生物学的アッセイを実施する為に試料をプールする方法
本発明はカテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法に関し、ここで該分析は分析物の定量的測定を含み、該試料をプールする方法は、ｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プール内の個々の試料の量は、該試料中の該分析物がＸ０：Ｘ１：Ｘ２：Ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するものであり且つ、ｘは、カテゴリー変数のクラスの数を表す２以上の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的試料についてのカテゴリカルアウトカムによる測定の分野に関し、より特には、カテゴリカルアウトカムによるバイオアッセイの試料調製の為の方法に関する。本発明は、試料をプールする方法、対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の該方法の使用方法を提供する。本発明はさらに、複数の試料についての分析を実施する方法、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置、プールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置、試料をプールする方法を実行するコンピュータプログラム製品、及び複数の試料についての分析を実施する為の方法を実行するコンピュータプログラム製品を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
バイオアッセイは、生物学的分析物の特性、濃度又は存在が試料中において測定される手順である。バイオアッセイは、科学の全分野における研究、最も顕著にはライフサイエンス及び特には分子生物学における研究の本質的部分である。
【０００３】
分子生物学における特定の種類の分析は、遺伝子型同定及びシークエンシングに関する。遺伝子型同定及びシークエンシングは、個体の遺伝子型を、生物学的アッセイにより決定するプロセスをいう。現在の方法は、ＰＣＲ、ＤＮＡ及びＲＮＡシークエンシング、並びに種々のキャリア、例えばガラスプレート又はビーズなど、の上に乗せられたＤＮＡ及びＲＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを含む。該技術は、父であること／母であることについての試験にとって、疾患関連遺伝子の調査の為の臨床研究において、及び、任意の種の特性の遺伝子制御を調査することを目的とした他の研究、例えばＱＴＬ（量的形質遺伝子座）のための全ゲノムスキャンなど、において本質的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の技術の限界の故に、ほとんど全ての遺伝子型同定は部分的である。すなわち、個体の遺伝子型の小さい断片だけが決定される。多くの例において、これは問題でない。例えば、父であること／母であることについて試験するとき、１０〜２０の遺伝子の領域だけが調査されて、関係又は関係の欠如を決定する。これはヒトゲノムのごく小さな断片である。
【０００５】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノム中で最も豊富な種類の多型である。ハイスループットＳＮＰ遺伝子型同定の為の技術及び密集したＳＮＰマーカーマップの並行の開発により、ＳＮＰは、多くの遺伝子研究にとって、よりぬきのマーカーとなった。たくさんの数の試料が、マッピング及び関連の研究において又はゲノムの選抜実験において必要とされる。
【０００６】
ハイスループットの遺伝子型同定能力を備える為に、整列化（arraying）技術が、開発された。そのような技術は、商業上の供給業者、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（マイクロアレイに基づくＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マッピングアレイ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標））、Ｂｉｏｔｒｏｖｅ（Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ（商標））、及びＳｅｑｕｅｎｏｍ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標））など、から利用可能である。多くの種（ヒト、家畜、植物、バクテリア及びウィルス）において、多数のＳＮＰが利用可能であり、又は近い将来において利用可能となるであろう。新たな革新は、全ゲノムの遺伝子型同定又は関連研究及び、植物及び動物の育種の為の、関連する全ゲノム選抜プログラムを可能とした。今のところそのようなプログラムのコストはまだかなりのものであり、もし試料が個別に遺伝子型同定されるならば、最大で数百万ドルの予算を要求する。それ故に、任意の種におけるＳＮＰの同定を目的とした研究は、現在、限られた数の個体だけの分析を含む。それ故に、本発明は、遺伝子型同定のコストの非常に実質的な減少を許すので、非常に意義あるものである。
【０００７】
ゲノムの変異性における十分な洞察を得るために、ゲノムの（関連のある部分の）全配列を知ることが必要である。しかしながら、全配列を決定するコストは、前の段落において記載された遺伝子型同定のコストよりもさらに高い。該コストにもかかわらず、シークエンシングは、遺伝子型同定に取って代わり、全ゲノムまたはその特定の領域についての個体の遺伝子型同定を与えるであろうことが期待される。本発明もまた、シークエンシングのコストを減じる方法を提供する。
【０００８】
試料プーリングは、通常は、分類形質についての研究において、分析コストを減ずるための手段として用いられる。いくつかの試料の混合物からなる該プールにおける特徴の存在は、そのプールにおける該試料の少なくとも１つにおけるその特徴の存在を示す。ＤＮＡプールは例えば、下記のために用いられる。
集団における対立遺伝子頻度を見積もるため。個体の良い試料を集団から採ることにより、対立遺伝子１の未加工の対立遺伝子頻度（raw allele frequency）が、該プールにおける対立遺伝子１についての結果と対立遺伝子１についての結果及び対立遺伝子２についての結果の合計との間の比として計算される。
症例及び対照が別のプールに分けられるところの症例−対照関連研究のため、及び
限定された数の個体及び限定された数のＳＮＰについてのハプロタイプの再構築のため。該プールにおいて測定された対立遺伝子頻度に基づき、ハプロタイプは、種々のアルゴリズム、例えば最大尤度など、により見積もられうる。語「ハプロタイプ頻度」は、語「マーカーの同時分布（joint distribution of markers）」と同じことを意味する。
【０００９】
試料プーリングの重要な不利点は、該測定された特徴が、全体としての該プールにおいて同定されるだけであり、該プールにおける個々の試料のいずれにおいて同定されないことである。１つの例外は、２つの個体からなる２つのプールのそれぞれが作られた場合（父＋子及び母＋子）に三つ組（父、母及び子）を遺伝子型同定する為のＤＮＡプールである。それぞれのプールにおいて観察された対立遺伝子頻度は、すべての３つの個体についての遺伝子型を示す。この種の試料プーリングは、３３％のコスト減少を与えるが、そのような三つ組により可能なだけである。全ての他の例において、プールされた試料は、個々の試料についての結果を提供する為に、個々に再度分析されなければならない。
【００１０】
すなわち、三つ組以外の試料タイプについての試料プールを提供する一方で、なおもそのプール内の個々の試料についての試験結果を与えることが有益だろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明者らは今、プール中のそれぞれの個体試料の分布が、それぞれの他の試料の分布の固定された比である場合、すなわち試料の量が等モルでないが特定の比で与えられる場合、無作為の個体がプールされうること及び個体の遺伝子型がそのようなプールから取り出されうることを発見した。個々の試料についての結果は、試験がカテゴリー変数の定量的測定に関与すること、すなわち試験が定量的に測定される分類形質又は離散的形質（a categorical or discrete trait）に関与することを条件として、該プールされた試験結果から推測されうる。
【００１２】
実際に、本発明者らは、二倍体動物における或る座位での或る対立遺伝子の存在の研究の為に、１つの座位で２つの可能な対立遺伝子（Ａ又はＢ）を有する第１の二倍体動物のＤＮＡ試料と同じ座位で２つの可能な対立遺伝子（Ａ又はＢ）を有する第２の二倍体動物のＤＮＡ試料との１：３の比での混合が、その混合物における対立遺伝子のいずれかについて（２）＋（２＋２＋２）＝８の可能性の存在を結果すること、ここで一つの対立遺伝子（例えばＡ）からの期待される定量的装置シグナルが最大試料シグナル強度の１２・５％である、を発見した。これは、最大試料シグナル強度の３７．５％の測定されたシグナル強度で、該試料は、３ｘ対立遺伝子Ａを含むことを意味し、これは該シグナルが、該第１の二倍体動物から得られることはできず、そして該第２の二倍体動物からだけ得られることができることを意味し、該第１の二倍体動物は遺伝子型ＢＢを有し及び該第２の二倍体動物は遺伝子型ＡＢを有することを示す。同様に、測定されたシグナル強度が最大試料シグナル強度の５０％である場合、全ての試料は、遺伝子型ＡＢを有する。測定されたシグナル強度が、最大試料シグナル強度の０％である場合、そのときは全ての試料が遺伝子型ＢＢを有する。該プール中の該２つ個体は、全部で３*３の可能な遺伝子型を有する。該測定の精度が少なくとも６．２５％であるとすると、それぞれの測定は、１００％の八分の一（１／８）の値又はその倍数に割り当てられうる。一般に、それぞれの可能な測定結果は、
の値に割り当てられることができ、ここでｙ＝２（１つの位置での対立遺伝子Ａについての２つの可能な結果、対立遺伝子は存在する又は不在である）、ｐは倍数性レベルであり、ｎは試料の数であり、且つ１００％は最大試料シグナル強度である。全部で、（倍数性レベル＋１）ｎの可能な遺伝子型があるであろう。
【００１３】
今、３つの動物の試料（ｘ、ｙ及びｚ）を１：３：９の比で（それぞれ、すなわち、３のプーリング因子で）プールしたとき、理論上は、その混合物中の対立遺伝子のいずれかについて合計２６の可能性があり、ここで一つの対立遺伝子（例えばＡ）からの期待される定量的シグナルは、最大の試料シグナル強度の３．８５％である。これは、最大試料シグナル強度の１２％の測定されたシグナル強度で、該試料は、３ｘ対立遺伝子Ａを含み、動物ｘが遺伝子型ＢＢを有し、動物ｙが遺伝子型ＡＢを有し、及び動物ｚが遺伝子型ＢＢを有することを示す。同様に、該測定されたシグナル強度が最大試料シグナル強度の９６％であるとき、試料ｘは遺伝子型ＡＢを有し、一方で試料ｙ及びｚは遺伝子型ＡＡを有する。該測定の精度が少なくとも１．９％であるとすると、それぞれの測定は、１００％の２６分の１（１／２６）の値、又はその倍数に割り当てられうる。（そのようなプールされた実験についての可能なアウトカムの概観について、以下の実施例を参照されたい）。
【００１４】
本発明者らは、この原理が、分析の結果が試料中の分析物の性質に関して分類的であるところの、該試料中の分析物の定量的測定を伴う多くの該分析について用いられうることを示した。
【００１５】
第一の局面において、本発明は今、カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法を提供し、ここで該分析は、分析物の定量的測定を含み、該試料をプールする方法は、ｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プール中の個々の試料の量は、該試料中の分析物がｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘは、カテゴリー変数（又はプーリング因子）のクラスの数を表す２以上の整数、例えば３、４、５、６、７、又は８など、好ましくは２又は３、であり、且つｎは試料の数である。アノテーションｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１）は、ｘ０：ｘ１：ｘ２：・・・：ｘ（ｎ−１）又はｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘi；ｘ（ｎ−１）をいうとして理解されるべきであり、ここでｎは試料の数であり且つiは、２とｎの間の値を有する増加する整数である。
【００１６】
倍数体個体のプーリングについて、ｘは（倍数性レベル＋１）に等しく、すなわち１つのシングル位置で２つの可能な対立遺伝子を有する一倍体についてｘ＝２であり、二倍体についてｘ＝３であり、そして四倍体についてｘ＝５であり、ｘはまた、可能な遺伝子型の数にも等しい。
【００１７】
３つの可能な対立遺伝子があると仮定すると、そのときは、一倍体は３つの可能な遺伝子型を有し（ｘ＝３）、二倍体は６つの可能な遺伝子型を有し（ｘ＝６）、そして三倍体は１０の可能な遺伝子型を有するだろう（ｘ＝１０）。１つの二倍体個体において、第一の対立遺伝子は、第二及び第三の対立遺伝子と同じく０、１又は２回生じうる。これは、２つの対立遺伝子によるのと同じ比（ｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１））（ｘがやはり倍数性レベル＋１である）でプールすることを可能とする。３つの対立遺伝子についてのシグナル強度は、該プールされた試料中の対立遺伝子の数を発見する為に、最近の結果点
（ここでｙ＝２であり（対立遺伝子１、２又は３が存在する又は不在である）、ｐ＝倍数性レベルであり、且つｎ＝試料の数である）に丸められる。
【００１８】
すなわち、該プール中の２つの個体の試料の間の比（例として）は、その中の分析物が、１：ｘのモル比で存在するような比であり、ここでｘは分類形質についてのクラスの最大数である。
【００１９】
該プール中の個体の試料の量が、公比（common ratio）３を有する幾何数列として与えられるところの方法が、二倍体個体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するために特に適しており、ここでそれぞれの個体は３つの可能な遺伝子型を有する。該遺伝子型は、３つの可能な変異（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ）を有しうる分類形質である。
【００２０】
該プール中の該個体試料の量が公比２を有する幾何数列として与えられるところの方法は、一倍体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するために特に適している。その例について、以下の実験の部で言及される。
【００２１】
他の局面において、本発明は、カテゴリー変数（ｘ）のクラスの数がｐ＋１に等しく、ｐが個体の倍数性レベルを表すところの一倍体又は倍数体個体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するための、上記で記載された本発明の方法の使用方法に関する。そのような使用方法は例えば、一倍体又は倍数体個体中の対立遺伝子を遺伝子型同定することを許す。
【００２２】
さらに他の局面において、本発明は、複数の試料についての分析を実施する方法であって、該試料を、上記で記載された本発明の方法に従いプールして、プールされた試料を用意すること、及び該プールされた試料について該分析を実施することを含む上記方法に関する。得られた定量的結果は次に、最も近い結果点（最大試料シグナル強度がそれぞれの可能な結果について割られるところの理論上の間隔の数により決定される、以下を参照されたい）に四捨五入され、そして該シグナル強度は、該プールされた試料中のカテゴリー変数のクラスの合計数に割り当てられる。これから、該カテゴリー変数は、該プール中のそれぞれの個体試料について、該プール中の種々の個体試料の比を考慮して、決定される。
【００２３】
他の局面において、本発明は、複数の試料について分析を実施する方法であって、本明細書上記で定められたとおり試料をプールする方法により得られた、プールされた試料の１セットについて分析を実施することを含む、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され且つ該試料中の分析物の定量的測定（a quantitative measurement）に関与する、上記方法を提供する。
【００２４】
この方法の好ましい実施態様において、分析の実施の方法はさらに、該測定から、該試料のプール中の個体試料の寄与を演繹するステップを含む。
【００２５】
他の局面において、本発明は、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置であって、プールされた試料を用意する為の試料アスピレーターを備えており及び本明細書上記で定義された試料をプールする方法を実施する為のプロセッサをさらに備えている上記装置を提供する。
【００２６】
他の局面において、本発明は、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置を提供し、ここで該装置は、カテゴリー変数について該試料を分析する為に及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されている。
【００２７】
この分析装置の好ましい実施態様において、該装置はさらに、プーリング装置を備えており、最も好ましくは上記で開示されたプーリング装置を備えている。
【００２８】
他の局面において、本発明は、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、本明細書上記において定義されたとおりの試料をプールする方法を実行する。
【００２９】
他の局面において、本発明は、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数試料に対する分析を実施する為の方法を実行し、該方法は、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され及び該試料中の分析物の定量的測定に関与する。
【００３０】
このコンピュータプログラム製品の好ましい実施態様において、該方法はさらに、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法に従うプーリングのステップを含む。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法を用いることにより、分析コストが非常に、すなわち典型的には５０％だけ、そしてさらには６６％だけ又はそれより多く、減少されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】プールされたデータに基づいたときの対立遺伝子頻度（Ｙ軸）と個別の測定に基づいたときの対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の相関をグラフ表示で示す図である。
【図２】個体について測定されたときの対立遺伝子頻度（Ｙ軸）とプールにおいて予測された対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の関係をグラフ表示で示す図である。
【図３】プールにおける補正された対立遺伝子頻度（Ｙ軸）と個別のタイピング後に固体について測定された対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の関係をグラフ表示で示す図である。
【図４】実験１におけるプール１についての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の差をグラフ表示で示す図である。
【図５】実験２における全てのプールについての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の相関をグラフ表示で示す図である。
【図６】実験２における全てのプールについての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の差をグラフ表示で示す図である。
【図７】カテゴリー変数が、いくつかの可能なカテゴリーの１つである値をとることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
好ましい実施態様の説明
本明細書において用いられるときに、語「カテゴリー変数」は、離散変数、例えば特徴又は形質など、例えば分析物又はそれにおける特徴の存在又は不在、又は分析物におけるホモ接合的若しくはヘテロ接合的な形で存在する若しくは不在である対立遺伝子形質、をいう。離散は、分類的（categorical）についての同義語であり、そして、非線形又は不連続的をいう。「変数」は一般に、試料の特性を測定する（分類上の）形質をいう。カテゴリー変数は、（２つのクラスからなる）バイナリーでありうる。「クラス」は、大きさ（測定値、a measurement）が割り当てられうるグループ又はカテゴリーをいう。すなわち、純粋なカテゴリー変数は、カテゴリーの割り当てを許すであろうものであり、及び、カテゴリー変数は、いくつかの可能なカテゴリー（クラス）の一つである値をとる。特に、該カテゴリー変数は、遺伝マーカー、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、又は任意の他の遺伝マーカーなど、対立遺伝子、免疫応答、疾患、抵抗能力、毛の色、性、疾患感染の状態、遺伝子型又は試料又は生物学的実体の任意の他の形質又は特性の存在に関しうる。それらは、例えば分析装置により受信され、読み取られ及び／又は記録されうる生成された分析物シグナルとして、数値的に測定されうるが、カテゴリー変数それ自体は数値的な意味を有さず及び該カテゴリーは固有の順序付けを有さない。例えば、性は、２つのカテゴリー（しばしば０及び１としてコードされる男性及び女性）を有するカテゴリー変数であり、そして、好ましくは順序付けされないカテゴリーを表す。遺伝子型もまた、好ましくは順序付けされない多くのカテゴリー（ときどき２、１及び０としてコードされるＡＡ、Ａａ及びａａ）を有するカテゴリー変数である。
【００３４】
本発明の局面における試料は、カテゴリー変数が測定されるべきところの任意の試料でありうる。該試料は、生物学的試料、例えば動物（ヒトを含む）又は植物の組織試料又は体液試料など、環境試料、例えば土、空気又は水の試料などでありうる。該試料は、（部分的に）精製されてもよく、又は処理されていない（未加工の）試料であってもよい。該試料は、好ましくは核酸試料、例えばＤＮＡ試料である。
【００３５】
