのスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を培養液（ＥＤＣ １０ｇ／リットル）から遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分間）した微生物を１００ミリリットルの０．５％ＮａＣｌ水溶液に薄めた。その１０ミリリットルをピペットで取り、尿素−ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２−緩衝液からなる水溶液１０ミリリットルに加えた。室温２０℃で試験管を振盪させて所定の時間後に試験管の中の炭酸塩の沈殿量を測定した。なお、すべての実施例、実験例、比較例では、全実験を通してウレアーゼ産生微生物は最終溶液の半分の体積の培養液で培養した量を使った。なお、実験例１では１０本の試験管の検体を準備して、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩はろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に付着したものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着または底へ沈殿した。
【００４５】
次に、実験例１において、１Ｍ尿素水溶液に代えて０．５Ｍ尿素水溶液を使用し、０．５ＭＣａＣｌ２−０．５ＭＭｇＣｌ２水溶液に代えて０．５ＭＭｇＣｌ２水溶液を加えた以外は、実験例１と同様にして比較例１の炭酸塩を生成し、その生成量を実験例１と同様にして調べた。また、各時間における反応液のｐＨを測定した。これらの結果を下記表３及び図３に示す。実験例１の場合、およそ２０時間後には加えた量の約６５％の沈殿が生成した。その後徐々に沈殿量は増えて最終的には８０％程度まで増加すると思われる。約９時間後の電子顕微鏡写真を図４に示す。一方、比較例１の場合、約１５時間で８０％の沈殿が起こった。比較例１では、マグネサイトが生成した。
【００４６】
【表３】
【００４７】
［実験例２］
次に、Ｃａイオン／Ｍｇイオン（モル比）の割合を表４及び表５に示すように変えて、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素を加えて炭酸塩を以下のように生成し、得られた炭酸塩の量を以下の実験方法、評価方法によって評価した。結果を下記表４及び表５に併記すると共に、図５に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
＜実験方法＞
緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）をベースに１ＭＣａＣｌ２と１Ｍ尿素を加えて２００ミリリットル（Ｃａ液）を準備した。また、緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）に１Ｍ ＭｇＣｌ２と１Ｍ尿素を加えた混合溶液２００ミリリットル （Ｍｇ液）を準備した。Ｃａ液とＭｇ液を所定の割合で混ぜて１０ミリリットルに分取した。その割合はＭｇ／Ｃａ比で１０：０，９：１，８：２，７：３，５：５，４：６，３：７，２：８，１：９，０：１０である。また、培養した菌体溶液２００ミリリットルを５０ミリリットルずつ分けて、４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み溶液を除き、沈殿した菌体に０．５％ＮａＣｌ溶液をそれぞれ５０ミリリットル加えた。これらから１０ミリリットルをメスピペットで取り、ＣａとＭｇの混合液１０ミリリットルに加えた。これから５ミリリットルをメスピペットで取り試験体とした。その後、約２０℃で振盪させて、７２時間及び１週間後に沈殿物の質量を測った。沈殿物は溶液中と試験管ガラス壁に付着したものに分けて測定した。溶液中の沈殿はろ過して乾燥質量を、試験管に付着したものは乾燥して試験管と沈殿物の質量を測定した。ろ紙および試験管の質量をそれぞれの測定値から差し引いて、それらを加えたものを全沈殿物とした。
【００５１】
