猫眼草抽出物およびその調製方法と用途
本発明は、薬用植物である猫眼草から活性化合物を単離する方法であって、下記のステップを含む方法を開示する。猫眼草のアセトン抽出物に対し有機溶剤による粗抽出を行うステップ；有機溶剤による抽出物に対しＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高くかつ毒性作用のない抽出物に対してさらに単離を行うステップ；単離により得られた画分に対しＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高い抽出物に対してさらに単離精製を行うステップ；単離によって得られた単一成分の化合物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および理化学的特性の分析を行うことにより、その構造を決定するステップ。単離により得られた化合物はＮＯ産生を抑制する活性を有する。そのうち化合物１〜３の構造は次のとおりである。
【化１】
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用植物である猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）から単離抽出した抗炎症活性物質およびその調製方法と用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの人を悩ませている日常的な炎症性の疾患としては、骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊髄炎、痛風関節炎などの関節炎；湿疹、乾癬、皮膚炎などの炎症性皮膚病；ブドウ膜炎、結膜炎などの炎症性眼疾；喘息、気管支炎、急性呼吸促迫症候群などの肺疾患；菌血症、内毒素血症、潰瘍性口内炎、歯茎炎、膵臓炎など；限局性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結腸炎、腹膜炎、消化性潰瘍、およびピロリ菌感染による粘膜炎症あるいは非ステロイド系抗炎症薬による胃腸病などの過敏性腸管症候群といった胃腸疾患などがある。
【０００３】
各種の炎症の発症メカニズムとしては、体内の一酸化窒素（ＮＯ）が細胞の免疫および炎症を導く毒性物質であることが知られている。その前駆物質はＬ−アルギニンであり、Ｌ−アルギニンはＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）の働きによりＮＯを産生する。現在、内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）、神経型ＮＯ合成酵素（ｎＮＯＳ）および誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の３つの異なるタイプのＮＯＳがすでに単離されている。また、マクロファージ、肝細胞、平滑筋細胞、腺癌細胞および上皮細胞がいずれもｉＮＯＳを発現し得ることが知られている。一部の炎症性細胞因子および例えばリポ多糖（ＬＰＳ）のような微生物生成物はｉＮＯＳの発現を誘導する。ｉＮＯＳは、誘導されると直ちに高度の活性を発現し、大量のＮＯを産生する。
【０００４】
このため長期にわたり、誘導型ＮＯ合成酵素ｉＮＯＳの抑制剤により上記に関連する炎症性疾病を治療することに力が注がれてきた。しかしこれらの抑制剤はその大部分が化学的手段によりに合成された物質であり、副作用が比較的大きい。従来技術においては、民間薬として使われている天然の植物からの抗炎症活性物質の抽出に関してはいまだ報告されていない。
【０００５】
猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）は中国では鎮咳、去痰の薬として用いられ、慢性気管支炎に使用されている。『中華人民共和国薬典』１９７７年版第１部に収録され、中国名は猫眼草、日本名はビョウガンソウ（猫眼草）という。中国河北省、内蒙古自治区および山西省などの乾燥地帯に分布する多年生の草本植物である。
【０００６】
本植物は、苦味があり、薬の性質はやや「寒」（陰性）で、毒性をもつ。去痰、鎮咳、でき物や腫れ物の解消、毒消し、痒み止めおよび抗菌などの薬理作用を有する。慢性気管支炎の治療に使用した場合の臨床効果は良好で、主に慢性気管支炎の咳、痰の緩和、リンパ節結核に対する体外からの治療および白癬・疱疹などの皮膚病の治療に使用される。例えば、中国特許公開番号ＣＮ１３２６７５１Ａ号（公開日２００１年１２月１９日）には、猫眼草の水による煮液を加工して作られるリンパ結核およびペストの治療に使用される「猫眼膏」が開示されている。
【０００７】
しかし今日まで、猫眼草の活性成分についてはあまり深く研究されてこなかった。猫眼草において、すでに分布と構造が究明されている化合物を次に例示する。本植物の茎および葉にはフラボノイド、ステロイド類、揮発油およびフェノール類化合物が含まれ、地上部分からはケンフェロール、クエルセチンなどのグリコシド類化合物を単離することができ、種子および植物体にはクマリン類化合物が含まれる。しかし、各種化合物の作用については大部分がまだ不明であり、さらなる研究が待たれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このため本発明者らは、猫眼草から、毒性がなく安全でかつ効果的にｉＮＯＳ酵素の活性化を抑制することによりＮＯの大量産生を抑制して抗炎症の働きをする明確な抗炎症活性を有する成分を抽出する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は下記の構造式を有し、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの名称を有する化合物を提供する。
【化１】
【００１０】
本発明は、薬用植物である猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）から活性物質を抽出する方法であって、下記のステップを含むことを特徴とする方法に関する。
１）アセトンにより猫眼草に対し抽出を行った上、濃縮する。
２）前記ステップ１）で得た抽出物を水中に浮遊させ、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを溶出剤として、順次それぞれ抽出を行い、抽出物を得る。
３）ステップ２）の有機溶剤抽出物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および毒性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高くかつ毒性作用のない抽出物に対し、さらにカラムクロマトグラフィーによる単離を行い、溶出液を得る。
４）ステップ３）で単離して得た溶出液に対し、ＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性の高かった溶出液をさらに単離精製し、活性物質を得る。
