独特のマヌカ因子（ＵＭＦ）により栄養強化した蜂蜜
【課題】 本発明は、ＵＭＦを調合した食品および医薬品に関する。
【解決手段】 本発明は、提示例のみに限定されるわけではないが、とりわけ、ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜とＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜の調合方法とＵＭＦを含有する蜂蜜の画分の製造方法とに関する。
【解決手段】 本発明は、提示例のみに限定されるわけではないが、とりわけ、ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜とＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜の調合方法とＵＭＦを含有する蜂蜜の画分の製造方法とに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＭＦを調合した食品と医薬品とに関する。本発明は、提示例のみに限定されるわけではないが、とりわけ、ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜とＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜の調合方法とＵＭＦを含有する蜂蜜の画分の調合方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
マヌカツリーはニュージーランドに自生しており、強い香りを有する蜂蜜を産する。蜂蜜は何千年も食品として利用されてきただけでなく、医薬品目的としても、とりわけ抗生物質として活用されてきた。抗菌活性の主たる機能は過酸化水素に依拠し、それは蜂蜜中で産生される酵素、グルコースオキシダーゼである。マヌカハニーはこの抗菌活性に加えて、追加活性を有する事が知られてきた。この追加活性とは、非過酸化活性として知られており、独特のマヌカ因子（ＵＭＦ）として市販されている。
この非過酸化活性の特性については多くの研究によって明らかにされており、この追加活性を司る画分を同定する試みは既に成されてはいるが、決して成功してきたとは言えない。
【０００３】
蜂蜜は数千年に渡り使用されてきており、蜂蜜について扱った最初の文献は約４０００年前に遡る。蜂蜜は食用として利用するのに何の操作も加工も必要としない唯一の甘味料である（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９９２）。
【０００４】
マヌカツリーは、ニュージーランドに自生している。湿った養分の低い溶脱土壌を好み、樹齢寿命は６０年程度である。この樹木は高さ６〜８ｍに成長し、直径は７〜１０ｃｍとなる。差し渡し１０〜１２ｍｍの花をつけ、通常は白色である（ウォード（Ｗａｒｄ），２０００）。マヌカツリーから得られる蜂蜜は、ハーブのような、ウッディな特徴ある強い香りを有し、濃い暗色の色調である。
【０００５】
蜂蜜中に存在する成分を同定する数多くの研究が成されてきた。蜂蜜の梼w紋買fータベースを作成する目的には、産地や採取元の花を特定する事であり、更には混ぜ物による蜂蜜の粗悪品を検出する為でもある。
【０００６】
含有されている成分のほとんどは、炭水化物類、酵素類、芳香族有機酸類、炭化水素類、直鎖一塩基酸類、直鎖二塩基酸類、水分である。
蜂蜜は主として糖類であるグルコース、フラクトース、シュクロース、マルトースなどで構成されているが（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９７８）、他の多くの多糖類も同定されている。
【０００７】
同定されているマヌカハニー中に含まれる重要な多糖類は、マルツロース、コウジビオース、ツラノース、ニゲロース、マルトース、トレハロース、パラチノース、シュクロース、エルロース、パノース、メレジトース、マルトトリオースなどがある（ウエストンとブロックルバンク（Ｗｅｓｔｏｎ＆Ｂｒｏｃｋｌｅｂａｎｋ），１９９９； ウー（Ｗｕ），２０００）。ウー（２０００）はマヌカハニーの主要多糖類としてツラノースを発見し、ウエストンとブロックルバンク（１９９９）はマルトースを発見した。
【０００８】
蜂によって蜂蜜に加えられる他の成分にはアミン酸類があり、最も多量に含まれるのはプロリンであり、少量のカタラーゼも含まれる（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９９２）。酵素であるカタラーゼは過酸化水素を分解して水と酸素に転換する。
【０００９】
マヌカハニーには高濃度の芳香族有機酸類が含有され、その大部分は２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）であり、芳香族有機酸類の含有量は、ニュージーランドクローバーから採取された蜂蜜よりも遥かに高い濃度（１０００倍）で含まれる（タン（Ｔａｎ）等１９８８）。他に同定されている含有芳香族有機酸類は、２−メトキシ安息香酸、２'−メト
キシアセトフェノン、２−デセンジオン酸、４−キドロキシ−３−５−ジメトキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−３−（４'−メトキシフェニル）プロピオン酸、シリンガ酸、３，
４，５−トリメトキシ安息香酸、アセトフェノンなどである（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）。
【００１０】
季節や産地に関係なく、１種類の花種から採れたマヌカハニーのサンプルは、プロピオン酸類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り７００ｍｇ以上、安息香酸類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り３５ｍｇ以上、アセトフェノン類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り２０ｍｇ以上であることから特定される（ウィルキンス等１９９３）。
【００１１】
タン等（１９８９）は主要な特徴的含有成分として２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸も同定し、２−メトキシ安息香酸と２1−メトキシアセトフェノンと共にこの成
分が高濃度で含有される事がマヌカの花から採取した蜂蜜である事の指標として利用できる事を指摘している。
【００１２】
ウィルキンス等（１９９３）は、マヌカハニーにおいてはデカンジオン酸とトランス−２−デセンジオン酸とが他の蜂蜜に比べて高濃度に含まれる事が多いと指摘している。オクタンデジオン酸、デカンジオン酸、トランス−２−デセンジオン酸のような二価酸類が含有されている事も報告されている（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）。
【００１３】
他種の蜂蜜に含有される他の成分としては、ラクトン、ジアスターゼ、酸性成分が無い事、灰分などがホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等（１９６２）により同定されている。この文献ではこれらの成分がマヌカハニーに含まれているという記述は無く、マヌカハニーに含まれる水分について報告されている文献は出版されていない。
【００１４】
蜂蜜は太古の昔から多くの文化圏において医薬品として利用されてきた（ランソム（Ｒａｎｓｏｍ），１９３７； アドコック（Ａｄｃｏｃｋ），１９６２）。最近では、その確実な抗菌作用が認識されるに至って、蜂蜜への興味が話題性のある成分として注目されてきた。この蜂蜜が有する抗菌効果は、実際には蜂蜜の種類によって異なる（ダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ），１９７９）。
【００１５】
マヌカハニーは高い抗菌効果を有するが、その機構は単純に蜂蜜の浸透圧、ｐＨ、グルコース酸化酵素活性だけではない事が観察されている（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），１９８３）。活性に寄与する機構は現在では、"非過酸化活性"或は"ＵＭＦ"として認識されている。
【００１６】
ダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ）（１９７９）は、抗菌活性の存在はグルコース酸化酵素活性や高い浸透圧に依拠するものではないことを報告していた。しかし、同氏は後者の活性については総抗菌活性のほんの一部にしか関わらないと論じている。
【００１７】
モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８８）は抗菌活性の存在はマヌカハニー中の過酸化水素に依拠するものではないことを検証し、更に、総合的な高い活性を有するマヌカハニーは、高値な非過酸化活性を有している事も明らかにした。
【００１８】
蜂蜜が有する非過酸化活性についての研究によって、蜂蜜はいくつかの興味深く且つ明らかに矛盾する特性を有する事が判った。ヴェルジェ（Ｖｅｒｇｅ）（１９５１）は活性画分を水、アルコール、エーテル、アセトン中に抽出した。シュラーとボーゲル（Ｓｃｈｌｅｒ＆Ｖｏｇｅｌ）（１９５６）は活性画分をエーテルにより抽出した。ラヴィ（Ｌａｖｉｅ）（１９６０）は、活性画分はアセトンでは抽出できるが、エーテルでは抽出できない事を示した。ゴネットとラヴィ（Ｇｏｎｎｅｔ＆Ｌａｖｉｅ）（１９６０）は冷エーテルで抽出した活性画分は９５度で揮発する事を示した。ムラデノフ（Ｍｌａｄｅｎｏｖ）（１９７４）は、蜂蜜は揮発性、難揮発性、不揮発性の抗菌活性を有する成分を含んでいる事を報告している。
【００１９】
マヌカハニーの活性は熱にも光に対しても安定している事が判っており（モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ），１９８８， タン（Ｔａｎ）等，１９８８， ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等，１９９０）、タン（Ｔａｎ）等による予備的な研究では（１９８８）、追加活性物質は有機溶媒、例えばエタノールやエーテル等に可溶である事が判った。
【００２０】
既に蜂蜜から単離されている過酸化水素と酵素であるリゾチーム以外で抗菌活性を有するのは、芳香族有機酸類とフェノール系成分だけである（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ）等，２０００）。
【００２１】
カフェインとフェルラ酸は両方共にフェノール酸であり、抗菌活性を有する事が同定されており（シズマークとマーテル（Ｃｉｚｍａｒｋ＆Ｍａｔｅｌ），１９７０， シズマークとマーテル（Ｃｉｚｍａｒｋ＆Ｍａｔｅｌ），１９７３）、蜂蜜から単離されている（ウォーダン（Ｗａｈｄａｎ），１９９８， ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。しかし、それらは低い濃度でしか含まれておらず、蜂蜜の抗菌作用としては過酸化水素の貢献度に比べて僅かな貢献度しかない（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。
【００２２】
マルエンダ リケンダ（Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｒｅｑｕｅｎｄａ）等（１９８７）は抗菌活性を有する他のフェノール酸類として、カフェイン酸、バニリン酸、ｐ−クマル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸などを報告している。
【００２３】
ピノセンブリン、ピノバンクシン、クリシン、フラボノンなどフラボノイド類が蜂蜜から単離された（ウォーダン（Ｗａｈｄａｎ），１９８８， フェレス（Ｆｅｒｒｅｒｅｓ）等，１９９４）。これらについては抗菌活性が詳細に報告されている（リヴェラ−ヴァルガス（Ｒｉｖｅｒａ−Ｖａｒｇａｓ）等，１９９３， Ｉｔｏ等，１９９４））が、これらも顕著な抗菌活性を発揮するのに十分な含有量が蜂蜜中には観察されない（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。
【００２４】
ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８３）は蜂蜜から得られる主要な抗菌成分として２つの芳香族成分を同定した。それらは、４−ヒドロキシ−３−５−ジメトキシ安息香酸とメチル−３，４，５−トリメトキシ安息香酸である。
【００２５】
プロポリスは、樹木のゴム性滲出液から蜂が集めてくる樹脂性素材でミツバチの巣箱の抗菌試薬として使用されているが、これには安息香酸とシナミン酸類とフラボノイド類とに代わる成分が含まれている（マルクッチ（Ｍａｒｃｕｃｃｉ），１９９５）。ワルダン（Ｗａｌｄａｎ）（１９９８）はフラボノイド類が抗菌作用を有するプロポリスの主要成分であると論じている。
【００２６】
抗菌活性を司る物質として同定されているものは、ガランジン、ピノセンブリン、カフェイン酸、フェルラ酸等がある（ラヴィ（Ｌａｖｉｅ），１９６０， ジサルベール（Ｇ
ｈｉｓａｌｂｅｒｔ），１９７９， ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等，１９９０）。ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ）（２０００）はその後、これらの個々の成分自体には抗菌活性は無いものの、プロポリス総体として初めて生物活性がある事を実証した。
【００２７】
蜂毒の成分であるメリチンとフォスフォリパーゼは弱い抗菌活性があると考えられていた。これらは両方共にタンパク質であるが、ゲル浸透クロマトグラフィによってマヌカハニーに含まれる抗菌作用物質は分子量が１０００ａｍｕ以下である事が判った（ラッセル等，１９９０）。
【００２８】
他の物質でマヌカハニーの有する非過酸化活性を司るものとして、蜂の体液に特異的に含まれる抗菌性ペプチド類が考えられる。これらは、アバエシン、アピダエシン、ヒメノプタエシン、ローヤリシン、リゾチーム類等である。このペプチド類は強い抗菌作用を有し、これらが蜂蜜に含まれていれば顕著な非過酸化活性を司ると考えられる（ウエストン等，２０００）。
【００２９】
マヌカハニーの抗菌活性物質（ＵＭＦ）の非過酸化活性については長年研究されてきたが、単離も同定もなされていない。実際、マヌカハニー中に単離可能な画分は存在しないと考えている研究者もいる。
【００３０】
ラッセル等（１９９０）は、追加抗菌活性の重要性についての考え方の違いは、おそらく抗菌活性の定量性の差異（すなわち、過酸化水素もしくは高浸透圧によらないもの）に依拠するのであろうと考察している。モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８８）は様々なニュージーランドハニーの試料について調べ、追加活性はある試料では観察されず、ある試料ではほとんど全ての活性が見受けられた。また彼等は、どの試料についても、追加抗菌活性の強さの程度と総体的な抗菌活性の強さの程度との間に緊密な相関関係があることも指摘している。
【００３１】
ボグダノフ（Ｂｏｇｄａｎｏｖ）（１９９７）はどの画分に非過酸化活性があるのかを調べる為に、揮発性成分、非極性成分と不揮発性成分、酸性成分、塩基性成分を分離する試みを行なった。彼はこれを行なうにあたり、試料の活性を測定し、次いでその画分を取り除き、然る後に再び活性を測定した。もしその試料に活性が残っていなかったら、取り除かれた画分に抗菌作用構成成分が存在した事になると結論している。揮発成分の抽出はロトベイパー（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）を６０℃に設定し、２時間加熱して行なわれた。非極性及び不揮発性成分の抽出はＣ−１８カラムを用いて行なわれた。塩基性成分の抽出はＨ型陽イオン交換カラムを用い、酸性成分の抽出はＯＨ型陰イオン交換カラムを用いて行なわれた。酸の除去には、酸が遊離陰イオン型になるように、蜂蜜はｐＨ＝１１に調整された。
【００３２】
ボグダノフは、逆滴定によって初期のｐＨに戻したら本来の抗菌活性は回復したので、最初の蜂蜜のｐＨを１１に変化させても抗菌活性には全く影響を及ぼさないと指摘している。マヌカハニーについて、ボグダノフは黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性試験を行なった場合は酸性の画分に１００％の活性が見受けられ、一般好気性菌に対して抗菌活性試験を行なった場合は酸性の画分に７５％、塩基性の画分に１０％、非極性の画分に５％、揮発性の画分に１０％の活性がそれぞれ観察されたと論じている。それゆえに、蜂蜜中の酸性画分が非過酸化抗菌活性を有し、酸の含有量と明白に相関関係があるがｐＨとは相関関係を有さないと結論付けられた。
【００３３】
ウォーダン（１９９８）は浸透圧の効果について、糖質溶液と希釈しない蜂蜜とで比較を行い、高い糖質濃度が抗菌活性の重要な因子である事を発見したが、希釈した場合は、また別の因子が抗菌活性に関与する事が明らかになった。更には本研究において蜂蜜はｐ
Ｈ＝７．２のニュートリエントブロスによって希釈して用いた理由により、ｐＨは活性に影響しない事が判明し、影響を与える他の物質が存在する事が予測された。
【００３４】
ウエストンとブロックルバンク（１９９９）は、ポリ（カプリル）アミド、セファデックス Ｇ−１０、バイオゲルＰ−２、ＸＡＤ−２樹脂などを酸性及び塩基性条件で使用するクロマトグラフィを用いたいくつかの方法によって、抗菌性物質から単糖の分離を試みた。２−ブタノールによる単離も試験した。ポリアミドとセファデックス Ｇ−１０とを用いたクロマトグラフィによって、活性物質は遅く溶出する画分に存在し、ＨＰＬＣによる分析ではフラボノイド類が存在する事が示唆された。