その存在又は形が定量的試験において測定される該分析物は、任意の化学的実体又は生物学的実体でありうる。好ましい実施態様において、該分析物は生体分子であり、そして、該カテゴリー変数は該生体分子の変異体（a variant）である。好ましくは、該生体分子は核酸、特にはポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ、ＤＮＡなど、であり、そして、該変異体は例えば、該ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド多型、例えば対立遺伝子変異体、もっとも好ましくはＳＮＰ、又は特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティー（base identity）でありうる。
【００３６】
本明細書において定義されたとおりの分析物は、このように、或るカテゴリー変数を示すＤＮＡ分子でありうる（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧのカテゴリー値を有する、その核酸分子中の特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティー）。特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーは、例えば該ヌクレオチドの蛍光アナログを組み込んでいるｃＤＮＡコピーに由来する蛍光に基づく、定量的試験、例えばＤＮＡシークエンシングの技術分野において既知のものなど、を用いることにより測定されうる。該ＤＮＡの特定の位置において該アナログにより放射されそして分析装置により測定された蛍光の定量的水準が次に、そのヌクレオチド位置についてのカテゴリー変数に、例えばその位置についてのアデニンとして、割り当てられる。
【００３７】
特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーを決定することにおいて、本発明は、特定の核酸のヌクレオチド配列が決定されるべき個体試料のプーリングに適する。本発明の方法のシークエンシングアッセイ（分析）についての適合性は、シークエンシングアッセイが、例えばシークエンシングゲル中の或る位置での任意の特定の塩基についてのシグナルの存在又は不在が、該核酸内の特定のヌクレオチド位置におけるその塩基アイデンティティーの存在又は不在に対応するところの、４つの可能な塩基のいずれか一つからのシグナルの決定を含むことに理解したときに、理解されうる。本明細書において記載されたとおりの比でシークエンスゲルを走らせる前の２つの試料のプーリングが、任意の特定のシグナルの源及びすなわちそれぞれの個体の核酸についての配列の決定を許すであろう。
【００３８】
該「分析物」は、ポリペプチド、例えばタンパク質、ペプチド又はアミノ酸など、でありうる。該分析物は、核酸、核酸プローブ、抗体、抗原、レセプター、ハプテン、およびレセプター又はその断片についてのリガンド、（蛍光）ラベル、色素原、放射性同位体など、であってもよい。事実、該分析物は、定量的に測定されることができ、そして該カテゴリー変数のクラスを決定するために用いられることができる、任意の化学的又は物理的物質により形成されることができる。
【００３９】
本明細書において用いられるときに、語「ヌクレオチド」は、糖、典型的にはリボース（ＲＮＡ）又はデオキシリボース（ＤＮＡ）のＣ−１炭素に結合されたプリン（アデニン又はグアニン）又はピリミジン（チアミン、シトシン又はウラシル）塩基を含み、そしてさらに該糖のＣ−５炭素に結合した１以上のホスフェート基を含む化合物をいう。該語は、個々のヌクレオチドの糖単位が、ホスホジエステル架橋を介して連結されて、吊り下がっているプリン又はピリミジン塩基を有する糖リン酸バックボーンを形成するところの核酸又はポリヌクレオチドの個々のビルディングブロックへの言及も含む。
【００４０】
本明細書において用いられるときに、語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形にある、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマー、すなわちポリヌクレオチドへの言及を含み、そして他の限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する既知のアナログ（例えばペプチド核酸）を包含する。ポリヌクレオチドは、天然の又は異種性の構造的又は調節的遺伝子の完全長又はサブシークエンスでありうる。他に示されない限り、該語は、該特定された配列ならびにその相補的配列への言及も含む。すなわち、「ポリヌクレオチド」が本明細書において意図されるときに、安定性の為に又は多の理由の為に修正されたバックボーンを有するＤＮＡ又はＲＮＡは「ポリヌクレオチド」である。さらに、本明細書において該語が用いられるときに、ほんの２例だけ挙げると、普通ではない塩基、例えばイノシンなど、又は修正された塩基、例えばトリチル化された塩基など、を含むＤＮＡ又はＲＮＡがポリヌクレオチドである。
【００４１】
語「定量的測定」は、試料中の分析物の量の決定をいう。語「定量的」は、該測定が数値的な値で表されうるという事実をいう。該数値的な値は、寸法、サイズ、程度、量、容量、濃度、高さ、深さ、幅（width）、幅（breadth）、長さ、重さ、体積又は面積に関しうる。該定量的測定は、測定シグナル、例えば色素生成シグナル又は蛍光シグナルなど、又は任意の他の定量的シグナルの強度、ピーク高さ又はピーク面（peak surface）に関与しうる。一般に、分析物の存在又は形を決定するときに、該測定は装置シグナルに関与するであろう。例えば、ＳＮＰの存在を決定するときに、該測定は、ハイブリダイゼーションシグナルに関与するであろうし、そして該測定は典型的には蛍光光度計により測定されたときの蛍光強度を与えるであろう。免疫応答の存在を決定するときに、該測定は抗体力価の測定を含むであろうし、そしてまた該測定は典型的には蛍光強度としても与えられるであろう。該測定は、連続的な測定結果を与えることを要しないが、離散間隔又はカテゴリーに関しうる。該測定は、準定量的でもありうる。該測定が最大試料シグナル強度の２ｎ−１、３ｎ−１又はｘｎ−１の部分的な及び好ましくは比例的な間隔で決定されうる限り（該プールが、公比２、３又はｘをそれぞれ有する幾何数列として与えられるかどうかに依って、ここでｎは該プール中の試料の数である）、該測定は原理上適当である。
【００４２】
語「プールする（プーリング）」は、本明細書において用いられるときに、ユーザーへの利点を最大化する為に、試料を一緒にグループ化すること又は併合することをいう。特に、語「プールする（プーリング）」は、加重値の１つの試料を表すための複数試料のコレクションの調製をいう。複数試料を１つのシングル試料へと併合することは通常、試料を混合することにより実施される。本発明において、混合は、個々の試料の量を注意深く重さを量ることを要し、ここでそれぞれの試料中に存在する分析物の量は決定的である。試料Ａが２ｇ／ｌの分析物の量を有し且つ試料Ｂが１ｇ／ｌの分析物の量を有するとき、これらの試料は、１：３の分析物比を与える為に、１：６の体積比でプールされる必要がある。
【００４３】
本発明の実施態様において定められたとおり、２つの試料が例えば１：３の比でプールされるとき、又は３つの試料が１：３：９の比でプールされるとき、該プール中の変異体の可能な頻度は、それぞれ１２．５％及び３．８５％の間隔のエンドポイントにより設定される。これらの間隔のエンドポイントは、本明細書において「結果点」といわれ、そして、最大試料シグナル強度に達するまでの定量的測定のステップ増加と等価である。
【００４４】
語「幾何数列（geometric sequence）」は、任意の２つの連続した項の間の比が同じであるところの数字の列をいう。言い換えると、毎回、該数列中の次の項が、前の項に同じ数を乗ずることにより得られる。この固定された数字は、該数列についての公比と呼ばれる。本発明の幾何数列において、試料の種類に依存して、第１項は１であり、及び公比は２又は３である。
【００４５】
語「最大試料シグナル強度」は、プール中の全ての試料が陽性（正）のシグナルを与えるとき、すなわち個体の試料の１００％が、試験された分析物について陽性であるときに、そのプールから得られたシグナルをいう。該最大試料シグナル強度は、任意の適当な方法により決定されうる。例えば、５０の個体の試料が、これらの試料のうちに存在する離散イベントの数の点でそれらの組成を決定する為に別々に測定されることができ、そしてその後、これらの試料がプールされた実験において次に測定されうる、ここで該プールされた試料について測定された該シグナル強度が、全ての個別の試料の全てのシグナル強度を合計することにより得られるだろうものと同じ比で見えている。
【００４６】
本発明の方法は、ｎ個の試料の任意の数により実施されうる。しかしながら、実際は、ｎについての最大数は、測定方法の精度により、すなわち２つの連続的な結果点の間の統計的にしっかりとした区別が決定されうる精度により、設定される。該方法の該精度（標準偏差）は、それに従うべきである。
【００４７】
本発明の方法の適用は、遺伝子型同定方法を含むがこれに限定されない。ＤＮＡのプーリングに基づく遺伝子型同定は多くの適用を有する。遺伝子型は、全ての種において、マッピング、関連及び診断のために用いられうる。特定の遺伝子型同定の例は、ａ）ヒトにおける遺伝子型同定、例えば医療的診断などだけでなく、症例−対照研究プーリングが続く、フォローアップの個体のタイピングなど；ｂ）家畜における遺伝子型同定、例えばＱＴＬ研究における、候補遺伝子アプローチにおける及びゲノムの広い選抜適用における、個体のタイピングなど；及びｃ）例えばマッピング研究及び関連研究のための、植物における遺伝子型同定を含む。
【００４８】
プーリングは、ヒト、家畜、植物、バクテリア、ウィルスをシークエンシングするときにも用いられうる。より特には、シークエンシングの為の個体の試料のプーリングは、２以上（２又はそれより多い）個体のシークエンスが比較されるべきときに適切である。
【００４９】
試料をプールする為の本発明の方法は、少なくとも第一の試料からのサブ試料と少なくとも第二の試料からのサブ試料をとることを含み、ここで該第一及び第二のサブ試料は一つの容器に併合されて、プールされた試料の形にある２つのサブ試料の混合物を与え、且つ、該プールされた試料中の該第一及び第二のサブ試料の比は、本明細書において記載されたとおりその中の分析物の濃度に基づき、１：３又は３：１である。同様に、３つの試料がプールされる場合（この言い回しは、３つのサブ試料が混合されるという事実をいう）、第一、第二及び第三のサブ試料（任意の順序における）の間の、プールされた試料において得られるべき比が、本明細書において定められたとおり１：３：９である。該プール中の変異体の可能な頻度は、それぞれ１２．５％及び３．８５％の間隔のエンドポイントにより設定される。これらの間隔のエンドポイントは、本明細書において「結果点」といわれ、そして、最大試料シグナル強度に達するまでの段階増加と等価である。
【００５０】
本明細書において定義されたとおり、プールする方法は、プーリング装置により（を用いて）実施されうる。そのような装置は適切に、例えば定められた（しかし可変の）体積の形で、試料の定められた量を集め及び配る為に構成された試料コレクターを備える。適当な試料コレクターは、研究室において用いられるロボットの試料配達及び処理システムにおいて一般に適用されるようなピペッターである。そのようなロボットのシステムは通常、１以上のマイクロプレートプロセッサステージ、試薬ステーション、フィルタープレートアスピレーター、及び、圧縮空気及びディスポーザブルピペットチップに基づくロボットピペッティングモジュールを適切に備えている卓上装置である。これらの試料ロボットシステムは、本発明の方法を実施する為に非常に適当である。なぜなら、それらは種々の試料からの種々の液体体積を１以上の反応チューブへと一緒にする為に、最終的に設計されているからである。それ故に、種々の試料からの種々の液体体積を一つのプールされた試料へ一緒にする仕事を実施する為にそのようなピペッティングロボティックシステムを採用することは、当業者の技術水準内である。しかしながら、そのようなピペッティングロボティックシステムは、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為の試料プーリング装置のただ１つの適当な実施態様であり、該装置は試料を複数の試料バイアルから集める為及び試料を一つのプーリングバイアルへと配ってプールされた試料を用意する為の試料コレクターを備えており、そしてさらに本明細書において定義されたとおりの試料をプールする方法を実施する為に構成されたプロセッサを備えている。語「プロセッサ」は、本明細書において用いられるときに、メモリー又は他のストレージ装置からの記憶され及び取り戻された指示が、１以上の実行ユニット、例えばピペッティング装置及び、ピペッティングロボティックシステムの試料バイアルとプーリングバイアルとの間で該ピペッティング装置を動かす為のロボティックアームを備えているユニットなど、を用いて実行される任意のコンピューティング装置への言及を含むことが意図される。語「バイアル」は、広く解釈されるべきであり、そして、アレイ上の分析スポットへの言及を含みうる。本発明に従うプロセッサは、それ故に、たとえば、パーソナルコンピュータ、メインフレームコンピュータ、ネットワークコンピュータ、ワークステーション、サーバー、マイクロプロセッサ、ＤＳＰ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びにこれらの一部及び組み合わせ及び他の種類のデータプロセッサを含みうる。該プロセッサは、本明細書上記で定義されたとおりのプーリング装置上で本発明に従い試料をプールする方法を実行するコンピュータプログラムからの指示を受け取る為に構成される。
【００５１】
カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法であって、該分析が分析物の定量的測定を伴い、該試料をプールする方法が、ｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プール中の個々の試料の量は、該試料中の該分析物が、Ｘ０：Ｘ１：Ｘ２：Ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘは、カテゴリー変数のクラスの数を表す２以上の整数である。
【００５２】
プールする方法は全く簡単であり、且つ比較的シンプルな方式で記載されることができる一方で、本明細書において記載されたとおりのプールされた試料の分析の方法はより複雑である。
【００５３】
本明細書において記載されたとおり、カテゴリー変数（例えば遺伝子型）は、いくつかの可能なカテゴリー（ＢＢ、ＡＢ、ＡＡ）の一つである値をとりうる。これれのカテゴリーは、結果間隔（resule interval）のクラスと一致する。該カテゴリーは、パラメーター（例えば蛍光）についての分析物（ＤＮＡ）に対する定量的測定を実施すること、及び分析結果の分類化（categorization）に基づきこれらのパラメーター値にクラスを割り当てることにより決定され、該クラスのそれぞれが該カテゴリー変数についての変異体を表す（図７を参照されたい）。
【００５４】
一般に、可能な分析結果（アウトカム）の合計数は、カテゴリー変数の性質に依存する。例えば、二倍体生物の遺伝子型の場合、倍数性レベルが、可能な分析結果の数を決定する。一般的な点で、該カテゴリー変数の性質は、試料内の分析物の種々の数の変異体又はセットの存在を含みうる（図７におけるリピート）。また、可能な分析結果の合計数は、１つのリピートがとることができる可能な異なるカテゴリー値による。可能な分析結果の数の例が表１において与えられる。
【００５５】
【表１】
【００５６】
例えば、二倍体個体の遺伝子型（１つの試料内に１つの対立遺伝子の２のリピート）は、３（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ）に等しい。なぜなら、１つの対立遺伝子は、２つの異なる変異体（Ａ又はＢ）だけを有するからである。三倍体（１つの対立遺伝子の３のリピート）は、４つの異なる遺伝子型（ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＡＢＢ及びＢＢＢ）を有しうる。
【００５７】
個体についての血液集団は、４つの異なる変異体（Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯ）を有する１つのリピートである。
【００５８】
表１における式は、どのリピートについて変異体が測定されるかが重要でないところの状況について適用できる。例えば、遺伝子型同定することについて、遺伝子型ＡＢと遺伝子型ＢＡとの間に差異はない。しかしながら、もし該リピートのアイデンティティーが重要であるならば、次に可能な分析結果の合計数を計算する為の式はｎｋである。この式は次に、表１の該式
にとってかわる。また、該表中の全ての値は、従って、変化する。１つのリピートについて２のリピート及び２の可能な結果を有する状況について、４の結果があるであろう。１つのリピートについて３のリピート及び３の可能な結果による状況について、９の異なる結果があるであろう。
【００５９】
可能な分析結果の合計数は、本明細書において、プーリング比（例えば１：３：９）として適用され、そして、「プーリング因子」（１：３：９の場合３）と呼ばれるものを直接に提供する。例えば、遺伝子型同定する為に一倍体個体をプーリングするとき、１リピート当たり２つの可能な変異体を有する１つのリピートがある。そのような場合、該プーリング因子は２に等しい（表１における結果の数である）。
【００６０】
４つの個体をプーリングすることは、次に、比２０：２１：２２：２３で行われる必要がある。
【００６１】
二倍体個体をプーリングするとき、プーリング因子は３である。３つの個体をプーリングすることは、比３０：３１：３２で行われる必要がある。
【００６２】
プールにおける結果の合計数は次に、以下の式と等しい
合計のプール結果＝プーリング因子試料数
【００６３】
シグナル強度についての増加は、次に、
増加＝１／（プーリング因子試料数−１）×１００％
又は
１／（ｙ×（（プーリング因子）０＋（プーリング因子）１＋（プーリング因子）２＋・・・＋（プーリング因子）（ｎ−１））×１００％、
と等しく、
ここでｎは試料数であり、及びｙ＝プーリング因子マイナス１である。
【００６４】
もし測定強度が全ての変異体について１つのリピートについて存在するならば（全ての値マイナス１である（なぜなら該失われた１は次に他について１マイナス強度として計算されうるからである））、表１の最上列が続かれる。なぜならこれが、このリピートについての２つの可能なアウトカムに対応する、そのリピートのすべての値について存在する又は不在であるとして見られうるからである。３の可能な対立遺伝子が、２の変わりに想定され且つ２の代わりに３の異なる光強度を測定することができる上の例を参照されたい（赤及び緑）。
【００６５】
もし、一つの測定だけがあるならば、表１が従われる。
【００６６】
本明細書において意図されるとおりのプールされた試料を分析する為の本発明の方法は、該プールされた試料に対する要求された分析物についての測定の実施を含む。測定結果、例えば装置シグナル、を記録すると、該分析は次に、本明細書以下において与えられる実施例において非常に詳細に説明される一連の工程を伴う。
【００６７】
本発明の方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施すること、ここで該試料はカテゴリー変数について分析される、は該試料内の分析物の定量的測定を含む。該分析物は、化学的又は物理的な物質又は実体であり、そのパラメーターが該カテゴリー変数の少なくとも１つの変異体の存在又は不在を示す。例えば、カテゴリー変数として、変異体対立遺伝子Ａ又はＢを有する生物の遺伝子型を決定するとき、該分析物は該生物のＤＮＡ、ＤＮＡプローブ又は遺伝子のラベルであり、そしてその分析物のパラメーターの絶対値が、変異体の存在（又は不在）に直接に関連付けられうる。該分析物についての該定量的測定は一般に、分析物パラメーターについての値としての蛍光強度、放射性同位体強度又は任意の定量的大きさ（任意の定量的測定値、any quantitative measurement）に関与するであろう。或る閾値又はカテゴリー値を越える大きさは一般に、該変異体の存在を示すであろう。試料中の分析物の定量的測定は、すなわち、該試料中において分析されるべきそのカテゴリー変数の変異体の存在又は不在を示す分析物を参照する。
【００６８】
本質的に、本明細書において記載されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料を分析する方法において、該プール中の個体試料の寄与、すなわち、該プール中の個体試料についての結果は、以下の通りに決定される。
【００６９】
第１に、ｎ個の試料のプールについて実施されるべき或る分析「Ａ」についての最大試料シグナル強度が決定され、そして１００％シグナルに設定される。該最大試料シグナル強度は、ｎ個の試料のプール中の試料の１００％が、該カテゴリー変数について陽性であるときに達せられるシグナル強度である。該最大試料シグナル強度は、ｎ個の陽性の参照試料の試験プールを用意すること及び該測定シグナルを決定することにより決定されることができ、ここで該陽性の参照試料は、該カテゴリー変数に関して陽性であり、且つｎは分析「Ａ」が実施される該プール中の試料の数である。分析「Ａ」についての該最大試料シグナル強度は、後の使用の為に、コンピュータメモリー中に記録され又は格納される。次に、関心のある該分析物は、該分析物についての該プールされた試料のシグナル強度が決定されるところの分析「Ａ」を実施することにより、本発明の方法により得られたプールされた試料において測定される。該プールされた試料における該分析物についての得られたシグナル強度が記録され、上記で定められたとおりの最近の結果点へと四捨五入されそして任意的に格納され、そして次に該最大シグナル強度と比較される。適当には、この比較は以下の通りに実施されうる。一般に、それぞれの可能な測定結果は、値
に割り当てられ、ここでｎはプールされた試料の数であり、ｙは、「Ａ」が存在するか又は不在であるかを表す２の整数であり、且つ１００％は最大試料シグナル強度である。アノテーション
は、
をいうとして理解されるべきであり、ここでｎは試料の数であり、及びiは２〜ｎの間の値を有する増加する整数である。例えば、カテゴリー変数のｙ＝２のクラス（マーカー存在及びマーカー不在）、且つ４つの試料のプール、４つの陽性参照試料を用いて１００％に設定された最大試料シグナル強度セットにより、合計で
の結果点があり、ここでそれぞれの可能な測定結果が値
又はその倍数に割り当てられうる。
【００７０】