５）ステップ４）で単離して得た単一成分の化合物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および理化学的特性の分析を行い、それによりその構造を決定する。
【００１１】
前記ステップ１において、好ましくはアセトンの抽出濃度を７０％とする。
前記ステップ３において、好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のクロマトグラフカラムを用いて単離を行い、５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを順次用いて溶出する。
前記ステップ４において、好ましくはＣＨＰ−２０のクロマトグラフカラムおよび／またはＨＰＬＣにより精製を行い、精製方法はＣＨＰ−２０カラムで単離するときには３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを順次用いて溶出を行い、ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ １５０×１０ｍｍＩ．Ｄ．）を用いるときには移動相を０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍとする。
前記ＮＯ産生抑制活性試験はマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を用い、試料濃度は１００μｇ／ｍｌで行う。
前記毒性作用は、ＭＭＴ細胞毒性試験により行う。
前記理化学的特性の分析技術には、核磁気共鳴を含む。
前記活性化合物は、抗炎症活性を有することが好ましい。
前記活性化合物には、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンなどが含まれる。
クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびクエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシドは、ＮＯ産生抑制活性を有する。
【００１２】
本発明はさらに、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド）、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンの、ＮＯ合成酵素と関わりのある炎症の治療薬調製における用途にも関する。
【００１３】
本発明により得られた有益な技術的効果は、初めて猫眼草から明確な抗炎症活性を有する物質を単離して得たことであり、これは誘導型ＮＯ合成酵素ｉＮＯＳに対する天然の抑制剤であり、化学合成物質のもつ有害な副作用の問題を克服することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
実施例１ 猫眼草抽出物の調製方法
（１）猫眼草の粗抽出方法および生成物
猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）９．０ｋｇを７０％アセトン（２７Ｌ）にて３回抽出し、抽出液を濃縮し、得られたエキスに水を加えて懸濁液にし、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを順次用いて抽出を行った。これら３種の抽出物のそれぞれに対し、試料濃度を１００μｇ／ｍｌとして、ＮＯ産生抑制試験およびＭＴＴ試験を行った。その結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この中からＮＯ産生抑制率が高く、かつＭＴＴ細胞毒性試験で毒性の認められなかった酢酸エチル抽出物を選び出し、これを次の操作ステップに進めた。
【００１７】
（２）酢酸エチル抽出物のカラムクロマトグラフィーの方法および生成物
酢酸エチル抽出物４６．１ｇをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに付し、単離を行う。５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを用いて順次溶出し、合計９画分の溶出液を回収し、これらの１画分ごとにＮＯ産生抑制試験を行った。その結果を表２に示す（Ｆｒ．は画分の意）。
【００１８】
【表２】
【００１９】
この中からＮＯ産生抑制率が高く、かつ収率も比較的よい画分４および８を選び、次の操作ステップに進めたが、画分５は収率が最も高く、ＮＯ産生抑制率も特に低くはなかったことから、これも次の操作ステップに進めた。
【００２０】
（３）画分４、５および８の単離精製方法ならびに生成物
そこでＣＨＰ−２０カラムを用いてＦｒ．４、Ｆｒ．６およびＦｒ．８に対し、それぞれ単離を行い、３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを用いて順次溶出を行った。
前記Ｆｒ．４からは、単離・純化により６つの画分Ｆｒ．４−Ａ（８６７．２ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｂ（５８．１ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｃ（５７．７ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｄ（８１．５ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｅ（０．５２ｇ）およびＦｒ．４−Ｆ（１６．６ｍｇ）を得た。このうち逆相ＴＬＣ（０．１％ＴＦＡ：メタノール＝６０：４０）において単スポットを示したＦｒ．４−Ｄに対し、逆相の高速液体クロマトグラフＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ １５０×１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）において、移動相０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍにて精製を行い、化合物（１）〔５．３ｍｇ〕を得た。
前記Ｆｒ．５からは、単離・純化により５つの画分Ｆｒ．５−Ａ（２．０２ｇ）、Ｆｒ．５−Ｂ（０．１６ｇ）、Ｆｒ．５−Ｃ（３３．２ｍｇ）、Ｆｒ．５−Ｄ（０．０７ｇ）およびＦｒ．５−Ｅ（５６．４ｍｇ）を得た。Ｆｒ．５−Ａからは結晶が析出したため、メタノールで再結晶し、化合物（２）〔０．２５ｇ〕を得た。
前記Ｆｒ．８からは、単離・純化により９つの画分Ｆｒ．８−１（１０．７ｍｇ）、Ｆｒ．８−２（１７．０ｍｇ）、Ｆｒ．８−３（３５６．５ｍｇ）、Ｆｒ．８−４（３５２ｍｇ）、Ｆｒ．８−５（３４．５ｍｇ）、Ｆｒ．８−６（１３．１ｍｇ）、Ｆｒ．８−７（１９．４ｍｇ）、Ｆｒ．８−８（３５４ｍｇ）およびＦｒ．８−９（９８．１ｍｇ）を得た。Ｆｒ．８−４に対し、ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ）において、移動相０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍにて精製し、化合物（３）〔３．３ｍｇ〕を得た。