【００３５】
フェノール抽出物の主要な産生物はシリンジ酸メチルである事が薄相クロマトグラフィによって同定され、フェニル乳酸が僅かに存在する事も判った。ＨＰＬＣの分析によって、シリンジ酸メチルは総フェノール抽出物の４５％以上を占める事が明らかになった。同論文では、マヌカハニーに含まれるシリンジ酸メチルとフェニル乳酸の含有量では、それ自体で全ての非過酸化活性を満たせない事が検討され、結論付けられている。更には、このレベルのシリンジ酸メチルの含有量は、活性マヌカハニーと不活性マヌカハニーとに同様に含有される量であって、故に、観察される活性の差異には関与していないと考えられる。
【００３６】
ＸＡＤ−２では全ての活性成分が炭水化物と一緒に溶出し、フェノール酸類と一緒に溶出する活性成分はない。バイオゲル−Ｐ２を用いた場合も同様の結果であった。単糖は何の抗菌活性特性も有していないので、抗菌活性物質は糖類によって運ばれる事が推測された。
【００３７】
ウエストン等（１９９９）は、活性蜂蜜と不活性蜂蜜どちらのフェノール酸画分にも全体として同じ抗菌活性を有する事が実証されたので、マヌカハニーのフェノール酸物質類が個々に或は全体として抗菌活性を有していたとしても、"観測される活性"には関与していないと結論付けた。
【００３８】
ウエストンとブロックルバンク（１９９９）は、活性マヌカハニーは、四糖であるシアル酸ルイスＸ（この糖は胃の内壁に潰瘍を生じさせるバクテリアの接着作用を制御する抗原決定基である）に類似した特殊なオリゴ糖を有するものではないかと推定した。彼等は活性マヌカハニーと不活性マヌカハニーとについてオリゴ糖組成を調べたが、両方のマヌカハニーに違いは見つからなかった。
【００３９】
ペリー（Ｐｅｒｒｙ）等（１９９７）はニュージーランドに成育する、異なる化学的特性を有する３種のマヌカを発見したが、これらの成分は葉から採れる芳香油の組成から判別できる。その一つはピネン類の割合が高く、もう一つはセスキテルペン類の割合が高く、イーストランド地域に成育する３つ目はサイクリックトリケトンとレプトスペルモンの含有量が高かった。これらの中で３つ目の芳香油が最も抗菌活性が高かった。
【００４０】
ウエストン等（２０００）は非常に高い非過酸化活性を有するマヌカハニーの試料からレプトスペルモンを検出する為に３種類の方法を試みた。一つ目の方法はＸＡＤ−２樹脂を用いてフェノール酸を吸着させる方法で、２つ目の方法は２−ブタノールを用いて抽出する方法で、３つ目の方法は液―液抽出を用いる方法であった。これら３種の方法から得た抽出物のどれからもトリケトン類は検出されなかった。これによって、レプトスペルモンは水に不溶であるから花蜜内には存在せず、よって蜂蜜中には存在しないと結論付けられた。
【００４１】
ウエストン等（２０００）は抗菌活性を有するマヌカと有しないマヌカとに含まれるフ
ェノール酸を比較して、定量的にも定性的にも両者に違いがない事を実証した。シナミン酸とフラボノイド類との含有量は多くのヨーロッパ産蜂蜜と近い値か同値であった。１９種のマヌカハニー試料の分析によって、含有されるフェノール酸類の組成や量は全ての試料について同等であったので、産地の違いによるフェノール酸類の違いはない事が判った。
【００４２】
ウエストン（２０００）は下記のまとめをしている；
（ｉ） 蜂蜜において何等かの抗菌活性に関与する唯一の物質は過酸化水素であり、プロポリス由来のフェノール酸類のような他の物質は過酸化水素と比較して重要ではなく、
（ｉｉ） 蜂蜜中の過酸化水素含有量は原則的に、植物由来のカタラーゼを一定量加えて解析されるが、但し
（ｉｉｉ） 過酸化水素は蜂蜜或は画分サンプル中のグルコース酸化酵素によって産生されるというホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等（１９６３）とダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ）（１９７１）との研究結果に基づけば、抗菌活性分析を行なう為にサンプル類を希釈し前処理する現在の解析方法（アレン，モラン，リード（Ｒｅｉｄ），１９９１， モランとラッセル，１９９８）ではこれらのサンプルに加えるカタラーゼ量は、上記の機序で産生される過酸化水素を分解するのに十分な量ではない。
【００４３】
これに加えて、揮発成分類はＧＣ−ＭＳにより分析され、一般的に、花蜜の構成成分であり、花の香りに寄与する事もわかった。これらの成分は多岐にわたるが、それらの蜂蜜中における含有量は少なく、特定の花や蜂蜜に特異的に含まれる揮発成分もこれらの含有量においては抗菌作用を発揮する事はない。更に、蜂蜜が１種類の花種から採取された事を同定する為に使用される花蜜に含有されるフェノール酸成分類も抗菌特性は有していない。但し、抗菌活性を有する為の適切な含有量があるのかどうかについては判っていない。
【００４４】
よってウエストン（２０００）は、この時点の研究の結論としてＵＭＦの存在の可能性を低いとし、それはカタラーゼの添加で十分分解できなかった結果として異常な高値として残ってしまった過酸化水素を計測していたにすぎないと示した。"独特の因子"は実際のところ、マヌカハニー中に大量のカタラーゼが存在するか否かによって、マヌカハニーの抗菌活性の有無を区別していたのかもしれない。
【００４５】
高いＵＭＦ値を有する蜂蜜、そしてそのような蜂蜜から加工した製品は消費者から強く求められている。これは高いＵＭＦ値の蜂蜜が有する効能はともかくとして、ＵＭＦ含有画分の単離が出来るかどうかに帰結する。
【００４６】
もしマヌカハニーの画分がＵＭＦ活性に関係しているとすれば、単離されたＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜や他の加工食品や医薬品へ応用する事が可能である。公知のマヌカハニーの好都合な特性や有用な効果を更に発展させる事が出来る。
【００４７】
本発明の目的は、マヌカハニーからＵＭＦを含有する画分を調整する方法を提供し、もしくは少なくとも消費者に役に立つ選択肢を提供する事である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４８】
ＵＭＦを含有する画分は、熟練した技術者が知る多くの装置を用いれば大量の蜂蜜から分離精製されるであろう。しかし、これまでＨＰＬＣを用いて蜂蜜に非過酸化生物活性を与える成分の精製と単離とが試みられてきたが、従来技術で行なわれてきたカラム類や溶離液の選択はこの目的への具体的な到達を阻んできた。
【００４９】
従来技術の試みは、間違った実験条件を用いる事によって蜂蜜の生物活性を無意識に破壊しがちであったか、もしくは使用していたカラムが十分な分離能を持たずそれ故分離した画分の同定が困難であったかのいずれかであった。
【００５０】
更には、ＵＭＦ画分が蜂蜜に占める割合は小さい為に、これまで行なわれてきた分離技術であれば溶離液のピークは無意識的に無視されてきたか他の成分類と重なって見つからなかったとも考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００５１】
本発明は、通常乾燥重量で１％にも満たない少量の蜂蜜画分が実質的に全ての非過酸化活性を有しており、しかもこの画分は大量の蜂蜜減量からＵＭＦを含有する画分として単離されることを定めるものである。
【００５２】
本発明の第一の態様は、ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜について定める。
望ましくは、この蜂蜜はマヌカハニーである。
望ましくはこの蜂蜜は栄養強化されていない如何なるマヌカハニーよりもＵＭＦ値が高いものである。更に望ましくは、この栄養強化された蜂蜜はＵＭＦ値２５以上を有し、更に望ましくはＵＭＦ値３５以上を有する。
【００５３】
本発明の第二の態様は、蜂蜜にＵＭＦを含有する画分を混合する工程を含むＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜を調整する方法について定める。
本発明の第三の態様は、画分が得られたサンプルに存在する実質的に全ての単糖の糖質類から画分を分離する事によりＵＭＦを含有する画分を調整する方法について定める。
【００５４】
望ましくは、本方法は、
・ マトリクスにある量の蜂蜜を加え、
・ 溶液を用いてマトリクスからサンプルを溶出させ、そして
・ ＵＭＦを含有する画分を採取する
工程を含む。
【００５５】
望ましくは、ＵＭＦを含む画分の採取は、サンプルに存在する実質的に全ての単糖の糖質類を溶出させた後に開始する。更に望ましくは、採取されたＵＭＦを含有する画分は、実質的にサンプルに存在する総ての単糖の糖質類を含んでいない。
【００５６】
望ましくは、蜂蜜はマヌカハニーである。
望ましくは、マヌカハニーはＵＭＦ値２５以上を有し、更に望ましくはＵＭＦ値３５以上を有する。
【００５７】
望ましくは、マトリクスはサイズ排除マトリクスかもしくは逆相マトリクスである。
望ましくは、溶離液は水である。
望ましくは、マトリクスはクロマトグラフィ用カラムに充填してある。
【００５８】
本発明における第三の態様の、第一実施例において、マトリクスはサイズ排除とイオン交換マトリクスである。望ましくは、対イオンはＮａ＋である。更に望ましくは、マトリクスは排除限界の値が１０４である。更に望ましくは、マトリクスはスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体である。
【００５９】
本発明における第三の態様の第二実施例において、マトリクスはＣ１８である。望ましくは、マトリクスは粒子径１５μｍ、細孔径１００Åである。
蜂蜜をそのまま全量使用する事が望ましいが、裏漉しした蜂蜜を含む、予め蜂蜜から分取した構成成分や一部分を、本方法に使用する事も出来る。
【００６０】
本発明の第四の態様は、マヌカハニーからのＵＭＦを含有する画分を定める。
望ましくは、この画分は実質的に単糖の糖質類を含有していない。
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分が有する抗菌活性はアルカリｐＨ領域で不安定である。更に望ましくは、アルカリｐＨ領域は９以上である。
【００６１】
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は本発明の第三の態様に準じた方法により調整される。
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は実施例２と３と４とに記載されているクロマトグラフ上の特徴を有する。
【００６２】
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は、ＵＭＦを含有する画分を含む蜂蜜のサンプル（２０μＬ）を分析用カラムであるショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２とを直列に繋ぎナトリウム化したカラムに注入して、カラム温度５０℃でミリＱ水にて流量１ｍＬ／ｍｉｎで溶離させた時に、保持時間が１９．４分から２５分の間となる。更に望ましくは、ＵＭＦを含有する画分の保持時間が１９．４分から２１．７分の間となる。
【００６３】
本発明の第五の態様は、本発明の第四の態様に準じたＵＭＦを含有する画分の医薬品用途への転用を定める。
望ましくは、医薬品用途はニュージーランド特許出願ＮＯ．５０１６８７に記載されているような、創傷包帯である。
【００６４】
本発明の第六の態様は、本発明の第四の態様に準じたＵＭＦを含有する画分の食品用途への転用を定める。
望ましくは、食品用途は蜂蜜である。
【００６５】
"ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜"とは、単離したＵＭＦを含有する画分を加えた蜂蜜を意味する。
"マヌカハニー"とは、そのほとんどをマヌカの花から採取した花蜜を意味する。
【００６６】
"ＵＭＦ値"とは、全蜂蜜もしくは裏漉し蜂蜜もしくはその画分を寒天プレート拡散分析法によってフェノール相当量に関連させて測定した抗菌活性の測定値を意味する。
"ＵＭＦを含有する画分"とは、全蜂蜜もしくは裏漉し蜂蜜に含まれる非過酸化抗菌活性成分の画分を意味する。
【００６７】
画分について"実質的に単糖の糖質類がない"とは、画分を採取するサンプル中に含有される単糖の総糖質類量に比べて、画分中の単糖の糖質類の重量が、少量もしくは無視できる程度に少ない事を意味し、例えば、単糖の総糖質類量の５％（ｗ／ｗ）以下であり、更に典型例では１％（ｗ／ｗ）以下である。
【００６８】
本発明が採用されれば、全蜂蜜中のＵＭＦを含有する画分が明確に検出でき、これまで出来なかった非過酸化活性を定量的に表す事が可能となる事が確認される。更には、マヌカハニー以外の蜂蜜ＵＭＦを含有する画分の存在が調べられていないものに非過酸化活性がある事が示される可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
本発明における望ましい実施例では、蜂蜜中に存在する主要な単糖類を分離するように
設計された分離用カラムが用いられる。これらの主要な単糖類はグルコースとフラクトースとである。カラムの実施例としてはレゼックスＴＭ、ヌクレオシルＴＭ、ショウデックスＴＭなどが含まれる。これらは例としてのみ取り上げて頂きたい。
【００７０】
カラムを通して蜂蜜を溶離する間に、ＵＶ吸光度光度計と示差屈折計の両方またはいずれかを用いて溶離液中の対象となる分画をモニターしながら、小さな画分を分取し分析する事が望ましい。
【００７１】
ショウデックスＴＭ（配位子交換とサイズ排除の混合モード）クロマトグラフィカラムはグルコースとフラクトースとを蜂蜜中の他の成分から分離するのに利用されてきた。示差屈折計によって小さなピークとして検出される分画がフラクトースのピークの後に溶出する事が明らかにされている。
【００７２】
フラクトースにはＵＶ吸収はないが、この分画にはＵＶ吸収がある。この分画を調べると実質的に蜂蜜の全ての非過酸化性抗菌活性を有している事が明らかになっている。この分画がいわゆるＵＭＦを含有する画分と呼ばれる。カタラーゼを用いて蜂蜜中の過酸化物由来のどの抗菌活性を破壊しても、ＵＭＦ画分の活性は維持された。
【００７３】
エーテルを用いた蜂蜜の液―液抽出もＵＭＦを含有する画分の単離を簡便化するのに利用される。これらの実験において、エーテルは多くの非糖質と有機化合物を蜂蜜から取り除く事ができ、一方、残りのサンプルの非過酸化活性は維持される。
【００７４】
更にＵＭＦ画分を精製する為には、画分を何回もカラムに通してますます多くの不純物を取り除くか、例えば逆相カラムのような他の種類の充填剤を詰めたカラムを用いたクロマトグラフィを行なえば、画分から化合物を分離する事が出来るであろう。
【００７５】
このＵＭＦ画分はこれまで決して分離されておらず、数多くの研究グループによって様々な試みが成されてきたにも拘らず、ただ別個の集合体として存在する事が認識されていただけであった。逆相、バイオゲル Ｐ−２、ＸＡＤ−４０、陰イオン交換カラムなどは全て従来技術において、非過酸化生物活性を有する化合物の単離と同定のために既に使用されてきた。
【００７６】
これらの状況の中でこの画分は分離されなかったかもしくは確認されなかった。その理由は、その存在量が微量であり、蜂蜜研究におけるこれまでのＨＰＬＣでは、おそらく大きな単糖のピークに隠されていたか、クロマトグラフィ条件が蜂蜜の生物活性を破壊していたのであろう。
【００７７】
発明者等が行った予備的な研究によって、陰イオン交換カラムのようにアルカリ領域のｐＨを必要とするカラムではＵＭＦ分画を分離できない事が判った。アルカリ条件では蜂蜜の活性は破壊される事が判った。つまり、中性領域のｐＨで使用するカラムを採用せねばならない。
【００７８】
ＵＭＦを含有する画分はｐＨ９では３０分後にその生物活性のほとんどを失う事が判った。この画分はｐＨ１０では５分間で破壊される事が判った。ＨＰＬＣの分析時間は通常これよりも長い。ｐＨ１１では蜂蜜の生物活性は直ちに破壊される。
【００７９】
非過酸化活性（ＵＭＦ）を示すマヌカハニーサンプルをエーテルで抽出し標準的技術でクロマトグラフィの分離を阻害する脂肪酸を取り除いた。水層とエーテル層両方を、抗菌分析法を用いて試験し、どちらの層にＵＭＦ活性を単離出来るか調べた。ＵＭＦ活性は水層に維持されており、エーテル層には何等有意義な生物活性も見られなかった。
【００８０】
蜂蜜サンプル中の非過酸化活性レベルを検証する為に、過酸化水素によって蜂蜜に供せられるどの抗菌活性も破壊するカタラーゼを用いて行なった。カタラーゼ溶液は蒸留水（１０ｍＬ）にカタラーゼ（０．０２ｇ）を溶解させて作成した。蜂蜜は蒸留水に溶解させ、１ｍＬの水に対して１ｇの蜂蜜の割合に調整し、１ｍＬ毎に分けた。次いで１ｍＬの蒸留水（総活性測定用）か１ｍＬのカタラーゼ溶液（非過酸化活性用）を各サンプルバイアルに加えた。
【００８１】
（第１実施形態）−抗菌活性の拡散分析
寒天（２３ｇ）を蒸留水（１Ｌ）に溶解させて寒天培地を作成しオートクレーブにかける前に１５０ｍＬをフラスコに分け取った。必要であればフラスコを水槽で蒸気処理（１００℃，３０分間）し、次いで他の水槽で寒天温度をバクテリア培養に耐えられる温度に下げた（５０℃、３０分間）。
黄色ブドウ球菌培地は無菌の接種用トリプティックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）を用いたビーズ培養法によって調整し、次いでインキュベートした（３７℃、１８時間）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培地はトリプティックソイ培養液において０．５ＡＵの吸光度になるようにサーモスペクトロニクス社 ヘリオスγ分光光度計（５４０ｎｍ）を用いて調整した。ブランクとしてトリプティックソイブイヨンを使用した。