試料のプール中のそれぞれの試料についての結果は、簡単な結果表から読み取られることができ、これはコンピュータメモリー中にコンピュータ読み取り可能な形で格納されることができ、そして該表は、該最大試料シグナル強度の０％〜１００％の間の
の増加する段階のそれぞれの結果点について、該プール中の個体試料のそれぞれについて対応する値を割り当てる。例えば、そのような結果表は、以下の表２において与えられるとおりの表である。
【００７１】
該分析は、該プールされた試料中の種々のサブ試料のそれぞれに、該カテゴリー変数を割り当てることにより完了される。
【００７２】
本明細書において定義されるとおりのプールされた試料を分析する方法は、分析装置により実施されうる。本発明の分析装置は、上記で記載されたとおりの試料をプールする為の方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えており、ここで該装置は、該試料をカテゴリー変数について分析する為に及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されている。上記で言及されたとおり、該分析装置の独特の特徴は、それが、プールされた試料を、該プール中のそれぞれの個体試料におけるカテゴリー変数について分析する為及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されていることである。本質的には、該分析装置は、該プールされた試料について得られた測定結果を測定し及び分析する為に並びにその結果からプール中のそれぞれの個体試料におけるカテゴリー変数を推測するように構成されている。そのような装置は適当には、該プールされた試料中の分析物シグナルの測定の為のシグナル読み取りユニットを備えている。該分析装置はさらに適当には、該測定結果及び上記で記載されたとおりの結果表を格納する為のメモリーを備えている。該分析装置はさらに適当には、メモリーから及び／又は該読み取りユニットからデータを回収する為に構成され、並びに計算を実施する為及び該プールされた試料についての測定結果が、上記言及された結果表を用いて、該プール中の個体試料についての対応する結果と比較され及び当該結果に割り当てられるところの反復プロセスを実施する為に構成されたプロセッサ；該メモリー又はプロセッサへと試料データを入力する為のインプット／アウトプットインターフェース；及び該プロセッサに接続されたディスプレイを備えている。該プロセッサは、本発明に従う試料を分析する方法を、本明細書上記で定義されたとおりの分析装置で実行するコンピュータプログラムからの指示を受信する為に構成されている。本明細書において用いられるときに、語「プロセッサ」は、メモリー又は他の記憶装置から回収された指示が１以上の実行ユニット、例えばプールされた試料を受け取る為及び試料中又はプールされた試料中において該分析物のシグナルを決定することにより分析物の測定を実施する為のシグナル読み取りユニットなど、を用いて実行される任意のコンピューティング装置への言及を含む。
【００７３】
本発明の分析装置はさらに、本発明のプーリング装置を備えうる。
【００７４】
本発明はさらに、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、上記で記載されたとおりの試料をプールする方法を実行する。本質的には、該コンピュータプログラム製品は、本発明のプーリング装置のメモリー内に格納されてよく、及び該装置のプロセッサにより、該プーリングの方法の種々のプロセスステップに対応する指示のセットを該プロセッサに備えることによって実行されてよい。
【００７５】
本発明はさらに、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数の試料についての分析を実施する為の方法を実行し、該方法は上記で記載されたとおりの試料をプールする方法によって得られたプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され及び該試料における分析物の定量的測定に関与する（を含む）。本質的には、該コンピュータプログラム製品は、本発明の分析装置のメモリー内に格納されてよく、及び、該装置のプロセッサにより、該プロセッサに該分析の方法の種々のプロセスステップに対応する指示のセットを備えることによって実行されてよい。分析を実施する為の該コンピュータプログラム製品において、ソフトウェア指示に埋め込まれた該方法はさらに、上記で記載されたとおりの試料をプールする工程を含みうる。
【００７６】
本発明は今、以下の非限定的な実施例により説明されるであろう。
【００７７】
実施例
【実施例１】
【００７８】
標準化の為に５０の個体の１のプールを用いた、ＳＮＰの存在についての、二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【００７９】
ステップ１） ５０の個体が個別に試験された。
【００８０】
全てのＳＮＰ及び全ての個体について、我々は、赤い蛍光（対立遺伝子の存在）及び緑の蛍光（対立遺伝子の不在）についての強度を、マイクロアレイフォーマットにおける２つの異なる蛍光色素を用いて得た。赤と緑との間の比は、ホモ接合性の動物について常には１（又は０）でなく、又はヘテロ接合性の動物について常には０．５でない。
【００８１】
個体のタイピングについてのデータは、全てのタイプされたＳＮＰについてのシグナル強度からの補正因子を計算するために用いられた。
【００８２】
最も重要な補正因子（Ｋ）（対立遺伝子を表す際に、何らかの不均等な効率について、データを補正する為にしばしば用いられる補正因子）を得る為に、我々は、ヘテロ接合性の遺伝子型からのシグナルを用いた。もしヘテロ接合性遺伝子型が存在しないならば、我々は、研究されたＳＮＰが、調査下の集団において分離されておらず、そしてそれ故に該プール中におけるこのＳＮＰについての結果は取り除かれるべきであると想定した。
【００８３】
５０の個体の試料におけるヘテロ接合体の不在に起因するＳＮＰの除外は、結果として、低いＭＡＦ（minor allele frequency、マイナーな対立遺伝子の頻度）を有するＳＮＰについての情報が失われうることを有しうる。多くの適用（例えばゲノムの広い選抜など）にとって、これは、非常に低いマイナーな対立遺伝子の頻度を有するＳＮＰは精度にあまり寄与せず、そして次に、これらのＳＮＰについてのデータを用いないこと又は該補正因子を適用しないことの決定がなされうるので有害でない。
【００８４】
我々が用いた第一の補正因子（Ｋ）は；
であり、ここでＸｒａｗは赤についての測定された強度であり、及びＹｒａｗは緑についての測定された強度である。この値は、遺伝子型ＡＢを有する個々に遺伝子型同定された試料から決定された。
【００８５】
１つの遺伝子型についての全てのビーズの平均結果を用いる代わりに、我々は全ての別々のビーズの結果を用いることもできる。すなわち、１つの試料から、我々は、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗについて若しくはＸ及びＹについての平均結果を用い、又は我々はその試料から全ての別々のビーズの結果を用いる。
【００８６】
他の補正因子はＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇであった。ＡＡａｖｇは、ＡＡ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、１に近いと期待される。ＢＢａｖｇは、ＢＢ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は０に近いと期待される。ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇは、式
を用いて計算された。
【００８７】
ステップ２） 上記ステップ１から全ての５０の個体を含む１つの試験プールが構築された。この目的のために、ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度が、それぞれの個体試料において、ＮａｎｏＤｒｏｐスペクトロフォトメーター（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いて測定された。全てのＤＮＡ試料は次に、一つの試料へとプールする前に、５０ｎｇ／μｌの標準濃度へと希釈された。このようにして得られた該試験プールにおいて、我々は、補正されていない又は第一のステップにおいて発見された補正因子に基づく対立遺伝子頻度を見積もった。
【００８８】
対立遺伝子Ａについての未補正対立遺伝子頻度は、両方の強度の合計により割り算された赤強度の間の比として、以下の通りに計算される。
我々が適用した、対立遺伝子頻度について第一の補正は
であった。
我々が適用した第二の補正は標準化であった。
補正及び標準化の両方について、我々は該個体試料とは別に、全てのＳＮＰについて、全ての３つの遺伝子型を用いた。
【００８９】
見積もられた対立遺伝子頻度の精度の順序は、標準化された（最も正確）、補正された（間）及び補正されていない（最も正確でない）、であった。
【００９０】
これは、もしステップ１においてヘテロ接合性個体が無いならば、該補正因子Ｋは０．５に設定され、そしてもしホモ接合性個体が無いならば、補正因子ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇがそれぞれ１及び０に設定されたことを意味する。
【００９１】
ステップ３） 我々は、個体のタイピング（分類、typing）について計算された対立遺伝子頻度及び該試験プールにおける結果に基づく対立遺伝子頻度を比較した。これから、我々は、現実の結果がＸ軸上にある四次多項式を見積もった。別々に試験された個体における及びほぼ１８０００のＳＮＰを有するプールにおける遺伝子型同定結果についての図１を参照されたい。遺伝子型同定は、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、該チキンゲノムを通じて均等に分布されたＳＮＰにより行われた（van As et al., 2007）。該アッセイについての詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上に見られうる（http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=12）。
【００９２】
この多項式から、我々は、個体から既知の該頻度が０、０．０５、０．１、０．１５・・・・・０．９、０．９５及び１だろうときに、該試験プール中における予測された対立遺伝子頻度（the predicted allell frequency）を計算した。
【００９３】
Ｙ軸上に現実の頻度を有する第二のグラフにこれらの結果を置くことにより、我々は、補正の第三ステップについての補正因子を得た、図２を参照されたい。
【００９４】
これらの補正因子を適用した後、該試験プールにおける対立遺伝子頻度は、現実の頻度との直線関係を示した、図３を参照されたい。
【００９５】
約１８０００のＳＮＰによるこの実験において、５０の個体の試験プールにおいて測定された（及び記載されたとおりに補正された）対立遺伝子頻度の９６％超が、個体タイピングからの結果と比較して、＋又は−６．２５％の範囲内であった。
【００９６】
本発明の適用の為に、前の３ステップは好ましくは、「キャリブレーション」として、実際の分析の前に、該分析の精度を増す為に、実施される。しかしながら、これらのステップは、それぞれの回で実施される必要はない。該測定の該キャリブレーション（もし実施されるならば）は次にステップ４）が続く。
【００９７】
ステップ４） 比１：３、１：３：９又は１：３１：３２：３（ｎ−１）における２、３又はｎ個の個体のＤＮＡプールの構築し、及び該プールを遺伝子型同定のための測定に付す、ここでシグナル強度は、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（上記参照）を用いてマイクロアレイ上で赤及び緑について決定される。
【００９８】
ステップ５） ステップ１及びステップ３において発見された補正因子により、該対立遺伝子頻度が、該プールにおいて得られたシグナル強度から計算されうる。プール中の２つの個体により、該予測された補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与える。四捨五入が、最近の結果点（the nearest result point）へと行われるべきである。該２つの個体の遺伝子型は、表２において示された結果から得られうる。
【００９９】
プール中の３つの個体により、四捨五入は、結果点の間の間隔が３．８５％（１００／（３３−１））等であるところの最近の結果点へと行われるべきである。
【０１００】
連続的な結果点の間の間隔が短ければ短いほど、該結果点の一つへの特定の結果の適切な割り当てを許す為に、強度の読み取りはより正確である必要がある。より正確な読み取りは、遺伝子型同定技術のさらなる発展により実行可能となるであろう。
【０１０１】
プール中に２つの個体を有する状況について、該プール内の見積もられ且つ補正された対立遺伝子頻度が、個体の現実の頻度から±６．２５％の範囲内にあるところのＳＮＰだけを用いることを決定しうる。（図３中の赤線を参照されたい）。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
プールされた結果と個体の結果（ステップ３における）との間の６．２５％よりも大きな差異を示すＳＮＰは、もし個体の遺伝子型を推測する為に他の情報が利用可能でないならば、取り除かれるべきである。
【０１０４】
個体の遺伝子型を推測する為の追加情報が、個体の系図から又は、該個体が属するファミリー又は集団内に存在するハプロタイプについての情報から得られうる。
【０１０５】
補正因子の再現性に依って、ステップ１、２及び３は、アッセイ条件が同じであると知られているところの新規分析において完全にスキップされうる。
【０１０６】
実施例１の方法に従うとき、分析される必要がある試料の合計数を減少する一方でなお当初の個体試料についての信頼できる結果を得ることができることにより、著しい節約が達成されうる。分析されるべき試料の合計数の典型的な減少が表３に示される。
【０１０７】
【表３】
【実施例２】
【０１０８】
標準化のための２の個体の２５のプールを用いた、二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【０１０９】
ステップ１） ５０の個体が、実施例１のステップ１におけるとおりに別々に試験される。
【０１１０】
ステップ２） 比１：３で、上記ステップ１からの全ての５０の個体を含む、２つの試料の２５プールをそれぞれ構築する。これらのプールにおいて、補正されていない又は第一のステップにおいて発見された補正因子に基づく対立遺伝子頻度を見積もる。
【０１１１】
ステップ３） ２つの個体のタイピングからの対立遺伝子頻度の合計と、２つの個体試料のプールにおける該見積もられた頻度とを比較する。これらの２５の点から、回帰直線を計算する。該回帰計数及び切片が次に、他のプールから見積もられた頻度を補正する為に用いられうる。
【０１１２】
ステップ４） 次に、比１：３、１：３：９又は１：３１：３２：３（ｎ−１）における２、３又はｎ個の個体のＤＮＡプールを構築する。
【０１１３】
ステップ５） ステップ１及びステップ３において発見された補正因子により、該プールにおいて得られたシグナル強度から対立遺伝子頻度を計算する。
【０１１４】
試料数の節約は、二倍体個体のシークエンシングについての表８において言及された節約と同一である。
【実施例３】
【０１１５】
ハプロイド個体試料の遺伝子型同定の例
【０１１６】
２つのハプロイド試料がプールされ、そしてゲノム内の或る位置での対立遺伝子Ａの存在について測定されたとき、該測定（ピーク高さ、ピーク下面（surface under peak）、強度）における期待された比は以下のとおりである。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
もし２つの試料のプールだけが用いられるならば、補正因子は必要とされなくてもよい。より多くの試料がプールされる場合、補正因子はおそらく必要とされる。そのときは、それらは、ヘテロ接合性及びホモ接合性の二倍体個体を模倣する為に、該分析物の等しい量を有する２つの試料のプールから計算されうる。
【０１１９】
３つの試料のプーリングが、１：２：４の比でプールされるとき、該測定における以下の比が期待される。
【０１２０】
【表５】
【実施例４】
【０１２１】
シークエンシングプロトコールにおける本発明の使用
【０１２２】
この発明において記載されたプールする方法は、２以上の個体において配列を決定する必要がある状況に適用されうる。
【０１２３】
シークエンシングの為の個体、テンプレート又はＰＣＲ産物のプーリングは、一般的な慣習ではない。なぜなら、二重のトレースを分析するときの本質的な問題は、２つの塩基がそれぞれの位置で表され及び該トレースだけを説明することによりどのテンプレートからそれぞれの塩基が来たかを教えることが不可能であるからである。
【０１２４】
二重トレースを結果する意図的にプールされたテンプレートに加えて、二重トレースを生じるいくつかの生物学的及び生物工学的状況が知られている。これらは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された転写物のオルタナティブスプライシングされた領域において、直接にシークエンシングされ（クローニングすること無く）ることにおいて及びランダム挿入変異誘発実験において、見られる。
【０１２５】
プールされた配列のハプロタイプ又は二重トレースをさかのぼる為のいくつかの方法が記載されている。Ｆｌｏｔら（２００６）は、個体のハプロタイプを見つけ出す為に提案されたいくつかの分子方法を記載する。例えば、クローン化されたＰＣＲ産物のシークエンシング（例えばＭｕｉｒら、２００１）、ＳＳＣＰ（一本鎖コンホメーション多型）（Ｓｕｎｎｕｃｋｓら、２０００）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｋｎａｐｐ、２００５）、一分子レベルへの極端なＤＮＡ希釈（Ｄｉｎｇ ＆ Ｃａｎｔｏｒ、２００３）、及び、対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの使用（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、２００３）である。加えて、配列の混合物のハプロタイプ再構築の為のコンピュータによるいくつかの方法が提案されている。
【０１２６】
しかしながら、記載された全ての方法は、非常にコストがかかり且つ時間を消費するものであり、並びに、特定の目的（例えば、再シークエンシング、オルタナティブスプライシング、テンプレート、又は、配列長の異なる２つの産物のＰＣＲ増幅された混合物、参照ゲノム配列の利用可能性）に適用できるだけであり、そして、ハプロイド若しくは二倍体の試料の標準的な直接のシークエンシング又は全く未知の配列のデノボシークエンシングに適さない。
【０１２７】
本発明において記載されたプーリングに従う配列テンプレートのプーリングは、同じ配列断片が個体及びプールされた試料の両方において入手されうる状況に適用されうる。これは、例えばショットガンシークエンシング（ランダムに切断された断片）はプーリングにとって適当でないことを意味する。
【０１２８】
上記で言及された全ての適用において、もしプーリングが意図的に適用されるならば、等しい量のテンプレート（試料、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＣＲ産物）がプールされる。
【０１２９】
本明細書において、我々は、等しくない量のテンプレートのプーリングを記載する。この例について、２つのテンプレートからなるプールについての状況だけが記載されるが、本発明は、二倍体生物について比１：３、１：３：９、１：３１：３２：３（ｎ−１）で、及びハプロイド生物について１：２、１：２：４、１：２１：２２：２（ｎ−１）の比で、２、３又はｎの個体のＤＮＡ（又はＰＣＲ後産物）のプールを構築するために用いられうる。
【０１３０】
満たされる必要がある一般的条件は、該シークエンシング装置がテンプレートを（例えば蛍光について）スキャンし、そして、得られたクロマトグラムが、ＤＮＡテンプレートの配列を、規則的に間隔があけられ且つ同様の高さの一連のピークとして表すことである。
【０１３１】
ステップ１） ５０の個体についてシークエンス反応を別々に実施する
【０１３２】
個々のシークエンシング反応についてのデータは、全塩基（又はヌクレオチド）の位置についてのピーク面積又はピーク高さから補正因子を計算するために用いられる。
【０１３３】
ステップ２） ２つのプールされた個体の２５のプールについてシークエンス反応を実施する
【０１３４】
ピーク面積比が、塩基及びノイズのピークでの、第一及び第二のピークを区別する為に用いられる。該第二のピークは、該第一のピークの百分率であり、そして閾値が、ピークとノイズピークとを区別する為に用いられる。プールされたシークエンシング反応についてのデータは、全塩基（又はヌクレオチド）の位置についてのピーク面積又はピーク高さから補正因子を計算するために用いられる。
【０１３５】
ステップ３） ステップ１及び２の結果のグラフを作り、そして回帰直線を構築する（回帰係数及び切片を計算する）
【０１３６】
ステップ４） ＤＮＡ（又はＰＣＲ後産物）のプールを構築する
【０１３７】
比１：３、１：３：９、１：３１：３２：３（ｎ−１）での二倍体生物についての及び１：２、１：２：４、１：２１：２２：２（ｎ−１）の比でのハプロタイプ生物についての、２、３又はｎ個の個体のプールが構築される。
【０１３８】
ステップ５） ステップ１、２およびステップ３において発見された補正因子を用いて、ベースコーリング（塩基判定、basecalling）が、該プール内の得られたシグナル強度から計算されうる。
【０１３９】
この例において、２つだけの可能なヌクレオチド（Ａ及びＣ）がそれぞれの塩基位置で示されるが、同じ原理が、遺伝コードに基づく４つの利用可能なヌクレオチドのうちの２つの他の組み合わせについて機能する。「Ａ」ヌクレオチドについての平均ピーク高さは１００に設定され、及び、「Ｃ」ヌクレオチドの平均ピーク高さは７５である。これらのピーク高さに基づき、２つのハプロイド試料のプールにおけるヌクレオチドの全ての可能な組み合わせについて、相対的なピーク高さが表６に提示される。２つの二倍体テンプレートからなるプールについての相対的ピーク高さが表７に与えられる。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
表８は、本発明におけるプーリング戦略と非プーリング状況とを比較する、シークエンス反応の数の減少を示す。
【０１４３】
【表８】
【実施例５】
【０１４４】