【００２１】
実施例２ 主な化合物の理化学的性状
単離・純化により得られた３つの化合物の物理化学的分析を行った。主なデータを表３、４および５に示す。
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
化合物１〜３の構造は下記のとおりである。
【化２】
【００２６】
実施例３ 猫眼草抽出物のＮＯ産生抑制活性
使用材料
ＲＡＷ２６４．７細胞、（マクロファージ、アベルソン白血病ウィルスから転化）、米国ＡＴＣＣ（米国標準菌株保存機構）より取得。１０％ＦＢＳを含むハムＦ１２培地を用い、５％ＣＯ2、３７℃にて培養。
ＩＦＮ−γ：Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社；ＬＰＳ：Ｓｉｇｍａ社；スルファニルアミド：和光純薬；Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩（Ｎ−１−Ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉａｍｉｎｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）：和光純薬；グリース試薬：（１）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩を注射用水５ｍｌに溶解する；（２）注射用水５ｍｌ、スルファニルアミド５０ｍｇにリン酸２５０μｌを加える。
【００２７】
計測器
マイクロプレートリーダー（３５５０型マイクロプレートリーダー、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
【００２８】
具体的な方法および結果
ＲＡＷ２６４．７細胞５０ｍｌをファルコンチューブに入れて遠心分離し（１０００ｒｐｍ、３分、４℃）、細胞を沈殿させ、上清をアスピレーターを用いて除き、新鮮培地を１０ｍｌ加えて懸濁させる。（濃度が１．５×１０5個／ｍｌになるよう調整）９６穴プレートの各穴に２００μｌずつ注入し、ＣＯ2インキュベーター内で１〜２時間放置する。ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ Ｓｉｇｍａ ０５５：Ｂ５）を２μｌ加え、マウスＩＦＮ−γ（３３ｎｇ／ｍｌ Ｇｅｎｚｙｍｅ）２μｌ、検体化合物０．４μｌを加える。ＣＯ2インキュベーターに入れ、１６時間培養する。終濃度はＩＦＮ−γ０．３３ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌとする。検体化合物をＤＭＳＯに溶解し、含量が培地に対して０．２％となるようにする。顕微鏡で観察し、ＭＴＴ試験を行う。グリース法によりＮＯ産生の評価を行う。上清１００μｌを採取して０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩溶液５０μｌ、スルファニルアミド５０μｌを加え、室内で遮光して１０分間放置する。分光光度計にて５７０ｎｍ（対照６５５ｎｍ）のＯ．Ｄ．値を測定する。
【００２９】
活性の評価
ＮＯ2-の量を算出し、下記の公式に代入して抑制効果を求める。
抑制効果（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下で、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ2-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳがいずれも存在しない状態で、誘導されて産生したＮＯ2-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ2-の量
【００３０】
ＮＯ産生抑制効果のＩＣ50値は表６のとおりである。
【００３１】
【表６】
【００３２】
化合物１、２および３はいずれも強いＮＯ産生抑制活性を有することを示している。
【００３３】
実施例４ 猫眼草抽出物のｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２およびＩＬ−１２のｍＲＮＡに対する発現抑制試験
ＲＡＷ２６４．７細胞（１．２×１０6細胞／ｍｌ）を化合物ＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに６時間培養する。ＲＮＡ単離用試薬キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍにおける吸光値を測定し、ＲＮＡの量を決定し、ＲＮＡ２５０ｎｇとオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーとを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。前記反応は、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2５ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ酵素（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ｇｏｌｄ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）０．６ユニットならびにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー０．４μＭｍｏｌにより３０μｌの反応溶液中で行う。ｉＮＯＳに対して使用するプライマーは５’−ＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣＧＡＣＣＣ−３’［Ｓ］、５’−ＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣ−３’［ＡＳ］とし、β−アクチンのプライマーは５’−ＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’［Ｓ］、５’−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３’［ＡＳ］とし、ＴＮＦ−ａのプライマーは５’−ＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴ−３’［Ｓ］、５’−ＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＡ−３’［ＡＳ］とする。ＣＯＸ−２のプライマーは５’−ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＴ−３’［Ａ］、５’−ＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＧ−３’［ＡＳ］とする。ＩＬ−１２のプライマーは５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧ−３’［Ｓ］、５’−ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧ−３’［ＡＳ］とする。ＰＣＲ反応は下記の方式により行った。９４℃１分間（変性）、６０℃１分間（アニール）および７２℃１．５分間を１サイクルとして２５サイクル行う。ＰＣＲ生成物は２％アガロース中で電気泳動した後、エチジウムブロミドで染色し測定する。