【００８２】
大きなサイズの矩形分析プレート（コーニング社製４３１１１１ 無菌バイオアッセイ皿， ２４５ｍｍ×２４５ｍｍ×１８ｍｍ）の調整は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培地（上記条件１００μＬ， ０．５ ＯＤ）を接種した寒天培地１５０ｍＬを基準面まで注いで行なった。一旦凝固させてから分析プレートを上下逆さまにして４℃で一晩保存した。
【００８３】
全蜂蜜のサンプル調整は、全蜂蜜を秤量し（１．００ｇ）蒸留水に溶解させて（１ｍＬ）行なった。再現性の良い分析を行なう為に、これらの作業はインキュベーション（３７℃、３０分間）によって蜂蜜を柔らかくして行い、その間の時間を管理し過酸化水素の産生を一定にするようにした。過酸化水素活性を計測しない他の実験では、室温下で溶解するまで撹拌した。
【００８４】
作成された５０％（ｗ／ｖ）溶液は、更に、総非過酸化活性の必要性に応じて、蒸留水かカタラーゼ溶液（２０ｍｇ／１０ｍＬ蒸留水）かで同量希釈（１：１）してサンプルとした。
【００８５】
ＨＰＬＣから得た蜂蜜の分画と液／液抽出物とは蒸留水で希釈し（１：１）蜂蜜の分離前の調整濃度と同じにした。作成された５０％溶液は、非過酸化活性の目的の為に、更にカタラーゼ溶液で希釈した（１：１）。
【００８６】
フェノール標準液は１０％のフェノールストック溶液（１０ｇフェノール／１００ｍＬ蒸留水）を用いて２，３，４，５，６，７％の濃度に調整した。これらの溶液は暗所に４℃の条件で保存し、１ヶ月毎に再調整する。
【００８７】
ウェルは、８ｍｍの穿孔器を用いて標準の８×８グリッドに穿孔し、接種針を用いて寒天を剥がした。プレート上にサンプルをセットするのに使用するテンプレートは、それぞれ１６個の番号を付けられたウェルが繰り返し４連あり行と列の組合せは１つずつの準ラテン方格法用とした。これによってサンプルはランダムにセットできるので、エッジ効果によるデータのバイアスを取り除く事ができる。
【００８８】
２５％濃度の蜂蜜サンプルとフェノール標準液は配分された各ウェルに添加した（１１
μＬ）。
（第２実施形態）
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、５１５ＨＰＬＣポンプ、２４１０示差屈折計、９９６フォトダイオードアレイ検出器、ミレニアム操作ソフトウエアを使用するウォーターズ社のＨＰＬＣシステムにより実施した。
【００８９】
初期の研究でショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８００シリーズのカラム類が使用した全てのカラムの中で最も良い分離結果を出した。ここでは、ショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８０１と ショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８０２を直列に繋いで、サイズ排除クロマトグラフィと配位子交換クロマトグラフィを組み合わせて蜂蜜サンプルを分画分取した。
【００９０】
ＫＳ８０１はナトリウム型で排除限界は１０３であった。ＫＳ８０２もナトリウム型で排除限界は１０４であった。両方のカラム共にスチレンジビニルベンゼンが充填剤に使用されている。使用温度は、製造元の推奨では１ｍＬ／ｍｉｎの流量において最初は８０℃であった。溶離液にはミリＱ水を用いた。
【００９１】
２０ｍｇ／２０μＬである蜂蜜サンプルの注入はＫＳ８００シリーズＨＰＬＣカラムへ行われた。図１と図２は示差屈折計によって検出されて得られたデータのプロットである。抗菌活性分析に使用する分画は２０回の注入から採取された。
【００９２】
図１において、分画Ａは０分から１２分まで、分画Ｂは１２分から１９．４分まで、分画Ｃは１９．４分から２５分までを分取したものである。プロットによれば、グルコース（１）のピークの後にフラクトース（２）のピークが観察される。オリゴ糖（３）のピークも観察される。
【００９３】
分離された分画の抗菌活性は試験用培地として黄色ブドウ球菌を使用したウェル拡散法によって行なった。
試験用にＨＰＬＣで採取した分画を、ビュッヒ４６１水槽を付属させた、ビュッヒ（Ｂ・モ・堰j ＲＥ１１１ ロトベイパー（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）を用いて４０℃で減圧乾
固させた。次いでそのサンプルを２００μＬの蒸留水と２００μＬのカタラーゼ溶液とを含む溶液で再溶解させ、非過酸化活性のみが存在する事を確かめた。
【００９４】
蜂蜜サンプルは２５％濃度に調整し、抗菌活性の試験を行なった。抗菌活性分析は２％から６％の値域のフェノール標準液を３複製用い、サンプルは３複製から５複製用いて、寒天プレート上の番号管理されたランダムウェルに添加して実施した。
【００９５】
そのプレートを３７℃で一晩、バクテリアが成育可能な条件にてインキュベートした。インキュベーションの後、デジタルキャリパー計によってウェル周りの阻害領域の直径を計測した。
【００９６】
蜂蜜の非過酸化活性は分画Ｃ（図１）に完全に含まれていた。
ＨＰＬＣプロットのベースライン領域に注目すれば、分画Ｃの活性領域に２つのピークが観察される（図２）。これらのピークのどれが活性に関与しているかを検証する為に、他の分画分取時間の設定方法を工夫した；分画Ｄは０分から１９．４分、分画Ｅは１９．４分から２１．７分、分画Ｆは２１．７分から２５分とした。
【００９７】
これらの実験から、全抗菌活性成分は分画Ｅに単離出来た。
この試験は更に２回繰り返し実施し、同様の結果を得た。
（第３実施形態） 蜂蜜のセミ分画分取（サイズ排除とイオン交換との組合せ）
これまでの研究によって（第２実施形態とスノウ（Ｓｎｏｗ）（２００１））、ＵＭＦを含有する画分は単糖の糖質類の大きな部分からショウデックスＴＭＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２分析用カラムを用いて分離できる事が実証されている。
【００９８】
サンプルの注入量を増加させカラムを通すのに適切であるこのカラムの分取用バージョン（ＫＳ−２００２カラム）を使用した。裏漉し蜂蜜からの溶出液の内訳は、最初にフェノール酸類、次いで二糖類とオリゴ糖類、最後に単糖類である事が同定された。
【００９９】
ショウデックスＴＭＳＵＧＡＲ ＫＳ２００２（２０ｍｍ×３００ｍｍ，２０μｍ粒子径，６０Å細孔径）分取スケールカラムはサイズ排除と配位子交換機能が組合わされている。このカラムはナトリウム（Ｎａ＋）型で使用し排除限界は１×１０４である。クロマトグラフィはミリＱ水を溶離液とし、使用流量は３ｍＬ／ｍｉｎで、室温で行った。
【０１００】
３００ｍｇ／ｍＬ濃度の蜂蜜の大量注入は２００μＬのループによって行なった。９９６ＰＤＡと２４１０ＲＩ両検出器によってスペクトルをモニターした。採取した分画は全て大サイズの蒸発皿で凍結乾燥した。
【０１０１】
図３は３００ｍｇ／ｍＬ濃度の裏漉し蜂蜜を２００μＬ注入して得た溶出液の内訳である。全蜂蜜中に観察されるグルコースとフラクトースの量はほぼ等しい（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等，１９６２）が、今回は蜂蜜を注入前に裏漉ししているのでグルコースのピークはフラクトースのピークに比べて減少している。
【０１０２】
サイズ排除マトリクスは通常僅かに疎水性を有する弱い陰イオン性であり、その為に理想的な分離とはならず、分離は分子量サイズが厳密に反映されない（クニコ（Ｃｕｎｉｃｏ）等，１９９８）。このカラムはスチレンジビニルベンゼンをサイズ排除用重合体として使用しており、フェノール酸類とはイオン交換相互作用を有する。それ故保持時間は分子量サイズを表すものではない。
【０１０３】
カラムからの溶出液はまず４つの分画として分取した；
１． ０．０−１３．０分 フェノール酸類
２． １３．０−１８．４分 二糖類とオリゴ糖類
３． １８．４−２２．６分 グルコースとフラクトース
４． ２２．６−３０．０分 遅く溶出する成分類
活性は常に１８．４分から３０分の間の分画に観察された。次いで一つの分画に全ての活性が含まれているかどうかを確認した。
【０１０４】
【表１】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１０５】
表１は分取時間の違いによる３〜５つの分画の試験結果と得られた分画の非過酸化活性試験結果をまとめたものである。注記として、最初の分析は全蜂蜜を使用し、後の２つは裏濾した蜂蜜を使用したものである。
【０１０６】
検出可能な全ての活性は最終的に１９．５分から２５．０分の間の分画類に限定される事が判った。これら２つの分画の９５％信頼区間（ＣＩ，＝平均±２×ＳＥ）は表２にまとめた。
【０１０７】
信頼区間は阻害領域にもフェノール相当領域にも重ならず、分画４の活性は統計的に裏漉し蜂蜜のそれとは同じではない事を示している。すなわち、カラムへの吸着かもしくは他の分画へ分割移行し分析の検出限界以下の量しか残っていないかの原因で何等かの活性の損失が起こっている事が示唆される。分画４の活性平均値はフェノール活性相当として裏漉し蜂蜜の９０％を占めた。
【０１０８】
【表２】
阻害領域の数値は個々のウェルの数値で、フェノール相当領域の数値はプレートデータから計算した数値である。
【０１０９】
図３に示す通り、この分画にはほとんど全てのフラクトースが含まれる。単糖類そのものは抗菌活性を有していないが、水分活性を減少させ、且つグルコース酸化酵素の基質を供給し過酸化水素とグルコン酸とを産生させる物理的効果がある。それゆえ、低い濃度ではあっても他の化合物がこの分画に存在する事は明らかである。
【０１１０】
フラクトースのテーリング上にある小さなピークはこのカラムの分析用バージョンを使用したスノウ（２００１）の研究によって観察された。スノウ（２００１）によってこの分画を単離し、その構成成分をＧＣ−ＭＳとＮＭＲを用いて同定する試みが成された。しかし、サンプル中のほとんどの化合物が結果として同定できなかった。更にこのピークの大きさと全蜂蜜の活性との相関関係を調べる試みも成されたが、何の関連性も見つからなかった。これによって、このピークはどの一つも活性を有しない多くの化合物で構成されている事が示唆される。
【０１１１】
スノウ（２００１）は活性画分に関連するこのピークにはＵＶ活性があることを指摘している。しかしこれらのＵＶ活性ピーク類は、分取用カラムの性質上分離能が低く、この領域の弱いＵＶ活性を有する大量の開鎖単糖類が干渉するために、同定されなかった。
【０１１２】
単糖類を含まない分画を得るために分画４を再度注入する事とした。再度注入した分画から得たスペクトル（図４）には、１０．５分に新たなピークが出現しているものの、単糖ピークのテーリング上に何の濃縮されたピークも見受けられなかった。単糖のピークの立ち上がり位置に膨らみが観察されるが、グルコースの残渣であるようだ。ベースライン領域を拡大した図を図５に示す。
【０１１３】
糖類は、通常水溶液系に溶解しにくい化合物の溶解性を向上させる。よって、その化合物は糖類と相互作用を有するか糖類によって可溶化される可能性がある。糖類の濃度を低下させれば相互作用が無くなり早く溶出した。
【０１１４】
このピークは活性因子である可能性があるが、そのピークの大きさは、非過酸化活性に寄与する化合物（もしくは化合物類）は極めて低い濃度で存在するという考え方をとるのが良いであろう。或は、それは、冷凍庫で一ヶ月保存されていたサンプルを使用したので、分解物であるかかもしれない。
【０１１５】
再注入する前にサンプルの活性を試験したが活性の低下は見受けられず、この結果は単離するまで２ヶ月以上も冷凍保存していても活性画分は安定であったという研究結果からも裏打ちされている。このピークは非抗菌性化合物の分解物を反映している可能性もある。
【０１１６】
分画４を再注入して得られた２０．５分から２５．０分の間の分画を分取し、スノウ（
２００１）によって観察された活性ピークが同定できるかどうかを検証する為に、その分画を再度注入した。大変小さいとはいえ、１０．５分にやはり新たなピークがはっきりとスペクトル上に出現した（図６、拡大図は図７）。
【０１１７】
これにより、このピークは保存による分解物ではなく実際に活性が糖類に関連していない事を反映しているであろう事が示唆される。
この再注入から得られた分画の活性を調べるバイオ分析を行なう為に十分な量（極めて大まかな活性を示す為には最低２００ｍｇの蜂蜜をカラムに通さねばならず、厳密な活性分析を行なうには８００ｍｇ必要である）は分取しなかった。
【０１１８】
再注入によるクロマトグラム上のデータの変化動向について確定的なことは言えない。この方針はこれ以上追究しない事としたが、カラムによって分離を行なう条件を変えるなど、より大きな容量を検討する方針は継続する。
【０１１９】
（第４実施形態） 蜂蜜のセミ分画分取（逆相）
Ｃ１８ ２５ｍｍ逆相カラムの優位性は、カラムへ一度に１ｇを注入する事が出来る実質的により大きな保持容量を有する事であり、一方ＫＳ−２００２カラムは６０ｍｇしか注入できない。
【０１２０】
逆相の分取用カラムにはデルタパック Ｃ１８カートリッジ（２５ｍｍ×１００ｍｍ，
１５μｍ粒子径、１００Å細孔径）を３本直列に繋いで使用した。これにデルタ Ｃ１８ガードインサート（２５ｍｍ×１０ｍｍ、１５μｍ粒子径、１００Å細孔径）を装着した。クロマトグラフィは室温にて流量１０ｍＬ／ｍｉｎ、０．５ｇ／ｍＬのサンプルの大量注入は２ｍＬループで行なった。
【０１２１】
溶離システムは２種類を使用した。一つ目はミリＱ水のみを使用した。しかし後に、最初に１００％ミリＱ水を流し、糖類が溶出した後で１００％アセトニトリルに切替える方法に変更した。高い流量を使用するために、検出には広口径カラム用のＷａｔｅｒｓ（ウォーターズ） ４１０示差屈折計を使用した。
【０１２２】
水中に採取された画分は大型の蒸発皿で凍結乾燥した。アセトニトリル中に採取された分画は減圧下で濃縮し、凍結乾燥器を用いて完全に乾燥させた。
これによって、活性の生物学的分析を行なう為に十分な量のサンプルを採取するのに費やす時間が大幅に短縮された。加えて、このカラムによって単糖類から活性成分をより効率よく分離する事が出来るかどうかが関心事であった。図８はこのカラムに大量注入して（０．５ｇ／ｍＬ、２ｍＬ注入）ミリＱ水で溶離させて得られたスペクトルである。
【０１２３】
このスペクトルのほとんどは単糖類のピークである。このカラムではフラクトースからグルコースを分離する事は出来なかったが、単糖類の直ぐ後の１４分から２５分ぐらいの間に複数のピークのセットが溶出しているのが観察される。
【０１２４】
これらのうち、いくつかのピークはオリゴ糖類である事が判明したが、これらの成分は活性マヌカハニー中に全蜂蜜量比でおよそ８％含まれている（ＷｅｓｔｏｎとＢｒｏｃｋｌｅｂａｎｋ，１９９９）。図９はこれらのピークを表示する為にベースライン領域を拡大してある。
【０１２５】
カラムからの溶出液はまず３つの分画として分取した；
１． ０．０−８．３分 早い時間に溶出する成分類
２． ８．３−１１．８分 糖類
３． １１．８−２５．０分 遅い時間に溶出する成分類
検出可能な活性成分は全て分画Ｃに含まれていることが判った（表３）。
【０１２６】
【表３】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１２７】
興味を引くのは、いくつかの活性成分がアセトニトリルによって溶出しているかであり、それはアセトニトリルが分画に対して異なった溶解性を有するからである。加えて、全ての活性成分がミリＱ水によってカラムから溶出されるかどうかも検討する必要がある。
【０１２８】
逆相クロマトグラフィにおいて、アセトニトリルは水よりも強力な溶媒であり、カラムから残存化合物を洗い出す目的で使用する事が出来る。分取された分画類は図１０にまとめた。
【０１２９】
カラムはまずミリＱ水で溶離を行い、概要を前述したように分画ＡとＢを分取した。分画Ｂから分画Ｃ（１１．８分）へ越える時点で送液ポンプを止め、溶離液を直接１００％アセトニトリルに交換した。
【０１３０】
分画ＣＨ２Ｏを１１．８分からアセトニトリルが検出器に到達するまで分取し（およそ１３分間もしくは保持時間２４分まで）、溶離液の置き換わりは屈折率の変化によってベースラインが急速に上昇する事で確かめられた。この時間から３本のカラム容量分のアセトニトリルをカラムに通してフラッシュし、溶出液はＣＭｅＣＮ分画として分取した。
【０１３１】
表４に示す通り、検出可能な活性成分は全て分画ＣＨ２Ｏに含まれており、ＣＭｅＣＮ分画には一切含まれていない。これにより、活性成分はカラムに逆相的に保持されていない事がわかった。
【０１３２】
分画Ｃと分画ＣＨ２Ｏだけがそれぞれ７２％と７５％の裏漉し蜂蜜相当フェノール活性があったが、他の分画には検出可能な活性は観察されなかった。これにより、活性成分が不可逆的にカラムに吸着されていることが示唆された。
【０１３３】
使用したカラムは分取用でありエンドキャップされていないシリカゲル基材上にＣ１８鎖を有しているため、分析成分類はシリカゲルに吸着しているか、もしくは活性シラノール基との反応によって変性している可能性がある。加えて、分画にはばらついた値ではあるが常に部分的な活性を有する。この特殊なケースは、糖類の含有量が低下した時の分析
で非過酸化活性の拡散が無くなる事によるものかもしれない。
【０１３４】
【表４】
各数値は ａ）複製ＨＰＬＣ分析、ｂ）プレート全体の各ウェルの数値、ｃ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１３５】
ＫＳ−２００２とＣ１８カラムとの比較
デルタパック Ｃ１８による活性分画はＫＳ−２００２による場合と比べて遥かに糖類の混入が少なく、且つそれにより活性成分の糖質類からの分離状態がより良い。逆に言え