択一的な補正方法を用いた標準化の為の、５０の個体の１プール及び２の個体の２５プールを用いた二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【０１４５】
ステップ１） ５０の個体が別々に試験された。
実施例１、ステップ１と同じだが、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗの代わりに標準化された強度Ｘ及びＹを用いた異なる補正方法を伴う。
【０１４６】
第一の補正因子（Ｋ）はＸ及びＹを用いて計算される。
ここでＸはＡ対立遺伝子（赤）についての標準化された強度であり、そしてＹはＢ対立遺伝子（緑）についての標準化された強度である。この値は、遺伝子型ＡＢを有する個々に遺伝子型同定された試料から決定された。
【０１４７】
他の補正因子ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇもまたＸ及びＹに基づく。ＡＡａｖｇは、ＡＡ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、１に近いことが期待される。ＢＢａｖｇは、ＢＢ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、０に近いことが期待される。ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇは式
を用いて計算された。
【０１４８】
全ての補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇもまた、実施例１、ステップ１におけるとおり、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗに基づき計算されうる。
もし遺伝子型ＡＡが５０の個体のうちで利用可能でないならば、ＡＡａｖｇは１に設定される。また、もしＢＢ遺伝子型が利用可能でないならば、次にＢＢａｖｇは０に設定される。
【０１４９】
次のステップは、全ての５０の個体が結果を有するところのそれらのＳＮＰについての個体タイピングに基づき対立遺伝子頻度を計算することである。
【０１５０】
ステップ２） 実施例１、ステップ２におけるとおり、ステップ１からの全ての５０の個体を含む１つのプールが構築された。
【０１５１】
対立遺伝子Ａについての補正されていない対立遺伝子頻度が、両方の標準化された強度の合計（Ｘ＋Ｙ）により割り算された標準化された赤強度（Ｘ）の間の比として計算される。
補正されていない対立遺伝子頻度イコールＸ／（Ｘ＋Ｙ） （Ｒａｆと呼ばれる）
【０１５２】
我々が適用した対立遺伝子頻度についての第一の補正は、
補正された対立遺伝子頻度＝Ｘ／（Ｘ＋Ｋ*Ｙ） （Ｒａｆｋと呼ばれる）
である。
【０１５３】
ヘテロ接合性の遺伝子型がなかったならば、Ｋは計算されることができない。その場合、以下のルールが適用されうる；
【０１５４】
もしＲａｆ＜０．１ならば、そのときはＲａｆｋは０に設定される。
もしＲａｆ＞０．９ならば、そのときはＲａｆｋは１に設定される。
Ｋが失われるところの全ての他の状況において、ＲａｆｋはＲａｆに等しく設定される。
【０１５５】
ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いた標準化補正は、標準化された強度Ｘ及びＹにより開始するときは、常には必要でない。もしＸｒａｗ及びＹｒａｗにより開始するならば、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いた標準化が実施例１、ステップ２におけるとおりに適用されうる。
【０１５６】
標準化が適用されるならばそのときは、以下の式
を使用する。
【０１５７】
ステップ３） 我々は、ステップ１における個体タイピングについて計算された期待される対立遺伝子頻度（the expected allell frequency）と、ステップ２における５０のプールにおける結果に基づく観察された（補正された又は補正されていない）頻度とを比較した。これから、我々は、以下のモデル
期待された対立遺伝子頻度＝切片なしのｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４
を用いて、回帰係数を計算した。
【０１５８】
補正された頻度（Ｒａｆｋ及びＲａｆｎ）又は補正されていない頻度（Ｒａｆ）のいずれかが、上記式において観察された頻度として用いられる。
該期待された対立遺伝子頻度と、該モデルから予測された対立遺伝子頻度とを比較することにより、最良の補正手順（Ｒａｆｋ、Ｒａｆｎ又はＲａｆ）が発見されうる。
最良の補正手順（the best correction procedure）からの回帰係数は後で、ステップ５ａにおいて２つの個体のプールからの対立遺伝子頻度を補正する為に用いられうる。
【０１５９】
ステップ４） ５０の個体試料から、比１：３で、２つの個体の２５のＤＮＡプールを構築する。該プールにおいて、どの個体が１回用いられ、そしてどれが３回用いられるかを注記する。
【０１６０】
ステップ５ａ） ５０の個体のプールの結果に基づく補正
ステップ１（Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇ）及びステップ３（回帰因子ｂ１、ｂ２、ｂ３及びｂ４）において発見された補正因子により、該対立遺伝子頻度が、ステップ４下で構築されたプールにおける得られたシグナル強度から計算されうる。第一のＲａｆ又はＲａｆｋ又はＲａｆｎが、ステップ１からの補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いて（ステップ３において発見された最良の補正手順によって）計算される。
【０１６１】
次に、Ｒａｆｃ又はＲａｆｋｃ又はＲａｆｎｃが、ステップ３下で発見された多項式の回帰係数を用いて、
期待された対立遺伝子頻度＝ｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４、ここで、観察された頻度＝Ｒａｆ又はＲａｆｋ又はＲａｆｎ
のとおりに計算される。
【０１６２】
プール中の２つの個体により、該予測され補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与えるべきである。最近の結果点への四捨五入がなされるべきである。該２つの個体の遺伝子型同定は、実施例１の表２において示されたとおりの結果から得られうる。
【０１６３】
ステップ５ｂ） ２つの個体のプールの結果に基づく補正
Ｒａｆ、Ｒａｆｋ及びＲａｆｎが、ステップ４下で構築されたプールのシグナル強度及びステップ１下で発見された補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇに基づき計算される。
【０１６４】
次に、ステップ３、実施例５、におけるのと同じモデルを用いた多項式回帰係数が、２０のプールに基づき計算されうる。このモデルは、全てのＳＮＰについて別々に又は全てのＳＮＰにわたって適用されうる。
他の５つのプールにおける該対立遺伝子頻度が、これらの回帰因子に基づき、
のとおりに予測される。
【０１６５】
これは、全ての試料が予測の為に１回用いられるような方法で５回繰り返されうる。これらのプールにおける該期待された対立遺伝子頻度は次に、最良の補正手順を発見する為に該予測された対立遺伝子頻度と比較される。
【０１６６】
プールにおける２つの個体により、該予測され補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与えるべきである。最近の結果点への四捨五入が行われるべきである。２つの個体の遺伝子型が、実施例１の表２に示されたとおりの結果から得られうる。
【０１６７】
ステップ５ｃ） ２つの個体のプールの結果に基づく補正
予測の他の方法が、多重線形回帰係数を用いて、以下のモデル
に基づき光強度（Ｘ又はＸｒａｗ及びＹ及びＹｒａｗ）について、ＳＮＰにより行われうる。
【０１６８】
これらの多重線形回帰因子により、対立遺伝子頻度が次に、
を用いて予測されうる。
【０１６９】
上記に記載されたとおりの該多重線形回帰係数が、２０のプールに基づき計算される。
次に、他の５のプールの対立遺伝子頻度が、これらの回帰因子に基づき予測される。これは、全ての試料が予測の為に１回用いられるような方法で、５回繰り返される。これらのプール中における該期待された対立遺伝子頻度は次に、該最良の補正手順を発見する為に予測された対立遺伝子頻度と比較されうる。
【０１７０】
ステップ５ａ及びステップ５ｂにおけるとおり、２つの個体の遺伝子型が、実施例１の表２において示されるとおりの結果から得られうる。
【０１７１】
ステップ６） 他の個体の試料から、２つの個体の、比１：３でのＤＮＡプールを構築する。ステップ４におけるとおり、該プールにおいて、どの個体が１回用いられそしてどの個体が３回用いられるかを注記する。
これらのプールから、我々は、記載されたとおりの対立遺伝子頻度の予測の為の最良の補正方法を用いて及び実施例１の表２を用いて、遺伝子型を得ることができる。
【０１７２】
実験１
実施例５において記載された手順の、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ａｓｓａｙ ＢｅａｄＣｈｉｐテクノロジー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ、米国）を用いた全ゲノムＳＮＰ分析への適用
【０１７３】
遺伝子型同定が、５０の個体について、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、チキンゲノムを通じて均等に分散されたＳＮＰにより、行われた（ｖａｎ Ａｓら、２００７）。該アッセイについての詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上で見られうる
。
【０１７４】
頻度が正確に見積もられうるかどうかをチェックする為に、（該５０の個々に遺伝子型同定された個体のうちの４つの異なる動物からの）８の対立遺伝子が、１つのプール中に一緒にされた。表２を用いた、予測された対立遺伝子頻度から遺伝子型への翻訳が実施されなかったことを除き、実施例５において記載されとおりのステップ１〜３及びステップ５が、採用された。
【０１７５】
ステップ４において、４の個体のＤＮＡの等モル量が、比１：３での２つの個体からのＤＮＡの代わりにプールされた。
【０１７６】
もし２つの異なる動物からの比１：３が用いられるならば、我々は、これが８の対立遺伝子をプールへ一緒にしていると考えうる。４つの個体の等モル量を用いることによっても、８の対立遺伝子が一緒にされる。
【０１７７】
このように、１２のプールが構成されそして、ステップ１におけるとおり、５０の動物の１つのプールが構成される（４＋２の追加の試料のプールにおけるのと同じ試料が用いられる）。次に、これらの１３のプールが、ｉｎｆｉｎｉｕｍチップの第二のバッチを用いて遺伝子型同定された。
【０１７８】
ＳＮＰ当たりのＫ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇが、実施例５、ステップ１におけるとおりに計算された。次に、５０のプールからの補正されていない及び補正された対立遺伝子頻度が、実施例５、ステップ２におけるとおりに計算された。
【０１７９】
多項式の回帰係数もまた、実施例５、ステップ３におけるとおりに計算された。
【０１８０】
さらに、ステップ５ｂ及び５ｃにおいて記載されたとおり、より多くの多項式及び多重線形回帰係数が計算された。これは、１１のプールに基づき行われ、そして次に、残りのプール中の対立遺伝子頻度が、該回帰因子を用いて予測された。
【０１８１】
この実験において、Ｘ及びＹ（赤及び緑についての強度）に対する多重線形回帰が最良の結果を与えた。最終的な結果について、図４及び表９を参照されたい。
【０１８２】
全部で、４．６％の対立遺伝子頻度が、誤ったクラスに落ちていた。これらが１：３の比の２つの個体のプールであった場合、これは３．０％の遺伝子型同定エラーを結果しただろう。
【０１８３】
【表９】
【０１８４】
実験２
実施例５に記載された手順の、Ｖｅｒａｃｏｄｅ Ａｓｓａｙテクノロジー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ、米国）を用いたＳＮＰ分析への適用
【０１８５】
遺伝子型同定が、ニワトリゲノムを通じて均等に分散したＳＮＰにより、９６Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ Ｖｅｒａｃｏｄｅ，Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、５０の個体に対して行われた（ステップ１）。該アッセイの詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上に見られうる
。
【０１８６】
すべての試料の１プールについても構築され（ステップ２におけるとおり）、そして２の個体の比１：３での２４のプールについても構築された（ステップ４におけるとおり）。これらの２５のプールが、化学物質の第二のバッチにより遺伝子型同定された。
【０１８７】
すべての補正が、実施例５のステップ１〜３において記載されたとおりに行われた。ステップ５ａにおける補正は、ステップ３において発見された多項式回帰因子を用いて、２のすべての２４のプールについて適用された。
【０１８８】
ステップ５ｂ及びステップ５ｃについて、我々は、該回帰因子（ステップ５ｂにおいて多項式の、及びステップ５ｃにおいて多重線形の）を計算する為に毎回２３のプールを用いて、残りのプールについての対立遺伝子頻度を予測することができた。全部で、我々はこれを２４回行い、そしてすべてのプールが対立遺伝子頻度を予測するために１回用いられた。
【０１８９】
最良の結果が、Ｒａｆｋ（標準化された値Ｘ及びＹに基づき計算された）を用いて得られ、そして次に、Ｒａｆｋｃを結果する、ステップ５ｂからの多項式回帰因子を用いて補正された。
【０１９０】
全部で、８４のＳＮＰが個体においてコールされた。次に、いくつかのＳＮＰは、個体のいつくかについてコールされなかった。全部で、我々は１９０６の完全なプール*ＳＮＰの組み合わせを有した。
【０１９１】
【表１０】
【０１９２】
全部で、１３８（１３８／１９０６*１００＝７．２％）のミスマッチがあった（表１０）。すべての観察は、２つの個体試料からなるので、これは１７４の遺伝子型エラー（１７０／１９０６*２*１００＝４．４６％）をもたらした、表１１、図５及び図６を参照されたい。
【０１９３】
この例（ステップ３（実施例５）及びステップ５ａ、５ｂ又は５ｃ（実施例５）を用いて行われたとおり）における最良の補正手順を定めるプロセスも、ＳＮＰによるミスマッチの数についての情報をもたらす。これは、より低いコールレート（call rate）の費用で、該セットからのＳＮＰを排除してミステイクのリスクを減少することを可能にする。
【０１９４】
【表１１】
【０１９５】
実験３
実施例５において記載された手順の、他の遺伝子型同定方法を用いたＳＮＰ分析への適用
【０１９６】
実施例５において記載された手順はまた、実施例１及び実施例２において記載された方法以外の任意の他の遺伝子型同定方法、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ、米国）又はＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、においても用いられうる。
【実施例６】
【０１９７】
他の補正方法を用いた以外は、実施例４におけるとおりのシークエンシングプロトコールにおける本発明の使用方法
【０１９８】
ステップ１） ５０の個体について別々にシークエンス反応を実施する
対立遺伝子１のピーク高さ及び対立遺伝子２のピーク高さをＸｒａｗ及びＹｒａｗ値として、又は相対的ピーク高さをＸ及びＹとして用いる。
対立遺伝子１についての相対的ピーク高さはＸ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）であり、そして、対立遺伝子２についての相対的ピーク高さはＹ＝Ｙ（Ｘ＋Ｙ）である。
次に、Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを、実施例５のステップ１において遺伝子型同定する為に行われたのと同じ方法で計算する。
【０１９９】
ステップ２） すべての５０の個体の１つのプールにおけるシークエンス反応を実施する
実施例５のステップ２におけるとおり、補正されていない及び補正された対立遺伝子頻度が計算される；
【０２００】
ステップ３） 個体のシークエンシングから及び該プールから頻度を計算する
多項式の回帰係数を発見する為に、実施例５のステップ３におけるのと同じモデルを用いる。
【０２０１】
ステップ４） ２つのプールされた個体の２５のプールについてシークエンス反応を実施する
【０２０２】
ステップ５ａ） 最良の方法を発見する為に、全ての５０の個体のプールに基づき期待された頻度と補正された頻度とを比較する
【０２０３】
ステップ５ｂ） モデル
期待された遺伝子頻度＝切片なしの、ｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４
を用いて、他の２０のプールにおいて発見された多項式回帰因子を用いて、２の個体の５のプールにおける、Ｒａｆｎｃ、Ｒａｆｋｃ及びＲａｆｃを計算する
【０２０４】
ステップ５ｃ） モデル
を用いて、他の２０のプールにおいて発見された多重線形回帰係数を用いて、２の個体の５のプールにおける、予測された対立遺伝子頻度を計算する
【０２０５】
ステップ３及びステップ５から、全てのプールが対立遺伝子頻度の予測のために用いられるような方法で、ステップ５ｂ及び５ｃを数回繰り返すことにより、最良の補正手順を決定する（検証）。
【０２０６】
もし必要ならば、検証についての他の数が用いられうる。例えば、回帰因子を発見する為に及び次にこれらの因子を用いてそれを予測する為に、２４のプールを用いることができる。全部で、次に、これを２５回繰り返すことが必要である。
【０２０７】
最良の補正手段並びに必要とされる補正因子及び回帰因子により、新たなプールの頻度を予測すること及び表２における得られた対立遺伝子を読み取ることが可能であった。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的試料についてのカテゴリカルアウトカムによる測定の分野に関し、より特には、カテゴリカルアウトカムによるバイオアッセイの試料調製の為の方法に関する。本発明は、試料をプールする方法、対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の該方法の使用方法を提供する。本発明はさらに、複数の試料についての分析を実施する方法、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置、プールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置、試料をプールする方法を実行するコンピュータプログラム製品、及び複数の試料についての分析を実施する為の方法を実行するコンピュータプログラム製品を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
バイオアッセイは、生物学的分析物の特性、濃度又は存在が試料中において測定される手順である。バイオアッセイは、科学の全分野における研究、最も顕著にはライフサイエンス及び特には分子生物学における研究の本質的部分である。
【０００３】
分子生物学における特定の種類の分析は、遺伝子型同定及びシークエンシングに関する。遺伝子型同定及びシークエンシングは、個体の遺伝子型を、生物学的アッセイにより決定するプロセスをいう。現在の方法は、ＰＣＲ、ＤＮＡ及びＲＮＡシークエンシング、並びに種々のキャリア、例えばガラスプレート又はビーズなど、の上に乗せられたＤＮＡ及びＲＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを含む。該技術は、父であること／母であることについての試験にとって、疾患関連遺伝子の調査の為の臨床研究において、及び、任意の種の特性の遺伝子制御を調査することを目的とした他の研究、例えばＱＴＬ（量的形質遺伝子座）のための全ゲノムスキャンなど、において本質的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の技術の限界の故に、ほとんど全ての遺伝子型同定は部分的である。すなわち、個体の遺伝子型の小さい断片だけが決定される。多くの例において、これは問題でない。例えば、父であること／母であることについて試験するとき、１０〜２０の遺伝子の領域だけが調査されて、関係又は関係の欠如を決定する。これはヒトゲノムのごく小さな断片である。
【０００５】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノム中で最も豊富な種類の多型である。ハイスループットＳＮＰ遺伝子型同定の為の技術及び密集したＳＮＰマーカーマップの並行の開発により、ＳＮＰは、多くの遺伝子研究にとって、よりぬきのマーカーとなった。たくさんの数の試料が、マッピング及び関連の研究において又はゲノムの選抜実験において必要とされる。
【０００６】
ハイスループットの遺伝子型同定能力を備える為に、整列化（arraying）技術が、開発された。そのような技術は、商業上の供給業者、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（マイクロアレイに基づくＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）マッピングアレイ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標））、Ｂｉｏｔｒｏｖｅ（Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ（商標））、及びＳｅｑｕｅｎｏｍ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標））など、から利用可能である。多くの種（ヒト、家畜、植物、バクテリア及びウィルス）において、多数のＳＮＰが利用可能であり、又は近い将来において利用可能となるであろう。新たな革新は、全ゲノムの遺伝子型同定又は関連研究及び、植物及び動物の育種の為の、関連する全ゲノム選抜プログラムを可能とした。今のところそのようなプログラムのコストはまだかなりのものであり、もし試料が個別に遺伝子型同定されるならば、最大で数百万ドルの予算を要求する。それ故に、任意の種におけるＳＮＰの同定を目的とした研究は、現在、限られた数の個体だけの分析を含む。それ故に、本発明は、遺伝子型同定のコストの非常に実質的な減少を許すので、非常に意義あるものである。
【０００７】