図５から、つぎのことがわかる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）が０．２以下の場合、炭酸マグネシウム（マグネサイト）又は炭酸マグネシウム又はＣａ−炭酸マグネシウムが生成し、７２時間以降も沈殿が起こり続ける。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．３のとき、沈殿は７２時間で終了していると思われ、そのときの沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は１：１である。沈殿速度の点からは安定していると考えられる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．５のとき、１週間後に沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は０．５となっている。上記実験例２では沈殿量を時間で示してあるが、この場合も１６９時間後に０．７４３Ｍの沈殿が起こっており、この結果と一致する。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＞０．７ではＭｇの沈殿量は相対的に少なく、基本的にＭｇはＭｇ−カルサイトの生成に寄与するものと考えられる。沈殿速度は比較的速く、７２時間でほぼ安定している。
【００５２】
［実施例１〜５及び比較例２、３］
上記実験例２ではＭｇ／Ｃａ比＝１．０で行った実験結果から沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は０．５であった。このことは、加えたカルシウムはほぼ全部（全体の５０％）、マグネシウムが加えた量の５０％（全体の約２５％）が沈殿したことを示している。また、Ｍｇ／Ｃａ比が０の場合には、カルシウムのほぼ１００％がカルサイトとして沈殿した。したがって、Ｍｇ／Ｃａ比が異なることによる沈殿鉱物の違いによる影響を調べるために、カラム生成実験行った。この実験では砂（密度：１．４２ｇ／ｃｍ３、間隙比：０．８６）に反応液（Ｍｇ／Ｃａ比が１と０）をそれぞれ浸透させ、針貫入試験（株式会社丸東製作所の軟岩ぺネトロ計）を行って、その結果より一軸圧縮強さを推定して比較した。得られた結果を下記表６に示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
＜実験方法＞
上記実施例１〜４及び比較例２、３の作成方法を図６の生成カラムの概略正面図を用いて説明する。図６において１は、生成カラムである。この生成カラム１は、内径４３ｍｍの透明のアクリルパイプであり、その下端側にゴム栓２をつけ、内壁にはポリピレンの薄いシートを張り付け、その中に粗砂３（高さ約２ｃｍ）、細砂４（９ｃｍ）、粗砂３（約２ｃｍ）の順に水中堆積させた。このとき、余り緩くならないように適度に振動を与えながら堆積をさせた。なお、図中の数字は、アクリルパイプ１の長さ（１８０ｍｍ）、細砂４の高さ（９０ｍｍ）を示す。粗砂３と細砂４、細砂４と粗砂３との間には、ろ紙５，５を敷いた。底のゴム栓２には排液口６を取り付けた。供試体は６本準備（実施例１〜４、比較例２、３）した。その概要は、上記表６のとおりである。供試体内の水を排水した後、表６に示すような金属イオンで作成した反応液１５０ミリリットルを上部から流し入れて、最終的に溶液表面が上部粗砂の表面に来たとき排液を止めた。なお、ウレアーゼ産生微生物は、流し入れる直前に混合したが、培養液をそのまま使用したので、金属イオン、尿素等は２倍の濃度にしておいて、培養液で薄まって所定の濃度になるようにした。反応は１日間として、次の日には実施例１を除いて、上から新しい反応液を入れて同じ操作を繰り返した。以降、浸透回数を上記表６のようにした。
【００５５】
表６には炭酸塩含有量は計算によるものと、実際に測定したものを示した。計算に依る方法は次のように行った。実施例１〜４はＭｇ／Ｃａ比が１で行ったので、沈殿量は０．７５Ｍとなる。また、ＭｇとＣａの沈殿割合は１：２であるので、実際の沈殿物の分子量は１／２（１／３Ｍｇ＋２／３Ｃａ＋２ＣＯ３）であり、０．５（０．３３３×２４＋０．６６７×４０＋１２０）＝７７．３３となる。従って、その０．７５Ｍは０．７５×７７．３３＝５８．０ｇ。一方、砂の間隙比は０．８６であるので、間隙と固体粒子の体積比は０．８６：１となる。即ち、間隙中が反応液で満たされているので、固体の体積を１ｃｍ３とすると、間隙の体積は０．８６ｃｍ３となる。したがって、この間隙中沈殿物の量は、５８ｇ×０．８６／１０００＝０．０５０ｇとなる。炭酸塩含有量の定義は、質量比で炭酸塩／（炭酸塩＋他の固体）であるので、１間隙体積による沈殿量は次のように表せる。Ｍｇ／Ｃａ＝０．５において、砂の密度を２．６５ｇ／ｃｍ３とすると、ドロマイト沈殿量＝０．０５／（０．０５＋２．６５×１）×１００（％）＝１．８５２％、すなわち、実施例１〜４において、１間隙体積（浸透中の沈殿はごく少量で無視）では１．８５２％の炭酸塩が生成する。従って、これに浸透回数分だけ乗じればその場合の炭酸塩含有量が得られる。カルサイトに対しては１ＭのＣａを加えると１Ｍのカルシウムが生成するので、分子量１００で計算すると、１間隙体積に対して沈殿量は１００×０．８６／１０００＝０．０８６ｇとなる。従って、１間隙体積に対してカルサイトの沈殿量は、カルサイト沈殿量＝０．０８６／（０．０８６＋２．６５×１）＝３．１４％となる。２間隙体積では６．２８％、３間隙体積では９．４％となる。