【００３４】
猫眼草抽出物はｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現に対し濃度依存的な抑制作用を有する。また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＣＯＸ−２のｍＲＮＡに対する発現抑制から、猫眼草抽出物は転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制できると推定される（下図）。
【００３５】
上図は猫眼草抽出物のｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２およびＩＬ−１２のｍＲＮＡに対する発現抑制の結果である。
【００３６】
この結果は、猫眼草抽出物がｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現に対し濃度依存的な抑制作用を有することを示している。また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＣＯＸ−２のｍＲＮＡの発現に対しても抑制作用を有し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化抑制が推測される。上記の数種の炎症因子は急性・慢性炎症、アレルギー性疾患などの疾患機序と密接に関わっていることから、猫眼草抽出物から単離されたこれらの炎症因子抑制剤は急性・慢性炎症およびアレルギー性疾患などの疾患の治療薬の調製に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用植物である猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）から単離抽出した抗炎症活性物質およびその調製方法と用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの人を悩ませている日常的な炎症性の疾患としては、骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊髄炎、痛風関節炎などの関節炎；湿疹、乾癬、皮膚炎などの炎症性皮膚病；ブドウ膜炎、結膜炎などの炎症性眼疾；喘息、気管支炎、急性呼吸促迫症候群などの肺疾患；菌血症、内毒素血症、潰瘍性口内炎、歯茎炎、膵臓炎など；限局性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結腸炎、腹膜炎、消化性潰瘍、およびピロリ菌感染による粘膜炎症あるいは非ステロイド系抗炎症薬による胃腸病などの過敏性腸管症候群といった胃腸疾患などがある。
【０００３】
各種の炎症の発症メカニズムとしては、体内の一酸化窒素（ＮＯ）が細胞の免疫および炎症を導く毒性物質であることが知られている。その前駆物質はＬ−アルギニンであり、Ｌ−アルギニンはＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）の働きによりＮＯを産生する。現在、内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）、神経型ＮＯ合成酵素（ｎＮＯＳ）および誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の３つの異なるタイプのＮＯＳがすでに単離されている。また、マクロファージ、肝細胞、平滑筋細胞、腺癌細胞および上皮細胞がいずれもｉＮＯＳを発現し得ることが知られている。一部の炎症性細胞因子および例えばリポ多糖（ＬＰＳ）のような微生物生成物はｉＮＯＳの発現を誘導する。ｉＮＯＳは、誘導されると直ちに高度の活性を発現し、大量のＮＯを産生する。
【０００４】
このため長期にわたり、誘導型ＮＯ合成酵素ｉＮＯＳの抑制剤により上記に関連する炎症性疾病を治療することに力が注がれてきた。しかしこれらの抑制剤はその大部分が化学的手段によりに合成された物質であり、副作用が比較的大きい。従来技術においては、民間薬として使われている天然の植物からの抗炎症活性物質の抽出に関してはいまだ報告されていない。
【０００５】
猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）は中国では鎮咳、去痰の薬として用いられ、慢性気管支炎に使用されている。『中華人民共和国薬典』１９７７年版第１部に収録され、中国名は猫眼草、日本名はビョウガンソウ（猫眼草）という。中国河北省、内蒙古自治区および山西省などの乾燥地帯に分布する多年生の草本植物である。
【０００６】
本植物は、苦味があり、薬の性質はやや「寒」（陰性）で、毒性をもつ。去痰、鎮咳、でき物や腫れ物の解消、毒消し、痒み止めおよび抗菌などの薬理作用を有する。慢性気管支炎の治療に使用した場合の臨床効果は良好で、主に慢性気管支炎の咳、痰の緩和、リンパ節結核に対する体外からの治療および白癬・疱疹などの皮膚病の治療に使用される。例えば、中国特許公開番号ＣＮ１３２６７５１Ａ号（公開日２００１年１２月１９日）には、猫眼草の水による煮液を加工して作られるリンパ結核およびペストの治療に使用される「猫眼膏」が開示されている。
【０００７】
しかし今日まで、猫眼草の活性成分についてはあまり深く研究されてこなかった。猫眼草において、すでに分布と構造が究明されている化合物を次に例示する。本植物の茎および葉にはフラボノイド、ステロイド類、揮発油およびフェノール類化合物が含まれ、地上部分からはケンフェロール、クエルセチンなどのグリコシド類化合物を単離することができ、種子および植物体にはクマリン類化合物が含まれる。しかし、各種化合物の作用については大部分がまだ不明であり、さらなる研究が待たれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このため本発明者らは、猫眼草から、毒性がなく安全でかつ効果的にｉＮＯＳ酵素の活性化を抑制することによりＮＯの大量産生を抑制して抗炎症の働きをする明確な抗炎症活性を有する成分を抽出する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は下記の構造式を有し、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの名称を有する化合物を提供する。
【化１】
【００１０】