ゲノムの変異性における十分な洞察を得るために、ゲノムの（関連のある部分の）全配列を知ることが必要である。しかしながら、全配列を決定するコストは、前の段落において記載された遺伝子型同定のコストよりもさらに高い。該コストにもかかわらず、シークエンシングは、遺伝子型同定に取って代わり、全ゲノムまたはその特定の領域についての個体の遺伝子型同定を与えるであろうことが期待される。本発明もまた、シークエンシングのコストを減じる方法を提供する。
【０００８】
試料プーリングは、通常は、分類形質についての研究において、分析コストを減ずるための手段として用いられる。いくつかの試料の混合物からなる該プールにおける特徴の存在は、そのプールにおける該試料の少なくとも１つにおけるその特徴の存在を示す。ＤＮＡプールは例えば、下記のために用いられる。
集団における対立遺伝子頻度を見積もるため。個体の良い試料を集団から採ることにより、対立遺伝子１の未加工の対立遺伝子頻度（raw allele frequency）が、該プールにおける対立遺伝子１についての結果と対立遺伝子１についての結果及び対立遺伝子２についての結果の合計との間の比として計算される。
症例及び対照が別のプールに分けられるところの症例−対照関連研究のため、及び
限定された数の個体及び限定された数のＳＮＰについてのハプロタイプの再構築のため。該プールにおいて測定された対立遺伝子頻度に基づき、ハプロタイプは、種々のアルゴリズム、例えば最大尤度など、により見積もられうる。語「ハプロタイプ頻度」は、語「マーカーの同時分布（joint distribution of markers）」と同じことを意味する。
【０００９】
試料プーリングの重要な不利点は、該測定された特徴が、全体としての該プールにおいて同定されるだけであり、該プールにおける個々の試料のいずれにおいて同定されないことである。１つの例外は、２つの個体からなる２つのプールのそれぞれが作られた場合（父＋子及び母＋子）に三つ組（父、母及び子）を遺伝子型同定する為のＤＮＡプールである。それぞれのプールにおいて観察された対立遺伝子頻度は、すべての３つの個体についての遺伝子型を示す。この種の試料プーリングは、３３％のコスト減少を与えるが、そのような三つ組により可能なだけである。全ての他の例において、プールされた試料は、個々の試料についての結果を提供する為に、個々に再度分析されなければならない。
【００１０】
すなわち、三つ組以外の試料タイプについての試料プールを提供する一方で、なおもそのプール内の個々の試料についての試験結果を与えることが有益だろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明者らは今、プール中のそれぞれの個体試料の分布が、それぞれの他の試料の分布の固定された比である場合、すなわち試料の量が等モルでないが特定の比で与えられる場合、無作為の個体がプールされうること及び個体の遺伝子型がそのようなプールから取り出されうることを発見した。個々の試料についての結果は、試験がカテゴリー変数の定量的測定に関与すること、すなわち試験が定量的に測定される分類形質又は離散的形質（a categorical or discrete trait）に関与することを条件として、該プールされた試験結果から推測されうる。
【００１２】
実際に、本発明者らは、二倍体動物における或る座位での或る対立遺伝子の存在の研究の為に、１つの座位で２つの可能な対立遺伝子（Ａ又はＢ）を有する第１の二倍体動物のＤＮＡ試料と同じ座位で２つの可能な対立遺伝子（Ａ又はＢ）を有する第２の二倍体動物のＤＮＡ試料との１：３の比での混合が、その混合物における対立遺伝子のいずれかについて（２）＋（２＋２＋２）＝８の可能性の存在を結果すること、ここで一つの対立遺伝子（例えばＡ）からの期待される定量的装置シグナルが最大試料シグナル強度の１２・５％である、を発見した。これは、最大試料シグナル強度の３７．５％の測定されたシグナル強度で、該試料は、３ｘ対立遺伝子Ａを含むことを意味し、これは該シグナルが、該第１の二倍体動物から得られることはできず、そして該第２の二倍体動物からだけ得られることができることを意味し、該第１の二倍体動物は遺伝子型ＢＢを有し及び該第２の二倍体動物は遺伝子型ＡＢを有することを示す。同様に、測定されたシグナル強度が最大試料シグナル強度の５０％である場合、全ての試料は、遺伝子型ＡＢを有する。測定されたシグナル強度が、最大試料シグナル強度の０％である場合、そのときは全ての試料が遺伝子型ＢＢを有する。該プール中の該２つ個体は、全部で３*３の可能な遺伝子型を有する。該測定の精度が少なくとも６．２５％であるとすると、それぞれの測定は、１００％の八分の一（１／８）の値又はその倍数に割り当てられうる。一般に、それぞれの可能な測定結果は、
の値に割り当てられることができ、ここでｙ＝２（１つの位置での対立遺伝子Ａについての２つの可能な結果、対立遺伝子は存在する又は不在である）、ｐは倍数性レベルであり、ｎは試料の数であり、且つ１００％は最大試料シグナル強度である。全部で、（倍数性レベル＋１）ｎの可能な遺伝子型があるであろう。
【００１３】
今、３つの動物の試料（ｘ、ｙ及びｚ）を１：３：９の比で（それぞれ、すなわち、３のプーリング因子で）プールしたとき、理論上は、その混合物中の対立遺伝子のいずれかについて合計２６の可能性があり、ここで一つの対立遺伝子（例えばＡ）からの期待される定量的シグナルは、最大の試料シグナル強度の３．８５％である。これは、最大試料シグナル強度の１２％の測定されたシグナル強度で、該試料は、３ｘ対立遺伝子Ａを含み、動物ｘが遺伝子型ＢＢを有し、動物ｙが遺伝子型ＡＢを有し、及び動物ｚが遺伝子型ＢＢを有することを示す。同様に、該測定されたシグナル強度が最大試料シグナル強度の９６％であるとき、試料ｘは遺伝子型ＡＢを有し、一方で試料ｙ及びｚは遺伝子型ＡＡを有する。該測定の精度が少なくとも１．９％であるとすると、それぞれの測定は、１００％の２６分の１（１／２６）の値、又はその倍数に割り当てられうる。（そのようなプールされた実験についての可能なアウトカムの概観について、以下の実施例を参照されたい）。
【００１４】
本発明者らは、この原理が、分析の結果が試料中の分析物の性質に関して分類的であるところの、該試料中の分析物の定量的測定を伴う多くの該分析について用いられうることを示した。
【００１５】
第一の局面において、本発明は今、カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法を提供し、ここで該分析は、分析物の定量的測定を含み、該試料をプールする方法は、ｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プール中の個々の試料の量は、該試料中の分析物がｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘは、カテゴリー変数（又はプーリング因子）のクラスの数を表す２以上の整数、例えば３、４、５、６、７、又は８など、好ましくは２又は３、であり、且つｎは試料の数である。アノテーションｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１）は、ｘ０：ｘ１：ｘ２：・・・：ｘ（ｎ−１）又はｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘi；ｘ（ｎ−１）をいうとして理解されるべきであり、ここでｎは試料の数であり且つiは、２とｎの間の値を有する増加する整数である。
【００１６】
倍数体個体のプーリングについて、ｘは（倍数性レベル＋１）に等しく、すなわち１つのシングル位置で２つの可能な対立遺伝子を有する一倍体についてｘ＝２であり、二倍体についてｘ＝３であり、そして四倍体についてｘ＝５であり、ｘはまた、可能な遺伝子型の数にも等しい。
【００１７】
３つの可能な対立遺伝子があると仮定すると、そのときは、一倍体は３つの可能な遺伝子型を有し（ｘ＝３）、二倍体は６つの可能な遺伝子型を有し（ｘ＝６）、そして三倍体は１０の可能な遺伝子型を有するだろう（ｘ＝１０）。１つの二倍体個体において、第一の対立遺伝子は、第二及び第三の対立遺伝子と同じく０、１又は２回生じうる。これは、２つの対立遺伝子によるのと同じ比（ｘ０：ｘ１：ｘ２：ｘ（ｎ−１））（ｘがやはり倍数性レベル＋１である）でプールすることを可能とする。３つの対立遺伝子についてのシグナル強度は、該プールされた試料中の対立遺伝子の数を発見する為に、最近の結果点
（ここでｙ＝２であり（対立遺伝子１、２又は３が存在する又は不在である）、ｐ＝倍数性レベルであり、且つｎ＝試料の数である）に丸められる。
【００１８】
すなわち、該プール中の２つの個体の試料の間の比（例として）は、その中の分析物が、１：ｘのモル比で存在するような比であり、ここでｘは分類形質についてのクラスの最大数である。
【００１９】
該プール中の個体の試料の量が、公比（common ratio）３を有する幾何数列として与えられるところの方法が、二倍体個体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するために特に適しており、ここでそれぞれの個体は３つの可能な遺伝子型を有する。該遺伝子型は、３つの可能な変異（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ）を有しうる分類形質である。
【００２０】
該プール中の該個体試料の量が公比２を有する幾何数列として与えられるところの方法は、一倍体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するために特に適している。その例について、以下の実験の部で言及される。
【００２１】
他の局面において、本発明は、カテゴリー変数（ｘ）のクラスの数がｐ＋１に等しく、ｐが個体の倍数性レベルを表すところの一倍体又は倍数体個体中の対立遺伝子変異を遺伝子型同定するための、上記で記載された本発明の方法の使用方法に関する。そのような使用方法は例えば、一倍体又は倍数体個体中の対立遺伝子を遺伝子型同定することを許す。
【００２２】
さらに他の局面において、本発明は、複数の試料についての分析を実施する方法であって、該試料を、上記で記載された本発明の方法に従いプールして、プールされた試料を用意すること、及び該プールされた試料について該分析を実施することを含む上記方法に関する。得られた定量的結果は次に、最も近い結果点（最大試料シグナル強度がそれぞれの可能な結果について割られるところの理論上の間隔の数により決定される、以下を参照されたい）に四捨五入され、そして該シグナル強度は、該プールされた試料中のカテゴリー変数のクラスの合計数に割り当てられる。これから、該カテゴリー変数は、該プール中のそれぞれの個体試料について、該プール中の種々の個体試料の比を考慮して、決定される。
【００２３】
他の局面において、本発明は、複数の試料について分析を実施する方法であって、本明細書上記で定められたとおり試料をプールする方法により得られた、プールされた試料の１セットについて分析を実施することを含む、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され且つ該試料中の分析物の定量的測定（a quantitative measurement）に関与する、上記方法を提供する。
【００２４】
この方法の好ましい実施態様において、分析の実施の方法はさらに、該測定から、該試料のプール中の個体試料の寄与を演繹するステップを含む。
【００２５】
他の局面において、本発明は、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置であって、プールされた試料を用意する為の試料アスピレーターを備えており及び本明細書上記で定義された試料をプールする方法を実施する為のプロセッサをさらに備えている上記装置を提供する。
【００２６】
他の局面において、本発明は、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置を提供し、ここで該装置は、カテゴリー変数について該試料を分析する為に及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されている。
【００２７】
この分析装置の好ましい実施態様において、該装置はさらに、プーリング装置を備えており、最も好ましくは上記で開示されたプーリング装置を備えている。
【００２８】
他の局面において、本発明は、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、本明細書上記において定義されたとおりの試料をプールする方法を実行する。
【００２９】
他の局面において、本発明は、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数試料に対する分析を実施する為の方法を実行し、該方法は、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され及び該試料中の分析物の定量的測定に関与する。
【００３０】
このコンピュータプログラム製品の好ましい実施態様において、該方法はさらに、本明細書上記で定義されたとおりの試料をプールする方法に従うプーリングのステップを含む。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法を用いることにより、分析コストが非常に、すなわち典型的には５０％だけ、そしてさらには６６％だけ又はそれより多く、減少されうる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】プールされたデータに基づいたときの対立遺伝子頻度（Ｙ軸）と個別の測定に基づいたときの対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の相関をグラフ表示で示す図である。
【図２】個体について測定されたときの対立遺伝子頻度（Ｙ軸）とプールにおいて予測された対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の関係をグラフ表示で示す図である。
【図３】プールにおける補正された対立遺伝子頻度（Ｙ軸）と個別のタイピング後に固体について測定された対立遺伝子頻度（Ｘ軸）との間の関係をグラフ表示で示す図である。
【図４】実験１におけるプール１についての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の差をグラフ表示で示す図である。
【図５】実験２における全てのプールについての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の相関をグラフ表示で示す図である。
【図６】実験２における全てのプールについての、（個別のタイピングに基づく）期待された対立遺伝子頻度と予測された対立遺伝子頻度との間の差をグラフ表示で示す図である。
【図７】カテゴリー変数が、いくつかの可能なカテゴリーの１つである値をとることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
好ましい実施態様の説明
本明細書において用いられるときに、語「カテゴリー変数」は、離散変数、例えば特徴又は形質など、例えば分析物又はそれにおける特徴の存在又は不在、又は分析物におけるホモ接合的若しくはヘテロ接合的な形で存在する若しくは不在である対立遺伝子形質、をいう。離散は、分類的（categorical）についての同義語であり、そして、非線形又は不連続的をいう。「変数」は一般に、試料の特性を測定する（分類上の）形質をいう。カテゴリー変数は、（２つのクラスからなる）バイナリーでありうる。「クラス」は、大きさ（測定値、a measurement）が割り当てられうるグループ又はカテゴリーをいう。すなわち、純粋なカテゴリー変数は、カテゴリーの割り当てを許すであろうものであり、及び、カテゴリー変数は、いくつかの可能なカテゴリー（クラス）の一つである値をとる。特に、該カテゴリー変数は、遺伝マーカー、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）、又は任意の他の遺伝マーカーなど、対立遺伝子、免疫応答、疾患、抵抗能力、毛の色、性、疾患感染の状態、遺伝子型又は試料又は生物学的実体の任意の他の形質又は特性の存在に関しうる。それらは、例えば分析装置により受信され、読み取られ及び／又は記録されうる生成された分析物シグナルとして、数値的に測定されうるが、カテゴリー変数それ自体は数値的な意味を有さず及び該カテゴリーは固有の順序付けを有さない。例えば、性は、２つのカテゴリー（しばしば０及び１としてコードされる男性及び女性）を有するカテゴリー変数であり、そして、好ましくは順序付けされないカテゴリーを表す。遺伝子型もまた、好ましくは順序付けされない多くのカテゴリー（ときどき２、１及び０としてコードされるＡＡ、Ａａ及びａａ）を有するカテゴリー変数である。
【００３４】
本発明の局面における試料は、カテゴリー変数が測定されるべきところの任意の試料でありうる。該試料は、生物学的試料、例えば動物（ヒトを含む）又は植物の組織試料又は体液試料など、環境試料、例えば土、空気又は水の試料などでありうる。該試料は、（部分的に）精製されてもよく、又は処理されていない（未加工の）試料であってもよい。該試料は、好ましくは核酸試料、例えばＤＮＡ試料である。
【００３５】
その存在又は形が定量的試験において測定される該分析物は、任意の化学的実体又は生物学的実体でありうる。好ましい実施態様において、該分析物は生体分子であり、そして、該カテゴリー変数は該生体分子の変異体（a variant）である。好ましくは、該生体分子は核酸、特にはポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ、ＤＮＡなど、であり、そして、該変異体は例えば、該ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド多型、例えば対立遺伝子変異体、もっとも好ましくはＳＮＰ、又は特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティー（base identity）でありうる。
【００３６】
本明細書において定義されたとおりの分析物は、このように、或るカテゴリー変数を示すＤＮＡ分子でありうる（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧのカテゴリー値を有する、その核酸分子中の特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティー）。特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーは、例えば該ヌクレオチドの蛍光アナログを組み込んでいるｃＤＮＡコピーに由来する蛍光に基づく、定量的試験、例えばＤＮＡシークエンシングの技術分野において既知のものなど、を用いることにより測定されうる。該ＤＮＡの特定の位置において該アナログにより放射されそして分析装置により測定された蛍光の定量的水準が次に、そのヌクレオチド位置についてのカテゴリー変数に、例えばその位置についてのアデニンとして、割り当てられる。
【００３７】
特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーを決定することにおいて、本発明は、特定の核酸のヌクレオチド配列が決定されるべき個体試料のプーリングに適する。本発明の方法のシークエンシングアッセイ（分析）についての適合性は、シークエンシングアッセイが、例えばシークエンシングゲル中の或る位置での任意の特定の塩基についてのシグナルの存在又は不在が、該核酸内の特定のヌクレオチド位置におけるその塩基アイデンティティーの存在又は不在に対応するところの、４つの可能な塩基のいずれか一つからのシグナルの決定を含むことに理解したときに、理解されうる。本明細書において記載されたとおりの比でシークエンスゲルを走らせる前の２つの試料のプーリングが、任意の特定のシグナルの源及びすなわちそれぞれの個体の核酸についての配列の決定を許すであろう。
【００３８】
該「分析物」は、ポリペプチド、例えばタンパク質、ペプチド又はアミノ酸など、でありうる。該分析物は、核酸、核酸プローブ、抗体、抗原、レセプター、ハプテン、およびレセプター又はその断片についてのリガンド、（蛍光）ラベル、色素原、放射性同位体など、であってもよい。事実、該分析物は、定量的に測定されることができ、そして該カテゴリー変数のクラスを決定するために用いられることができる、任意の化学的又は物理的物質により形成されることができる。
【００３９】
本明細書において用いられるときに、語「ヌクレオチド」は、糖、典型的にはリボース（ＲＮＡ）又はデオキシリボース（ＤＮＡ）のＣ−１炭素に結合されたプリン（アデニン又はグアニン）又はピリミジン（チアミン、シトシン又はウラシル）塩基を含み、そしてさらに該糖のＣ−５炭素に結合した１以上のホスフェート基を含む化合物をいう。該語は、個々のヌクレオチドの糖単位が、ホスホジエステル架橋を介して連結されて、吊り下がっているプリン又はピリミジン塩基を有する糖リン酸バックボーンを形成するところの核酸又はポリヌクレオチドの個々のビルディングブロックへの言及も含む。
【００４０】
本明細書において用いられるときに、語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形にある、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマー、すなわちポリヌクレオチドへの言及を含み、そして他の限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する既知のアナログ（例えばペプチド核酸）を包含する。ポリヌクレオチドは、天然の又は異種性の構造的又は調節的遺伝子の完全長又はサブシークエンスでありうる。他に示されない限り、該語は、該特定された配列ならびにその相補的配列への言及も含む。すなわち、「ポリヌクレオチド」が本明細書において意図されるときに、安定性の為に又は多の理由の為に修正されたバックボーンを有するＤＮＡ又はＲＮＡは「ポリヌクレオチド」である。さらに、本明細書において該語が用いられるときに、ほんの２例だけ挙げると、普通ではない塩基、例えばイノシンなど、又は修正された塩基、例えばトリチル化された塩基など、を含むＤＮＡ又はＲＮＡがポリヌクレオチドである。
【００４１】
語「定量的測定」は、試料中の分析物の量の決定をいう。語「定量的」は、該測定が数値的な値で表されうるという事実をいう。該数値的な値は、寸法、サイズ、程度、量、容量、濃度、高さ、深さ、幅（width）、幅（breadth）、長さ、重さ、体積又は面積に関しうる。該定量的測定は、測定シグナル、例えば色素生成シグナル又は蛍光シグナルなど、又は任意の他の定量的シグナルの強度、ピーク高さ又はピーク面（peak surface）に関与しうる。一般に、分析物の存在又は形を決定するときに、該測定は装置シグナルに関与するであろう。例えば、ＳＮＰの存在を決定するときに、該測定は、ハイブリダイゼーションシグナルに関与するであろうし、そして該測定は典型的には蛍光光度計により測定されたときの蛍光強度を与えるであろう。免疫応答の存在を決定するときに、該測定は抗体力価の測定を含むであろうし、そしてまた該測定は典型的には蛍光強度としても与えられるであろう。該測定は、連続的な測定結果を与えることを要しないが、離散間隔又はカテゴリーに関しうる。該測定は、準定量的でもありうる。該測定が最大試料シグナル強度の２ｎ−１、３ｎ−１又はｘｎ−１の部分的な及び好ましくは比例的な間隔で決定されうる限り（該プールが、公比２、３又はｘをそれぞれ有する幾何数列として与えられるかどうかに依って、ここでｎは該プール中の試料の数である）、該測定は原理上適当である。