【００５６】
炭酸塩の含有量は、強塩酸によって溶かし、発生するＣＯ２ガス圧を測定して決定できる。これには図７のような装置と市販の炭酸カルシウムを使って得たキャリブレーションが必要である。図７において１０はガス圧測定器であり、このガス圧測定器１０は、反応容器１１内で、試料１２を強塩酸１３によって溶かし、発生するＣＯ２ガス圧を測定するものである。即ち、各供試体の上部粗砂をドライバーなどで削り取って、針貫入試験を行った後、細砂試料を数ｇ取り出し、１１０℃で炉乾燥する。反応容器１１内で、炉乾燥した試料約０．５ｇ（試料１２）を３ＮのＨＣｌ（強塩酸１３）で溶かし、ガス圧測定器１０で発生するＣＯ２ガス圧を測定して、キャリブレーション図から炭酸カルシウムの量を決定し、それを乾燥試料質量で除して百分率で表すと炭酸カルシウム含有量となる。なお、図７において反応容器１１は、内部の様子を説明するために透明容器として示した。沈殿物のＭｇ／Ｃａ比が０．５の場合には、まず炭酸カルシウムと同様に炭酸カルシウム含有量を求めて、それにドロマイトとカルサイトの分子量の比（７７／１００）を乗じて炭酸塩の含有量とする。炭酸塩の計算値と実測値はやや誤差はあるが、ノジュールの生成や、粒子集合体における不均一性から考えると満足できる範囲にあると考えられる。
【００５７】
反応液浸透実験後、そのまま１ヶ月放置しておいて、反応液を排出して自然乾燥後に針貫入試験を行った。針貫入は上部粗砂を取り除き細砂の表面部を露出させた状態で行った。場所を変えて数回貫入抵抗と貫入量を測定し、針貫入抵抗を貫入量で除して貫入勾配を求めた。それを平均したものを表７に示した。推定一軸圧縮強さは次の関係式から推定した。なお、この方法は、これまで土木学会の岩盤力学委員会で指針が作られている。
ｙ＝０．９７８ｘ＋２．５９９
ここに、ｙ：一軸圧縮強さの対数値、ｙ：貫入勾配の対数値である。ある報告によると、天然岩石１１４個、セメント処理試料５０個で調べた結果、上式の相関係数は０．９１４である。
【００５８】
図８は、測定炭酸塩と推定一軸圧縮強さの関係を示す。これより、同じ炭酸塩含有量では、ドロマイト（実施例１〜４）のセメント効果がカルサイト（比較例１、２）の約３倍あることがわかる。また、１Ｍ以下の炭酸塩濃度では炭酸塩は一軸圧縮強さにほとんど寄与しないことがわかる。ただし、観察からは粒子相互の結合は部分的に見られ、また炭酸塩のノジュール（純度の高い球形の塊）が形成されている。ドロマイトの炭酸塩含有率に対する強度増加率は０．４５（ＭＰａ／％）、またカルサイトの強度増加率は０．３３（ＭＰａ／％）であり、どちらも極めて高いといえる。
【００５９】
＜耐酸性に対する実験方法＞
針貫入試験で用いた実施例３と比較例３の共試体を用いて耐酸性の実験を行った。酸として酢酸を用いた。純度９９．７％、比重１．０４９の酢酸３０ミリリットルを１リットルの蒸留水に溶かし．約０．５Ｍの酢酸を準備した。この溶液のｐＨは２．６８であった。実施例３と比較例３の供試体の上下を逆にして、酢酸７０ミリリットルを流した。どちらの試料も気泡を生じた。しばらくして、それぞれ上から７０ミリリットルの水を流したあと、１時間放置した。実施例３及び比較例３の供試体のパイプ中の粗砂を取り除き、細砂の表面を露出させて、針貫入面とした。
【００６０】
測定結果を下記表７に示す。実施例３の供試体では酢酸による洗浄で一軸圧縮強さが３９％減少したのに対し、比較例３の供試体では６６％減少した。このことから、次のことが考えられる。
Ｍｇの影響で耐酸性が増大する。
実施例３の沈殿物のかなりの部分が溶けたことから、全てがドロマイトではなくカルサイトまたはＭｇ−カルサイトである可能性が高い。
比較例３の沈殿物の全てが純粋なカルサイトではなく、砂の中に混入していた他のイオンの影響を受けて沈殿したものと思われる。従って、耐酸性が少し高い可能性がある。
【００６１】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のセメント工法の応用可能な土木技術としては、例えば、地震時の液状化対策、盛土の補強、構造物下の地盤補強、宅地の地盤改良、岩盤クラックおよびコンクリートひび割れの充填(グラウト)、砂杭の補強または固化、高レベル放射性廃棄物処分場におけるバッファ材料および岩盤の止水、道路の路床および路盤の補強、河川堤防の補強、地すべり対策、がけ崩れ対策、アースダムの止水、土壌中の重金属の不動化、廃棄物最終処分場の止水対策、土石流対策等である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法。
【請求項２】
上記ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９１）及び／又はスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９２）を使用する請求項１に記載のセメント工法。