ば、ＫＳ−２００２カラムからはより多くの割合の活性成分が回収されるが、これは活性成分のＣ１８カラムのシリカゲル基材との化学的相互作用が反映されている。
【０１３６】
ＫＳ−２００２カラムから得た活性分画では、全活性が観察されるのと反対に、Ｃ１８カラムから得た分画では、部分的な活性しか得られない。しかし、これはＫＳ−２００２分画がより多くの糖質を含有する為に分析の際に拡散を補助するからとも考えられる。
【０１３７】
（第６実施形態） ＵＭＦを含有する画分における非過酸化性活性の安定性
これまでの文献で、非過酸化性活性は蜂蜜を加熱した後も顕著な活性が持続し（ボグダノフ，１９８４； モランとラッセル，１９８８； ロス（Ｒｏｔｈ）等，１９８６）、もしくは貯蔵しても持続（ボグダノフ，１９８４；Ｓｅａｌｅｙ，１９８６）する事が指摘されており、そしてこの事は非過酸化性活性を推奨する所見の理由の一つとなっている。
【０１３８】
本研究では単離されたＨＰＬＣ分画が室温と冷蔵温度で短時間貯蔵された（８時間から２４時間）場合と、冷凍温度で中期間貯蔵された（１週間から８週間）場合の安定性について調べた。
【０１３９】
これは実験を進めるに当り実際的な検討課題であり、分画に劣化がなくそれゆえ非活性化合物を取り除いても活性の損失はない事を確かめたかった。加えて、どのくらいの量のサンプルを試験使用のために"備蓄"出来るかを知る事も大切であった。
【０１４０】
付随する興味は、実際、貯蔵によって全蜂蜜の活性を増加できるとメーカーが提言している事例証拠のように本当に活性が増加するのかの検討であった。
この実験の結果の概要は表５にまとめ、視覚的に表したのが図１１である。
【０１４１】
【表５】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１４２】
裏漉し蜂蜜をＫＳ−２００２カラムで分離し１９．５分から２５分までの分画を分取し、速やかに冷凍した。注入が完了したその日のうちに分画は凍結乾燥させた。
一旦乾燥させてから蒸留水によって５０％の活性強度にもどし、次いで様々な時間の貯蔵を室温、冷蔵、冷凍にて行なった。各サンプルは裏漉し蜂蜜換算で４８０ｍｇに相当する。
【０１４３】
貯蔵の後、サンプルを２５％活性強度に希釈し、２枚の複製プレート上の各々４ウェルで試験し、何等かの活性の損失や獲得が無いかを調べた。これらの結果を、新しく採取した活性分画を同じプレートで試験した活性値と比較した。加えて、裏漉し蜂蜜を凍結乾燥した２つの複製サンプルを作成し、凍結乾燥の工程が蜂蜜の活性に与える影響について調べた。
【０１４４】
元の分画の保持率を表６にまとめた。元の活性の保持率は阻害領域では９４％から１０６％、フェノール相当領域では８６％から１１４％であった。これにより、様々な条件の貯蔵によって単離された活性分画の非過酸化性活性は何等かの影響を受ける事がわかった
。
【０１４５】
【表６】
表７はこれらの結果のＲＥＭＬ解析である。これらの結果によって、貯蔵による活性の変化のいくつかは、統計的に重要である。阻害領域のデータでは室温と冷蔵貯蔵サンプルは共にコントロールに比べて有意に低くなっている。
【０１４６】
フェノール相当領域についてはこれらの処理においては統計的に有意な差は見られず、おそらくそれはこのデータセットの反復性が低く、それにより標準エラーを生じ予想平均間の差異が曖昧になったのであろう。
【０１４７】
活性の増加について統計的有意性が見られるのは、阻害領域のデータで８週間冷凍貯蔵したものと、フェノール相当領域のデータで４週間冷凍貯蔵したものとである。
しかし、この実験の制限は実験が反復実施されず、同じ日に複製プレートで試験された事である。ついては、有意性を検証するためには日差データの変動が重要な役割を担う。フェノール標準品検量線を用いたフェノール相当活性解析値は阻害領域を使うよりもより大きな幅の値を生じるように見え、フェノール標準品は日差データの変動を補正できない事を示唆している。
【０１４８】
これらの結果に統計的有意性が見られなくても、活性の良好な保持は依然として観察された。冷凍貯蔵されたサンプルのいくつかからは活性が増加する統計的に有意な結果が得られた。しかし、日差変動とプレート間変動との影響については本実験において反復実験をしていないので未知のままである。
【０１４９】
【表７】
平均値間の差異は、サンプル値の予想平均値からコントロール値の予想平均値を減じて求めた。各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５０】
（第６実施形態） 蜂蜜の栄養強化
蜂蜜は、通常は自然には起こらない非常に優れた高い抗菌活性を有しており、その結果、値段が高い。よって、もしそのままでは活性が低すぎて医薬品利用が出来ない蜂蜜の活性を濃縮する方法や、既に高い活性を有する蜂蜜の効能を通常自然には得られない程度にまで増加させる方法が開発されたら、市場優位性を有する。
【０１５１】
蜂蜜の過酸化性活性は自然に産生され、過酸化物破壊物質の濃度とグルコース酸化酵素の安定性に依存するので、非過酸化性活性（ＵＭＦ）を濃縮することだけが有効である。
逆相ＨＰＬＣはＵＭＦを分離でき、サイズ排除／イオン交換による分画４とは対照的にサンプルの大量注入にカラムが対応し、分画Ｃ（１００％ミリＱ水で溶出）は分取され、裏漉し蜂蜜の栄養強化に利用される。
【０１５２】
栄養強化サンプルを作成する為に、分画Ｃ（１ｇの裏漉し蜂蜜を分離して作成）を１ｍＬの蒸留水に未処理の裏漉し蜂蜜を１ｇ溶解させた溶液に加えた。この５０％溶液を更にカタラーゼで希釈し２５％の溶液とした。よって、サンプルは理論的に裏漉し蜂蜜コントロールの２倍量のＵＭＦを含有している事になる。
【０１５３】
最初の実験（表８）では、裏漉し蜂蜜の活性に加えて少しの増加が得られた。
【０１５４】
【表８】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５５】
これによると、裏漉し蜂蜜の活性がフェノール活性相当で２３．５％増加している事が判る。活性の倍増は観察されなかったので、栄養強化レベルの増加を含む実験に拡張し、活性分画の調合分量を増加させれば直接比例した活性応答を得る事が可能かどうかを検討した。
【０１５６】
各調合は前述のように、各々裏漉し蜂蜜１，２，３ｇと未処理裏漉し蜂蜜１ｇとに相当する濃度の分画Ｃの添加により構成された。
表９は作成されたサンプルの活性を示し、図１２は阻害領域の結果をグラフ化して示している。
【０１５７】
【表９】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５８】
高い相関関係が見られ（Ｒ２＝０．９８７４）、直接比例した活性応答が起こった事を示している。これによって、蜂蜜の非過酸化性活性を増加させる事は可能である事が確認
された。
【０１５９】
しかし、直線回帰解析によれば、これらサンプル試験で用いた複製プレートデータには傾きにおいて統計学上有意な違いがあった（ｐ値＝０．０１１）。これらのグラフはミニタブによる解析結果として図１３に示してある。
【０１６０】
これらのようなプレートの影響は珍しい事ではない。既に議論したように、プレートに拠る変動はＷＤＡ法において最も有意な変動要因であり、よってサンプルの試験は複製プレート法で行い、平均化する事でこの影響を補正する事が出来る。
【０１６１】
あるいは、栄養強化のデータが１：３のデータポイント（比率３、図１３）では、他の３つの栄養強化レベルと比較して２つのグラフ間の変移量がより大きい。これはおそらく何らかの要因がこのポイントを制限し、グラフが曲がったのであろう。
【０１６２】
これは単にこのサンプルが２つのプレートに添加された時に同質でなかった事に依拠している。但し、分析自体が高い活性による高感度のものではなかった。この理由は３つにまとめられる；
（ｉ） 阻害領域が重なると細長くなる傾向があり、計測を困難にする
（ｉｉ） 拡散がより変動する
（ｉｉｉ） 阻害領域が標準の最高値を超える
本研究において分画は注意深くスペースを空け、阻害領域が重ならないようにしたが、１：３栄養強化サンプルは標準の最高値に近接した。
【０１６３】
これらの検討とは関係なく、マヌカハニーからのＵＭＦを含有する分画の調整と、蜂蜜の栄養強化に使用する方法が実証された。
前述の論及された説明書きが完全であるかもしくは構成要素が既知の等価な内容を有する場合は、そのような等価な内容は個別の陳述として組み込まれる。
【０１６４】
本発明が実施例と可能な実施形態に関連したものとを用いて記載されているとしても、それについての改善および修正、もしくは改善または修正は、本発明の範囲や主旨から逸脱するものではない。
【０１６５】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】配位子交換クロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィとを用いたＨＰＬＣ示差屈折計によるマヌカハニーの分析を示すグラフ。
【図２】配位子交換クロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィとを用いたＨＰＬＣ示差屈折計によるマヌカハニーの分析におけるベースラインを拡大したグラフ。
【図３】裏漉し蜂蜜をＫＳ−２００２カラムでＨＰＬＣ分析（３００ｍｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２００μＬ注入して示差屈折計によりピークの溶出をモニターした）を示すグラフ。
【図４】ＫＳ−２００２カラムから得た活性画分を再度注入しＨＰＬＣ分析（分画４（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り２００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターした）を示すグラフ。
【図５】ＫＳ−２００２カラムから得た活性画分を再度注入しＨＰＬＣ分析。分画４（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り２００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大したグラフ。
【図６】ＫＳ−２００２カラムに分画４を注入して得られた２０．５分から２５分までのＨＰＬＣ分析（２００μＬ注入して得られた溶離ピークの示差屈折計によるモニター（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り１００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した））したグラフ。
【図７】分画４をＫＳ−２００２カラムに再度注入して得られた２０．５分から２５分までの分画のＨＰＬＣスペクトル。この分画を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大した図（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り１００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）。
【図８】Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣのスペクトル。０．５ｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２ｍＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターした。
【図９】Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ。０．５ｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２ｍＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大したスペクトル。
【図１０】Ｃ１８カラムから得た分画をミリＱとアセトニトリルとに収集した実例を示すグラフ。
【図１１】保管が活性画分の非過酸化活性に与える影響を示すグラフ。
【図１２】栄養強化した裏漉し蜂蜜の組成検討を示すグラフ。
【図１３】プレート毎にグループ分けして栄養強化実験を行なったデータ（１〜２はオープンスペース、単位はｍｍ２、割合は画分Ｃと裏漉し蜂蜜との比、単位はｇ／ｇ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＭＦを調合した食品と医薬品とに関する。本発明は、提示例のみに限定されるわけではないが、とりわけ、ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜とＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜の調合方法とＵＭＦを含有する蜂蜜の画分の調合方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
マヌカツリーはニュージーランドに自生しており、強い香りを有する蜂蜜を産する。蜂蜜は何千年も食品として利用されてきただけでなく、医薬品目的としても、とりわけ抗生物質として活用されてきた。抗菌活性の主たる機能は過酸化水素に依拠し、それは蜂蜜中で産生される酵素、グルコースオキシダーゼである。マヌカハニーはこの抗菌活性に加えて、追加活性を有する事が知られてきた。この追加活性とは、非過酸化活性として知られており、独特のマヌカ因子（ＵＭＦ）として市販されている。
この非過酸化活性の特性については多くの研究によって明らかにされており、この追加活性を司る画分を同定する試みは既に成されてはいるが、決して成功してきたとは言えない。
【０００３】
蜂蜜は数千年に渡り使用されてきており、蜂蜜について扱った最初の文献は約４０００年前に遡る。蜂蜜は食用として利用するのに何の操作も加工も必要としない唯一の甘味料である（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９９２）。
【０００４】
マヌカツリーは、ニュージーランドに自生している。湿った養分の低い溶脱土壌を好み、樹齢寿命は６０年程度である。この樹木は高さ６〜８ｍに成長し、直径は７〜１０ｃｍとなる。差し渡し１０〜１２ｍｍの花をつけ、通常は白色である（ウォード（Ｗａｒｄ），２０００）。マヌカツリーから得られる蜂蜜は、ハーブのような、ウッディな特徴ある強い香りを有し、濃い暗色の色調である。
【０００５】
蜂蜜中に存在する成分を同定する数多くの研究が成されてきた。蜂蜜の梼w紋買fータベースを作成する目的には、産地や採取元の花を特定する事であり、更には混ぜ物による蜂蜜の粗悪品を検出する為でもある。
【０００６】
含有されている成分のほとんどは、炭水化物類、酵素類、芳香族有機酸類、炭化水素類、直鎖一塩基酸類、直鎖二塩基酸類、水分である。
蜂蜜は主として糖類であるグルコース、フラクトース、シュクロース、マルトースなどで構成されているが（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９７８）、他の多くの多糖類も同定されている。
【０００７】
同定されているマヌカハニー中に含まれる重要な多糖類は、マルツロース、コウジビオース、ツラノース、ニゲロース、マルトース、トレハロース、パラチノース、シュクロース、エルロース、パノース、メレジトース、マルトトリオースなどがある（ウエストンとブロックルバンク（Ｗｅｓｔｏｎ＆Ｂｒｏｃｋｌｅｂａｎｋ），１９９９； ウー（Ｗｕ），２０００）。ウー（２０００）はマヌカハニーの主要多糖類としてツラノースを発見し、ウエストンとブロックルバンク（１９９９）はマルトースを発見した。
【０００８】
蜂によって蜂蜜に加えられる他の成分にはアミン酸類があり、最も多量に含まれるのはプロリンであり、少量のカタラーゼも含まれる（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），１９９２）。酵素であるカタラーゼは過酸化水素を分解して水と酸素に転換する。
【０００９】
マヌカハニーには高濃度の芳香族有機酸類が含有され、その大部分は２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）であり、芳香族有機酸類の含有量は、ニュージーランドクローバーから採取された蜂蜜よりも遥かに高い濃度（１０００倍）で含まれる（タン（Ｔａｎ）等１９８８）。他に同定されている含有芳香族有機酸類は、２−メトキシ安息香酸、２'−メト
キシアセトフェノン、２−デセンジオン酸、４−キドロキシ−３−５−ジメトキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−３−（４'−メトキシフェニル）プロピオン酸、シリンガ酸、３，
４，５−トリメトキシ安息香酸、アセトフェノンなどである（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）。
【００１０】
季節や産地に関係なく、１種類の花種から採れたマヌカハニーのサンプルは、プロピオン酸類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り７００ｍｇ以上、安息香酸類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り３５ｍｇ以上、アセトフェノン類の総計濃度が蜂蜜１ｋｇ当り２０ｍｇ以上であることから特定される（ウィルキンス等１９９３）。
【００１１】
タン等（１９８９）は主要な特徴的含有成分として２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸も同定し、２−メトキシ安息香酸と２1−メトキシアセトフェノンと共にこの成
分が高濃度で含有される事がマヌカの花から採取した蜂蜜である事の指標として利用できる事を指摘している。