【００４２】
語「プールする（プーリング）」は、本明細書において用いられるときに、ユーザーへの利点を最大化する為に、試料を一緒にグループ化すること又は併合することをいう。特に、語「プールする（プーリング）」は、加重値の１つの試料を表すための複数試料のコレクションの調製をいう。複数試料を１つのシングル試料へと併合することは通常、試料を混合することにより実施される。本発明において、混合は、個々の試料の量を注意深く重さを量ることを要し、ここでそれぞれの試料中に存在する分析物の量は決定的である。試料Ａが２ｇ／ｌの分析物の量を有し且つ試料Ｂが１ｇ／ｌの分析物の量を有するとき、これらの試料は、１：３の分析物比を与える為に、１：６の体積比でプールされる必要がある。
【００４３】
本発明の実施態様において定められたとおり、２つの試料が例えば１：３の比でプールされるとき、又は３つの試料が１：３：９の比でプールされるとき、該プール中の変異体の可能な頻度は、それぞれ１２．５％及び３．８５％の間隔のエンドポイントにより設定される。これらの間隔のエンドポイントは、本明細書において「結果点」といわれ、そして、最大試料シグナル強度に達するまでの定量的測定のステップ増加と等価である。
【００４４】
語「幾何数列（geometric sequence）」は、任意の２つの連続した項の間の比が同じであるところの数字の列をいう。言い換えると、毎回、該数列中の次の項が、前の項に同じ数を乗ずることにより得られる。この固定された数字は、該数列についての公比と呼ばれる。本発明の幾何数列において、試料の種類に依存して、第１項は１であり、及び公比は２又は３である。
【００４５】
語「最大試料シグナル強度」は、プール中の全ての試料が陽性（正）のシグナルを与えるとき、すなわち個体の試料の１００％が、試験された分析物について陽性であるときに、そのプールから得られたシグナルをいう。該最大試料シグナル強度は、任意の適当な方法により決定されうる。例えば、５０の個体の試料が、これらの試料のうちに存在する離散イベントの数の点でそれらの組成を決定する為に別々に測定されることができ、そしてその後、これらの試料がプールされた実験において次に測定されうる、ここで該プールされた試料について測定された該シグナル強度が、全ての個別の試料の全てのシグナル強度を合計することにより得られるだろうものと同じ比で見えている。
【００４６】
本発明の方法は、ｎ個の試料の任意の数により実施されうる。しかしながら、実際は、ｎについての最大数は、測定方法の精度により、すなわち２つの連続的な結果点の間の統計的にしっかりとした区別が決定されうる精度により、設定される。該方法の該精度（標準偏差）は、それに従うべきである。
【００４７】
本発明の方法の適用は、遺伝子型同定方法を含むがこれに限定されない。ＤＮＡのプーリングに基づく遺伝子型同定は多くの適用を有する。遺伝子型は、全ての種において、マッピング、関連及び診断のために用いられうる。特定の遺伝子型同定の例は、ａ）ヒトにおける遺伝子型同定、例えば医療的診断などだけでなく、症例−対照研究プーリングが続く、フォローアップの個体のタイピングなど；ｂ）家畜における遺伝子型同定、例えばＱＴＬ研究における、候補遺伝子アプローチにおける及びゲノムの広い選抜適用における、個体のタイピングなど；及びｃ）例えばマッピング研究及び関連研究のための、植物における遺伝子型同定を含む。
【００４８】
プーリングは、ヒト、家畜、植物、バクテリア、ウィルスをシークエンシングするときにも用いられうる。より特には、シークエンシングの為の個体の試料のプーリングは、２以上（２又はそれより多い）個体のシークエンスが比較されるべきときに適切である。
【００４９】
試料をプールする為の本発明の方法は、少なくとも第一の試料からのサブ試料と少なくとも第二の試料からのサブ試料をとることを含み、ここで該第一及び第二のサブ試料は一つの容器に併合されて、プールされた試料の形にある２つのサブ試料の混合物を与え、且つ、該プールされた試料中の該第一及び第二のサブ試料の比は、本明細書において記載されたとおりその中の分析物の濃度に基づき、１：３又は３：１である。同様に、３つの試料がプールされる場合（この言い回しは、３つのサブ試料が混合されるという事実をいう）、第一、第二及び第三のサブ試料（任意の順序における）の間の、プールされた試料において得られるべき比が、本明細書において定められたとおり１：３：９である。該プール中の変異体の可能な頻度は、それぞれ１２．５％及び３．８５％の間隔のエンドポイントにより設定される。これらの間隔のエンドポイントは、本明細書において「結果点」といわれ、そして、最大試料シグナル強度に達するまでの段階増加と等価である。
【００５０】
本明細書において定義されたとおり、プールする方法は、プーリング装置により（を用いて）実施されうる。そのような装置は適切に、例えば定められた（しかし可変の）体積の形で、試料の定められた量を集め及び配る為に構成された試料コレクターを備える。適当な試料コレクターは、研究室において用いられるロボットの試料配達及び処理システムにおいて一般に適用されるようなピペッターである。そのようなロボットのシステムは通常、１以上のマイクロプレートプロセッサステージ、試薬ステーション、フィルタープレートアスピレーター、及び、圧縮空気及びディスポーザブルピペットチップに基づくロボットピペッティングモジュールを適切に備えている卓上装置である。これらの試料ロボットシステムは、本発明の方法を実施する為に非常に適当である。なぜなら、それらは種々の試料からの種々の液体体積を１以上の反応チューブへと一緒にする為に、最終的に設計されているからである。それ故に、種々の試料からの種々の液体体積を一つのプールされた試料へ一緒にする仕事を実施する為にそのようなピペッティングロボティックシステムを採用することは、当業者の技術水準内である。しかしながら、そのようなピペッティングロボティックシステムは、複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為の試料プーリング装置のただ１つの適当な実施態様であり、該装置は試料を複数の試料バイアルから集める為及び試料を一つのプーリングバイアルへと配ってプールされた試料を用意する為の試料コレクターを備えており、そしてさらに本明細書において定義されたとおりの試料をプールする方法を実施する為に構成されたプロセッサを備えている。語「プロセッサ」は、本明細書において用いられるときに、メモリー又は他のストレージ装置からの記憶され及び取り戻された指示が、１以上の実行ユニット、例えばピペッティング装置及び、ピペッティングロボティックシステムの試料バイアルとプーリングバイアルとの間で該ピペッティング装置を動かす為のロボティックアームを備えているユニットなど、を用いて実行される任意のコンピューティング装置への言及を含むことが意図される。語「バイアル」は、広く解釈されるべきであり、そして、アレイ上の分析スポットへの言及を含みうる。本発明に従うプロセッサは、それ故に、たとえば、パーソナルコンピュータ、メインフレームコンピュータ、ネットワークコンピュータ、ワークステーション、サーバー、マイクロプロセッサ、ＤＳＰ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びにこれらの一部及び組み合わせ及び他の種類のデータプロセッサを含みうる。該プロセッサは、本明細書上記で定義されたとおりのプーリング装置上で本発明に従い試料をプールする方法を実行するコンピュータプログラムからの指示を受け取る為に構成される。
【００５１】
カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法であって、該分析が分析物の定量的測定を伴い、該試料をプールする方法が、ｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プール中の個々の試料の量は、該試料中の該分析物が、Ｘ０：Ｘ１：Ｘ２：Ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘは、カテゴリー変数のクラスの数を表す２以上の整数である。
【００５２】
プールする方法は全く簡単であり、且つ比較的シンプルな方式で記載されることができる一方で、本明細書において記載されたとおりのプールされた試料の分析の方法はより複雑である。
【００５３】
本明細書において記載されたとおり、カテゴリー変数（例えば遺伝子型）は、いくつかの可能なカテゴリー（ＢＢ、ＡＢ、ＡＡ）の一つである値をとりうる。これれのカテゴリーは、結果間隔（resule interval）のクラスと一致する。該カテゴリーは、パラメーター（例えば蛍光）についての分析物（ＤＮＡ）に対する定量的測定を実施すること、及び分析結果の分類化（categorization）に基づきこれらのパラメーター値にクラスを割り当てることにより決定され、該クラスのそれぞれが該カテゴリー変数についての変異体を表す（図７を参照されたい）。
【００５４】
一般に、可能な分析結果（アウトカム）の合計数は、カテゴリー変数の性質に依存する。例えば、二倍体生物の遺伝子型の場合、倍数性レベルが、可能な分析結果の数を決定する。一般的な点で、該カテゴリー変数の性質は、試料内の分析物の種々の数の変異体又はセットの存在を含みうる（図７におけるリピート）。また、可能な分析結果の合計数は、１つのリピートがとることができる可能な異なるカテゴリー値による。可能な分析結果の数の例が表１において与えられる。
【００５５】
【表１】
【００５６】
例えば、二倍体個体の遺伝子型（１つの試料内に１つの対立遺伝子の２のリピート）は、３（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢ）に等しい。なぜなら、１つの対立遺伝子は、２つの異なる変異体（Ａ又はＢ）だけを有するからである。三倍体（１つの対立遺伝子の３のリピート）は、４つの異なる遺伝子型（ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＡＢＢ及びＢＢＢ）を有しうる。
【００５７】
個体についての血液集団は、４つの異なる変異体（Ａ、Ｂ、ＡＢ又はＯ）を有する１つのリピートである。
【００５８】
表１における式は、どのリピートについて変異体が測定されるかが重要でないところの状況について適用できる。例えば、遺伝子型同定することについて、遺伝子型ＡＢと遺伝子型ＢＡとの間に差異はない。しかしながら、もし該リピートのアイデンティティーが重要であるならば、次に可能な分析結果の合計数を計算する為の式はｎｋである。この式は次に、表１の該式
にとってかわる。また、該表中の全ての値は、従って、変化する。１つのリピートについて２のリピート及び２の可能な結果を有する状況について、４の結果があるであろう。１つのリピートについて３のリピート及び３の可能な結果による状況について、９の異なる結果があるであろう。
【００５９】
可能な分析結果の合計数は、本明細書において、プーリング比（例えば１：３：９）として適用され、そして、「プーリング因子」（１：３：９の場合３）と呼ばれるものを直接に提供する。例えば、遺伝子型同定する為に一倍体個体をプーリングするとき、１リピート当たり２つの可能な変異体を有する１つのリピートがある。そのような場合、該プーリング因子は２に等しい（表１における結果の数である）。
【００６０】
４つの個体をプーリングすることは、次に、比２０：２１：２２：２３で行われる必要がある。
【００６１】
二倍体個体をプーリングするとき、プーリング因子は３である。３つの個体をプーリングすることは、比３０：３１：３２で行われる必要がある。
【００６２】
プールにおける結果の合計数は次に、以下の式と等しい
合計のプール結果＝プーリング因子試料数
【００６３】
シグナル強度についての増加は、次に、
増加＝１／（プーリング因子試料数−１）×１００％
又は
１／（ｙ×（（プーリング因子）０＋（プーリング因子）１＋（プーリング因子）２＋・・・＋（プーリング因子）（ｎ−１））×１００％、
と等しく、
ここでｎは試料数であり、及びｙ＝プーリング因子マイナス１である。
【００６４】
もし測定強度が全ての変異体について１つのリピートについて存在するならば（全ての値マイナス１である（なぜなら該失われた１は次に他について１マイナス強度として計算されうるからである））、表１の最上列が続かれる。なぜならこれが、このリピートについての２つの可能なアウトカムに対応する、そのリピートのすべての値について存在する又は不在であるとして見られうるからである。３の可能な対立遺伝子が、２の変わりに想定され且つ２の代わりに３の異なる光強度を測定することができる上の例を参照されたい（赤及び緑）。
【００６５】
もし、一つの測定だけがあるならば、表１が従われる。
【００６６】
本明細書において意図されるとおりのプールされた試料を分析する為の本発明の方法は、該プールされた試料に対する要求された分析物についての測定の実施を含む。測定結果、例えば装置シグナル、を記録すると、該分析は次に、本明細書以下において与えられる実施例において非常に詳細に説明される一連の工程を伴う。
【００６７】
本発明の方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施すること、ここで該試料はカテゴリー変数について分析される、は該試料内の分析物の定量的測定を含む。該分析物は、化学的又は物理的な物質又は実体であり、そのパラメーターが該カテゴリー変数の少なくとも１つの変異体の存在又は不在を示す。例えば、カテゴリー変数として、変異体対立遺伝子Ａ又はＢを有する生物の遺伝子型を決定するとき、該分析物は該生物のＤＮＡ、ＤＮＡプローブ又は遺伝子のラベルであり、そしてその分析物のパラメーターの絶対値が、変異体の存在（又は不在）に直接に関連付けられうる。該分析物についての該定量的測定は一般に、分析物パラメーターについての値としての蛍光強度、放射性同位体強度又は任意の定量的大きさ（任意の定量的測定値、any quantitative measurement）に関与するであろう。或る閾値又はカテゴリー値を越える大きさは一般に、該変異体の存在を示すであろう。試料中の分析物の定量的測定は、すなわち、該試料中において分析されるべきそのカテゴリー変数の変異体の存在又は不在を示す分析物を参照する。
【００６８】
本質的に、本明細書において記載されたとおりの試料をプールする方法により得られたプールされた試料を分析する方法において、該プール中の個体試料の寄与、すなわち、該プール中の個体試料についての結果は、以下の通りに決定される。
【００６９】
第１に、ｎ個の試料のプールについて実施されるべき或る分析「Ａ」についての最大試料シグナル強度が決定され、そして１００％シグナルに設定される。該最大試料シグナル強度は、ｎ個の試料のプール中の試料の１００％が、該カテゴリー変数について陽性であるときに達せられるシグナル強度である。該最大試料シグナル強度は、ｎ個の陽性の参照試料の試験プールを用意すること及び該測定シグナルを決定することにより決定されることができ、ここで該陽性の参照試料は、該カテゴリー変数に関して陽性であり、且つｎは分析「Ａ」が実施される該プール中の試料の数である。分析「Ａ」についての該最大試料シグナル強度は、後の使用の為に、コンピュータメモリー中に記録され又は格納される。次に、関心のある該分析物は、該分析物についての該プールされた試料のシグナル強度が決定されるところの分析「Ａ」を実施することにより、本発明の方法により得られたプールされた試料において測定される。該プールされた試料における該分析物についての得られたシグナル強度が記録され、上記で定められたとおりの最近の結果点へと四捨五入されそして任意的に格納され、そして次に該最大シグナル強度と比較される。適当には、この比較は以下の通りに実施されうる。一般に、それぞれの可能な測定結果は、値
に割り当てられ、ここでｎはプールされた試料の数であり、ｙは、「Ａ」が存在するか又は不在であるかを表す２の整数であり、且つ１００％は最大試料シグナル強度である。アノテーション
は、
をいうとして理解されるべきであり、ここでｎは試料の数であり、及びiは２〜ｎの間の値を有する増加する整数である。例えば、カテゴリー変数のｙ＝２のクラス（マーカー存在及びマーカー不在）、且つ４つの試料のプール、４つの陽性参照試料を用いて１００％に設定された最大試料シグナル強度セットにより、合計で
の結果点があり、ここでそれぞれの可能な測定結果が値
又はその倍数に割り当てられうる。
【００７０】
試料のプール中のそれぞれの試料についての結果は、簡単な結果表から読み取られることができ、これはコンピュータメモリー中にコンピュータ読み取り可能な形で格納されることができ、そして該表は、該最大試料シグナル強度の０％〜１００％の間の
の増加する段階のそれぞれの結果点について、該プール中の個体試料のそれぞれについて対応する値を割り当てる。例えば、そのような結果表は、以下の表２において与えられるとおりの表である。
【００７１】
該分析は、該プールされた試料中の種々のサブ試料のそれぞれに、該カテゴリー変数を割り当てることにより完了される。
【００７２】
本明細書において定義されるとおりのプールされた試料を分析する方法は、分析装置により実施されうる。本発明の分析装置は、上記で記載されたとおりの試料をプールする為の方法により得られたプールされた試料のセットについての分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えており、ここで該装置は、該試料をカテゴリー変数について分析する為に及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されている。上記で言及されたとおり、該分析装置の独特の特徴は、それが、プールされた試料を、該プール中のそれぞれの個体試料におけるカテゴリー変数について分析する為及び該試料中の分析物の定量的測定を実施するように構成されていることである。本質的には、該分析装置は、該プールされた試料について得られた測定結果を測定し及び分析する為に並びにその結果からプール中のそれぞれの個体試料におけるカテゴリー変数を推測するように構成されている。そのような装置は適当には、該プールされた試料中の分析物シグナルの測定の為のシグナル読み取りユニットを備えている。該分析装置はさらに適当には、該測定結果及び上記で記載されたとおりの結果表を格納する為のメモリーを備えている。該分析装置はさらに適当には、メモリーから及び／又は該読み取りユニットからデータを回収する為に構成され、並びに計算を実施する為及び該プールされた試料についての測定結果が、上記言及された結果表を用いて、該プール中の個体試料についての対応する結果と比較され及び当該結果に割り当てられるところの反復プロセスを実施する為に構成されたプロセッサ；該メモリー又はプロセッサへと試料データを入力する為のインプット／アウトプットインターフェース；及び該プロセッサに接続されたディスプレイを備えている。該プロセッサは、本発明に従う試料を分析する方法を、本明細書上記で定義されたとおりの分析装置で実行するコンピュータプログラムからの指示を受信する為に構成されている。本明細書において用いられるときに、語「プロセッサ」は、メモリー又は他の記憶装置から回収された指示が１以上の実行ユニット、例えばプールされた試料を受け取る為及び試料中又はプールされた試料中において該分析物のシグナルを決定することにより分析物の測定を実施する為のシグナル読み取りユニットなど、を用いて実行される任意のコンピューティング装置への言及を含む。
【００７３】
本発明の分析装置はさらに、本発明のプーリング装置を備えうる。
【００７４】
本発明はさらに、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、上記で記載されたとおりの試料をプールする方法を実行する。本質的には、該コンピュータプログラム製品は、本発明のプーリング装置のメモリー内に格納されてよく、及び該装置のプロセッサにより、該プーリングの方法の種々のプロセスステップに対応する指示のセットを該プロセッサに備えることによって実行されてよい。
【００７５】
本発明はさらに、コンピュータプログラム製品それ自身又はキャリア上のコンピュータプログラム製品を提供し、該プログラム製品は、コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数の試料についての分析を実施する為の方法を実行し、該方法は上記で記載されたとおりの試料をプールする方法によって得られたプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料はカテゴリー変数について分析され及び該試料における分析物の定量的測定に関与する（を含む）。本質的には、該コンピュータプログラム製品は、本発明の分析装置のメモリー内に格納されてよく、及び、該装置のプロセッサにより、該プロセッサに該分析の方法の種々のプロセスステップに対応する指示のセットを備えることによって実行されてよい。分析を実施する為の該コンピュータプログラム製品において、ソフトウェア指示に埋め込まれた該方法はさらに、上記で記載されたとおりの試料をプールする工程を含みうる。
【００７６】
本発明は今、以下の非限定的な実施例により説明されるであろう。
【００７７】
実施例
【実施例１】
【００７８】
標準化の為に５０の個体の１のプールを用いた、ＳＮＰの存在についての、二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【００７９】
ステップ１） ５０の個体が個別に試験された。
【００８０】
全てのＳＮＰ及び全ての個体について、我々は、赤い蛍光（対立遺伝子の存在）及び緑の蛍光（対立遺伝子の不在）についての強度を、マイクロアレイフォーマットにおける２つの異なる蛍光色素を用いて得た。赤と緑との間の比は、ホモ接合性の動物について常には１（又は０）でなく、又はヘテロ接合性の動物について常には０．５でない。
【００８１】
個体のタイピングについてのデータは、全てのタイプされたＳＮＰについてのシグナル強度からの補正因子を計算するために用いられた。
【００８２】
最も重要な補正因子（Ｋ）（対立遺伝子を表す際に、何らかの不均等な効率について、データを補正する為にしばしば用いられる補正因子）を得る為に、我々は、ヘテロ接合性の遺伝子型からのシグナルを用いた。もしヘテロ接合性遺伝子型が存在しないならば、我々は、研究されたＳＮＰが、調査下の集団において分離されておらず、そしてそれ故に該プール中におけるこのＳＮＰについての結果は取り除かれるべきであると想定した。