本発明は、薬用植物である猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）から活性物質を抽出する方法であって、下記のステップを含むことを特徴とする方法に関する。
１）アセトンにより猫眼草に対し抽出を行った上、濃縮する。
２）前記ステップ１）で得た抽出物を水中に浮遊させ、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを溶出剤として、順次それぞれ抽出を行い、抽出物を得る。
３）ステップ２）の有機溶剤抽出物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および毒性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高くかつ毒性作用のない抽出物に対し、さらにカラムクロマトグラフィーによる単離を行い、溶出液を得る。
４）ステップ３）で単離して得た溶出液に対し、ＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性の高かった溶出液をさらに単離精製し、活性物質を得る。
５）ステップ４）で単離して得た単一成分の化合物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および理化学的特性の分析を行い、それによりその構造を決定する。
【００１１】
前記ステップ１において、好ましくはアセトンの抽出濃度を７０％とする。
前記ステップ３において、好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のクロマトグラフカラムを用いて単離を行い、５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを順次用いて溶出する。
前記ステップ４において、好ましくはＣＨＰ−２０のクロマトグラフカラムおよび／またはＨＰＬＣにより精製を行い、精製方法はＣＨＰ−２０カラムで単離するときには３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを順次用いて溶出を行い、ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ １５０×１０ｍｍＩ．Ｄ．）を用いるときには移動相を０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍとする。
前記ＮＯ産生抑制活性試験はマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を用い、試料濃度は１００μｇ／ｍｌで行う。
前記毒性作用は、ＭＭＴ細胞毒性試験により行う。
前記理化学的特性の分析技術には、核磁気共鳴を含む。
前記活性化合物は、抗炎症活性を有することが好ましい。
前記活性化合物には、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンなどが含まれる。
クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびクエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシドは、ＮＯ産生抑制活性を有する。
【００１２】
本発明はさらに、クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド）、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンの、ＮＯ合成酵素と関わりのある炎症の治療薬調製における用途にも関する。
【００１３】
本発明により得られた有益な技術的効果は、初めて猫眼草から明確な抗炎症活性を有する物質を単離して得たことであり、これは誘導型ＮＯ合成酵素ｉＮＯＳに対する天然の抑制剤であり、化学合成物質のもつ有害な副作用の問題を克服することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
実施例１ 猫眼草抽出物の調製方法
（１）猫眼草の粗抽出方法および生成物
猫眼草（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌｕｎｕｌａｔａ Ｂｇｅ．）９．０ｋｇを７０％アセトン（２７Ｌ）にて３回抽出し、抽出液を濃縮し、得られたエキスに水を加えて懸濁液にし、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを順次用いて抽出を行った。これら３種の抽出物のそれぞれに対し、試料濃度を１００μｇ／ｍｌとして、ＮＯ産生抑制試験およびＭＴＴ試験を行った。その結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この中からＮＯ産生抑制率が高く、かつＭＴＴ細胞毒性試験で毒性の認められなかった酢酸エチル抽出物を選び出し、これを次の操作ステップに進めた。
【００１７】
（２）酢酸エチル抽出物のカラムクロマトグラフィーの方法および生成物
酢酸エチル抽出物４６．１ｇをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムに付し、単離を行う。５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを用いて順次溶出し、合計９画分の溶出液を回収し、これらの１画分ごとにＮＯ産生抑制試験を行った。その結果を表２に示す（Ｆｒ．は画分の意）。
【００１８】
【表２】
【００１９】
この中からＮＯ産生抑制率が高く、かつ収率も比較的よい画分４および８を選び、次の操作ステップに進めたが、画分５は収率が最も高く、ＮＯ産生抑制率も特に低くはなかったことから、これも次の操作ステップに進めた。
【００２０】
（３）画分４、５および８の単離精製方法ならびに生成物
そこでＣＨＰ−２０カラムを用いてＦｒ．４、Ｆｒ．６およびＦｒ．８に対し、それぞれ単離を行い、３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを用いて順次溶出を行った。
前記Ｆｒ．４からは、単離・純化により６つの画分Ｆｒ．４−Ａ（８６７．２ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｂ（５８．１ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｃ（５７．７ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｄ（８１．５ｍｇ）、Ｆｒ．４−Ｅ（０．５２ｇ）およびＦｒ．４−Ｆ（１６．６ｍｇ）を得た。このうち逆相ＴＬＣ（０．１％ＴＦＡ：メタノール＝６０：４０）において単スポットを示したＦｒ．４−Ｄに対し、逆相の高速液体クロマトグラフＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ １５０×１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．）において、移動相０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍにて精製を行い、化合物（１）〔５．３ｍｇ〕を得た。