【００１２】
ウィルキンス等（１９９３）は、マヌカハニーにおいてはデカンジオン酸とトランス−２−デセンジオン酸とが他の蜂蜜に比べて高濃度に含まれる事が多いと指摘している。オクタンデジオン酸、デカンジオン酸、トランス−２−デセンジオン酸のような二価酸類が含有されている事も報告されている（タン（Ｔａｎ）等１９８８； ウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）等１９９３）。
【００１３】
他種の蜂蜜に含有される他の成分としては、ラクトン、ジアスターゼ、酸性成分が無い事、灰分などがホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等（１９６２）により同定されている。この文献ではこれらの成分がマヌカハニーに含まれているという記述は無く、マヌカハニーに含まれる水分について報告されている文献は出版されていない。
【００１４】
蜂蜜は太古の昔から多くの文化圏において医薬品として利用されてきた（ランソム（Ｒａｎｓｏｍ），１９３７； アドコック（Ａｄｃｏｃｋ），１９６２）。最近では、その確実な抗菌作用が認識されるに至って、蜂蜜への興味が話題性のある成分として注目されてきた。この蜂蜜が有する抗菌効果は、実際には蜂蜜の種類によって異なる（ダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ），１９７９）。
【００１５】
マヌカハニーは高い抗菌効果を有するが、その機構は単純に蜂蜜の浸透圧、ｐＨ、グルコース酸化酵素活性だけではない事が観察されている（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），１９８３）。活性に寄与する機構は現在では、"非過酸化活性"或は"ＵＭＦ"として認識されている。
【００１６】
ダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ）（１９７９）は、抗菌活性の存在はグルコース酸化酵素活性や高い浸透圧に依拠するものではないことを報告していた。しかし、同氏は後者の活性については総抗菌活性のほんの一部にしか関わらないと論じている。
【００１７】
モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８８）は抗菌活性の存在はマヌカハニー中の過酸化水素に依拠するものではないことを検証し、更に、総合的な高い活性を有するマヌカハニーは、高値な非過酸化活性を有している事も明らかにした。
【００１８】
蜂蜜が有する非過酸化活性についての研究によって、蜂蜜はいくつかの興味深く且つ明らかに矛盾する特性を有する事が判った。ヴェルジェ（Ｖｅｒｇｅ）（１９５１）は活性画分を水、アルコール、エーテル、アセトン中に抽出した。シュラーとボーゲル（Ｓｃｈｌｅｒ＆Ｖｏｇｅｌ）（１９５６）は活性画分をエーテルにより抽出した。ラヴィ（Ｌａｖｉｅ）（１９６０）は、活性画分はアセトンでは抽出できるが、エーテルでは抽出できない事を示した。ゴネットとラヴィ（Ｇｏｎｎｅｔ＆Ｌａｖｉｅ）（１９６０）は冷エーテルで抽出した活性画分は９５度で揮発する事を示した。ムラデノフ（Ｍｌａｄｅｎｏｖ）（１９７４）は、蜂蜜は揮発性、難揮発性、不揮発性の抗菌活性を有する成分を含んでいる事を報告している。
【００１９】
マヌカハニーの活性は熱にも光に対しても安定している事が判っており（モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ），１９８８， タン（Ｔａｎ）等，１９８８， ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等，１９９０）、タン（Ｔａｎ）等による予備的な研究では（１９８８）、追加活性物質は有機溶媒、例えばエタノールやエーテル等に可溶である事が判った。
【００２０】
既に蜂蜜から単離されている過酸化水素と酵素であるリゾチーム以外で抗菌活性を有するのは、芳香族有機酸類とフェノール系成分だけである（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ）等，２０００）。
【００２１】
カフェインとフェルラ酸は両方共にフェノール酸であり、抗菌活性を有する事が同定されており（シズマークとマーテル（Ｃｉｚｍａｒｋ＆Ｍａｔｅｌ），１９７０， シズマークとマーテル（Ｃｉｚｍａｒｋ＆Ｍａｔｅｌ），１９７３）、蜂蜜から単離されている（ウォーダン（Ｗａｈｄａｎ），１９９８， ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。しかし、それらは低い濃度でしか含まれておらず、蜂蜜の抗菌作用としては過酸化水素の貢献度に比べて僅かな貢献度しかない（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。
【００２２】
マルエンダ リケンダ（Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｒｅｑｕｅｎｄａ）等（１９８７）は抗菌活性を有する他のフェノール酸類として、カフェイン酸、バニリン酸、ｐ−クマル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、シリンガ酸などを報告している。
【００２３】
ピノセンブリン、ピノバンクシン、クリシン、フラボノンなどフラボノイド類が蜂蜜から単離された（ウォーダン（Ｗａｈｄａｎ），１９８８， フェレス（Ｆｅｒｒｅｒｅｓ）等，１９９４）。これらについては抗菌活性が詳細に報告されている（リヴェラ−ヴァルガス（Ｒｉｖｅｒａ−Ｖａｒｇａｓ）等，１９９３， Ｉｔｏ等，１９９４））が、これらも顕著な抗菌活性を発揮するのに十分な含有量が蜂蜜中には観察されない（ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ），２０００）。
【００２４】
ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８３）は蜂蜜から得られる主要な抗菌成分として２つの芳香族成分を同定した。それらは、４−ヒドロキシ−３−５−ジメトキシ安息香酸とメチル−３，４，５−トリメトキシ安息香酸である。
【００２５】
プロポリスは、樹木のゴム性滲出液から蜂が集めてくる樹脂性素材でミツバチの巣箱の抗菌試薬として使用されているが、これには安息香酸とシナミン酸類とフラボノイド類とに代わる成分が含まれている（マルクッチ（Ｍａｒｃｕｃｃｉ），１９９５）。ワルダン（Ｗａｌｄａｎ）（１９９８）はフラボノイド類が抗菌作用を有するプロポリスの主要成分であると論じている。
【００２６】
抗菌活性を司る物質として同定されているものは、ガランジン、ピノセンブリン、カフェイン酸、フェルラ酸等がある（ラヴィ（Ｌａｖｉｅ），１９６０， ジサルベール（Ｇ
ｈｉｓａｌｂｅｒｔ），１９７９， ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等，１９９０）。ウエストン（Ｗｅｓｔｏｎ）（２０００）はその後、これらの個々の成分自体には抗菌活性は無いものの、プロポリス総体として初めて生物活性がある事を実証した。
【００２７】
蜂毒の成分であるメリチンとフォスフォリパーゼは弱い抗菌活性があると考えられていた。これらは両方共にタンパク質であるが、ゲル浸透クロマトグラフィによってマヌカハニーに含まれる抗菌作用物質は分子量が１０００ａｍｕ以下である事が判った（ラッセル等，１９９０）。
【００２８】
他の物質でマヌカハニーの有する非過酸化活性を司るものとして、蜂の体液に特異的に含まれる抗菌性ペプチド類が考えられる。これらは、アバエシン、アピダエシン、ヒメノプタエシン、ローヤリシン、リゾチーム類等である。このペプチド類は強い抗菌作用を有し、これらが蜂蜜に含まれていれば顕著な非過酸化活性を司ると考えられる（ウエストン等，２０００）。
【００２９】
マヌカハニーの抗菌活性物質（ＵＭＦ）の非過酸化活性については長年研究されてきたが、単離も同定もなされていない。実際、マヌカハニー中に単離可能な画分は存在しないと考えている研究者もいる。
【００３０】
ラッセル等（１９９０）は、追加抗菌活性の重要性についての考え方の違いは、おそらく抗菌活性の定量性の差異（すなわち、過酸化水素もしくは高浸透圧によらないもの）に依拠するのであろうと考察している。モランとラッセル（Ｍｏｌａｎ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ）（１９８８）は様々なニュージーランドハニーの試料について調べ、追加活性はある試料では観察されず、ある試料ではほとんど全ての活性が見受けられた。また彼等は、どの試料についても、追加抗菌活性の強さの程度と総体的な抗菌活性の強さの程度との間に緊密な相関関係があることも指摘している。
【００３１】
ボグダノフ（Ｂｏｇｄａｎｏｖ）（１９９７）はどの画分に非過酸化活性があるのかを調べる為に、揮発性成分、非極性成分と不揮発性成分、酸性成分、塩基性成分を分離する試みを行なった。彼はこれを行なうにあたり、試料の活性を測定し、次いでその画分を取り除き、然る後に再び活性を測定した。もしその試料に活性が残っていなかったら、取り除かれた画分に抗菌作用構成成分が存在した事になると結論している。揮発成分の抽出はロトベイパー（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）を６０℃に設定し、２時間加熱して行なわれた。非極性及び不揮発性成分の抽出はＣ−１８カラムを用いて行なわれた。塩基性成分の抽出はＨ型陽イオン交換カラムを用い、酸性成分の抽出はＯＨ型陰イオン交換カラムを用いて行なわれた。酸の除去には、酸が遊離陰イオン型になるように、蜂蜜はｐＨ＝１１に調整された。
【００３２】
ボグダノフは、逆滴定によって初期のｐＨに戻したら本来の抗菌活性は回復したので、最初の蜂蜜のｐＨを１１に変化させても抗菌活性には全く影響を及ぼさないと指摘している。マヌカハニーについて、ボグダノフは黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性試験を行なった場合は酸性の画分に１００％の活性が見受けられ、一般好気性菌に対して抗菌活性試験を行なった場合は酸性の画分に７５％、塩基性の画分に１０％、非極性の画分に５％、揮発性の画分に１０％の活性がそれぞれ観察されたと論じている。それゆえに、蜂蜜中の酸性画分が非過酸化抗菌活性を有し、酸の含有量と明白に相関関係があるがｐＨとは相関関係を有さないと結論付けられた。
【００３３】
ウォーダン（１９９８）は浸透圧の効果について、糖質溶液と希釈しない蜂蜜とで比較を行い、高い糖質濃度が抗菌活性の重要な因子である事を発見したが、希釈した場合は、また別の因子が抗菌活性に関与する事が明らかになった。更には本研究において蜂蜜はｐ
Ｈ＝７．２のニュートリエントブロスによって希釈して用いた理由により、ｐＨは活性に影響しない事が判明し、影響を与える他の物質が存在する事が予測された。
【００３４】
ウエストンとブロックルバンク（１９９９）は、ポリ（カプリル）アミド、セファデックス Ｇ−１０、バイオゲルＰ−２、ＸＡＤ−２樹脂などを酸性及び塩基性条件で使用するクロマトグラフィを用いたいくつかの方法によって、抗菌性物質から単糖の分離を試みた。２−ブタノールによる単離も試験した。ポリアミドとセファデックス Ｇ−１０とを用いたクロマトグラフィによって、活性物質は遅く溶出する画分に存在し、ＨＰＬＣによる分析ではフラボノイド類が存在する事が示唆された。
【００３５】
フェノール抽出物の主要な産生物はシリンジ酸メチルである事が薄相クロマトグラフィによって同定され、フェニル乳酸が僅かに存在する事も判った。ＨＰＬＣの分析によって、シリンジ酸メチルは総フェノール抽出物の４５％以上を占める事が明らかになった。同論文では、マヌカハニーに含まれるシリンジ酸メチルとフェニル乳酸の含有量では、それ自体で全ての非過酸化活性を満たせない事が検討され、結論付けられている。更には、このレベルのシリンジ酸メチルの含有量は、活性マヌカハニーと不活性マヌカハニーとに同様に含有される量であって、故に、観察される活性の差異には関与していないと考えられる。
【００３６】
ＸＡＤ−２では全ての活性成分が炭水化物と一緒に溶出し、フェノール酸類と一緒に溶出する活性成分はない。バイオゲル−Ｐ２を用いた場合も同様の結果であった。単糖は何の抗菌活性特性も有していないので、抗菌活性物質は糖類によって運ばれる事が推測された。
【００３７】
ウエストン等（１９９９）は、活性蜂蜜と不活性蜂蜜どちらのフェノール酸画分にも全体として同じ抗菌活性を有する事が実証されたので、マヌカハニーのフェノール酸物質類が個々に或は全体として抗菌活性を有していたとしても、"観測される活性"には関与していないと結論付けた。
【００３８】
ウエストンとブロックルバンク（１９９９）は、活性マヌカハニーは、四糖であるシアル酸ルイスＸ（この糖は胃の内壁に潰瘍を生じさせるバクテリアの接着作用を制御する抗原決定基である）に類似した特殊なオリゴ糖を有するものではないかと推定した。彼等は活性マヌカハニーと不活性マヌカハニーとについてオリゴ糖組成を調べたが、両方のマヌカハニーに違いは見つからなかった。
【００３９】
ペリー（Ｐｅｒｒｙ）等（１９９７）はニュージーランドに成育する、異なる化学的特性を有する３種のマヌカを発見したが、これらの成分は葉から採れる芳香油の組成から判別できる。その一つはピネン類の割合が高く、もう一つはセスキテルペン類の割合が高く、イーストランド地域に成育する３つ目はサイクリックトリケトンとレプトスペルモンの含有量が高かった。これらの中で３つ目の芳香油が最も抗菌活性が高かった。
【００４０】
ウエストン等（２０００）は非常に高い非過酸化活性を有するマヌカハニーの試料からレプトスペルモンを検出する為に３種類の方法を試みた。一つ目の方法はＸＡＤ−２樹脂を用いてフェノール酸を吸着させる方法で、２つ目の方法は２−ブタノールを用いて抽出する方法で、３つ目の方法は液―液抽出を用いる方法であった。これら３種の方法から得た抽出物のどれからもトリケトン類は検出されなかった。これによって、レプトスペルモンは水に不溶であるから花蜜内には存在せず、よって蜂蜜中には存在しないと結論付けられた。
【００４１】
ウエストン等（２０００）は抗菌活性を有するマヌカと有しないマヌカとに含まれるフ
ェノール酸を比較して、定量的にも定性的にも両者に違いがない事を実証した。シナミン酸とフラボノイド類との含有量は多くのヨーロッパ産蜂蜜と近い値か同値であった。１９種のマヌカハニー試料の分析によって、含有されるフェノール酸類の組成や量は全ての試料について同等であったので、産地の違いによるフェノール酸類の違いはない事が判った。
【００４２】
ウエストン（２０００）は下記のまとめをしている；
（ｉ） 蜂蜜において何等かの抗菌活性に関与する唯一の物質は過酸化水素であり、プロポリス由来のフェノール酸類のような他の物質は過酸化水素と比較して重要ではなく、
（ｉｉ） 蜂蜜中の過酸化水素含有量は原則的に、植物由来のカタラーゼを一定量加えて解析されるが、但し
（ｉｉｉ） 過酸化水素は蜂蜜或は画分サンプル中のグルコース酸化酵素によって産生されるというホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等（１９６３）とダストマン（Ｄｕｓｔｍａｎｎ）（１９７１）との研究結果に基づけば、抗菌活性分析を行なう為にサンプル類を希釈し前処理する現在の解析方法（アレン，モラン，リード（Ｒｅｉｄ），１９９１， モランとラッセル，１９９８）ではこれらのサンプルに加えるカタラーゼ量は、上記の機序で産生される過酸化水素を分解するのに十分な量ではない。
【００４３】
これに加えて、揮発成分類はＧＣ−ＭＳにより分析され、一般的に、花蜜の構成成分であり、花の香りに寄与する事もわかった。これらの成分は多岐にわたるが、それらの蜂蜜中における含有量は少なく、特定の花や蜂蜜に特異的に含まれる揮発成分もこれらの含有量においては抗菌作用を発揮する事はない。更に、蜂蜜が１種類の花種から採取された事を同定する為に使用される花蜜に含有されるフェノール酸成分類も抗菌特性は有していない。但し、抗菌活性を有する為の適切な含有量があるのかどうかについては判っていない。
【００４４】
よってウエストン（２０００）は、この時点の研究の結論としてＵＭＦの存在の可能性を低いとし、それはカタラーゼの添加で十分分解できなかった結果として異常な高値として残ってしまった過酸化水素を計測していたにすぎないと示した。"独特の因子"は実際のところ、マヌカハニー中に大量のカタラーゼが存在するか否かによって、マヌカハニーの抗菌活性の有無を区別していたのかもしれない。
【００４５】
高いＵＭＦ値を有する蜂蜜、そしてそのような蜂蜜から加工した製品は消費者から強く求められている。これは高いＵＭＦ値の蜂蜜が有する効能はともかくとして、ＵＭＦ含有画分の単離が出来るかどうかに帰結する。
【００４６】
もしマヌカハニーの画分がＵＭＦ活性に関係しているとすれば、単離されたＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜や他の加工食品や医薬品へ応用する事が可能である。公知のマヌカハニーの好都合な特性や有用な効果を更に発展させる事が出来る。
【００４７】
本発明の目的は、マヌカハニーからＵＭＦを含有する画分を調整する方法を提供し、もしくは少なくとも消費者に役に立つ選択肢を提供する事である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４８】
ＵＭＦを含有する画分は、熟練した技術者が知る多くの装置を用いれば大量の蜂蜜から分離精製されるであろう。しかし、これまでＨＰＬＣを用いて蜂蜜に非過酸化生物活性を与える成分の精製と単離とが試みられてきたが、従来技術で行なわれてきたカラム類や溶離液の選択はこの目的への具体的な到達を阻んできた。