【請求項３】
上記反応液中における上記（２）尿素の濃度が０．５〜２２００ｍＭであり、上記（３）第１金属イオンと上記（４）第２金属イオンの合計濃度が０．５〜２２００ｍＭである請求項１又は２に記載のセメント工法。
【請求項４】
上記炭酸塩の生成によって地盤中で土壌粒子を結合させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項５】
岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項６】
汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項７】
土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項８】
岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆する請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項９】
土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又は発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項１】
炭酸塩によるセメント工法において、（１）ウレアーゼ産生微生物と、（２）尿素と、（３）第１金属イオンとしてカルシウムイオンと、（４）マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の第２金属イオンとを、（３）第１金属イオンに対する（４）第２金属イオンのモル比として第１金属イオン／第２金属イオンが９／１〜１／９となるように反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とするセメント工法。
【請求項２】
上記ウレアーゼ産生微生物として、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９１）及び／又はスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９２）を使用する請求項１に記載のセメント工法。
【請求項３】
上記反応液中における上記（２）尿素の濃度が０．５〜２２００ｍＭであり、上記（３）第１金属イオンと上記（４）第２金属イオンの合計濃度が０．５〜２２００ｍＭである請求項１又は２に記載のセメント工法。
【請求項４】
上記炭酸塩の生成によって地盤中で土壌粒子を結合させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項５】
岩及び／又はコンクリート表面の穴又は亀裂内で上記炭酸塩を沈殿させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項６】
汚泥粒子表面で上記炭酸塩を沈殿させることにより汚泥を粒状化させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項７】
土壌中で上記炭酸塩を沈殿させることにより、重金属などの汚染物質を不動化させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項８】
岩石、コンクリート、モルタル、石膏、ガラス、セラミック又はスレートの固体表面を上記炭酸塩で被覆する請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【請求項９】
土壌、岩盤又はコンクリートの中に穴を空け、金属、コンクリート、プラスチック、繊維又は発泡性プラスチックからなる固体を挿入して、土壌、岩盤又は上記固体を上記炭酸塩で固結させる請求項１、２又は３に記載のセメント工法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−４５３３３（Ｐ２０１１−４５３３３Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９８４５９（Ｐ２００９−１９８４５９）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０９２４３６７６）合同会社ライフエンジニアリングインターナショナル (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０９２４３６７６）合同会社ライフエンジニアリングインターナショナル (2)
【Ｆターム（参考）】
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