【００８３】
５０の個体の試料におけるヘテロ接合体の不在に起因するＳＮＰの除外は、結果として、低いＭＡＦ（minor allele frequency、マイナーな対立遺伝子の頻度）を有するＳＮＰについての情報が失われうることを有しうる。多くの適用（例えばゲノムの広い選抜など）にとって、これは、非常に低いマイナーな対立遺伝子の頻度を有するＳＮＰは精度にあまり寄与せず、そして次に、これらのＳＮＰについてのデータを用いないこと又は該補正因子を適用しないことの決定がなされうるので有害でない。
【００８４】
我々が用いた第一の補正因子（Ｋ）は；
であり、ここでＸｒａｗは赤についての測定された強度であり、及びＹｒａｗは緑についての測定された強度である。この値は、遺伝子型ＡＢを有する個々に遺伝子型同定された試料から決定された。
【００８５】
１つの遺伝子型についての全てのビーズの平均結果を用いる代わりに、我々は全ての別々のビーズの結果を用いることもできる。すなわち、１つの試料から、我々は、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗについて若しくはＸ及びＹについての平均結果を用い、又は我々はその試料から全ての別々のビーズの結果を用いる。
【００８６】
他の補正因子はＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇであった。ＡＡａｖｇは、ＡＡ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、１に近いと期待される。ＢＢａｖｇは、ＢＢ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は０に近いと期待される。ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇは、式
を用いて計算された。
【００８７】
ステップ２） 上記ステップ１から全ての５０の個体を含む１つの試験プールが構築された。この目的のために、ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度が、それぞれの個体試料において、ＮａｎｏＤｒｏｐスペクトロフォトメーター（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いて測定された。全てのＤＮＡ試料は次に、一つの試料へとプールする前に、５０ｎｇ／μｌの標準濃度へと希釈された。このようにして得られた該試験プールにおいて、我々は、補正されていない又は第一のステップにおいて発見された補正因子に基づく対立遺伝子頻度を見積もった。
【００８８】
対立遺伝子Ａについての未補正対立遺伝子頻度は、両方の強度の合計により割り算された赤強度の間の比として、以下の通りに計算される。
我々が適用した、対立遺伝子頻度について第一の補正は
であった。
我々が適用した第二の補正は標準化であった。
補正及び標準化の両方について、我々は該個体試料とは別に、全てのＳＮＰについて、全ての３つの遺伝子型を用いた。
【００８９】
見積もられた対立遺伝子頻度の精度の順序は、標準化された（最も正確）、補正された（間）及び補正されていない（最も正確でない）、であった。
【００９０】
これは、もしステップ１においてヘテロ接合性個体が無いならば、該補正因子Ｋは０．５に設定され、そしてもしホモ接合性個体が無いならば、補正因子ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇがそれぞれ１及び０に設定されたことを意味する。
【００９１】
ステップ３） 我々は、個体のタイピング（分類、typing）について計算された対立遺伝子頻度及び該試験プールにおける結果に基づく対立遺伝子頻度を比較した。これから、我々は、現実の結果がＸ軸上にある四次多項式を見積もった。別々に試験された個体における及びほぼ１８０００のＳＮＰを有するプールにおける遺伝子型同定結果についての図１を参照されたい。遺伝子型同定は、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、該チキンゲノムを通じて均等に分布されたＳＮＰにより行われた（van As et al., 2007）。該アッセイについての詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上に見られうる（http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=12）。
【００９２】
この多項式から、我々は、個体から既知の該頻度が０、０．０５、０．１、０．１５・・・・・０．９、０．９５及び１だろうときに、該試験プール中における予測された対立遺伝子頻度（the predicted allell frequency）を計算した。
【００９３】
Ｙ軸上に現実の頻度を有する第二のグラフにこれらの結果を置くことにより、我々は、補正の第三ステップについての補正因子を得た、図２を参照されたい。
【００９４】
これらの補正因子を適用した後、該試験プールにおける対立遺伝子頻度は、現実の頻度との直線関係を示した、図３を参照されたい。
【００９５】
約１８０００のＳＮＰによるこの実験において、５０の個体の試験プールにおいて測定された（及び記載されたとおりに補正された）対立遺伝子頻度の９６％超が、個体タイピングからの結果と比較して、＋又は−６．２５％の範囲内であった。
【００９６】
本発明の適用の為に、前の３ステップは好ましくは、「キャリブレーション」として、実際の分析の前に、該分析の精度を増す為に、実施される。しかしながら、これらのステップは、それぞれの回で実施される必要はない。該測定の該キャリブレーション（もし実施されるならば）は次にステップ４）が続く。
【００９７】
ステップ４） 比１：３、１：３：９又は１：３１：３２：３（ｎ−１）における２、３又はｎ個の個体のＤＮＡプールの構築し、及び該プールを遺伝子型同定のための測定に付す、ここでシグナル強度は、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（上記参照）を用いてマイクロアレイ上で赤及び緑について決定される。
【００９８】
ステップ５） ステップ１及びステップ３において発見された補正因子により、該対立遺伝子頻度が、該プールにおいて得られたシグナル強度から計算されうる。プール中の２つの個体により、該予測された補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与える。四捨五入が、最近の結果点（the nearest result point）へと行われるべきである。該２つの個体の遺伝子型は、表２において示された結果から得られうる。
【００９９】
プール中の３つの個体により、四捨五入は、結果点の間の間隔が３．８５％（１００／（３３−１））等であるところの最近の結果点へと行われるべきである。
【０１００】
連続的な結果点の間の間隔が短ければ短いほど、該結果点の一つへの特定の結果の適切な割り当てを許す為に、強度の読み取りはより正確である必要がある。より正確な読み取りは、遺伝子型同定技術のさらなる発展により実行可能となるであろう。
【０１０１】
プール中に２つの個体を有する状況について、該プール内の見積もられ且つ補正された対立遺伝子頻度が、個体の現実の頻度から±６．２５％の範囲内にあるところのＳＮＰだけを用いることを決定しうる。（図３中の赤線を参照されたい）。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
プールされた結果と個体の結果（ステップ３における）との間の６．２５％よりも大きな差異を示すＳＮＰは、もし個体の遺伝子型を推測する為に他の情報が利用可能でないならば、取り除かれるべきである。
【０１０４】
個体の遺伝子型を推測する為の追加情報が、個体の系図から又は、該個体が属するファミリー又は集団内に存在するハプロタイプについての情報から得られうる。
【０１０５】
補正因子の再現性に依って、ステップ１、２及び３は、アッセイ条件が同じであると知られているところの新規分析において完全にスキップされうる。
【０１０６】
実施例１の方法に従うとき、分析される必要がある試料の合計数を減少する一方でなお当初の個体試料についての信頼できる結果を得ることができることにより、著しい節約が達成されうる。分析されるべき試料の合計数の典型的な減少が表３に示される。
【０１０７】
【表３】
【実施例２】
【０１０８】
標準化のための２の個体の２５のプールを用いた、二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【０１０９】
ステップ１） ５０の個体が、実施例１のステップ１におけるとおりに別々に試験される。
【０１１０】
ステップ２） 比１：３で、上記ステップ１からの全ての５０の個体を含む、２つの試料の２５プールをそれぞれ構築する。これらのプールにおいて、補正されていない又は第一のステップにおいて発見された補正因子に基づく対立遺伝子頻度を見積もる。
【０１１１】
ステップ３） ２つの個体のタイピングからの対立遺伝子頻度の合計と、２つの個体試料のプールにおける該見積もられた頻度とを比較する。これらの２５の点から、回帰直線を計算する。該回帰計数及び切片が次に、他のプールから見積もられた頻度を補正する為に用いられうる。
【０１１２】
ステップ４） 次に、比１：３、１：３：９又は１：３１：３２：３（ｎ−１）における２、３又はｎ個の個体のＤＮＡプールを構築する。
【０１１３】
ステップ５） ステップ１及びステップ３において発見された補正因子により、該プールにおいて得られたシグナル強度から対立遺伝子頻度を計算する。
【０１１４】
試料数の節約は、二倍体個体のシークエンシングについての表８において言及された節約と同一である。
【実施例３】
【０１１５】
ハプロイド個体試料の遺伝子型同定の例
【０１１６】
２つのハプロイド試料がプールされ、そしてゲノム内の或る位置での対立遺伝子Ａの存在について測定されたとき、該測定（ピーク高さ、ピーク下面（surface under peak）、強度）における期待された比は以下のとおりである。
【０１１７】
【表４】
【０１１８】
もし２つの試料のプールだけが用いられるならば、補正因子は必要とされなくてもよい。より多くの試料がプールされる場合、補正因子はおそらく必要とされる。そのときは、それらは、ヘテロ接合性及びホモ接合性の二倍体個体を模倣する為に、該分析物の等しい量を有する２つの試料のプールから計算されうる。
【０１１９】
３つの試料のプーリングが、１：２：４の比でプールされるとき、該測定における以下の比が期待される。
【０１２０】
【表５】
【実施例４】
【０１２１】
シークエンシングプロトコールにおける本発明の使用
【０１２２】
この発明において記載されたプールする方法は、２以上の個体において配列を決定する必要がある状況に適用されうる。
【０１２３】
シークエンシングの為の個体、テンプレート又はＰＣＲ産物のプーリングは、一般的な慣習ではない。なぜなら、二重のトレースを分析するときの本質的な問題は、２つの塩基がそれぞれの位置で表され及び該トレースだけを説明することによりどのテンプレートからそれぞれの塩基が来たかを教えることが不可能であるからである。
【０１２４】
二重トレースを結果する意図的にプールされたテンプレートに加えて、二重トレースを生じるいくつかの生物学的及び生物工学的状況が知られている。これらは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された転写物のオルタナティブスプライシングされた領域において、直接にシークエンシングされ（クローニングすること無く）ることにおいて及びランダム挿入変異誘発実験において、見られる。
【０１２５】
プールされた配列のハプロタイプ又は二重トレースをさかのぼる為のいくつかの方法が記載されている。Ｆｌｏｔら（２００６）は、個体のハプロタイプを見つけ出す為に提案されたいくつかの分子方法を記載する。例えば、クローン化されたＰＣＲ産物のシークエンシング（例えばＭｕｉｒら、２００１）、ＳＳＣＰ（一本鎖コンホメーション多型）（Ｓｕｎｎｕｃｋｓら、２０００）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｋｎａｐｐ、２００５）、一分子レベルへの極端なＤＮＡ希釈（Ｄｉｎｇ ＆ Ｃａｎｔｏｒ、２００３）、及び、対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの使用（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、２００３）である。加えて、配列の混合物のハプロタイプ再構築の為のコンピュータによるいくつかの方法が提案されている。
【０１２６】
しかしながら、記載された全ての方法は、非常にコストがかかり且つ時間を消費するものであり、並びに、特定の目的（例えば、再シークエンシング、オルタナティブスプライシング、テンプレート、又は、配列長の異なる２つの産物のＰＣＲ増幅された混合物、参照ゲノム配列の利用可能性）に適用できるだけであり、そして、ハプロイド若しくは二倍体の試料の標準的な直接のシークエンシング又は全く未知の配列のデノボシークエンシングに適さない。
【０１２７】
本発明において記載されたプーリングに従う配列テンプレートのプーリングは、同じ配列断片が個体及びプールされた試料の両方において入手されうる状況に適用されうる。これは、例えばショットガンシークエンシング（ランダムに切断された断片）はプーリングにとって適当でないことを意味する。
【０１２８】
上記で言及された全ての適用において、もしプーリングが意図的に適用されるならば、等しい量のテンプレート（試料、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＣＲ産物）がプールされる。
【０１２９】
本明細書において、我々は、等しくない量のテンプレートのプーリングを記載する。この例について、２つのテンプレートからなるプールについての状況だけが記載されるが、本発明は、二倍体生物について比１：３、１：３：９、１：３１：３２：３（ｎ−１）で、及びハプロイド生物について１：２、１：２：４、１：２１：２２：２（ｎ−１）の比で、２、３又はｎの個体のＤＮＡ（又はＰＣＲ後産物）のプールを構築するために用いられうる。
【０１３０】
満たされる必要がある一般的条件は、該シークエンシング装置がテンプレートを（例えば蛍光について）スキャンし、そして、得られたクロマトグラムが、ＤＮＡテンプレートの配列を、規則的に間隔があけられ且つ同様の高さの一連のピークとして表すことである。
【０１３１】
ステップ１） ５０の個体についてシークエンス反応を別々に実施する
【０１３２】
個々のシークエンシング反応についてのデータは、全塩基（又はヌクレオチド）の位置についてのピーク面積又はピーク高さから補正因子を計算するために用いられる。
【０１３３】
ステップ２） ２つのプールされた個体の２５のプールについてシークエンス反応を実施する
【０１３４】
ピーク面積比が、塩基及びノイズのピークでの、第一及び第二のピークを区別する為に用いられる。該第二のピークは、該第一のピークの百分率であり、そして閾値が、ピークとノイズピークとを区別する為に用いられる。プールされたシークエンシング反応についてのデータは、全塩基（又はヌクレオチド）の位置についてのピーク面積又はピーク高さから補正因子を計算するために用いられる。
【０１３５】
ステップ３） ステップ１及び２の結果のグラフを作り、そして回帰直線を構築する（回帰係数及び切片を計算する）
【０１３６】
ステップ４） ＤＮＡ（又はＰＣＲ後産物）のプールを構築する
【０１３７】
比１：３、１：３：９、１：３１：３２：３（ｎ−１）での二倍体生物についての及び１：２、１：２：４、１：２１：２２：２（ｎ−１）の比でのハプロタイプ生物についての、２、３又はｎ個の個体のプールが構築される。
【０１３８】
ステップ５） ステップ１、２およびステップ３において発見された補正因子を用いて、ベースコーリング（塩基判定、basecalling）が、該プール内の得られたシグナル強度から計算されうる。
【０１３９】
この例において、２つだけの可能なヌクレオチド（Ａ及びＣ）がそれぞれの塩基位置で示されるが、同じ原理が、遺伝コードに基づく４つの利用可能なヌクレオチドのうちの２つの他の組み合わせについて機能する。「Ａ」ヌクレオチドについての平均ピーク高さは１００に設定され、及び、「Ｃ」ヌクレオチドの平均ピーク高さは７５である。これらのピーク高さに基づき、２つのハプロイド試料のプールにおけるヌクレオチドの全ての可能な組み合わせについて、相対的なピーク高さが表６に提示される。２つの二倍体テンプレートからなるプールについての相対的ピーク高さが表７に与えられる。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
表８は、本発明におけるプーリング戦略と非プーリング状況とを比較する、シークエンス反応の数の減少を示す。
【０１４３】
【表８】
【実施例５】
【０１４４】
択一的な補正方法を用いた標準化の為の、５０の個体の１プール及び２の個体の２５プールを用いた二倍体個体試料の遺伝子型同定の例
【０１４５】
ステップ１） ５０の個体が別々に試験された。
実施例１、ステップ１と同じだが、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗの代わりに標準化された強度Ｘ及びＹを用いた異なる補正方法を伴う。
【０１４６】
第一の補正因子（Ｋ）はＸ及びＹを用いて計算される。
ここでＸはＡ対立遺伝子（赤）についての標準化された強度であり、そしてＹはＢ対立遺伝子（緑）についての標準化された強度である。この値は、遺伝子型ＡＢを有する個々に遺伝子型同定された試料から決定された。
【０１４７】
他の補正因子ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇもまたＸ及びＹに基づく。ＡＡａｖｇは、ＡＡ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、１に近いことが期待される。ＢＢａｖｇは、ＢＢ遺伝子型の補正されていない対立遺伝子頻度の平均である。この値は、０に近いことが期待される。ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇは式
を用いて計算された。
【０１４８】
全ての補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇもまた、実施例１、ステップ１におけるとおり、Ｘｒａｗ及びＹｒａｗに基づき計算されうる。
もし遺伝子型ＡＡが５０の個体のうちで利用可能でないならば、ＡＡａｖｇは１に設定される。また、もしＢＢ遺伝子型が利用可能でないならば、次にＢＢａｖｇは０に設定される。
【０１４９】
次のステップは、全ての５０の個体が結果を有するところのそれらのＳＮＰについての個体タイピングに基づき対立遺伝子頻度を計算することである。
【０１５０】
ステップ２） 実施例１、ステップ２におけるとおり、ステップ１からの全ての５０の個体を含む１つのプールが構築された。
【０１５１】
対立遺伝子Ａについての補正されていない対立遺伝子頻度が、両方の標準化された強度の合計（Ｘ＋Ｙ）により割り算された標準化された赤強度（Ｘ）の間の比として計算される。
補正されていない対立遺伝子頻度イコールＸ／（Ｘ＋Ｙ） （Ｒａｆと呼ばれる）
【０１５２】
我々が適用した対立遺伝子頻度についての第一の補正は、
補正された対立遺伝子頻度＝Ｘ／（Ｘ＋Ｋ*Ｙ） （Ｒａｆｋと呼ばれる）
である。
【０１５３】
ヘテロ接合性の遺伝子型がなかったならば、Ｋは計算されることができない。その場合、以下のルールが適用されうる；
【０１５４】
もしＲａｆ＜０．１ならば、そのときはＲａｆｋは０に設定される。
もしＲａｆ＞０．９ならば、そのときはＲａｆｋは１に設定される。
Ｋが失われるところの全ての他の状況において、ＲａｆｋはＲａｆに等しく設定される。
【０１５５】
ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いた標準化補正は、標準化された強度Ｘ及びＹにより開始するときは、常には必要でない。もしＸｒａｗ及びＹｒａｗにより開始するならば、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いた標準化が実施例１、ステップ２におけるとおりに適用されうる。
【０１５６】
標準化が適用されるならばそのときは、以下の式
を使用する。
【０１５７】
ステップ３） 我々は、ステップ１における個体タイピングについて計算された期待される対立遺伝子頻度（the expected allell frequency）と、ステップ２における５０のプールにおける結果に基づく観察された（補正された又は補正されていない）頻度とを比較した。これから、我々は、以下のモデル
期待された対立遺伝子頻度＝切片なしのｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４
を用いて、回帰係数を計算した。
【０１５８】
補正された頻度（Ｒａｆｋ及びＲａｆｎ）又は補正されていない頻度（Ｒａｆ）のいずれかが、上記式において観察された頻度として用いられる。
該期待された対立遺伝子頻度と、該モデルから予測された対立遺伝子頻度とを比較することにより、最良の補正手順（Ｒａｆｋ、Ｒａｆｎ又はＲａｆ）が発見されうる。
最良の補正手順（the best correction procedure）からの回帰係数は後で、ステップ５ａにおいて２つの個体のプールからの対立遺伝子頻度を補正する為に用いられうる。
【０１５９】
ステップ４） ５０の個体試料から、比１：３で、２つの個体の２５のＤＮＡプールを構築する。該プールにおいて、どの個体が１回用いられ、そしてどれが３回用いられるかを注記する。
【０１６０】
ステップ５ａ） ５０の個体のプールの結果に基づく補正
ステップ１（Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇ）及びステップ３（回帰因子ｂ１、ｂ２、ｂ３及びｂ４）において発見された補正因子により、該対立遺伝子頻度が、ステップ４下で構築されたプールにおける得られたシグナル強度から計算されうる。第一のＲａｆ又はＲａｆｋ又はＲａｆｎが、ステップ１からの補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを用いて（ステップ３において発見された最良の補正手順によって）計算される。
【０１６１】
次に、Ｒａｆｃ又はＲａｆｋｃ又はＲａｆｎｃが、ステップ３下で発見された多項式の回帰係数を用いて、
期待された対立遺伝子頻度＝ｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４、ここで、観察された頻度＝Ｒａｆ又はＲａｆｋ又はＲａｆｎ
のとおりに計算される。
【０１６２】