【００４９】
従来技術の試みは、間違った実験条件を用いる事によって蜂蜜の生物活性を無意識に破壊しがちであったか、もしくは使用していたカラムが十分な分離能を持たずそれ故分離した画分の同定が困難であったかのいずれかであった。
【００５０】
更には、ＵＭＦ画分が蜂蜜に占める割合は小さい為に、これまで行なわれてきた分離技術であれば溶離液のピークは無意識的に無視されてきたか他の成分類と重なって見つからなかったとも考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００５１】
本発明は、通常乾燥重量で１％にも満たない少量の蜂蜜画分が実質的に全ての非過酸化活性を有しており、しかもこの画分は大量の蜂蜜減量からＵＭＦを含有する画分として単離されることを定めるものである。
【００５２】
本発明の第一の態様は、ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜について定める。
望ましくは、この蜂蜜はマヌカハニーである。
望ましくはこの蜂蜜は栄養強化されていない如何なるマヌカハニーよりもＵＭＦ値が高いものである。更に望ましくは、この栄養強化された蜂蜜はＵＭＦ値２５以上を有し、更に望ましくはＵＭＦ値３５以上を有する。
【００５３】
本発明の第二の態様は、蜂蜜にＵＭＦを含有する画分を混合する工程を含むＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜を調整する方法について定める。
本発明の第三の態様は、画分が得られたサンプルに存在する実質的に全ての単糖の糖質類から画分を分離する事によりＵＭＦを含有する画分を調整する方法について定める。
【００５４】
望ましくは、本方法は、
・ マトリクスにある量の蜂蜜を加え、
・ 溶液を用いてマトリクスからサンプルを溶出させ、そして
・ ＵＭＦを含有する画分を採取する
工程を含む。
【００５５】
望ましくは、ＵＭＦを含む画分の採取は、サンプルに存在する実質的に全ての単糖の糖質類を溶出させた後に開始する。更に望ましくは、採取されたＵＭＦを含有する画分は、実質的にサンプルに存在する総ての単糖の糖質類を含んでいない。
【００５６】
望ましくは、蜂蜜はマヌカハニーである。
望ましくは、マヌカハニーはＵＭＦ値２５以上を有し、更に望ましくはＵＭＦ値３５以上を有する。
【００５７】
望ましくは、マトリクスはサイズ排除マトリクスかもしくは逆相マトリクスである。
望ましくは、溶離液は水である。
望ましくは、マトリクスはクロマトグラフィ用カラムに充填してある。
【００５８】
本発明における第三の態様の、第一実施例において、マトリクスはサイズ排除とイオン交換マトリクスである。望ましくは、対イオンはＮａ＋である。更に望ましくは、マトリクスは排除限界の値が１０４である。更に望ましくは、マトリクスはスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体である。
【００５９】
本発明における第三の態様の第二実施例において、マトリクスはＣ１８である。望ましくは、マトリクスは粒子径１５μｍ、細孔径１００Åである。
蜂蜜をそのまま全量使用する事が望ましいが、裏漉しした蜂蜜を含む、予め蜂蜜から分取した構成成分や一部分を、本方法に使用する事も出来る。
【００６０】
本発明の第四の態様は、マヌカハニーからのＵＭＦを含有する画分を定める。
望ましくは、この画分は実質的に単糖の糖質類を含有していない。
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分が有する抗菌活性はアルカリｐＨ領域で不安定である。更に望ましくは、アルカリｐＨ領域は９以上である。
【００６１】
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は本発明の第三の態様に準じた方法により調整される。
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は実施例２と３と４とに記載されているクロマトグラフ上の特徴を有する。
【００６２】
望ましくは、ＵＭＦを含有する画分は、ＵＭＦを含有する画分を含む蜂蜜のサンプル（２０μＬ）を分析用カラムであるショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２とを直列に繋ぎナトリウム化したカラムに注入して、カラム温度５０℃でミリＱ水にて流量１ｍＬ／ｍｉｎで溶離させた時に、保持時間が１９．４分から２５分の間となる。更に望ましくは、ＵＭＦを含有する画分の保持時間が１９．４分から２１．７分の間となる。
【００６３】
本発明の第五の態様は、本発明の第四の態様に準じたＵＭＦを含有する画分の医薬品用途への転用を定める。
望ましくは、医薬品用途はニュージーランド特許出願ＮＯ．５０１６８７に記載されているような、創傷包帯である。
【００６４】
本発明の第六の態様は、本発明の第四の態様に準じたＵＭＦを含有する画分の食品用途への転用を定める。
望ましくは、食品用途は蜂蜜である。
【００６５】
"ＵＭＦにより栄養強化した蜂蜜"とは、単離したＵＭＦを含有する画分を加えた蜂蜜を意味する。
"マヌカハニー"とは、そのほとんどをマヌカの花から採取した花蜜を意味する。
【００６６】
"ＵＭＦ値"とは、全蜂蜜もしくは裏漉し蜂蜜もしくはその画分を寒天プレート拡散分析法によってフェノール相当量に関連させて測定した抗菌活性の測定値を意味する。
"ＵＭＦを含有する画分"とは、全蜂蜜もしくは裏漉し蜂蜜に含まれる非過酸化抗菌活性成分の画分を意味する。
【００６７】
画分について"実質的に単糖の糖質類がない"とは、画分を採取するサンプル中に含有される単糖の総糖質類量に比べて、画分中の単糖の糖質類の重量が、少量もしくは無視できる程度に少ない事を意味し、例えば、単糖の総糖質類量の５％（ｗ／ｗ）以下であり、更に典型例では１％（ｗ／ｗ）以下である。
【００６８】
本発明が採用されれば、全蜂蜜中のＵＭＦを含有する画分が明確に検出でき、これまで出来なかった非過酸化活性を定量的に表す事が可能となる事が確認される。更には、マヌカハニー以外の蜂蜜ＵＭＦを含有する画分の存在が調べられていないものに非過酸化活性がある事が示される可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
本発明における望ましい実施例では、蜂蜜中に存在する主要な単糖類を分離するように
設計された分離用カラムが用いられる。これらの主要な単糖類はグルコースとフラクトースとである。カラムの実施例としてはレゼックスＴＭ、ヌクレオシルＴＭ、ショウデックスＴＭなどが含まれる。これらは例としてのみ取り上げて頂きたい。
【００７０】
カラムを通して蜂蜜を溶離する間に、ＵＶ吸光度光度計と示差屈折計の両方またはいずれかを用いて溶離液中の対象となる分画をモニターしながら、小さな画分を分取し分析する事が望ましい。
【００７１】
ショウデックスＴＭ（配位子交換とサイズ排除の混合モード）クロマトグラフィカラムはグルコースとフラクトースとを蜂蜜中の他の成分から分離するのに利用されてきた。示差屈折計によって小さなピークとして検出される分画がフラクトースのピークの後に溶出する事が明らかにされている。
【００７２】
フラクトースにはＵＶ吸収はないが、この分画にはＵＶ吸収がある。この分画を調べると実質的に蜂蜜の全ての非過酸化性抗菌活性を有している事が明らかになっている。この分画がいわゆるＵＭＦを含有する画分と呼ばれる。カタラーゼを用いて蜂蜜中の過酸化物由来のどの抗菌活性を破壊しても、ＵＭＦ画分の活性は維持された。
【００７３】
エーテルを用いた蜂蜜の液―液抽出もＵＭＦを含有する画分の単離を簡便化するのに利用される。これらの実験において、エーテルは多くの非糖質と有機化合物を蜂蜜から取り除く事ができ、一方、残りのサンプルの非過酸化活性は維持される。
【００７４】
更にＵＭＦ画分を精製する為には、画分を何回もカラムに通してますます多くの不純物を取り除くか、例えば逆相カラムのような他の種類の充填剤を詰めたカラムを用いたクロマトグラフィを行なえば、画分から化合物を分離する事が出来るであろう。
【００７５】
このＵＭＦ画分はこれまで決して分離されておらず、数多くの研究グループによって様々な試みが成されてきたにも拘らず、ただ別個の集合体として存在する事が認識されていただけであった。逆相、バイオゲル Ｐ−２、ＸＡＤ−４０、陰イオン交換カラムなどは全て従来技術において、非過酸化生物活性を有する化合物の単離と同定のために既に使用されてきた。
【００７６】
これらの状況の中でこの画分は分離されなかったかもしくは確認されなかった。その理由は、その存在量が微量であり、蜂蜜研究におけるこれまでのＨＰＬＣでは、おそらく大きな単糖のピークに隠されていたか、クロマトグラフィ条件が蜂蜜の生物活性を破壊していたのであろう。
【００７７】
発明者等が行った予備的な研究によって、陰イオン交換カラムのようにアルカリ領域のｐＨを必要とするカラムではＵＭＦ分画を分離できない事が判った。アルカリ条件では蜂蜜の活性は破壊される事が判った。つまり、中性領域のｐＨで使用するカラムを採用せねばならない。
【００７８】
ＵＭＦを含有する画分はｐＨ９では３０分後にその生物活性のほとんどを失う事が判った。この画分はｐＨ１０では５分間で破壊される事が判った。ＨＰＬＣの分析時間は通常これよりも長い。ｐＨ１１では蜂蜜の生物活性は直ちに破壊される。
【００７９】
非過酸化活性（ＵＭＦ）を示すマヌカハニーサンプルをエーテルで抽出し標準的技術でクロマトグラフィの分離を阻害する脂肪酸を取り除いた。水層とエーテル層両方を、抗菌分析法を用いて試験し、どちらの層にＵＭＦ活性を単離出来るか調べた。ＵＭＦ活性は水層に維持されており、エーテル層には何等有意義な生物活性も見られなかった。
【００８０】
蜂蜜サンプル中の非過酸化活性レベルを検証する為に、過酸化水素によって蜂蜜に供せられるどの抗菌活性も破壊するカタラーゼを用いて行なった。カタラーゼ溶液は蒸留水（１０ｍＬ）にカタラーゼ（０．０２ｇ）を溶解させて作成した。蜂蜜は蒸留水に溶解させ、１ｍＬの水に対して１ｇの蜂蜜の割合に調整し、１ｍＬ毎に分けた。次いで１ｍＬの蒸留水（総活性測定用）か１ｍＬのカタラーゼ溶液（非過酸化活性用）を各サンプルバイアルに加えた。
【００８１】
（第１実施形態）−抗菌活性の拡散分析
寒天（２３ｇ）を蒸留水（１Ｌ）に溶解させて寒天培地を作成しオートクレーブにかける前に１５０ｍＬをフラスコに分け取った。必要であればフラスコを水槽で蒸気処理（１００℃，３０分間）し、次いで他の水槽で寒天温度をバクテリア培養に耐えられる温度に下げた（５０℃、３０分間）。
黄色ブドウ球菌培地は無菌の接種用トリプティックソイ培養液（３０ｇ／Ｌ）を用いたビーズ培養法によって調整し、次いでインキュベートした（３７℃、１８時間）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培地はトリプティックソイ培養液において０．５ＡＵの吸光度になるようにサーモスペクトロニクス社 ヘリオスγ分光光度計（５４０ｎｍ）を用いて調整した。ブランクとしてトリプティックソイブイヨンを使用した。
【００８２】
大きなサイズの矩形分析プレート（コーニング社製４３１１１１ 無菌バイオアッセイ皿， ２４５ｍｍ×２４５ｍｍ×１８ｍｍ）の調整は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培地（上記条件１００μＬ， ０．５ ＯＤ）を接種した寒天培地１５０ｍＬを基準面まで注いで行なった。一旦凝固させてから分析プレートを上下逆さまにして４℃で一晩保存した。
【００８３】
全蜂蜜のサンプル調整は、全蜂蜜を秤量し（１．００ｇ）蒸留水に溶解させて（１ｍＬ）行なった。再現性の良い分析を行なう為に、これらの作業はインキュベーション（３７℃、３０分間）によって蜂蜜を柔らかくして行い、その間の時間を管理し過酸化水素の産生を一定にするようにした。過酸化水素活性を計測しない他の実験では、室温下で溶解するまで撹拌した。
【００８４】
作成された５０％（ｗ／ｖ）溶液は、更に、総非過酸化活性の必要性に応じて、蒸留水かカタラーゼ溶液（２０ｍｇ／１０ｍＬ蒸留水）かで同量希釈（１：１）してサンプルとした。
【００８５】
ＨＰＬＣから得た蜂蜜の分画と液／液抽出物とは蒸留水で希釈し（１：１）蜂蜜の分離前の調整濃度と同じにした。作成された５０％溶液は、非過酸化活性の目的の為に、更にカタラーゼ溶液で希釈した（１：１）。
【００８６】
フェノール標準液は１０％のフェノールストック溶液（１０ｇフェノール／１００ｍＬ蒸留水）を用いて２，３，４，５，６，７％の濃度に調整した。これらの溶液は暗所に４℃の条件で保存し、１ヶ月毎に再調整する。
【００８７】
ウェルは、８ｍｍの穿孔器を用いて標準の８×８グリッドに穿孔し、接種針を用いて寒天を剥がした。プレート上にサンプルをセットするのに使用するテンプレートは、それぞれ１６個の番号を付けられたウェルが繰り返し４連あり行と列の組合せは１つずつの準ラテン方格法用とした。これによってサンプルはランダムにセットできるので、エッジ効果によるデータのバイアスを取り除く事ができる。
【００８８】
２５％濃度の蜂蜜サンプルとフェノール標準液は配分された各ウェルに添加した（１１
μＬ）。
（第２実施形態）
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、５１５ＨＰＬＣポンプ、２４１０示差屈折計、９９６フォトダイオードアレイ検出器、ミレニアム操作ソフトウエアを使用するウォーターズ社のＨＰＬＣシステムにより実施した。
【００８９】
初期の研究でショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８００シリーズのカラム類が使用した全てのカラムの中で最も良い分離結果を出した。ここでは、ショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８０１と ショウデックスＴＭＳｕｇａｒ ＫＳ８０２を直列に繋いで、サイズ排除クロマトグラフィと配位子交換クロマトグラフィを組み合わせて蜂蜜サンプルを分画分取した。
【００９０】
ＫＳ８０１はナトリウム型で排除限界は１０３であった。ＫＳ８０２もナトリウム型で排除限界は１０４であった。両方のカラム共にスチレンジビニルベンゼンが充填剤に使用されている。使用温度は、製造元の推奨では１ｍＬ／ｍｉｎの流量において最初は８０℃であった。溶離液にはミリＱ水を用いた。
【００９１】
２０ｍｇ／２０μＬである蜂蜜サンプルの注入はＫＳ８００シリーズＨＰＬＣカラムへ行われた。図１と図２は示差屈折計によって検出されて得られたデータのプロットである。抗菌活性分析に使用する分画は２０回の注入から採取された。
【００９２】
図１において、分画Ａは０分から１２分まで、分画Ｂは１２分から１９．４分まで、分画Ｃは１９．４分から２５分までを分取したものである。プロットによれば、グルコース（１）のピークの後にフラクトース（２）のピークが観察される。オリゴ糖（３）のピークも観察される。
【００９３】
分離された分画の抗菌活性は試験用培地として黄色ブドウ球菌を使用したウェル拡散法によって行なった。
試験用にＨＰＬＣで採取した分画を、ビュッヒ４６１水槽を付属させた、ビュッヒ（Ｂ・モ・堰j ＲＥ１１１ ロトベイパー（Ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）を用いて４０℃で減圧乾
固させた。次いでそのサンプルを２００μＬの蒸留水と２００μＬのカタラーゼ溶液とを含む溶液で再溶解させ、非過酸化活性のみが存在する事を確かめた。
【００９４】
蜂蜜サンプルは２５％濃度に調整し、抗菌活性の試験を行なった。抗菌活性分析は２％から６％の値域のフェノール標準液を３複製用い、サンプルは３複製から５複製用いて、寒天プレート上の番号管理されたランダムウェルに添加して実施した。
【００９５】
そのプレートを３７℃で一晩、バクテリアが成育可能な条件にてインキュベートした。インキュベーションの後、デジタルキャリパー計によってウェル周りの阻害領域の直径を計測した。
【００９６】
蜂蜜の非過酸化活性は分画Ｃ（図１）に完全に含まれていた。
ＨＰＬＣプロットのベースライン領域に注目すれば、分画Ｃの活性領域に２つのピークが観察される（図２）。これらのピークのどれが活性に関与しているかを検証する為に、他の分画分取時間の設定方法を工夫した；分画Ｄは０分から１９．４分、分画Ｅは１９．４分から２１．７分、分画Ｆは２１．７分から２５分とした。
【００９７】
これらの実験から、全抗菌活性成分は分画Ｅに単離出来た。
この試験は更に２回繰り返し実施し、同様の結果を得た。
（第３実施形態） 蜂蜜のセミ分画分取（サイズ排除とイオン交換との組合せ）
これまでの研究によって（第２実施形態とスノウ（Ｓｎｏｗ）（２００１））、ＵＭＦを含有する画分は単糖の糖質類の大きな部分からショウデックスＴＭＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２分析用カラムを用いて分離できる事が実証されている。
【００９８】
サンプルの注入量を増加させカラムを通すのに適切であるこのカラムの分取用バージョン（ＫＳ−２００２カラム）を使用した。裏漉し蜂蜜からの溶出液の内訳は、最初にフェノール酸類、次いで二糖類とオリゴ糖類、最後に単糖類である事が同定された。
【００９９】
ショウデックスＴＭＳＵＧＡＲ ＫＳ２００２（２０ｍｍ×３００ｍｍ，２０μｍ粒子径，６０Å細孔径）分取スケールカラムはサイズ排除と配位子交換機能が組合わされている。このカラムはナトリウム（Ｎａ＋）型で使用し排除限界は１×１０４である。クロマトグラフィはミリＱ水を溶離液とし、使用流量は３ｍＬ／ｍｉｎで、室温で行った。
【０１００】
３００ｍｇ／ｍＬ濃度の蜂蜜の大量注入は２００μＬのループによって行なった。９９６ＰＤＡと２４１０ＲＩ両検出器によってスペクトルをモニターした。採取した分画は全て大サイズの蒸発皿で凍結乾燥した。