前記Ｆｒ．５からは、単離・純化により５つの画分Ｆｒ．５−Ａ（２．０２ｇ）、Ｆｒ．５−Ｂ（０．１６ｇ）、Ｆｒ．５−Ｃ（３３．２ｍｇ）、Ｆｒ．５−Ｄ（０．０７ｇ）およびＦｒ．５−Ｅ（５６．４ｍｇ）を得た。Ｆｒ．５−Ａからは結晶が析出したため、メタノールで再結晶し、化合物（２）〔０．２５ｇ〕を得た。
前記Ｆｒ．８からは、単離・純化により９つの画分Ｆｒ．８−１（１０．７ｍｇ）、Ｆｒ．８−２（１７．０ｍｇ）、Ｆｒ．８−３（３５６．５ｍｇ）、Ｆｒ．８−４（３５２ｍｇ）、Ｆｒ．８−５（３４．５ｍｇ）、Ｆｒ．８−６（１３．１ｍｇ）、Ｆｒ．８−７（１９．４ｍｇ）、Ｆｒ．８−８（３５４ｍｇ）およびＦｒ．８−９（９８．１ｍｇ）を得た。Ｆｒ．８−４に対し、ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ Ｇｕａｒｄ ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＬ）において、移動相０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）、紫外線測定波長２５４ｎｍにて精製し、化合物（３）〔３．３ｍｇ〕を得た。
【００２１】
実施例２ 主な化合物の理化学的性状
単離・純化により得られた３つの化合物の物理化学的分析を行った。主なデータを表３、４および５に示す。
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
化合物１〜３の構造は下記のとおりである。
【化２】
【００２６】
実施例３ 猫眼草抽出物のＮＯ産生抑制活性
使用材料
ＲＡＷ２６４．７細胞、（マクロファージ、アベルソン白血病ウィルスから転化）、米国ＡＴＣＣ（米国標準菌株保存機構）より取得。１０％ＦＢＳを含むハムＦ１２培地を用い、５％ＣＯ2、３７℃にて培養。
ＩＦＮ−γ：Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社；ＬＰＳ：Ｓｉｇｍａ社；スルファニルアミド：和光純薬；Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩（Ｎ−１−Ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｄｉａｍｉｎｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）：和光純薬；グリース試薬：（１）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩を注射用水５ｍｌに溶解する；（２）注射用水５ｍｌ、スルファニルアミド５０ｍｇにリン酸２５０μｌを加える。
【００２７】
計測器
マイクロプレートリーダー（３５５０型マイクロプレートリーダー、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
【００２８】
具体的な方法および結果
ＲＡＷ２６４．７細胞５０ｍｌをファルコンチューブに入れて遠心分離し（１０００ｒｐｍ、３分、４℃）、細胞を沈殿させ、上清をアスピレーターを用いて除き、新鮮培地を１０ｍｌ加えて懸濁させる。（濃度が１．５×１０5個／ｍｌになるよう調整）９６穴プレートの各穴に２００μｌずつ注入し、ＣＯ2インキュベーター内で１〜２時間放置する。ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ Ｓｉｇｍａ ０５５：Ｂ５）を２μｌ加え、マウスＩＦＮ−γ（３３ｎｇ／ｍｌ Ｇｅｎｚｙｍｅ）２μｌ、検体化合物０．４μｌを加える。ＣＯ2インキュベーターに入れ、１６時間培養する。終濃度はＩＦＮ−γ０．３３ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌとする。検体化合物をＤＭＳＯに溶解し、含量が培地に対して０．２％となるようにする。顕微鏡で観察し、ＭＴＴ試験を行う。グリース法によりＮＯ産生の評価を行う。上清１００μｌを採取して０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩溶液５０μｌ、スルファニルアミド５０μｌを加え、室内で遮光して１０分間放置する。分光光度計にて５７０ｎｍ（対照６５５ｎｍ）のＯ．Ｄ．値を測定する。
【００２９】
活性の評価
ＮＯ2-の量を算出し、下記の公式に代入して抑制効果を求める。
抑制効果（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下で、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ2-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γおよびＬＰＳがいずれも存在しない状態で、誘導されて産生したＮＯ2-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γおよびＬＰＳに誘導されて産生したＮＯ2-の量
【００３０】
ＮＯ産生抑制効果のＩＣ50値は表６のとおりである。
【００３１】
【表６】
【００３２】
化合物１、２および３はいずれも強いＮＯ産生抑制活性を有することを示している。
【００３３】
実施例４ 猫眼草抽出物のｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２およびＩＬ−１２のｍＲＮＡに対する発現抑制試験
ＲＡＷ２６４．７細胞（１．２×１０6細胞／ｍｌ）を化合物ＩＦＮ−γ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに６時間培養する。ＲＮＡ単離用試薬キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出する。２６０ｎｍにおける吸光値を測定し、ＲＮＡの量を決定し、ＲＮＡ２５０ｎｇとオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーとを用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。前記反応は、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2５ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ酵素（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ｇｏｌｄ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）０．６ユニットならびにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー０．４μＭｍｏｌにより３０μｌの反応溶液中で行う。ｉＮＯＳに対して使用するプライマーは５’−ＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＣＧＡＣＣＣ−３’［Ｓ］、５’−ＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣ−３’［ＡＳ］とし、β−アクチンのプライマーは５’−ＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’［Ｓ］、５’−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ−３’［ＡＳ］とし、ＴＮＦ−ａのプライマーは５’−ＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴ−３’［Ｓ］、５’−ＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＡ−３’［ＡＳ］とする。ＣＯＸ−２のプライマーは５’−ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＴ−３’［Ａ］、５’−ＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＧ−３’［ＡＳ］とする。ＩＬ−１２のプライマーは５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧ−３’［Ｓ］、５’−ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧ−３’［ＡＳ］とする。ＰＣＲ反応は下記の方式により行った。９４℃１分間（変性）、６０℃１分間（アニール）および７２℃１．５分間を１サイクルとして２５サイクル行う。ＰＣＲ生成物は２％アガロース中で電気泳動した後、エチジウムブロミドで染色し測定する。
【００３４】
猫眼草抽出物はｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現に対し濃度依存的な抑制作用を有する。また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＣＯＸ−２のｍＲＮＡに対する発現抑制から、猫眼草抽出物は転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制できると推定される（下図）。
【００３５】
上図は猫眼草抽出物のｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２およびＩＬ−１２のｍＲＮＡに対する発現抑制の結果である。
【００３６】
この結果は、猫眼草抽出物がｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現に対し濃度依存的な抑制作用を有することを示している。また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＣＯＸ−２のｍＲＮＡの発現に対しても抑制作用を有し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化抑制が推測される。上記の数種の炎症因子は急性・慢性炎症、アレルギー性疾患などの疾患機序と密接に関わっていることから、猫眼草抽出物から単離されたこれらの炎症因子抑制剤は急性・慢性炎症およびアレルギー性疾患などの疾患の治療薬の調製に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの名称を有し、下記の構造式を有することを特徴とする猫眼草抽出物。
【化１】
【請求項２】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする請求項１に記載の猫眼草抽出物。
【請求項３】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする猫眼草抽出物１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド。
【請求項４】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする猫眼草抽出物クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【請求項５】
ＮＯ合成酵素と関わりのある炎症の治療薬の調製に使用できることを特徴とするクエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニン。
【請求項６】
薬用植物である猫眼草から活性物質を抽出する方法であって、
１）アセトンにより猫眼草に対し抽出を行った上、濃縮するステップと、
２）前記ステップ１）で得た抽出物を水中に浮遊させ、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを溶出剤として、順次それぞれ抽出を行い、抽出物を得るステップと、
３）ステップ２）の抽出物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および毒性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高くかつ毒性作用のない抽出物に対し、さらにカラムクロマトグラフィーによる単離を行い、溶出液を得るステップと、
４）ステップ３）で単離して得た溶出液に対し、ＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性の高かった溶出液をさらに単離精製し、活性物質を得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ステップ１）において、好ましくはアセトンの抽出濃度を７０％とすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ３）において、好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムを用いて単離を行い、メタノールおよびアセトンで溶出することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ３）において、５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを順次用いて溶出することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ４）において、好ましくはＣＨＰ−２０カラムおよび／またはＨＰＬＣを用いて精製することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ４）の精製方法において、ＣＨＰ−２０カラムによる単離ではメタノールで溶出を行い、ＨＰＬＣの移動相にはＴＦＡ−メタノール−アセトニトリルを用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ４）において、３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを順次用いて溶出し、移動相を０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）としてＨＰＬＣにより精製することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＯ産生抑制活性試験においてはマウスマクロファージ系ＲＡＷ２６４．