プール中の２つの個体により、該予測され補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与えるべきである。最近の結果点への四捨五入がなされるべきである。該２つの個体の遺伝子型同定は、実施例１の表２において示されたとおりの結果から得られうる。
【０１６３】
ステップ５ｂ） ２つの個体のプールの結果に基づく補正
Ｒａｆ、Ｒａｆｋ及びＲａｆｎが、ステップ４下で構築されたプールのシグナル強度及びステップ１下で発見された補正因子Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇに基づき計算される。
【０１６４】
次に、ステップ３、実施例５、におけるのと同じモデルを用いた多項式回帰係数が、２０のプールに基づき計算されうる。このモデルは、全てのＳＮＰについて別々に又は全てのＳＮＰにわたって適用されうる。
他の５つのプールにおける該対立遺伝子頻度が、これらの回帰因子に基づき、
のとおりに予測される。
【０１６５】
これは、全ての試料が予測の為に１回用いられるような方法で５回繰り返されうる。これらのプールにおける該期待された対立遺伝子頻度は次に、最良の補正手順を発見する為に該予測された対立遺伝子頻度と比較される。
【０１６６】
プールにおける２つの個体により、該予測され補正された頻度は、結果点０％、１２．５％、２５．０％、３７．５％、５０．０％、６２．５％、７５．０％、８７．５％及び１００％を与えるべきである。最近の結果点への四捨五入が行われるべきである。２つの個体の遺伝子型が、実施例１の表２に示されたとおりの結果から得られうる。
【０１６７】
ステップ５ｃ） ２つの個体のプールの結果に基づく補正
予測の他の方法が、多重線形回帰係数を用いて、以下のモデル
に基づき光強度（Ｘ又はＸｒａｗ及びＹ及びＹｒａｗ）について、ＳＮＰにより行われうる。
【０１６８】
これらの多重線形回帰因子により、対立遺伝子頻度が次に、
を用いて予測されうる。
【０１６９】
上記に記載されたとおりの該多重線形回帰係数が、２０のプールに基づき計算される。
次に、他の５のプールの対立遺伝子頻度が、これらの回帰因子に基づき予測される。これは、全ての試料が予測の為に１回用いられるような方法で、５回繰り返される。これらのプール中における該期待された対立遺伝子頻度は次に、該最良の補正手順を発見する為に予測された対立遺伝子頻度と比較されうる。
【０１７０】
ステップ５ａ及びステップ５ｂにおけるとおり、２つの個体の遺伝子型が、実施例１の表２において示されるとおりの結果から得られうる。
【０１７１】
ステップ６） 他の個体の試料から、２つの個体の、比１：３でのＤＮＡプールを構築する。ステップ４におけるとおり、該プールにおいて、どの個体が１回用いられそしてどの個体が３回用いられるかを注記する。
これらのプールから、我々は、記載されたとおりの対立遺伝子頻度の予測の為の最良の補正方法を用いて及び実施例１の表２を用いて、遺伝子型を得ることができる。
【０１７２】
実験１
実施例５において記載された手順の、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ａｓｓａｙ ＢｅａｄＣｈｉｐテクノロジー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ、米国）を用いた全ゲノムＳＮＰ分析への適用
【０１７３】
遺伝子型同定が、５０の個体について、１８Ｋ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ iＳｅｌｅｃｔ Ｉｎｆｉｎｉｕｍアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、チキンゲノムを通じて均等に分散されたＳＮＰにより、行われた（ｖａｎ Ａｓら、２００７）。該アッセイについての詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上で見られうる
。
【０１７４】
頻度が正確に見積もられうるかどうかをチェックする為に、（該５０の個々に遺伝子型同定された個体のうちの４つの異なる動物からの）８の対立遺伝子が、１つのプール中に一緒にされた。表２を用いた、予測された対立遺伝子頻度から遺伝子型への翻訳が実施されなかったことを除き、実施例５において記載されとおりのステップ１〜３及びステップ５が、採用された。
【０１７５】
ステップ４において、４の個体のＤＮＡの等モル量が、比１：３での２つの個体からのＤＮＡの代わりにプールされた。
【０１７６】
もし２つの異なる動物からの比１：３が用いられるならば、我々は、これが８の対立遺伝子をプールへ一緒にしていると考えうる。４つの個体の等モル量を用いることによっても、８の対立遺伝子が一緒にされる。
【０１７７】
このように、１２のプールが構成されそして、ステップ１におけるとおり、５０の動物の１つのプールが構成される（４＋２の追加の試料のプールにおけるのと同じ試料が用いられる）。次に、これらの１３のプールが、ｉｎｆｉｎｉｕｍチップの第二のバッチを用いて遺伝子型同定された。
【０１７８】
ＳＮＰ当たりのＫ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇが、実施例５、ステップ１におけるとおりに計算された。次に、５０のプールからの補正されていない及び補正された対立遺伝子頻度が、実施例５、ステップ２におけるとおりに計算された。
【０１７９】
多項式の回帰係数もまた、実施例５、ステップ３におけるとおりに計算された。
【０１８０】
さらに、ステップ５ｂ及び５ｃにおいて記載されたとおり、より多くの多項式及び多重線形回帰係数が計算された。これは、１１のプールに基づき行われ、そして次に、残りのプール中の対立遺伝子頻度が、該回帰因子を用いて予測された。
【０１８１】
この実験において、Ｘ及びＹ（赤及び緑についての強度）に対する多重線形回帰が最良の結果を与えた。最終的な結果について、図４及び表９を参照されたい。
【０１８２】
全部で、４．６％の対立遺伝子頻度が、誤ったクラスに落ちていた。これらが１：３の比の２つの個体のプールであった場合、これは３．０％の遺伝子型同定エラーを結果しただろう。
【０１８３】
【表９】
【０１８４】
実験２
実施例５に記載された手順の、Ｖｅｒａｃｏｄｅ Ａｓｓａｙテクノロジー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ、米国）を用いたＳＮＰ分析への適用
【０１８５】
遺伝子型同定が、ニワトリゲノムを通じて均等に分散したＳＮＰにより、９６Ｃｈｉｃｋｅｎ ＳＮＰ Ｖｅｒａｃｏｄｅ，Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓａｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、米国）を用いて、５０の個体に対して行われた（ステップ１）。該アッセイの詳細、ワークフロー及びチップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａのウェブサイト上に見られうる
。
【０１８６】
すべての試料の１プールについても構築され（ステップ２におけるとおり）、そして２の個体の比１：３での２４のプールについても構築された（ステップ４におけるとおり）。これらの２５のプールが、化学物質の第二のバッチにより遺伝子型同定された。
【０１８７】
すべての補正が、実施例５のステップ１〜３において記載されたとおりに行われた。ステップ５ａにおける補正は、ステップ３において発見された多項式回帰因子を用いて、２のすべての２４のプールについて適用された。
【０１８８】
ステップ５ｂ及びステップ５ｃについて、我々は、該回帰因子（ステップ５ｂにおいて多項式の、及びステップ５ｃにおいて多重線形の）を計算する為に毎回２３のプールを用いて、残りのプールについての対立遺伝子頻度を予測することができた。全部で、我々はこれを２４回行い、そしてすべてのプールが対立遺伝子頻度を予測するために１回用いられた。
【０１８９】
最良の結果が、Ｒａｆｋ（標準化された値Ｘ及びＹに基づき計算された）を用いて得られ、そして次に、Ｒａｆｋｃを結果する、ステップ５ｂからの多項式回帰因子を用いて補正された。
【０１９０】
全部で、８４のＳＮＰが個体においてコールされた。次に、いくつかのＳＮＰは、個体のいつくかについてコールされなかった。全部で、我々は１９０６の完全なプール*ＳＮＰの組み合わせを有した。
【０１９１】
【表１０】
【０１９２】
全部で、１３８（１３８／１９０６*１００＝７．２％）のミスマッチがあった（表１０）。すべての観察は、２つの個体試料からなるので、これは１７４の遺伝子型エラー（１７０／１９０６*２*１００＝４．４６％）をもたらした、表１１、図５及び図６を参照されたい。
【０１９３】
この例（ステップ３（実施例５）及びステップ５ａ、５ｂ又は５ｃ（実施例５）を用いて行われたとおり）における最良の補正手順を定めるプロセスも、ＳＮＰによるミスマッチの数についての情報をもたらす。これは、より低いコールレート（call rate）の費用で、該セットからのＳＮＰを排除してミステイクのリスクを減少することを可能にする。
【０１９４】
【表１１】
【０１９５】
実験３
実施例５において記載された手順の、他の遺伝子型同定方法を用いたＳＮＰ分析への適用
【０１９６】
実施例５において記載された手順はまた、実施例１及び実施例２において記載された方法以外の任意の他の遺伝子型同定方法、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ、米国）又はＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、においても用いられうる。
【実施例６】
【０１９７】
他の補正方法を用いた以外は、実施例４におけるとおりのシークエンシングプロトコールにおける本発明の使用方法
【０１９８】
ステップ１） ５０の個体について別々にシークエンス反応を実施する
対立遺伝子１のピーク高さ及び対立遺伝子２のピーク高さをＸｒａｗ及びＹｒａｗ値として、又は相対的ピーク高さをＸ及びＹとして用いる。
対立遺伝子１についての相対的ピーク高さはＸ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）であり、そして、対立遺伝子２についての相対的ピーク高さはＹ＝Ｙ（Ｘ＋Ｙ）である。
次に、Ｋ、ＡＡａｖｇ及びＢＢａｖｇを、実施例５のステップ１において遺伝子型同定する為に行われたのと同じ方法で計算する。
【０１９９】
ステップ２） すべての５０の個体の１つのプールにおけるシークエンス反応を実施する
実施例５のステップ２におけるとおり、補正されていない及び補正された対立遺伝子頻度が計算される；
【０２００】
ステップ３） 個体のシークエンシングから及び該プールから頻度を計算する
多項式の回帰係数を発見する為に、実施例５のステップ３におけるのと同じモデルを用いる。
【０２０１】
ステップ４） ２つのプールされた個体の２５のプールについてシークエンス反応を実施する
【０２０２】
ステップ５ａ） 最良の方法を発見する為に、全ての５０の個体のプールに基づき期待された頻度と補正された頻度とを比較する
【０２０３】
ステップ５ｂ） モデル
期待された遺伝子頻度＝切片なしの、ｂ１*観察された頻度＋ｂ２*観察された頻度２＋ｂ３*観察された頻度３＋ｂ４*観察された頻度４
を用いて、他の２０のプールにおいて発見された多項式回帰因子を用いて、２の個体の５のプールにおける、Ｒａｆｎｃ、Ｒａｆｋｃ及びＲａｆｃを計算する
【０２０４】
ステップ５ｃ） モデル
を用いて、他の２０のプールにおいて発見された多重線形回帰係数を用いて、２の個体の５のプールにおける、予測された対立遺伝子頻度を計算する
【０２０５】
ステップ３及びステップ５から、全てのプールが対立遺伝子頻度の予測のために用いられるような方法で、ステップ５ｂ及び５ｃを数回繰り返すことにより、最良の補正手順を決定する（検証）。
【０２０６】
もし必要ならば、検証についての他の数が用いられうる。例えば、回帰因子を発見する為に及び次にこれらの因子を用いてそれを予測する為に、２４のプールを用いることができる。全部で、次に、これを２５回繰り返すことが必要である。
【０２０７】
最良の補正手段並びに必要とされる補正因子及び回帰因子により、新たなプールの頻度を予測すること及び表２における得られた対立遺伝子を読み取ることが可能であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法であって、該分析が分析物の定量的測定を含み、該試料をプールする方法がｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プールにおける個々の試料の量は、該試料中の該分析物がＸ０：Ｘ１：Ｘ２：Ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘが該カテゴリー変数のクラスの数を表す２以上の整数である、上記方法。
【請求項２】
該分析物が生体分子であり且つ該カテゴリー変数が該生体分子の変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該生体分子が核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該変異体が、該核酸におけるヌクレオチド多型である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ヌクレオチド多型がＳＮＰである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該変異体が、特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該定量的測定が、装置シグナルの強度、ピーク高さ又はピーク面の測定を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該装置シグナルが蛍光シグナルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
半数体又は多数体の個体における対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用方法であって、該カテゴリー変数（ｘ）のクラスの数がｐ＋１に等しく、ｐが倍数性レベルを表す、上記使用方法。
【請求項１０】
二倍体個体における対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の、ｘが３である、請求項９に記載の使用方法。
【請求項１１】
複数の試料についての分析を実施する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項の方法に従い該試料をプールして、プールされた試料を用意すること、及び該プールされた試料について該分析を実施することを含む、上記方法。
【請求項１２】
複数の試料についての分析を実施する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に従う方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料がカテゴリー変数について分析され且つ該試料内の分析物の定量的測定に関与する、上記方法。
【請求項１３】
該測定から、該試料のプールにおける個々の試料の寄与を演繹することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置であって、プールされた試料を用意するための試料コレクターを備えており且つ請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施する為のプロセッサをさらに備えている、上記装置。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置であって、該装置は該試料をカテゴリー変数について分析する為及び該試料内の分析物の定量的測定を実施するように構成されている、上記分析装置。
【請求項１６】
請求項１４のプーリング装置をさらに備えている、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試料をプールする方法を実行する、コンピュータプログラム製品それ自体又はキャリア上のコンピュータプログラム製品。
【請求項１８】
コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数の試料について分析を実施する為の方法を実行し、該方法が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、該試料がカテゴリー変数について分析され且つ該試料内の分析物の定量的測定に関与する、コンピュータプログラム製品それ自体又はキャリア上のコンピュータプログラム製品。
【請求項１９】
該方法が請求項１〜８のいずれか１項に記載のプーリングのステップをさらに含む、請求項１８に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１】
カテゴリー変数について分析されるべき試料をプールする方法であって、該分析が分析物の定量的測定を含み、該試料をプールする方法がｎ個の試料のプールを用意することを含み、ここで該プールにおける個々の試料の量は、該試料中の該分析物がＸ０：Ｘ１：Ｘ２：Ｘ（ｎ−１）のモル比で存在するような量であり、且つｘが該カテゴリー変数のクラスの数を表す２以上の整数である、上記方法。
【請求項２】
該分析物が生体分子であり且つ該カテゴリー変数が該生体分子の変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該生体分子が核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該変異体が、該核酸におけるヌクレオチド多型である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ヌクレオチド多型がＳＮＰである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該変異体が、特定のヌクレオチド位置の塩基アイデンティティーである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該定量的測定が、装置シグナルの強度、ピーク高さ又はピーク面の測定を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該装置シグナルが蛍光シグナルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
半数体又は多数体の個体における対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法の使用方法であって、該カテゴリー変数（ｘ）のクラスの数がｐ＋１に等しく、ｐが倍数性レベルを表す、上記使用方法。
【請求項１０】
二倍体個体における対立遺伝子変異体を遺伝子型同定する為の、ｘが３である、請求項９に記載の使用方法。
【請求項１１】
複数の試料についての分析を実施する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項の方法に従い該試料をプールして、プールされた試料を用意すること、及び該プールされた試料について該分析を実施することを含む、上記方法。
【請求項１２】
複数の試料についての分析を実施する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に従う方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、ここで該試料がカテゴリー変数について分析され且つ該試料内の分析物の定量的測定に関与する、上記方法。
【請求項１３】
該測定から、該試料のプールにおける個々の試料の寄与を演繹することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の試料を１つのプールされた試料へとプールする為のプーリング装置であって、プールされた試料を用意するための試料コレクターを備えており且つ請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施する為のプロセッサをさらに備えている、上記装置。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施する為に構成されたプロセッサを備えている分析装置であって、該装置は該試料をカテゴリー変数について分析する為及び該試料内の分析物の定量的測定を実施するように構成されている、上記分析装置。
【請求項１６】
請求項１４のプーリング装置をさらに備えている、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試料をプールする方法を実行する、コンピュータプログラム製品それ自体又はキャリア上のコンピュータプログラム製品。
【請求項１８】
コンピュータ、プログラムされたコンピュータネットワーク又は他のプログラム可能な装置においてロードされそして実行されたときに、複数の試料について分析を実施する為の方法を実行し、該方法が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られるプールされた試料のセットについて分析を実施することを含み、該試料がカテゴリー変数について分析され且つ該試料内の分析物の定量的測定に関与する、コンピュータプログラム製品それ自体又はキャリア上のコンピュータプログラム製品。
【請求項１９】
該方法が請求項１〜８のいずれか１項に記載のプーリングのステップをさらに含む、請求項１８に記載のコンピュータプログラム製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０４０９５（Ｐ２０１１−５０４０９５Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１９７８（Ｐ２０１０−５３１９７８）
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８０１６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５１０１２１５７０）ヘンドリクス ゲネティクス ビー．ブイ． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３１日（２００８．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８０１６
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５１０１２１５７０）ヘンドリクス ゲネティクス ビー．ブイ． (1)
【Ｆターム（参考）】
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