【０１０１】
図３は３００ｍｇ／ｍＬ濃度の裏漉し蜂蜜を２００μＬ注入して得た溶出液の内訳である。全蜂蜜中に観察されるグルコースとフラクトースの量はほぼ等しい（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）等，１９６２）が、今回は蜂蜜を注入前に裏漉ししているのでグルコースのピークはフラクトースのピークに比べて減少している。
【０１０２】
サイズ排除マトリクスは通常僅かに疎水性を有する弱い陰イオン性であり、その為に理想的な分離とはならず、分離は分子量サイズが厳密に反映されない（クニコ（Ｃｕｎｉｃｏ）等，１９９８）。このカラムはスチレンジビニルベンゼンをサイズ排除用重合体として使用しており、フェノール酸類とはイオン交換相互作用を有する。それ故保持時間は分子量サイズを表すものではない。
【０１０３】
カラムからの溶出液はまず４つの分画として分取した；
１． ０．０−１３．０分 フェノール酸類
２． １３．０−１８．４分 二糖類とオリゴ糖類
３． １８．４−２２．６分 グルコースとフラクトース
４． ２２．６−３０．０分 遅く溶出する成分類
活性は常に１８．４分から３０分の間の分画に観察された。次いで一つの分画に全ての活性が含まれているかどうかを確認した。
【０１０４】
【表１】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１０５】
表１は分取時間の違いによる３〜５つの分画の試験結果と得られた分画の非過酸化活性試験結果をまとめたものである。注記として、最初の分析は全蜂蜜を使用し、後の２つは裏濾した蜂蜜を使用したものである。
【０１０６】
検出可能な全ての活性は最終的に１９．５分から２５．０分の間の分画類に限定される事が判った。これら２つの分画の９５％信頼区間（ＣＩ，＝平均±２×ＳＥ）は表２にまとめた。
【０１０７】
信頼区間は阻害領域にもフェノール相当領域にも重ならず、分画４の活性は統計的に裏漉し蜂蜜のそれとは同じではない事を示している。すなわち、カラムへの吸着かもしくは他の分画へ分割移行し分析の検出限界以下の量しか残っていないかの原因で何等かの活性の損失が起こっている事が示唆される。分画４の活性平均値はフェノール活性相当として裏漉し蜂蜜の９０％を占めた。
【０１０８】
【表２】
阻害領域の数値は個々のウェルの数値で、フェノール相当領域の数値はプレートデータから計算した数値である。
【０１０９】
図３に示す通り、この分画にはほとんど全てのフラクトースが含まれる。単糖類そのものは抗菌活性を有していないが、水分活性を減少させ、且つグルコース酸化酵素の基質を供給し過酸化水素とグルコン酸とを産生させる物理的効果がある。それゆえ、低い濃度ではあっても他の化合物がこの分画に存在する事は明らかである。
【０１１０】
フラクトースのテーリング上にある小さなピークはこのカラムの分析用バージョンを使用したスノウ（２００１）の研究によって観察された。スノウ（２００１）によってこの分画を単離し、その構成成分をＧＣ−ＭＳとＮＭＲを用いて同定する試みが成された。しかし、サンプル中のほとんどの化合物が結果として同定できなかった。更にこのピークの大きさと全蜂蜜の活性との相関関係を調べる試みも成されたが、何の関連性も見つからなかった。これによって、このピークはどの一つも活性を有しない多くの化合物で構成されている事が示唆される。
【０１１１】
スノウ（２００１）は活性画分に関連するこのピークにはＵＶ活性があることを指摘している。しかしこれらのＵＶ活性ピーク類は、分取用カラムの性質上分離能が低く、この領域の弱いＵＶ活性を有する大量の開鎖単糖類が干渉するために、同定されなかった。
【０１１２】
単糖類を含まない分画を得るために分画４を再度注入する事とした。再度注入した分画から得たスペクトル（図４）には、１０．５分に新たなピークが出現しているものの、単糖ピークのテーリング上に何の濃縮されたピークも見受けられなかった。単糖のピークの立ち上がり位置に膨らみが観察されるが、グルコースの残渣であるようだ。ベースライン領域を拡大した図を図５に示す。
【０１１３】
糖類は、通常水溶液系に溶解しにくい化合物の溶解性を向上させる。よって、その化合物は糖類と相互作用を有するか糖類によって可溶化される可能性がある。糖類の濃度を低下させれば相互作用が無くなり早く溶出した。
【０１１４】
このピークは活性因子である可能性があるが、そのピークの大きさは、非過酸化活性に寄与する化合物（もしくは化合物類）は極めて低い濃度で存在するという考え方をとるのが良いであろう。或は、それは、冷凍庫で一ヶ月保存されていたサンプルを使用したので、分解物であるかかもしれない。
【０１１５】
再注入する前にサンプルの活性を試験したが活性の低下は見受けられず、この結果は単離するまで２ヶ月以上も冷凍保存していても活性画分は安定であったという研究結果からも裏打ちされている。このピークは非抗菌性化合物の分解物を反映している可能性もある。
【０１１６】
分画４を再注入して得られた２０．５分から２５．０分の間の分画を分取し、スノウ（
２００１）によって観察された活性ピークが同定できるかどうかを検証する為に、その分画を再度注入した。大変小さいとはいえ、１０．５分にやはり新たなピークがはっきりとスペクトル上に出現した（図６、拡大図は図７）。
【０１１７】
これにより、このピークは保存による分解物ではなく実際に活性が糖類に関連していない事を反映しているであろう事が示唆される。
この再注入から得られた分画の活性を調べるバイオ分析を行なう為に十分な量（極めて大まかな活性を示す為には最低２００ｍｇの蜂蜜をカラムに通さねばならず、厳密な活性分析を行なうには８００ｍｇ必要である）は分取しなかった。
【０１１８】
再注入によるクロマトグラム上のデータの変化動向について確定的なことは言えない。この方針はこれ以上追究しない事としたが、カラムによって分離を行なう条件を変えるなど、より大きな容量を検討する方針は継続する。
【０１１９】
（第４実施形態） 蜂蜜のセミ分画分取（逆相）
Ｃ１８ ２５ｍｍ逆相カラムの優位性は、カラムへ一度に１ｇを注入する事が出来る実質的により大きな保持容量を有する事であり、一方ＫＳ−２００２カラムは６０ｍｇしか注入できない。
【０１２０】
逆相の分取用カラムにはデルタパック Ｃ１８カートリッジ（２５ｍｍ×１００ｍｍ，
１５μｍ粒子径、１００Å細孔径）を３本直列に繋いで使用した。これにデルタ Ｃ１８ガードインサート（２５ｍｍ×１０ｍｍ、１５μｍ粒子径、１００Å細孔径）を装着した。クロマトグラフィは室温にて流量１０ｍＬ／ｍｉｎ、０．５ｇ／ｍＬのサンプルの大量注入は２ｍＬループで行なった。
【０１２１】
溶離システムは２種類を使用した。一つ目はミリＱ水のみを使用した。しかし後に、最初に１００％ミリＱ水を流し、糖類が溶出した後で１００％アセトニトリルに切替える方法に変更した。高い流量を使用するために、検出には広口径カラム用のＷａｔｅｒｓ（ウォーターズ） ４１０示差屈折計を使用した。
【０１２２】
水中に採取された画分は大型の蒸発皿で凍結乾燥した。アセトニトリル中に採取された分画は減圧下で濃縮し、凍結乾燥器を用いて完全に乾燥させた。
これによって、活性の生物学的分析を行なう為に十分な量のサンプルを採取するのに費やす時間が大幅に短縮された。加えて、このカラムによって単糖類から活性成分をより効率よく分離する事が出来るかどうかが関心事であった。図８はこのカラムに大量注入して（０．５ｇ／ｍＬ、２ｍＬ注入）ミリＱ水で溶離させて得られたスペクトルである。
【０１２３】
このスペクトルのほとんどは単糖類のピークである。このカラムではフラクトースからグルコースを分離する事は出来なかったが、単糖類の直ぐ後の１４分から２５分ぐらいの間に複数のピークのセットが溶出しているのが観察される。
【０１２４】
これらのうち、いくつかのピークはオリゴ糖類である事が判明したが、これらの成分は活性マヌカハニー中に全蜂蜜量比でおよそ８％含まれている（ＷｅｓｔｏｎとＢｒｏｃｋｌｅｂａｎｋ，１９９９）。図９はこれらのピークを表示する為にベースライン領域を拡大してある。
【０１２５】
カラムからの溶出液はまず３つの分画として分取した；
１． ０．０−８．３分 早い時間に溶出する成分類
２． ８．３−１１．８分 糖類
３． １１．８−２５．０分 遅い時間に溶出する成分類
検出可能な活性成分は全て分画Ｃに含まれていることが判った（表３）。
【０１２６】
【表３】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１２７】
興味を引くのは、いくつかの活性成分がアセトニトリルによって溶出しているかであり、それはアセトニトリルが分画に対して異なった溶解性を有するからである。加えて、全ての活性成分がミリＱ水によってカラムから溶出されるかどうかも検討する必要がある。
【０１２８】
逆相クロマトグラフィにおいて、アセトニトリルは水よりも強力な溶媒であり、カラムから残存化合物を洗い出す目的で使用する事が出来る。分取された分画類は図１０にまとめた。
【０１２９】
カラムはまずミリＱ水で溶離を行い、概要を前述したように分画ＡとＢを分取した。分画Ｂから分画Ｃ（１１．８分）へ越える時点で送液ポンプを止め、溶離液を直接１００％アセトニトリルに交換した。
【０１３０】
分画ＣＨ２Ｏを１１．８分からアセトニトリルが検出器に到達するまで分取し（およそ１３分間もしくは保持時間２４分まで）、溶離液の置き換わりは屈折率の変化によってベースラインが急速に上昇する事で確かめられた。この時間から３本のカラム容量分のアセトニトリルをカラムに通してフラッシュし、溶出液はＣＭｅＣＮ分画として分取した。
【０１３１】
表４に示す通り、検出可能な活性成分は全て分画ＣＨ２Ｏに含まれており、ＣＭｅＣＮ分画には一切含まれていない。これにより、活性成分はカラムに逆相的に保持されていない事がわかった。
【０１３２】
分画Ｃと分画ＣＨ２Ｏだけがそれぞれ７２％と７５％の裏漉し蜂蜜相当フェノール活性があったが、他の分画には検出可能な活性は観察されなかった。これにより、活性成分が不可逆的にカラムに吸着されていることが示唆された。
【０１３３】
使用したカラムは分取用でありエンドキャップされていないシリカゲル基材上にＣ１８鎖を有しているため、分析成分類はシリカゲルに吸着しているか、もしくは活性シラノール基との反応によって変性している可能性がある。加えて、分画にはばらついた値ではあるが常に部分的な活性を有する。この特殊なケースは、糖類の含有量が低下した時の分析
で非過酸化活性の拡散が無くなる事によるものかもしれない。
【０１３４】
【表４】
各数値は ａ）複製ＨＰＬＣ分析、ｂ）プレート全体の各ウェルの数値、ｃ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１３５】
ＫＳ−２００２とＣ１８カラムとの比較
デルタパック Ｃ１８による活性分画はＫＳ−２００２による場合と比べて遥かに糖類の混入が少なく、且つそれにより活性成分の糖質類からの分離状態がより良い。逆に言え
ば、ＫＳ−２００２カラムからはより多くの割合の活性成分が回収されるが、これは活性成分のＣ１８カラムのシリカゲル基材との化学的相互作用が反映されている。
【０１３６】
ＫＳ−２００２カラムから得た活性分画では、全活性が観察されるのと反対に、Ｃ１８カラムから得た分画では、部分的な活性しか得られない。しかし、これはＫＳ−２００２分画がより多くの糖質を含有する為に分析の際に拡散を補助するからとも考えられる。
【０１３７】
（第６実施形態） ＵＭＦを含有する画分における非過酸化性活性の安定性
これまでの文献で、非過酸化性活性は蜂蜜を加熱した後も顕著な活性が持続し（ボグダノフ，１９８４； モランとラッセル，１９８８； ロス（Ｒｏｔｈ）等，１９８６）、もしくは貯蔵しても持続（ボグダノフ，１９８４；Ｓｅａｌｅｙ，１９８６）する事が指摘されており、そしてこの事は非過酸化性活性を推奨する所見の理由の一つとなっている。
【０１３８】
本研究では単離されたＨＰＬＣ分画が室温と冷蔵温度で短時間貯蔵された（８時間から２４時間）場合と、冷凍温度で中期間貯蔵された（１週間から８週間）場合の安定性について調べた。
【０１３９】
これは実験を進めるに当り実際的な検討課題であり、分画に劣化がなくそれゆえ非活性化合物を取り除いても活性の損失はない事を確かめたかった。加えて、どのくらいの量のサンプルを試験使用のために"備蓄"出来るかを知る事も大切であった。
【０１４０】
付随する興味は、実際、貯蔵によって全蜂蜜の活性を増加できるとメーカーが提言している事例証拠のように本当に活性が増加するのかの検討であった。
この実験の結果の概要は表５にまとめ、視覚的に表したのが図１１である。
【０１４１】
【表５】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１４２】
裏漉し蜂蜜をＫＳ−２００２カラムで分離し１９．５分から２５分までの分画を分取し、速やかに冷凍した。注入が完了したその日のうちに分画は凍結乾燥させた。
一旦乾燥させてから蒸留水によって５０％の活性強度にもどし、次いで様々な時間の貯蔵を室温、冷蔵、冷凍にて行なった。各サンプルは裏漉し蜂蜜換算で４８０ｍｇに相当する。
【０１４３】
貯蔵の後、サンプルを２５％活性強度に希釈し、２枚の複製プレート上の各々４ウェルで試験し、何等かの活性の損失や獲得が無いかを調べた。これらの結果を、新しく採取した活性分画を同じプレートで試験した活性値と比較した。加えて、裏漉し蜂蜜を凍結乾燥した２つの複製サンプルを作成し、凍結乾燥の工程が蜂蜜の活性に与える影響について調べた。
【０１４４】
元の分画の保持率を表６にまとめた。元の活性の保持率は阻害領域では９４％から１０６％、フェノール相当領域では８６％から１１４％であった。これにより、様々な条件の貯蔵によって単離された活性分画の非過酸化性活性は何等かの影響を受ける事がわかった
。
【０１４５】
【表６】
表７はこれらの結果のＲＥＭＬ解析である。これらの結果によって、貯蔵による活性の変化のいくつかは、統計的に重要である。阻害領域のデータでは室温と冷蔵貯蔵サンプルは共にコントロールに比べて有意に低くなっている。
【０１４６】
フェノール相当領域についてはこれらの処理においては統計的に有意な差は見られず、おそらくそれはこのデータセットの反復性が低く、それにより標準エラーを生じ予想平均間の差異が曖昧になったのであろう。
【０１４７】
活性の増加について統計的有意性が見られるのは、阻害領域のデータで８週間冷凍貯蔵したものと、フェノール相当領域のデータで４週間冷凍貯蔵したものとである。
しかし、この実験の制限は実験が反復実施されず、同じ日に複製プレートで試験された事である。ついては、有意性を検証するためには日差データの変動が重要な役割を担う。フェノール標準品検量線を用いたフェノール相当活性解析値は阻害領域を使うよりもより大きな幅の値を生じるように見え、フェノール標準品は日差データの変動を補正できない事を示唆している。
【０１４８】
これらの結果に統計的有意性が見られなくても、活性の良好な保持は依然として観察された。冷凍貯蔵されたサンプルのいくつかからは活性が増加する統計的に有意な結果が得られた。しかし、日差変動とプレート間変動との影響については本実験において反復実験をしていないので未知のままである。
【０１４９】
【表７】
平均値間の差異は、サンプル値の予想平均値からコントロール値の予想平均値を減じて求めた。各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５０】
（第６実施形態） 蜂蜜の栄養強化
蜂蜜は、通常は自然には起こらない非常に優れた高い抗菌活性を有しており、その結果、値段が高い。よって、もしそのままでは活性が低すぎて医薬品利用が出来ない蜂蜜の活性を濃縮する方法や、既に高い活性を有する蜂蜜の効能を通常自然には得られない程度にまで増加させる方法が開発されたら、市場優位性を有する。
【０１５１】
蜂蜜の過酸化性活性は自然に産生され、過酸化物破壊物質の濃度とグルコース酸化酵素の安定性に依存するので、非過酸化性活性（ＵＭＦ）を濃縮することだけが有効である。
逆相ＨＰＬＣはＵＭＦを分離でき、サイズ排除／イオン交換による分画４とは対照的にサンプルの大量注入にカラムが対応し、分画Ｃ（１００％ミリＱ水で溶出）は分取され、裏漉し蜂蜜の栄養強化に利用される。
【０１５２】
栄養強化サンプルを作成する為に、分画Ｃ（１ｇの裏漉し蜂蜜を分離して作成）を１ｍＬの蒸留水に未処理の裏漉し蜂蜜を１ｇ溶解させた溶液に加えた。この５０％溶液を更にカタラーゼで希釈し２５％の溶液とした。よって、サンプルは理論的に裏漉し蜂蜜コントロールの２倍量のＵＭＦを含有している事になる。
【０１５３】
最初の実験（表８）では、裏漉し蜂蜜の活性に加えて少しの増加が得られた。
【０１５４】
【表８】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５５】
これによると、裏漉し蜂蜜の活性がフェノール活性相当で２３．５％増加している事が判る。活性の倍増は観察されなかったので、栄養強化レベルの増加を含む実験に拡張し、活性分画の調合分量を増加させれば直接比例した活性応答を得る事が可能かどうかを検討した。
【０１５６】
各調合は前述のように、各々裏漉し蜂蜜１，２，３ｇと未処理裏漉し蜂蜜１ｇとに相当する濃度の分画Ｃの添加により構成された。
表９は作成されたサンプルの活性を示し、図１２は阻害領域の結果をグラフ化して示している。
【０１５７】
【表９】
各数値は ａ）プレート全体の各ウェルの数値、ｂ）フェノール活性をプレート毎に計算した数値、に基づいている。
【０１５８】
高い相関関係が見られ（Ｒ２＝０．９８７４）、直接比例した活性応答が起こった事を示している。これによって、蜂蜜の非過酸化性活性を増加させる事は可能である事が確認
された。
【０１５９】
しかし、直線回帰解析によれば、これらサンプル試験で用いた複製プレートデータには傾きにおいて統計学上有意な違いがあった（ｐ値＝０．０１１）。これらのグラフはミニタブによる解析結果として図１３に示してある。