７により分析を行い、試料濃度は１００μｇ／ｍｌとすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記毒性作用がＭＭＴ細胞毒性試験により分析されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性物質がクエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１】
クエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの名称を有し、下記の構造式を有することを特徴とする猫眼草抽出物。
【化１】
【請求項２】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする請求項１に記載の猫眼草抽出物。
【請求項３】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする猫眼草抽出物１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド。
【請求項４】
ＮＯ産生を抑制する活性を有することを特徴とする猫眼草抽出物クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【請求項５】
ＮＯ合成酵素と関わりのある炎症の治療薬の調製に使用できることを特徴とするクエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニン。
【請求項６】
薬用植物である猫眼草から活性物質を抽出する方法であって、
１）アセトンにより猫眼草に対し抽出を行った上、濃縮するステップと、
２）前記ステップ１）で得た抽出物を水中に浮遊させ、クロロホルム、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールを溶出剤として、順次それぞれ抽出を行い、抽出物を得るステップと、
３）ステップ２）の抽出物に対し、ＮＯ産生抑制活性試験および毒性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性が高くかつ毒性作用のない抽出物に対し、さらにカラムクロマトグラフィーによる単離を行い、溶出液を得るステップと、
４）ステップ３）で単離して得た溶出液に対し、ＮＯ産生抑制活性試験を行った上、ＮＯ産生抑制活性の高かった溶出液をさらに単離精製し、活性物質を得るステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ステップ１）において、好ましくはアセトンの抽出濃度を７０％とすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ３）において、好ましくはＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムを用いて単離を行い、メタノールおよびアセトンで溶出することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ３）において、５０％メタノール、７０％メタノール、メタノールおよびアセトンを順次用いて溶出することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ４）において、好ましくはＣＨＰ−２０カラムおよび／またはＨＰＬＣを用いて精製することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ４）の精製方法において、ＣＨＰ−２０カラムによる単離ではメタノールで溶出を行い、ＨＰＬＣの移動相にはＴＦＡ−メタノール−アセトニトリルを用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ４）において、３０％メタノール、５０％メタノール、７０％メタノールおよびメタノールを順次用いて溶出し、移動相を０．１％ＴＦＡ−メタノール−アセトニトリル（６０：３０：５）としてＨＰＬＣにより精製することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＯ産生抑制活性試験においてはマウスマクロファージ系ＲＡＷ２６４．７により分析を行い、試料濃度は１００μｇ／ｍｌとすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記毒性作用がＭＭＴ細胞毒性試験により分析されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性物質がクエルセチン−３−Ｏ−（２”，３”−ジガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クエルセチン−３−Ｏ−（２”−ガロイル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコシド、ヒペリン、クエルセチン、３，４−レゾルシン酸、ルテオリンおよびアピゲニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２６２６１（Ｐ２００７−５２６２６１Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０１０９５（Ｐ２００７−５０１０９５）
【出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／０００１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６６２
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０６３００２０２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００４／０００１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６６２
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０６３００２０２）
【Ｆターム（参考）】
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