【０１６０】
これらのようなプレートの影響は珍しい事ではない。既に議論したように、プレートに拠る変動はＷＤＡ法において最も有意な変動要因であり、よってサンプルの試験は複製プレート法で行い、平均化する事でこの影響を補正する事が出来る。
【０１６１】
あるいは、栄養強化のデータが１：３のデータポイント（比率３、図１３）では、他の３つの栄養強化レベルと比較して２つのグラフ間の変移量がより大きい。これはおそらく何らかの要因がこのポイントを制限し、グラフが曲がったのであろう。
【０１６２】
これは単にこのサンプルが２つのプレートに添加された時に同質でなかった事に依拠している。但し、分析自体が高い活性による高感度のものではなかった。この理由は３つにまとめられる；
（ｉ） 阻害領域が重なると細長くなる傾向があり、計測を困難にする
（ｉｉ） 拡散がより変動する
（ｉｉｉ） 阻害領域が標準の最高値を超える
本研究において分画は注意深くスペースを空け、阻害領域が重ならないようにしたが、１：３栄養強化サンプルは標準の最高値に近接した。
【０１６３】
これらの検討とは関係なく、マヌカハニーからのＵＭＦを含有する分画の調整と、蜂蜜の栄養強化に使用する方法が実証された。
前述の論及された説明書きが完全であるかもしくは構成要素が既知の等価な内容を有する場合は、そのような等価な内容は個別の陳述として組み込まれる。
【０１６４】
本発明が実施例と可能な実施形態に関連したものとを用いて記載されているとしても、それについての改善および修正、もしくは改善または修正は、本発明の範囲や主旨から逸脱するものではない。
【０１６５】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】配位子交換クロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィとを用いたＨＰＬＣ示差屈折計によるマヌカハニーの分析を示すグラフ。
【図２】配位子交換クロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィとを用いたＨＰＬＣ示差屈折計によるマヌカハニーの分析におけるベースラインを拡大したグラフ。
【図３】裏漉し蜂蜜をＫＳ−２００２カラムでＨＰＬＣ分析（３００ｍｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２００μＬ注入して示差屈折計によりピークの溶出をモニターした）を示すグラフ。
【図４】ＫＳ−２００２カラムから得た活性画分を再度注入しＨＰＬＣ分析（分画４（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り２００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターした）を示すグラフ。
【図５】ＫＳ−２００２カラムから得た活性画分を再度注入しＨＰＬＣ分析。分画４（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り２００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大したグラフ。
【図６】ＫＳ−２００２カラムに分画４を注入して得られた２０．５分から２５分までのＨＰＬＣ分析（２００μＬ注入して得られた溶離ピークの示差屈折計によるモニター（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り１００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した））したグラフ。
【図７】分画４をＫＳ−２００２カラムに再度注入して得られた２０．５分から２５分までの分画のＨＰＬＣスペクトル。この分画を２００μＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大した図（蜂蜜裏漉し１ｍＬ当り１００ｍｇの濃度に相当する濃度に調整した）。
【図８】Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣのスペクトル。０．５ｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２ｍＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターした。
【図９】Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ。０．５ｇ／ｍＬの裏漉し蜂蜜を２ｍＬ注入し、溶出液を示差屈折計でモニターしたデータを拡大したスペクトル。
【図１０】Ｃ１８カラムから得た分画をミリＱとアセトニトリルとに収集した実例を示すグラフ。
【図１１】保管が活性画分の非過酸化活性に与える影響を示すグラフ。
【図１２】栄養強化した裏漉し蜂蜜の組成検討を示すグラフ。
【図１３】プレート毎にグループ分けして栄養強化実験を行なったデータ（１〜２はオープンスペース、単位はｍｍ２、割合は画分Ｃと裏漉し蜂蜜との比、単位はｇ／ｇ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜。
【請求項２】
前記蜂蜜はマヌカハニーである、請求項１に記載の蜂蜜。
【請求項３】
前記栄養強化された蜂蜜が栄養強化されていないマヌカハニーよりも高いＵＭＦ値を有する、請求項１又は請求項２に記載の蜂蜜。
【請求項４】
前記栄養強化された蜂蜜が２５よりも高い、更に望ましくは３５より高いＵＭＦ値を有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の蜂蜜。
【請求項５】
ＵＭＦを含有する画分と蜂蜜とを混合する工程を備える、ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜を調整する方法。
【請求項６】
ＵＭＦを含有する画分を調整する方法であり、
ａ） 一定量のマヌカハニーをクロマトグラフィのマトリクスに加える工程と、
ｂ） 溶媒を用いて前記マトリクスからサンプルを溶出させる工程と、
ｃ） ＵＭＦを含有する画分を分取する工程とを備える方法。
【請求項７】
マヌカハニーが、２５よりも高い、更に望ましくは３５より高いＵＭＦ値を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリクスがサイズ排除マトリクスもしくは逆相マトリクスである、請求項６もしくは請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が水である、請求項６〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＭＦを含有する画分の分取を、実質的に全ての単糖の糖質類が存在するサンプルの溶出液から採取し始める、請求項６〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記分取したＵＭＦを含有する画分が、実質的に単糖の糖質類を含まない、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリクスがカラムの形式になっている、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記マトリクスがサイズ排除とイオン交換マトリクスである、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
対イオンがＮａ＋である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリクスが１０４の排除限界を有する、請求項１３もしくは請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マトリクスがスチレンジビニルベンゼン共重合体である、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記マトリクスがＣ１８である請求項６〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリクスが１５μｍの粒子径と１００Åの細孔径とを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マヌカハニーから採取した、ＵＭＦを含有する画分。
【請求項２０】
前記画分が実質的に単糖の糖質類を含まない、請求項１９に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２１】
ＵＭＦを含有する画分が有する抗菌活性がアルカリ領域のｐＨでは不安定である、請求項１９又は請求項２０に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２２】
前記アルカリ領域のｐＨが９を超える、請求項１９〜２１のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２３】
前記ＵＭＦを含有する画分が、請求項６〜１８のいずれか１つに記載の方法によって調整される、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２４】
前記ＵＭＦを含有する画分が、第２実施形態に記載のクロマトグラフィ上の特性を有するような、請求項１９〜２３のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２５】
ＵＭＦを含有する画分を含む蜂蜜のサンプル（２０μＬ）をショウデックスＴＭ Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２分析用カラムへ直列に繋ぎ、ナトリウム型に調整したカラムに注入し、温度５０℃、溶離液ミリＱ水、流量１ｍＬ／ｍｉｎで運転したときに、前記ＵＭＦを含有する画分が、１９．４分〜２５分の間に保持時間を有するような、請求項１９〜２３のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２６】
前記ＵＭＦを含有する画分が保持時間１９．４分〜２１．７分の間である、請求項２５に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分を調合した医薬品。
【請求項２８】
前記医薬品が創傷包帯である、請求項２７に記載の医薬品。
【請求項２９】
請求項１９〜２６のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分を調合した食品。
【請求項３０】
前記食品が蜂蜜である、請求項２９に記載の食品。
【請求項１】
ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜。
【請求項２】
前記蜂蜜はマヌカハニーである、請求項１に記載の蜂蜜。
【請求項３】
前記栄養強化された蜂蜜が栄養強化されていないマヌカハニーよりも高いＵＭＦ値を有する、請求項１又は請求項２に記載の蜂蜜。
【請求項４】
前記栄養強化された蜂蜜が２５よりも高い、更に望ましくは３５より高いＵＭＦ値を有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の蜂蜜。
【請求項５】
ＵＭＦを含有する画分と蜂蜜とを混合する工程を備える、ＵＭＦにより栄養強化された蜂蜜を調整する方法。
【請求項６】
ＵＭＦを含有する画分を調整する方法であり、
ａ） 一定量のマヌカハニーをクロマトグラフィのマトリクスに加える工程と、
ｂ） 溶媒を用いて前記マトリクスからサンプルを溶出させる工程と、
ｃ） ＵＭＦを含有する画分を分取する工程とを備える方法。
【請求項７】
マヌカハニーが、２５よりも高い、更に望ましくは３５より高いＵＭＦ値を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マトリクスがサイズ排除マトリクスもしくは逆相マトリクスである、請求項６もしくは請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が水である、請求項６〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＵＭＦを含有する画分の分取を、実質的に全ての単糖の糖質類が存在するサンプルの溶出液から採取し始める、請求項６〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記分取したＵＭＦを含有する画分が、実質的に単糖の糖質類を含まない、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記マトリクスがカラムの形式になっている、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記マトリクスがサイズ排除とイオン交換マトリクスである、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
対イオンがＮａ＋である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マトリクスが１０４の排除限界を有する、請求項１３もしくは請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マトリクスがスチレンジビニルベンゼン共重合体である、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記マトリクスがＣ１８である請求項６〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリクスが１５μｍの粒子径と１００Åの細孔径とを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マヌカハニーから採取した、ＵＭＦを含有する画分。
【請求項２０】
前記画分が実質的に単糖の糖質類を含まない、請求項１９に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２１】
ＵＭＦを含有する画分が有する抗菌活性がアルカリ領域のｐＨでは不安定である、請求項１９又は請求項２０に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２２】
前記アルカリ領域のｐＨが９を超える、請求項１９〜２１のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２３】
前記ＵＭＦを含有する画分が、請求項６〜１８のいずれか１つに記載の方法によって調整される、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２４】
前記ＵＭＦを含有する画分が、第２実施形態に記載のクロマトグラフィ上の特性を有するような、請求項１９〜２３のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２５】
ＵＭＦを含有する画分を含む蜂蜜のサンプル（２０μＬ）をショウデックスＴＭ Ｓｕｇａｒ ＫＳ−８０１とＫＳ−８０２分析用カラムへ直列に繋ぎ、ナトリウム型に調整したカラムに注入し、温度５０℃、溶離液ミリＱ水、流量１ｍＬ／ｍｉｎで運転したときに、前記ＵＭＦを含有する画分が、１９．４分〜２５分の間に保持時間を有するような、請求項１９〜２３のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２６】
前記ＵＭＦを含有する画分が保持時間１９．４分〜２１．７分の間である、請求項２５に記載のＵＭＦを含有する画分。
【請求項２７】
請求項１９〜２６のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分を調合した医薬品。
【請求項２８】
前記医薬品が創傷包帯である、請求項２７に記載の医薬品。
【請求項２９】
請求項１９〜２６のいずれか１つに記載のＵＭＦを含有する画分を調合した食品。
【請求項３０】
前記食品が蜂蜜である、請求項２９に記載の食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５０１３６１（Ｐ２００８−５０１３６１Ａ）
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７０９５（Ｐ２００７−５２７０９５）
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２０２５０
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０６４０７２１３）ザ ユニバーシティ オブ ワイカト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＷＡＩＫＡＴＯ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月８日（２００５．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００１１８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２０２５０
【国際公開日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【出願人】（５０６４０７２１３）ザ ユニバーシティ オブ ワイカト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＷＡＩＫＡＴＯ
【Ｆターム（参考）】
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